CN1216550A - 抗微生物蛋白质 - Google Patents

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Sugar Research Institute
University of Queensland UQ
Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
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Abstract

本文公开了一个抗微生物蛋白质的新家族。可以从Macadamia integrifalia分离一种原型蛋白质。本文也描述了编码所说蛋白质的DNA和用于表达所说的抗微生物蛋白质或用于将所说的抗微生物蛋白质引入植物的DNA构建体。可以将包含所说的抗微生物蛋白质的组合物或所说的抗微生物蛋白质本身施用到植物或哺乳动物中,以抵抗微生物侵染。

Description

抗微生物蛋白质
                  技术领域
本发明涉及对真菌和细菌生长发挥抑制性活性的分离的蛋白质，所说的真菌和细菌包含一些植物和动物的微生物病原体。本发明也涉及包含编码抗微生物蛋白质序列的重组基因，该基因的表达产物可以防御微生物病原体对植物细胞或其它生物细胞侵染。本发明进一步涉及所说的蛋白质和/或编码所说的蛋白质的基因在控制人和兽医疾病中的微生物上的用途。
                  现有技术
对农业和园艺业来说，植物微生物病害是一个重要问题。一般来说，植物病害每年造成数以百万吨计的农作物损失，这些损失的重要部分是由真菌和细菌性病害造成的。对抗真菌和细菌性病害的一种可能的方法是提供转基因植物，该转基因植物能够表达蛋白质或在某些程度上增加植物对病原体侵袭抗性的蛋白质。一种简单的策略是首先在体外确定具有抗微生物活性的蛋白质，克隆编码该蛋白质的DNA序列，制备在植物中有效表达该蛋白质的嵌合基因构建体，把这一基因转移到转基因植物中，并且通过与对照植物比较估计所引入的基因对微生物病原体的抗性作用。
在上述病害控制策略中，第一步并且最重要的一步是确定具有强抗微生物活性的蛋白质。近年来，确定并且描述了许多具有抗微生物和/或抗真菌活性的不同植物蛋白质。按照它们的假定的作用方式和/或它们的氨基酸序列同源性，将这些蛋白质分成几类。这些种类包含下列：几丁质酶(Roberts,W.K.等[1986]生物化学生物物理学报880:161-170)；β-1,3-葡聚糖酶(Manners,J.D.等[1973]植物化学12:547-553)；硫素(Bolmann,H.等[1988]EMBO J.7:1559-1565和Fernadez de Caleya,R.等[1972]微生物应用23:998-1000)；permatins(Roberts,W.K.等[1990]普通微生物杂志136:1771-1778和Vigers,A.J.等[1991]分子植物-微生物相互作用4:315-323)；核糖体-失活蛋白(Roberts,W.K.等[1986]生物化学生物物理学报880:161-170和Leah,R.等[1991]生物化学杂志266:1564-1573)；植物防卫素(Terras,F.R.G.等[1995]植物细胞7:573-588)；壳多糖结合蛋白(Bolle,M.F.C.等[1992]植物分子生物学22:1187-1190和Van Parijs,J.等[1991]Planta183:258-264)；奇甜蛋白样，或渗透蛋白样蛋白质(Woloshuk,C.P.等[1991]植物细胞3:619-628和Hejgaard,J.[1991]FEBS Letts.291:127-131)；PR1-型蛋白质(Niderman,T.等[1995]植物生理学108:17-27)；非特异脂质转换蛋白质(Terras,F.R.G.等[1992]植物生理学100:1055-1058和Molina,A.等[1993]FEBS Letts.3166:119-122)；以及，knottin或knottin样蛋白质(Cammue,B.P.A.等[1992]生物化学杂志67:2228-2233)。此外，植物不是抗微生物蛋白质的唯一来源，并且有许多报道从动物和微生物细胞分离出抗微生物蛋白质(在Gabay,J.E.[1994]科学264:373-374和在＂抗微生物肽＂[1994]CIBA基础专题研讨186,John Wiley和Sons Publ.,Chichester，英国中的评论)。
一些证据表明，在转基因植物中编码具有体外抗微生物活性的蛋白质的基因的异位表达可以导致增加对微生物病原体的抗性。这种工程抗性的例子包括表达编码下列物质的基因的转基因植物：植物壳多糖酶，或单独地(Broglie,K.等[1991]科学254:1194-1197)或与β-1,3-葡聚糖酶结合(Van den Elzen,P.J.M.等[1993]Phil.Trans.Roy.Sec.342:271-278)；植物防卫素(Terras,F.R.G.等[1995]植物细胞7:573-588)；渗透蛋白样蛋白质(Liu,D.等[1994]美国国家科学院院报91:1888-1892)；PR1-类蛋白质(Alexander,D.等[1993]美国国家科学院院报90:7327-7331)和核糖体-失活蛋白(Logemann,J.等[1992]生物/工程10:305-308)。
虽然在转基因植物中对工程病害抗性的抗微生物蛋白质潜在用途已经广泛地描述过，但是还有其它应用值得一提。首先，高效力的抗微生物蛋白质可以通过直接应用用于控制植物病害(De Bolle,M.F.C.等[1993]在植物保护反应机制中，B.Fritig和M.Legrand编辑，KluwerAcad.Publ.,Dordrecht,NL,pp.433-436)。此外，在人和兽医学中，抗微生物肽有潜在的治疗应用。虽然对于植物来源的肽还没有描述过，但是正在积极开发动物肽，并且已达到临床试验(Jacob,L.和Zasloff,M.[1994]在＂抗微生物肽＂中，CIBA基础专题研讨186,John Wiley和Sons出版，Chichester，英国，pp.197-223)。
在这里所描述的本发明给出了一种具有抗微生物活性的以前未发现的新的蛋白质。这种蛋白质可以从Macadamia integrifalia(Mi)植物分离出来。Macadamia integrifalia属于山龙眼科。有些人认为Macadamiaintegrifalia(也称为Bauple坚果或昆士兰坚果)是世界上可充分食用的坚果。由于这个理由，它在澳大利亚和海外为了商业目的被广泛地栽培(Williams,Keith A.W.,天然植物(昆士兰)，第Ⅱ卷，1984,Keith.W.由Williams出版，并由Newstead of Printcraft印刷，Qld，澳大利亚)。
                      发明概述
按照本发明的第一种实施方案，本发明提供了一种分离的或合成的抗微生物蛋白质，该蛋白质选自：
(ⅰ)包含与图6(SEQ ID NO:1)显示的序列的27到102位残基相对应的氨基酸序列的蛋白质；
(ⅱ)(ⅰ)的同系物；
(ⅲ)具有与(ⅰ)基本上相同的3-维形状，并且具有与(ⅰ)基本上相同的抗微生物活性的蛋白质；
(ⅳ)包括-C-9X-C-X-C-25X-C-14X-C-11X-C-的相关半胱氨酸间距的蛋白质，其中X是任何不同于半胱氨酸的氨基酸残基；和
(ⅴ)从山龙眼科分离的蛋白质，其特异性地与抗(ⅰ)产生的抗体进行反应，并且具有与(ⅰ)基本上相同的抗微生物活性。
按照本发明的第二种实施方案，本发明提供了一种分离的或合成的DNA，该DNA编码按照第一种实施方案的蛋白质。
按照本发明的第三种实施方案，本发明提供了一种DNA构建体，该DNA构建体包含有效地与所说编码蛋白质的表达元件连接的按照第二种实施方案的DNA。
按照本发明的第四种实施方案，本发明提供了一种包含按照第三种实施方案的DNA构建体的宿主细胞。
按照本发明的第五种实施方案，本发明提供了一种包含按照第三种实施方案的DNA构建体的转基因植物。
按照本发明的第六种实施方案，本发明提供了按照第五种实施方案的转基因植物的繁殖材料。
按照本发明的第七种实施方案，本发明提供了一种包含按照第一种实施方案的抗微生物蛋白质和农业上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合物。
按照本发明的第八种实施方案，本发明提供了一种包含按照第一种实施方案的抗微生物蛋白质和药物上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合物。
按照本发明的第九种实施方案，本发明提供了一种控制植物的微生物感染的方法，该方法包括：
ⅰ)把按照第三种实施方案的DNA构建体引入到所说的植物中；或
ⅱ)用按照第一种实施方案的抗微生物蛋白质或按照第七种实施方案的组合物处理所说的植物。
按照本发明的第十种实施方案，本发明提供了一种控制哺乳动物的微生物感染的方法，该方法包括用按照第一种实施方案的抗微生物蛋白质或按照第八种实施方案的组合物处理所说的动物。
本发明的其它的实施方案包括产生抗微生物蛋白质的方法。
                附图简要描述
图1显示从马卡达姆属(Macadamia)坚果提取的碱性蛋白质组分的阳离子交换层析轮廓图，给出了兴趣组分的生物测定结果。
图2显示来自阳离子交换分离和对应的生物测定数据的高度抑制性组分31和32的反相HPLC轮廓图。
图3显示纯化MiAMP1的SDS-PAGE分析。
图4显示MiAMP1的质谱分析结果。
图5描述还原性和烷基化MiAMP1的质谱分析结果。
图6显示MiAMP1的氨基酸序列和编码所说蛋白质的核苷酸序列。
图7描述来自利用对MiAMP1的野兔抗血清进行的各种山龙眼科物种的蛋白质提取物的蛋白质印迹。
图8是质粒pPCV91-MiAMP1的图谱。
图9是质粒pET-MiAMP1的图谱。
图10描述用于分析来自转化和非转化大肠杆菌培养物样品的染色SDS-PAGE凝胶。
      实施本发明的最佳方式和其它方式
下文中将要用到下列缩写：
FBS     胎牛血清
EDTA    乙二胺四乙酸
LDH     乳酸脱氢酶
MeCN    甲基氰化物(乙腈)
Mi       Macadamia integrifolia
MiAMP1   Macadamia integrifolia抗微生物蛋白质1
ND       未测定
PCR      聚合酶链反应
PMSF     苯甲基磺酰氟
SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
TFA      三氟乙酸
TPCK     甲苯磺酰苯丙氨酸氯甲酮
RACE     cDNA末端迅速扩增
本发明的发明人已经鉴定出一类新的抗微生物蛋白质。从Macadamia integrifolia(下文简称Mi)的种子可以分离出原型蛋白质。因而，本发明提供了抗微生物蛋白质本身以及编码抗微生物蛋白质的DNA序列。
本发明也提供从山龙眼科的植物组织中获得相关蛋白质的方法。用抗微生物蛋白质的一个特殊例子产生的抗体(第一号Macadamia integrifolia抗微生物蛋白质(MiAMP1))，从Macadamia integrifolia相关的其它树种筛选组织是可能的。其它马卡达姆属物种以及在山龙眼科更广的范畴中的物种对于这样的筛选来说是主要的靶。确实，如实施例10所显示的，这样的筛选可用来鉴定几个包含蛋白质的物种，该蛋白质与以抗原反应、大小以及在种子组织中的定位为基础的MiAMP1有关。相关蛋白质的筛选不必局限在山龙眼科，其它物种也有可能含有类似蛋白质。
本发明也提供了原型抗微生物蛋白质的氨基酸序列(实施例9)其它物种。从这一序列，通过逆翻译氨基酸序列可以产生编码该蛋白质的DNA序列。于是，可以化学(和/或酶促)合成或从马卡达姆属的植物组织中利用实验室手册中描述的标准克隆方法(如分子生物学当前草案(版权1987-1995,Ausubel F.M.等编辑，并且John Wiley&Sons,Inc.出版，美国印刷))分离出具有编码抗微生物蛋白质的核苷酸序列的DNA。
抗微生物蛋白质本身显示出一种特殊的三维结构，它可以通过利用X-射线晶体学或核磁共振技术鉴定。这一结构将在蛋白质的抗微生物活性上起着重要的作用。从蛋白质序列，预言蛋白质可能显示的构象和结构基元(次级结构)将是很有可能的。人们将意识到，本领域技术人员能够获得具有已知结构的蛋白质，并且能够明显地改变其序列，并仍然保持该蛋白质的整个三维形状和抗微生物活性。该结构很可能不能改变(改变而不产生严重的后果)的一方面是半胱氨酸含量和半胱氨酸残基的间距，由于这将破坏二硫键的形成，而该二硫键对于保持蛋白质的总体结构起着决定作用。很可能在决定蛋白质的形状和功能上起决定作用的其它残基是甘氨酸和脯氨酸，它们在蛋白质骨架上有唯一的构象。对于显示其结构和活性来说，在蛋白质的三维空间中带电残基(即精氨酸，赖氨酸，组氨酸，谷氨酸，以及天冬氨酸)的分布也是重要的。尤其是高密度的带正电残基显示出在各种蛋白质中赋予抗微生物活性(Pathak等[1995]蛋白质：结构，功能以及遗传学：182-186)。
利用标准密码子表可以推断出编码这些蛋白质的DNA序列。利用有限数量的可能DNA序列，可以产生合适的寡核苷酸探针，并且该探针用于分离实际基因(实施例11)以及对照序列。利用标准DNA合成仪(如Beckman Oligo1000仪)与构建合成的基因片段成为整个基因的已知技术(参见上述的分子生物学当前方案)化学合成该基因也是可能的。
然后，在组成型或诱导型启动子控制下(实施例12和14)，此基因可以克隆到生物系统中，该系统允许蛋白质表达(实施例13和15)。使蛋白质在各种系统中表达的转化方法是已知的。为了产生进一步利用的蛋白质，可以将蛋白质在任何合适的系统中表达。这种蛋白质表达的合适宿主包含大肠杆菌，真菌细胞，昆虫细胞，哺乳动物细胞以及植物。在这样的宿主中用于表达蛋白质的标准方法在各种教科书，包括分子生物学当前方案(上述的)第16节(蛋白质表达)中描述过。
按照各种已知方法(土壤杆菌属(Agrobacterium),Ti质粒，电穿孔法，微注射，微粒枪，以及类似的方法)，用本发明的DNA构建体可以转化植物细胞。例如，对于在植物中表达来说，编码MiAMP1的DNA序列将用于与编码天然或异源信号肽序列的DNA序列相结合，该信号肽序列将蛋白质导向特定细胞区室(例如质外体或液泡)。这些编码序列能与植物启动子序列连接在一起，并且确保在植物细胞中进行强表达。这种启动子序列可以确保在大多数或所有植物细胞中蛋白质的强组成型表达，它可能是在特定组织或细胞(对微生物感染敏感)中确保表达的启动子，并且也可能是在感染过程期间确保表达的强诱导启动子。这些类型的基因弹夹也将包含MiAMP编码区的转录终止和聚腺苷酸化序列3’以确保有效地产生编码MiAMP的mRNA和保证其稳定性。可能的是，MiAMP的有效表达可以由将其DNA序列包含进一种编码大得多的蛋白质(经处理产生一种或更多种活性MiAMP分子)的序列中得到促进。然后，上述编码MiAMP的基因弹夹利用两种普通的方法可以在植物细胞中表达。首先，基因弹夹可以连接到二元载体中，该载体携带ⅰ)位于根瘤土壤杆菌Ti质粒的T-DNA两侧的左边缘和右边缘序列，ⅱ)用于选择抗生素抗性植物细胞的合适的可选择的标记基因，ⅲ)在根瘤土壤杆菌或大肠杆菌中起作用的复制起点以及ⅳ)允许选择根瘤土壤杆菌和大肠杆菌携带质粒的细胞的抗生素抗性基因。这种携带编码嵌合MiAMP1基因的二元载体可能通过电穿孔法或三亲交配引入到携带无细胞毒性的(disarmed)Ti质粒的根瘤土壤杆菌菌株，如菌株LBA4404,GV3101和AGL1中，或引入到毛根土壤杆菌菌株，如R4或NCCP1885中。然后，用合适的植物外植体或完整的植物组织和转化植物细胞和/或通过抗生素抗性选择的再生体可以共培养这些土壤杆菌属菌株(实施例12和13)。利用产生的各种蛋白质抗体或利用抗微生物生物测定可以检测在转基因植物中MiAMP1蛋白质的表达。基因转移到植物的第二种方法可以通过在靶植物细胞中基因的同向插入来完成。例如，MiAMP1编码基因弹夹可以与编码植物中抗生素抗性嵌合基因的质粒一起共沉淀在黄金或钨微粒上。利用快速流动的氦气能够加速钨微粒并且使该微粒轰击合适的植物组织。该植物组织可以是胚发生细胞培养物，植物外植体，愈伤组织或细胞悬浮液或完整的分生组织。使用选择的抗生素抗性基因和用于检测表达MiAMP1蛋白质的植物细胞的抗体可以恢复植物。在植物中用于MiAMP1表达的这些以及其它相关方法在＂植物分子生物学＂中已有描述(第二版，Gelvin,S.B.和Schilperoort,R.A.编辑，1994 Kluwer学院出版社出版，Dordrecht,荷兰)。
单子叶植物和双子叶植物都可以转化和再生。遗传学上能够进行改良的植物包含谷类作物、饲料作物、水果、蔬菜、油料作物、棕榈树、林业树以及藤本植物。能够进行改良的植物的特定的例子如下：玉米、香蕉、花生、野生豌豆、向日葵、番茄、canola、烟草、小麦、大麦、燕麦、土豆、大豆、棉花、石竹属植物、高粱、羽扇豆属植物和稻米。用抗微生物基因可以转化这些以及其它农作物，以致于它们可以显示出更大程度的对病原体侵袭的抗性。此外，蛋白质通过拓扑应用可以用于控制病害。本发明也涉及抗微生物蛋白质在控制哺乳动物(包含人类)的病原体上的用途。该蛋白质对于控制微生物感染可以以局部或静脉内应用的方式运用。Macadumia integrifolia抗微生物蛋白质(MiAMP1)
如上所述，已经鉴定和描述了一类新的抗微生物蛋白质(从Mi种子分离的)。该类包括一种特殊的蛋白质因子，如上文定义的称作MAiAMP1。该蛋白质具有高碱性(预料的pI值为10.1)并且含有6个半胱氨酸残基(实施例8和9)，这些残基被认为通过形成二硫键在稳定蛋白质三维结构中起着重要的作用。另外，由质谱鉴定该蛋白质的相对分子量，这种质谱显示它的相对分子量为8134±2Da。氨基酸序列与以前描述的序列数据库(Swiss Prot和Non-redundant数据库)中的蛋白质不具有任何明显的同源性，其是利用blast算法(Altschul,S.F.等[1990]分子生物学杂志215:403)检索出的，这说明它是迄今为止未知的抗微生物蛋白质。该蛋白质不同于上述任何种类的植物，动物或微生物来源的抗微生物蛋白质。
MiAMP1蛋白质显示广泛范围的抗真菌活性(实施例4)。对于一些病原体/微生物(用蛋白质试验时抗这些生物体的IC50值为2μg/ml)，MiAMP1在1μg/ml那样低的浓度下就显示出对真菌生长十分显著的抑制作用。因而，该蛋白质可以提供针对几种植物病害的保护作用。通过应用到植物部分上，MiAMP1可以用作杀真菌剂或抗生素。通过在整个转基因植物中表达，该蛋白质也可用来阻止病原体生长(实施例13)。通过局部应用或静脉内注射，该蛋白质可用于控制人病原体。该蛋白质的一个特征是某些微生物的抑制作用通过Ca2+(1mM)的存在受到抑制。
参照本发明的上述实施方案，按照第一种实施方案，一种优选的抗微生物蛋白质是MiAMP1。这种蛋白质具有与图6中显示的序列的残基27-102相对应的序列(SEQ ID NO:1)。
通过本领域技术人员所熟知的任何方法(包括这里举例说明方法)可以分离按照本发明的抗微生物蛋白质。可以化学合成或酶促合成抗微生物蛋白质。这些方法也为本领域技术人员所熟知，并且描述过，例如，在Hancock,D.C.等(1995)分子生物技术4(1):73-86，以及Wong,C.H.和Wang,K.T.(1991)Experientia(巴塞尔)47(11-12):1123-1129中描述过。
图6蛋白质的同系物定义为与图中显示的序列具有基本上相同的氨基酸序列的蛋白质。这意味着大多数存在于MiAMP1中的残基将以相互相同的相对位置存在于同系物中，或由含有具有相似性质的侧链的另一个氨基酸残基所代表。例如，经常可能的是相互交换天冬酰胺和天冬氨酸；丙氨酸和甘氨酸；丝氨酸，苏氨酸和丙氨酸；异亮氨酸，缬氨酸和亮氨酸；以及赖氨酸和精氨酸；而半胱氨酸和组氨酸残基很少能由其它氨基酸取代(Bordo,D.和Argos,P.[1991]分子生物学杂志217:721-729)。本领域技术人员意识到，除了实施例中所提到的外，同系物可以具有许多保守性取代。
按照本发明的第三种实施方案，术语＂构建体＂包括载体，如质粒，粘粒，病毒和其类似物，以及裸DNA自身。可包含在构建体中的调控元件为本领域技术人员所熟知。这样元件的例子是启动子，增强子，聚腺苷酸化信号和转录终止子。
转基因植物的繁殖材料，如在第六种实施方案中所详细列举的，包括种子，子代植物和克隆材料。
如以上限定的本发明的第七和第八种实施方案所提出的，按照第一种实施方案的抗微生物蛋白质可以包含在对植物和哺乳动物施用的组合物中。抗微生物蛋白质可以以蛋白质盐存在于组合物中。这样的盐为本领域技术人员所熟知，可包含在组合物中的载体，稀释剂或赋形剂的性质也为本领域技术人员所熟知。例如，存在于药物组合物中的载体可以是生理上相容的缓冲液(如Hank或Ringer溶液，生理盐水，由盐水和葡萄糖组成的混合物，以及肝素柠檬酸钠-檬酸酸葡萄糖溶液)。该药物组合物可以依据治疗目的口服或非肠道使用，同时可以制备成药粉，胶囊，注射和口服液，片剂，栓剂，阴道药栓，软膏，乳剂，凝胶，以及气雾剂。典型地，用于农业的组合物通过喷雾施用。
除按照本发明的抗微生物蛋白质外，组合物可以包含其它抗微生物剂。典型的是，这样的抗微生物剂是抗-真菌剂。
下面是本发明的非限制性实施例。
              实施例1
Macadamia integrifolia种子的碱性蛋白质的提取
将25kg坚果(购自Macadamia Nut Factory，昆士兰，澳大利亚)在食品加工器(The Big Oscar,Sunbeam)中磨碎，并将所形成的粗粉用50L包含10mM NaH2PO4,100mM KCl,2mM EDTA,0.75％聚乙烯基聚吡咯烷酮以及0.5mM苯甲基磺酰氟(PMSF)的冰预冷的抽提缓冲液在4℃下抽提2-4小时。将所形成的匀浆通过厨房滤器以除去更大的颗粒状材料，然后在大容量离心机中经离心(4,000rpm,15分钟)进一步澄清。将固态硫酸铵添加到上清液中以达到30％相对饱和度，并且在4℃下搅拌一夜使沉淀形成。接下来在4,000rpm下离心30分钟，取上清液，并且添加硫酸铵以达到70％相对饱和度。使该溶液过夜沉淀，然后在4,000rpm下离心30分钟以收集沉淀的蛋白质组分。将沉淀的蛋白质悬浮在最小体积的抽提缓冲液中，并且再一次进行离心(13,000rpm×30分钟)以除去未溶解部分。进行透析(10mM乙醇胺pH9.0,2mM EDTA和1mm PMSF)以除去残余的硫酸铵后，将蛋白质溶液通过预先用10mM乙醇胺(pH9),2mMEDTA平衡的Q-琼脂糖凝胶快速流动柱(5×12cm)。
从这一层析柱收集的洗脱液代表种子的碱性(pI＞9)蛋白质组分。将这一组分如实施例3的描述进一步纯化。
              实施例2
          抗微生物活性测定
一般来说，在96-加样孔微量滴定板中进行生物测定以估计抗真菌和抗细菌活性。典型地，将试验生物悬浮在合成生长培养基中，该培养基由K2HPO4(2.5mM),MgSO4(50μM),CaCl2(50μM),FeSO4(5μM),CoCl2(0.1μM),CuSO4(0.1μM),Na2MoO4(2μM),H3BO3(0.5μM),KI(0.1μM),ZnSO4(0.5μM),MnSO4(0.1μM)，葡萄糖(10g/l)，天冬酰胺(1g/l)，甲硫氨酸(20mg/l)，肌醇(2mg/l)，生物素(0.2mg/l)，硫氨素-HCl(1mg/l)和吡哆醇-HCl(0.2mg/l)组成。试验生物包括细菌细胞，真菌孢子(50,000孢子/ml)或真菌菌丝体片段(通过把待测真菌培养物菌丝团混成一体，然后通过细筛过滤除去较大的菌丝团而产生的)。在微量滴定板每个加样孔中点上50μl悬浮在培养基中的试验生物。进一步在合适的加样孔中添加50μl试验抗微生物溶液。在生物测定中为了解决孔与孔的差异，每种试液做四个平行样。将每个96-加样孔平板的16个孔作为与试液比较用对照。
除非特别说明，使用的试验生物是隐地疫霉，在25℃下温育48小时。在25℃下培养所有包含酵母的真菌，而在37℃下培养大肠杆菌。通过采用各种时间间隔内生长培养物的600nm处的吸光度来测量，并且将生长抑制百分率定义为对照孔吸收度的平均变化减去试验孔吸收度的变化之差除以对照孔在600nm处的吸收度的平均变化后再乘以100。(即[(对照孔的平均变化-试验孔的变化)/(对照孔的平均变化)]×100)。典型地，测量在24小时间隔内进行，同时24-48时间段用于测量抑制百分率。
                        实施例3
Macadamia integrifolia碱性蛋白质组分的抗微生物蛋白质的纯化
用于分离Mi抗微生物蛋白质的起始材料是从上述实施例1的成熟种子中提取的碱性组分。如图1显示的，这种蛋白质通过阳离子交换层析进一步纯化。
将大约4g溶解在20mM琥珀酸钠(pH4)的碱性蛋白质组分上样到预先用琥珀酸盐缓冲液平衡的S-琼脂糖凝胶高效柱(5×60cm)(Pharmacia)上。在20mM琥珀酸钠(pH4)中用20升从0至2M线型梯度的NaCl以17ml/分钟的流速洗脱该柱。通过联机测量280nm处的吸光度(参见图1)监测蛋白质的洗脱物，并且收集成200ml的组分。随后以100μg/ml的浓度在抗真菌活性分析中检验每一组分的部分。这一生物测定结果包含在图1中：阴影带表示显示100％抑制作用的最大活性组分的抑制百分率。分级分离得到在0.05和1M NaCl之间洗脱的一些未解析的峰。在大约6小时进入分离时洗脱的主峰(组分31和32)显示最明显的抗微生物活性。
通过反相层析进一步纯化显示明显抗微生物活性的组分。将大约1mg量组分31和32的结合物装载到用95％H2O/5％MeCN/0.1％TFA(=100％A)平衡的Pep-S(C2/C18)层析柱(25×0.93cm)(Pharmacia)上。该层析柱用300ml从100％A至5％H2O/95％MeCN/0.1％TFA(=100％B)的线型梯度液以3ml/分钟流速进行洗脱(100分钟)。手工收集各个峰，真空干燥三次以除去痕量TFA，以及随后悬浮在500μl Milli-Q水(Millipore公司水纯化系统)中以用于如实施例2描述的生物测定。图2显示来自图1中显示的阳离子交换分离的纯化组分31/32的HPLC轮廓图。在214nm处监测蛋白质的洗脱。对于抗微生物活性，生物测定各个峰：图2中的带显示抑制作用与100μg/ml来自每个峰的材料相对应。构成峰7的活性蛋白质(在大约47分钟时洗脱(35％MeCN))称作MiAMP1。
                  实施例4
            MiAMP1的抗微生物潜能
如实施例3纯化MiAMP1。如上述实施例2试验抗微生物潜能。当对各种真菌和细菌试验时，下表1显示纯化MiAMP1的IC50值。在表中，＂＞100"表明没有试验高于100μg/ml的浓度；＂＜X＂表明没有试验低于(X)值的浓度。缩写＂ND＂表明没有进行试验或结果不能加以解释。在试验培养基中有1mM Ca2+的存在下也试验了抗微生物蛋白质，并且在左手栏给出这些试验的IC50值。正如在表中所见的，在Ca2+存在时，MiAMP1的抑制性活性大大降低(虽然不是完全除去)。
            表    1
观察到50％的生长抑制作用的MiAMP1的浓度
生物                 IC50(μg/ml)        IC50+Ca2+Alternaria helianthi       2-5                ＞100烟曲霉                     ＞100              ＞100灰葡萄孢                   2-5                ＞100白假丝酵母                 ＞100              ＞100奇异长喙壳                 20                  75镰形刺盘孢                 ＞100              ＞100盘长孢状刺盘孢             2-5                ＞100尖镰孢                     2-5                100Leptosphaeria               5                  ＞100maculansMacrophomina                ＜25               ＞100phaseolina石膏状小孢霉                ＞100              ＞100隐地疫霉                    5-10               ＞100禾生腐霉                    5                  ＞100核盘菌                      5                  ＞100整齐小核菌                  ＞100              ＞100大丽花轮枝孢                2-5                ＞100酿酒酵母                    ND                  1-5
  密执安棍状杆菌          ＜10         ＜10
  Pseudomonas             ＞100        ＞100
  rubrilineans
  大肠杆菌                ＞100         ND
                  实施例5
      纯化的MiAMP1对植物细胞的作用
由于MiAMP1可能是一种有用的在转基因农作物中表达的蛋白质，因此我们试验了MiAMP1是否对植物细胞有毒。正如Gibson等描述的方法(Gibson等[1976]植物：223-229),以28℃在110rpm摇动下在暗处将烟草(Nicotiana plumbaginofolia)微愈伤组织培养物在改良CSV培养基(Gibson,1976#219)中培养。在1x CSV培养基中将过滤灭菌的抗微生物蛋白质的50微升的小份添加至50μl植物细胞悬浮液中以便获得100μg/ml的终浓度。在28℃温育一夜之后，进行加二乙酸荧光素的酚沙黄测定以便估计细胞生存力。将50微升FDA贮液(5mg/ml在丙酮中)添加至2.5mlPS贮液(0.05％在生长培养基中)中以形成混合染色剂(Widholm,J.M.[1972]染色技术47:189-194)。将一滴混合染色剂添加至一滴细胞悬浮液中，然后通过明视野显微术和UV激发显微术使其可见以便鉴定细胞生存力。将0.1％TritonX-100溶液用作这些实验中的阳性对照。烟草微愈伤组织培养物显示，在浓度达100μg/ml暴露于MiAMP1达72小时时，正如测量的荧光细胞(二乙酸荧光素染色)在生存力方面没有任何下降并且在死亡细胞(酚沙黄染色)数量上也没有任何增加。
                  实施例6
        MiAMP1对人培养细胞和红细胞的作用
用HeLa细胞培养物进行毒性测定以研究MiAMP1对人细胞的毒性。将HeLa细胞培养物用改良的RPMI1640培养基(痕量生物科学，NSW，澳大利亚)在37℃,5％CO2下保存在单层培养物中。将RPMI培养基补充了10％胎牛血清(FBS),2mM L-谷氨酰胺，2g/l加青霉素G(10,000U/l)的NaHCO3和硫酸链霉素(100g/l)。将一百微升量的刚收获的和稀释的细胞转移到微量滴定板上(每个点样孔104-105个细胞)。将细胞固着并且几乎融合后，除去上清液并且用100μl预先悬浮在1x细胞培养物的培养基中的过滤灭菌的抗微生物蛋白质来代替。将浓度达1μg/ml的抗微生物蛋白质分三份添加至包含单层HeLa细胞的点样孔中，然后培养物在5％CO2,37℃下温育一夜。也将细胞以10-400μg/ml的浓度在大麦硫素(hordothionin)存在下温育(作为阳性对照)。在温育之后，除去上清液，细胞用2x磷酸盐缓冲的盐水(1.5mM KH2PO4,8mMK2HPO4,2.7mM KCl,135mM NaCl,37℃)冲洗，然后用中性红染料进行染色(Terras,F.R.G.等[1992]生物化学杂志267:15301-15309)。作为细胞死亡的量度也测定了培养物上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性(Legrand[1992]生物技术杂志25:231-243)。除在正常培养基中测试之外，也在缺乏FBS的培养基中测试了细胞，这是由于FBS也许掩盖毒性的可能性。
在浓度为1mg/ml时，细胞生存力或增殖不受影响，这一点通过显微镜检和染色后染料摄取的定量得到证明。相对地，大麦硫素(一种已知的人细胞抗生素蛋白质)在10μg/ml和更高的浓度时导致细胞生存力的完全丧失。通过在培养物上清液中测量LDH水平确认由MiAMP1导致的对细胞生存力的作用缺乏，这显示在水平上没有任何变化。
除细胞生存力测定之外，按照Cammue(Cammue,B.P.A.等[1995]植物生理学109:445-455)用人红细胞进行溶血测定。将人红细胞通过在10mM磷酸盐，120mM NaCl,27mM KCl(pH7.2)中重悬浮细胞，缓缓地混合并且以温和的离心沉降细胞(3分钟，300g)来洗涤几次。当上清液不显示任何可见的变色时，将细胞在PBS中进行重悬浮以获得0.5％悬浮液。将100μl的小份添加至微量滴定板点样孔中。将蛋白质溶液(100μl)添加至各自点样孔中以达到10-500μg/ml的终浓度。Triton X-100(终浓度0.05％)用作溶血作用的阳性对照，同时水用作为阴性对照。将细胞悬浮液在37℃下温育1小时，将微量滴定板在300g,10℃下离心5分钟，并且将上清液转移到新鲜平板上，在其上测量吸光度(405nm处)。这些试验显示暴露于浓度达100μg/ml的MiAMP1的红细胞没有发生任何溶解。其结果与硫素抗微生物肽(例如大麦硫素)形成对照，据报道后者在浓度为5-40μg/ml时就引起培养红细胞的破裂(Terras,F.R.G.等[1992]生物化学杂志267:15301-15309)。
                实施例7
            分离的MiAMP1的纯度
通过天然的SDS-PAGE，接着利用考马斯蓝蛋白质染色溶液进行染色来检验分离抗微生物蛋白质的纯度(参见图3)。在10-20％麦黄酮(tricine)梯度凝胶(Novex)上用如同制造商说明书介绍的方法(100V,1-2小时分离时间)进行电泳。将泳道3包含的标准物(Kaleidascope多肽标准物，Biorad)用来确定蛋白质的近似分子量。
可以从图3看到，纯化MiAMP1以大约8kDa进行迁移，接近于分子量标准物中的抑蛋白酶肽(图3中出现的标准物M.W.从上到下依次为38.6kDa,25.0kDa,16.3kDa,7.8kDa,3.4kDa)。在SDS-PAGE分析中的单一主区带和在分析阳离子交换和反相分离中洗脱的单峰(未显示)的检测强有力地表明，MiAMP1活性仅仅是因为纯化蛋白质而不是因为少量污染组分。
                实施例8
            MiAMP1的质谱分析
将纯化MiAMP1进行质谱分析。将溶液中大约1μg蛋白质用于试验。分析显示出蛋白质的分子量是8134Da±2Da(参见图4)。另外，将蛋白质用二硫苏糖醇进行二硫键的还原，并且用4-乙烯基吡啶进行烷基化。然后，也将这种还原/烷基化产物进行质谱分析，显示出获得638个质量单位(即分子量增加至8773±2Da-参见图5)。质量上的增加解释为六个4-乙烯基吡啶基团(质量106Da)与还原蛋白质进行反应，并且该蛋白质包含总共6个半胱氨酸残基。随后，通过氨基酸和核苷酸测序也证实了半胱氨酸含量(参见实施例9和11)。
                  实施例9
            MiAMP1的氨基酸序列
将大约1μg已还原并且烷基化的纯化蛋白质进行自动Edman降解N端测序。在第一次进行测序中，鉴定出序列的35个残基。随后，用内切蛋白酶Lys-C(切开赖氨酸残基的羧基)消化MiAMP1。按照制造商说明书，用Lys-C(Boehringer曼海姆)消化一毫克还原性/烷基化蛋白质。通过反相HPLC纯化该片段并且进行测序。利用这种消化液，鉴定出直到蛋白质序列的第68个残基。用内切蛋白酶胰蛋白酶(TPCK处理的，Sigma)进一步消化Lys-C片段产生两个片段。随后的测序提供出序列附加的2个残基以给出部分序列的70个残基(参见图6，成熟蛋白质的全序列)。随后，余下的6个氨基酸是从DNA序列(参见实施例8)推断出来的，从而得到整个76个氨基酸残基的蛋白质序列。图6显示成熟蛋白质序列(画方框)以及从cDNA序列(实施例8)鉴定出的信号肽序列(下划线)。翻译的ATG起始和TAG终止密码子也在氨基酸序列上面显示的核苷酸序列中加下划线予以强调。一旦确定蛋白质的氨基酸序列，预料蛋白质的质量是可能的。利用软件程序MacVector4.5.3可以获得预料的质量为8137.51Da的蛋白质。蛋白质质量取决于形成二硫键的数量，它的范围是8131.5-8137.5Da。即使该蛋白质大概形成3个二硫键(质量降低6Da)，这一点也与通过质谱分析(实施例5)获得的8134.4±2Da的质量几乎一致。由于通过质谱法测量的蛋白质质量和由氨基酸序列计算出的质量几乎完全一致，因而可以精确地判断氨基酸序列。
                实施例10
          在山龙眼科的其它切除物中相关蛋白质的鉴定
按照标准方案，用缀合白喉类毒素(悬浮在弗氏不完全佐剂中)的MiAMP1对兔进行肌肉免疫。在给动物添加一定剂量的MiAMP1佐剂以加强免疫应答之后，在规则的间隔内从动物中获取血清。收集大约100ml血清用于筛选从几种植物种子获得的粗提物。将100g量的种子磨碎，并且如实施例1抽提以获得粗提物。在SDS-PAGE凝胶上分离包含5和50μg量的蛋白质小份，然后为了随后检测抗原蛋白质，将凝胶印迹到硝酸纤维素膜上。膜用MiAMP1兔初级抗体进行温育，洗涤，然后为了抗原区带的比色检测，利用化学5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/氮蓝四唑底物系统(schleicher和Schuell)用碱性磷酸酶缀合的山羊抗兔IgG进行温育。图7中描述了进行染色的膜。
图7显示各种包含与MiAMP1类似大小的抗原相关蛋白质的山龙眼科物种。泳道1-22包含下列提取物：1)Persoonia levis,2)Stirlingiasimplex,3)Isopogon trilobus,4)Protea pulchra,5)Cardwelliasublimis,6)Stenocarpus sinuatus,7)Telopea oreades,8)Xylomelumprotocea,9)Macadamia integrifolia,10)Grevillea robusra,11)Hakeaplatysperma,12)Banksia asplenifolia,13)Banksia robur,14)MiAMPl(纯化的)，15)稻米，16大麦，17)鹰嘴豆，18)绿豆，19)Flindersia australis,20)小罗卜，21)canola,22)MiAMP1(纯化的)。泳道1-14包含来自山龙眼科的提取物并且所有的都显示存在与MiAMP1类似大小的抗原相关蛋白质(包含泳道2中很弱的没有很好拍照的信号)。包含从不相关物种的提取物的对照泳道(15-21)没有显示任何类似大小和抗原性的蛋白质。
利用几个来自山龙眼科物种的粗提取物也进行了生物测定。具体地说，来自Banksia robur,Banksia canei,Hakea gibbosa,Stenocarpussinuatus,Stirlingia latifolia以及Macadamia integrifolia的提取物全都显示出具有抗微生物活性。
                实施例11
          编码MiAMP1的DNA分子克隆
与逆翻译核苷酸序列对应的简并引物用于逆转录酶PCR反应(引物α序列5’CCG AAG CAG TTG CA[C/G/T]GC[C/G/T]C3’和引物β序列5’GAG[C/A]G[T/G]TAT[T/A][C/G][T/G]AAG TGT GG 3’)。从琼脂糖凝胶中切除DNA带，并且利用Qiagen DNA清除试剂盒纯化它们后，直接对PCR产物进行测序(Perkin Elmer公司的ABI PRISM染色终止子循环测序准备反应试剂盒)。利用这一方法，我们能够在聚合酶链反应中利用cDNA作为模板从Mi核心的mRNA扩增160碱基对的DNA片段。然后，由这一核苷酸序列设计出用于cDNA末端的5’和3’快速扩增(RACE)的特异性寡核苷酸引物。3’RACE方案利用从已知核苷酸序列产生的特异性引物(引物α,5’-TGC TCT CTA CAA CCA GGC TG-3')和寡聚d(T)25引物(引物β)以扩增与cDNA 3’末端相对应的片段(图6，位置334-493)。5’RACE方案利用从已知核苷酸序列产生的另一个特异性引物(引物β,5’-GCA TTG GAT GAA GAT ACT C-3')与设计的引物(引物α,5’-GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG GII GGGIIG-3’)结合起来用来给5′RACE方案中使用的多聚-C-尾cDNA有效地退火(Frohman,M.A.[1990]＂RACE:cDNA末端的快速扩增＂，PCR方案，方法和应用指导，Innis,M.A.,Gelfan,D.H.,Sninsky,J.J.和White,T.J.eds,pp.28-38，学院出版社，伦敦)。5’RACE方案导致鉴定碱基1-282(图6)。其后，合成与基因5’和3’末端对应的两个特异性引物，并且用来扩增邻近的全长核苷酸片段(图6，位置15-481)，该全长核苷酸片段直接连接到pGEM-T载体(Promega)的克隆位点上用于进一步操作和测序。
            实施例12
      植物转化载体pPCV91-MiAMP1的构建
表达载体pPCV91-MiAMP1(图8)包含MiAMP1 DNA的全编码区，该DNA的5’末端侧接来自花椰菜花叶病毒(pCaMV35S)的35SRNA的强组成型启动子(Odel等，[1985]自然313:810-812)，该启动子带有四元重复增强子元件(e-35S)，使得具有高转录活性(Kay等[1987]科学236:1299-1302)。MiAMP1 DNA的编码区3’末端侧接来自花椰菜花叶病毒(pA35S)的35S RNA的聚腺苷酸化序列。这一载体的质粒骨架是质粒pPCV91(Walden,R.等[1990]分子细胞生物学方法1:175-194)。该质粒也包含对于植物转化有用的其它元件，如氨苄青霉素抗性基因(bla)和nos启动子(pnos)驱动的潮霉素抗性基因(hph)。在各种克隆和转化方法中对于选择应考虑到这些和其它特性。构建质粒pPCV91-MiAMP1如下：在pGEM-T载体(实施例11)中利用限制酶SacⅡ与SpeⅠ消化PCR-克隆片段以释放MiAMP1基因片段。用限制酶BamHⅠ消化二元载体pPCV91。然后，利用T4 DNA聚合酶处理MiAMP1 DNA片段和二元载体以使突出端变钝。其后，利用T4 DNA连接酶将两片段连接成用于植物转化的pPCV91-MiAMP1二元载体(图8)。
                实施例13
              植物转化
以载体pPCV91-MiAMP1(实施例12)利用Walkerpeach等(Walkerpeach,C.R.等[1994]植物分子生物学手册B1:1-19)的由VanHaute修改(Van Haute,E.等[1983]EMBO J.2:411-417)的方法转化无细胞毒性的根瘤土壤杆菌菌株GV3101(pMP90RK)(Koncz,C.S.[1986]分子遗传学与基因工程杂志204:383-396)。
基于Horsch等的方法(Horsch等[1985]科学：1229-1231)，用Nicotiana tabacum叶片转化烟草，并且与包含pPCV91-MiAMP1的菌株共培养。在进行共培养土壤杆菌属和烟草叶片之后，将转基因植物(以pPCV91-MiAMP1转化的)在包含50μg/ml潮霉素和500μg/ml头孢噻唑的培养基上再生。利用标准蛋白质印迹技术，可以将这些转基因植物用来分析新引入的基因的表达。可以选择插入基因的有组成型表达能力的植物并且进行自体受粉得到种子。可以进一步分析转基因植物的Fl代籽苗。
                实施例14
      细菌表达载体pET-MiAMP1的构建
将位于MiAMP1基因编码区侧翼的PCR引物改造成含有NdeⅠ和BamHⅠ的限制性位点(分别与编码区的5’和3’末端对应)。然后将这些引物用于扩增MiAMP1 cDNA的编码区。在用NdeⅠ和BamHⅠ消化后，将这一扩增的PCR产物连接到编码区符合读框的pET-17b载体(Novagen/Studier,F.W.等[1986]分子生物学杂志189:113)上以产生载体pET-MiAMP1(图9)。
                实施例15
      在液体培养物中MiAMP1蛋白质的表达
将用载体pET-MiAMP1(实施例14)转化的大肠杆菌菌株BL21(Grodberg,J.[1988]细菌学杂志170:1245)培养至0.6的光密度，并且添加0.4mM IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)进行诱导。在设定的间隔内移走小份生长培养物，并将蛋白质提取物进行SDS-PAGE凝胶电泳，以观察培养物中MiAMP1的表达水平。
图10显示诱导后获得的提取物的SDS-PAGE分析。泳道1含有分子量标记。泳道2-7含有来自0、1、2、3、4和5小时诱导后培养物的提取物。泳道8含有来自非转化大肠杆菌菌株BL21的提取物。泳道9含有纯化的MiAMP1。图10中的箭头指出了在培养物中产生的MiAMP1蛋白质的区带。诱导后MiAMP1水平上显著的积累是明显的。
本领域技术人员会认识到，对以上例举的实施方案可以进行许多变化，而不偏离本发明广泛的界限与范围。
                序列表(1)一般信息：
(ⅰ)申请人：
    (A)名称：热带植物病理学协作研究中心
    (B)街道：Queensland大学
    (C)城市：St Lucia
    (D)州：Queensland
    (E)国家：澳大利亚
    (F)邮区代码(ZIP):4067
    (A)名称：MANNERS,John M.(仅美国)
    (B)街道：Warmington街28号
    (C)城市：Paddington
    (D)州：Queensland
    (E)国家：澳大利亚
    (F)邮区代码(ZIP):4064
    (A)名称：MARCUS,John P.(仅美国)
    (B)街道：Balderstone街1-10号
    (C)城市：Corinda
    (D)州：Queensland
    (E)国家：澳大利亚
    (F)邮区代码(ZIP):4075
    (A)名称：GOULTER,Kenneth C.(仅美国)
    (B)街道：Emblem街26号
    (C)城市：Jamboree Heights
    (D)州：Queensland
    (E)国家：澳大利亚
    (F)邮区代码(ZIP):4074
    (A)名称：GREEN,Jodie L.(仅美国)
    (B)街道：4 Reef Close
    (C)城市：Jamboree Heights
    (D)州：Queensland
    (E)国家：澳大利亚
    (F)邮区代码(ZIP):4074
    (A)名称：HARRISON,Stuart J.(仅美国)
    (B)街道：Thurlow街8号
    (C)城市：Newmarket
    (D)州：Queensland
    (E)国家：澳大利亚
    (F)邮区代码(ZIP):4051
(ⅱ)发明名称：抗微生物蛋白质
(ⅲ)序列数：2
(ⅳ)计算机可读形式：
    (A)介质类型：软盘
    (B)计算机：IBM PC兼容机
    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
    (D)软件：PatentIn Release#1.0,版本#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO:1的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：102个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅵ)原始来源：
    (A)有机体：Macadamia integrifolia
    (F)组织类型：种子
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:Met Ala Ser Thr Lys Leu Phe Phe Ser Val Ile Thr Val Met Met Leu1               5                   10                  15Ile Ala Met Ala Ser Glu Met Val Asn Gly Ser Ala Phe Thr Val Trp
        20                  25                  30Ser Gly Pro Gly Cys ASn ASn Arg Ala Glu Arg Tyr Ser Lys Cys Gly
    35                  40                  45Cys Ser Ala Ile His Gln Lys Gly Gly Tyr Asp Phe Ser Tyr Thr Gly
50                  55                  60Gln Thr Ala Ala Leu Tyr Asn Gln Ala Gly Cys Ser Gly Val Ala His65                  70                  75                  80Thr Arg Phe Gly Ser Ser Ala Arg Ala Cys Asn Pro Phe Gly Trp Lys
                85              90                  95Ser Ile Phe Ile Gln Cys
        100(2)SEQ ID NO:2的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：480个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：cDNA
(ⅵ)原始来源：
    (A)有机体：Macadamia integrifolia
    (F)组织类型：种子
(ⅸ)特征：
    (A)名称/关键词：sig_肽
    (B)位置：70..147
(ⅸ)特征：
    (A)名称/关键词：mat_肽
    (B)配置：148..375
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:ATTAAGTCTT TGAGTCTCAT ACATACTCTT CTCCTCCCCA CCATTAGCAC TTATCAGCTA        60ACCTCAGCCA TGGCTTCCAC CAAGTTGTTC TTCTCAGTCA TTACTGTGAT GATGCTCATA       120GCAATGGCAA GTGAGATGGT GAATGGGAGT GCATTTACAG TATGGAGTGG TCCAGGGTTGT      180AACAACCGTG CTGAGCGATA TAGCAAGTGT GGATGCTCAG CTATACATCA GAAGGGAGGC       240TATGACTTCA GCTACACTGG ACAAACTGCT GCTCTCTACA ACCAGGCTGG ATGCAGTGGT       300GTTGCACACA CCAGGTTTGG GTCCAGTGCC AGGGCATGCA ACCCTTTTGG TTGGAAGAGT       360ATCTTCATCC AATGCTAGAT TTCATAACTC TTGGATCCAT CTTCTATGTT TTTCAAGTGT       420ATAATTAGAG AGATGCATGG ATATATAATA AATAAGTAAA AGCTACGGTA TCACCATGTG       480

Claims (19)

1．一种分离的或者合成的抗微生物蛋白质，该蛋白质选自：
(ⅰ)包含与(SEQ ID NO:1)显示的序列的27到102位残基相对应的氨基酸序列的蛋白质；
(ⅱ)(ⅰ)的同系物；
(ⅲ)具有与(ⅰ)基本上相同的3-维形状，并且具有与(ⅱ)基本上相同的抗微生物活性的蛋白质；
(ⅳ)包括-C-9X-C-X-C-25X-C-14X-C-11X-C-的相关半胱氨酸间距的蛋白质，其中X是任何不同于半胱氨酸的氨基酸残基；和
(ⅴ)从山龙眼科分离的蛋白质，其特异性地与抗(ⅰ)产生的抗体进行反应，并且具有与(ⅰ)基本上相同的抗微生物活性。
2．按照权利要求1的蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID NO:1的27到102位残基的氨基酸序列。
3．一种编码选自下组的蛋白质的分离的或合成的DNA：
(ⅰ)包含与(SEQ ID NO:1)显示的序列的27到102位残基相对应的氨基酸序列的蛋白质；
(ⅱ)(ⅰ)的同系物；
(ⅲ)具有与(ⅰ)基本上相同的3-维形状，并且具有与(ⅰ)基本上相同的抗微生物活性的蛋白质；
(ⅳ)包含-C-9X-C-X-C-25X-C-14X-C-11X-C-的相关半胱氨酸间距的蛋白质，其中X是任何不同于半胱氨酸的氨基酸残基；和
(ⅴ)从山龙眼科分离的蛋白质，其特异性地与抗(ⅰ)产生的抗体进行反应，并且具有与(ⅰ)基本上相同的抗微生物活性。
4．按照权利要求3的DNA，该DNA包含SEQ ID NO:2的148-375位核苷酸。
5．一种DNA构建体，该构建体包含有效地连接到所说的编码蛋白质的表达元件上的按照权利要求3的DNA。
6．按照权利要求5的构建体，其中所说的DNA包含SEQ ID NO:2的70到375位核苷酸。
7．按照权利要求5的构建体，该构建体选自pPCV91-MiAMP1和pET-MiAMP1。
8．一种包含按照权利要求5的DNA构建体的宿主细胞。
9．按照权利要求8的宿主细胞，该细胞选自细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞。
10．一种包含按照权利要求5的DNA构建体的转基因植物。
11．按照权利要求10的转基因植物，该转基因植物是单子叶植物或双子叶植物。
12．按照权利要求11的转基因植物，该转基因植物选自谷类作物、饲料作物、水果、蔬菜、油料作物、棕榈树、林业树和藤本植物。
13．按照权利要求11的转基因植物，该转基因植物选自玉米、香蕉、花生、野生豌豆、向日葵、番茄、canola、烟草、小麦、大麦、燕麦、土豆、大豆、棉花、石竹属植物、高粱、羽扇豆属植物和稻米。
14．按照权利要求11的转基因植物的繁殖材料。
15．按照权利要求14的繁殖材料，该繁殖材料选自种子、子代植物和克隆材料。
16．一种药物组合物，该组合物包含按照权利要求1的抗微生物蛋白质和一种农业上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
17．一种药物组合物，该组合物包含按照权利要求1的抗微生物蛋白质和一种药物上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
18．一种控制植物的微生物感染的方法，该方法包括：
ⅰ)把按照权利要求5的DNA构建体引入到所说的植物中；或
ⅱ)用按照权利要求1的抗微生物蛋白质或按照权利要求16的组合物处理所说的植物。
19．一种控制哺乳动物的微生物感染的方法，该方法包括用按照权利要求1的抗微生物蛋白质或按照权利要求17的组合物处理所说的动物。
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