ES2742199T3 - Proteínas de fusión de inteína, solubles y métodos para la purificación de las biomoléculas - Google Patents

Abstract

Una proteína de fusión que comprende un polipéptido de N-inteína y una contrapartida de solubilización de Ninteína unidos por un enlace peptídico, en el que la contrapartida de solubilización de N-inteína tiene un peso molecular inferior a 15 kDa, un valor de índice alifático menor que 60 y un valor de gran promedio de hidropatía menor que -1, y que aumenta la solubilidad del polipéptido de N-inteína, en comparación con el polipéptido de Ninteína expresado en ausencia de la contrapartida de solubilización.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas de fusión de inteína, solubles y métodos para la purificación de las biomoléculas.

Solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de los EE. UU. N.° 62/074,494, presentada el 3 de noviembre de 2014, y la Solicitud Provisional de los EE. UU. N.° 62/209,010, presentada el 24 de agosto de 2015. Todas las enseñanzas de las solicitudes anteriores se incorporan en la presente como referencia.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a proteínas de fusión que comprenden un polipéptido de N-inteína y una contrapartida de solubilización de N-inteína, así como matrices de cromatografía de afinidad que comprenden dichas proteínas de fusión, según se describe en las reivindicaciones.

Antecedentes de la invención

Los métodos de purificación de proteínas que implican etiquetar una proteína de interés con una etiqueta de afinidad se usan ampliamente en el contexto de los laboratorios, para aplicaciones de investigación y desarrollo, pero han demostrado ser poco prácticos para operaciones de fabricación a gran escala. En la industria del bioprocesamiento, solo se utilizan etiquetas de afinidad escindibles para garantizar que el producto final no contenga la etiqueta, que debe eliminarse durante la producción, por lo general, utilizando una proteasa específica del sitio. La eliminación de la etiqueta de afinidad requiere pasos de proceso adicionales, que aumentan sustancialmente el costo y el tiempo, en especial, a escala industrial. Además, la escisión ineficiente y fuera del sitio conduce a la contaminación del producto proteico final, con proteínas que retienen la etiqueta y los fragmentos de proteínas truncadas, respectivamente, lo que no es aceptable en aplicaciones de bioprocesamiento.

Por consiguiente, existe la necesidad de desarrollar reactivos de cromatografía de afinidad y métodos mejorados que permitan la purificación de proteínas a gran escala, en condiciones industriales.

Compendio de la invención

Las inteínas constituyen una clase de enzimas autocatalíticas que contienen actividades tanto de proteasa como de ligasa. Una clase de inteínas, llamada “inteínas divididas”, comprende dos medias inteínas complementarias, denominadas N-inteína y C-inteína, que se asocian de una manera selectiva y extremadamente estrecha para formar una enzima inteína activa (Shah NH, et. al, J. Amer. Chem. Soc. 135: 18673-18681; Dassa B., et al., Nucl. Acids Res., 37: 2560-2573 (2009)).

El uso de inteínas, incluidas las inteínas divididas, en procesos de purificación de proteínas a gran escala ya se ha descrito en el estado de la técnica (véase, por ejemplo, el documento de patente número WO 2013/045632). El uso de inteínas divididas para la separación cromatográfica de las proteínas de interés de mezclas sin procesar también se ha descrito con anterioridad (véase, por ejemplo, la publicación china N.° CN101884910; Guan D., et al., Biotech. Bioeng. 110: 2471-2481 (2013); Lu W., et al., J. Chrom. A, 1218: 2553-2560 (2011)).

Sin embargo, el uso de inteínas en procesos de purificación de proteínas a gran escala se ve obstaculizado por su escasa solubilidad cuando se expresan en sistemas de expresión comunes, tales como E. coli. Además, no se ha descrito una matriz de cromatografía que incluya un ligando de afinidad basado en inteína, que se una covalentemente a un soporte sólido, que es crítico para procesos eficientes de purificación de proteínas a escala industrial.

La presente invención proporciona proteínas de fusión solubles que comprenden un polipéptido de N-inteína, capaz de formar un complejo de inteína activa, mediante la asociación con una segunda proteína de fusión que comprende un polipéptido de C-inteína. Las proteínas de fusión que comprenden un polipéptido de N-inteína se pueden unir covalentemente a un soporte sólido, para producir una matriz de cromatografía de afinidad, que es adecuada para aplicaciones de bioprocesamiento a gran escala.

Por consiguiente, en una realización, la presente invención se refiere a una proteína de fusión, que comprende un polipéptido de N-inteína y una contrapartida de solubilización de N-inteína, unidos por un enlace peptídico. En un aspecto particular de esta realización, la contrapartida de solubilización de N-inteína tiene un peso molecular menor que 15 kDa aproximadamente, un valor de índice alifático menor que 60 aproximadamente y un valor de gran promedio de hidropatía menor que -1, y mejora (por ejemplo, aumenta y/o promueve) la solubilidad del polipéptido de N-inteína. En un aspecto adicional de esta realización, la contrapartida de solubilización de la N-inteína comprende la SEQ ID NO: 15. En otro aspecto más de esta realización, el polipéptido de N-inteína es la N-inteína GP41-1 (SEQ ID NO: 1) o una variante de la misma.

En otra realización, la invención se refiere a una matriz de cromatografía de afinidad que comprende una proteína de fusión, que comprende un polipéptido de N-inteína y una contrapartida de solubilización de N-inteína, unida a un soporte sólido. En un aspecto particular de esta realización, el soporte sólido es una resina de cromatografía que incluye una base de poliviniléter hidrófilo.

Las proteínas de fusión de N-inteína de la presente invención tienen una solubilidad y una actividad catalítica mejoradas y resultan de utilidad como reactivos para realizar la purificación de proteínas a gran escala (por ejemplo, cromatografía de afinidad) y procesos de modificación (por ejemplo, escisión peptídica y reacciones de ligamiento) cuando se asocian con la correspondiente C-inteína.

Breve descripción de los dibujos

El archivo de la patente o solicitud contiene al menos un dibujo ejecutado en color. La Oficina proporcionará copias de esta publicación de patente o solicitud de patente con dibujos en color, previa solicitud y pago de la tarifa necesaria.

La figura 1 es un diagrama esquemático, que representa un método de purificación por afinidad ejemplar de la invención. El método emplea una matriz de cromatografía de afinidad ejemplar de la invención, que comprende una proteína de fusión que tiene un polipéptido de N-inteína fusionado a una contrapartida de solubilización de N-inteína que está unido a un soporte sólido (superficie). Una segunda proteína de fusión que comprende una C-inteína, que es complementaria a la N-inteína en la matriz de cromatografía de afinidad se fusiona con la proteína diana a purificar (proteína de interés) y a cualquier otro elemento requerido para la expresión, tales como las señales de secreción. La figura 1A muestra los diversos componentes antes de la unión de la proteína de fusión C-inteína a la matriz de cromatografía de afinidad de la N-inteína. La figura 1B muestra la proteína de fusión C-inteína unida a la matriz de cromatografía de afinidad de N-inteína, en condiciones apropiadas (por ejemplo, pH, sal, oxidación/reducción) para la asociación de las inteínas. La figura 1C muestra los componentes después de que las exteínas N y C se han escindido de sus proteínas de fusión respectivas, en condiciones apropiadas para la actividad catalítica del complejo de inteínas.

La figura 2A es una gráfica que representa el efecto de la polaridad de fusión sobre la actividad catalítica (tasa de escisión) para tres contrapartidas de solubilización candidatas de la N-inteína (46, 206, 246; véase la tabla 2) que se fusionaron con el término N (SOLP-NINT) o con el término C (NINT-SOLP) de la N-inteína GP41-1.

La figura 2B es un gráfico que representa el efecto de la polaridad de fusión en la expresión de proteínas en la E. coli para tres contrapartidas de solubilización candidatas de N-inteína (46, 206, 246) que se fusionaron con el término N (SOLP-NINT) o el término C (NINT-SOLP) de la N-inteína GP41-1.

La figura 3 es un gráfico que representa las tasas de escisión del sustrato y los títulos de expresión solubles para siete contrapartidas de solubilización candidatas (46, 206, 246, 51, 138, 342, 368) que se fusionaron al extremo C-terminal de la N-inteína GP41 -1.

La figura 4 es un gráfico que representa la correlación entre las propiedades físicas calculadas de las contrapartidas de solubilización candidatas y la expresión total (título) o soluble (título soluble) en la E. coli de las proteínas de fusión que contienen la contrapartida de solubilización fusionada al término C de la N-inteína. mw: peso molecular; pI: punto isoeléctrico; IA: índice alifático; GRAVY: gran promedio de hidropatía [todos ellos por sus siglas en inglés]. La figura 5A es un gráfico que muestra las frecuencias con las que se encuentran aminoácidos particulares en aproximadamente cien homólogos de la GP41-1 en el residuo correspondiente a la cisteína, en la posición 65 de la inteína GP41-1.

La figura 5B es un gráfico que muestra las frecuencias con las que se encuentran los aminoácidos particulares en aproximadamente cien homólogos de GP41-1 en el residuo correspondiente a la cisteína, en la posición 89 de la inteína GP41-1.

La figura 6 es un injerto que representa las actividades catalíticas (tasas de escisión) de las proteínas de fusión de la contrapartida de solubilización 138 con la N-inteína GP41-1 de tipo salvaje, que contiene dos residuos de cisteína de naturales, ubicados centralmente, en las posiciones 65 y 89 o variantes de la N-inteína GP41-1 que contiene sustituciones de aminoácidos para uno o ambos de los residuos de cisteína, en las posiciones 65 y 89.

La figura 7 representa una estructura de solución de RMN para la contrapartida de solubilización 138 (estructura 1RYK del banco de datos de proteínas). La proteína contiene cuatro dominios de hélice alfa, es globular, tiene una larga bobina no estructurada, que forma la conexión al terminal carboxi de la N-inteína (región en el círculo; no se muestra la N-inteína). Las regiones de bucle GKL y GYQ indicadas por el resaltado amarillo se dirigieron para las inserciones de los residuos de la cisteína para crear las nuevas versiones (GCKL (SEQ ID NO: 61), GCYQ (SEQ ID NO: 62) y GCGYQ (SEQ ID NO: 63)) de la contrapartida de solubilización 138 (138_GKL22GCKL, 138_GYQ48GCYQ, y 138_GYQ48GCGYQ).

Descripción detallada de la invención

A continuación se proporciona una descripción de las realizaciones ejemplares de la invención.

I. Definiciones

Para que la presente descripción pueda entenderse con mayor facilidad, primero se definen ciertos términos. A lo largo de la descripción detallada se brindan otras definiciones. A menos que se los defina de manera contraria, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que se refiere esta invención.

Las frases “biomolécula de interés” y “molécula diana” se usan indistintamente en el presente documento para referirse a una molécula biológica (por ejemplo, una proteína), un material o un ensamblaje macromolecular, que se debe purificar o eliminar de una mezcla (por ejemplo, una mezcla de proteína cruda). Las biomoléculas de interés ejemplares incluyen, por ejemplo, péptidos y proteínas recombinantes, incluidos los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales), vacunas, virus y otros ensamblajes macromoleculares, tales como nanopartículas y partículas similares a virus que pueden incorporar componentes tanto sintéticos como biomoleculares. A modo de ejemplo, las biomoléculas de interés pueden incluir proteínas y ensamblajes biomoleculares (por ejemplo, producidos por tecnología de ADN recombinante), como por ejemplo, hormonas (por ejemplo, insulina, hormona de crecimiento humana, eritropoyetina, interferones, factor estimulante de colonias de granulocitos, activador de plasminógeno tisular), anticuerpos monoclonales (mAb) y derivados de mAb (por ejemplo, mAb bi-específicos, Fab, scFvs, anticuerpos de tiburones y camélidos), productos terapéuticos derivados de andamios (por ejemplo, DARPins, Affibodies, anticalins), enzimas terapéuticas (por ejemplo, galactosidasa alfa A, alfa-L-iduronidasa, N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa, glucocerebrosidasa), toxinas (por ejemplo, botulinum, CRM 197, ricina), vacunas recombinantes (por ejemplo, ántrax, difteria, tétanos, neumonía, virus de la hepatitis B, virus del papiloma humano), partículas similares a virus (por ejemplo, hepatitis B, papiloma humano, influenza, parvovirus, virus Norwalk), así como enzimas industriales (por ejemplo, papaína, bromelina, tripsina, proteinasa K, enzima BENZONASE™, enzima DENERASE™, ureasa, pepsina, etc.) y reactivos de diagnóstico (por ejemplo, glucosa y lactato deshidrogenasa, ADN polimerasas, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, enzimas de restricción, anticuerpos derivados de hibridomas, etc.). En una realización particular, la molécula diana es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal) contra una diana terapéutica.

El término “proteína de fusión” se refiere a una molécula proteica única, natural, sintética, semisintética o recombinante, que comprende la totalidad o una porción de dos o más polipéptidos heterólogos unidos por enlaces peptídicos.

El término “peptídico”, como se usa en el presente documento, se refiere a péptidos y proteínas de más de dos aminoácidos de longitud, que también pueden incorporar moléculas que no sean de aminoácidos (por ejemplo, cromóforos, fármacos, toxinas, agentes de contraste de imágenes, etc.).

El término “polipéptido” se refiere a un polímero de aminoácidos, y no a una longitud específica; por lo tanto, los péptidos, oligopéptidos y proteínas se incluyen dentro de la definición de un polipéptido.

La frase “inteína dividida”, como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína, ya sea aislada de la naturaleza o creada mediante tecnología de ADN recombinante, que tiene las siguientes propiedades: (1) la proteína se presenta en dos mitades, que interactúan con alta afinidad y selectividad; (2) las dos mitades deben contener todas las secuencias de inteína requeridas para la actividad catalítica y también pueden contener secuencias peptídicas que no sean inteínas adjuntas; (3) la proteína tiene actividad enzimática solo cuando las dos mitades están estrechamente asociadas y (4) la actividad enzimática es la escisión o ligadura peptídica selectiva del sitio, que sirve para separar las secuencias de inteína de las secuencias peptídicas que no son de inteína o para ligar las secuencias peptídicas que no son de inteína en proteínas lineales o circulares contiguas.

La expresión “inteínas complementarias” se usa en el presente documento para referirse a los poritones [SIC: las porciones] de N-inteína y C-inteína de un par de inteína dividido.

El término “N-inteína”, como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido de inteína que tiene homología con la porción N-terminal de un único polipéptido de inteína, y que se asocia con una C-inteína complementaria para formar una enzima de inteína activa.

El término “C-inteína”, como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido de inteína que tiene homología con la porción C-terminal de un polipéptido de inteína único, y que se asocia con una C-inteína complementaria para formar una enzima de inteína activa.

El término “exteína”, como se usa en el presente documento, se refiere a las secuencias peptídicas del N y C terminales que se fusionan con las N-inteínas y C-inteínas de la naturaleza y se manipulan (por ejemplo, se escinden o ligan) a través de la acción enzimática de la inteína dividida.

El término “ligando”, como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula que es capaz de una interacción fuerte y selectiva con otra, especialmente cuando está unida a una superficie, tal como una resina de cromatografía. En algunas realizaciones de esta invención, el ligando puede ser una proteína de fusión N-inteína descrita en el presente documento.

La expresión “contrapartida de solubilización”, como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína que, cuando se fusiona con una N-inteína, potencia (por ejemplo, aumenta, promueve o mantiene) la cantidad de N inteína soluble expresada en la E. coli, en relación con la cantidad de N-inteína soluble expresada en ausencia de la contrapartida de solubilización. Por ejemplo, en diversas realizaciones, la expresión de la N-inteína como una proteína de fusión con una contrapartida de solubilización puede aumentar la solubilidad de la N-inteína en al menos aproximadamente el 10 % (por ejemplo, en aproximadamente el 20 %, en aproximadamente el 30 %, en aproximadamente el 40 %, en aproximadamente el 50 %, en aproximadamente el 60 %, en aproximadamente el 70 %, en aproximadamente el 80 %, en aproximadamente el 90 % o más, en relación con la solubilidad de la inteína cuando se expresa sin la contrapartida de solubilización.

En una realización, la contrapartida de solubilización E (SEQ ID NO: 25) se fusiona con una N-inteína y la solubilidad de la proteína de fusión resultante se usa para proporcionar un punto de inicio experimental. Esto es de particular utilidad cuando la N-inteína sola no es soluble o estable.

La frase “molécula parental” o “contraparte de tipo salvaje (wt)” [por sus siglas en inglés] o “proteína wt” o “dominio wt”, como se usa en el presente documento, pretende referirse a una proteína correspondiente (por ejemplo, N-inteína, contrapartida de solubilización de la N-inteína), o un dominio de una proteína, en su forma sustancialmente nativa, que por lo general se usa como control en este documento.

La expresión “identidad de secuencia” significa que dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos, cuando están alineadas de manera óptima, como por los programas GAP o BESTFIT que usan pesos de brecha predeterminados, comparten al menos el 70 % de identidad de secuencia o al menos el 80 % de identidad de secuencia o al menos 85 % de identidad de secuencia o al menos 90 % de identidad de secuencia o al menos 95 % de identidad de secuencia o más. Para la comparación de secuencias, normalmente una secuencia actúa como una secuencia de referencia (por ejemplo, secuencia parental), con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y referencia se ingresan en una computadora, se designan las coordenadas de las subsecuencias, si es necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmos de secuencia. El algoritmo de comparación de secuencias luego calcula el porcentaje de identidad de secuencia para la o las secuencias de prueba en relación con la secuencia de referencia, en función de los parámetros de programa designados.

La alineación óptima de las secuencias para establecer la comparación se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Apl. Math. 2: 482 (1981), por el algoritmo de alineación de homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), por el método de búsqueda de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad Sci. USA 85: 2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software de genética de Wisconsin, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o por inspección visual (véase en general Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology). Un ejemplo de algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990). El software para realizar los análisis de BLAST está disponible públicamente, a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica (accesible públicamente a través del servidor de Internet de los Institutos Nacionales de la Salud, NCBI). Normalmente, para realizar la comparación de secuencias pueden usarse los parámetros de programa predeterminados, aunque también el posible utilizar parámetros personalizados. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTp emplea como valor predeterminado una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (ver Henikoff y Henikoff, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)).

El término “cromatografía”, como se usa en el presente documento, se refiere a una técnica de separación dinámica que separa una molécula diana de interés de otras moléculas presentes en la mezcla y le permite aislarse. Por lo general, en un método de cromatografía, una fase móvil (líquido o gas) transporta una muestra que contiene la molécula diana de interés a través de un medio de fase estacionaria (normalmente sólido). Las diferencias en la partición o afinidad a la fase estacionaria separan las diferentes moléculas, mientras que la fase móvil transporta las distintas moléculas en un momento diferente.

La frase “cromatografía de afinidad”, como se usa en este documento, se refiere a un modo de cromatografía en el que una molécula diana a separar se aísla por su interacción con una molécula (por ejemplo, un ligando de cromatografía de afinidad de acuerdo con esta invención, que comprende una N-inteína y un factor de solubilización de N-inteína) que interactúan específicamente con la molécula diana. En una realización, la cromatografía de afinidad implica la adición de una muestra que contiene una molécula diana (por ejemplo, una inmunoglobulina o una proteína que contiene Fc) a un soporte sólido que lleva un ligando basado en N-inteína, como se describe en este documento.

La expresión “matriz de afinidad” o “matriz de cromatografía de afinidad”, como se usa indistintamente en este documento, se refiere a un soporte cromatográfico sobre el cual se une un ligando de cromatografía de afinidad (por ejemplo, una proteína de fusión N-inteína o un dominio de la misma). El ligando es capaz de unirse a una molécula de interés, a través de la interacción de afinidad (por ejemplo, una proteína de fusión C-inteína complementaria) que se debe purificar o eliminar de una mezcla.

El término “inmunoglobulina”, “Ig” o “anticuerpo” (utilizados como sinónimos en el presente documento) se refiere a una proteína que tiene una estructura de cadena básica de cuatro polipéptidos, que consiste en dos cadenas pesadas y dos ligeras; dichas cadenas se estabilizan, por ejemplo, por enlaces disulfuro entre cadenas, que tiene la capacidad de unirse específicamente al antígeno. La frase “inmunoglobulina de cadena única” o “anticuerpo de cadena única” (utilizadas indistintamente en el presente documento) se refiere a una proteína que tiene una estructura de cadena de dos polipéptidos, que consiste en una cadena pesada y una cadena ligera, donde dichas cadenas se estabilizan, por ejemplo, por uniones peptídicas de cadenas, que tienen la capacidad de unirse específicamente al antígeno. El término “dominio” se refiere a una región globular de un polipéptido de cadena pesada o ligera, que comprende bucles peptídicos (por ejemplo, que comprenden 3 a 4 bucles peptídicos) estabilizados, por ejemplo, mediante una lámina plisada en p y/o un enlace disulfuro intracadena. Asimismo, los dominios se mencionan aquí como “constantes” o “variables”, en función de la falta relativa de variación de secuencia dentro de los dominios de varios miembros de la clase en el caso de un dominio “constante”, o la variación significativa dentro de los dominios de varios miembros de la clase en el caso de un dominio “variable”. Los “dominios” de anticuerpos o polipéptidos a menudo se denominan indistintamente en la técnica como “regiones” de anticuerpos o polipéptidos. Los dominios “constantes” de las cadenas ligeras de los anticuerpos se denominan indistintamente como “regiones constantes de cadena ligera”, “dominios constantes de cadena ligera”, regiones “CL” o dominios “CL”. Los dominios “constantes” de las cadenas pesadas de anticuerpos se denominan indistintamente como “regiones constantes de cadena pesada”, “dominios constantes de cadena pesada”, regiones “CH” o dominios “CH”. Los dominios “variables” de las cadenas ligeras de anticuerpos se denominan indistintamente como “regiones variables de cadena ligera”, “dominios variables de cadena ligera”, regiones “VL” o dominios “VL”. Los dominios “variables” de las cadenas pesadas de anticuerpos se denominan indistintamente como “regiones variables de cadena pesada”, “dominios variables de cadena pesada”, regiones “VH” o dominios “VH”.

Los “anticuerpos” o “inmunoglobulinas” pueden ser monoclonales o policlonales y pueden presentarse en forma monomérica o polimérica, por ejemplo, anticuerpos IgM que existen en forma pentamérica y/o anticuerpos de IgA, que se presentan en forma monomérica, dimérica o multimérica. El término “fragmento” se refiere a una parte o porción de un anticuerpo o a una cadena de anticuerpo que comprende menos residuos de aminoácidos que un anticuerpo intacto o completo o una cadena del anticuerpo. Los fragmentos pueden obtenerse a través del tratamiento químico o enzimático de un anticuerpo intacto o completo o una cadena de anticuerpos. Los fragmentos también se pueden obtener por medios recombinantes. Los fragmentos ejemplares incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fc y/o Fv.

Expresiones tales como “polinucleótido” y “molécula de ácido nucleico”, usadas indistintamente en el presente documento, se refieren a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Estos términos incluyen un ADN de cadena simple, doble o triple, ADN genómico, ADNc, ARN, ADN-ARN híbrido, o un polímero que comprende bases de purina y pirimidina, u otras bases de nucleótidos naturales, modificadas química o bioquímicamente, no naturales o derivadas. El esqueleto del polinucleótido puede comprender azúcares y grupos fosfato (como se puede encontrar típicamente en el ARN o ADN), o grupos fosfato o de azúcar modificados o sustituidos. Además, se puede obtener un polinucleótido bicatenario a partir del producto polinucleotídico monocatenario de síntesis química, ya sea sintetizando la cadena complementaria y recociendo las cadenas en condiciones apropiadas, o sintetizando la cadena complementaria de novo utilizando una ADN polimerasa con un cebador apropiado. Una molécula de ácido nucleico puede adoptar muchas formas diferentes, por ejemplo, un gen o fragmento de gen, uno o más exones, uno o más intrones, ARNm, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácidos nucleicos, y cebadores. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos, uracilo, otros azúcares y grupos de enlace, tales como fluororibosa y tioato y ramas de nucleótidos. Conforme se usa en este documento, “ADN” o “secuencia de nucleótidos” incluye no solo las bases A, T, C y G, sino que también incluye cualquiera de sus análogos o formas modificadas de estas bases, tales como nucleótidos metilados, modificaciones internucleótidas tales como enlaces no cargados y tioatos, el uso de análogos de azúcar y estructuras de esqueleto modificadas y/o alternativas, tales como poliamidas. En una realización particular, una molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión N-inteína o una variante de la misma, como se describe en el presente documento.

II. Proteínas de fusión basadas en inteína

Las inteínas son una clase de enzimas autocatalíticas descubiertas en 1990, que contienen actividades tanto de proteasa como de ligasa, que funcionan en el ciclo de vida natural de estas moléculas. Se ha demostrado que los reactivos de inteína tienen utilidad para la escisión, ligadura y circularización de sustratos peptídicos. En 1998, se descubrió una nueva clase de inteínas denominadas “inteínas divididas”, en las que la enzima se encuentra naturalmente en dos partes, denominadas N-inteína y C-inteína (medias inteínas complementarias). Mientras que las inteínas divididas se han encontrado en una amplia variedad de procariotas inferiores (Zettler J., et al., FEBS Letters, 553:909-914 (2009); Dassa B., et al., Biochemistry, 46:322-330 (2007); Choi J., et al., J Mol Biol. 556: 1093-1106 (2006); Caspi, et al., Mol Microbiol,. 50: 1569-1577 (2003); Liu X. and Yang J., J Biol Chem, 275:26315-26318 (2003); Wu H., et al., Proc Natl Acad Sci USA. 5:9226-9231 (1998)), no se han identificado inteínas divididas en eucariotas (véase la base de datos de inteínas mantenida por New England Biolabs (http://tools.neb.com/inbase/list.php)). Recientemente se han caracterizado dos inteínas divididas que son extremadamente rápidas y bastante promiscuas con respecto a las secuencias de exteínas adyacentes. Una clase es la inteína Npu DnaE (Iwai I., et al., FEBS Letters 550: 1853-1858 (2006); Zettler J., et al., FEBS Letters, 553:909-914 (2009)) y la otra, las inteínas GP41 divididas, identificadas a partir de datos metagenómicos (Carvajal-Vallejos P., et al., J. Biol. Chem. 287: 28686-28696 (2012); Publicación Internacional PCT No. WO2013045632).

Las N- y C-inteínas, con exteínas adjuntas (las dos medias proteínas que se unirán mediante la actividad de la inteína), se asocian de forma extremadamente específica y estrecha a través de múltiples interacciones entre dominios, para formar la enzima inteína activa (Shah NH, et al., J. Amer. Chem. Soc. 135: 18673-18681; Dassa B., et al., Nucl. Acids Res., 37: 2560-2573 (2009)). Además de las actividades de ligasa y proteasa presentes en la primera clase de inteínas, las inteínas divididas tienen utilidad en las separaciones de afinidad, debido a la interacción estrecha y selectiva de los dominios de las N- y C-inteínas.

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que la expresión de polipéptidos de inteína como proteínas de fusión con ciertas proteínas heterólogas, referidas aquí como contrapartidas de solubilización, aumenta la solubilidad de la inteína, por lo que la inteína es adecuada como reactivo para la cromatografía de afinidad y otras aplicaciones de purificación y modificación de proteínas que se pueden llevar a la práctica tanto a pequeña como a gran escala. De un modo más específico, la invención proporciona proteínas de fusión altamente solubles que comprenden un polipéptido de N-inteína y una contrapartida de solubilización de N-inteína, capaz de formar un complejo de inteína activa mediante la asociación con un polipéptido de C-inteína complementario.

Por consiguiente, en una realización, la presente invención se refiere a una proteína de fusión que comprende un polipéptido de N-inteína y una contrapartida de solubilización de N-inteína, como se describe en la reivindicación 1. En la técnica, se conoce una variedad de polipéptidos de N-inteína. Las N-inteínas ejemplares incluyen las N-inteínas que se muestran en la tabla 1 y otras descritas en otra parte en este documento. Las N-inteínas descritas en el presente documento, y otras N-inteínas conocidas en la técnica, así como las variantes de dichas N-inteínas que tienen aproximadamente, al menos el 75 % de identidad de secuencia (por ejemplo, aproximadamente, al menos el 80 %, aproximadamente, al menos el 90 %, a aproximadamente, al menos el 95 %, aproximadamente, al menos el 96 %, aproximadamente, al menos el 97 %, aproximadamente, al menos el 98 %, aproximadamente, al menos el 99 % de identidad de secuencia) respecto de una N-inteína de tipo salvaje, pueden incluirse en las proteínas de fusión descritas en el presente documento.

El primer aminoácido en un dominio N-terminal de la inteína suele estar muy conservado y puede ser importante para la reacción de empalme de proteínas. Sin embargo, en algunas realizaciones, el primer aminoácido en un dominio N-terminal de la inteína (por ejemplo, una cisteína, una serina) se puede sustituir con un aminoácido (por ejemplo, un aminoácido distinto de la cisteína o la serina) que evite o reduzca la escisión entre la inteína y un polipéptido heterólogo. En una realización particular, el primer aminoácido en un dominio N-terminal de inteína está sustituido con una alanina.

En una realización particular, las proteínas de fusión N-inteína descritas en este documento comprenden la N-inteína GP41-1 de tipo salvaje (SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 29) o una variante de la misma. La variante adecuada de N-inteínas GP41-1 puede tener aproximadamente, al menos el 75 % de identidad de secuencia (por ejemplo, aproximadamente, al menos el 80 %, aproximadamente, al menos el 90 %, aproximadamente, al menos el 95 %, aproximadamente, al menos el 96 %, aproximadamente, al menos el 97 %, aproximadamente, al menos el 98 %, aproximadamente, al menos el 99 % de identidad de secuencia) respecto de la N-inteína GP41-1 de tipo salvaje (SEQ ID NO: 1). Los ejemplos particulares de las variantes de las N-inteínas GP41-1 para su inclusión en las proteínas de fusión de la invención incluyen las variantes de GP41-1 que se asignan a las SEQ ID NO: 2-8 en este documento. En ciertas realizaciones, la variante de N-inteína GP41-1 carece de residuos de cisteína. En una realización particular, uno o más residuos de cisteína que ocurren naturalmente en la N-inteína GP41-1 se eliminan. En otra realización, uno o más residuos de cisteína que ocurren naturalmente en la N-inteína GP41-1 (posiciones 7, 65 y 89 de la SEQ ID NO: 1) están sustituidos con otro residuo de aminoácido (por ejemplo, treonina, lisina o asparagina). En una realización, el residuo de cisteína que se produce naturalmente en la N-inteína GP41-1 en la posición 65 de la SEQ ID NO: 1 está sustituido con otro residuo de aminoácido (por ejemplo, serina, treonina). En una realización particular, el residuo de cisteína en la posición 65 de la SEQ ID NO: 1 está sustituido con treonina. En otra realización más, el residuo de cisteína que se produce naturalmente en la N-inteína GP41-1 en la posición 89 de la SEQ ID NO: 1 está sustituido con otro residuo de aminoácido (por ejemplo, metionina, tirosina). En una realización particular, el residuo de cisteína en la posición 89 de la SEQ ID NO: 1 está sustituido con metionina. En algunas realizaciones, la variante GP41-1 es la variante de N-inteína GP41-1 NINTAA_TM (SEQ ID NO: 6) o la variante de N-inteína G P41 -1 NINTAA_TK (SEQ ID NO: 8).

En algunas realizaciones, la variante de N-inteína GP41-1 que carece de algunos o todos los residuos de cisteína es al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces o al menos 10 veces más activa que la N-inteína GP41-1 natural en las reacciones de ligadura o escisión. La actividad de inteína, ya sea por escisión o por ligadura, puede analizarse, por lo general, utilizando electroforesis en gel SDS en condiciones reductoras (por ejemplo, Zettler J., Schütz V., Mootz HD, FEBS Letters 583: 909-914, 2009; Aranko AS, Züger S, Buchinger E , Iwai H, ^pL^oS ONE 4: e5185, 2009). Para ser breves, las reacciones de inteína, por lo general en el transcurso del tiempo, se detienen mediante la adición de un tampón de carga de gel SDS que contenga un agente reductor (por ejemplo, ditiotreitol o p-mercaptoetanol), las muestras se hierven para desnaturalizarlas por completo y luego se cargan en un gel de poliacrilamida que contiene SDS junto con marcadores de tamaño de proteína apropiados. Una vez completada la electroforesis, las proteínas de la reacción se separaron de acuerdo con sus pesos moleculares y se pueden visualizar mediante tinción con tintes tradicionales o fluorescentes. Las cantidades de los diversos productos intermedios y productos en función del tiempo se pueden cuantificar mediante densitometría e intensidades en función del tiempo convertidas en tasas enzimáticas (kobs), mediante la aplicación de un programa de ajuste de curvas.

Tabla 1. Ejemplares de las divisiones divididas GP41 -1 y sus variantes

Típicamente, los polipéptidos de N-inteína tienen poca solubilidad cuando se expresan en sistemas de expresión comunes, tales como la E. coli. La presente invención evita este problema, por ejemplo, expresando la N-inteína como una proteína de fusión con una contrapartida de solubilización de N-inteína, lo que aumenta la solubilidad de la N-inteína (por ejemplo, cuando se expresa en la E. coli). Preferiblemente, la contrapartida de solubilización de la N-inteína aumenta la solubilidad del polipéptido de N-inteína, de manera que menos de aproximadamente el 25 % en masa de la proteína de fusión resultante esté presente en los cuerpos de inclusión después de la producción en el sistema de expresión (por ejemplo, E. coli). El experto en la técnica puede determinar fácilmente el porcentaje en masa de una proteína expresada que está presente en los cuerpos de inclusión, después de la producción en un sistema de expresión utilizando técnicas y reactivos estándar.

Una persona con los conocimientos comunes en la técnica puede seleccionar fácilmente posibles las contrapartidas de solubilización que pueden aumentar la solubilidad de una N-inteína dada, usando procedimientos conocidos en este ámbito y descritos en el presente documento. Por ejemplo, la probabilidad de generar un producto soluble tras la sobreexpresión en un sistema de expresión (por ejemplo, E. coli) se puede calcular utilizando el algoritmo de Wilkinson y Harrison (Wilkinson DL y Harrison RG, Bio/Technology, 9: 443, 1991). La predicción de si la proteína contiene una señal de secreción funcional se puede realizar utilizando el algoritmo SignalP 4.1, disponible en el Centro de Análisis de Secuencias Biológicas de la Universidad Técnica de Dinamarca (http://genome.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ ). Véanse también los métodos descritos en los ejemplos 1-3 detallados en el presente documento. En última instancia, las contrapartidas de solubilización que proporcionan una mejora óptima de la solubilidad, al tiempo que permiten la actividad catalítica de la inteína máxima deben seleccionarse de las contrapartidas de solubilización candidatas a través de la selección experimental.

Las contrapartidas de solubilización de la N-inteína que tienen ciertas propiedades físicas son particularmente adecuadas para su inclusión en las proteínas de fusión de la invención. Dichas propiedades físicas incluyen un peso molecular inferior a 15 kDa aproximadamente, un valor de índice alifático (AI) inferior a 60 aproximadamente, y un valor de GRAVY que es inferior a -1. Una persona con los conocimientos comunes en esta técnica puede determinar cada una de estas propiedades para una contrapartida de solubilización dada, usando ensayos y técnicas estándar, por ejemplo, utilizando la herramienta en línea ProtParam (http://web.expasy.org/tools/protparam/) que es parte del conjunto de herramientas de bioinformática SwissProt ExPASy.

El gran promedio de hidropaticidad (GRAVY) (Kyte J y Doolittle RF., J. Mol. Biol. 157: 105, 1982) de una secuencia de polipéptido lineal se calcula como la suma de los valores de hidropatía de todos los aminoácidos, dividida Por el número de residuos en la secuencia. El aumento de la puntuación positiva indica mayor hidrofobicidad. El cálculo se basa en la escala de Kyte-Doolittle. GRAVY es un método simple para mostrar el carácter hidropático de una proteína.

En diversas realizaciones, las proteínas de fusión de N-inteína descritas en el presente documento tienen un valor GRAVY que es menor que -1.

El índice alifático (Ikai, AJ., J. Biochem. 88: 1895, 1980) de una proteína se define como el volumen relativo ocupado por las cadenas laterales alifáticas (alanina, valina, isoleucina y leucina). Puede considerarse como un factor positivo para el aumento de la termoestabilidad de las proteínas globulares. El índice alifático de una proteína se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula: índice alifático = X(Ala) a * X(Val) b * (X(Ile) X (Leu)). * Los coeficientes a y b son el volumen relativo de la cadena lateral de valina (a = 2,9) y de las cadenas laterales de Leu/Ile (b = 3.9) a la cadena lateral de alanina. La probabilidad de generar un producto soluble tras la sobreexpresión en la E. coli también se puede calcular utilizando el algoritmo de Wilkinson y Harrison (Wilkinson DL y Harrison RG., Bio/Technology, 9 : 443, 1991). Otros algoritmos disponibles no necesariamente dan resultados similares. En diversas realizaciones, las proteínas de fusión de N-inteína descritas en este documento tienen un valor de índice alifático (AI) menor que aproximadamente 60, y un valor GRAVY que es menor que -1.

Con preferencia, la contrapartida de solubilización de N-inteína tiene un peso molecular inferior a 15 kDa aproximadamente, un valor de índice alifático inferior a 60 °C aproximadamente.

Los ejemplos de contrapartidas de solubilización de N-inteína particulares se describen en la tabla 2.

Tabla 2. Contrapartidas ejemplares de solubilización de N-inteína

En una realización particular, la contrapartida de solubilización de N-inteína es, o comprende, toda o una parte de la contrapartida de solubilización 138 (SEQ ID NO: 15), o una variante de la misma (por ejemplo, la contrapartida de solubilización 138 GKL22GCKL (SEQ ID NO: 16); contrapartida de solubilización 138 GYQ48GCYQ (SEQ ID NO: 17); contrapartida de solubilización 138 GYQ48GCGY (SEQ ID NO: 18)).

Los métodos para preparar proteínas de fusión, o quiméricas, son bien conocidos en la técnica, incluidas, entre otras, técnicas estándar de ADN recombinante. Por ejemplo, los fragmentos de ADN que codifican diferentes secuencias de proteínas (por ejemplo, una N-inteína y una contrapartida de solubilización de N-inteína; una C-inteína y una molécula diana) se unen entre sí en el marco, de acuerdo con las técnicas convencionales. En otra realización, el gen de fusión puede sintetizarse mediante técnicas convencionales, que incluyen sintetizadores de ADN automatizados. Alternativamente, la amplificación por PCR de los fragmentos de ácido nucleico puede llevarse a cabo utilizando cebadores de anclaje que dan lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos de ácido nucleico consecutivos, que posteriormente se pueden recocer y volver a amplificar para generar una secuencia de ácido nucleico quimérica (véase Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1992). Además, hay muchos vectores de expresión disponibles comercialmente que ya codifican un resto de fusión (por ejemplo, un resto GST, un resto Fc).

Con preferencia, la proteína de fusión se expresa a partir de un ácido nucleico codificante en células huésped procarióticas o eucariotas transfectadas o establemente transfectadas o estables o en organismos no humanos. Las células hospedadoras comunes o los organismos no humanos para la expresión de proteínas recombinantes incluyen, por ejemplo, Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Pseudomonas fluorescens, Lactococcus lactis, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Zea maize, Nicotinia tabacum, Daucus carota, células SF9, células CHO (por ejemplo, células CHO DG44, células CHO DXB11), células NS0, células HEK 293 y animales no humanos completos, como vacas y cabras. En una realización, la proteína de fusión N-inteína se expresa en E. coli. Luego, la proteína de fusión N-inteína expresada se puede purificar, separándola de las proteínas celulares contaminantes utilizando métodos convencionales de separación y cromatografía, como la clarificación por filtración profunda, la purificación por anión y la cromatografía de intercambio catiónico y la concentración por ultrafiltración.

La proteína heteróloga (por ejemplo, la contrapartida de solubilización de N-inteína, molécula diana) puede fusionarse a cualquier extremo del polipéptido de inteína. En una realización, una contrapartida de solubilización de N-inteína se une al extremo N-terminal de un polipéptido de N-inteína. En otra realización, una contrapartida de solubilización de N-inteína se une al término C de un polipéptido de N-inteína.

En algunas realizaciones, el polipéptido de inteína (por ejemplo, N-inteína, C-inteína) y la proteína heteróloga (por ejemplo, la contrapartida de solubilización de N-inteína, molécula diana) se unen directamente a través de un enlace peptídico. En otras realizaciones, la proteína de fusión incluye una molécula espaciadora o enlazadora entre el polipéptido de inteína (por ejemplo, N-inteína, C-inteína) y la proteína heteróloga (por ejemplo, la contrapartida de solubilización de N-inteína, molécula diana). Las moléculas espaciadoras/enlazadoras adecuadas son conocidas en la técnica.

En las proteínas de fusión descritas en el presente documento, el dominio N-terminal de la inteína se puede fusionar directamente (por ejemplo, a través de un enlace peptídico) o indirectamente (por ejemplo, a través de una secuencia de aminoácidos de enlace) a un polipéptido heterólogo. Por lo tanto, en algunas realizaciones, un polipéptido heterólogo se fusiona directa o indirectamente al extremo N de un dominio N-terminal de la inteína. En ciertas realizaciones, el primer aminoácido del polipéptido heterólogo se selecciona del grupo que consiste en Met, Cys, Thr, Arg, Lys, Ser, GIn, His, Ala, Tyr, Phe, Asn, Trp, Val, Leu, Asp , He, Gly, Glu y Pro.

En algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende un enlace entre el polipéptido heterólogo y la secuencia de inteína. Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender un conector entre el término C de la proteína heteróloga y el término N del dominio N-terminal de la inteína. El enlace puede tener, por ejemplo, una longitud de entre alrededor de 1 y aproximadamente 10 aminoácidos. En algunas realizaciones, el enlace puede tener una longitud de entre alrededor de 1 y aproximadamente 5 aminoácidos. Por ejemplo, el enlace puede contener 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos. En algunas realizaciones, el último aminoácido del enlace que contacta con el polipéptido heterólogo y el extremo N del dominio N-terminal de una inteína se selecciona del grupo que consiste en Met, Cys, Thr, Arg, Lys, Ser, GIn, His, Ala, Tyr, Phe, Asn, Trp, Val, Leu, Asp, Ile, Gly, Glu y Pro.

En algunas realizaciones, el enlace puede comprender una secuencia de exteína. En algunas realizaciones, el enlace puede comprender una secuencia de exteína nativa. En algunas realizaciones, la exteína comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID NOS: 4, 8, 13, 17, 21, 25, 35 y 39 del documento de patente WO201345632. En algunas realizaciones, un enlace que comprende aminoácidos de una exteína comprende, por ejemplo, el primero (es decir, N-terminal) de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 aminoácidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 8, 13, 17, 21, 25, 35 y 39. En algunas realizaciones, el enlace comprende aproximadamente 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 8, 13, 17, 21, 25, 35 y 39. En algunas realizaciones, una proteína de fusión comprende un dominio de inteína y un dominio de exteína que se encuentran juntos en la naturaleza (por ejemplo, una N-inteína GP41-1 y una C-inteína GP41-1). En otras realizaciones, una proteína de fusión comprende un dominio de inteína y un dominio de exteína, que no se encuentra junto con ese dominio de inteína particular en la naturaleza, también denominado en este documento un “dominio de exteína heterólogo”. A modo de ejemplo, una proteína de fusión puede comprender un dominio de inteína GP41 -1 y un dominio de exteína IMPDH.

Las proteínas de fusión de la invención pueden incluir, además, opcionalmente uno o más rótulos detectables. Los rótulos adecuados para su uso de acuerdo con la presente invención son conocidos en la técnica y, por lo general, incluyen cualquier molécula que, por su naturaleza química, y ya sea por medios directos o indirectos, proporcione una señal identificable que permita la detección de una proteína. Así, por ejemplo, las proteínas de fusión se pueden rotular de una manera convencional, como con moléculas reporteras específicas, fluoróforos, materiales radiactivos o enzimas (por ejemplo, peroxidasas, fosfatasas). En una realización particular, las proteínas de fusión incluyen uno o más colorantes fluorescentes como rótulos detectables. Los métodos estándar para modificar una proteína para incluir un rótulo detectable son conocidos en la técnica.

En diversas realizaciones, la invención se refiere, además, a un ácido nucleico aislado, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión de la invención, un vector de expresión que comprende dichos ácidos nucleicos y una célula huésped que lleva dichos vectores de expresión.

III. Matrices de cromatografía de afinidad que comprenden proteínas de fusión N-inteína

Las proteínas de fusión descritas en el presente documento que contienen polipéptidos de N-inteína y contrapartidas de solubilización de N-inteína tienen utilidad, entre otras cosas, como ligandos para aplicaciones de cromatografía de afinidad. Por consiguiente, la presente invención, en ciertas realizaciones, proporciona matrices de cromatografía de afinidad que comprenden una proteína de fusión, la cual comprende un polipéptido de N-inteína y una contrapartida de solubilización de N-inteína unida a un soporte sólido.

En una realización particular, el soporte sólido es una resina de cromatografía. En una cierta realización, la resina de cromatografía incluye una base hidrófila de poliviniléter. Las resinas de cromatografía adecuadas que tienen una base hidrófila de poliviniléter incluyen, aunque no taxativamente, resinas ESHMUNO® (EMD Millipore Corporation). En otra realización, la resina de cromatografía es un medio polimérico basado en metacrilato sintético (por ejemplo, cuentas con un tamaño de partícula en el intervalo de 20-40 |um aproximadamente o de alrededor de 40-90 |um). En algunas realizaciones, la resina de cromatografía tiene funcionalidad de ácido carboxílico. Las resinas de cromatografía adecuadas que tienen funcionalidad de ácido carboxílico incluyen, aunque no taxativamente, resinas COO de FRACTOGEL® (EMD Millipore Corporation).

Otros soportes sólidos adecuados para las matrices de cromatografía de afinidad de la invención pueden incluir, por ejemplo, vidrio de poros controlados, sílice, óxido de circonio, óxido de titanio, agarosa, polimetacrilato, poliacrilato, poliacrilamida, alcohol polivinílico y poliestireno, así como sus derivados (por ejemplo, sus aleaciones).

Un material poroso utilizado como soporte sólido puede comprender un compuesto hidrófilo, un compuesto hidrófobo, un compuesto oleófobo, un compuesto oleófilo o cualquier combinación de los mismos. El material poroso puede comprender un polímero o un copolímero. Los ejemplos de materiales porosos adecuados incluyen, aunque no taxativamente, poliéter sulfona, poliamida, por ejemplo, nailon, polisacáridos, tales como, por ejemplo, agarosa y celulosa, poliacrilato, polimetacrilato, poliacrilamida, polimetacrilamida, politetrafluoroetileno, polisulfona, poliéster, fluoruro de polivinilideno, polipropileno, polietileno, alcohol polivinílico, policarbonato, polímero de un fluorocarbono, por ejemplo, poli(tetrafluoroetileno-co-perfluoro(alquil vinil éter)), vidrio, sílice, circonia, óxido de titanio, cerámica, metal y sus aleaciones.

El material poroso puede comprender una molécula orgánica o inorgánica o una combinación de moléculas orgánicas e inorgánicas y puede comprender uno o más grupos funcionales, por ejemplo, un grupo hidroxilo, un grupo tiol, un grupo amino, un grupo carbonilo o un grupo ácido carboxílico, adecuado para reaccionar, por ejemplo, formando enlaces covalentes para una modificación química adicional, con el fin de unirse covalentemente a una proteína. En otra realización, el material poroso puede no poseer un grupo funcional, pero puede estar recubierto con una capa de material que lleve grupos funcionales, tales como un grupo hidroxilo, un grupo tiol, un grupo aminoácido, un grupo carbonilo o un grupo ácido carboxílico.

En algunas realizaciones, se usa una matriz de separación por afinidad convencional, por ejemplo, de naturaleza orgánica y basada en polímeros que exponen una superficie hidrófila a los medios acuosos usados, por ejemplo, exponen grupos hidroxi (-OH), carboxi (-COOH), carbonilo (-CHO, o RCO-R'), carboxamido (-CONH2, posiblemente en formas N-sustituidas), amino (-NH2, posiblemente en forma sustituida), oligo- o polietilenoxi en sus superficies externos y, si están presentes, también en sus superficies internas. En una realización, los polímeros pueden basarse, por ejemplo, en polisacáridos, tales como dextrano, almidón, celulosa, pululano, agarosa, etc., que se han reticulado ventajosamente, por ejemplo con bisepóxidos, epihalohidrinas, bromuro de alilo, éter alilglicídico hidrocarburos inferiores sustituidos con 1,2,3-trihalo, para proporcionar una porosidad y rigidez adecuadas. En otra realización, el soporte sólido comprende cuentas de agarosa porosas. Los diversos soportes utilizados en la presente invención pueden prepararse fácilmente, de acuerdo con métodos estándar conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, la gelificación en suspensión inversa descrita, por ejemplo, en Hjerten, Biochim Biophys Acta 79 (2), 393-398 (1964). Alternativamente, las matrices base pueden ser productos disponibles comercialmente, como los medios FastFlow SEPHAROSE™ (GE Healthcare, Uppsala, Suecia). En algunas realizaciones, particularmente ventajosas para separaciones a gran escala, el soporte está adaptado para aumentar su rigidez y, por lo tanto, hace que la matriz sea más adecuada para altas velocidades de flujo.

De un modo alternativo, el soporte sólido se puede basar en polímeros sintéticos, como alcohol polivinílico, polihidroxialquil-acrilatos, polihidroxialquil-metacrilatos, poliacrilamidas, polimetacrilamidas, etc. En el caso de los polímeros hidrófobos, tales como las matrices basadas en bencenos sustituidos con divinilo y monovinilo, la superficie de la matriz a menudo se hidrofiliza, para exponer grupos hidrofílicos, como se los definió con anterioridad, a un líquido acuoso circundante. Dichos polímeros pueden producirse fácilmente de acuerdo con métodos estándar, véase, por ejemplo, Arshady, Chimica e L’Industria 70 (9), 70-75 (1988). De un modo alternativo, se puede usar un producto disponible comercialmente, como SOURCE™ (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) y la resina POROS (Applied Biosystems, Foster City, CA).

En otras realizaciones más, el soporte sólido comprende un soporte de naturaleza inorgánica, por ejemplo, sílice, óxido de circonio, óxido de titanio y sus aleaciones. La superficie de las matrices inorgánicas a menudo se modifica para incluir grupos reactivos adecuados. Los ejemplos incluyen CM Zirconia (Ciphergen-BioSepra (Cergypontoise, Francia)) y soportes CPG® (Millipore Corporation).

En algunas realizaciones, el soporte sólido puede basarse, por ejemplo, en zirconia, óxido de titanio o sílice en forma de vidrio de poro controlado, que puede modificarse para que contenga grupos reactivos y/o admita el empapado cáustico, para acoplarse a los ligandos.

Los formatos de soporte sólido ejemplares incluyen, aunque no taxativamente, una cuenta (esférica o irregular), una fibra hueca, una fibra sólida, una almohadilla, un gel, una membrana, un casete, una columna, un chip, un portaobjetos, un plato o un monolito.

Con respecto al formato de una matriz, en una realización, está en forma de un monolito poroso. En una realización alternativa, la matriz está en forma de cuentas o partículas que puede ser porosas o no porosas. Las matrices en forma de cuentas o partículas se pueden usar como lecho compacto o en forma suspendida. Las formas suspendidas incluyen aquellas conocidas como lechos expandidos y suspensiones puras, en las cuales las partículas o cuentas pueden moverse con libertad. En el caso de monolitos, lechos compactados y lechos expandidos, el procedimiento de separación comúnmente sigue la cromatografía convencional con un gradiente de concentración. En el caso de una suspensión pura, se utilizará el modo discontinuo. Además, se puede usar un soporte sólido en formas tales como una superficie, un chip, un capilar o un filtro.

La matriz también podría estar en forma de membrana en un cartucho. La membrana podría estar en formato de lámina plana, espiral o fibra hueca.

En ciertas realizaciones, el soporte sólido puede ser un soporte soluble, por ejemplo, un polímero soluble o un polímero soluble en agua. Los soportes solubles ejemplares incluyen, aunque no taxativamente, un biopolímero tal como, por ejemplo, una proteína o un ácido nucleico. El polímero también puede ser un polímero soluble sintético, tal como, por ejemplo, incluso aunque no en forma taxativa, un polímero que contenga grupos cargados negativamente (carboxílico o sulfónico), grupos cargados positivamente (amina cuaternaria, amina terciaria, grupos secundarios o primarios), grupos hidrófobos (grupos fenilo o butilo), grupos hidrófilos (grupos hidroxilo o amino) o una combinación de los anteriores. Se pueden encontrar polímeros solubles sintéticos ejemplares en la publicación internacional PCT n.° WO2008091740 y en la publicación estadounidense n° US20080255027, cuyas enseñanzas completas se incorporan aquí como referencia.

En algunas realizaciones, el soporte sólido puede incluir una molécula de avidina (por ejemplo, estreptavidina) y la proteína de fusión N-inteína puede comprender una etiqueta de biotina (por ejemplo, una molécula de biotina unida covalentemente a la contrapartida de solubilización en la proteína de fusión), de tal manera que la unión de la proteína de fusión al soporte sólido se logre a través de la interacción de las moléculas de avidina y biotina.

Las proteínas de fusión de N-inteína de la invención se pueden unir al soporte sólido en un solo sitio en la proteína de fusión (unión de punto único) o en más de un sitio en la proteína de fusión (unión multipunto). Con preferencia, el polipéptido de N-inteína en la proteína de fusión está orientado aleado del soporte sólido, cuando la proteína de fusión está unida al soporte sólido. Por ejemplo, se pueden colocar grupos de aminoácidos reactivos únicos (por ejemplo, residuos de cisteína) en la contrapartida de solubilización, en ubicaciones que son distales a la región activa del dominio N-inteína, para garantizar que la N-inteína se aleje del soporte sólido.

Con preferencia, el o los sitios (por ejemplo, grupos de aminoácidos reactivos únicos) en la proteína de fusión que participan en la unión al soporte sólido se encuentran exclusivamente en la contrapartida de solubilización de N-inteína. Por consiguiente, para lograr esto, puede ser necesario modificar el polipéptido de N-inteína para eliminar el aminoácido que proporciona el sitio reactivo único (por ejemplo, cisteína), por ejemplo, mediante la eliminación o sustitución de dichos aminoácidos, dondequiera que se encuentren en el N-inteína. Los métodos para eliminar o sustituir aminoácidos en una proteína son bien conocidos en la técnica.

La proteína de fusión de N-inteína inmovilizada puede ser adecuada para separaciones cromatográficas de columna o de múltiples pocillos o puede ser paramagnética, de modo que pueda capturarse desde la solución mediante la aplicación de un campo magnético.

Se puede usar cualquier técnica adecuada para unir una proteína de fusión descrita en este documento a un soporte, por ejemplo, un soporte sólido que incluye aquellos que son de amplio conocimiento en la técnica y descritos en el presente documento. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la proteína de fusión puede unirse a un soporte mediante técnicas de acoplamiento convencionales que utilizan, por ejemplo, grupos tiol, amino y/o carboxi presentes en la proteína de fusión. Por ejemplo, los bisepóxidos, epiclorhidrina, CNBr, N-hidroxisuccinimida (NHS), etc., son reactivos de acoplamiento muy conocidos. En algunas realizaciones, se introduce un espaciador entre el soporte y la proteína de fusión, lo cual mejora la disponibilidad de la proteína de fusión y facilita el acoplamiento químico de la proteína de fusión al soporte.

La unión de una proteína de fusión N-inteína a un soporte sólido se puede lograr de muchas maneras diferentes, la mayoría de las cuales son bien conocidas en la técnica, así como las descritas en el presente documento. Véase, por ejemplo, Hermanson et al., Immovilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press, pp. 51-136 (1992). Por ejemplo, los ligandos de proteínas se pueden acoplar a un soporte sólido a través de grupos activos ya sea sobre la superficie del soporte sólido o bien al ligando de las proteínas, como, por ejemplo, grupo hidroxilo, tiol, epóxido, amino, carbonilo, epóxido o ácido carboxílico. La unión se puede lograr usando químicas conocidas, que incluyen, entre otros, el uso de bromuro de cianógeno (CNBr), éster de N-hidroxi succinimida, activación de epoxi (bisoxirano) y aminación reductora.

En una realización particular, se usa una resina de cromatografía (por ejemplo, cuentas) que tiene grupos ácido carboxílico (-COOH) o amino (-NH2). En una realización adicional, la resina de cromatografía también tiene grupos hidroxilo (-OH) y/u otro grupo funcional que se puede convertir en -COOH o -NH2 o -OH.

En algunas realizaciones, el acoplamiento de proteínas dirigido por tiol se puede usar para unir la proteína de fusión N-inteína de la invención a un soporte sólido. El acoplamiento de proteínas dirigido a tiol se ha descrito en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Ljungquist, et al., Eur. J. Biochem. Vol. 186, pp. 558-561 (1989). Se sabe que las maleimidas reaccionan selectivamente con grupos tiol, a pH 7,0-7,5. Con un pH > 8, también pueden reaccionar con grupos de aminas y, además, tienden a hidrolizarse (Greg T. Hermanson, Bioconjugation Techniques, Academic Press, 2008; Ian Johnson, Michelle T.Z. Spence, Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 2010). Por debajo del pH 8, las yodoacetamidas también son altamente selectivas hacia los grupos tiol (Greg T. Hermanson, Bioconjugation Techniques, Academic Press, 2008; Ian Johnson, Michelle T.Z. Spence, Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 2010). Sin embargo, las yodoacetamidas son intrínsecamente inestables en la luz y la mayoría de los enlaces disponibles comercialmente no son solubles en agua y/o son muy caros. Dado que la selectividad de la yodoacetamida hacia los grupos tiol no es superior a la maleimida, la maleimida suele ser la mejor opción para la fabricación a gran escala. En algunas realizaciones, el ligando de N-inteína se puede acoplar a AMP o FG-COO activado con yodoacetamida a través de un único grupo sulfhidrilo disponible en el dominio de solubilización. La densidad del ligando de la resina derivada se puede calcular midiendo el agotamiento de una proteína de fusión que contenga la C-inteína de la solución. Hasta la fecha, se ha logrado una densidad de ligando de N-inteína no optimizada de 1 g/litro de FG-COO. Muchas proteínas también se han acoplado con éxito a resinas activadas con epoxi, tales como FRACTOGEL® Epoxy. El epóxido reacciona con grupos amino primarios, grupos hidroxilo y sulfhidrilo y produce matrices de afinidad muy estables (PV Kuznetsov 1993. Pharmaceutical Chemistry Journal 27: 439-52).

En algunas realizaciones, los ligandos de proteínas pueden acoplarse a un soporte sólido a través de un enlace intermedio. El enlace puede comprender al menos un grupo funcional acoplado a un resto de enlace. El resto de enlace puede comprender cualquier molécula capaz de ser acoplada a un grupo funcional. Por ejemplo, el resto de enlace puede incluir un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo, cualquiera de ellos. El resto de enlace puede comprender una cadena de carbono, que varía de 1 a 30 átomos de carbono. En algunas realizaciones, el enlace puede comprender más de 30 átomos de carbono. El resto de enlace puede comprender al menos un heteroátomo, tal como nitrógeno, oxígeno y azufre. El resto de unión puede comprender una cadena ramificada, una cadena no ramificada o una cadena cíclica. El resto de enlace puede estar sustituido con dos o más grupos funcionales.

La elección de las condiciones apropiadas de tampón para acoplar un ligando de proteína a un soporte sólido está dentro de la capacidad del experto en la técnica. Los tampones adecuados incluyen cualquier tampón que no contenga amina, tal como los tampones de carbonato, bicarbonato, sulfato, fosfato y acetato. Cuando se utiliza la química asociativa, la concentración de sal del tampón dependerá del grupo asociativo utilizado. Por ejemplo, la concentración de sal puede estar en el rango de 5 nM-100 mM. Cuando se usa una especie cargada, la concentración de sal puede ser de al menos 5 nM pero de menos de 0,1 M, al menos 5 nM pero menos de 0,01 M, al menos 5 nM pero menos de 0,001M. En ciertas realizaciones, la concentración de sal puede ser de 0,01 M. Cuando se usa una especie hidrófoba, por lo general, es conveniente una alta concentración de sal. Por lo tanto, la concentración de sal puede ser mayor que 0,001 M, mayor que 0,01 M, o mayor que 0,1 M.

En algunas realizaciones, cuando se usa química asociativa, la reacción se realiza a una temperatura que varía de 0 °C a 99 °C. En ciertas realizaciones, el método de reacción se pone en práctica a una temperatura inferior a 60 °C, inferior a 40 °C, inferior a 20 °C, o inferior a 10 °C. En algunas realizaciones, el método de la invención se pone en práctica a una temperatura de 4 °C aproximadamente. En otras realizaciones, el método de la invención se pone en práctica a una temperatura de 20 °C.

En otras realizaciones, la proteína de fusión N-inteína se puede combinar con varios modificadores (membranas, superficies poliméricas, fluorescentes u otros rótulos de detección) en combinación con productos químicos de reticulación o condensación apropiados para formar un aducto covalente que incluya a proteína de fusión N-inteína y el modificador.

IV. Métodos para usar las proteínas de fusión basadas en inteínas de la invención

Las proteínas de fusión descritas en el presente documento que contienen polipéptidos de N-inteína y contrapartidas de solubilización de N-inteína, y las matrices de cromatografía de afinidad que comprenden dichas proteínas de fusión, tienen utilidad, entre otras cosas, en los métodos de purificación por afinidad, métodos de selección de complejos de inteína dividida activa adecuadas para uso en métodos de purificación por afinidad y métodos de escisión y ligadura peptídicos, como se describe más adelante en este documento.

Por consiguiente, la presente descripción, en ciertas realizaciones, se refiere a un método de purificación por afinidad de una molécula diana en una muestra. En un aspecto de esta realización, el método comprende: a) proporcionar una muestra que contiene una primera proteína de fusión, que comprende un polipéptido de C-inteína unido a una molécula diana mediante un enlace peptídico; b) poner en contacto la muestra con una matriz de cromatografía de afinidad que comprende una segunda proteína de fusión, en donde la segunda proteína de fusión comprende un polipéptido de N-inteína unido por un enlace peptídico a una contrapartida de solubilización de N-inteína que promueve la solubilidad del polipéptido de N-inteína, en condiciones en las que el polipéptido de C-inteína en la primera proteína de fusión se une selectivamente al polipéptido de N-inteína en la segunda proteína de fusión, para formar un complejo de inteína que es inactivo; c) lavar la matriz de cromatografía de afinidad que contiene el complejo de inteína inactivo, para eliminar los contaminantes no unidos; d) exponer el complejo de inteína a condiciones en las que el complejo de inteína es activo y escinde la molécula diana del polipéptido de C-inteína y e) recuperar la molécula diana escindida.

La proteína de fusión que comprende un polipéptido de N-inteína unido a una contrapartida de solubilización de N-inteína puede ser cualquiera de las proteínas de fusión de N-inteína descritas en otra parte en el presente documento.

La muestra que contiene la proteína de fusión que comprende un polipéptido de C-inteína unida a una molécula diana puede ser cualquier muestra adecuada (por ejemplo, muestra biológica). En una realización, la muestra es una preparación o mezcla de proteína sin procesar (por ejemplo, un extracto celular).

La molécula diana puede ser cualquier biomolécula de interés. A modo de ejemplo, las biomoléculas de interés pueden incluir proteínas y ensamblajes biomoleculares (por ejemplo, producidos por tecnología de ADN recombinante), como, por ejemplo, hormonas (por ejemplo, insulina, hormona de crecimiento humana, eritropoyetina, interferones, factor estimulante de colonias de granulocitos, activador de plasminógeno tisular), anticuerpos monoclonales (mAb) y derivados de mAb (por ejemplo, mAb bi-específicos, Fab, scFv, anticuerpos de tiburones y camélidos), productos terapéuticos derivados de andamios (por ejemplo, DARPins, Affibodies, anticalins), enzimas terapéuticas (por ejemplo, galactosidasa alfa A, alfa-L-iduronidasa, N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa, glucocerebrosidasa), toxinas (por ejemplo, botulinum, CRM 197, ricina), vacunas recombinantes (por ejemplo, ántrax, difteria, tétanos, neumonía, virus de la hepatitis B, virus del papiloma humano ), partículas similares a virus (por ejemplo, hepatitis B, papiloma humano, influenza, parvovirus, virus Norwalk), así como enzimas industriales (por ejemplo, papaína, bromelina, tripsina, proteinasa K, enzima BENZONASE™, enzima DENERASE™, ureasa, pepsina, etc.) y reactivos de diagnóstico (por ejemplo, glucosa y lactato deshidrogenasa, ADN polimerasas, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, enzimas de restricción, anticuerpos derivados de hibridomas, etc.). En una realización particular, la molécula diana es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal) a una diana terapéutica.

Dependiendo de la inteína particular utilizada (por ejemplo, especie Synechocystis (Ssp) DnaB, Nostoc punctiforme (Npu) DnaE, GP41-1), las condiciones de carga, lavado, escisión y elución difieren significativamente. No obstante, los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente las condiciones apropiadas de carga, lavado, escisión y elución para una inteína particular. Las condiciones adecuadas (por ejemplo, concentración de agentes caotrópicos y reductores/oxidantes, iones metálicos (por ejemplo, cinc, calcio, estroncio, magnesio, manganeso), agentes excluyentes de volumen (por ejemplo PEG, PVP, dextrano), detergentes, sales, temperatura y pH) para inteínas particulares incluyen, aunque no taxativamente, las condiciones descritas a continuación. Para la inteína GP41-1 en particular, se sabe que la actividad no se ve afectada relativamente por un pH variable en el rango de 6-10 (Carvajal-Vallejos P., et al., J. Biol. Chem. 287: 28686-28696 (2012)).

Un experto en la técnica puede determinar las condiciones en las cuales el polipéptido de C-inteína en la primera proteína de fusión se une selectivamente al polipéptido de N-inteína en la segunda proteína de fusión para formar un complejo de inteína catalíticamente inactivo, para una inteína dada. En general, para el proceso a escala industrial, el cambio de temperatura durante una separación cromatográfica se considera poco práctico, ya que el cambio resultaría en un largo paso de equilibrio para garantizar que la columna y la temperatura del empaque sean uniformes en todo momento. Las condiciones de unión ejemplares incluyen: a) una temperatura variable en el rango de aproximadamente 4-25 °C, y un tampón que comprenda Tris/HCl 50 mM, NaCl 300 mM, EDTA 1 mM, glicerol al 10 % (v/v), DTT 2 mM, pH = 7 (por ejemplo, para GP41 -1, véase Carvajal-Vallejos P., et al., J. Biol. Chem. 287: 28686-28696 (2012)); b) una temperatura variable en el rango de 4-25 °C aproximadamente y un tampón que comprenda NaAc 50 mM, NaCl 0,5 M, pH = 5 (por ejemplo, para la inteína DnaB, véase Lu W., et al., J. Chrom. A, 1218: 2553-2560 (2011)) y c) una temperatura variable en el rango de 4-25 °C aproximadamente y un tampón que comprenda NaCl 0,5 M, Tris-HCl 10 mM, cloruro de zinc 0,5 mm, pH = 8 (por ejemplo, para Npu DnaE, véase Guan D., et al., Biotech. Bioeng. 110: 2471-2481 (2013)).

De un modo similar, las condiciones que promueven la actividad catalítica del complejo de inteína pueden variar dependiendo de las inteínas utilizadas y pueden ser determinadas por un experto en la técnica. Las condiciones ejemplares para promover la actividad de la inteína catalítica incluyen: a) un tampón que comprenda Tris-HCl 50 mM, pH = 7,0, NaCl 300 mM, EDTA 1 mM; b) un tampón, que comprenda L-arginina 0,3 M, EDtA 5 mM, un tampón fosfato 50 mM, pH = 6,5 y c) un tampón que comprenda NaCl 0,5 M, Tris-HCl 10 mM, DTT 50 mM, pH = 8,0.

En un aspecto de esta realización, el método puede comprender, además, limpiar, regenerar y/o almacenar las matrices de cromatografía de afinidad de la invención. Típicamente, una matriz de cromatografía de afinidad puede limpiarse en condiciones alcalinas o ácidas, dependiendo de la composición de la matriz. Un experto en la técnica puede determinar las condiciones adecuadas para limpiar, regenerar, restaurar y/o almacenar una matriz de afinidad.

Un método de purificación de afinidad ejemplar se proporciona en la figura 1 y el ejemplo 10 descritos en el presente documento.

En otra realización más, la descripción se refiere a un método de selección de un complejo de inteína catalíticamente activo, que es adecuado para uso en purificación por afinidad. En un aspecto de esta realización, el método comprende: a) poner en contacto una primera proteína de fusión que comprende un polipéptido de C-inteína unido a una molécula diana mediante un enlace peptídico, con una segunda proteína de fusión que comprende un polipéptido de N-inteína unido a una Contrapartida de solubilización de N-inteína por un enlace peptídico, en condiciones en las que el polipéptido de C-inteína en la primera proteína de fusión se une selectivamente al polipéptido de N-inteína en la segunda proteína de fusión, para formar un complejo de inteína y b) determinar si la molécula diana se escinde del polipéptido de C-inteína en condiciones que promueven la actividad de inteína, en donde la presencia de la molécula diana escindida es indicativa de un complejo de inteína catalíticamente activo. Las N-inteínas y las C-inteínas empleadas en el método de esta realización pueden ser cualquier par de inteínas divididas complementarias, tales como, por ejemplo, los pares de inteína divididos descritos en este documento (por ejemplo, la N-inteína GP41-1 y las C-inteínas).

Las condiciones en las cuales el polipéptido de C-inteína en la primera proteína de fusión se une selectivamente al polipéptido de N-inteína en la segunda proteína de fusión para formar un complejo de inteína catalíticamente inactivo pueden variar, dependiendo de las inteínas utilizadas y se pueden determinar apelando a los conocimientos comunes en la técnica. Las condiciones de unión ejemplares incluyen: a) una temperatura variable en el rango de 4­ 25 °C aproximadamente, y un tampón que comprenda Tris-HCl 100 mM, NaCl 25 mM, cloruro de zinc 0,1 mM, pH = 9; b) una temperatura comprendida en el intervalo de 4-25 °C aproximadamente y un tampón que comprenda NaAc 50 mM, NaCl 0,5 M, pH = 5 y c) una temperatura variable en el rango de 4-25 °C aproximadamente y un tampón que comprenda NaCl 0,5 M, Tris-HCl 10 mM, pH = 8.

La molécula diana puede ser cualquier molécula diana adecuada, que incluye, entre otras, cualquiera de las moléculas diana descritas en el presente documento.

Ejemplos

Ejemplo 1. Selección de la caracterización de las contrapartidas de solubilización candidatos para la N-inteína GP41-1

Utilizando el conjunto de las más de 4000+ proteínas de Escherichia conocidas como punto de partida, se seleccionaron siete contrapartidas de solubilización (véase la tabla 2, SEQ ID NOs: 11-15, 19, 20) para las pruebas, aplicando los siguientes criterios:

(1) las proteínas seleccionadas carecían de residuos de cisteína;

(2) las proteínas seleccionadas se predijeron vía simulación computacional para ser solubles cuando se sobreexpresan en la E. coli;

(3) las proteínas seleccionadas tenían un peso molecular inferior a 11 kDa;

(4) las proteínas seleccionadas se predijeron como no secretables, ya fuera vía simulación computacional o por conocimiento concreto;

(5) cuando se disponía de información sobre las interacciones de las proteínas, las proteínas seleccionadas eran monoméricas más que multiméricas;

(6) cuando se disponía de información sobre la función de las proteínas, las proteínas seleccionadas no tenían un carácter regulador o tóxico, lo que significaba que no participaban en el control de las principales vías celulares o que podían causar la muerte de las E. coli que las sobreexpresaba (por ejemplo, nucleasas, polimerasas, etc.) y (7) se favorecieron aquellas proteínas que tenían estructuras cristalográficas por rayos X o RMN conocidas.

La tabla 3 proporciona las propiedades físicas (peso molecular (mw), pH isoeléctrico (pI), probabilidad de expresión soluble en E. coli, si se predice que la proteína se secretará en E. coli, el gran promedio de la hidrofobicidad (GRAVY), y el índice alifático (AI) para las inteínas y las contrapartidas de solubilización evaluadas en este estudio, que se calcularon utilizando algoritmos disponibles públicamente. Todos los parámetros físicos, con la excepción de la probabilidad de solubilidad tras la sobreexpresión en la E. coli y la predicción de probabilidad de secreción, se calcularon utilizando la herramienta en línea ProtParam (http://web.expasy.org/tools/protparam/) que es parte del conjunto de herramientas de bioinformática SwissProt ExPASy. El peso molecular se expresa en daltons. El pI para cada proteína es el valor de pH en el que la proteína no tiene carga neta. El punto isoeléctrico (pI) es un pH en el que la carga neta de la proteína es cero. En el caso de las proteínas, el punto isoeléctrico depende principalmente de siete aminoácidos cargados: glutamato (grupo 5-carboxilo), aspartato (grupo p-carboxilo), cisteína (grupo tiol), tirosina (grupo fenol), histidina (cadenas laterales de imidazol), lisina (grupo £-amonio) y arginina (grupo guanidinio). Adicionalmente, se debe tener en cuenta la carga de los grupos terminales de proteínas (NH2 i COOH). Cada uno de ellos tiene su constante de disociación ácida única, conocida como pK. Además, la carga neta de la proteína está en estrecha relación con el pH de la solución (tampón). Teniendo en cuenta esto, podemos usar la ecuación de Henderson-Hasselbach para calcular la carga de proteína en cierto pH:

El promedio general de hidropaticidad (GRAVY) (Kyte J y Doolittle RF., J. Mol. Biol. 157: 105, 1982) de una secuencia polipeptídica lineal se calcula como la suma de los valores de hidropatía de todos los aminoácidos, dividida por el número de residuos en la secuencia. El aumento de la puntuación positiva indica mayor hidrofobicidad. El cálculo se basa en la escala de Kyte-Doolittle. GRAVY es un método simple para mostrar el carácter hidropático de una proteína.

El índice alifático (Ikai, AJ., J. Biochem. 88: 1895, 1980) de una proteína se define como el volumen relativo ocupado por las cadenas laterales alifáticas (alanina, valina, isoleucina y leucina). Puede considerarse como un factor positivo para el aumento de la termoestabilidad de las proteínas globulares. El índice alifático de una proteína se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula: Índice alifático = X (Ala) a * X (Val) b * (X (Ile) X (Leu)). * Los coeficientes a y b son el volumen relativo de la cadena lateral de valina (a = 2,9) y de las cadenas laterales de Leu/Ile (b = 3,9) a la cadena lateral de alanina. La probabilidad de generar un producto soluble tras la sobreexpresión en E. coli también se puede calcular utilizando el algoritmo de Wilkinson y Harrison (Wilkinson DL y Harrison RG., Bio/Technology, 9: 443, 1991). Otros algoritmos disponibles no dan necesariamente resultados similares.

La predicción de si la proteína contiene una señal de secreción funcional se realizó utilizando el algoritmo SignalP 4.1, disponible en el Centro para el Análisis de Secuencias Biológicas de la Universidad Técnica de Dinamarca (http://genome.cbs.dtu.dk/services/ SignalP /).

Tabla 3. Parámetros físicos medidos para las inteínas y las contrapartidas de solubilización de N-inteína utilizadas en este estudio

Ejemplo 2. Creación de construcciones de expresión de proteínas de E. coli

Las construcciones de plásmidos que llevan la secuencia de codificación para las posibles contrapartidas de solubilización 46, 206 y 246 se fusionaron con la secuencia de codificación para NINTAA_CC, ya fuera a través del aminoácido amino o carboxi terminal de NINTAA_CC y se insertaron en una versión de pJ414 de DNA2.0. Estas construcciones se transformaron en células BL21 DE3 de E. coli competentes, utilizando métodos convencionales y se aislaron colonias resistentes a la ampicilina. La producción de proteínas del tamaño esperado se confirmó mediante electroforesis de poliacrilamida SDS (SDS PAGE).

Los transformantes de cada una de las 6 construcciones se cultivaron en 2 ml de LB, que contenía 100 pg de ampicilina/ml (LB Amp) de una reserva de glicerol de células BL21 DE3 de E. coli transformadas con la construcción correspondiente. Se dejó que este preinóculo creciera durante la noche a 37 °C y 250 rpm y se usó para inocular 200 ml de LB Amp (inóculo al 1 %). El cultivo se incubó a 37 °C y 250 rpm, a una OD600 de entre 0,5 -0,6. La expresión de proteínas se indujo mediante la adición de 0,4 mM de IPTG. La temperatura se redujo a 30 °C y el cultivo se incubó a esta temperatura y 250 rpm durante 5 horas. Después de ese período, las células se recolectaron mediante centrifugación (4500 g, 25 min, 4 °C), el sobrenadante se descartó y el gránulo celular se mantuvo a -80 °C para una purificación adicional de la proteína.

La región codificante para la proteína de sustrato de prueba CINT_TRX se clonó en pSABAD92A (número de acceso al GenBank HM070247) y se transformó en células BL21 DE3 competentes. Los transformantes exitosos se aislaron en caldo Luria más 50 pg/ml de carbenecilina (LB C). La producción de proteínas del tamaño esperado se confirmó utilizando SDS PAGE. Las reservas de glicerol de cada uno de los tres clones/construcción BL21 se almacenaron a -80 °C.

Se usó una pequeña cantidad de reservas de glicerol BL21 congelado para inocular un cultivo de 5 ml en LB C a 37 °C, 250 rpm. Al día siguiente, se usan 0,1 ml del cultivo desarrollado durante toda la noche para inocular 10 ml de LB C y este cultivo se desarrolló a 37 °C, 250 rpm a una OD600 de 0,6 a 0,9. Los cultivos se indujeron con arabinosa al 0,02 % a 28 °C, 250 rpm durante 5 horas. Después de la inducción, las células se recolectaron mediante centrifugación (4500 g, 25 min, 4 °C), el sobrenadante se descartó y el gránulo celular se mantuvo a -80 °C para una purificación adicional de la proteína.

Ejemplo 3. Determinación de la relación soluble frente a insoluble y de la cantidad total de proteínas expresadas Para determinar los rendimientos de expresión y la relación soluble:insoluble para cada construcción, se centrifugaron alícuotas de los cultivos desarrollados correspondientes a biomasas equivalentes, cultivados como se indicó con anterioridad, a 5000 g, 15 min, 4 °C. Después de descartar el sobrenadante del cultivo, las células se resuspendieron en 200 ul de un tampón de solubilización que consistía en Tris 50 mM, pH 8, NaCl 300 mM, Triton X-100 al 0,5 %. Las células se rompieron por sonicación (10 ráfagas x 3, Branson 250 Sonifier, con tiempo entre cada serie para permitir el enfriamiento de la muestra). Para separar la fracción soluble de la insoluble, las muestras se centrifugaron a 16.000 g y 4 °C durante 10 min. Las fracciones solubles se retiraron en un tubo separado, mientras que las fracciones insolubles se resuspendieron en 200 pl del mismo tampón de solubilización por sonicación (utilizando los mismos parámetros que en la sonicación anterior).

Las proteínas recombinantes en lisados celulares se cuantificaron después de gel de SDS PAGE, luego de la tinción con Coomassie, usando análisis densitométrico de la utilización de una curva de BSA cuantificada como referencia. Se cargaron tres volúmenes de muestra diferentes por clon junto con la curva estándar de BSA (6 puntos de 0,2 a 1,2 ug). Las intensidades de las bandas de proteínas se determinaron mediante densitometría utilizando el software “Quantity One” (Biorad). Se aplica un factor de corrección para cada proteína considerando la relación de peso molecular BSA/proteína recombinante.

Las concentraciones para proteínas purificadas se determinaron utilizando los coeficientes de extinción calculados y su absorbancia se calculó a 280 nm.

Ejemplo 4. Purificación de proteínas expresadas

Para purificar la proteína de fusión de C-inteína INT_TRX utilizada como sustrato de escisión en su totalidad, las células de E. coli que expresaban la proteína se resuspendieron en un tampón que contenía Tris-HCl 50 mM, pH = 8.0, NaCl 300 mM, 0,5X CelLytic B (Sigma -Aldrich) e imidazol 20 mM. Las células se sonicaron en hielo durante 20 minutos, con un ciclo de actividad pulsada del 30 % (Branson 250 Sonifier) y se centrifugaron durante 30 minutos a 34500 g a 4°C. La fusión de C-inteína soluble se purificó a partir del sobrenadante en las columnas His-Trap HP (GE Healthcare), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las fracciones eluidas que contenían las proteínas de fusión C-inteína purificadas se agruparon, se dializaron contra el tampón de escisión (Tris-HCl 50 mM, pH = 7.0, NaCl 300 mM, EDTA 1 mM, glicerol al 10 % (v/v); CB) en presencia de DTT 2 mM y se almacenaron en alícuotas a -80 °C.

Las fusiones de N-inteína se purificaron en condiciones nativas, a partir de células de E. coli que albergan las construcciones de expresión. Los gránulos celulares se resuspendieron en un tampón que contenía Tris-HCl 100 mM, pH = 8,0, NaCl 150 mM y EDTA 1 mM. Las células se sometieron a sonicación en hielo durante 20 minutos, con un ciclo de actividad pulsada del 30 % (Branson 250 Sonifier) y se centrifugaron durante 30 minutos a 34500 g a 4 °C. La fracción soluble de la fusión de N-inteína se purificó por cromatografía en columnas His-Trap HP, como se describió con anterioridad. Las fracciones eluidas que contenían la proteína purificada se agruparon, se dializaron contra CB, en presencia de DTT 2 mM y se almacenaron en alícuotas a -80 °C.

Ejemplo 5. Determinación de la cinética de escisión para proteínas expresadas

Las reacciones in vitro se realizaron como se describió previamente (Carvajal-Vallejos P., et al., J. Biol. Chem. 287: 28686, 2012). En resumen, las proteínas de fusión N y C purificadas se preincubaron brevemente por separado, en las condiciones de prueba correspondientes. La reacción de escisión se inició mezclando proteínas de fusión N-inteína y C-inteína complementarias en un tampón de escisión, a concentraciones equimolares de 5 pM y se incubaron a 25 °C y 37 °C. Para los experimentos relacionados con esta invención, la contrapartida de escisión siempre fue CINT_TRX. Las alícuotas se eliminaron a intervalos específicos y la reacción se detuvo mediante la adición de un tampón SDS PAGE, que contenía un 8 % de SDS (p/v) y un 20 % de p-mercaptoetanol (v/v), seguido de 5 minutos de ebullición. Los productos de las reacciones se cuantificaron mediante SDS PAGE (4-12 % de geles de Bis-Tris de Novex, Invitrogen, Carlsbad, EE. UU.), seguido de la tinción con azul brillante de Coomassie (Sigma). Las intensidades relativas de las bandas de proteínas se determinaron densitométricamente, utilizando el programa de Quantity One (BioRad). Los diferentes productos de escisión se normalizaron de acuerdo con su peso molecular correspondiente. El porcentaje de escisión de proteínas se calculó a partir de la relación de los productos escindidos y el precursor marcado con inteína CINT_TRX. Las tasas constantes (kobs) se determinaron utilizando el software GraFit (Erithacus, Surrey, Reino Unido), ajustando los datos a la ecuación P = Po (1-e-kt), donde P es la cantidad de producto de fusión de C-inteína escindido formado en el momento t; P0 es la cantidad máxima de producto escindido que se puede obtener (rendimiento); e es la constante de Euler y k es la tasa observada. Todas las reacciones se trataron como procesos irreversibles, de estado preestabilizado y de primer orden, bajo el supuesto de que, después de la asociación rápida de los dos fragmentos de inteína complementarios, la escisión de la proteína de fusión C-inteína se produce como una reacción monomolecular.

Ejemplo 6. Determinación de la ubicación y propiedades óptimas para las contrapartidas de solubilización NINT

Se crearon fusiones NINTAA_CC para potenciales contrapartidas de solubilización en ambas posibles orientaciones (es decir, se fusionaron con el término N o C de NINTAA_CC) para todas las contrapartidas de solubilización. Las seis construcciones resultantes se expresaron en la E. coli, y la proteína producida se analizó con respecto a la cantidad total producida y la solubilidad, como se describió con anterioridad. Además, se purificó la proteína de cada construcción y se caracterizó la velocidad de escisión, utilizando CINT_TRX purificado como sustrato. Los resultados de este análisis se muestran en las figuras. 2A y 2B. Mientras que la fusión de la contrapartida de solubilización al término N de NINTAA_CC produce mayores cantidades de proteína en la E. coli para todas las construcciones probadas que la fusión de la contrapartida de solubilización al término C, se observa lo contrario de esta tendencia cuando se miden las tasas de escisión. El trabajo publicado utilizando un sistema diferente de inteínas divididas mientras estos estudios estaban en curso demostró una relación similar entre la ubicación de la contrapartida de solubilización y la N-inteína y la actividad de N-inteína que se explicó al referirse a información estructural conocida que indica una mayor probabilidad de interferencia estérica entre los dominios de exteína, cuando la fusión se realiza en la polaridad opuesta (Guan D, Ramírez M, Chen Z., Biotechnol Bioeng. 110: 2471, 2013).

Este trabajo se amplió para incluir las contrapartidas de solubilización adicionales 51, 138, 342 y 368 (véanse las tablas 2 y 3), que eran distintas de las contrapartidas de solubilización caracterizadas previamente, en términos de tamaño y punto isoeléctrico (pl). Todas estas se fusionaron al término carboxilo de NINTAA_CC, como se mostró con anterioridad con las contrapartidas de solubilización 46, 206 y 246, para producir fusiones que tenían la actividad catalítica más alta. Estas construcciones se expresaron en la E. coli, se purificaron y se analizaron para determinar la tasa de escisión, como se describió con anterioridad. Los resultados de estos análisis se presentan en la figura 3. Mientras que la contrapartida de solubilización 246 claramente tiene la mayor actividad, el mejor compromiso entre la actividad catalítica y la expresión soluble se observó para la contrapartida de solubilización 138.

Para entender las propiedades de la contrapartida de solubilización 138 que la hacen efectiva para la solubilización de N-inteína durante la expresión en la E. coli, los parámetros de proteína calculados para cada una de las solubilizaciones candidatas en la tabla 3 se correlacionaron con el título soluble en la figura 4. Si bien ninguno de estos parámetros se correlacionó fuertemente con la expresión general, tanto los valores de AI como de GRAVY mostraron una correlación negativa con el título soluble.

Ejemplo 7. Selección de aminoácidos para el reemplazo de residuos de cisteína en NINTAA_CC

La N-inteína GP41-1 aislada de fuentes naturales contiene tres residuos de cisteína, pero uno había sido reemplazado previamente para obtener NINTAA_CC, la construcción madre para esta invención. Los dos residuos de cisteína restantes contenidos en NINTAA_CC se seleccionaron para su reemplazo, de modo que se pudiera introducir un único residuo de cisteína reactivo en el dominio de solubilización, para su posterior inmovilización u otra modificación.

Para identificar los aminoácidos que pudieran sustituirse por los dos residuos de cisteína en NINTA_CC y aún producir una proteína de inteína estable y funcional, se realizaron varios análisis filogenéticos, en los que se alinearon secuencias de proteínas y variantes de aminoácidos naturales en las posiciones 65 y 89 en la SEQ ID NO: 1 fueron examinados. Sería de esperar que el reemplazo de las cisteínas internas que se presentan naturalmente en GP41-1 con otros aminoácidos que se encuentran en estas posiciones en inteínas similares produzca proteínas variantes de GP41-1 funcionales y/o estables, ya que la selección natural ha permitido que estas variantes persistan en la naturaleza. Cuando dicho análisis se realiza con N-inteínas de la clase de inteína GP41 (1,2, 3, 4, 5, 6; Dassa B., et al., Nucl. Acids Res., 37: 2560-2573 (2009)), se encuentra que los dos residuos de cisteína en las posiciones 65 y 89 en la SEQ ID NO: 1 están altamente conservados, lo que sugiere que la sustitución de estas cisteínas afectaría adversamente la actividad y/o la estabilidad de la inteína GP41-1. Sin embargo, si el análisis se amplía para incluir proteínas ligeramente más divergentes, que pueden tener o no función de inteína, se identifican muchas proteínas que tienen homología con el gen phoH del regulón de fosfato de la E. coli. Se obtuvieron aproximadamente cien homólogos de GenBank, usando la herramienta de búsqueda BLAST y se alinearon con el algoritmo CLUSTAL, aplicando la herramienta gratuita, BioEdit (Hall TA., Nucl. Acids. Symp. Ser. 41:95, 1999). Los resultados de este análisis se muestran en la figura 5, donde la numeración de la posición se basa en NINTAA_CC (SEQ ID NO: 2). A partir de este análisis, queda claro que la treonina y la alanina se producen con frecuencia en la posición 65 y que la lisina, la metionina y las asparaginas se producen con frecuencia en la posición 89, lo que indica que la sustitución de las cisteínas naturales con estos aminoácidos naturales debería producir una proteína estable.

Ejemplo 8. Selección de las variantes de aminoácidos de NINTAA_CC para propiedades óptimas

Se crearon, expresaron, purificaron y caracterizaron construcciones basadas en NINTAA_CC (SEQ ID NO: 2), que contenían las sustituciones de aminoácidos que se muestran en la tabla 4, como se describió con anterioridad.

Las mediciones de la tasa de escisión para las proteínas de fusión de N-inteína preparadas a partir de cada construcción se detallan en la figura 6. La NINTAA_CC madre (+ cnt) se muestra a la izquierda para establecer una comparación. Los aminoácidos en las posiciones 65 y 89 se muestran en la parte inferior de la figura. Un residuo de treonina en la posición 65 produce fusiones de N-inteína que tienen significativamente más actividad que la progenitora. De las construcciones probadas, la fusión de N-inteína que tiene una treonina en la posición 65 y una metionina en la posición 89 proporcionó una construcción con una velocidad catalítica aproximadamente tres veces mayor que la construcción original.

Tabla 4. Variantes de N-inteína GP41 -1

Ejemplo 9. Estrategia para la introducción de residuos únicos de cisteína en la contrapartida de solubilización 138

Para permitir la modificación química de la proteína de fusión N-inteína sin disminuir su actividad catalítica, el sitio de la probable modificación debería estar lo más alejado posible del sitio activo de la N-inteína. En ausencia de información estructural para la contrapartida de solubilización 138, un enfoque razonable sería realizar un análisis filogenético, como se describió con anterioridad para la N-inteína GP41-1 (véase el ejemplo 7), determinar las regiones de la proteína que muestran una alta variabilidad, modificar estas por la inserción de una cisteína, y luego probar todas las construcciones resultantes. Sin embargo, hay una estructura de solución de RMN disponible para la contrapartida de solubilización 138 (estructura 1RYK de banco de datos de proteínas), que se muestra en la figura 7. La proteína contiene cuatro dominios de hélice alfa, es globular, tiene una larga bobina no estructurada, que forma la conexión al terminal carboxi de la N-inteína (región en el círculo; no se muestra la N-inteína). Las regiones de bucle GKL y GYQ indicadas por el resaltado amarillo se dirigieron para las inserciones de los residuos de la cisteína para crear las nuevas versiones (GCKL (SEQ ID NO: 61), GCYQ (SEQ ID NO: 62) y GCGYQ (SEQ ID NO: 63)) de la contrapartida de solubilización 138 (138_GKL22GCKL (SEQ ID NO: 16), 138_GYQ48GCYQ (SEQ ID NO: 17) y 138_GYQ48GCGYQ (SEQ ID NO: 18)).

Ejemplo 10. Acoplamiento de la proteína de fusión N-inteína (ligando) a la resina de cromatografía

Una proteína de fusión soluble que contiene la contrapartida de solubilización 138_GYQ48GCGYQ (SEQ ID NO: 18) fusionada al término carboxilo de la variante de GP41-1 NINTAA_TM (SEQ ID NO: 6) se expresa a partir de un ácido nucleico codificador en la E. coli y posteriormente se separa de proteínas celulares contaminantes utilizando métodos de separación convencionales.

La proteína de fusión N-inteína purificada se acopla luego a una resina de cromatografía FRACTOGEL® o ESHMUNO® (EMD Millipore Corporation), a través del único sitio de cisteína reactiva en el dominio asociado de solubilización de la proteína de fusión utilizando técnicas estándar.

En la preparación para la activación, 5 ml de resina húmeda de FRACTOGEL® COO (FG-COO) se lavan una vez con agua desionizada y tres veces con ácido 2-(N-morfolino)etansulfónico 150 mM, a pH 6,5 (tampón MES), en un embudo Buechner y se transfieren a una botella de vidrio Schott. Se disuelven 0,1035 g de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) en 3 ml de tampón MES y se agregan a FG-COO. La mezcla se incuba durante 2 minutos a temperatura ambiente. Se agrega una solución de 0,1372 g de ácido trifluoroacético de N-(3-aminopropil)maleimida (APM), en 4 ml de tampón MES y la mezcla se mantiene a temperatura ambiente durante la noche con agitación. El pH se mantuvo a 6,5, a través de la titulación con NaOH 1M. Para el almacenamiento, la resina activada se resuspende en NaCl 150 mM, que contiene etanol al 20 % y se almacena en un refrigerador. Para el análisis de la funcionalización, se prepara una solución al 50 % v/v de resina activada en tampón fosfato 100 mM que contiene NaCl 150 mM, a pH = 7,2 (tampón PO). Se mezclan 0,5 ml de FG-COO activado con 1 ml de solución de clorhidrato de cisteína 204 uM, en tampón PO y se incuba durante una hora. Una muestra de FG-COO que no se ha activado con AMP se procesa en paralelo, como control negativo. La resina se lava luego extensivamente con tampón PO, NaCl 0,5 M y se resuspende en NaCl 0,5 M, para el análisis de grupos sulfhidrilo libres usando reactivo de Ellmann (ácido 5,5'-ditio-bis-(ácido 2-nitrobenzoico)) y métodos conocidos. Con este análisis se determina una densidad de ligando de hasta 400 pmol por gramo de resina seca.

Ejemplo 11. Purificación por afinidad de una tiorredoxina usando proteínas de fusión de inteína

La resina que contiene la proteína de fusión N-inteína inmovilizada, preparada de acuerdo con el ejemplo 10 de este documento se empaqueta en una columna de cromatografía estándar, y una mezcla de proteína sin procesar, que contiene la proteína de fusión CINT_TRX (SEQ ID NO: 10), que incluye la tiorredoxina de la molécula diana fusionada al término carboxi de la C-inteína GP41-1, se agrega a la columna que contiene la proteína de fusión N-inteína inmovilizada, a una temperatura variable en el rango de 4-25 °C, y usando un tampón de carga que contiene Tris-HCl 100 mM, NaCl 25 mM, cloruro de zinc 0,1 mM, pH = 9, para permitir una fuerte interacción entre los dominios de la N-inteína y C-inteína GP41 -1, sin permitir la catálisis de la inteína.

La columna cargada se lava luego para eliminar los contaminantes no unidos y débilmente unidos, utilizando un tampón de lavado que contiene detergente (por ejemplo, Triton X100, ND40) o sal (por ejemplo, acetato, fosfato, cloruro, sales de sulfato de sodio, amonio o potasio).

La escisión y elución de la porción de tiorredoxina de la proteína de fusión C-inteína se realiza mediante la adición de un tampón de escisión (Tris-HCl 50 mM, pH = 7,0, NaCl 300 mM, EDTA 1 mM). La tiorredoxina escindida se recupera luego en el eluato.

Tabla 5. Inteínas divididas ejemplares y sus secuencias.

Las secuencias subrayadas corresponden a las cajas N1 de los dominios N-terminales de la inteína. Las secuencias subrayadas dobles corresponden a las cajas C1 de los dominios C-terminales de la inteína (por ejemplo, que carecen del primer aminoácido de la exteína).

Secuencias adicionales de N-inteína ejemplares

gp 41-2

CLDLKTQVQTQQGLKDISNIQVGDLVL (SEQ ID NO:42)

gp 41-3

CLDLKTQVQTPQGMKEISNIQVGDLVLSNTGYNEVLNVFPKSKKKS (SEQ ID NO:43)

gp 41-4

CLDLKTQVQTPQGMKEISNIQVGDLVLSNTGYNEVLNVFPKSKKKSYKITLEDGKEII

CSEEHLFPTQTGEMNISGGLKEGMCLYVKE (SEQ ID NO:44)

gp 41-5

CLDLKTQVQTPQGMKEISNIQVGDLVLSNTGYNEVLNVFPKSKKKSYKITLEDGKEII

C SEEHLFPT QT GEMNI S GGLKEGMCL Y VKE (SEQ ID NO:45)

gp 41-6

SYKITLEDGKEIICSEEHLFPTQNGEVNIKGGLKEGMCLYVKE (SEQ ID NO:46)

gp 41-7

MMLKKILKIEELDERELIDIEVSGNH (SEQ ID NO:47)

NrdA-1

CVAGDTKIKIKYPESVGDQYGTWYWNVLEKEIQIEDLEDYIIMRECEIYDSNAPQIEV

LSYNIETGEQEWKPITAFAQTSPKAKYMKITDEESGKSIYYTPEHQYFTKNRGYYMA

KDLIETDEPIIVNKDMNF (SEQ ID NO:48)

NrdA-4

CLAGDTTVTVLEGDIVFEMTLENLVSLYKNVFSVSVLSFNPETQKQEFKPVTNAALM

NPESKVLKITDSDTGKSIVCTPDHKVFTKNRGYVIASELNAEDILEIK (SEQ ID NO:49)

NrdA-5

HTETVRRVGTITAFAQTSPKSKVMKITDEESGNSIVVTPEHKVFTKNRGYVMAKNLV

ETDELVIN (SEQ IDNO:50)

NrdA-6

YVCSRDDTTGFKLICTPDHMIYTKNRGYIMAKYLKEDDELLINEIHLPT (SEQ ID NO:51)

NrdJ-1

CLVGSSEIITRNYGKTTIKEVVEIFDNDKNIQVLAFNTHTDNIEWAPIKAAQLTRPNAE

LVELEIDTLHGVKTIRCTPDHPVYTKNRGYVRADELTDDDELVVAI (SEQ ID NO:52)

NrdJ-2

CLVGSSEIITRNYGKTTIKEVVEIFDNDKNIQVLAFNTHTDNIEWAPIKAAQLTRPNAE

LVELEINTLHGVKTIRCTPDHPVYTKNRDYVRADELTDDDELVVAI (SEQ ID NO:53)

Secuencias adicionales de CN-inteína ejemplares

gp 41-9

MIMKNRERFITEKILNIEEIDDDLTVDIGMDNEDHYFVANDILTHNT (SEQ ID NO:54)

IMPDH-2

MKFTLEPITKIDSYEVTAEPVYDIEVENDHSFCVeNGFVVHNS (SEQ ID NO:55)

IMPDH-3

MKFKLVEITSKETFNYSGQ-VHDLTVEDDHSYSI-NNIVVHNS (SEQ ID NO:56),

NrdA-3

MLKIEYLEEEIPVYDITVEETHNFFANDILIHNC (SEQ ID NO:57),

NrdA-5

MLKIEYLEEEIPVYDITVEGTHNLAYSL (SEQ ID NO:58),

NrdA-6

MGIKIRKLEQNRVYDIKVEKIIIFCNNILVHNC (SEQ ID NO:59), and

NrdJ-1

MEAKTYIGKLKSRKIVSNEDTYDIQTSTHNFFANDILVHNS (SEQ ID NO:60).

Las enseñanzas relevantes de todas las patentes, solicitudes publicadas y referencias citadas en este documento se incorporan como referencia en su totalidad.

A menos que se indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, condiciones de expresión, condiciones de tratamiento, etc., utilizados en la memoria descriptiva, incluidas las reivindicaciones, deben entenderse como modificados en todos los casos por expresiones tales como “aproximadamente/alrededor de”. Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos son aproximaciones y pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se pretenden obtener mediante la presente invención. Salvo que se indique lo contrario, la frase “al menos” que precede a una serie de elementos debe entenderse como que se refiere a cada elemento de la serie. Los expertos en la materia reconocerán, o podrán determinar recurriendo a la experimentación que no exceda la de la práctica rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención descritas en este documento. Dichos equivalentes quedan incluidos en las siguientes reivindicaciones.

Aunque esta invención se ha mostrado y descrito particularmente con referencias a realizaciones de ejemplo de la misma, los expertos en la materia entenderán que se pueden realizar diversos cambios en la forma y detalles sin apartarse del alcance de la invención abarcada por las reivindicaciones adjuntas.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de fusión que comprende un polipéptido de N-inteína y una contrapartida de solubilización de N-inteína unidos por un enlace peptídico, en el que la contrapartida de solubilización de N-inteína tiene un peso molecular inferior a 15 kDa, un valor de índice alifático menor que 60 y un valor de gran promedio de hidropatía menor que -1, y que aumenta la solubilidad del polipéptido de N-inteína, en comparación con el polipéptido de N-inteína expresado en ausencia de la contrapartida de solubilización.

2. La proteína de fusión según la reivindicación 1, en la que:

a) el polipéptido de N-inteína es la N-inteína GP41-1 (SEQ ID NO: 1), o una variante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 % de identidad de la GP41 -1 y, opcionalmente, en donde la variante de N-inteína GP41-1 tiene un aminoácido que no es un residuo de cisteína en las posiciones 7, 65 y 89 de la SEQ ID NO: 1 y, opcionalmente, en donde la variante de N-inteína GP41-1 tiene una alanina en la posición 7, un residuo de treonina o una alanina residuo en la posición 65 y un residuo de metionina, un residuo de lisina o un residuo de asparagina en la posición 89 de la SEQ ID NO: 1 o

b) el polipéptido de N-inteína comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 1-8 y 29-56.

3. La proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde el polipéptido de N-inteína carece de un aminoácido que se usa para unir la proteína de fusión a un soporte sólido y, opcionalmente, en donde el aminoácido usado para la unión de la proteína de fusión a un soporte sólido es la cisteína.

4. La proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en la que:

a) la contrapartida de solubilización de la N-inteína se une al extremo N-terminal del polipéptido de la N-inteína o b) la contrapartida de solubilización de la N-inteína se une al extremo C-terminal del polipéptido de la N-inteína.

5. La proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la contrapartida de solubilización de N-inteína es la contrapartida de solubilización de la N-inteína 138 (SEQ ID NO: 15), o en la que la variante de la contrapartida de solubilización de la N-inteína 138 comprende la SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, o SEQ ID NO: 18.

6. La proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la proteína de fusión se produce en la E. coli, en condiciones en las que menos del 25 % en masa de la proteína de fusión producida está presente en los cuerpos de inclusión.

7. La proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la proteína de fusión se modifica para incluir un marcador detectable y, opcionalmente, en el que el marcador detectable es un tinte fluorescente.

8. La proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la proteína de fusión se expresa en Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Pseudomonas fluorescens, Lactococcus lactis, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Zea maize, Nicotinia tabacum, Daucus carota, células SF9, células CHO, células NS0 o células HEK 293.

9. Un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión según las reivindicaciones 1 -8 y, opcionalmente, en el que: a) el ácido nucleico se incluye en un vector de expresión o

b) el ácido nucleico se incluye en un plásmido.

10. Una célula hospedadora que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 9 y, opcionalmente, en donde la célula hospedadora es E. coli.

11. Una matriz de cromatografía de afinidad que comprende la proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 unida a un soporte sólido, opcionalmente en la que:

a) el soporte sólido es una resina de cromatografía y, opcionalmente, en la que la resina de cromatografía incluye una base hidrófila de poliviniléter o

b) el soporte sólido es una cuenta, una fibra hueca, una fibra sólida, una almohadilla, un gel, una membrana, un casete, una columna, un chip, una placa, un plato o un monolito y, opcionalmente, en donde el soporte sólido es una cuenta magnética.

12. La matriz de cromatografía de afinidad según la reivindicación 11, en la que el soporte sólido comprende vidrio de poro controlado, sílice, óxido de circonio, óxido de titanio, agarosa, polimetacrilato, poliacrilato, poliacrilamida, alcohol polivinílico, poliestireno o derivados de los mismos.

13. La matriz de cromatografía de afinidad según una cualquiera de las reivindicaciones 11-12, en la que la matriz comprende, además, una molécula espaciadora entre la proteína de fusión y el soporte sólido.

14. La matriz de cromatografía de afinidad según una cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en la que:

a) la proteína de fusión está unida al soporte sólido en un sitio único en la contrapartida de solubilización de la N-inteína o

b) la proteína de fusión se une al soporte sólido en más de un sitio en la contrapartida de solubilización de la N-inteína.

15. La matriz de cromatografía de afinidad según una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en la que el polipéptido de la N-inteína en la proteína de fusión permanece activo cuando la proteína de fusión está unida al soporte sólido y, opcionalmente, en donde el polipéptido de N-inteína en la fusión la proteína está orientado de modo que se aleje del soporte sólido cuando la proteína de fusión se une al soporte sólido.