DE69918979T2

DE69918979T2 - Verwendung eines polypeptids aus hülsen-albumin (pa1b) als inzektizid

Info

Publication number: DE69918979T2
Application number: DE69918979T
Authority: DE
Inventors: Bernard Delobel; Annie Grenier; J. Gueguen; Eric Ferrasson; Mbaiguinam Mbailao
Original assignee: INST NAT SCIENCES APPLIQ; Institut National de la Recherche Agronomique INRA; Institut National des Sciences Appliquees de Lyon
Current assignee: INST NAT SCIENCES APPLIQ; Institut National de la Recherche Agronomique INRA; Institut National des Sciences Appliquees de Lyon
Priority date: 1998-05-11
Filing date: 1999-05-07
Publication date: 2005-07-21
Anticipated expiration: 2019-05-08
Also published as: CA2328590A1; WO1999058695A1; FR2778407A1; AU3529199A; ES2226374T3; CA2328590C; FR2778407B1; DE69918979D1; EP1078085A1; ATE272120T1; US20080086786A1; EP1078085B1; US20100263089A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft insektizide Proteine und deren Verwendung zum Pflanzenschutz, insbesondere von Getreide, Getreidekörnern und aus diesen abgeleitete Produkten gegen Schadinsekten.
Schadinsekten von Getreidekörnern finden sich in verschiedenen Familien, insbesondere unter den Käfern, den Schmetterlingen und den Homopteren. Von den Käfern sind insbesondere die Getreidekäfer zu nennen (Sitophilus oryzae, Sitophilus zeamais, Sitophilus granarius), so wie Tenebrio spp., Rhyzoperta dominica, Trogoderma spp., Tribolium confusum. Von den Schmetterlingen sind insbesondere Sitotroga cerealella und Ephestia kuehniella zu nennen.
Getreidekörnerschädlinge sind unter den Hauptfeinden der Ernte, die sie auf dem Acker angreifen (zumindest in heißen Regionen), und vor allem in den Lagersilos; sie können gleichermaßen umgewandelte, von Getreide abgeleitete Produkte angreifen (z.B. Mehl, Grieß, etc.). Diese Insekten verursachen sehr bedeutende Schäden und sind jedes Jahr der Ursprung der Zerstörung eines wichtigen Teils der weltweiten, jährlichen Getreideernte, welche bis zu 25 % reichen kann.
Zur Bekämpfung dieser Insekten sind verschiedene Methoden vorgeschlagen worden. Die Verwendung von Insektiziden (LINDAN^®, dann MALATHION^® und Ethylenbromid) ist derzeit aufgrund von Problemen in Frage gestellt, die sich durch die Gegenwart von Rückständen dieser Produkte in Nahrungsmitteln stellen. Außerdem sind Resistenzen gegenüber diesen Produkten bei zahlreichen Insekten der Zielgruppe aufgetreten, was ihre Verwendung immer weniger wirksam macht. Zum Ersatz dieser Insektizide oder zur Beschränkung ihrer Verwendung sind verschiedene Verfahren vorgeschlagen worden [zur Übersicht siehe z.B. F.H. ARTHUR, J. Stored Prod. Res., 32, Seiten 293–302, (1996)]. Die derzeit am weitesten entwickelten sind physikalische Verfahren, wie das Abkühlen der Silos, die Konservierung unter CO₂ oder unter Stickstoff; diese Verfahren sind allerdings kostspielig und ihre Durchführung, die ein großes Fachwissen erfordert, ist heikel; sie sind daher nicht überall anwendbar.
Eine andere Art des Vorgehens, die Gegenstand zahlreicher Untersuchungen ist, besteht in der Erzeugung transgener Pflanzen, welche ein oder mehrere Gene) expremieren, die ihnen Resistenz gegen den Angriff von Insekten verleihen. Dieses Vorgehen erfordert jedoch, daß geeignete Gene zu Verfügung stehen, die außerdem sowohl verträglich für die Umwelt als auch für die Konsumenten sein müssen.
Der größte Teil der Insekten zeigt eine mehr oder weniger strikte Ernährungsspezifizität; so wie die Getreidekörner von Getreidekäfern (Sitophilus oryzae, Sitophilus zemais, Sitophilus granarius), die keine Körner von Leguminosen angreifen, im Gegenteil, andere Schädlinge, wie die Samenkäfer, greifen die Leguminosen an, aber nicht Getreide.
Die vorhergehenden Arbeiten der Gruppe der Erfinder [DELOBEL et GRENIER, J. Stored Prod. Res., 29, Seiten 7 – 14, (1993)], haben gezeigt, daß die drei vorangehend genannten Sitophilus-Spezies sich auf Nüssen oder Eicheln entwickeln können, aber sie sterben im Gegenzug schnell auf Erbsen, wobei diese Sterblichkeit eine Folge des Konsums von Erbsen durch diese Getreidekäfer ist.
Die Erfinder haben Untersuchungen hinsichtlich der für diese Mortalität verantwortlichen toxischen Substanz unternommen. Es ist außerdem bekannt, daß die Leguminosen mehrere entomotoxische Substanzen enthalten, und daß bei verschiedenen Insektenarten, für die die Leguminosen toxisch sind, natürliche Unterpopulationen existieren, die mehr oder weniger resistent gegenüber der Toxizität der Leguminosen sind.
Z.B. hat im Fall der Getreidekäfer ein durch die Gruppe der Erfinder durchgeführter Test an 90 Stämmen unterschiedlicher geographischer Herkunft gezeigt, daß 4 Stämme zur Art Sitophilus oryzae gehörten, welche Individuen umfaßten, die im adulten Stadium zum Überleben auf Erbsen in der Lage waren; dagegen ist kein diese Fähigkeit besitzender Stamm bei den Arten Sitophilus zeamais oder Sitophilus granarius bewiesen worden; die Untersuchung des genetischen Determinismus dieser Resistenz hat gezeigt, daß dieses Merkmal monogenetisch, rezessiv und autosomal ist [GRENIER et al., Heredity, 79, Seiten 15–23, (1997)].
Die Erfinder haben einen homozygoten Stamm von S. oryzae für dieses Resistenzgen ausgewählt und diesen Stamm zur Erforschung der toxischen Substanz gegenüber derjenigen verwendet, bei der sich die durch dieses Gen codierte Resistenz zeigt.
Die Erfinder haben auf diese Art festgestellt, daß diese Toxizität mit Isoformen eines Proteins von einer Sequenz in Verbindung steht, die ähnlich der von Erbsen-Albumin PA1b, beschrieben von HIGGINS et al., [J. Biol. Chem., 261 (24), Seiten 11124 – 11130, (1986)], ist, und eine starke Ähnlichkeit (65 % Identität) mit dem Soja-Leginsulin zeigt [WATANABE et al., Eur. J. Biochem., 15, Seiten 224:1 – 167 – 72, (1994)]. Keine entomotoxische Eigenschaft wurde bisher mit dem Protein PA1b in Verbindung gebracht, weder mit dem Leginsulin noch mit anderen homologen Proteinen.
Die Ausrichtung der Sequenz einer der Isoformen des von den Erfindern gereinigten Proteins mit der des Erbsenproteins PA1b, veröffentlicht von HIGGINS et al., und der von Soja-Leginsulin, veröffentlicht von WATANABE et al., ist in 7 wiedergegeben. Die drei Sequenzen weisen insbesondere sechs Cysteinreste auf, die konservierte Positionen besetzen.
Die vorliegende Erfindung hat die Verwendung eines Polypeptids in der Eigenschaft als Insektizid zur Aufgabe, das eine der nachfolgenden allgemeinen Formel (I) entsprechende Sequenz umfaßt: X₁CX₂CX₃CX₄CX₅CX₆CX₇ (I)worin:
C einen Cysteinrest darstellt, und X₁ für die Sequenz y₁y₂ steht, worin y₁ und y₂ jeweils eine Aminosäure darstellen, ausgewählt aus Alanin, Serin, Glycin und Threonin, oder y₁ eine aus Alanin, Serin, Glycin und Threonin ausgewählte Aminosäure darstellt und y₂ Glutaminsäure oder Aspartamsäure; und/oder
X₂ für die Sequenz y₃y₄y₅ steht, worin y₃ Glutamin oder Asparagin darstellt und y₄ und y₅ jeweils eine aus Alanin, Serin, Glycin, Threonin, Valin, Leucin, Isoleucin und Methionin ausgewählte Aminosäure; und/oder
X₃ für die Sequenz y₆y₇y₈y₉y₁₀y₁₁y₁₂ steht, worin y₆ eine aus Alanin, Serin, Glycin und Threonin ausgewählte Aminosäure darstellt, y₇, y₁₁ und y₁₂ jeweils Prolin, y₈ eine aus Phenylalanin, Tryptophan und Thyrosin ausgewählte Aminosäure, y₉ Aspartamsäure oder Glutaminsäure, y₁₀ eine aus Valin, Leucin, Isoleucin und Methionin ausgewählte Aminosäure; und/oder
X₄ für die Sequenz y₁₃y₁₄y₁₅y₁₆ steht, worin y₁₃, y₁₄, y₁₅, y₁₆ jeweils eine aus Alanin, Serin, Glycin und Threonin ausgewählte Aminosäure darstellen, oder y₁₄ eine aus Alanin, Serin, Glycin und Threonin ausgewählte Aminosäure, y₁ ₃ und y₁₅ jeweils eine basische Aminosäure und y₁ ₆ Aspartamsäure oder Glutaminsäure; und/oder
X₅ eine basische Aminosäure darstellt; und/oder
X₆ für die Sequenz y₁₇y₁₈y₁₉y₂₀y₂₁y₂₂y₂₃y₂₄y₂₅ steht, worin y₁₇, y₁ ₉, y₂₁ und y₂₃ jeweils eine aus Valin, Leucin, Isoleucin und Methionin ausgewählte Aminosäure darstellen, y₁ ₈ Prolin, y₂₀ und y₂₄ jeweils eine aus Alanin, Serin, Glycin und Threonin ausgewählte Aminosäure, y₂₂ eine aus Valin, Leucin, Isoleucin, Methionin, Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin ausgewählte Aminosäure und Y₂₅ eine aus Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin ausgewählte Aminosäure; und/oder
X₇ für die Sequenz y₂₆y₂₇y₂₈y₂₉y₃₀ steht, worin y₂₆ eine basische Aminosäure darstellt oder eine aus Valin, Leucin, Isoleucin und Methionin ausgewählte Aminosäure, y₂₇ Asparagin oder Glutamin oder eine basische Aminosäure, y₂₈ Prolin und y₂₉ und y₃ ₀ jeweils eine aus Alanin, Serin, Glycin und Threonin ausgewählte Aminosäure.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das als Insektizid verwendete Polypeptid wenigstens 40 %, bevorzugt wenigstens 60 %, Homologie mit einer beliebigen Isoform eines Albumins PA1b auf.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung werden unter „Albumin PA1b" nicht nur sämtliche Isoformen des Erbsenproteins PA1b verstanden, sondern ebenso sämtliche Proteine derselben Familie, die bei anderen Pflanzen vorliegen, und insbesondere ausgehend von Körnern von Leguminosen gereinigt werden können, insbesondere von Leguminosen der Familie der Cesalpinaceae, der Mimosaceae oder der Fabaceae, oder der Meliaceae, wie Khaya senegalensis.
Die erfindungsgemäß verwendbaren Polypeptide können natürliche Polypeptide sein, z.B. die Leginsuline der Leguminosen, wie das von WATANABE et al. beschriebene Soja-Leginsulin; es kann sich ebenso um künstliche Polypeptide handeln, deren Sequenz sich von der eines PA1b durch Hinzufügen, Deletion oder Substitution einer kleinen Anzahl Aminosäuren ableitet. Man kann z.B. Polypeptide verwenden, die eine Sequenz aufweisen, die für die allgemeine Formel (I) steht, oder einen Teil derselben entspricht der in der Insektiziden Aktivität mit inbegriffenen Region. Dieses aktive Peptid kann eventuell an seinem N-terminalen oder C-terminalen Ende mit einer anderen Peptidsequenz verbunden sein.
Diese Polypeptide können durch klassische Verfahren erhalten werden, die selbst bekannt sind, z.B. mittels Peptidsynthese oder mittels Gentechnik, wobei in einer geeigneten Wirtszelle eine für das gewünschte Polypeptid codierende Sequenz exprimiert wird. Sie können, im Fall der natürlichen Polypeptide, wie das PA1b und das Leginsulin, ebenso ausgehend von den Körnern der Pflanzen, wie die der Leguminosen oder der Meliaceen, gereinigt werden.
Erfindungsgemäß können die Polypeptide, die eine Sequenz der allgemeinen Formel (I) umfassen, in der Eigenschaft als einziges aktives Prinzip eines Insektizids verwendet werden, beziehungsweise in Verbindung mit einem oder mehreren anderen aktiven Prinzipien. Sie können insbesondere zur Bekämpfung von Schadinsekten von Getreidekörnen verwendet werden und ebenso gegen phytophage Insekten, wie den Schmetterlingen Mamestra brassicae oder Ostrina nubilalis oder den Käfern Chrysomelidae wie Anthonomus grandis oder gegen phloemophage Insekten, wie den Blattläusen.
Außerdem haben die Erfinder festgestellt, daß das Protein PA1b seine Insektizide Aktivität über mehrere Jahre in trockenen Körnern beibehält, und daß diese Aktivität durch ein Aufheizen auf 100°C nicht beeinflußt wird.
Andererseits ist das Protein für den Menschen oder höhere Tiere nicht toxisch; es liegt in Leguminosen vor, die einen Teil ihrer gewöhnlichen Ernährung bilden.
Die Polypeptide der allgemeinen Sequenz (I) sind insbesondere gut für den Schutz von Körnern, Mehl oder von diesen abgeleiteten, umgewandelten Produkten angepaßt, insbesondere während der Lagerung.
Zur Ausführung der vorliegenden Erfindung ist die Konzentration des Polypeptids der Sequenz (I), auf dem Niveau des zu schützenden Produkts (Pflanzen, Körner oder abgeleitete Produkte) allgemein von 10 μmol/kg bis 100 mmol/kg (oder von 10 μM bis 100 mM) und vorteilhafterweise von 50 μmol/kg bis 10 mmol/kg (oder von 50 μM bis 10 mM).
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das zu schützende Produkt mit einer besagtes Polypeptid aufweisenden Zubereitung behandelt. Dieses kann z.B. in Form einer gereinigten Zubereitung oder einer angereicherten Fraktion vorliegen, die insbesondere aus den Körnern der besagtes Polypeptid natürlich produzierenden Pflanzen hergestellt werden kann, beziehungsweise aus Zellkulturen, die ein für dieses Polypeptid codierendes Gen exprimieren.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine transgene Pflanze erzeugt, die wenigstens durch zumindest ein für besagtes Polypeptid codierendes Gen transformiert wurde, und das Polypeptid in wenigstens eines seiner Gewebe oder Organe exprimiert.
Die vorliegende Erfindung umfaßt ebenso auf diese Art und Weise erzeugte transgene Pflanzen; vorteilhafterweise sind besagte Pflanzen Getreidepflanzen.
Diese Pflanzen können durch gewöhnliche Pflanzentransgenese erhalten werden, die an sich bekannt ist.
Auf diese Weise ist es möglich in einer Pflanze ein ubiquitäre Expression von einem Polypeptid der Sequenz (I) und/oder eine Expression oder eine Überexpression in bestimmten Geweben oder Organen (z.B. in den Körnern) zu erhalten und so die Pflanze, das Gewebe oder die betroffenen Organe gegen die Angriffe von Insekten, für die das Polypeptid toxisch ist, zu schützen. Insbesondere die Expression eines Polypeptids der Sequenz (I) in den Körnern erlaubt dieselben zu schützen, ebenso nach der Ernte, sowie Mehl und aus den Körnern erhaltene, umgewandelte Produkte.
Die vorliegende Erfindung wird mit Hilfe der Beschreibung unter Bezugnahme auf die nicht beschränkenden Beispiele verstanden, die die Reinigung beschreiben und die Insektiziden Eigenschaften eines Leguminosen-Albumins PA1b erläutern.
Beispiel 1: Nachweis der Toxizität von verschiedenen Leguminosemehlen für Getreideschädlinge
Die Toxizität von Mehlen von unterschiedlichen Leguminosen wurde an Getreidekäfern (Sitophilus oryzae) getestet. Die Untersuchungen wurden parallel an Tieren vom Wildtyp (empfindlicher Stamm S) durchgeführt und an Mutanten, die eine auf Erbsen basierende Ernährung überlebten (resistenter Stamm R).
Die Getreidekäfer (Sitophilus oryzae) wurden in regulierter Umgebung bei 27,5 °C und 70 % relativer Luftfeuchtigkeit gezogen. Junge adulte Tiere von einer Woche wurden für die Tests der Masse der Aufzucht entnommen. Für jeden Test wurden Mengen von 30 Insekten untersucht und die tägliche Sterberate wurde notiert.
Mehlklöße wurden mit Wasser geformt, 24 Stunden getrocknet und zur Ernährung der Getreidekäfer verwendet. Das verwendete graue Weizenmehl wird mit unterschiedlichen Anteilen Leguminosenmehl ergänzt und bei einer Maschenweite von 0,2 mm gesiebt.
Die Dosis-Wirkungs-Kurve der Sterblichkeit der Getreidekäfer wurde unter Verwendung unterschiedlicher Dosierungen von jedem zu testenden Mehl erhalten. Die Ergebnisse wurden mit dem Programm „Toxicologie" [FEBVAY et RHABÉ, „Toxicilogie", ein Programm zur Analyse von Sterblichkeitskurven mittels Probitanalyse (methode des probits) auf Macintosh, Cahiers Techn. INKA, 27, Seiten 77-78, (1991)] behandelt. Dieses Programm verwendet die Transformation von kumulierten Sterberaten in Wahrscheinlichkeiten (Probits) und bestimmt die Gleichung der Regressionskurve und die letale 50%-Konzentration. Diese Werte werden nach einer Exposition von 4 und 7 Tagen bestimmt.
Außerdem wurde für jede Konzentration Erbsenmehl die Letalzeit bis 50% Sterberate (TL50) für den empfindlichen Stamm S ebenso berechnet. Die so etablierte Eichkurve erlaubt Bestimmungen in der Untersuchungsfolge für jedes getestete Mehl oder jede getestete Mehlfraktion. wobei die Äquivalenzkonzentration in Erbsenmehl (in % Erbsen im Weizen) angegeben wird. Diese Kurve ist in 1 wiedergegeben.
Toxizität von Erbsenmehl:
2 zeigt die kumulierte Sterblichkeit für adulte Tiere des empfindlichen Stamms S von Sitophilus oryzae auf Erbsen (♢) und auf Weizen (☐) als Funktion der Ernährungsdauer in Tagen. Die Resultate zeigen, daß die Getreidekäfer schnell auf Erbsen getötet werden: in 8 Tagen sind zwischen 90 und 100% der adulten Tiere tot.
3 zeigt die Sterblichkeit von Sitophilus oryzae bei 6 Tagen für Kügelchen mit verschiedenen Konzentrationen Erbsenmehl; der resistente Stamm (R) und der empfindliche Stamm (S) werden verglichen. Die so etablierte Kurve Dosis/Wirkung zeigt, daß für den empfindlichen Stamm (S) bei 10% Erbsenmehl eine Sterblichkeit von 70 % in 6 Tagen zu beobachten ist (und 100 % in 14 Tagen). In derselben Zeit wird der resistente Stamm (R) nicht betroffen.
Toxizität von Mehl von anderen Leguminosen:
Unter den Körnern von Leguminosen, die für die menschliche Ernährung verwendet werden, wurden 10 auf ihre Wirkung auf empfindliche und resistente Getreidekäfer getestet.
80% Leguminosenmehl und 20% Weizenmehl enthaltende Kügelchen wurden verwendet. 4 erläutert die kumulierte Sterblichkeit von Getreidekäfern Sitophilus oryzae, resistenter Stamm R () oder empfindlicher Stamm S (), gemessen nach 5 (4A), 7(4B), 14(4C) und 20 Tagen (4D) Ernährung auf Augenbohnen (Vigna unguiculata) weiße Variante (1) und rote Variante (2), Erdnüssen (3: Vigna subterranea), Linsen (4: Lens esculenta), Bohnen (5: Phaseolus vulgaris), Mungbohnen (6: Vigna radiata), Adzukibohnen (7: Vigna angularis), Ackerbohnen (8: Vicia faba), Kichererbsen (9: Cicer arietinum) und Lupinen (10: Lupinus albus).
Die Ergebnisse zeigen, daß sämtliche Leguminosen bis zu 7 Tagen für den empfindlichen Stamm toxisch sind, ebenso wie Vigna subterranea und Cicer arietinum nicht auch alle Insekten getötet haben, die sich davon ernährten; im Gegenteil, der resistente Stamm zeigte keine oder eine sehr geringe Sterblichkeit. Man kann daher schließen, daß derselbe Mechanismus des Ursprungs der Toxizität bei sämtlichen Leguminosen vorliegt; dieser Mechanismus erscheint so insbesondere bei Vigna subterranea, Vigna radiata und Cicer arietinum vorzuherrschen.
Dennoch zeigte die Untersuchung der Sterblichkeiten nach 14 und 20 Tagen auf bestimmten Leguminosen für den resistenten Stamm eine mehr oder weniger große Sterblichkeit, die daher auf andere Mechanismen zurückzuführen sein muß; das ist insbesondere auf Phaseolus vulgaris und auf Vigna vulgaris der Fall.
Beispiel 2: Reinigung und Identifizierung der für die Toxizität bei Erbsen verantwortlichen Substanz
Herstellung einer mit Albuminen angereicherten Proteinfraktion (SRA1).
Die mit Albumin angereicherte Fraktion wird im Pilotmaßstab nach dem von CREVIEU et al. [Nahrung, 40(5), Seiten 237-244, (1996)] entwickelten Protokoll hergestellt.
Das Erbsenmehl (10 kg) wird unter Rühren mit 140 Liter Acetatpuffer (pH 4,9) vermischt, die Mischung wird bei 7500 U/min zentrifugiert, der Überstand wird einer Ultrafiltration an einer M5-Membran unterworfen, wobei dies bei einer Temperatur, die 25°C nicht überschreitet, erfolgt. Der Rückstand wird einer Diafiltration an derselben Membran unterworfen, wobei der neue Rückstand während 20 min bei 6000 U/min zentrifugiert und der Überstand lyophilisiert wird. Das erhaltene Pulver (SRA1), das im Mittel 1% der Ausgangsmasse darstellt, wird für nachfolgende Reinigungen verwendet.
Bei jeder Reinigungsstufe wird die Toxizität der verschiedenen Fraktionen gemäß dem oben in Beispiel 1 beschriebenen Protokoll bestimmt.
Anionenaustauschchromatographie
10 g SRA1 werden in 100 ml einer 60%-igen Lösung von Methanol suspendiert und eine Stunde bei 4°C gerührt. Nach dem Zentrifugieren (30 min, 9000 g, 4°C) wird der Überstand zurückgewonnen, bis das vorhandene Methanol im Rotationsverdampfer entfernt ist. Das Volumen wird dann mittels Wasser und eines Puffers von 1M Tris-HCl (pH 8,8) zum Erhalt einer Endkonzentration von 50 mM in Tris-HCl wieder auf 100 ml eingestellt. Die löslichen Proteine werden mittels Anionenaustauschchromatographie auf einer FAST FLOW DEAE SEPHAROSE-Säule (120 × 50 mm) fraktioniert. Die adsorbierten Proteine werden mittels einer Konzentration von 50% von Puffer B (50 mM Tris-HCl, pH 8,8; 500 mM NaCl) in Puffer A (50 mM Tris-HCl, pH 8,8) eluiert. Der Durchfluß der Elution beträgt 20 ml/min und die gesammelten Fraktionen besitzen ein Volumen von 80 ml. Die Proteine werden durch Absorption bei 280 nm detektiert.
Das Chromatogramm ist in 5 dargestellt. Die Konzentration in Puffer B wird durch die unterbrochenen Linie angezeigt. Die den Peaks entsprechenden Fraktionen von 80 ml werden in zwei Hauptfraktionen vereinigt, DEAE und DEAE1, in dem Chromatogramm durch horizontale Linien gezeigt. Die nichtadsorbierte Fraktion (DEAE NA) enthielt die gesamte Toxizität.
Diese Fraktion wird 72 Stunden gegen Wasser dialysiert und dann lyophilisiert. Auf diese Weise erhielt man ungefähr 450 mg der Fraktion DEAE NA.
Semi-präparative, Reversphasen-HPLC-Chromatographie
Die nach Anionenaustauschchromatographie erhaltene Fraktion DEAE NA wird mittels Reversphasen-HPLC-Chromatographie (RP-HPLC) an einer HYPERSIL-Kolonne (250 × 10,5 mm), gefüllt mit NUCLEOSIL 5μm 300 Å, gepfropft mit einer C18-Aliphatkette, fraktioniert. Für jede Chromatographie werden 15 mg der Proteine auf die Säule aufgebracht. Der Durchfluß der Elution ist 3 ml/min und die Proteine werden durch Absorption bei 220 nm de tektiert. Die Proteine werden mittels eines Gradienten von Puffer B (0,04% Trifluoressigsäure in Acetonitril) in der Mischung A (0,04% Trifluoressigsäure in Wasser) gemäß der folgenden Sequenz eluiert: t m = 0 min, 40% B; t = 5 min, 40% B; t = 17 min, 48% B; t = 18 min, 80% B; und t = 23 min, 80% B.
Dass Chromatogramm wird durch 6 erläutert. Der Gradient des Acetonitrils wird durch die unterbrochene Linie wiedergegeben. Die Toxizität ist nur auf dem Niveau der Peaks F1 und PT lokalisiert; die den gesammelten Peaks entsprechenden Fraktionen sind in dem Chromatogramm durch horizontale Striche wiedergegeben.
Dreißig, einer 450 mg DEAE NA entsprechenden injizierten Menge aufeinander folgende Chromatogramme sind durchgeführt worden. Die Fraktionen wurden wieder vereinigt und dann nach Verdampfen des Acetonitrils und der Trifluoressigsäure im SPEED VAC lyophilisiert. 4 mg der Fraktion PT und 5 mg von F 1 wurden auf diese Weise erhalten. Diese Fraktionen wurden dann mittels Reversphasen-HPLC-Chromatographie (RP-HPLC) analysiert.
Reversphasen-HPLC-Chromatographie
Die Kontrolle der Reinheit der Proteine der Fraktionen F1 und PT wird mittels Reversphasen-HPLC-Chromatographie an INTERCHROM-Säule (250 × 4,6 mm), gefüllt mit NUCLEOSIL 5μm 100 Å, gepfropft mit einer C18-Aliphatkette, durchgeführt. Der Durchfluß der Elution ist 1 ml/min und die Proteine werden durch Absorption bei 220 nm detektiert.
Die Proteine werden während 45 Minuten mittels eines linearen Gradienten von 0 bis 50% von Mischung B (0,04% Trifluoressigsäure in Acetonitril) in Mischung A (0,04% Trifluoressigsäure in Wasser) eluiert.
Diese Analyse zeigt, daß die Fraktion PT das toxische Protein PT nicht enthält. Die Fraktion F 1 ist von größerer Komplexität und enthält zwei hauptsächliche Polypeptide
Charakterisierung der in den Fraktionen PT und F1 vorliegenden Proteine
Die Massenbestimmungen wurden mittels Elektrospray-Massenspektrometrie (ES-MS) durchgeführt. Die mittleren Massen wurden ausgehend von 2 Untersuchungen berechnet und sind 3741,1 Da im Fall der Fraktion PT und 3736 bis 3941 Da für die Polypeptide der Fraktion F1.
Die Zahl von freien und durch Disulfidbrücken verbundenen Cysteinreste wurde durch Alkylierung des Proteins mit Iodacetamid, vor und nach Reduktion, und Vergleich der Retentionszeit bei der RP-HPLC und der Massen im ES-MS der alkylyierten Proteine mit dem nativen Protein bestimmt.
Das nichtreduzierte alkylierte Protein zeigte eine zu dem nativen Protein identische Retentionszeit und Masse. Im Gegenzug zeigte das reduzierte und nachfolgend alkylierte Protein eine Retentionszeit, die deutlich von der für das native Protein beobachteten verschieden war (30 min an Stelle von 42 min), und eine Masse von 4089,0 Da.
Es erscheint daher, daß dieses Protein 6 Cysteinreste enthält, die alle über drei Disulfidbrücken verbunden sind.
Vollständige Sequenz des Proteins PT
Die vollständige Sequenz des Proteins PT wurde bestimmt. Die auf der Basis von 37 Resten berechnete Masse ist 3741,4 Da, was im Rahmen des Meßfehlers identisch mit der mittels Massenspektrometrie ermittelten Masse (3471,1 Da) für das native Protein ist. Der für das mit Iodacetamid alkylierte Protein berechnete Wert (4090 Da) entspricht gleichermaßen dem experimentell ermittelten (4089,9 Da). Diese Ergebnisse zeigen die Abwesenheit von posttrans formellen Modifikationen (Glycosylyierungen, Phosphorylyierungen ...) des Proteins.
Die Sequenz des Proteins PT zeigt eine sehr starke Homologie mit der von Erbsenalbumin PA1b [HIGGINS et al., J. Biol. Chem., 261(24), Seiten 11124-11130, (1996)]. Die beiden Sequenzen unterscheiden sich nicht, außer durch Ersatz eines Valinrests an Position 29 des Proteins PT durch ein Isoleucin in PA1b. Eine starke Ähnlichkeit (62% Identität, 89% Homologie, bestimmt mit Hilfe der Software MAC MOLLY unter Verwendung der Matrize BLOSUM62 wird ebenso zwischen dem Protein PT und dem Soja-Leginsulin [WATANABE et al., Eur. J. Biochem., 15, Seiten 224:1-167-72, (1994) beobachtet. Insbesondere die sechs Cysteinreste, die eine wesentliche Rolle bei der Struktur der Proteine spielen, besetzen konservierte Positionen.
Der Vergleich der 3 Sequenzen ist in 7 dargestellt.
Diese Ergebnisse erlauben den Schluß, daß das für die Resistenz von Erbsen gegen Getreidekäfer verantwortliche Protein ähnlich dem von HIGGINS beschriebenen Protein PA1b ist. Dieses Protein wird in der Form eines Preproteins von 130 Resten gebildet (PA1), das eine posttransformale Reifung durchmacht, wobei das Protein PA1b als ein Protein mit 53 Resten freigesetzt wird, bezeichnet als PAIa [HIGGINS et al., J. Biol. Chem., 261(24), Seiten 11124-11130, (1986)].
Die Sequenzierung der 10 ersten N-terminalen Reste von jedem toxischen Polypeptid der Fraktion F 1 wurde ebenso durchgeführt. Die erhaltenen Sequenzen sind denen des N-terminalen Endes des Proteins PT identisch. Wie die mittels ES-MS bestimmten Massen sehr nahe an der von PT sind, erscheint, daß diese Polypeptide Isoformen von PT darstellen.
Beispiel 3: Aktivität und Stabilität der aus Erbsen extrahierten entomotoxischen Proteine
Aktivität:
Die entomotoxische Aktivität der Polypeptide der Fraktion PT oder der Fraktion F1 wurde, wie oben in Beispiel 1 beschrieben, bestimmt; bei einer Konzentration von 1% in Weizenmehl (3mmol/kg) besitzen diese Polypeptide für Getreidekäfer eine reine Erbsenmehl äquivalente Toxizität. Eine Konzentration von 60 μmol/kg ist ausreichend, um einen Befall durch Getreidekäfer zu verhindern.
Stabilität:
Die Polypeptide der Fraktion Pt oder der Fraktion F 1, extrahiert aus über mehrere Jahre gelagerten trockenen Körnern, behalten ihre entomotoxische Aktivität. Außerdem wird diese Aktivität durch ein Erhitzen auf 100°C nicht beeinflußt.
Toxizität für verschieden Insekten:
Die Toxizität des Proteins PT für die Mehlmotte Ephestia kuehniellea (Lepidoptera) und für die Blattlaus Acyrthosiphon pisum (Homoptera) wurde ebenso untersucht.
Die Untersuchungen an der Mehlmotte wurden an den Larven des ersten und zweiten Stadiums von Ephestia kuehniellea durchgeführt, die von Kügelchen von Weizenmehl ernährt wurden, die die verschiedenen Konzentrationen des Proteins PT enthielten (in mmol pro kg Weizenmehl). Die Ergebnisse sind in 8 dargestellt.
(❍ = 0 Tage Überleben;
= 4 Tage Überleben; ☐ = 10 Tage Überleben).
Diese Ergebnisse zeigen, daß dieses Protein, schon ab einer Konzentration von 0,25 mmol/kg sehr toxisch ist.
Die Blattlaus Acyrthosiphon pisum (Homoptera) wurde auf künstlichem Milieu ernährt, welches verschiedene Konzentrationen des Proteins PT enthielt:
(⎕ = 3,3 μM;
= 17 μM; ♦ = 46 μM;
❍ = 84 μM;
= 100 μM.
Die Ergebnisse, die in 9 dargestellt sind, zeigen, daß eine bedeutende Sterblichkeit schon ab einer Konzentration von 46 μMol erscheint, wobei die Sterblichkeit bei 100 μMol vollständig ist.

Claims

Verwendung eines Polypeptids als Insektizid, das eine der nachfolgenden allgemeinen Formel (I) entsprechende Sequenz umfaßt: X₁CX₂CX₃CX₄CX₅CX₆CX₇ (I)worin: C einen Cysteinrest darstellt, X₁ die Sequenz y₁y₂ darstellt, worin y₁ und y₂ jeweils eine Aminosäure darstellen, ausgewählt aus Alanin, Serin, Glycin und Threonin, oder y₁ eine aus Alanin, Serin, Glycin und Threonin ausgewählte Aminosäure darstellt und y₂ Glutaminsäure oder Aspartamsäure; X₂ die Sequenz y₃y₄y₅ darstellt, worin y₃ Glutamin oder Asparagin darstellt und y₄ und y₅ jeweils eine aus Alanin, Serin, Glycin, Threonin, Valin, Leucin, Isoleucin und Methionin ausgewählte Aminosäure; X₃ die Sequenz y₆y₇y₈y₉y₁₀y₁₁y₁₂ darstellt, worin y₆ eine aus Alanin, Serin, Glycin und Threonin ausgewählte Aminosäure darstellt, y₇, y₁₁ und y₁ ₂ jeweils Prolin, y₈ eine aus Phenylalanin, Tryptophan und Thyrosin ausgewählte Aminosäure, y₉ Aspartamsäure oder Glutaminsäure, y₁₀ eine aus Valin, Leucin, Isoleucin und Methionin ausgewählte Aminosäure; X₄ die Sequenz y₁₃y₁₄y₁₅y₁₆ darstellt, worin y₁ ₃, y₁₄, y₁₅, y₁₆ jeweils eine aus Alanin, Serin, Glycin und Threonin ausgewählte Aminosäure darstellen, oder y₁₄ eine aus Alanin, Serin, Glycin und Threonin ausgewählte Aminosäure, y₁ ₃ und y₁₅ jeweils eine basische Aminosäure und y₁₆ Aspartamsäure oder Glutaminsäure; X₅ eine basische Aminosäure darstellt; X₆ der Sequenz y₁₇y₁₈y₁₉y₂₀y₂₁y₂₂y₂₃y₂₄y₂₅ entspricht, worin y₁₇, y₁ ₉, y₂₁ und y₂₃ jeweils eine aus Valin, Leucin, Isoleucin und Methionin ausgewählte Aminosäure darstellen, y₁₈ Prolin, y₂ ₀ und y₂₄ jeweils eine aus Alanin, Serin, Glycin und Threonin ausgewählte Aminosäure, y₂₂ eine aus Valin, Leucin, Isoleucin, Methionin, Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin ausgewählte Aminosäure und y₂₅ eine aus Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin ausgewählte Aminosäure; X₇ die Sequenz y₂₆y₂₇y₂₈y₂₉y₃₀ darstellt, worin y₂₆ eine basische Aminosäure darstellt oder eine aus Valin, Leucin, Isoleucin und Methionin ausgewählte Aminosäure, y₂₇ Asparagin oder Glutamin oder eine basische Aminosäure, y₂₈ Prolin und y₂ ₉ und y₃₀ jeweils eine aus Alanin, Serin, Glycin und Threonin ausgewählte Aminosäure.
Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Polypeptid eine wenigstens 60%ige Identität mit dem Erbsenalbumin PA1b zeigt.
Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Polypeptid eine oben definierte Sequenz der Formel (I) umfaßt, worin: y₁ Alanin darstellt, y₃ Asparagin, y₄ Glycin, y₆ Serin, y₇, y₁₁ und y₁₂ jeweils Prolin, y₈ Phenylalanin, y₉ Glutaminsäure, x₅ Arginin, y₁₈ Prolin, y₂₀ Glycin, y₂₁ Leucin, y₂₄ Glycin, y₂ ₅ Tyrosin, y₂₈ Prolin, y₃ ₀ Glycin, und: y₂ Serin darstellt, y₅ Valin, y₁₀ Methionin, y₁ ₃ Glycin, y₁ ₄ Threonin, y₁₅ Serin, y₁₆ Alanin, y₁₇ Isoleucin, y₁ ₉ Valin, y₂₂ Valin, y₂ ₃ Isoleucin oder Valin, y₂₆ Arginin, y₂₇ Asparagin, y₂ ₉ Serin, oder: y₂ Aspartamsäure darstellt, y₅ Alanin, y₁₀ Valin, y₁ ₃ Arginin, y₁ ₄ Serin, y₁₅ Arginin, y₁ ₆ Aspartamsäure, y₁₇ Valin, y₁ ₉ Isoleucin, y₂₂ Phenylalanin, y₂ ₃ Valin, y₂ ₆ Isoleucin, y₂₇ Histidin, y₂₈ Prolin und y₂ ₉ Threonin.
Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Polypeptid aus der durch die Albumine PA1b und den Leginsulinen gebildete Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Polypeptid zum Schutz von Getreidekörnern oder von diesen abgeleiteten Produkten gegen Schadinsekten verwendet wird.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Polypeptid zum Schutz von Pflanzen gegen Getreidekörnerschadinsekten verwendet wird.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Polypeptid in einer Konzentration von 10 μmol/kg bis 100 mmol/kg verwendet wird.
Verwendung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Polypeptid in einer Konzentration von 50 μmol/kg bis 10 mmol/kg verwendet wird.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Behandlung des zu schützenden Produkts mit einer das genannte Polypeptid umfassenden Zubereitung umfaßt.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Herstellung einer transgenen Pflanze umfaßt, welche in wenigstens einem, für das genannte Polypeptid kodierenden Gen transformiert wurde, und dem Exprimieren von letzterem in wenigstens einer der Gewebe oder Organe derselben.