ITMI20012564A1 - Procedimento per l'alchilazione selettiva di gruppi-sh in proteine e peptidi nello studio di miscele proteiche complesse - Google Patents
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Description
Descrizione dell'invenzione industriale avente per titolo:
"PROCEDIMENTO PER L’ALCHILAZIONE SELETTIVA DI GRUPPI -SH IN PROTEINE E PEPTIDI NELLO STUDIO DI MISCELE PROTEICHE COMPLESSE”
DESCRIZIONE DELL’INVENZIONE
La presente invenzione si riferisce all’uso di molecole in grado di alchilare selettivamente e completamente i gruppi -SH di proteine.
Nell’era post-genomica sta emergendo la scienza “proteomica”, cioè un’area di ricerca che si occupa dell’analisi globale dell’espressione genica, tramite una combinazione di metodiche per risolvere, identificare, quantificare e caratterizzare tutte le proteine presenti in un tessuto, un lisato cellulare, un liquido biologico, un intero organismo (Wilkins, M.R., Williams, K.L., Appel, R.D., Hochstrasser, D.F., Eds., Proteome Research: New Frontiers in Functional Genomics, Springer, Berlin, 1997). Il termine “proteoma” è un neologismo coniato di recente, che indica appunto l’intero assetto di espressione di PROTEine da parte del GenOMA. Poiché il proteoma, anche di un semplice lisato cellulare, può essere estremamente complesso (migliaia e migliaia di proteine), per la sua analisi si usano metodiche dette mappe bidimensionali (2-D) che abbinano una metodica di separazione in base alla carica (isoelettrofocalizzazione, IEF) nella prima dimensione, ad un metodo di separazione in base alla massa (SDS-PAGE, cioè gel elettroforesi in poliacrilamide in presenza di sodio dodecil solfato) nella seconda dimensione. Tale metodo, introdotto già nel 1975 (O'Farrell, P.H., J. Biol. Chem. 250, 1975, 4007-4021) è stato negli anni raffinato con l’introduzione dei gradienti di pH immobilizzati (Righetti, P.G., Immobilized pH Gradients : Theory and Methodology. Elsevier, Amsterdam, 1990), di nuovi surfattanti (Chevallet, M., Santoni, V., Poinas, A., Rouquie, D., Fuchs, A., Kieffer, S., Rossignol, M., Lunardi, J., Garin, J., Rabilloud, T., Electrophoresis 19, 1998, 1901-1909), di nuove metodiche di colorazione (Rabilloud, T., Anal. Chem. 72, 2000, 48A-55A).
Tra i principali problemi nell’ analisi di miscele proteiche complesse vi sono la completa solubilizzazione del campione e l eliminazione di artefatti durante i vari processi elettroforetici. Per affrontare il primo problema si è fatto ricorso all’uso di nuovi surfattanti, del tipo amido-sulfobetaine, in combinazione con agenti caotropici, quali urea/tiourea (Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J., Electrophoresis 18, 1997, 307-316). Quanto all’eliminazione di artefatti, si è recentemente dimostrato che la riduzione e l’alchilazione di ponti disolfuro è un processo fondamentale per evitare la formazione di zone proteiche spurie nelle mappe 2-D. La sola riduzione dei ponti disolfuro in proteine native (tipicamente ottenuta con un eccesso di 2-mercaptoetanolo o ditiotreitolo) non è in grado di evitare artefatti, soprattutto nella prima dimensione di IEF. Infatti, durante il processo di separazione in IEF, soprattutto in ambiente alcalino, i gruppi -SH ridotti si riossidano facilmente, dando luogo a formazione di bande artefattuali dovute ad omo- od etero-oligomeri tra catene polipepti diche uguali o diverse (Herbert, B., Galvani, M., Hamdan, M., Olivieri, E., McCarthy, J., Pedersen, S., Righetti, P.G., Electrophoresis 22, 2001, 2046-2057). Pertanto, si è proposto di ridurre e successivamente alchilare le proteine come pre-trattamento fondamentale del campione, prima dell’inizio di qualsiasi processo di separazione. L’agente alchilante per eccellenza è sempre stata la iodoacetamide, raccomandata fin dagli anni cinquanta dai chimici delle proteine ed universalmente adottata in tutti i protocolli di analisi. Dati recenti, però, hanno dimostrato pesanti limiti di questo agente alchilante:
a) in primo luogo, non è mai possibile ottenere il 100% di alchilazione dei gruppi -SH ridotti (Galvani, M., Hamdan, M., Herbert, B., Righetti, P.G., Electrophoresis 22, 2001, 2058-2065), il che lascia quindi intatti potenziali gruppi reattivi che possono dar luogo a bande spurie. Se il processo di alchilazione viene protratto per tempi superiori a 6 ore, non solo l’alchilazione degli -SH non progredisce, ma si alchilano non-selettivamente altri gruppi reattivi, quali gli ε-amino gruppi di lisine;
b) inoltre, la reazione di alchilazione è fortemente inibita in presenza di numerosi surfattanti usati per solubilizzare tali miscele proteiche;
c) infine, si è recentemente scoperto che la iodoacetamide reagisce rapidamente con uno degli agenti solubilizzanti universalmente adottati oggi nell’analisi del proteoma, e precisamente con la tiourea. L’addizione alla tiourea (presente in forte eccesso) è ancora più rapida dell’addizione ai gruppi -SH, il che può fortemente diminuire la resa della reazione (Galvani, M., Rovatti, L., Hamdan, M., Herbert, B., Righetti, P.G., Electrophoresis 22, 2001, 2066-2074).
Nella presente invenzione si descrive l’uso di molecole che permettono di ovviare a tutti gli inconvenienti sopra citati. Si è infatti trovato che composti debolmente basici, contenenti doppi legami, sono in grado di addizionarsi al gruppo -SH di proteine ridotte: (a) in maniera quantitativa; (b) in maniera selettiva (cioè evitando reazioni collaterali su altri gruppi proteici, quali lisine, tirosine, gruppi -NH2 terminali); (c) senza che si verifichino reazioni collaterali con i componenti della miscela di solubilizzazione, in particolare con la tiourea; (d) senza inibizione da parte dei surfattanti tipicamente utilizzati in tali miscele solubilizzanti.
I composti dei quali si rivendica l’impiego posseggono le seguenti caratteristiche strutturali:
a) la presenza di uno o più atomi di azoto debolmente basici;
b) la presenza di un doppio legame di tipo acrilico.
Composti di questo tipo particolarmente efficaci risultano essere i derivati della vinil piridina, quali la 2- e 4-vinil piridina, le cui strutture sono
riportate qui di seguito:
Meno adatta, per la maggiore facilità di polimerizzazione, ma anch’essa utilizzabile con opportune precauzioni, è la 3-vinilpiridina.
L’impiego di vinilpiridine come alchilanti di gruppi -SH di proteine è stato citato da M.J. Dunn (Gel Electrophoresis: Proteins, Bio Sci Pubi. Oxford, 1993). Tuttavia, tale impiego è stato abbandonato nella pratica corrente, poiché non erano mai state individuate, anteriormente alla presente invenzione, le caratteristiche di estrema selettività, di completa reattività e di altissima specificità di tali molecole. Secondo l’invenzione, infatti, esse possono essere impiegate per l’alchilazione di proteine sia in ambiente alcalino sia a pH attorno alla neutralità; sono compatibili con la presenza nel campione proteico di surfattanti sia zwitterionici (e.g., CHAPS, amidosulfobetaine), sia neutri (Triton X-100, Nonidet P-40), sia anionici (e.g., SDS); sono altresì completamente compatibili con agenti caotropici usati per solubilizzare miscele proteiche complesse, quali l’urea e la tiourea, in quanto non reagiscono con tali composti nelle condizioni d’impiego.
Vengono qui di seguito descritte le proprietà alchilanti di questi composti, paragonate a quelle della iodoacetamide e di derivati neutri del'acrilamide, incluse acrilamidi N-sostituite.
Esempio 1
Cinetica di alchilazione di a-lattalbumina bovina (LCA) con iodoacetamide (IAA). Una soluzione 50 μΜ di LCA in 50 mM Tris-acetato, pH 9.0 e 7 M urea, viene ridotta con 50 mM ditiotreitolo (DTT) per 1 ora a 25 °C. Dopo riduzione, la proteina viene alchilata con 100 mM IAA e la cinetica di alchilazione seguita fino ad un periodo di 24 ore tramite spettrometria di massa in MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorptìon ionization - rime of flight). La LCA contiene nella catena polipeptidica 8 cisteine, quindi 8 -SH potenzialmente alchilabili. Come si vede dalla Fig. 1, già dopo due minuti di reazione il derivato alchilato su 8 gruppi -SH rappresenta solo il 60% dei prodotti di reazione (pannello b, picco ad m/z 14653), il rimanente 40% essendo costituito dai derivati epta- esa- e penta-alchilati, nell’ ordine. Tuttavia si nota che, anche dopo due ore di reazione, il derivato octa-alchilato aumenta ad appena il 70%, il rimanente 30% rappresentando derivati a minor grado di alchilazione (pannello c, picco ad m/z 14656). Non è possibile far progredire la reazione anche per lunghi tempi di incubazione: dopo 24 ore risultano invece alchilati altri gruppi presenti nelle proteine (soprattutto gli εamino gruppi delle lisine) (pannello d; e.g., il picco ad m/z 14707 è un derivato nona-alchilato, ed è il picco maggioritario; inoltre si notano picchi che potrebbero essere deca-alchilati ed anche a maggior grado di alchilazione; il prodotto finale di reazione è comunque fortemente eterogeneo ed il prodotto desiderato, m/z= 14652, è ora fortemente minoritario). La mancata reazione quantitativa e le reazioni collaterali su altri residui aminoacidici sono di notevole disturbo nell’analisi del proteoma, in quanto impediscono il corretto riconoscimento delle proteine, oggi effettuato soprattutto con spettrometria di massa. Inoltre, le reazioni su lisine ed altri residui danno origine a macchie spurie, in quanto generano nuove forme proteiche a differente punto isoelettrico (pi).
Esempio 2
Alchilazione di a-lattalbumina bovina (LCA) con dimetil acrilamide (DMA) e 4-vinil piridina in presenza di surfattanti neutri. Una soluzione 50 μ M di LCA in 50 mM Tris-acetato, pH 9.0 e 7 M urea, viene ridotta con 50 mM ditiotreitolo (DTT) per 1 ora a 25°C. Dopo riduzione la proteina viene alchilata con 100 mM o di DMA o di 4-vinil piridina (4VP) per un’ora a 25°C. Entrambe le reazioni avvengono in presenza di 1% Triton X-100, uno dei possibili surfattanti usati nell’analisi del proteoma. I prodotti di reazione vengono analizzati tramite spettrometria di massa in MALDI-TOF. Come si evince dalla Fig. 2, mentre nel caso di 4VP è presente un solo prodotto di reazione (m/z 15038), corrispondente all’addotto di LCA con 8 residui di 4VP, nel caso di DMA sono ancora presenti piccole quantità di prodotto non reagito (m/z 14213) con tutta una serie di prodotti di reazione i cui i componenti più abbondanti sono i prodotti tri- e tetra-alchilati. Risulta dunque inequivocabile come 4VP sia di gran lunga il reattivo più efficace, in grado di portare la reazione a completamento rimanendo insensibile all’effetto di inibizione di surfattanti.
Esempio 3
Alchilazione di a-lattalbumina bovina (LCA) con acrilamide e con 2- o 4-vinil piridina in presenza di surfattanti zwitterionici a pH neutro. L’ alchilazione di proteine con IAA è di solito condotta a valori di pH tra 8.5 e 9.0, il che facilita la reazione tra il gruppo -S" (pK 8.3), carico negativamente, ed agenti neutri quali IAA ed acrilamide. A questo valore di pH, tuttavia, e per tempi di alchilazione lunghi, si verificano reazioni spurie, quali l’alchilazione degli ε-amino gruppi delle lisine. Al contrario, la 2- e 4-vinil piridina sono basi deboli (pK 5.2), che a pH 5 esistono in forma protonata, il che le rende, fortemente reattive con i gruppi -SH deprotonati. Un pH di reazione interessante potrebbe essere pH 7.0, circa a metà strada tra i due valori di pK dei due reagenti. A questo pH sia l’agente alchilante sia il gruppo -SH avrebbero ancora una parziale carica positiva e negativa, rispettivamente, che li potrebbe rendere decisamente reattivi. Una soluzione 50 μΜ di LCA in 50 mM fosfato, pH 7.0 e 7 M urea, viene ridotta con 50 mM ditiotreitolo (DTT) per 1 ora a 25°C. Dopo riduzione la proteina viene alchilata con 100 mM o di acrilamide o di 2- o 4-vinil piridina (4VP) per un’ora a 25°C. Entrambe le reazioni avvengono in presenza di 1% di amidosulfobetaina (ASB), un surfattante zwitterionico molto usato nell’analisi del proteoma. I prodotti di reazione vengono analizzati tramite spettrometria di massa in MALDI-TOF. Come si evince dalla Fig. 3, mentre nel caso di 2VP e 4VP (pannelli b e c) è presente un solo prodotto di reazione (m/z 15038), corrispondente all’addotto di LCA con 8 residui di 4VP, nel caso dell’ acrilamide sono ancora presenti notevoli quantità di LCA non reagito, con tutta una serie di prodotti di reazione, in cui i componenti più abbondanti sono i prodotti di- e tri-alchilati. Risulta dunque inequivocabile come 2VP e 4VP siano di gran lunga i reattivi più efficaci, in grado di portare a completamento la reazione, rimanendo inoltre insensibili all’effetto di inibizione di surfattanti.
Esempio 4
Alchilazione di lisozima con acrilamide e con 4-vinil piridina a pH alcalino e neutro. Si è voluto anche investigare se il punto isoelettrico (pi) della proteina possa influenzare l’alchilazione dei gruppi -SH. Questo potrebbe essere un inconveniente proprio nel caso di 2VP e 4VP (dato il loro carattere debolmente basico) in caso di reazione con proteine basiche, in quanto l’eccesso di cariche positive su tali proteine potrebbe inibirne l’accesso ai siti di reazione. Si è pertanto studiato il comportamente del lisozima (da uova di pollo), proteina a pi ca. 10, anch’essa contenente 8 cisteine nella catena polipeptidica. Una soluzione 50 μΜ di lisozima in 50 mM fosfato, pH 7.0, oppure in 50 mM Tris-acetato, pH 9.0, sempre in presenza di urea 7M, viene ridotta con 50 mM ditiotreitolo (DTT) per 1 ora a 25°C. Dopo riduzione, la proteina viene alchilata con 100 mM di acrilamide o di 4VP per un’ora a 25°C. I prodotti di reazione vengono analizzati tramite spettrometria di massa in MALDI-TOF. Come si deduce dalla Fig. 4, nel caso di 4VP (pannello a per la reazione a pH 9.0 e b per quella a pH 7.0) un solo prodotto di reazione è presente (m/z 15164), corrispondente all’addotto di lisozima con 8 residui di 4VP, mentre nel caso di acrilamide è presente come prodotto principale il picco m/z 14893 (corrispondente all’ addotto con 8 residui di acrilamide) ma sono pure visibili notevoli quantità di m/z 14750 e 14822, corrispondenti ai prodotti esa- ed epta-alchilati, rispettivamente. Risulta dunque inequivocabile come 4VP (ed il suo analogo 2VP) siano in grado di alchilare al 100% anche proteine basiche e a pH sfavorevoli, quale pH 7.0, cioè a un pH in corrispondenza del quale la carica positiva del lisozima aumenta notevolmente.
Esempio 5
Alchilazione di proteine a medio Mr, e con alto contenuto di cisteine, con IAA e con 4 VP a pH neutro. Negli esempi sopra riportati è stata analizzata l’alchilazione di proteine di piccole dimensioni (13-15000 Da) e a contenuto medio di gruppi -SH (8 cisteine). Si è ritenuto opportuno valutare le reazioni su proteine a massa medio-alta e con elevato contenuto di cisteine nella catena polipeptidica. Due casi interessanti sono rappresentati dall’albumina di siero umano (HSA) (Mr 66472, pi 5.7, contenente 35 residui di cisteina) e dalla fosforilasi di coniglio (Mr 97158, pi 6.8, contenente 36 residui di cisteina). Soluzioni di 50 μΜ di HSA, o di fosforilasi, in 50 mM fosfato, pH 7.0, entrambe in presenza di urea 7M, vengono ridotte con 50 mM di ditiotreitolo (DTT) per 1 ora a 25°C. Dopo riduzione le proteine vengono alchilate con 100 mM o di IAA o di 2 VP o 4 VP per una o sei ore a 25°C. I prodotti di reazione vengono analizzati tramite spettrometria di massa in MALDI-TOF. I risultati sono riportati in Tabella 1.
*La percentuale di alchilazione nei tre casi è stato misurato tramite spettrometria di massa MALDI-TOF delle proteine intatte.
Si può notare come, nel caso di IAA, per entrambe le proteine si raggiunge un valore di alchilazione di 68% ca. dopo un’ora di reazione, e di ca. 80% dopo sei ore; al contrario, nel caso di 4VP (o del suo analogo 2VP) si raggiunge già il valore di 100% di reazione dopo una sola un’ora di incubazione.
Esempio 6
Alchilazione di proteine con 2- o 4-VP normali e deuterate per l’analisi quantitativa dell’espressione proteica. Per lo studio della variazione di espressione proteica in cellule di controllo vs. cellule sottoposte a trattamenti (con farmaci, induttori, inibitori, etc.) è importante poter marcare le due popolazioni cellulari, separatamente, con alchilante normale e con alchilante deuterato. I due campioni vengono poi mescolati in rapporto 1:1 e ia mappa 2-D sviluppata. Le zone proteiche che, da analisi con programmi di quantizzazione (tipo il PDQuest e il Melarne) risultano aver variato l’espressione (mostrando incrementi o decrementi della sintesi proteica) vengono eluite dal gel di poliacrilamide, digerite con tripsina ed i peptidi analizzati tramite spettrometria di massa in MALDI-TOF. A questo punto, tutti i peptidi marcati con 2- o 4-VP si sdoppiano in due picchi, il picco “leggero” e quello “pesante” (quest’ultimo marcato con l’isotopo deuterato), spaziati ad una distanza di 7 Da. Un rapporto unitario tra le aree dei due picchi isotopici significa che non ci sono state variazioni di sintesi proteica tra il controllo e le cellule trattate. Se invece tale rapporto è maggiore (o minore) di uno, ciò significa che nelle cellule trattate vi è stata o induzione o repressione della sintesi proteica. Tale metodo permette quindi di constatare, in maniera univoca, quali effettori inducono o reprimono la sintesi proteica ed è quindi di fondamentale importanza nella valutazione di tutti gli effetti biologici indotti da farmaci, nello studio d’insorgenza di malattie geniche eccetera. L’uso del rapporto isotopico per questi tipi di studi è descritto in letteratura (Gygi, S.P., Aebersold, R., in Proteomics: a Trend Guide, Blackstock, W., Mann, M., eds., Elsevier, London, 2000, pp. 31-36), ma l’agente alchilante usato è una molecola molto complessa, della quale non è mai stata dimostrata la reattività e che non risulta in grado di alchilare i gruppi -SH in maniera quantitativa, come avviene invece nel caso della 2- e della 4-vinil piridina. Inoltre, l’agente cui si è accennato è biotinilato, in quanto serve per la separazione in cromatografia di affinità dei peptidi marcati, cosa non necessaria nel caso delle mappe 2-D. E’ stata pertanto preparata una 2-vinilpiridina parzialmente o totalmente deuterata, partendo da 2-metilpiridina eptadeuterata, dalla quale si passa al corrispondente picolillitio e quindi, per reazione con paraformaldeide, alla 2-(2-idrossietil)-piridina, secondo quanto descritto da J. Finkelstein et al. in Journal of Organic Chemistry 4, 374 (1939). Da quest’ultimo composto si perviene (I. C. Ivanov et al., Arch. Pharm. 322 (3), 181, 1989) alla 2-vinilpiridina, eptadeuterata impiegando d2- paraformaldeide o pentadeuterata qualora s’impieghi paraformaldeide non deuterata, quindi con differenze di massa di 7 e rispettivamente 5D rispetto alla 2-vinilpiridina “leggera” (La preparazione delle altre due vinilpiridine deuterate può essere realizzata conducendo con gli opportuni reagenti le impiegando gli opportuni reagenti deuterati nelle sintesi descritte per esempio in USP 2.556.845 nel caso delle 4-vinilpiridina, e in Tetrahedron Letters 1993, 8329 e in Journal of thè American Chemical Society 75, 4738 (1953) per quanto riguarda la 3-vinilpiridina).
La Fig. 5 offre un esempio di questo tipo di analisi. Sieri di ratti normali sono stati marcati con 2-vinilpiridina “leggera” e rispettivamente eptadeuterata, mescolate in rapporto 70% deuterata e 30% leggera, e separati in mappe 2-D. La zona della glicoproteina acida (Mr 21546, pi 5.0) è stata eluita, digerita con tripsina ed analizzata in spettrometria di massa MALDI-TOF. Tale analisi ha fornito lo spettro di massa in Fig. 5. Un numero di frammenti peptidici vengono osservati a vari valori di m/z, inclusi i due frammenti a m/z 1235.0 e 1241.9. La differenza di m/z 6.9 coincide con la differenza tra la 2-dl VP e la 2-VP non deuterata. Questa osservazione, assieme all’intensità relativa dei due segnali (ca. 68:32) conferma che questo frammento contiene un singolo residuo di cisteina che riflette il rapporto dei marcatori isotopici (70:30) nella miscela di origine.
Claims (10)
- RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per l’alchilazione selettiva dei gruppi -SH di proteine e polipeptidi, caratterizzato dal fatto che in qualità di agenti alchilanti ad altissima selettività, reattività e specificità s’impiegano molecole a loro volta caratterizzate dalla presenza di uno o più atomi di azoto debolmente basico; e dalla presenza di un doppio legame di tipo acrilico, dette molecole potendo essere deuterate.
- 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che in qualità di agenti alchilanti ad altissima selettività, reattività e specificità s’impiegano 2-vinilpiridina, 3-vinilpiridina o 4-vinilpiridina, eventualmente deuterate.
- 3. Procedimento secondo le rivendicazioni 1 e 2 applicato all’analisi del proteoma o di miscele proteiche/peptidiche sia allo stato nativo sia allo stato denaturato.
- 4. Procedimento secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che l’analisi viene condotta tramite mappe bidimensionali elettro foretiche, caratterizzate da una prima dimensione in isoelettrofocalizzazione (sia convenzionale sia in gradienti di pH immobilizzati) seguita da una seconda dimensione in SDS-PAGE.
- 5. Procedimento secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che l’analisi viene condotta tramite qualsiasi tipo di separazioni elettro foretiche, sia mono-dimensionali che bi- o multi-dimensionali, sia in fase libera che su vari tipi di gels (inclusi, ma non esclusivamente, gels di poliacrilamide e di agarosio).
- 6. Procedimento secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che l’analisi viene condotta tramite elettroforesi capillare in fase libera, in polimeri setaccianti, in presenza di SDS, in isolettrofocalizzazione, in capillari convenzionali, in micro- e nano-chips.
- 7. Procedimento secondo le rivendicazioni da 3 a 6, caratterizzato dal fatto che l’analisi viene condotta in combinazione con altre metodiche, quali blotting e spettrometria di massa, sia on-line, sia off-line.
- 8. Procedimento secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che l’analisi viene condotta mediante separazioni cromatografiche, sia mono dimensionali che bi- o multi-dimensionali.
- 9. Procedimento secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che l’analisi viene condotta tramite separazioni abbinate elettroforetiche/cromatografiche, sia bi- sia multi-dimensionali.
- 10. Procedimento secondo le rivendicazioni 1 e 2 applicato al prefrazionamento nell’analisi del proteoma, o di miscele proteiche/peptidiche in generale, tramite separazioni elettroforetiche o cromatografiche d’ogni tipo, eventualmente abbinate fra loro.
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