JP2001521364A

JP2001521364A - 抗微生物性タンパク質

Info

Publication number: JP2001521364A
Application number: JP52718097A
Authority: JP
Inventors: マナーズ，ジョン・マイケル; マーカス，ジョン・ポール; グールター，ケネス・クリフォード; グリーン，ジョディー・リン; ハリソン，スチュアート・ジョン
Original assignee: University of Queensland UQ
Current assignee: University of Queensland UQ
Priority date: 1996-01-31
Filing date: 1997-01-31
Publication date: 2001-11-06
Also published as: DE69736828T2; BR9707481A; ATE342993T1; KR19990082212A; WO1997028185A1; EP0877756A4; DE69736828D1; ES2277352T3; CN1216550A; EP0877756A1; NZ326727A; EP0877756B1; CA2251537A1; AUPN780296A0

Abstract

(57)【要約】新しい類の抗微生物性タンパク質が記載されている。原型のタンパク質はＭｉから単離される。タンパク質をコードするＤＮＡがＤＮＡ構築体と共に記載され、これは抗微生物性タンパク質を発現するのに、または抗微生物性タンパク質を植物に導入するのに用いられる。抗微生物性タンパク質含有の組成物および抗微生物性タンパク質自体が微生物の蔓延に対処するために植物または哺乳動物に投与される。

Description

【発明の詳細な説明】抗微生物性タンパク質技術分野本発明は、真菌および細菌の成長に阻止活性を及ぼす単離されたタンパク質に関する。真菌および細菌は植物および動物のいくつかの微生物病原菌を含む。本発明はまた、抗微生物性タンパク質をコードする配列を含む組換え遺伝子に関し、その発現産物は、病原微生物の感染から植物細胞または他の生物細胞を守ることに役立ち得る。本発明はさらに、ヒトおよび家畜の診療における微生物コントロールのためのタンパク質および／またはタンパク質をコードする遺伝子の使用に関する。発明の背景植物の微生物病は農業および園芸産業にとって重要な問題である。植物の病気は一般に年間何百万トンもの作物損失を引き起こし、これら損失の大部分は真菌性および細菌性の病気が原因である。真菌性および細菌性の病気に対処する一つの可能な方法は、病原菌の感染に対する植物の抵抗力を何らかの方法で高めるタンパク質を発現し得る形質転換植物または該タンパク質を提供することである。簡単な戦略は、まずインビトロで抗微生物活性を有するタンパク質を同定し、タンパク質をコードするＤＮＡ配列をクローニングし、植物におけるタンパク質の有効な発現のためのキメラ遺伝子構築体をつくり、この遺伝子を形質転換植物に転移し、導入された遺伝子の病原微生物に対する抵抗力の効果を対照植物との比較で検査する。上記病気のコントロールのための戦略で最も重要な最初の工程は、強力な抗微生物活性を有するタンパク質を同定することである。近年、抗微生物および／または抗真菌活性を有する多くの様々な植物タンパク質が同定され、記述されたきた。これらのタンパク質は、推定活性形態および／またはアミノ酸配列相同性によっていくつかの種類に分類される。これらの種類には下記のものがある：キチナーゼ（Roberts，W.K．et al．[1986]Biochim．Biophys．Acta 880:161-170）；β−１,３−グルカナーゼ（Manners，J.D．et al．[1973]Phytochemistry 12: 547-553）；チオニン（Bolmann，H．et al．[1988]EMBO J．7:1559-1565 and Fe rnadez de Caleya，R．et al．[1972]Appl．Microbiol．23:998-1000）；ペルマチン（Roberts，W．K．et al．[1990]J．Gen．Microbiol．136:1771-1778 and V igers，A.J．et al．[1991]Mol．Plant-Microbe Interact．4:315-323）；リボソーム非活性タンパク質（Roberts，W．K．et al．[1986]Biochim．Biophys．Ac ta 880:161-170 and Leah，R．et al．[1991]J．Biol．Chem．266:1564-1573）；植物デフェンシン（Terras，F．R．G．et al．[1995]The Plant Cell 7:573-5 88）；キチン結合タンパク質（De Bolle，M.F.C．et al．[1992]Plant Mol．Bio l．22:1187-1190 and Van Parijs，J．et al．[1991]Planta 183:258-264)；タウマチン様またはオスモチン様タンパク質（Woloshuk，C.P．et al．[1991]The Plant Cell 3:619-628 and Hejgaard，J．[1991]FEBS Letts．291:127-131）；ＰＲ１型タンパク質（Niderman，T．et al．[1995]Plant Physiol．108:17-27）；非特異性脂質転移タンパク質（Terras，F．R．G．et al．[1992]Plant Physio l．100:1055-1058 and Molina，A．et al．[1993]FEBS Letts．3166:119-122）；およびクノチンまたはクノチン様タンパク質（Cammue，B.P.A．et al．[1992] J．Biol．Chem．67:2228-2233)。さらに、植物は抗微生物性タンパク質の唯一の源でなく、動物および微生物細胞からの抗微生物性タンパク質の単離に関して多くの報告がある（Gabay，J.E．[1994]Science 264:373-374 and in“Anti-micro bial peptides”[1994]CIBA Foundation Symposium 186，John Wiley and Sons Publ.，Chichester，UK）。形質転換植物においてインビトロ抗微生物活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の異所性発現が、病原微生物に対する抵抗力を高めることができるといういくつかの証拠がある。この設計された抵抗力の例には、植物キチナーゼ単独（Broglie，K．et al．[1991]Science 254:1194-1197）またはβ−１,３−グルカナーゼとの併用（Van den Elzen，P.J.M．et al．[1993]Phil．Trans．Roy．S oc．342:271-278）；植物デフェンシン（Terras，F.R.G．et al．[1995]The Plant Cell 7:573-588）；オスモチン様タンパク質（Liu，D．et al.[1994]Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 91:1888-1892）；ＰＲ１型タンパク質（Alexander，D ．et al．[1993]Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:7327-7331）およびリボソーム非活性タンパク質（Logemann，J．et al．[1992]Bio/Technology 10:305-308）をコードする遺伝子を発現する形質転換植物がある。形質転換植物における病気の抵抗力を設計するための抗微生物性タンパク質の可能と考えられる使用は広範囲に記載されてきたが、言及する価値のある他の適用がある。まず、非常に有効な抗微生物性タンパク質は、直接的適用により植物の病気のコントロールに使用され得る（De Bolle，M.F.C．et al．[1993]in Mec hanisms of Plant Defence Responses，B．Fritig and M．Legrand eds.，Kluwe r Acad．Publ.，Dordrecht，NL，pp．433-436）。さらに、抗微生物性ペプチドは、ヒトおよび家畜の医薬に潜在的な治療効果を有する。これは植物起源のペプチドに関して記載されていないが、動物からのペプチドで活発に調査されていて、臨床試験まで行った（Jacob，L．and Zasloff，M．[1994]in“Anti-microbial Peptides”，CIBA Foundation Symposium 186，John Wiley and Sons Publ.，C hichester，UK，pp．197-223）。本明細書に記載の発明は、以前に発見されなかった新規の抗微生物活性を有するタンパク質を構成する。このタンパク質はMacadamia integrifolia（Mi）植物から単離することができる。Macadamia integrifoliaはヤマモガシ（Proteaceae ）科に属する。M.integrifoliaはまた、Bauple NutまたはQueensland Nutとしても知られ、世界で最高の食用ナッツと考えられている。このような理由で、該ナッツはオーストラリアおよび海外の広範囲で商業的に栽培されている（Williams ，Keith A．W.，Native Plants（Queensland），Volume II，1984，published b y Keith A．W．Williams and printed by Printcraft of Newstead，Qld，Austr alia）。発明の概要本発明の第一の実施態様により（i）図６に示す配列（配列番号１）の残基２７から１０２に対応するアミノ酸配列を含むタンパク質；（ii）（i）の相同物；（iii）（i）と基本的に同じ３次元構造を有し、かつ(i)と基本的に同じ抗微生物活性を有するタンパク質；（iv）−Ｃ−９Ｘ−Ｃ−Ｘ−Ｃ−２５Ｘ−Ｃ−１４Ｘ−Ｃ−１１Ｘ−Ｃ−の相対システイン間隔（式中、Ｘはシステイン以外のアミノ酸残基）を含むタンパク質；（v）（i）に対する抗体に特異的に反応し、かつ（i）と基本的に同じ抗微生物活性を有するヤマモガシ科から単離されたタンパク質よりなる群から選ばれた単離または合成の抗微生物性タンパク質が提供される。本発明の第二の実施態様により、第一実施態様のタンパク質をコードする単離または合成ＤＮＡが提供される。本発明の第三の実施態様により、該コードタンパク質の発現のため作用的にエレメントに結合した第二実施態様のＤＮＡを含むＤＮＡ構築物が提供される。本発明の第四の実施態様により、第三実施態様のＤＮＡ構築物を含有する宿主細胞が提供される。本発明の第五の実施態様により、第三実施態様のＤＮＡ構築物を含有する形質転換植物が提供される。本発明の第六の実施態様により、第五実施態様の形質転換植物の再生産材料が提供される。本発明の第七の実施態様により、第一実施態様の抗微生物性タンパク質を農業的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に含有する組成物が提供される。本発明の第八の実施態様により、第一実施態様の抗微生物性タンパク質を薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に含有する組成物が提供される。本発明の第九の実施態様により、植物の微生物蔓延をコントロールする方法が提供され、その方法は、（i）第三実施態様のＤＮＡ構築物を該植物に導入するか、または（ii）第一実施態様の抗微生物性タンパク質または第七実施態様の組成物で該植物を処置することを含む。本発明の第十実施態様により、哺乳動物の微生物蔓延をコントロールする方法が提供され、その方法は、第一実施態様の抗微生物性タンパク質または第八実施態様の組成物で動物を処理することを含む。本発明の他の実施態様は、抗微生物性タンパク質をつくる方法を含む。図面の簡単な説明図１は、マカダミアナッツから抽出された塩基性タンパク質フラクションのカチオン交換クロマトグラフィーを所望のフラクションについてのバイオアッセイの結果とともに示す。図２は、カチオン交換単離からえられた高度の阻止フラクション３１および３２の逆相ＨＰＬＣおよび対応のバイオアッセイデータを示す。図３は、精製ＭｉＡＭＰ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。図４は、ＭｉＡＭＰ１の質量分光分析の結果を示す。図５は、還元およびアルキル化ＭｉＡＭＰ１の質量分光分析の結果を示す。図６は、ＭｉＡＭＰ１のアミノ酸配列とタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを示す。図７は、ＭｉＡＭＰ１に対するウサギ抗血清を用いる種々のProteaceae種からのタンパク質抽出物のウエステンブロットを示す。図８は、プラスミドｐＰＣＶ９１−ＭｉＡＭＰ１のマップである。図９は、プラスミドｐＥＴ−ＭｉＡＭＰ１のマップである。図１０は、形質転換または非形質転換E.coliの培養物からのサンプルを分析するのに用いた染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。本発明を実施する最良態様および他の態様下記の略号を本明細書で使用する。ＦＢＳウシ胎児血清ＥＤＴＡエチレンジアミンテトラ酢酸ＬＤＨラクテート・デヒドロゲナーゼＭｅＣＮメチルシアニド（アセトニトリル）Ｍｉ Macadamia integrifolia ＭｉＡＭＰ１ Macadamia integrifolia抗微生物性タンパク質１ＮＤ未測定ＰＣＲポリメラーゼ連鎖反応ＰＭＳＦフェニルメチルスルホニルフルオリドＳＤＳ−ＰＡＧＥナトリウム・ドデシルスルフェート・ポリアクリルアミドゲル電気泳動ＴＦＡトリフルオロ酢酸ＴＰＣＫトシルフェニルアラニン・クロロメチルケトンＲＡＣＥｃＤＮＡ末の急速増幅本発明は抗微生物性タンパク質の新しい類を同定する。原型のタンパク質は、 Macadamia integrifolia（以後、Ｍｉ）の種子から単離される。そして本発明は、抗微生物性タンパク質自体およびそのタンパク質をコードするＤＮＡ配列を提供する。本発明は、ヤマモガシ科の植物組織から関連タンパク質を得る方法も提供する。抗微生物性タンパク質の特定例−Macadamia integrifolia抗微生物性タンパク質１番（ＭｉＡＭＰ１）に対する抗体でもって、Macadamia integrifoliaに関連する他種の木から組織を選別することが可能である。マカダミアの他種および更に広いカテゴリーのヤマモガシ科の種がこの選別にとっての主要な標的である。実施例１０に示すように、この選別は、種子組織における抗原応答、大きさ、位置に基づくＭｉＡＭＰ１に関するタンパク質含有のいくつかの種を同定するのに用いられる。関連タンパク質の選別をヤマモガシ科に限定する必要はなく、他種が同様のタンパク質を含有していることもある。本発明はまた、原型の抗微生物性タンパク質のアミノ酸配列を提供する（実施例９）。この配列から、タンパク質をコードするＤＮＡ配列がアミノ酸配列の逆翻訳により誘導され得る。抗微生物性タンパク質コードのヌクレオチド配列を有するＤＮＡは、化学的および／または酵素的に合成され、あるいはCurrent Pr otocols in Molecular Biology（copyright 1987-1995，edited by Ausubel F． M．et al．and published by John Wiley & Sons，Inc.，printed in the USA）などの実験マニュアルに記載の標準的クローニング法を用いてマカダミア植物組織から単離される。抗微生物性タンパク質自体は、Ｘ線結晶または核磁気共鳴を用いて測定される特定の３次元構造を表す。この構造はタンパク質の抗微生物性活性に大きく影響する。タンパク質の配列から、タンパク質が発揮するであろう可能な立体配座および構造モチーフ（２次構造）についての予測をすることもできる。当業者は、既知構造のタンパク質をとりあげ、意味のあるように配列を変えて、タンパク質の全体の３次元形および抗微生物性活性を保持し得るであろう。重要な影響なしには多くの場合変わり得ないであろう構造のひとつは、システイン含量およびシステイン残基の間隔である。なぜなら、これはタンパク質の全体構造を保持するのに重要なジスルフィド結合の形成を崩壊させるであろうからである。タンパク質の形および機能を決定するのに重要である他の残基は、タンパク質の骨格における特別の立体配座を決めるであろうグリシンとプロリンである。同様に、タンパク質の３次元空間における電荷残基（すなわち、アルギニン、リジン、ヒスチジン、グルタメートおよびアスパルテート）の分布が構造および発揮される活性に重要であろう。特に、正電荷残基の高密度は、様々なタンパク質において抗微生物性を付与することが示されている（Pathak et al．[1995]PROTEINS:Structu re，Function and Genetics 22:182-186）。これらのタンパク質をコードするＤＮＡ配列は標準コドン表を用いて演繹される。この有限数の可能なＤＮＡ配列を用いて、適当なオリゴヌクレオチドプローブが誘導され、実際の遺伝子（実施例１１）および対照配列を単離するのに使用される。標準ＤＮＡ合成機（ベックマンオリゴ１０００機）と合成遺伝子フラグメントを全遺伝子中に構築する既知技術（参照、Current Protocols in Molecul ar Biology前出）とを使用して、化学的に遺伝子を合成することもできる。この遺伝子は、構成的または誘導的プロモーター（実施例１２および１４）のコントロールの下に、タンパク質の発現をもたらす生物系にクローンされる。タンパク質を種々の系で発現する形質転換法は既知である。このタンパク質は更に使用するためタンパク質を生産する目的に適した系で発現される。このタンパク質の発現に適した宿主には、E.coli、真菌細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞および植物がある。このような宿主におけるタンパク質発現の標準的方法は、Current Protocols in Molecular Biology（前出）の１６章（タンパク質発現）などの種々の教科書に記載されている。植物細胞は、種々の既知方法（Agrobacterium、Ｔｉプラスミド、マイクロ注入、マイクロ射出ガンなど）により本発明のＤＮＡ構築物で形質転換し得る。植物における発現について、ＤＮＡ配列コード、例えばＭｉＡＭＰ１が、特定の細胞室（例えば、アポプラストまたは空胞）にタンパク質を標的する天然または異型のシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配列と共に用いられる。これらのコード配列は、植物細胞における強力な発現をもたらすであろう植物プロモーター配列に連結し得る。このプロモーター配列は、ほとんどあるいはすべての植物細胞におけるタンパク質の強力な構成的発現をもたらすであろう。そして、この配列は、微生物感染に感受性のある特定の組織または細胞での発現をもたらすプロモーターであり、また感染過程において発現を強力に誘導するプロモーターでもあり得る。これらのタイプの遺伝子カセットはまた、ＭｉＡＭＰ１コード領域の転写終了およびポリアデニル化配列３’を含み、ＭｉＡＭＰ１をコードするｍＲＮＡの効率的な産生および安定化を保証する。ＭｉＡＭＰ１の効率的な発現は、１またはそれ以上の活性ＭｉＡＭＰ１分子を産生するために植物中にプロセスされた非常により大きいタンパク質をコードする配列に、このＤＮＡを挿入することにより容易になし得るであろう。上記のＭｉＡＭＰ１をコードする遺伝子カセットは、２種類の普通の方法を用いて植物細胞中で発現さすことができる。第一の方法では、遺伝子カセットをバイナリーベクターに連結できる。このベクターは、i）Agrobacterium tumefaciens ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡをはさむ左と右の境界配列、ii）抗生物質耐性植物細胞の選択のために適した選択可能マーカー遺伝子、iii）A.tumefaciensまたはEsherichia coliのいずれかの中で機能する複製源およびiv）A.tumefaciensおよびE.coliのプラスミド保有細胞の選択をもたらす抗生物質耐性遺伝子を有している。キメラＭｉＡＭＰ１コード遺伝子を保有するこのバイナリーベクターは、電気穿孔法かトリパレンタルマッチングかにより、ＬＢＡ４４０４、ＧＶ３１０１またはＡＧＬ１株などのジスアームＴｉプラスミドを保有するA.tumefaciens株、またはＲ４またはＮＣＣＰ１８８５などのA.rhizogenes株に導入することができる。次いで、これらのAgrobacteriu m株は、適当な植物の外植片または無傷植物組織および抗生物質耐性で選択された形質転換植物細胞および／または再生体とともに共培養することができる（実施例１２及び１３）。形質転換植物におけるＭｉＡＭＰ１タンパク質の発現はタンパク質に対する抗体または抗微生物バイオアッセイのいずれかを用いて検出できる。植物への遺伝子転移の第２の方法は標的植物細胞に遺伝子を直接的に挿入することによりなされる。例えば、ＭｉＡＭＰ１コード遺伝子カセットは、植物中の抗生物質耐性についてのキメラ遺伝子をコードするプラスミドと共に金またはタングステン粒子上に共沈殿さすことができる。タングステン粒子はヘリウムガスの速い流れで加速され、適当な植物組織にばらまかれる。これには、胚胎細胞培養、植物外植片、カルス組織、細胞懸濁および無傷の分裂組織がある。植物は、選択のための抗生物質耐性遺伝子およびＭｉＡＭＰ１タンパク質発現の植物細胞を検出するのに用いた抗体を使用して、回収できる。植物におけるＭｉＡＭＰ１発現についてこれらの方法および他の関連方法は“Plant Molecular Biolog y”（2nd ed.，edited by Gelvin，S.B．and Schilperoort，R.A.,^C1994 publis hed by Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，The Netherlands）に記載されている。単子葉および双子葉植物の両方が形質転換され、再生され得る。遺伝子的に修飾され得る植物体には、穀物、飼料、果物、野菜、油種子、ヤシ、樹木およびブドウがある。修飾され得る植物の特定の例は、トウモロコシ、バナナ、ピーナッツ、飼料豆、サンフラワー、トマト、カノラ、タバコ、コムギ、オオムギ、オートミール、ジャガイモ、大豆、綿、カーネーション、モロコシ、ルピナスおよび米である。これらは、あるいは他の農業植物は、抗微生物性遺伝子で形質転換されて、病原体に対して大きい抵抗性を発揮する。また、このタンパク質はトポロジカルな使用により疾患のコントロールに用いられる。本発明は、ヒトを含む哺乳動物の病原体をコントロールするのに抗微生物性タンパク質を使用することに関する。タンパク質は微生物感染のコントロールにトポロジカルまたは静脈内いずれにも適用される。 Macadamia integrifolia抗微生物性タンパク質（ＭｉＡＭＰ１）上記したように、強力な抗微生物性タンパク質の新しいクラス（Ｍｉ種子から単離）を同定し、特性を明らかにした。このクラスには上記したようにＭｉＡＭＰ１と名付けた特定のタンパク質ファクターを含む。このタンパク質は、推定ｐＩ値１０．１の高い塩基性で、６個のシステイン残基を含み（実施例８及び９）、これらの残基はジスルフィドの形成を通じてタンパク質の３次元構造を安定にするのに重要であると推定される。更に、タンパク質の比較分子質量が質量分光分析により調べられ、８１３４±２Ｄａを示した。アミノ酸配列は、ブラスト・アルゴリズム（Altschul，S.F．et al．[1990]J．Mol．Biol．215:403）を用いて調査した配列データベース（Swiss Prot and Non-redundant databases）に記載されているタンパク質と顕著な相同性がなく、新規な抗微生物性タンパク質であることが分かった。このタンパク質は、植物、動物または微生物のいずれからの抗微生物性タンパク質について以前から知られているクラスに適合しない。ＭｉＡＭＰ１タンパク質は広い範囲の抗真菌類活性を示す（実施例４）。ＭｉＡＭＰ１は１μｇ／ｍｇの低い濃度で真菌類の生育を顕著に阻止し、病原体／微生物のあるものに対しては低い値のＩＣ₅₀、２μｇ／ｍｌで検査された。このように、いくつかの植物疾患に対する保護を提供するのに用いられる。ＭｉＡＭＰ１は植物の部分に適用され、殺真菌剤または抗生物質として用いることができる。このタンパク質は、形質転換植物全体の中で発現されることにより病原体の生育を阻止するのに用いられる（実施例１３）。このタンパク質はトポロジカル適用または静脈注射によりヒト病原体のコントロールに用いられる。その一つの特徴は、いくつかの微生物の阻止がＣａ²⁺の存在（１ｍＭ）によって抑制されることである。上記の本発明の実施態様に特に関して、第一の実施態様について好ましい抗微生物タンパク質はＭｉＡＭＰ１である。このタンパク質は図６（配列番号１）に示す配列の２７−１０２残基に対応する基を有す。本発明の抗微生物タンパク質は、本明細書に例示した方法を含み、当業者に知られている方法のいずれによっても単離される。抗微生物タンパク質は化学的または酵素的に合成され得る。これらの方法も、当業者に既知であり、また例えば Hancock，D．C．et al．(1995)Mol．Biotech．4(1):73-86，and Wong，C．H．an d Wang，K．T．(1991)Experientia（Basel）47(11-12):1123-1129に記載されている。図６タンパク質の相同物は、図示された配列に実質的に同じアミノ酸配列を有するタンパク質であると定義される。このことは、ＭｉＡＭＰ１中に存在する大多数の残基が同じ相対位置において相同物に存在するか、同じ性質を有し、側鎖含有の他のアミノ酸残基で表現されることを意味する。例えば、アスパラギンとアスパラギン酸；アラニンとグリシン；セリンとスレオニンとアラニン；イソロイシンとバリンとロイシン、さらにリジンとアルギニンを交換することはしばしば可能である。一方システインおよびヒスチジン残基は他のアミノ酸であまり置換できない（Bordo，D．andArgos，P．[1991]J．Mol．Biol．217:721-729）。当業者は、既に述べた例から相同物について多くの同類置換がなし得ることが分かるであろう。本発明の第三実施態様について、用語“構築体”はプラスミド、コスミド、ウイルスなど、さらに裸のＤＮＡ自体を含む。構築体に含み得るコントロール・エレメントは当業者に分かるであろう。これらのエレメントの例として、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルおよび転写ターミネーターがある。形質転換植物の再製材料には、第六実施態様に記載したように種子、子孫植物およびクローナル材がある。上記の第七および第八実施態様に明らかにしたように、第一実施態様の抗微生物タンパク質は植物または哺乳動物に投与されるために組成物中に含有されることがある。抗微生物タンパク質は組成物中にタンパク質の塩として存在し得る。これらの塩は、当業者に理解できるように、組成物中に含有され得る担体、希釈剤または賦形剤の性質をとる。例えば、医薬組成物中に存在する担体は、ハンクまたはリンゲル液、生理食塩水、塩と糖の混合液、ヘパリン化クエン酸ナトリウムークエン酸デキストリン液などの生理的に許容される緩衝液である。医薬組成物は、治療の目的に応じて経口的または非経口的に投与され、粉末、顆粒、注射用または経口用の溶液、錠剤、坐剤、ペッサリー、軟膏、クリーム、ゲルまたはエアゾルとして製造される。農業用の組成物は、典型的には噴霧の形で投与される。組成物は本発明の抗微生物タンパク質に加えて他の抗微生物剤を含むことができる。このような薬剤は、典型的には抗真菌剤である。本発明の非限定的実施例は次の通りである。実施例１ Macadamia integrifolia種子からの塩基性タンパク質の抽出Ｍｉナッツ（the Macadamia Nut Factory，Queensland，Australiaから購入）２５kgを食品処理機（The Big Oscar，Sunbeam）で粉末にし、得た粉末物を１０ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄、１５ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、１００ｍＭＫＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡ、０.７５％ポリビニルポリピロリドンおよび０.５ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）含有の氷冷抽出用緩衝液５０Ｌで２〜４時間４℃で抽出した。得たホモジェネートは、台所用濾過器を通して大きい粒子物を除き、高容量遠心機で遠心分離（4000ｒｐｍ、１５分間）して、さらに澄明にした。上澄液にナトリウム・アンモニウムスルファートを加えて、３０％相対飽和度を得て、一夜４℃で撹拌して沈殿を形成せしめた。３０分間４０００ｒｐｍでの遠心分離後、上澄液を採取し、アンモニウム・スルファートを加えて、７０％相対飽和度を得た。溶液を一夜に沈殿せしめ、沈殿タンパク質フラクションを得るために、４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。沈殿タンパク質を抽出用緩衝液の最小容量に再懸濁し、再び遠心分離して（１３０００ｒｐｍ×３０分間）、不溶のタンパク質を除去した。透析（１０ｍＭエタノールアミンｐＨ９.０、２ｍＭのＥＤＴＡおよび１ｍＭのＰＭＳＦ）で残渣のアンモニウム・スルファートを除去した後、あらかじめ１０ｍＭエタノールアミン（ｐＨ９）および２ｍＭのＥＤＴＡで平衡化したＱ−セファローズ・ファストフロー・カラム（５×１２ｃｍ）にかけた。このカラムから採取の流物は種子の塩基性（ｐＩ＞９）タンパク質フラクションを表す。このフラクションは実施例３記載のように、さらに精製した。実施例２抗微生物学活性検定一般的に抗真菌および抗菌活性の検定は、９６−ウエルミクロタイタープレートにおいて実施された。典型的には、Ｋ₂ＨＰＯ₄（２．５ｍＭ）、ＭｇＳＯ₄ （５０μＭ）、ＣａＣｌ₂（５０μＭ）、ＦｅＳＯ₄（５μＭ）、ＣｏＣｌ₂（０ .１μＭ）、ＣｕＳＯ₄（０.１μＭ）、Ｎａ₂ＭｏＯ₄（２μＭ）、Ｈ₃ＢＯ₃（０. ５μＭ）、ＫＩ（０.１μＭ）、ＺｎＳＯ₄（０.５μＭ）、ＭｎＳＯ₄（０.１μＭ）、グルコース（１０ｇ／ｌ）、アスパラギン（１ｇ／ｌ）、メチオニン（２０ｍｇ／ｌ）、ミオ−イノシトール（２ｍｇ／ｌ）、ビオチン（０.２ｍｇ／ｌ）、チアミンＨＣｌ（１ｍｇ／ｌ）およびピリドキシン−ＨＣｌ（０.２ｍｇ／ｌ）含有の合成生育培地に試験生物体を懸濁せしめた。試験生物体は、細菌細胞、真菌胞子（５０,０００胞子／ｍｌ）または真菌糸体フラグメント（試験する真菌培養物から菌糸マスを混じ、次いで細メッシュで濾過して大きい菌糸マスを除去することによりつくられる）からなる。培地に懸濁の試験生物体をマイクロタイタープレートの各ウエルに入れた。試験抗微生物性溶液５０μｌを適当なウエルに加えた。バイオアッセイにおけるウエル対ウエルの多様性を処理するために各試験液につき４複製をつくった。各９６ウエルからの１６ウエルを試験溶液との比較のための対照として用いた。特に断らない限り、試験生物体はPhytophthora cryptogeaであり、インキュベーションは２５℃、４８時間行われた。イーストを含むすべての真菌は２５℃で、E.coliは３７℃で生育した。生育阻止％は、種々の時間間隔で生育培地の６００ｎｍでの吸収を測定し、対照ウエルでの吸収の平均変化から試験ウエルの吸収の変化を引き、それを対照ウエルの６００ｎｍでの吸収の平均変化で割った商を１００倍したものと定義した（すなわち、［（対照ウエルの平均変化−試験ウエルの変化）／対照ウエルの平均変化］×１００）。典型的には、測定は２４時間間隔で行い、２４−４８時間の間を阻止％に用いた。実施例３ Macadamia integrifolia塩基性タンパク質フラクションから抗微生物性タンパク質の精製Ｍｉ抗微生物性タンパク質の単離のための出発材料は、実施例１記載の成熟種子から抽出された塩基性フラクションである。このタンパク質を図１に示すようにカチオン交換クロマトグラフィーにより精製した。２０ｍＭナトリウム・サクシネート（ｐＨ４）に溶解した塩基性タンパク質フラクション約４ｇを、あらかじめサクシネート緩衝液で平衡にしたＳ−セファロース高性能カラム（５×６０ｃｍ）（Pharmacia）にかけた。カラムを２０ｍＭナトリウム・サクシネート（ｐＨ４）中の０−２ＭのＮａＣｌ直線勾配液２０リットルで１７ｍｌ／分の割合で溶出した。２８０ｎｍでの吸収の１線測定によって（図１参照）溶出物をタンパク質について調べ、フラクション２００ｍｌに収集した。各フラクションの部分について１００μｇ／ｍｌの濃度で抗真菌活性アッセイで順次試験した。このバイオアッセイの結果は図１に示す。網かけ棒は１００％阻止を示す最も活性のフラクションを有する阻止％を表す。フラクション化は、０.０５から１ＭのＮａＣｌで溶出する非解像ピークをもたらした。約６時間で溶出され、単離の主なピーク（フラクション３１および３２）が最も顕著な抗微生物活性を示した。顕著な抗微生物活性を示したフラクションは、さらに逆相クロマトグラフィーにより精製された。合わせたフラクション３１および３２の約１ｍｇを９５％Ｈ₂ Ｏ／５％ＭｅＣＮ／０.１％ＴＦＡ（＝１００％Ａ）で平衡にしたカラム（２５×０.９３ｃｍ）（Pharmacia）、Ｐｅｐ−Ｓ（Ｃ₂／Ｃ₁₈）に充填した。カラムを１００％Ａから５％Ｈ₂Ｏ／９５％ＭｅＣＮ／０.１％ＴＦＡ（＝１００％Ｂ）の直線勾配液（１００分）３００ｍｌで３ｍｌ／分で溶出した。個々のピークを収集し、真空乾燥を３回してＴＦＡの極微量を除去し、次いで、実施例２記載のバイオアッセイでの使用のために、milli−Ｑ水（Millipore社水分精製システム）５００μｌに再懸濁した。図２は、図１に示したカチオン交換単離によるフラクション３１／３２から精製されたフラクションのＨＰＬＣを示す。タンパク質溶出は２１４ｎｍで調べた。個々のピークを抗微生物活性についてバイオアッセイした。図２中の棒グラフは各ピークからの１００μｇ／ｍｌの物質に対応する阻止を示す。約４７分（３５％ＭｅＣＮ）で溶出するピーク７を構成する活性タンパク質をＭｉＡＭＰ１と名付けた。実施例４ＭｉＡＭＰｉの抗微生物力価ＭｉＡＭＰｉを実施例３のように精製した。抗微生物力価を実施例２のように調べた。下記の表１は、種々の真菌および細菌に対して調べたときの精製ＭｉＡＭＰｉのＩＣ₅₀価を示す。表中、“＞１００”は１００μｇ／ｍｌ以上の濃度では検査されなかったことを表す。“＜Ｘ”はＸ値以下の濃度では検査されなかったことを表す。略号“ＮＤ”は検査が実施されなかったか、あるいは結果が判定できなかったことを表す。抗微生物タンパク質はまた試験培養基において１ｍＭＣａ²⁺の存在下でも検査された。これらの検査のＩＣ₅₀値は右側欄に示す。表から分かるようにＭｉＡＭＰｉの阻止活性はＣａ²⁺の存在で大きく減少する（完全に消失するのではないが）。表１生長の５０％阻止が認められるＭｉＡＭＰｉの濃度実施例５植物細胞に対する精製ＭｉＡＭＰ１の作用ＭｉＡＭＰ１は形質転換農業植物において発現する有用なタンパク質であるので、ＭｉＡＭＰ１が植物細胞に毒性がないかを調べた。タバコ(Nicotiana plumb aginofolia)をGibson et al．(Gibson et al．[1976]Plant 128:223-229)記載の方法に従い、修正ＣＳＶ培地(Gibson，1976 #219)中、暗闇で、２８℃で１１０ｒｐｍで振りながらマイクロカリ培養した。１×ＣＳＶ培地中の濾過滅菌抗微生物タンパク質の５０ｍｌアリコットを植物細胞懸濁液５０μｌに加えて、最終濃度を１００μｇ／ｍｌとした。２８℃での一夜インキュベーション後に、フェノサフラニン・プラス・フルオレセンジアセテート・アッセイを行い、細胞の生育性を調べた。ＦＤＡストック（アセテート中５ｍｇ／ｍｌ）５０ｍｌをＰＳストック（生長培地中０.０５％）２.５ｍｌに加えて、混合染料(Widholm，J.M．[19 72]Stain Technology 47:189-194)をつくった。混合染料１滴を細胞懸濁液１滴に加え、次いで明視界顕微鏡およびＵＶ超立顕微鏡によって可視化して細胞の生育能を調べた。これらの実験において、Triton Ｘ−１００の０.１％溶液を正の対照とした。タバコマイクロカリ培養物は、最大７２時間１００μｇ／ｍｌの濃度でＭｉＡＭＰ１に接触せしめたことにより蛍光細胞の数（フルオレセンジアセテート染色）から測定して生育能に低下はなく、死亡細胞数の増加もみられなかった。実施例６ヒト培養細胞および赤血球に対するＭｉＡＭＰ１の作用ＨｅＬａ細胞培養で毒性アッセイを行い、ヒト細胞に対するＭｉＡＭＰ１の毒性を調べた。ＨｅＬａ細胞培養物を修正ＲＰＭＩ１６４０培地(Trace Bioscienc es，NSW，Australia)に５０％ＣＯ₂と共に３７℃で一層培養に保持した。ＲＰＭＩに１０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)２ｍＭＬ−グルタミン、２g/l ＮａＨＣＯ₃およびペニシリンＧ（１０,０００U/l）とストレプトマイシンスルファート（１００g/l）を補充した。新しく採取した希釈細胞１００ｍｌをマイクロタイタープレート（１０⁴−１０⁵細胞／ウエル）に移した。細胞が接着し、ほとんど合流した後に、上澄液を除去し、あらかじめ１×細胞培養基に懸濁させた濾過滅菌抗微生物タンパク質で置き換える。１ｍｇ／ｍｌまでの濃度の抗微生物タンパク質をＨｅＬａ細胞の単層を含むウエル３個に加え、培養物を３７℃、５％ＣＯ₂で一夜インキュベートした。細胞はまた正の対照として濃度１０−４００μｇ／ｍｌのホルドチオニンの存在下にインキュベートした。インキュベート後、上澄液を除去し、細胞を２×ホスフェート緩衝液（１.５ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄、８ｍＭＫ₂ＨＰＯ₄、２.７ｍＭＫＣｌ、１３５ｍＭＮａＣｌ、３７℃）ですすぎ、天然赤色染料で染色した（Terras，F.R.G．et al．[1992]J．Biol.Chem．267:15 301-15309）。培養上澄液について、死細胞の指標としてラクテート・デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を調べた（Legrand[1992]J．Biotech．25:231-243）。正常培地における検査に加えて、ＦＢＳを欠く培地でも細胞を検査した。ＦＢＳが毒性を隠す恐れがあるためである。細胞の生育能すなわち増殖能は、顕微鏡検査および染色後の染料取り込み定量で調べたところ、１ｍｇ／ｍｌの濃度において影響を受けなかった。一方、ホルトチオニン（ヒト細胞に対する抗生物質として知られるタンパク質）は１０μｇ／ｍｌおよびそれ以上の濃度で細胞生育能を完全に消失せしめた。ＭｉＡＭＰ１が細胞生育能に対する作用を欠いていることは、価に変化のなかった培養上澄液中のＬＤＨ価を測定することによって確認された。細胞生育能に加えて、ヒト赤血球について溶血アッセイがCammue（Cammue，B. P.A．et al．[1995]Plant Physiol．109:445-455）の方法によってなされた。ヒト赤血球を１０ｍＭホスフェート、１２０ｍＭＮａＣｌ、２７ｍＭＫＣｌ（ｐＨ７.２）に懸濁し、穏やかに撹拌し、緩和な遠心分離（３分、３００ｇ）にかけて、数回洗った。上澄液に可視着色がなくなったときに、細胞をＰＢＳに再懸濁して０.５％懸濁液を得た。アリコット１００μｌをマイクロタイター・プレート・ウエルに入れた。タンパク質溶液（１００μｌ）を個々のウエルに加え、最終溶液を１０−５００μｇ／ｍｌとした。Triton Ｘ-100（最終濃度０.０５％）を溶血の正の対照とし、水を負の対照として用いた。細胞懸濁液を１時間３７℃でインキュベートし、マイクロタイター・プレートを３００ｇ、１０℃、５分間遠心分離にかけ、上澄液を新しいプレートに移して、そこで吸収（４０５ｎｍ）を測定した。濃度１００μｇ／ｍｌのＭｉＡＭＰ１において赤血球の溶血は認められなかった。この結果は、濃度５−４０μｇ／ｍｌで培養赤血球の破壊を起こすと報告されている（Terras，F.R.G．et al．[1992]J．Biol.Chem．267: 15301‐15309）抗微生物ペプチド（例えば、ホルドチオニン）と明らかに異なる。実施例７単離ＭｉＡＭＰ１の純度単離抗微生物タンパク質の純度をコーマシー・ブルータンパク質染色液で染色した後に天然ＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べた。１０−２０％トリシン勾配ゲル（Nove x）で、製造者の指示通りに（１００Ｖ、分離１−２時間）電気泳動を行った。標準（Kaleidascope polypeptide standards，Biorad）をレーン３に加えて、タンパク質の平均分子量を測定した。図３から、精製ＭｉＡＭＰ１が分子量標準（図３の上から下へ標準分子量：３８.６ｋＤａ、２５.０ｋＤａ、１６.３ｋＤａ、７.８ｋＤａ、３.４ｋＤａ）において約８ｋＤａにおいてアプロチニンの隣に移動するのがみられる。ＳＤＳ− ＰＡＧＥ解析において単一主バンドの検出は、分析カチオン交換および逆相単離で溶出される単一ピークを有し、ＭｉＡＭＰ１の活性が精製タンパク質のみにより、少量の混在成分によるものでなかったことを示している。実施例８ＭｉＡＭＰ１の質量分光分析精製ＭｉＡＭＰ１を質量分光分析にかけた。タンパク質約１μｇの溶液を検査に用いた。分析の結果、タンパク質の分子量は８１３４Ｄａ±２Ｄａであった（図４）。さらに、タンパク質についてジチオトレイトールによるジスルフィド結合の還元および４−ビニルピリジンでのアルキル化を行った。この還元／アルキル化の産物を質量分光分析にかけると、６３８質量単位を取得していること（すなわち、分子量が８７７３±２Ｄａに増加した−図５参照）。この質量の増加は６個の４−ビニルピロリドン基（質量１０６Ｄａ）が還元タンパク質に反応したこと、およびタンパク質が計６個のシステイン残基を有しているものと解釈された。システインについてはアミノ酸およびヌクレオチド配列によっても確認された（実施例９および１１）。実施例９ＭｉＡＭＰ１のアミノ酸配列還元およびアルキル化した精製タンパク質約１μｇを自動Edman変性Ｎ−末配列決定にかけた。次いで、リシル残基のカルボニシル基の後に分裂するエンドプロテイナーゼＬｙｓ−ＣでＭｉＡＭＰ１を消化した。還元／アルキル化タンパク質１ｍｇをＬｙｓ−Ｃ（Boehringer Mannheim）で製造者の指示に従い、消化した。フラグメントを逆相ＨＰＬＣで精製し、配列を決定した。この消化物を用い、タンパク質の配列を残渣６８まで決定した。Ｌｙｓ−Ｃフラグメントをエンドプロテイナーゼトリプシン（ＴＰＣＫ処理、Sigma）でさらに消化して、２フラグメントを得た。次の配列決定で配列の追加の２残基が提供され、部分配列の７０残基を得た（成熟タンパク質の全配列については図６を参照）。次いで、ＤＮＡ配列から６アミノ酸を演繹し（図８参照）、７６アミノ酸残基の完全タンパク質配列を得た。図６は、ｃＤＮＡ配列から決定された成熟タンパク質の配列（箱囲み）およびシグナルペプチドの配列（下線）を示す（実施例８）。翻訳開始コドンＡＴＧおよび終止コドンＴＡＧも上記アミノ酸配列を示すヌクレオチド配列において下線を引いた。タンパク質のアミノ酸配列が決定されたので、タンパク質の質量を推測することが可能であった。ソフトウェアー・プログラムMac Vect or ４.５.３を用いて、推測質量８１３７.５１Ｄａを得た。形成されるジスルフィド結合の数からすると、タンパク質の質量は８１３１.５〜８１３７.５Ｄａの間にある。これは、タンパク質が３個のジスルフィド結合（６Ｄａ質量が低い）を形成したと仮定さえすると、質量分光分析で得た質量８１３４.４±２Ｄａによく一致する。質量分光分析で測定されたタンパク質質量とアミノ酸配列から計算された質量とがほとんど一致したことから、アミノ酸配列は正確であったと判断された。実施例１０ヤマモガシ科の他の切片における関連タンパク質の同定標準的手法に従って、フロインド不完全アジュバントに懸濁したジフテリア毒素にコンジュゲートするＭｉＡＭＰ１を家兎の筋肉に注射し、免疫した。免疫を強化するためにＭｉＡＭＰ１アジュバントの追加量を与えた後に一定間隔で家兎から血清を採取した。血清約１００ｍｌを集めて、いくつかの植物種子からの粗抽出物の選別に用いた。種子１００ｇを粉末化し、抽出して、実施例１と同様に粗抽出物を得た。タンパク質５および５μｇ含有のアリコットをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、抗原性タンパク質の順次検定のためにニトロセルローズ膜にゲルをブロットした。膜は、化学的５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム基質系（Schleicher and Schue11）を用いた抗原バンドの比色分析検定のために、ＭｉＡＭＰ１ウサギ第１抗体と共にインキュベートし、水洗し、次いでアルカリホスフェート−コンジュゲート羊抗ウサギＩｇＧでインキュベートした。染色膜を図７に示す。図７によると、様々なProteaceae種がＭｉＡＭＰ１と同じ大きさの抗原的に関連するタンパク質を含有している。レーン１−２２に次の抽出物を含む。１）Pe rsoonia levis、２）Stirlingia simplex、３)Isopogon trilobus、４)Protea p ulchra、５)Cardwellia sublimis、６)Stenocarpus sinuatus、７)Telopea orea des、８)Xylomelum protocea、９)Macadamia integrifolia、10)Grevillea robu sta、11)Hakea platysperma、12)Banksia asplenifolia、13)Banksia robur、14 )ＭｉＡＭＰ１（純）、15)米、16)大麦、17)ヒヨコマメ、18)ヤエナリ、19)Flin dersiaaustralis、20)ハツカダイコン、21)カナラ、22)ＭｉＡＭＰ１(純)。レーン１−１４はヤマモガシ科からの抽出物を含み、すべてがＭｉＡＭＰ１と同じ大きさの抗原的に関連するタンパク質の存在を示している（レーン２において、よく撮察されていないレーン２の非常に弱いシグナルを含む）。関連性のない種からの抽出物についての対照レーン（１５−２１）は同様の大きさのタンパク質および抗原性を何ら示していない。 Proteaceae種からのいくつかの粗抽出物について、バイオアッセイを行った。特にBanksia robur、Banksia canei、Hakea gibbosa、Stenocarpus sinuatus、S tirlingia IatifoliaおよびMacadamia integrifoliaからの抽出物はすべて抗微生物活性を示した。実施例１１ＭｉＡＭＰ１をコードするＤＮＡ分子クローニング逆翻訳ヌクレオチド配列に対応する変性プライマーを逆トランスクリプターゼＰＣＲ反応（プライマーα配列５'ＣＣＧＡＡＧＣＡＧＴＴＧＣＡ［Ｃ/ Ｇ/Ｔ］ＧＣ［Ｃ/Ｇ/Ｔ］Ｃ３'およびプライマーβ配列５'ＧＡＧ［Ｃ/Ａ］Ｇ［Ｔ/Ｇ］ＴＡＴ［Ｔ/Ａ］［Ｃ/Ｇ］［Ｔ/Ｇ］ＡＡＧＴＧＴＧＧ３'）において用いた。ＰＣＲ産物は、アガロースゲルからＤＮＡバンドを切り、Qiagen ＤＮＡクリーンナップキットを用いて精製した後に、直接的に配列決定した（ＡＢＩＰＲＩＳＭ Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit from P erkin Elmer Corporation）。この方法を用い、ポリメラーゼ連鎖反応における鋳型としてｃＤＮＡを使用して、Ｍｉの仁のｍＲＮＡからＤＮＡの１６０塩基対フラグメントを増幅できた。ｃＤＮＡ末の５’および３’急速増幅（ＲＡＣＥ）における使用のために、このヌクレオチド配列から特定のオリゴヌクレオチドプライマーが設計された。３’ＲＡＣＥプロトコールは、既知ヌクレオチド配列から誘導された特定のプライマー（プライマーα、５'ＴＧＣＴＣＴＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＧＣＴＧ３'）をオリゴｄ（Ｔ）₂₅プライマー（プライマーβ）と共に利用して、ｃＤＮＡの３’末（図６、３３４−４９３位）に対応するフラグメントを増幅した。５’ＲＡＣＥプロトコールは、既知配列から誘導された他の特定のプライマー（プライマーβ、５'−ＧＣＡＴＴＧＧＡＴＧＡＡＧＡＴＡＣＴＣ−３'）を、５’ＲＡＣＥプロトコールに用いられたポリＣ−テイルｃＤＮＡに効率的にアニールするように設計されたプライマー（プライマーα、５'−ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣＧＧＧＩＩＧＧＧｌｌＧＧＧＩＩＧ−３'）と併用した（Frohman，M. A．[1990]“RACE:Rapid amplification of cDNA ends"，in PCR Protocols，a G uide to Methods and Applications，Innis，M.A.，Gelfan，D.H.，Sninsky，J. J．and White，T.J．eds，pp．28-38，Academic Press，London）。５’ＲＡＣＥプロトコールは塩基１−２８２を決定した（図６）。次いで、遺伝子の５’および３’末に対応する２個の特殊なプライマーを合成し、ほぼ完全長のヌクレオチドフラグメント（図６、１５−４８１位）を増幅するのに用いた。このフラグメントは、さらなる操作および配列決定のためにｐＧＥＭ− Ｔベクター(Promega)のクローニング位置に直接的に連結されるものであった。実施例１２植物の形質転換ベクターｐＰＣＶ９１−ＭｉＡＭＰ１の構築発現ベクターｐＰＣＶ９１−ＭｉＡＭＰ１（図８）はその５’末にカリフラワーモザイクウイルス（ｐＣａＭＶ３５Ｓ）（Odel et al.，[1985]Nature 313:81 0-812）からの強力な構成的プロモーターを有するＭｉＡＭＰ１ＤＮＡの完全コード領域を含み、高い複製能をもたらす（Kay et al．[1987]Science 236:1299- 1302）。ＭｉＡＭＰ１ＤＮＡのコード領域はカリフラワーモザイクウイルスの３５ＳＲＮＡのポリアデニル配列（ｐＡ３５Ｓ）を有する。このベクターのプラスミド骨格はプラスミドｐＰＣＶ９１（Walden，R．et al.，[1990]Methods Mol ．Cell．Biol．1:175-194）である。このプラスミドは、ｎｏｓプロモーター（ｐｎｏｓ）に動かされるアンピシリン耐性遺伝子（ｂｌａ）およびハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｈ）などの植物形質転換に有用な他のエレメントを含有する。これらの、および他の特性が種々のクローニングおよび形質転換における選択を可能とする。プラスミドｐＰＣＶ９１−ＭｉＡＭＰ１は次のように構築された。ｐＧＥＭ−ＴベクターにおけるＰＣＲ−クローンフラグメント（実施例１１）を制限酵素Ｓａｃ IIおよびＳｐｅＩを用いて消化し、ＭｉＡＭＰ１遺伝子フラグメントを放出せしめた。バイナリーベクターｐＰＣＶ９１を制限酵素ＢａｍＨＩで消化した。ＭｉＡＭＰ１ＤＮＡフラグメントとバイナリーベクターの両者をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処置し、突出を平滑にした。次いで、この２フラグメントをＴ４ＤＮＡリガーゼにより連絡し、植物形質転換のためのｐＰＣＶ９１−ＭｉＡＭＰ１バイナリーベクターをつくった（図８）。実施例１３植物形質転換 Van Haute(VanHaute，E．et al．[1983]EMBO J．2:411-417)を修正したWalker peach et al．(Walkerpeach，C.R．et al．[1994]Plant Mol．Biol．ManualB1:1 -19)の方法を用いて、ジスアームAgrobacterium tumefaciens株ＧＶ３１０１（ｐＭＰ９０ＲＫ）（Koncz，C．S.[1986]Mol．Gen．Genet．204:383-396）をベクターｐＰＣＶ９１ＭｉＡＭＰ１（実施例１２）で形質転換した。タバコの形質転換は、Horsch et al．(Horsch et al．[1985]Science 227:122 9-1231)の方法に基づき、Nicotiana tabacumの葉を用いて、ｐＰＣＶ９１−ＭｉＡＭＰ１含有の株を共培養して、実施した。Agrobacteriumとタバコ葉の共培養の後に、形質転換植物（ｐＰＣＶ９１−ＭｉＡＭＰ１で転換）を５０μｇ／ｍｌハイグロマイシンおよび５００μｇ／ｍｌセフォタキシム含有の培地上で再生した。これらの形質転換植物は、標準ウエスタンブロット法を用いて、新たに導入された遺伝子の発現のために分析され得る。導入遺伝子の構成的発現ができる植物が選択されて、自己受粉し、種子をつくることができる。形質転換植物のＦ１世代がさらに解析される。実施例１４細菌性発現ベクターｐＥＴ−ＭｉＡＭＰ１の構築ＭｉＡＭＰ１のコード領域を挟むＰＣＲプライマーは、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ（夫々、コード領域の５’および３’末に対応する）の制限領域を含むようにつくった。これらのプライマーはＭｉＡＭＰ１ｃＤＮＡのコード領域を増幅するのに使用した。ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩでの消化後に、この増幅からのＰＣＲ産物をｐＥＴ−１７ｂベクター（Novagen/Studier，F.W．et al．[1986]J．Mo l．Biol．189:113）内に、ベクターｐＥＴ−ＭｉＡＭＰ１を産生するようにコード領域イン−フレームをもって、連結した。実施例１５液体培地におけるＭｉＡＭＰ１タンパク質の発現ベクターｐＥＴ−ＭｉＡＭＰ１（実施例１４）で形質転換したＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（Grodberg，J．[1988]J．Bacteriol．170:1245）を光学濃度０.６に培養し、０.４ｍＭＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を加えて誘導した。生育培養物のアリコットを時間間隔をおいて除去し、タンパク質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけ、培養中でＭｉＡＭＰ１の発現レベルを調べた。図１０は、誘導後に得られた抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。レーン１は分子量マーカーを含む。レーン２−７は誘導後０、１、２、３、４および５時間後での培養からの抽出物を含む。レーン８は非形質転換Ｅ．ｃｏｌｉからの抽出物を含み、レーン９は純ＭｉＡＭＰ１を含む。図１０中の矢印は、培養物中に産生したＭｉＡＭＰ１タンパク質のバンドを明らかにしたものである。誘導後にＭｉＡＭＰ１のレベルが顕著に蓄積したことは明らかである。上記した例示から本発明の範囲を逸脱しないで多くの変更をなし得ることは、当業者にとって分かるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/06 5/00 Ｂ 5/10 Ｅ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (71)出願人ザ・ステイト・オブ・クイーンズランド・スルー・イッツ・デパートメント・オブ・プライマリー・インダストリーズオーストラリア4000クイーンズランド州ブリスベーン、アン・ストリート80番、プライマリー・インダストリーズ・ビルディング (71)出願人ザ・ユニバーシティ・オブ・クイーンズランドオーストラリア4067クイーンズランド州セント・ルチア (71)出願人ビューロー・オブ・シュガー・エクスペリメント・ステイションズオーストラリア4068クイーンズランド州インドアルーピリー、マイアーズ・ロード 50番 (71)出願人クイーンズランド・ユニバーシティ・オブ・テクノロジーオーストラリア4000クイーンズランド州ブリスベーン、ジョージ・ストリート２番 (72)発明者マナーズ，ジョン・マイケルオーストラリア4064クイーンズランド州パディントン、ウォーミントン・ストリート28番 (72)発明者マーカス，ジョン・ポールオーストラリア4075クイーンズランド州コリンダ、ボールダーストーン・ストリート１―10番 (72)発明者グールター，ケネス・クリフォードオーストラリア4074クイーンズランド州ジャンボリー・ハイツ、エンブレム・ストリート26番 (72)発明者グリーン，ジョディー・リンオーストラリア4074クイーンズランド州ジャンボリー・ハイツ、リーフ・クロース４番 (72)発明者ハリソン，スチュアート・ジョンイギリス、エヌアール２・３アールワイ、ノーウィッチ、サンドリンガム・ロード25 番

Claims

【特許請求の範囲】１．（i）配列番号１に示す配列の残基２７から１０２に対応するアミノ酸配列を含むタンパク質；（ii）（i）の相同物；（iii）（i）と基本的に同じ３次元構造を有し、かつ（i）と基本的に同じ抗微生物活性を有するタンパク質；（iv）−Ｃ−９Ｘ−Ｃ−Ｘ−Ｃ−２５Ｘ−Ｃ−１４Ｘ−Ｃ−１１Ｘ−Ｃ−の相対システイン間隔（式中、Ｘはシステイン以外のアミノ酸残基）を含むタンパク質；（v）（i）に対する抗体に特異的に反応し、かつ（i）と基本的に同じ抗微生物活性を有するヤマモガシ科から単離されたタンパク質より選ばれた単離または合成の抗微生物性タンパク質。２．配列番号１の残基２７から１０２のアミノ酸配列を有する、請求項１のタンパク質。３．（i）配列番号１に示す配列の残基２７から１０２に対応するアミノ酸配列を含むタンパク質；（ii）（i）の相同物；（iii）（i）と基本的に同じ３次元構造を有し、かつ（i）と基本的に同じ抗微生物活性を有するタンパク質；（iv）−Ｃ−９Ｘ−Ｃ−Ｘ−Ｃ−２５Ｘ−Ｃ−１４Ｘ−Ｃ−１１Ｘ−Ｃ−の相対システイン間隔（式中、Ｘはシステイン以外のアミノ酸残基）を含むタンパク質；（v）（i）に対する抗体に特異的に反応し、かつ（i）と基本的に同じ抗微生物活性を有するヤマモガシ科から単離されたタンパク質より選ばれたタンパク質をコードする単離または合成ＤＮＡ。４．配列番号２の１４８から３７５のヌクレオチドを含む、請求項３のＤＮＡ。５．該コードタンパク質の発現のためのエレメントに作用的に連結した請求項３のＤＮＡを含むＤＮＡ構築体。６．該ＤＮＡが配列番号２のヌクレオチド７０から３７５を含む、請求項５の構築体。７．ｐＰＣＶ９１−ＭｉＡＭＰ１およびｐＥＴ−ＭｉＡＭＰ１からなる群より選ばれた、請求項５の構築体。８．請求項５のＤＮＡ構築体を含有する宿主細胞。９．細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞および哺乳動物細胞からなる群より選ばれた、請求項８の宿主細胞。１０．請求項５のＤＮＡ構築体を含有する形質転換植物。１１．単子葉または双子葉である、請求項１０の形質転換植物。１２．穀物、飼料、果物、野菜、油種子、ヤシ、樹木およびブドウからなる植物群より選ばれた、請求項１１の形質転換植物。１３．トウモロコシ、バナナ、ピーナッツ、飼料豆、サンフラワー、トマト、カノラ、タバコ、コムギ、オオムギ、オートミール、ジャガイモ、大豆、綿、カーネーション、モロコシ、ルピナスおよび米からなる植物群より選ばれた、請求項１１の形質転換植物。１４．請求項１１の形質転換植物の再製材料。１５．種子、子孫植物およびクローナル材からなる群から選ばれる、請求項１４の再製材料。１６．農業的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に請求項１の抗微生物性タンパク質を含有する組成物。１７．薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に請求項１の抗微生物性タンパク質を含有する組成物。１８．植物の微生物蔓延をコントロールする方法であって、 i）請求項５のＤＮＡ構築体を該植物に導入するか、または ii）該植物を請求項１の抗微生物性タンパク質または請求項１６の組成物で処理する、ことを含む方法。１９．哺乳動物の微生物蔓延をコントロールする方法であって、動物を請求項１の抗微生物性タンパク質または請求項１７の組成物で処置することを含む方法。