KR102129377B1

KR102129377B1 - 특정 특성이 발현된 단백질을 암호화하는 플라스미드를 선별하는 유도 플라스미드 디스플레이 시스템

Info

Publication number: KR102129377B1
Application number: KR1020190020634A
Authority: KR
Inventors: 권대혁; 김착희; 신종혁
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2019-02-21
Filing date: 2019-02-21
Publication date: 2020-07-02

Abstract

본 발명은 특정 특성이 발현된 단백질을 암호화하는 플라스미드를 선별하는 유도 플라스미드 디스플레이 시스템에 관한 것이다. 즉, 본 발명자들은 기존 시스템과는 달리 시험관 내 분자 진화를 통하여 생성된 거대한 유전자 돌연변이 라이브러리에서 원하는 특성을 가지는 단백질 변이체를 플라스미드와 융합단백질을 이루게 함으로써, 짧은 시간 안에 효율적으로 선별할 수 있는 유도 플라스미드 디스플레이 시스템을 개발하였는 바, 본 발명을 통해 활성이 유지되거나 성능이 극대화된 단백질을 선별한 후 이를 이용하여 산업적 가치가 높은 물질의 생산용 미생물에 적용함으로써 고부가 산물을 보다 경제적이고 효율적으로 얻을 수 있을 것으로 기대된다.

Description

특정 특성이 발현된 단백질을 암호화하는 플라스미드를 선별하는 유도 플라스미드 디스플레이 시스템{An inductive plasmid display system for selecting a plasmid encoding a protein with specific properties expressed}

본 발명은 특정 특성이 발현된 단백질을 암호화하는 플라스미드를 선별하는 유도 플라스미드 디스플레이 시스템으로서, 보다 구체적으로, 돌연변이 라이브러리 중에서 특정 특성이 발현된 목적단백질이 단백질 트랜스 접합(protein trans splicing)에 의해 융합단백질 및 플라스미드-단백질 복합체로 차례로 형성된 후, 플라스미드-단백질 복합체가 있는 세포를 파쇄하고, 플라스미드-단백질 복합체를 정제(purification)하여 융합단백질이 제거된 플라스미드를 선별하는 단계를 포함하는 유도 플라스미드 디스플레이 시스템에 관한 것이다.

초고속 대량 스크리닝/선별 방법(High throughput screening/selection method; HTSS) 중에는 미세역가플레이트(microtiter plates), 세포자동해석·분리장치(Fluorescence activated cell sorter; FACS), 디지털 이미징(digital imaging), 생장 보완(growth complementation), 및 플라스미드 디스플레이(plasmid display) 등의 방법이 있다. 여기에서 미세역가플레이트(microtiter plates), 디지털 이미징(digital imaging), 및 생장 보완(growth complementation)는 플레이트에 도말하는 과정이 동반되어야 하므로 많은 플레이트가 필요하고, 하루에 최대 10⁴~10⁶개의 변이체만을 스크리닝/선별 할 수 있다는 단점이 있고, 세포자동해석·분리장치(FACS)는 하루에 10⁹개의 변이체를 스크리닝 할 수 있지만 고가의 장비를 필요로 하는 단점이 있다. 하지만, 플라스미드 디스플레이(plasmid display)는 플레이트에 도말하는 과정이 필요하지 않고, 전환(transformation)하고 난 후, 라이브러리(library) 전체를 배양하여 선별(selection)할 수 있기 때문에 특성이 개선된 변이체를 탐색하는데 유용하게 사용될 수 있다는 장점이 있다.

이처럼, 디스플레이 기술(Display technology)을 기반으로 하는 초고속 스크리닝/선별방법에 관한 기술의 종류는 매우 다양하지만, 그 중에서 발전 가능성과 많은 잠재력을 가지고 있는 기술은 플라스미드 디스플레이 기술이다. 이 기술은 조작된 단백질(Engineered protein)이 세포 표면(cell surface)나 주변세포질(periplasm)로 전좌(translocation)되는 비효율적인 과정을 거치지 않으며, 세포질(cytoplasm)에서 플라스미드를 암호화(encoding)하는 목적 유전자(target gene)에 단백질(protein)을 직접적으로 연결시킨다. 이러한 방식으로 세포질에서 목적 단백질(target protein)이 플라스미드에 있는 특정 DNA 결합 영역(specific DNA binding domain; DBD)에 융합(fusion)된 형태로 발현되고, 플라스미드에 있는 결합 자리(binding site)에 이 융합 단백질(fusion protein)이 직접적으로 부착된다. 하지만, 기존의 플라스미드 디스플레이는 목적단백질과 플라스미드의 복합체를 정제한 후 효소를 처리하여 단백질의 접힘(folding)이 제대로 이루어지지 않은 변이체를 제거하고 접힘이 일어난 단백질을 선택하는 것으로만 제한적으로 사용되고 있는 실정이었다.

따라서, 활성이 유지되거나 극대화된 단백질을 선별하여 고부가 산물을 경제적이고 효율적으로 얻기 위한 연구가 필요한 실정이었다.

대한민국 공개특허공보 10-2015-0013503

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 목적단백질(Protein of interest; POI)의 돌연변이 라이브러리(mutant library)를 형성시키는 단계; 상기 돌연변이 라이브러리에 있는 돌연변이체를 발현시키는 단계; 상기 돌연변이체를 발현시켜 얻는 단백질 중 특정 특성이 발현된 단백질은 단백질 트랜스 접합(protein trans splicing)에 의해 융합단백질로 형성되는 단계; 상기 융합 단백질과 플라스미드가 결합하여 플라스미드-단백질 복합체가 형성되는 단계; 상기 플라스미드-단백질 복합체가 포함된 세포를 파쇄하고, 크로마토그래피를 이용하여 플라스미드-단백질 복합체를 정제하는 단계; 및 상기 플라스미드-단백질 복합체를 플라스미드 정제(plasmid purification)하여 융합단백질을 제거한 플라스미드를 선별하는 단계를 포함하는, 유도 플라스미드 디스플레이 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 유도 플라스미드 디스플레이 시스템에 의해 선별된 플라스미드를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 선별된 플라스미드에 포함된 특정 특성을 가진 유전자 또는 선별된 플라스미드에 의해 발현되는 특정 특성을 가진 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 특정 특성을 가진 유전자 또는 단백질을 포함하는 재조합 미생물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 목적단백질(Protein of interest; POI)의 돌연변이 라이브러리(mutant library)를 형성시키는 단계; 상기 돌연변이 라이브러리에 있는 돌연변이체를 발현시키는 단계; 상기 돌연변이체를 발현시켜 얻는 단백질 중 특정 특성이 발현된 단백질은 단백질 트랜스 접합(protein trans splicing)에 의해 융합단백질로 형성되는 단계; 상기 융합 단백질과 플라스미드가 결합하여 플라스미드-단백질 복합체가 형성되는 단계; 상기 플라스미드-단백질 복합체가 포함된 세포를 파쇄하고, 크로마토그래피를 이용하여 플라스미드-단백질 복합체를 정제하는 단계; 및 상기 플라스미드-단백질 복합체를 플라스미드 정제(plasmid purification)하여 융합단백질을 제거한 플라스미드를 선별하는 단계를 포함하는, 유도 플라스미드 디스플레이 시스템을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 구현예로, 상기 특정 특성은 수용성, 열안정성, pH안정성, 리간드에 대한 친화도, 효소의 활성, 및 효소 저해제 저항성으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택될 수 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 돌연변이 라이브러리는 목적단백질에 오류유발 PCR(error prone PCR) 및 DNA 섞임(DNA shuffling)을 이용한 무작위 돌연변이생성(random mutagenesis)를 일으킴으로써 형성된다.

또한, 본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 돌연변이체를 발현시키는 것은 POI-IntN(Prontein of Interset - Intein N) 및 IntC-DBD(Intein C - DNA binding domain)을 발현시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 DBD은 DNA 결합 영역(DNA binding domain)이다.

또한, 본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 IntN 및 IntC는 인테인(Intein)이다.

또한, 본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 단백질 트랜스 접합은 POI-IntN의 IntN와 IntC-DBD의 IntC가 결합하여 인테인으로 형성된 후 제거되는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 유도 플라스미드 디스플레이 시스템에 의해 선별된 플라스미드를 제공한다.

또한, 본 발명은 선별된 플라스미드에 포함된 특정 특성을 가진 유전자 또는 선별된 플라스미드에 의해 발현되는 특정 특성을 가진 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 특정 특성을 가진 유전자 또는 단백질을 포함하는 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명자들은 기존 시스템과는 달리 시험관 내 분자 진화를 통하여 생성된 거대한 유전자 돌연변이 라이브러리에서 원하는 특성을 가지는 단백질 변이체를 플라스미드와 융합단백질을 이루게 함으로써, 짧은 시간 안에 효율적으로 선별할 수 있는 유도 플라스미드 디스플레이 시스템을 개발하였는 바, 본 발명을 통해 활성이 유지되거나 성능이 극대화된 단백질을 선별한 후 이를 이용하여 산업적 가치가 높은 물질의 생산용 미생물에 적용함으로써 고부가 산물을 보다 경제적이고 효율적으로 얻을 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 유도 플라스미드 디스플레이 기술의 전반적인 과정에 대한 모식도이다.
도 2는 목적단백질에 무작위 돌연변이생성(Random mutagenesis)를 일으켜 돌연변이 라이브러리를 형성시키는 모식도이다.
도 3a 내지 도 3c는 IPTG 와 L-Arabinose에 따른 유도(induction) 순서에 따라 단백질 발현양상이 바뀌는 것을 나타낸 모식도로써, 도 3a는 IPTG 와 L-Arabinose로 동시에 유도한 후 단백질 발현양상을 확인한 모식도이고, 도 3b는 IPTG로 유도한 후에 L-Arabinose로 유도 했을 때 단백질 발현양상을 확인한 모식도이며, 도 3c는 L-Arabinose로 유도한 후에 IPTG로 유도 했을 때 단백질 발현양상을 확인한 모식도이다.
도 4a는 His-tag가 있는 유도 플라스미드를 나타낸 도면으로써, IPTG 및/또는 L-Arabinose를 유도했을 때 발현된 단백질을 나타낸 도이다.
도 4b는 1. 대조군, 2. IPTG만 유도한 경우, 3. Arabinose만 유도한 경우, 4. IPTG 와 L-Arabinose로 동시에 유도한 경우, 5. IPTG로 유도한 후에 L-Arabinose로 유도한 경우, 6. L-Arabinose로 유도한 후에 IPTG로 유도한 경우, His-tag가 있는 단백질의 발현을 SDS-PAGE로 나타낸 도이다.
도 4c는 도 4b의 1 내지 6으로 유도한 경우, His-tag가 있는 단백질의 발현을 웨스턴 블랏(Western blot)으로 나타낸 도이다.
도 4d는 도 4b의 1 내지 6으로 유도한 경우, 녹여서 분리한 His-tag가 있는 단백질-플라스미드 복합체(eluted protein-plasmid complex)를 SDS-PAGE로 나타낸 도이다.
도 4e는 도 4b의 1 내지 6으로 유도한 후, His-tag가 있는 플라스미드를 전환(Transformation)한 후 결과를 나타낸 도이다.
도 4f는 도 4b의 1 내지 6으로 유도한 후, 각각의 His-tag가 있는 플라스미드의 양을 PCR을 이용하여 나타낸 도이다.
도 5a는 GST 퓨전 단백질(Glutathione S-transferase fusion protein)이 있는 유도 플라스미드를 나타낸 도면으로써, IPTG 및/또는 L-Arabinose를 유도했을 때 발현된 단백질을 나타낸 도이다.
도 5b는 1. 대조군, 2. IPTG만 유도한 경우, 3. Arabinose만 유도한 경우, 4. IPTG 와 L-Arabinose로 동시에 유도한 경우, 5. IPTG로 유도한 후에 L-Arabinose로 유도한 경우, 6. L-Arabinose로 유도한 후에 IPTG로 유도한 경우, GST 퓨전 단백질이 있는 단백질의 발현을 SDS-PAGE로 나타낸 도이다.
도 5c는 도 4b의 1 내지 6으로 유도한 경우, GST 퓨전 단백질이 있는 단백질의 발현을 웨스턴 블랏(Western blot)으로 나타낸 도이다.
도 5d는 도 2b의 1 내지 6으로 유도한 후, GST 퓨전 단백질이 있는 플라스미드를 전환(Transformation)한 후 결과를 나타낸 도이다.
도 6a는 돌연변이를 일으키지 않은 야생형(Wild type) FucT2로 단백질 발현테스트 결과를 SDS-PAGE로 나타낸 것이다.
도 6b는 도 6a에 따라 유도한 경우, 항체(antibody)를 이용하여 단백질의 발현을 웨스턴 블랏(Western blot)으로 나타낸 것이다.
도 6c는 도 6a에 따라 유도한 후, 단백질 정제를 통해 SDS-PAGE에서 미세하게 접합(splicing)이 일어나지 아니한 것을 확인한 도이다.
도 6d는 도 6a에 따라 유도한 후, 단백질 정제 및 플라스미드 정제한 후 전환(Transformation)한 결과를 나타낸 것이다.
도 6e는 Error prone PCR로 FucT2 돌연변이 라이브러리(mutant library)를 형성시킨 후, 이를 이용하여 단백질 발현테스트 결과를 SDS-PAGE로 나타낸 것이다.
도 6f는 도 6e에 따라 유도한 경우, 항체(antibody)를 이용하여 단백질의 발현을 웨스턴 블랏(Western blot)으로 나타낸 것이다.
도 6g는 도 6e에 따라 유도한 경우, 단백질 정제 후, 단백질의 발현을 웨스턴 블랏(Western blot)으로 나타낸 것이고, soluble해진 변이체 FucT2가 접합(splicing)이 일어난 결과를 확인한 것이다.
도 6h는 도 6e에 따라 유도한 후, 단백질 정제 및 플라스미드 정제한 후, 전환(Transformation)한 결과를 나타낸 것이다.
도 6i는 도 6e에 따라 유도한 후, 선별된 FucT2 변이체를 이용하여 발효한 결과, 야생형 FucT2에 비해 선별된 FucT2 변이체에서 2FL의 생산량이 증가한 것을 그래프를 통해 확인한 것이다.

본 발명자들은 시험관내 분자 진화를 통하여 생성된 거대한 유전자 돌연변이 라이브러리에서 원하는 특성을 가지는 단백질 변이체를 짧은 시간 안에 효율적으로 선별하기 위해 유도 플라스미드 디스플레이 시스템을 개발하였는 바, 본 발명을 통해 활성이 유지되거나 성능이 극대화된 단백질을 선별한 후 이를 이용하여 산업적 가치가 높은 물질의 생산용 미생물에 적용함으로써 고부가 산물을 보다 경제적이고 효율적으로 얻을 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 자세히 설명한다.

따라서, 본 발명은 목적단백질(Protein of interest; POI)의 돌연변이 라이브러리(mutant library)를 형성시키는 단계; 상기 돌연변이 라이브러리에 있는 돌연변이체를 발현시키는 단계; 상기 돌연변이체를 발현시켜 얻는 단백질 중 특정 특성이 발현된 단백질은 단백질 트랜스 접합(protein trans splicing)에 의해 융합단백질로 형성되는 단계; 상기 융합 단백질과 플라스미드가 결합하여 플라스미드-단백질 복합체가 형성되는 단계; 상기 플라스미드-단백질 복합체가 포함된 세포를 파쇄하고, 크로마토그래피를 이용하여 플라스미드-단백질 복합체를 정제하는 단계; 및 상기 플라스미드-단백질 복합체를 플라스미드 정제(plasmid purification)하여 융합단백질을 제거한 플라스미드를 선별하는 단계를 포함하는, 유도 플라스미드 디스플레이 시스템을 제공한다.

구체적으로, 본 발명에서는 목적단백질에 오류유발 PCR(error prone PCR) 및 DNA 섞임(DNA shuffling)을 이용한 무작위 돌연변이생성(random mutagenesis)를 일으킴으로써 돌연변이 라이브러리를 형성시키고, 라이브러리 내의 돌연변이를 POI-IntN(Prontein of Interset - Intein N) 및 IntC-DBD(Intein C - DNA binding domain)을 발현시킨다. 이 중에서, 수용성, 열안정성, pH안정성, 리간드에 대한 친화도, 효소의 활성, 및 효소 저해제 저항성으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 특정 특성이 발현된 단백질은 단백질 트랜스 접합(protein trans splicing)에 의해 융합단백질로 형성된다.

이 때, 상기 목적 단백질은 푸코스 전이효소일 수 있지만 이에 제한되지 않고, 이 시스템에 적용될 수 있는 목적 단백질은 모든 단백질에 적용 가능할 수 있으며, 상기 DNA 결합 영역(DNA binding domain)은 본 발명에서는 Oct1을 사용하였으나 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 시스템은 Intein N과 Intein C가 사용되는 것을 특징으로 하고, 본 발명에서는 CfaN(N terminal domain of consensus fast DnaE intein)와 CfaC(C terminal domain of consensus fast DnaE intein)를 사용하였으나, 특정한 한 종류에 제한되지 않는다. 사용될 수 있는 Intein의 예시는 하기 표 1과 같다.

상기 단백질 트랜스 접합은 POI-Intein N의 Intein N와 Intien C-DBD의 Intein C가 결합하여 온전한 Intein으로 형성된 후 제거되는 것을 특징으로 하며, 상기 융합단백질은 예시로서 하기 표 2와 같은 융합단백질이 사용될 수 있고, 본 발명에서는 His tag(polyhistidine tag)-POI-Oct1 또는 GST(Glutathione S-transferase fusion protein)-POI-Oct1을 사용하였으나 이에 제한되지 않는다.

Tag	Protein
MBP	Maltose-binding protein
GST	Glutathione S- transferase
Trx	Thioredoxin
NusA	N-Utilization substance
SUMO	Small ubiquitin -modifier
SET	Solubility-enhancing tag
DsbC	Disulfide bond C
Skp	Seventeen kilodalton protein
T7PK	Phage T7 protein kinase
GB1	Protein G B1 domain
ZZ	Protein A IgG ZZ repeat domain

본 발명에 사용되는 용어 단백질 트랜스 접합(protein trans splicing)이란, 인테인(intein)이라는 내부 단백질 단편이 엑스테인(extein)이라 불리는 C 말단과 N 말단 외부 단백질의 연결을 통해 전구체 단백질로부터 제거되는 특정 단백질의 분자 내 반응을 뜻한다. 전구 단백질의 접합 연결 지점은 주로 친핵성 곁사슬을 함유하는 아미노산인 시스테인(cysteine) 또는 세린(serine)이며, 현재 알려진 단백질 접합 반응은 아데노신트리포스페이트(ATP) 또는 구아노신트리포스페이트(GTP)와 같은 외인성 보조 인자 또는 에너지원을 필요로 하지 않는다.

본 발명에 사용되는 용어 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)는 분자 생물학 시약의 일종이다.　이 화합물은 알로락토스(allolactose)와 분자적으로 유사하며, 젖당 대사물(lactose metabolite)로서 락 오페론(lac operon)의 전사를 개시한다. 그리고 이러한 이유로, 유전자가 락 오페론 통제하에 있을 때 단백질 발현을 유도하는데 쓰인다. IPTG는 알로락토스와는 달리, 베타 갈락토시다아제(β-galactosidase)에 의해 가수분해 되지 않는다. 이런 이유로 IPTG는 실험환경 내내 같은 농도로 유지된다. IPTG 유도(IPTG induction)을 하려면, 무균의 필터 여과한 1M 농도의 IPTG가 일반적으로 1:1000 희석 농도로 대수적(logarithmically)으로 성장중인 세균 배양액에 더해진다. 그러나 IPTG 최종농도는 다르게 쓸 수 있다.

본 발명에 사용되는 용어 L-Arabinose는 5 개의 탄소 원자를 함유하고 알데히드 (CHO)작용기를 포함하는 단당류인 알도펜토오스(aldopetose) 중에 한 종류이다. L-arabinose는 실제로 자연계에서 다른 종류인 D-arabinose보다 더 많이 보편적으로 존재하며, 헤미셀룰로오스(hemicellulose) 및 펙틴(pectin)과 같은 생체 고분자의 성분으로 자연에서 발견된다. araBAD 오페론으로도 알려진 L-arabinose 오페론은 많은 생체 분자 연구의 대상이 되어왔다. 오페론은 대장균에서 아라비노스의 이화 작용을 지시하며, 아라비노스가 존재하고 포도당이 없으면 역동적으로 활성화된다.

본 발명에 사용되는 용어 DNA 결합 영역(DNA binding domain; DBD)이란, 이중 가닥 또는 단일 가닥 DNA를 인식하는 적어도 하나의 구조 모티프를 포함하는 독립적으로 접힌 단백질 영역을 뜻한다. DBD는 특정 DNA 서열(인식 서열)을 인식하거나 DNA에 대한 일반적인 친화성을 가질 수 있다. 일부 DBD에는 접힌 구조의 핵산도 포함될 수 있으며, DBD에는 zinc finger domain, helix-loop-helix domain, leucine zipper domain, 또는 Oct1 등이 이용될 수 있고, Oct1이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 사용되는 용어 인테인(intein)이란, 단백질 접합(protein splicing)에 의해 전구체 단백질의 중앙부에서 자가촉매으로 절출되는 단백질로써, 비발현부위(인트론; intron)유사 단백질로도 불린다. 절출과 동시에 그의 전후인 펩티드사슬(peptide chain)은 다시 펩티드사슬로 결합되어 엑스텐신(extensin)이라는 기능단백질(functional protein)이 된다. 한편, 절출된 인테인은 그의 생물에 따라 유용한 작용을 하지 못하는 경우도 있는데, 이 경우는 유전자　내에서 분자적인 기생은 아니다. 인테인으로는 DnaE, DNA polymerase Ⅲ의 catalytic subunit α, 또는 Cfa 등이 존재하며, 바람직하게는 CfaN 과 CfaC이나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 사용되는 용어 his tag는 polyhistidine-tag의 약자로써 단백질 내 최소 6개 이상의 히스티딘(Histidine, His) 잔기(residue)로 구성된 아미노산 모티프를 뜻하는 것으로 보통 단백질의 N말단이나 C말단에 있다. 이는 또한 Hexa histidine-tag, 6xHis-tag, 또는 His6 tag등 으로도 알려져 있으며, His-tag(EMD 바이오사이언스 등록)으로 상표가 등록되어 있다. tag 안의 총 히스티딘의 잔기 수는 다를 수 있다. N 말단의 his tag을 제거하는데 엑소펩티다아제(exopeptidase)를 사용하는 경우 추가적인 시퀀스는 불필요하다(예, 퀴아젠(Qiagen) TAGZyme). 더욱이, 엑소펩티다아제 분열은 엔도프로테아제(endoprotease)기반의 tag 제거시 관찰되는 불특정 분열을 해결할 수 있다. his tag은 유전적으로 조작된 단백질을 친화성 정제를 하는데 자주 쓰인다.

상기 특정 특성이 발현된 단백질이 단백질 트랜스 접합(protein trans splicing)에 의해 융합단백질로 형성되고, 융합단백질 중의 Oct1이 플라스미드의 결합 자리(binding site)에 부착되어 플라스미드-단백질 복합체를 형성한다. 그 후, 상기 플라스미드-단백질 복합체가 포함된 세포를 파쇄하고, 크로마토그래피를 이용하여 플라스미드-단백질 복합체를 정제한 후에, 그 정제된 복합체를 플라스미드 정제(plasmid purification)하여 융합단백질을 제거한 플라스미드를 선택적으로 선별할 수 있다. 이 후, 유도 플라스미드 디스플레이 기술을 반복하면 보다 특성이 개선된 단백질의 정보를 가진 플라스미드를 풍부하게(enrichment) 얻을 수 있어, 결과적으로 쉽고 빠르게 원하는 플라스미드만을 선별할 수 있다.

본 발명에 사용되는 용어 "크로마토그래피"는 혼합물을 분리하는 실험적인 기법 중 하나이다. 혼합물은 이동상(mobile phase)라는 유체에 녹아 있으며, 정지상(stationary phase)이라는 구조를 따라 움직이게 된다. 혼합물의 여러 성분들은 각각 다른 속도로 이동하며 분리가 일어나게 된다. 이 분리는 이동상과 정지상간의 차등 분배(differential partitioning)에 기반한다. 각 물질의 정지상에서의 이동 능력의 차이는 분리의 원동력이 되며, 이는 물질의 고유한 분배 계수(partition coefficient)의 차이로 설명할 수 있다. 크로마토그래피는 관 크로마토그래피, 평면 크로마토그래피, 기체 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 이차원 크로마토 그래피, Ni-NTA(Nitrilotriacetic acid) 크로마토그래피, 글루타티온(glutathione) 크로마토그래피일 수 있고, 바람직하게는 Ni-NTA 크로마토그래피 또는 글루타티온 크로마토그래피이나 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 선별된 플라스미드에 포함된 특정 특성을 가진 유전자 또는 선별된 플라스미드에 의해 발현되는 특정 특성을 가진 단백질을 제공하고, 상기 특정 특성을 가진 유전자 또는 단백질을 포함하는 재조합 미생물을 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. His-tag가 있는 유도 플라스미드에서의 유도 플라스미드 디스플레이 시스템 확인

His-tag가 있는 유도 플라스미드에서의 유도 플라스미드 디스플레이 시스템 검증을 위해 하기와 같이 His tag가 있는 짧은 펩타이드를 이용하여 접합 유무에 대한 실험을 진행하였다(도 4a 참조).

우선, 3ml LB 배지에서 글루코즈(glucose) 20g/L 및 100ug/ml 클로람페니콜 항생제를 넣고 250rpm 조건에서 플라스미드 발현용 균주를 프리컬쳐하였다. 그리고, 400ul의 프리컬쳐한 상기 균주를 20ml LB에 접종하여 200rpm 조건에서 OD(optical density)가 0.8이 될 때까지 배양한 다음, 유전자 발현을 유도하기 위해 1mM IPTG 및 0.4% L-Arabinose를 인덕션(induction) 하였다. 이 때, IPTG와 L-Arabinose를 인덕션하는 순서는 총 6가지로 수행하였다(1. Control 2. IPTG, 3. L-Arabinose, 4. IPTG+L-Arabinose, 5. IPTG→L-Arabinose, 6. L-Arabinose→?IPTG).

상기 4번, 5번, 6번 조건의 경우 1차 인덕션 후 25℃, 200rpm에서 1시간 배양한 다음 2차 인덕션을 수행하였고 IPTG와 L-Arabinose를 모두 인덕션한 다음 동일한 조건에서 4시간동안 배양하였다. 그 다음, 상기 배양액을 3300 x g, 4℃조건에서 10분동안 원심분리(centrifugation)후 균주를 수득하여 bugbuster protein extraction reagent를 이용해 세포를 파쇄 하고 단백질 발현 양상을 관찰하였다.

이때, 수용성 부분과 불용성 부분은 9300 x g, 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 나누었으며 상기 방식으로 나누어진 전체(total) 및 수용성 부분은 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏(western blot)을 통해 단백질 발현을 확인하였다.

또한, 상기 수득한 분획물은 Ni-NTA 레진(resin)을 이용하여 his tag이 달려있는 펩타이드만 선택적으로 분리하였으며, 정제된 단백질에서 플라스미드만 분리해내기 위해 플라스미드 미니 프랩 키트를 사용하였다. 그 다음, 분리한 플라스미드의 양을 확인하기 위해 형질전환(transformation) 및 PCR(polymerase chain reaction)를 진행하여 각각 콜로니의 개수와 밴드의 강도(intensity)를 확인함으로써 정량적인 수치를 파악하였다.

그 결과, 도 4b에 나타난 바와 같이 SDS-PAGE 결과 인덕션 후 목적하는 His6-Oct1이 발현됨을 확인하였으며, 이는 도 4c에 나타난 웨스턴 블랏 결과에서도 동일하였다. 또한, 도 4d에 나타난 바와 같이 수용성인 His-tag가 있는 단백질-플라스미드 복합체(eluted protein-plasmid complex)의 밴드는 6번 조건에서 강하게 나타났으며, 도 4e에 나타난 바와 같이 His-tag가 있는 플라스미드를 전환(Transformation)한 후 콜로니는 3번, 4번, 5번 및 6번 조건에서 확인할 수 있었으며 개수는 6번 조건에서 가장 많음을 확인하였다. 나아가, 도 4f에 나타난 바와 같이 His-tag가 있는 플라스미드의 양을 PCR을 통해 확인한 결과 4번, 5번, 6번 조건에서 밴드가 뚜렷하게 나타남을 확인하였다.

상기 결과를 통해 수용성이 있는 펩타이드의 경우 접합이 일어나 Cfa의 인테인(intein)이 제거되고 단백질-플라스미드 복합체가 형성된다는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 본 발명이 수용성을 가진 단백질이 발현된다는 조건하에 접합이 발생함으로써 목적한 바와 같이 작동가능 하다는 것을 의미한다.

실시예 2. GST 퓨전 단백질이 있는 유도 플라스미드에서의 유도 플라스미드 디스플레이 시스템 확인

GST 퓨전 단백질이 있는 유도 플라스미드에서의 유도 플라스미드 디스플레이 시스템을 검증하기 위해 하기와 같이 수용성인 GST 단백질을 이용하여 접합 유무에 대한 실험을 진행하였다(도 5a 참조).

우선, 3ml LB 배지에서 글루코즈(glucose) 20g/L 및 100ug/ml 클로람페니콜 항생제를 넣고 250rpm 조건에서 플라스미드 발현용 균주를 프리컬쳐하였다. 그 다음, 400ul의 프리컬쳐한 상기 균주를 20ml LB에 접종하여 200rpm 조건에서 OD가 0.8이 될 때까지 배양하였으며, 유전자 발현을 유도하기 위해 1mM IPTG 및 0.4% L-Arabinose를 인덕션(induction) 하였다. 이 때, IPTG와 L-Arabinose를 인덕션하는 순서는 총 6가지로 수행하였다(1. Control 2. IPTG, 3. L-Arabinose, 4. IPTG+L-Arabinose, 5. IPTG→L-Arabinose, 6. L-Arabinose→IPTG).

이때, 수용성 부분과 불용성 부분은 9300 x g, 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 나누었으며 상기 방식으로 나누어진 전체(total) 및 수용성 부분은 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯(western blot)을 통해 단백질 발현을 확인하였다.

또한, 상기 수득한 분획물은 글루타치온 세파로오스 레진(glutathione sepharose resin)을 사용해 정제하였으며, 정제한 단백질에서 플라스미드만 분리해내기 위해 플라스미드 미니 프랩 키트를 사용하였고 분리한 플라스미드의 양을 확인하기 위해 형질전환(transformation) 이후 각각 콜로니의 개수를 봄으로써 정량적인 수치를 확인하였다.

그 결과, 도 5b에 나타난 바와 같이 SDS-PAGE 결과에서 GST 퓨전 단백질이 포함된 단백질의 발현을 확인하였으며, 이는 도 5c의 웨스턴 블롯 결과에서도 동일하게 나타났다. 또한, 도 5d에 나타난 바와 같이 GST 퓨전 단백질 발현이 가능한 플라스미드를 형질전환(Transformation)한 후 콜로니를 확인한 결과 3번, 4번, 6번 조건에서 다수 확인할 수 있었으며 그 개수는 3번 조건에서 가장 많았다.

상기 결과를 통해 GST를 이용한 경우 접합이 매우 잘 발생함을 확인하였고 Cfa 인테인(intein)이 제거되어 단백질-플라스미드 복합체가 형성됨을 확인하였다. 이는 본 발명이 수용성을 가진 단백질이 발현된다는 조건하에 접합이 발생함으로써 목적한 바와 같이 작동 가능하다는 것을 의미한다.

실시예 3. FucT2의 야생형과 FucT2 변이체에서의 유도 플라스미드 디스플레이 시스템 확인

FucT2의 야생형과 FucT2 변이체에서의 유도 플라스미드 디스플레이 시스템을 검증하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

상기 4번, 5번, 6번 조건의 경우 1차 인덕션 후 25℃, 200rpm에서 1시간 배양한 다음 2차 인덕션을 수행하였고 IPTG와 L-Arabinose를 모두 인덕션한 다음 동일한 조건에서 4시간동안 배양하였다. 그 다음, 상기 배양액을 3300 x g, 4℃조건에서 10분 동안 원심분리(centrifugation)후 균주를 수득하여 bugbuster protein extraction reagent를 이용해 세포를 파쇄 하고 단백질 발현 양상을 관찰하였다.

이때, 수용성 부분과 불용성 부분은 9300 x g, 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 나누었으며 상기 방식으로 나누어진 전체(total) 및 수용성 부분은 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯(western blot)을 통해 단백질 발현을 확인하였다. 또한, 상기 수득한 분획물은 Ni-NTA 레진(resin)을 이용하여 his tag가 달려있는 펩타이드만 선택적으로 분리하였다. 그리고 Error-prone PCR kit를 사용하여 야생형 FucT2에 무작위 라이브러리를 형성한 다음 상기와 같은 유도 플라스미드 시스템을 한번 반복하여 생성물을 수득하였다.

그 결과, 도 6a 내지 6d에 나타난 바와 같이 불용성인 야생형 FucT2는 접합(splicing)이 일어나지 못하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏에서의 밴드 및 형질전환 후 콜로니를 거의 확인할 수 없었다. 반면 Error prone PCR로 FucT2 돌연변이 라이브러리(mutant library)를 형성시킨 경우에는 도 6e 내지 6h에 나타난 바와 같이 접합이 일어난 결과물을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏 밴드를 통해 확인할 수 있었으며 형질전환후 다수의 콜로니도 확인할 수 있었다. 나아가, 도 6i에 나타난 바와 같이 선별된 FucT2 변이체를 이용하여 발효한 결과, 야생형 FucT2에 비해 선별된 FucT2 변이체에서 2'-FL(2'-Fucosyllactose)의 생산량이 증가하였음을 확인하였다.

상기 결과를 통해 불용성이 있는 야생형 FucT2는 접합(splicing)이 일어나지 못하지만 무작위 돌연변이 유발(random mutagenesis)을 통해 확보된 라이브러리 중에서 수용성이 있는 변이체 FucT2는 접합(splicing)이 일어날 수 있음을 확인하였으며, 이는 실제로 목적 단백질 라이브러리 중에서 수용성을 가진 변이체를 선별할 수 있다는 것을 의미하고 나아가, 수용성뿐만 아니라 다양한 특성이 개선된 단백질을 본 발명을 통해 선별할 수 있다는 것을 의미한다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다름 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 아닌 것으로 이해해야 한다.

<110> Research & Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> An inductive plasmid display system for selecting a plasmid encoding a protein with specific properties expressed <130> MP18-157 <160> 40 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cfa Int-N <400> 1 Cys Leu Ser Tyr Asp Thr Glu Ile Leu Thr Val Glu Tyr Gly Phe Leu 1 5 10 15 Pro Ile Gly Lys Ile Val Glu Glu Arg Ile Glu Cys Thr Val Tyr Thr 20 25 30 Val Asp Lys Asn Gly Phe Val Tyr Thr Gln Pro Ile Ala Gln Trp His 35 40 45 Asn Arg Gly Glu Gln Glu Val Phe Glu Tyr Cys Leu Glu Asp Gly Ser 50 55 60 Ile Ile Arg Ala Thr Lys Asp His Lys Phe Met Thr Thr Asp Gly Gln 65 70 75 80 Met Leu Pro Ile Asp Glu Ile Phe Glu Arg Gly Leu Asp Leu Lys Gln 85 90 95 Val Asp Gly Leu Pro 100 <210> 2 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cfa Int-C <400> 2 Met Val Lys Ile Ile Ser Arg Lys Ser Leu Gly Thr Gln Asn Val Tyr 1 5 10 15 Asp Ile Gly Val Glu Lys Asp His Asn Phe Leu Leu Lys Asn Gly Leu 20 25 30 Val Ala Ser Asn Cys Phe Asn 35 <210> 3 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Npu Int-N <400> 3 Ala Glu Tyr Cys Leu Ser Tyr Glu Thr Glu Ile Leu Thr Val Glu Tyr 1 5 10 15 Gly Leu Leu Pro Ile Gly Lys Ile Val Glu Lys Arg Ile Glu Cys Thr 20 25 30 Val Tyr Ser Val Asp Asn Asn Gly Asn Ile Tyr Thr Gln Pro Val Ala 35 40 45 Gln Trp His Asp Arg Gly Glu Gln Glu Val Phe Glu Tyr Cys Leu Glu 50 55 60 Asp Gly Ser Leu Ile Arg Ala Thr Lys Asp His Lys Phe Met Thr Val 65 70 75 80 Asp Gly Gln Met Leu Pro Ile Asp Glu Ile Phe Glu Arg Glu Leu Asp 85 90 95 Leu Met Arg Val Asp Asn Leu Pro Asn 100 105 <210> 4 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Npu Int-C <400> 4 Met Ile Lys Ile Ala Thr Arg Lys Tyr Leu Gly Lys Gln Asn Val Tyr 1 5 10 15 Asp Ile Gly Val Glu Arg Asp His Asn Phe Ala Leu Lys Asn Gly Phe 20 25 30 Ile Ala Ser Asn 35 <210> 5 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ssp Int-N <400> 5 Ala Glu Tyr Cys Leu Ser Phe Gly Thr Glu Ile Leu Thr Val Glu Tyr 1 5 10 15 Gly Pro Leu Pro Ile Gly Lys Ile Val Ser Glu Glu Ile Asn Cys Ser 20 25 30 Val Tyr Ser Val Asp Pro Glu Gly Arg Val Tyr Thr Gln Ala Ile Ala 35 40 45 Gln Trp His Asp Arg Gly Glu Gln Glu Val Leu Glu Tyr Glu Leu Glu 50 55 60 Asp Gly Ser Val Ile Arg Ala Thr Ser Asp His Arg Phe Leu Thr Thr 65 70 75 80 Asp Tyr Gln Leu Leu Ala Ile Glu Glu Ile Phe Ala Arg Gln Leu Asp 85 90 95 Leu Leu Thr Leu Glu Asn Ile Lys Gln Thr Glu Glu Ala Leu Asp Asn 100 105 110 His Arg Leu Pro Phe Pro Leu Leu Asp Ala Gly Thr Ile Lys 115 120 125 <210> 6 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ssp Int-C <400> 6 Met Val Lys Val Ile Gly Arg Arg Ser Leu Gly Val Gln Arg Ile Phe 1 5 10 15 Asp Ile Gly Leu Pro Gln Asp His Asn Phe Leu Leu Ala Asn Gly Ala 20 25 30 Ile Ala Ala Asn 35 <210> 7 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rma Int-N <400> 7 Cys Leu Ala Gly Asp Thr Leu Ile Thr Leu Ala Asp Gly Arg Arg Val 1 5 10 15 Pro Ile Arg Glu Leu Val Ser Gln Gln Asn Phe Ser Val Trp Ala Leu 20 25 30 Asn Pro Gln Thr Tyr Arg Leu Glu Arg Ala Arg Val Ser Arg Ala Phe 35 40 45 Cys Thr Gly Ile Lys Pro Val Tyr Arg Leu Thr Thr Arg Leu Gly Arg 50 55 60 Ser Ile Arg Ala Thr Ala Asn His Arg Phe Leu Thr Pro Gln Gly Trp 65 70 75 80 Lys Arg Val Asp Glu Leu Gln Pro Gly Asp Tyr Leu Ala Leu Pro Arg 85 90 95 Arg Ile Pro Thr Ala Ser Thr Pro Thr Leu Thr Glu Ala Glu Leu Ala 100 105 110 Leu Leu Gly His Leu Ile Gly Asp 115 120 <210> 8 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rma Int-C <400> 8 Trp Asp Pro Ile Val Ser Ile Glu Pro Asp Gly Val Glu Glu Val Phe 1 5 10 15 Asp Leu Thr Val Pro Gly Pro His Asn Phe Val Ala Asp Asn Ile Ile 20 25 30 Ala Gly Asn Ser 35 <210> 9 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ppu Int-N <400> 9 Cys Ile Ser Lys Phe Ser His Ile Met Trp Ser His Val Ser Lys Pro 1 5 10 15 Leu Phe Asn Phe Ser Ile Lys Lys Ser His Met His Asn Gly Asn Lys 20 25 30 Asn Ile Tyr Gln Leu Leu Asp Gln Gly Glu Ala Phe Ile Ser Arg Gln 35 40 45 Asp Lys Lys Thr Thr Tyr Lys Ile Arg Thr Asn Ser Glu Lys Tyr Leu 50 55 60 Glu Leu Thr Ser Asn His Lys Ile Leu Thr Leu Arg Gly Trp Gln Arg 65 70 75 80 Cys Asp Gln Leu Leu Cys Asn Asp Met Ile Thr Thr Gln Ile Gly Phe 85 90 95 Glu Leu Ser Arg Lys Lys Lys Tyr Leu Leu Asn Cys Ile Pro Phe Ser 100 105 110 Leu Cys Asn Phe Glu Thr 115 <210> 10 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ppu Int-C <400> 10 Leu Ala Asn Ile Asn Ile Ser Asn Phe Gln Asn Val Phe Asp Phe Ala 1 5 10 15 Ala Asn Pro Ile Pro Asn Phe Ile Ala Asn Asn Ile Ile Val His Asn 20 25 30 Ser <210> 11 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cwa Int-N <400> 11 Cys Leu Ser Tyr Asp Thr Glu Ile Leu Thr Val Glu Tyr Gly Ala Met 1 5 10 15 Tyr Ile Gly Lys Ile Val Glu Glu Asn Ile Asn Cys Thr Val Tyr Thr 20 25 30 Val Asp Lys Asn Gly Phe Val Tyr Thr Gln Thr Ile Ala Gln Trp His 35 40 45 Asn Arg Gly Glu Gln Glu Ile Phe Glu Tyr Asp Leu Glu Asp Gly Ser 50 55 60 Lys Ile Lys Ala Thr Lys Asp His Lys Phe Met Thr Ile Asp Gly Glu 65 70 75 80 Met Leu Pro Ile Asp Glu Ile Phe Glu Lys Asn Leu Asp Leu Lys Gln 85 90 95 Val Val Ser His Pro Asp Asp Tyr Leu Val 100 105 <210> 12 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cwa Int-C <400> 12 Met Val Lys Ile Ile Gly Cys Arg Ser Leu Gly Thr Gln Lys Val Tyr 1 5 10 15 Asp Ile Gly Val Glu Lys Asp His Asn Phe Leu Leu Ala Asn Gly Ser 20 25 30 Ile Ala Ser Asn Cys 35 <210> 13 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cra 505 Int-N <400> 13 Cys Leu Ser Tyr Glu Thr Glu Val Leu Thr Leu Glu Tyr Gly Phe Val 1 5 10 15 Pro Ile Gly Glu Ile Val Asn Lys Gln Met Val Cys Thr Val Phe Ser 20 25 30 Leu Asn Asp Ser Gly Asn Val Tyr Thr Gln Pro Ile Gly Gln Trp His 35 40 45 Asp Arg Gly Val Gln Asp Leu Tyr Glu Tyr Cys Leu Asp Asp Gly Ser 50 55 60 Thr Ile Arg Ala Thr Lys Asp His Lys Phe Met Thr Thr Gln Gly Glu 65 70 75 80 Met Val Pro Ile Asp Glu Ile Phe His Gln Gly Trp Glu Leu Val Gln 85 90 95 Val Ser Gly Ile Ser Lys Leu Val Gln Gln Arg Thr Leu Pro Phe Ile 100 105 110 Ile Val Asp Arg Lys Leu 115 <210> 14 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cra 505 Int-C <400> 14 Met Val Lys Ile Val Ser Arg Arg Tyr Leu Gly Lys Ala Asp Val Tyr 1 5 10 15 Asp Ile Gly Val Ala Lys Asp His Asn Phe Ile Ile Lys Asn Gly Leu 20 25 30 Val Ala Ser Asn Cys 35 <210> 15 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Csp 8801 Int-N <400> 15 Cys Leu Ser Tyr Asp Thr Glu Ile Leu Thr Val Glu Tyr Gly Ala Ile 1 5 10 15 Pro Ile Gly Lys Val Val Glu Glu Asn Ile Asp Cys Thr Val Tyr Thr 20 25 30 Val Asp Lys Asn Gly Phe Val Tyr Thr Gln Asn Ile Ala Gln Trp His 35 40 45 Leu Arg Gly Gln Gln Glu Val Phe Glu Tyr Tyr Leu Asp Asp Gly Ser 50 55 60 Ile Leu Arg Ala Thr Lys Asp His Gln Phe Met Thr Leu Glu Gly Glu 65 70 75 80 Met Leu Pro Ile His Glu Ile Phe Glu Thr Gly Leu Glu Leu Lys Lys 85 90 95 Ile Lys Ile <210> 16 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Csp 8801 Int-C <400> 16 Met Val Lys Ile Val Ser Tyr Arg Ser Leu Gly Lys Gln Phe Val Tyr 1 5 10 15 Asp Ile Gly Val Ala Gln Lys His Asn Phe Leu Leu Ala Asn Gly Ser 20 25 30 Ile Ala Ser Asn Cys 35 <210> 17 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Csp 0110 Int-N <400> 17 Cys Leu Ser Tyr Asp Thr Glu Ile Leu Thr Val Glu Tyr Gly Pro Met 1 5 10 15 Pro Ile Gly Lys Ile Val Glu Glu Asn Ile Asn Cys Ser Val Tyr Thr 20 25 30 Val Asn Lys Asn Gly Phe Val Tyr Thr Gln Ser Ile Ala Gln Trp His 35 40 45 His Arg Gly Glu Gln Glu Val Phe Glu Tyr Tyr Leu Glu Asp Gly Glu 50 55 60 Thr Ile Arg Ala Thr Lys Asp His Lys Phe Met Thr Thr Glu Gly Lys 65 70 75 80 Met Leu Pro Ile Asp Glu Ile Phe Glu Asn Asn Leu Asp Leu Lys Lys 85 90 95 Leu Thr Val <210> 18 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Csp 0110 Int-C <400> 18 Met Val Lys Ile Ile Glu Arg Arg Ser Leu Gly Lys Gln Asn Val Tyr 1 5 10 15 Asp Ile Gly Val Glu Lys Asp His Asn Phe Leu Leu Ser Asn Asn Leu 20 25 30 Ile Ala Ser Asn Cys 35 <210> 19 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mcht Int-N <400> 19 Cys Leu Ser Tyr Asp Thr Gln Ile Leu Thr Val Glu Tyr Gly Ala Val 1 5 10 15 Ala Ile Gly Glu Ile Val Glu Lys Gln Ile Glu Cys Thr Val Tyr Ser 20 25 30 Val Asp Glu Asn Gly Tyr Val Tyr Thr Gln Pro Ile Ala Gln Trp His 35 40 45 Asn Arg Gly Glu Gln Glu Val Phe Glu Tyr Leu Leu Glu Asp Gly Ala 50 55 60 Thr Ile Arg Ala Thr Lys Asp His Lys Phe Met Thr Asp Glu Asp Gln 65 70 75 80 Met Leu Pro Ile Asp Gln Ile Phe Glu Gln Gly Leu Glu Leu Lys Gln 85 90 95 Val Glu Val Leu Gln Pro Val Phe 100 <210> 20 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mcht Int-C <400> 20 Met Val Lys Ile Val Arg Arg Gln Ser Leu Gly Val Gln Asn Val Tyr 1 5 10 15 Asp Ile Gly Val Glu Lys Asp His Asn Phe Cys Leu Ala Ser Gly Glu 20 25 30 Ile Gln Ser Asn Cys 35 <210> 21 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Maer Int-N <400> 21 Cys Leu Gly Gly Glu Thr Leu Ile Leu Thr Glu Glu Tyr Gly Leu Leu 1 5 10 15 Pro Ile Ala Lys Ile Val Ser Glu Glu Ile Asn Cys Thr Val Tyr Thr 20 25 30 Val Asp Gln Asn Gly Phe Val Tyr Ser Gln Pro Ile Ser Gln Trp His 35 40 45 Glu Arg Gly Leu Gln Glu Val Phe Glu Tyr Thr Leu Glu Asn Gly Gln 50 55 60 Thr Ile Gln Ala Thr Lys Asp His Lys Phe Met Thr Ser Asp Gly Glu 65 70 75 80 Met Leu Ala Ile Asp Thr Ile Phe Glu Arg Gly Leu Asp Leu Lys Ser 85 90 95 Ser Asp Phe Ser 100 <210> 22 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Maer Int-C <400> 22 Met Val Lys Ile Ile Gly Arg Gln Ser Leu Gly Arg Lys Pro Val Tyr 1 5 10 15 Asp Ile Gly Val Glu Lys Asp His Asn Phe Leu Leu Gly Asn Gly Leu 20 25 30 Ile Ala Ser Asn Cys 35 <210> 23 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Asp Int-N <400> 23 Cys Leu Ser Tyr Asp Thr Glu Val Leu Thr Val Glu Tyr Gly Phe Val 1 5 10 15 Pro Ile Gly Glu Ile Val Glu Lys Gly Ile Glu Cys Ser Val Phe Ser 20 25 30 Ile Asn Asn Asn Gly Ile Val Tyr Thr Gln Pro Ile Ala Gln Trp His 35 40 45 His Arg Gly Lys Gln Glu Val Phe Glu Tyr Cys Leu Glu Asp Gly Ser 50 55 60 Ile Ile Lys Ala Thr Lys Asp His Lys Phe Met Thr Gln Asp Gly Lys 65 70 75 80 Met Leu Pro Ile Asp Glu Ile Phe Glu Gln Glu Leu Asp Leu Leu Gln 85 90 95 Val Lys Gly Leu Pro Glu 100 <210> 24 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Asp Int-C <400> 24 Met Ile Lys Ile Ala Ser Arg Lys Phe Leu Gly Val Glu Asn Val Tyr 1 5 10 15 Asp Ile Gly Val Arg Arg Asp His Asn Phe Phe Ile Lys Asn Gly Leu 20 25 30 Ile Ala Ser Asn Cys 35 <210> 25 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Oli Int-N <400> 25 Cys Leu Ser Tyr Asn Thr Glu Val Leu Thr Val Glu Tyr Gly Pro Leu 1 5 10 15 Pro Ile Gly Lys Ile Val Asp Glu Gln Ile His Cys Arg Val Tyr Ser 20 25 30 Val Asp Glu Asn Gly Phe Val Tyr Thr Gln Ala Ile Ala Gln Trp His 35 40 45 Asp Arg Gly Tyr Gln Glu Ile Phe Ala Tyr Glu Leu Ala Asp Gly Ser 50 55 60 Val Ile Arg Ala Thr Lys Asp His Gln Phe Met Thr Glu Asp Gly Gln 65 70 75 80 Met Phe Pro Ile Asp Glu Ile Trp Glu Lys Gly Leu Asp Leu Lys Lys 85 90 95 Leu Pro Thr Val Gln Asp Leu Pro Ala Ala Val Gly Tyr Thr Val Ser 100 105 110 <210> 26 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Oli Int-C <400> 26 Met Val Lys Ile Val Arg Arg Gln Ser Leu Gly Val Gln Asn Val Tyr 1 5 10 15 Asp Ile Gly Val Glu Lys Asp His Asn Phe Cys Leu Ala Ser Gly Glu 20 25 30 Ile Ala Ser Asn Cys 35 <210> 27 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aov Int-N <400> 27 Cys Leu Ser Ala Asp Thr Glu Ile Leu Thr Val Glu Tyr Gly Phe Leu 1 5 10 15 Pro Ile Gly Glu Ile Val Gly Lys Ala Ile Glu Cys Arg Val Tyr Ser 20 25 30 Val Asp Gly Asn Gly Asn Ile Tyr Thr Gln Ser Ile Ala Gln Trp His 35 40 45 Asn Arg Gly Glu Gln Glu Val Phe Glu Tyr Thr Leu Glu Asp Gly Ser 50 55 60 Ile Ile Arg Ala Thr Lys Asp His Lys Phe Met Thr Thr Asp Gly Glu 65 70 75 80 Met Leu Pro Ile Asp Glu Xaa Phe Ala Arg Gln Leu Asp Leu Met Gln 85 90 95 Val Gln Gly Leu Met 100 <210> 28 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aov Int-C <400> 28 Met Val Lys Ile Thr Ala Arg Lys Phe Val Gly Arg Glu Asn Val Tyr 1 5 10 15 Asp Ile Gly Val Glu His His His Asn Phe Ala Ile Lys Asn Gly Leu 20 25 30 Ile Ala Ser Asn Cys 35 <210> 29 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ter-3 Int-N <400> 29 Cys Leu Thr Tyr Glu Thr Glu Ile Met Thr Val Glu Tyr Gly Pro Leu 1 5 10 15 Pro Ile Gly Lys Ile Val Glu Tyr Arg Ile Glu Cys Thr Val Tyr Thr 20 25 30 Val Asp Lys Asn Cys Tyr Ile Tyr Thr Gln Pro Ile Ala Gln Trp His 35 40 45 Asn Arg Gly Met Gln Glu Val Tyr Glu Tyr Ser Leu Glu Asp Gly Thr 50 55 60 Val Ile Arg Ala Thr Pro Glu His Lys Phe Met Thr Glu Asp Gly Gln 65 70 75 80 Met Leu Pro Ile Asp Glu Ile Phe Glu Arg Asn Leu Asp Leu Lys Cys 85 90 95 Leu Gly Thr Leu Glu 100 <210> 30 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ter-3 Int-C <400> 30 Met Val Lys Ile Val Ser Arg Lys Leu Ala Lys Thr Glu Asn Val Tyr 1 5 10 15 Asp Ile Gly Val Arg Lys Asp His Asn Phe Val Leu Ala Asn Gly Leu 20 25 30 Ile Ala Ser Asn Cys 35 <210> 31 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ssp 7002 Int-N <400> 31 Cys Leu Ala Gly Gly Thr Pro Val Val Thr Val Glu Tyr Gly Val Leu 1 5 10 15 Pro Ile Thr Ile Val Glu Gln Glu Leu Leu Cys His Val Tyr Ser Val 20 25 30 Asp Ala Gln Gly Leu Ile Thr Ala Gln Leu Ile Glu Gln Trp His Gln 35 40 45 Arg Gly Asp Arg Leu Leu Tyr Glu Tyr Glu Leu Glu Asn Gly Gln Met 50 55 60 Ile Arg Ala Thr Pro Asp His Arg Phe Leu Thr Thr Thr Gly Glu Leu 65 70 75 80 Leu Pro Ile Asp Glu Ile Phe Thr Gln Asn Leu Asp Leu Ala Ala Trp 85 90 95 Ala Val Pro Asp Ser Leu Pro Arg Thr Ala 100 105 <210> 32 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ssp 7002 Int-C <400> 32 Met Val Lys Ile Ile Arg Arg Lys Phe Ile Gly His Ala Pro Thr Tyr 1 5 10 15 Asp Ile Gly Leu Ser Gln Asp His Asn Phe Leu Leu Gly Gln Gly Leu 20 25 30 Ile Ala Ala Asn Cys 35 <210> 33 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tvu Int-N <400> 33 Cys Leu Ser Gly Glu Thr Ala Val Met Thr Val Glu Tyr Gly Ala Ile 1 5 10 15 Pro Ile Arg Arg Leu Val Gln Glu Arg Leu Ile Cys Gln Val Tyr Ser 20 25 30 Leu Asp Pro Gln Gly His Leu Tyr Thr Gln Pro Ile Ala Gln Trp His 35 40 45 Phe Gln Gly Phe Arg Pro Val Tyr Ala Tyr Gln Leu Glu Asp Gly Ser 50 55 60 Thr Ile Cys Ala Thr Pro Asp His Arg Phe Met Thr Thr Ser Gly Gln 65 70 75 80 Met Leu Pro Ile Glu Gln Ile Phe Arg Glu Gly Leu Glu Leu Trp Gln 85 90 95 Val Ala Ile Ala Pro Pro Gly Ala Leu Ala Gln Gly Leu Lys Pro Ala 100 105 110 Val Gln Met Ser Cys 115 <210> 34 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tvu Int-C <400> 34 Met Lys Ile Val Gly Arg Arg Leu Val Gly Trp Gln Ala Val Tyr Asp 1 5 10 15 Ile Cys Leu Ala Gly Asp His Asn Phe Leu Leu Ala Asn Gly Ala Ile 20 25 30 Ala Ala Asn Cys 35 <210> 35 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tel Int-N <400> 35 Cys Leu Ser Gly Glu Thr Ala Val Met Thr Val Glu Tyr Gly Ala Val 1 5 10 15 Pro Ile Arg Arg Leu Val Gln Glu Arg Leu Ser Cys His Val Tyr Ser 20 25 30 Leu Asp Gly Gln Gly His Leu Tyr Thr Gln Pro Ile Ala Gln Trp His 35 40 45 Phe Gln Gly Phe Arg Phe Val Tyr Glu Tyr Gln Leu Glu Asp Gly Ser 50 55 60 Thr Ile Cys Ala Thr Pro Asp His Arg Phe Met Thr Thr Arg Gly Gln 65 70 75 80 Met Leu Pro Ile Glu Gln Ile Phe Gln Glu Gly Leu Glu Leu Trp Gln 85 90 95 Val Ala Ile Ala Pro Arg Gln Ala Leu Leu Gln Gly Leu Lys Pro Ala 100 105 110 Val Gln Met Ser Gly 115 <210> 36 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tel Int-C <400> 36 Met Lys Ile Val Gly Arg Arg Leu Met Gly Trp Gln Ala Val Tyr Asp 1 5 10 15 Ile Gly Leu Ala Ala Asp His Asn Phe Val Leu Ala Asn Gly Ala Ile 20 25 30 Ala Ala Asn Cys 35 <210> 37 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sel Int-N <400> 37 Cys Leu Ala Ala Asp Thr Glu Val Leu Thr Val Glu Tyr Gly Pro Ile 1 5 10 15 Ala Ile Gly Lys Leu Val Glu Glu Asn Ile Arg Cys Gln Val Tyr Cys 20 25 30 Cys Asn Pro Asp Gly Tyr Ile Tyr Ser Gln Pro Ile Gly Gln Trp His 35 40 45 Gln Arg Gly Glu Gln Glu Val Ile Glu Tyr Glu Leu Ser Asp Gly Arg 50 55 60 Ile Ile Arg Ala Thr Ala Asp His Arg Phe Met Thr Glu Glu Gly Glu 65 70 75 80 Met Leu Ser Leu Asp Glu Ile Phe Glu Arg Ser Leu Glu Leu Lys Gln 85 90 95 Ile Pro Thr Pro Leu Leu Ala Ile Ala Gln Pro Ser Pro Leu Ala Thr 100 105 110 Ala <210> 38 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sel Int-C <400> 38 Met Val Lys Ile Val Arg Arg Arg Ser Leu Gly Val Gln Pro Val Tyr 1 5 10 15 Asp Leu Gly Val Ala Thr Val His Asn Phe Val Leu Ala Asn Gly Leu 20 25 30 Val Ala Ser Asn Cys 35 <210> 39 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aha Int-N <400> 39 Cys Leu Ser Tyr Asp Thr Glu Ile Trp Thr Val Glu Tyr Gly Ala Met 1 5 10 15 Pro Ile Gly Lys Ile Val Glu Glu Lys Ile Glu Ser Cys Val Tyr Thr 20 25 30 Val Asp Glu Asn Gly Phe Val Tyr Thr Gln Pro Ile Ala Gln Trp His 35 40 45 Pro Arg Gly Gln Gln Glu Ile Ile Glu Tyr Thr Leu Glu Asp Gly Arg 50 55 60 Lys Ile Arg Ala Thr Lys Asp His Lys Met Met Thr Glu Ser Gly Glu 65 70 75 80 Met Leu Pro Ile Glu Glu Ile Phe Gln Arg Glu Leu Asp Leu Lys Val 85 90 95 Glu Thr Phe His Glu Met Ser Leu Leu Arg Arg Gly Ala Lys 100 105 110 <210> 40 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aha Int-C <400> 40 Met Val Lys Ile Ile Lys Arg Gln Ser Leu Gly Arg Gln Asn Val Tyr 1 5 10 15 Asp Val Cys Val Glu Thr Asp His Asn Phe Val Leu Ala Asn Gly Cys 20 25 30 Val Ala Ser Asn Cys 35

Claims

목적단백질(Protein of interest; POI)의 돌연변이 라이브러리(mutant library)를 형성시키는 단계;
상기 돌연변이 라이브러리에 있는 돌연변이체를 발현시키는 단계;
상기 돌연변이체를 발현시켜 얻는 단백질 중 특정 특성이 발현된 단백질은 플라스미드의 DNA 결합 영역(DNA binding domain; DBD)과 단백질 트랜스 접합(protein trans splicing)에 의해 융합단백질로 형성되는 단계;
상기 융합 단백질이 플라스미드의 결합 자리(binding site; BS)에 결합하여 플라스미드-단백질 복합체가 형성되는 단계;
상기 플라스미드-단백질 복합체가 포함된 세포를 파쇄하고, 크로마토그래피를 이용하여 플라스미드-단백질 복합체를 정제하는 단계; 및
상기 플라스미드-단백질 복합체를 플라스미드 정제(plasmid purification)하여 융합 단백질을 제거한 플라스미드를 선별하는 단계를 포함하는, 유도 플라스미드 디스플레이 방법.
제1항에 있어서,
상기 특정 특성은 수용성, 열안정성, pH안정성, 리간드에 대한 친화도, 효소의 활성, 및 효소 저해제 저항성으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는, 유도 플라스미드 디스플레이 방법.
제1항에 있어서,
상기 돌연변이 라이브러리는 목적단백질에 오류유발 PCR(error prone PCR) 및 DNA 섞임(DNA shuffling)을 이용한 무작위 돌연변이생성(random mutagenesis)를 일으킴으로써 형성되는 것을 특징으로 하는, 유도 플라스미드 디스플레이 방법.
제1항에 있어서,
상기 돌연변이체를 발현시키는 것은 POI-IntN(Prontein of Interset - Intein N) 및 IntC-DBD(Intein C - DNA binding domain)을 발현시키는 것을 특징으로 하는, 유도 플라스미드 디스플레이 방법.
제1항에 있어서,
상기 방법을 반복하여 특정 특성의 단백질 정보를 가진 플라스미드를 선별하는 것을 특징으로 하는, 유도 플라스미드 디스플레이 방법.
제4항에 있어서,
상기 IntN 및 IntC는 인테인(Intein)인 것을 특징으로 하는, 유도 플라스미드 디스플레이 방법.
제1항에 있어서,
상기 단백질 트랜스 접합은 POI-IntN의 IntN와 IntC-DBD의 IntC가 결합하여 인테인으로 형성된 후 제거되는 것을 특징으로 하는, 유도 플라스미드 디스플레이 방법.
삭제
삭제
삭제