KR19980068672A - 트리코스포론 베이젤리(Trichosporon Beigelii)에 작용하는 항진균성 펩타이드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 양친화성 부위, 유연성 부위 및 소수성 부위로 구성된 합성 펩타이드를 병원성 진균인 트리코스포론 베이젤리 (Trichosporon beigelii) 균주 등에 작용하는 항진균성 펩타이드로 사용하는 용도에 관한 것으로서, 본 발명의 항진균성 펩타이드는 세포 독성이 낮아 트리코스포론 베이젤리에 의해 유발되는 사모증 (white piedra) 등을 예방하고 치료하는데 널리 사용될 수 있다.

Description

트리코스포론 베이젤리 (Trichosporon beiglii)에 작용하는 항진균성 펩타이드

본 발명은 트리코스포론 베이젤리 (Trichosporon beigelii) 등에 작용하는 항진균성 펩타이드에 관한 것이다.

더욱 상세하게는, 본 발명은 양친화성 부위, 유연성 부위 및 소수성 부위로 구성된 합성 펩타이드를 병원성 진균인 트리코스포론 베이젤리 균주 등에 작용하는 항진균성 펩타이드로 사용하는 용도에 관한 것으로서, 본 발명의 항진균성 펩타이드는 세포 독성이 낮아 트리코스포론 베이젤리에 의해 유발되는 사모증 (white piedra) 등을 예방하고 치료하는데 널리 이용될 수 있다.

트리코스포론 베이젤리 (Trichosporon beigelii)는 사람의 머리카락, 수염, 눈썹, 겨드랑이, 음모 등의 모발에 감염되는 병원성 진균으로, 이에 감염되면 모발이 부드러워지고, 모발 자체가 점질적 성질을 띄며, 색깔이 밝은 갈색을 띄는 흰색으로 변하여 모발 자체에 손상을 줌으로써 모발이 쉽게 부러지는 사모증 (white piedra)이라는 질환을 일으키는 것으로 알려져 있다 (Avram, A., et al., Dermatol. Venereol., 114: 819, 1987; Kreger-van Rij, N. J. W., Amsterdam, Elsevier Science Publishers., 933-962, 1984). 이러한 트리코스포론 베이젤리가 나타내는 감염증은 온대성 또는 열대성 기후에 상관없이 유럽, 아시아 및 남미 등에서 널리 발견되고, 드물게는 미국의 남부 지방에서도 발견되고 있다. 또한, 트리코스포론 베이젤리는 거미원숭이 (Spider Monkey)와 말에서도 발견되었으나 거미원숭이에는 전염성이 없다고 알려졌다 (Kaplan, W., J. Am. Vet. Med. Assoc., 184: 113, 1959). 특히 이러한 사모증은 젊은 남자에게서 많이 발견된다 (Kalter, D. C., et al., J. Am. Acad. Dermatol., 14:982, 1986).

상기의 트리코스포론 베이젤리를 포함한 진균 감염증은 세균에 의한 감염증과는 달리 진핵세포인 진균의 특성상 대사 과정에 작용하는 항진균제를 개발하는데 한계가 있으므로 이의 치료제를 개발하기 위해 많은 새로운 시도들이 이루어지고 있다.

양친화성 펩타이드 (amphipathic peptide)는 세포막의 지질 성분과 유사한 구조를 지니므로 세포막의 지질들과 결합할 수 있는 특성을 지닌다. 이러한 양친화성 펩타이드는 미생물의 세포막 지질과 결합하여 미생물의 세포막을 파괴하거나 세포막의 전위에 영향을 주어 이를 변화시킴으로써 미생물을 파괴한다고 보고되어 있다.

따라서 양친화성 펩타이드의 항균 활성에 대해서 많은 연구가 이루어졌고, 이를 이용한 세균에 대한 항생제들을 개발하려는 연구들이 많이 시도되었다. 지금까지 보고된 대표적인 양친화성 펩타이드로는 마가이닌 2 (magainin 2, MA 2) 펩타이드, 멜리틴 (mellitin, ME) 펩타이드 및 세크로핀 A (cecropin A) 펩타이드 등이 있다.

우선 마가이닌 2 (아미노산 서열 : G I G K F L H S A K K F G K A F V G E I M N S) 펩타이드는 세포 독성은 없으면서 항균 활성과 함께 항진균, 항암 및 항원생생물 효과가 있다고 알려져 있다 (Zosloff, M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 5449, 1987). 멜리틴 (아미노산 서열 : G I G A V L K V L T T G L P A L I S W I K R K Q Q) 펩타이드는 벌독의 성분 중 고형분의 50% 이상을 차지하는 펩타이드로서, 카르복시 말단이 아미노화 (amidation)되어 있고 진핵세포에 대하여 세포독성이 비교적 커서 고등 동물세포를 낮은 농도에서도 잘 파괴하고, 미생물인 그람 음성균 및 양성균에 대해서도 항균 활성이 높다고 보고되었다 (Habermann, E., Science, 177: 314, 1972; Steiner, H. et al., Nature, 292: 246, 1981; Tosteson, M. T., et al., Biochemistry., 228: 337, 1987).

또한, 세크로핀 계열의 양친화성 펩타이드는 초파리에서 처음 발견되었고 그후 누에 번데기 및 돼지의 작은 창자에서도 발견되었는데, 이중 세크로핀 A (cecropin A, CA; 아미노산 서열 : K W K L F K K I E K V G Q N I R D G I K A G P A V A V V G Q A T Q I A K)는 항균 활성이 높고 항진균 및 항암 활성은 미미한 것으로 보고되었다 (Boman, H. G. and Hultmark, D., Annu. Rev. Microbiol., 41: 103, 1987).

또한, 상기한 양친화성 펩타이드들의 활성에 관한 연구와 더불어 이들이 갖는 아미노산 서열 및 단백질 구조 등의 특성을 살펴보면, 그 서열상의 특성 등이 본 펩타이드가 나타내는 항균, 항진균 및 항암 활성 등과 매우 밀접한 관련이 있음을 확인할 수 있다. 따라서, 상기 양친화성 펩타이드의 아미노산 서열을 이용하여 그 서열의 특정 부위에서 유사한 아미노산으로 치환시키거나, 일부 서열들을 재조합하여 융합 펩타이드 (hybrid peptide)를 제조하거나, 펩타이드 서열의 일부 기능 부위를 서로 도치시킴으로써 (translocate) 항균, 항진균 또는 항암 활성이 더욱 탁월한 새로운 합성 펩타이드를 제조할 수 있다 (Chan, H. C., et al., FEBS Lett., 259: 103, 1989; Boman, H. G., et al., FEBS Lett., 259: 103, 1989; Wade, D., et al., Int. J. Pept. Prot. Res., 40: 429, 1992).

실제적으로 상기의 양친화성 펩타이드를 응용하여 항암 효과가 있는 합성 펩타이드 mag A 및 mag G 등이 제조되고 그 효능이 보고된 바 있다 (Ohsaki, et al., Cancer Res., 52: 3534-3538, 1992). 그외에도 마가이닌 2 및 멜리틴 펩타이드들의 양친화성 부위 및 유연성 부위와 소수성 부위 등을 상호 결합시킨 아미노산 서열을 갖는 항진균 활성을 나타내는 합성 펩타이들이 개발되었고, 이들은 특히 아스퍼질러스 속 균주에 특이적으로 작용함이 알려져 항진균성 펩타이드로서 특허 출원된 바 있다 (대한민국 특허출원 제96-27996호). 또한, 본 발명자들은 기존의 세크로핀 A, 마가이닌 2 또는 멜리틴 펩타이드 등의 각 부위를 재조합한 아미노산 서열을 갖는 융합 펩타이드들을 제조하고 이들이 탁월한 항암 효과 등을 확인하여 특허 출원한 바 있다 (대한민국 특허출원 제96-52673호).

이와 같은 배경에서 본 발명자들은 인체에 사용할 수 있는 새로운 항진균제를 개발하기 위하여, 양친화성을 갖는 다양한 합성 펩타이드를 연구한 결과 재조합된 멜리틴 펩타이드로서 항암 효과가 있는 것으로 이미 보고된 서열 1 및 서열 2 의 합성 펩타이드 (대한민국 특허출원 제96-52673호)가 병원성 진균인 트리코스포론 베이젤리 (Trichosporon beigelii) 등에 효과적으로 작용함을 발견하고 이들의 항진균 활성 및 세포 독성 등을 확인하여 이들의 항진균성 펩타이드로서의 새로운 용도를 제공함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 인체에 사용이 가능한 항진균성 펩타이드를 제공함에 그 목적이 있다.

구체적으로, 본 발명은 서열 1 및 서열 2 의 아미노산 서열을 가지고 항암 효과가 있는 양친화성 펩타이드를 항진균성 펩타이드로 제공한다. 본 발명은 상기 아미노산 서열을 갖는 합성 펩타이드에 일부 서열을 첨가하거나 유사한 아미노산으로 치환한 모든 펩타이드를 항진균성 펩타이드로서 포함할 수 있고, 그의 아미노 말단의 아미노기 또는 카르복시 말단의 카르복실기를 다른 기능기로 치환시킨 항진균성 펩타이드를 포함할 수 있다.

본 발명은 트리코스포론 베이젤리 (Trichosporon beigelii) 균주에 특이적으로 작용하는 항진균성 펩타이드를 제공함에 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 상기 항진균성 펩타이드를 유효 성분으로 하는 약학적 조성물을 병원성 진균인 트리코스포론 베이젤리 (Trichosporon beigelii)에 의해 유발되는 감염증을 예방하고 치료하는데 사용하는 용도를 제공한다. 구체적으로 본 발명의 항진균성 펩타이드는 사모증의 치료제로 사용될 수 있고, 샴푸 등의 세제에 첨가하여 상기 감염증을 예방하는데도 사용될 수 있다.

도 1 은 본 발명의 합성 펩타이드가 트리코스포론 베이젤리 균체의 성장을 억제함을 MTT 법으로 발색시켜 나타낸 것이다.

PC : 양성 대조군; NC : 음성 대조군, ME : 멜리틴; CA : 세크로핀; S : 서열 2 의 합성 펩타이드.

도 2 는 본 발명의 합성 펩타이드를 트리코스포론 베이젤리 균체에 처리한 다음 YM 아가 배지에 도말하여 생균수를 확인한 사진이다.

A : 양성 대조군; B :세크로핀; C : 멜리틴; D : 서열 2 의 합성 펩타이드.

본 발명에서는 세포 독성이 없고 탁월한 항진균 활성을 나타내는 양친화성 펩타이드를 개발하기 위하여, 양친화성 부위, 유연성 (flexible) 부위 및 소수성(hydrophobic) 부위로 구성되는 다양한 합성 펩타이드를 제조하여 조사한다.

구체적으로, 본 발명은 아미노 말단에는 세크로핀의 양친화성 부위 (세크로핀의 서열1-8)가 위치하고 그 뒷부분에는 멜리틴(멜리틴의 서열 1-12)의 유연성 부위 및 소수성 부위가 위치하는 20개의 아미노산으로 구성된 합성 펩타이드 (서열 1 참조; 대한민국 특허출원 제96-52673호 참조) 및 그의 카르복시 말단 부위에 위치하는 아미노산 번호 18번, 19번의 트레오닌 (threonine)이 라이신 (lysine)으로 치환된 합성 펩타이드 (서열 2 참조)를 조사한 결과 탁월한 항진균 활성을 확인한다. 이 때 본 발명은 상기 펩타이드의 카르복시 말단이 아미노화(amidation)된 항진균성 펩타이드를 사용한다.

본 발명은 상기 양친화성인 합성 펩타이드에 일부 아미노산 서열을 첨가하거나 유사한 아미노산으로 치환된 모든 합성 펩타이드를 항진균성 펩타이드로서 포함할 수 있고, 그의 아미노 말단의 아미노기 또는 카르복시 말단의 카르복실기를 다른 기능기로 치환시킨 항진균성 펩타이드를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 항진균성 펩타이드들이 병원성 진균인 트리코스포론 베이젤리 (Trichosporon beigelii) 등에 특이적으로 항진균 활성을 탁월하게 나타냄을 확인한다.

본 발명의 펩타이드는 Fmoc 아미노기 보호 용기를 이용한 메리필드(Merrifield)의 고상법 등으로 합성한다 (Merrifield, R. B. J. Am. Chem. soc. 85:2149, 1963). 상기에서 합성한 펩타이드는 역상 C₁₈칼럼을 이용한 HPLC 칼럼으로 분리·정제하고, 그의 분자량을 MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization) 질량 분석법으로 측정하여 설계한 바와 동일한 펩타이드가 합성되었는지를 확인한다 (Hill,er al., Rapid Commin, Mass Spectrometry, 5: 395, 1991).

본 발명에서 제조한 합성 펩타이드의 항진균 효과를 조사하기 위하여, 생육 최소저해농도(MIC), 균체의 성장 억제능, 세포 독성 등을 측정한다.

본 발명의 합성 펩타이드의 항진균 활성을 조사하기 위하여, 균체가 자라지 못하는 펩타이드의 최소 농도인 생육 최소저해농도 및 펩타이드에 의한 균체의 성장 억제능을 측정한다.

병원성 진균인 트리코스포론 베이젤리 (Trichosporon beigelii) 균주 등을 이용하여 YM 배지 등에 배양하고 이를 적당한 세포 수로 마이크로 타이트레이트플레이트에 접종한 다음 본 발명의 합성 펩타이드를 첨가하여 다시 배양한다. 이에 MTT (3-[4,5[Dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)를 첨가하여 발색되는 정도로 생육 최소저해농도를 측정한다 (표 1 및 도 1 참조). 또한 같은 조건으로 합성 펩타이드를 처리하여 균체를 배양하고 상기 MTT 법으로 생육 최소저해농도를 펩타이드 비처리군 및 펩타이드 처리군에서 측정하여 그의 비로 성장 억제능을 측정한다 (표 2 및 도 2 참조).

그 결과, 본 발명의 합성 펩타이드는 균체의 성장을 억제함을 관찰하고 특히 서열 2 의 합성 펩타이드는 기존의 멜리틴이 펩타이드가 농도 3㎍/㎖에서 93.4% 의 억제능을 보이는 것과 비교하여 100% 의 억제능을 나타냄을 알 수 있다.

본 발명의 합성 펩타이드가 세포 독성을 나타내는지를 확인하기 위하여, 적혈구 파괴능 (hemolysis capacity)을 조사한다. 사람의 적혈구를 인산-염화나트륨 완충용액 등으로 희석하고 여기에 합성 펩타이드를 섞어 반응시킨 다음 원심분리하여 그 상등액 속에 포함된 헤모글로빈을 414nm 에서의 흡광도로 측정한다. 세포파괴 정도를 알 수 있는 적혈구 파괴능은 1% 트리톤-X100 을 첨가한 경우의 흡광도를 세포 파괴능 100% 로 보고 이를 상기 측정 값과 비교하여 계산한다 (표 3 참조). 그 결과, 본 발명의 서열 2 의 합성 펩타이드는 50㎍/㎖농도에서도 세포 독성이 거의 없음을 확인한다.

그 결과 본 발명의 펩타이드는 세포 독성을 나타내지 않고 강력한 항진균 활성을 나타냄을 알 수 있다. 본 발명의 합성 펩타이드는 약제학적 측면에서 여러 형태의 현탁제로 제조되어 이용될 수 있다.

본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 펩타이드 설계, 합성 및 분리·정제

본 발명의 합성 펩타이드는 본 발명자들이 개발한 반응기에서 Fmoc 아미노기 보호 용기를 이용한 메리필드 (Merrifield)의 고상법으로 합성하였다 (Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc., 85: 2149, 1963).

본 발명은 기존의 세크로핀의 양친화성 부위인 서열 1-8 을 합성 펩타이드의 아미노 말단에, 멜리틴의 유연성 및 소수성 부위인 서열 1-12 을 카르복시 말단에 위치시켜, 20개의 아미노산으로 이루어진 서열 1 의 아미노산 서열을 가지는 합성 펩타이드를 제조하였다. 또한, 이렇게 설계한 펩타이드에서 카르복시 말단 부위에 위치하는 18번, 19번의 트레오닌(threonine)을 라이신(lysine)으로 치환된 펩타이드를 설계하여 서열 2 의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 제조하였다. 이 때 이들 펩타이드의 카르복시 말단은 아미노화(amidation) 시켰다.

각 합성 펩타이드를 분리용 HPLC 로 분리하고 분석용 HPLC 로 그 순도를 확인한 결과, 95% 이상의 순도를 나타내면서 MALDI 질량 분석을 이용하여 얻은 분자량이 계산된 분자량과 일치함을 알아내고 정확한 아미노산 서열을 가지는 합성 펩타이드가 합성되었음을 확인하였다.

실시예 2 펩타이드의 생육 최소저해농도

본 발명의 합성 펩타이드의 항진균 활성을 조사하기 위하여, 균체가 분열되지 않는 최소 펩타이드 농도인 생육 최소저해농도를 측정하였다.

트리코스포론 베이젤리 (Trichosporon beigelii)를 YM 배지 (0.3% 이스트 추출물, 0.3% 말트 추출물, 0.5% 펩톤, 1% 덱스트로스)에서 배양한 다음 세포 수를 측정하여 5×10⁴개/100㎕의 균체 농도로 YM 배지로 희석하고 마이크로 타이트레이트 플레이트에 접종하였다. 이에 상기 합성 펩타이드를 각각 10, 5, 2.5 및 1.25㎍/㎖ 씩 첨가하여 28℃에서 30시간 동안 배양한 다음 MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5- diphenyltetrazolium bromide)를 10㎕ (5㎎/㎖)씩, 그리고 10X 인산-염화나트륨 완충용액 (PBS, pH 7.0)을 10㎕씩 첨가하여 37℃에서 12시간 정도 발색시키고 발색 정도를 마이크로플레이트 리더를 이용하여 570nm 에서 흡광도로 측정하였다. 그 결과 생육 최소저해농도 (MIC)를 측정하여 표 1 에 나타내었다.

[표 1]

펩타이드	트리코스포론 베이젤리에 대한최소 생육 저해농도(MIC, ㎍/㎖)
세크로핀	ND
멜리틴	5
서열 1 의 합성 펩타이드	5
서열 2 의 합성 펩타이드	2.5

본 측정 결과를 통해 기존의 멜리틴(ME)에 비해 본 발명의 서열 2 의 합성 펩타이드는 2배 낮은 생육 최소저해농도를 나타내므로 기존의 양친화성 펩타이드보다 항진균 활성이 증가되었음을 확인하였다.

실시예 3 균체의 성장 억제능 측정

본 발명의 합성 펩타이드의 항진균 활성을 측정하기 위하여, 펩타이드에 의한 균사체의 성장 억제능을 실시예 2 와 같은 방법으로 측정하였다.

실시예 2 와 동일한 조건으로 합성 펩타이드를 처리하여 균체를 배양하고 상기 MTT 법으로 생육 최소저해농도를 펩타이드 비처리군 및 펩타이드 처리군에서 측정하여 그의 비로 성장 억제능을 측정하였다. 그 결과, 본 발명의 합성 펩타이드는 균체의 성장을 억제함을 관찰하고 특히 서열 2 의 합성 펩타이드는 기존의 멜리틴이 펩타이드 농도 3㎍/㎖ 에서 93.4% 의 억제능을 보이는 것과 비교하여 100% 의 억제능을 나타냄을 알 수 있었다. 표 2 에 그 결과를 나타내었다.

[표 2]

펩타이드	트리코스포론 베이젤리에 대한성장 억제능(%)
세크로핀	0
멜리틴	93.4
서열 1 의 합성 펩타이드	58.6
서열 2 의 합성 펩타이드	100

실시예 4 펩타이드의 세포 독성

본 발명의 합성 펩타이드가 세포 독성을 나타내는지를 확인하기 위하여, 적혈구 파괴능을 조사하였다.

사람의 적혈구를 4% 가 되도록 0.5㎖의 인산-염화나트륨 완충용액 (PBS, pH 7.4)으로 희석하고 여기에 400㎍/㎖ 농도의 합성 펩타이드 용액 0.5㎖ 를 섞어 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음 1,000×g 로 원심분리하여 그 상등액 속에 포함된 헤모글로빈 양을 414nm 에서 흡광도를 측정하여 조사하였다. 세포 파괴 정도를 조사 하기 위하여 1% 트리톤-X100 을 첨가하여 흡광도를 측정하고 1% 트리톤-X100 의 세포 파괴능을 100% 로 보고 이를 각 합성 펩타이드의 적혈구 파괴능 (hemolysis capacity)과 비교하여 계산하였다. 그 결과는 표 3 에 나타내었다.

[표 3]

펩타이드	사람 적혈구 파괴능(%) (50㎍/㎖)
세크로핀 A	0
멜리틴	100
서열 1 의 합성 펩타이드	5.4
서열 2 의 합성 펩타이드	0.4

본 발명의 서열 2 의 합성 펩타이드는 세크로핀, 서열 1 의 합성 펩타이드 )와 같이 세포 독성을 거의 나타나지 않음을 알 수 있었다. 한편 대조군으로 사용한 벌독인 멜리틴 (melittin)은 세포 독성이 100% 로 매우 높게 나타났다.

본 발명의 서열 1 및 서열 2 의 항진균성 펩타이드는 이미 항암 효과가 있다고 알려진 양친화성 펩타이드이므로 항진균 및 항암 효능이 함께 있는 펩타이드로서 앞으로 이용이 크게 기대된다. 특히 서열 2 의 항진균성 펩터이드는 기존의 멜리틴(ME)에 비하여 높은 항진균 활성을 지니면서도 세포 독성이 거의 없어 인체에 안전한 항진균제로서 유용하게 사용될 수 있다. 구체적으로 이는 트리코스포론 베이젤리 (Trichosporon beigelii)에 의해 유발되는 사모증의 치료제 등으로 사용할 수 있고, 그 예방제로도 샴푸 세제 등에 첨가하여 널리 이용될 수 있다.

〔서 열 목 록〕

서열번호 : 1

서열의 길이 : 20

서열의 형 : 아미노산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 펩타이드

[서열 1]

〔서 열 목 록〕

서열번호 : 2

서열의 길이 : 20

서열의 형 : 아미노산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 펩타이드

[서열 2]

Claims (6)

1. 인체에 사용이 가능한 양친화성을 가지는 항진균성 펩타이드.
2. 제 1항에 있어서, 서열 1 의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 항진균성 펩타이드.
3. 제 1항에 있어서, 서열 2 의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 항진균성 펩타이드.
4. 제 1항의 항진균성 펩타이드를 유효 성분으로 하는 약학적 조성물을 트리코스포론 베이젤리 (Trichosporon beigelli) 균주에 의해 유발되는 감염증의 치료제 및 예방제로 사용하는 용도.
5. 제 4항에 있어서, 감염증은 사모증 (white piedra)인 것을 특징으로 하는 용도.
6. 제 4항에 있어서, 항진균성 펩타이드를 유효 성분으로 하는 약학적 조성물을 세제에 첨가하여 사용하는 것을 특징으로 하는 용도.