JP3410734B2 - 殺生物性蛋白質 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は殺生物性蛋白質（biocidal protein）、その
製造方法及び使用方法及びこれをコードするDNA配列に
関する。特に、本発明はミラビリス（Mirabilis）から
単離された抗菌性蛋白質に関する。
製造方法及び使用方法及びこれをコードするDNA配列に
関する。特に、本発明はミラビリス（Mirabilis）から
単離された抗菌性蛋白質に関する。
ミラビリスは約60の熱帯アメリカ種（tropical Ameri
can species）からなり、その多数のものが庭園植物と
してのその鑑賞的価値のために栽培されている。ミラビ
リス ヤラパ（Mirabilis jalapa）はオシロイバナ
（“four o'clock"又は“marvel of Peru"）として一般
的に知られており、白色，黄色又は赤色の花を有する。
M.ヤラパの塊根（tuberous root）はヤラッパ（jalap）
の代替品として使用される瀉下剤（purgative drug）の
供給源である。
can species）からなり、その多数のものが庭園植物と
してのその鑑賞的価値のために栽培されている。ミラビ
リス ヤラパ（Mirabilis jalapa）はオシロイバナ
（“four o'clock"又は“marvel of Peru"）として一般
的に知られており、白色，黄色又は赤色の花を有する。
M.ヤラパの塊根（tuberous root）はヤラッパ（jalap）
の代替品として使用される瀉下剤（purgative drug）の
供給源である。
植物は、通常、菌類生物（fungal organism）に著し
く富む基質（substrate）上で成長するが、感染した状
態にあることが希にある。潜在的な侵入物（potential
invader）を排斥するために、植物はその構成要素とし
て又は誘導可能な形で、広い範囲の抗菌性化合物を産生
する。これらの抗菌性化合物の中で最も研究されている
ものはフィトアレキシン、即ち、適当な防御関連信号分
子（defencerelated signal molecule）の知覚（percep
tion）に基づいて特異的に合成される、広範囲の抗菌活
性を有する二次代謝産物（secondary metabolite）であ
る。フィトアレキシンの産生は、フィトアレキシン生合
成経路の酵素をコードする一連の遺伝子の転写活性化
（transcriptional activation）に基づいている。しか
しながら、最近の10年間に幾つかの植物蛋白質は植物病
原性菌類（phytopathogenic fungi）の制御においてよ
り直接的な役割を果たし得ることが次第に明らかになっ
た。現在では、キチナーゼ、ベーター−1,3−グルカナ
ーゼ、リボソーム−不活性化蛋白質、チオニン（thioni
n）、キチン結合レクチン（chitin−binding lectin）
及びゼアマチン（zeamatin）を包含する、抗菌性を有す
る種々の蛋白質が確認されている。
く富む基質（substrate）上で成長するが、感染した状
態にあることが希にある。潜在的な侵入物（potential
invader）を排斥するために、植物はその構成要素とし
て又は誘導可能な形で、広い範囲の抗菌性化合物を産生
する。これらの抗菌性化合物の中で最も研究されている
ものはフィトアレキシン、即ち、適当な防御関連信号分
子（defencerelated signal molecule）の知覚（percep
tion）に基づいて特異的に合成される、広範囲の抗菌活
性を有する二次代謝産物（secondary metabolite）であ
る。フィトアレキシンの産生は、フィトアレキシン生合
成経路の酵素をコードする一連の遺伝子の転写活性化
（transcriptional activation）に基づいている。しか
しながら、最近の10年間に幾つかの植物蛋白質は植物病
原性菌類（phytopathogenic fungi）の制御においてよ
り直接的な役割を果たし得ることが次第に明らかになっ
た。現在では、キチナーゼ、ベーター−1,3−グルカナ
ーゼ、リボソーム−不活性化蛋白質、チオニン（thioni
n）、キチン結合レクチン（chitin−binding lectin）
及びゼアマチン（zeamatin）を包含する、抗菌性を有す
る種々の蛋白質が確認されている。
日本たばこ産業株式会社（Japan Tobacco Inc）の研
究者は以前にミラビリス ヤラパ懸濁細胞（最初、葉か
ら誘導されたカルス）から及び根及び葉の組織から抗ウ
イルス性蛋白質を抽出している（Tsutomu Ikeda等;198
7;Plant Cell Reports,6,216−218）。この“ミラビリ
ス抗植物ウイルス蛋白質”（“Mirabilis anti−plant
viral protein"）（MAP）は24KDaの分子量を有する。MA
Pのアミノ酸配列は決定されており、250アミノ酸からな
る。759塩基対の合成MAP遺伝子をベクター中にクローン
し、大腸菌（Escherichia coli）中で発現させている
（Noriyuki Habuka等;1989;Journal of Biological Che
mistry,264（12）,6629−6637）。下記の特許が許可さ
れている:J88061317及びUS4701522によりミラビリスMAP
蛋白質抽出物が保護されている;J87027797によりカルス
を培養することによるMAPの製造が保護されている。下
記の特許出願も行われている：カルス細胞をクローニン
グすることにより得られるMAPについてのJ63123386;E c
oli形質転換細胞を培養することによる抗ウイルス性蛋
白質の製造についてのJ02186988;ミラビリスからの抗ウ
イルス性ペプチド（NOG−22）についてのJ01294694;同
様の合成ペプチド（NOG−53）についてのJ01294693及び
抗ウイルス性蛋白質をコードする遺伝子についてのEP41
4134。更に日本たばこ産業株式会社はブーゲンビレア
（Bougainvillea）（ミラビリスと同一の密接に関連す
る科）から抽出された２種の抗ウイルス性蛋白質を保護
するための特許出願を行っている:BAP−１は33kDaの分
子量を有しており（J01272598）、BAP−２は約30kDaの
分子量を有している（J01272599）。
究者は以前にミラビリス ヤラパ懸濁細胞（最初、葉か
ら誘導されたカルス）から及び根及び葉の組織から抗ウ
イルス性蛋白質を抽出している（Tsutomu Ikeda等;198
7;Plant Cell Reports,6,216−218）。この“ミラビリ
ス抗植物ウイルス蛋白質”（“Mirabilis anti−plant
viral protein"）（MAP）は24KDaの分子量を有する。MA
Pのアミノ酸配列は決定されており、250アミノ酸からな
る。759塩基対の合成MAP遺伝子をベクター中にクローン
し、大腸菌（Escherichia coli）中で発現させている
（Noriyuki Habuka等;1989;Journal of Biological Che
mistry,264（12）,6629−6637）。下記の特許が許可さ
れている:J88061317及びUS4701522によりミラビリスMAP
蛋白質抽出物が保護されている;J87027797によりカルス
を培養することによるMAPの製造が保護されている。下
記の特許出願も行われている：カルス細胞をクローニン
グすることにより得られるMAPについてのJ63123386;E c
oli形質転換細胞を培養することによる抗ウイルス性蛋
白質の製造についてのJ02186988;ミラビリスからの抗ウ
イルス性ペプチド（NOG−22）についてのJ01294694;同
様の合成ペプチド（NOG−53）についてのJ01294693及び
抗ウイルス性蛋白質をコードする遺伝子についてのEP41
4134。更に日本たばこ産業株式会社はブーゲンビレア
（Bougainvillea）（ミラビリスと同一の密接に関連す
る科）から抽出された２種の抗ウイルス性蛋白質を保護
するための特許出願を行っている:BAP−１は33kDaの分
子量を有しており（J01272598）、BAP−２は約30kDaの
分子量を有している（J01272599）。
今般、本発明者は新規な種類の重要な抗菌性蛋白質を
精製した。
精製した。
本発明によれば、ミラビリスの種子から単離すること
ができる抗菌性蛋白質（antimicrobial protein）が提
供される。
ができる抗菌性蛋白質（antimicrobial protein）が提
供される。
別の要旨によれば、本発明は本発明による蛋白質をコ
ードするDNA配列を含有するベクターを包含する。このD
NAはコードされた（encoded）蛋白質の発現を可能にす
る生物学的な系にクローンするか又は形質転換し得る。
ードするDNA配列を含有するベクターを包含する。このD
NAはコードされた（encoded）蛋白質の発現を可能にす
る生物学的な系にクローンするか又は形質転換し得る。
本発明は、更に、本発明による抗菌性蛋白質をコード
する組換え体DNAを使用して形質転換した植物も包含す
る。
する組換え体DNAを使用して形質転換した植物も包含す
る。
本発明は、更に、菌類（fungi）又はバクテリア（bac
teria）を本発明による蛋白質に暴露することにより菌
類又はバクテリアを撲滅する方法も包含する。
teria）を本発明による蛋白質に暴露することにより菌
類又はバクテリアを撲滅する方法も包含する。
新規な種類の強力な（potent）抗菌性蛋白質をミラビ
リス ヤラパの種子から単離した。この種の蛋白質は以
下において、それぞれ、Mj−AMP1［ミラビリス ヤラパ
−抗菌性蛋白質１（Mirabilis jalapa−antimicrobial
protein 1）］及びMj−AMP2［ミラビリス ヤラパ−抗
菌性蛋白質２（Mirabilis jalapa−antimicrobial prot
ein 2）］と称する蛋白質因子（protein factor）を有
する。両者共、二量体状蛋白質である;Mj−AMP1は２個
の4kDaサブユニットからなり、Mj−AMP2は２個の3.5kDa
サブユニットからなる。その起源にかかわらず、これら
の蛋白質の一次構造（primary structure）は他の全て
の既知の植物蛋白質と異なり、無脊椎動物の毒液中に見
出だされる昆虫神経毒との相同性を示す。Mj−AMP1とMj
−AMP2のアミノ酸配列は決定されている。これらのアミ
ノ酸配列は標準ペプチドシンセサイザー（peptide synt
hesiser）を使用して蛋白質を製造することを可能にし
ている。
リス ヤラパの種子から単離した。この種の蛋白質は以
下において、それぞれ、Mj−AMP1［ミラビリス ヤラパ
−抗菌性蛋白質１（Mirabilis jalapa−antimicrobial
protein 1）］及びMj−AMP2［ミラビリス ヤラパ−抗
菌性蛋白質２（Mirabilis jalapa−antimicrobial prot
ein 2）］と称する蛋白質因子（protein factor）を有
する。両者共、二量体状蛋白質である;Mj−AMP1は２個
の4kDaサブユニットからなり、Mj−AMP2は２個の3.5kDa
サブユニットからなる。その起源にかかわらず、これら
の蛋白質の一次構造（primary structure）は他の全て
の既知の植物蛋白質と異なり、無脊椎動物の毒液中に見
出だされる昆虫神経毒との相同性を示す。Mj−AMP1とMj
−AMP2のアミノ酸配列は決定されている。これらのアミ
ノ酸配列は標準ペプチドシンセサイザー（peptide synt
hesiser）を使用して蛋白質を製造することを可能にし
ている。
Mj−AMP1とMj−AMP2をコードするcDNAを単離し、配列
決定を行った。このDNAは標準核酸シンセサイザーを使
用して製造することができ、或いは、適当なプローブ
（既知の配列から誘導）を使用して植物ゲノムから実際
のMj−AMP遺伝子と制御配列を単離し得る。ついでこの
遺伝物質を構造プロモーター（constitutive promote
r）又は誘導性プロモーター（inducible promoter）の
制御下での蛋白質の発現を可能にする生物学的系にクロ
ーンし得る。従って、蛋白質を適当な微生物又は培養細
胞（cultured cell）中で製造し、抽出しついで単離し
て使用し得る。適当な微生物としては大腸菌及びシュウ
ドモナス（Pseudomonas）が挙げられる。適当な細胞と
しては培養昆虫細胞及び培養哺乳動物細胞が挙げられ
る。このDNAを使用して既知の方法により任意の植物種
を形質転換し、その結果、抗菌性蛋白質をこの植物内で
発現させることができる。
決定を行った。このDNAは標準核酸シンセサイザーを使
用して製造することができ、或いは、適当なプローブ
（既知の配列から誘導）を使用して植物ゲノムから実際
のMj−AMP遺伝子と制御配列を単離し得る。ついでこの
遺伝物質を構造プロモーター（constitutive promote
r）又は誘導性プロモーター（inducible promoter）の
制御下での蛋白質の発現を可能にする生物学的系にクロ
ーンし得る。従って、蛋白質を適当な微生物又は培養細
胞（cultured cell）中で製造し、抽出しついで単離し
て使用し得る。適当な微生物としては大腸菌及びシュウ
ドモナス（Pseudomonas）が挙げられる。適当な細胞と
しては培養昆虫細胞及び培養哺乳動物細胞が挙げられ
る。このDNAを使用して既知の方法により任意の植物種
を形質転換し、その結果、抗菌性蛋白質をこの植物内で
発現させることができる。
本発明による植物細胞は、本発明による構築物（cons
truct）を使用して多数の既知の方法［アグロバクテリ
ウム（Agrobacterium）Tiプラスミド、エレクトロポレ
ーション（electroporation）、マイクロインジェクシ
ョン（microinjection）、マイクロプロジェクテイルガ
ン（microprojectile gun）等］により形質転換し得
る。ついで、適当な場合には、形質転換細胞を全植物
（whole plant）中で再生させ、この植物内に新規な核
物質をゲノム中に安定に組込むことができる。この方法
によりモノコット（monocot）及びジコット（dicot）植
物を得ることができるが、通常、後者の方が再生がより
容易である。
truct）を使用して多数の既知の方法［アグロバクテリ
ウム（Agrobacterium）Tiプラスミド、エレクトロポレ
ーション（electroporation）、マイクロインジェクシ
ョン（microinjection）、マイクロプロジェクテイルガ
ン（microprojectile gun）等］により形質転換し得
る。ついで、適当な場合には、形質転換細胞を全植物
（whole plant）中で再生させ、この植物内に新規な核
物質をゲノム中に安定に組込むことができる。この方法
によりモノコット（monocot）及びジコット（dicot）植
物を得ることができるが、通常、後者の方が再生がより
容易である。
本発明に従って遺伝的に修飾した（genetically modi
fied）植物の例としては次のものが挙げられる：トマ
ト、マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ及
びメロンのごとき果実；カノラ（canola）、ヒマワリ、
タバコ、テンサイ、小麦、大麦及び米のごとき小粒穀
類、トウモロコシ及び綿のごとき屋外作物（field cro
p）；及びニンジン、レタス、キャベツ及びタマネギの
ごとき野菜。
fied）植物の例としては次のものが挙げられる：トマ
ト、マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ及
びメロンのごとき果実；カノラ（canola）、ヒマワリ、
タバコ、テンサイ、小麦、大麦及び米のごとき小粒穀
類、トウモロコシ及び綿のごとき屋外作物（field cro
p）；及びニンジン、レタス、キャベツ及びタマネギの
ごとき野菜。
Mj−AMP蛋白質は広範囲の抗菌活性を示し、グラム陽
性バクテリアに対しても活性である。Mj−AMP蛋白質は
植物体部分に適用することにより殺菌剤又は抗生物質と
して使用し得る。その抗菌活性は塩依存性（salt−depe
ndent）であり、組成中に存在するイオンの種類と濃度
により変動し得る。特に、抗菌活性はカチオンの存在に
よって低下するようである。Mj−AMP蛋白質は植物体内
で発現させることにより菌類及びバクテリアを撲滅する
のにも使用し得る。
性バクテリアに対しても活性である。Mj−AMP蛋白質は
植物体部分に適用することにより殺菌剤又は抗生物質と
して使用し得る。その抗菌活性は塩依存性（salt−depe
ndent）であり、組成中に存在するイオンの種類と濃度
により変動し得る。特に、抗菌活性はカチオンの存在に
よって低下するようである。Mj−AMP蛋白質は植物体内
で発現させることにより菌類及びバクテリアを撲滅する
のにも使用し得る。
Mj−AMP蛋白質はミラビリス ヤラパ種子から単離
し、精製するか、その既知のアミノ酸配列から人工的に
合成するか又は組換え体DNAの発現により適当な微生物
内で製造し得る。この蛋白質はトランスジェニック植物
（transgenic plant）内でも発現させ得る。
し、精製するか、その既知のアミノ酸配列から人工的に
合成するか又は組換え体DNAの発現により適当な微生物
内で製造し得る。この蛋白質はトランスジェニック植物
（transgenic plant）内でも発現させ得る。
本発明は図面を参照することにより更に理解されるで
あろう： 図1Aは抗菌性蛋白質についてのゲル濾過クロマトグラ
ムとこれに付随する菌成長抑制率についてのグラフを示
す。
あろう： 図1Aは抗菌性蛋白質についてのゲル濾過クロマトグラ
ムとこれに付随する菌成長抑制率についてのグラフを示
す。
図1Bは抗菌性蛋白質についてのカチオン交換クロマト
グラムとこれに付随する菌成長抑制率についてのグラフ
を示す。
グラムとこれに付随する菌成長抑制率についてのグラフ
を示す。
図2Aは精製Mj−AMP1のHPLCプロフィールを示す。
図2Bは精製Mj−AMP2のHPLCプロフィールを示す。
図３は精製抗菌性蛋白質のSDS−PAGE分析を示す。
図4AはMj−AMP1とMj−AMP2の完全アミノ酸配列を示
す；差異は矢印によって示されている。
す；差異は矢印によって示されている。
図4Bは神経毒のアミノ酸配列と並列させた、Mj−AMP1
とMj−AMP2のアミノ酸配列を示す。
とMj−AMP2のアミノ酸配列を示す。
図５は抗菌性蛋白質の濃度を変化させて測定した、時
間依存性成長抑制率曲線を示す。
間依存性成長抑制率曲線を示す。
図６はクローンMJ1（Mj−AMP1）のヌクレオチド配列
と推定アミノ酸配列（deduced amono acid sequence）
を示す。
と推定アミノ酸配列（deduced amono acid sequence）
を示す。
図７はクローンMJ2（Mj−AMP2）のヌクレオチド配列
と推定アミノ酸配列を示す。
と推定アミノ酸配列を示す。
図８は発現ベクターpMDB1の構成（construction）を
示す。
示す。
図９はpBinRiの構成を示す。
図10は植物形質転換ベクターpMDB2の構成を示す。
図11はpVT0の構成を示す。
図12は植物形質転換ベクターpVT1の構成を示す。
図13は植物形質転換ベクターpVT2の構成を示す。
以下の実施例は本発明を例示するものである。
実施例 １
ミラビリス ヤラパ種子からの塩基性熱安定性蛋白質
の抽出。
の抽出。
1kgのＭヤラパ種子（英国、カンンブリア、ウルバー
ストン、Chiltern Seedsから購入）をコーヒーミル中で
粉砕し、得られた粗い粉末を、10mMのNaH2PO4、15mMのN
a2HPO4、100mMのKCl、2mMのEDTA、2mMのチオ尿素、1mM
のPMSF及び1mg/のロイペプチンを含有する氷冷抽出緩
衝液（extraction buffer）２を使用して４℃で２時
間抽出した。ホモジネート（homogenate）をチーズクロ
ス（cheesecloth）を通して絞り、遠心分離により清澄
化した（5000 x gで５分間）。上澄液に固体硫酸アンモ
ニウムを添加して相対飽和度（relative saturation）
を35％とし、室温で１時間放置後に生成した沈殿を遠心
分離により除去した（5000 x gで10分間）。上澄液の硫
酸アンモニウムの相対飽和度を65％に調節しついで室温
で一夜放置して生成した沈殿を遠心分離により捕集した
（5000 x gで30分間）。ペレットを10mM燐酸ナトリウム
緩衝液（pH6）に再度溶解させた後、溶液を75℃で10分
間加熱した。凝集した不溶性物質を遠心分離の後に排棄
し（5000 x gで20分間）、上澄液を2000Daの分子量カッ
トオッフ（molecular weight cut off）を有するベンゾ
イル化セルロースチューブ（benzoylated cellulose tu
bing）（Sigma）を使用して蒸留水に対して長時間（ext
ensively）透析した。透析後、10倍に濃縮した緩衝液
（ten−fold concentratred buffer）を添加することに
より溶液を50mM Tris−HCl（pH9）に調整し、ついで、5
0mM Tris−HCl（pH9）と平衡なＱ−セファロースファス
トフロー（Ｑ−Sepharose Fast Flow）カラム（Pharmac
ia）（12x 5cm）上を通過させた。75％の相対飽和度に
なるまで硫酸アンモニウムを添加することにより非結合
フラクション（unbound fraction）中の蛋白質を沈殿さ
せた。沈殿を遠心分離により捕集し（5000 x gで20分
間）、ペレットを15mの燐酸塩緩衝食塩水（phosphate
buffered saline）（PBS）に再溶解させた。この材料
によりＭヤラパ種子の塩基性熱安定性蛋白質フラクショ
ンが提供され、これをＭヤラパ抗菌性蛋白質の単離と精
製のための出発原料として使用した。
ストン、Chiltern Seedsから購入）をコーヒーミル中で
粉砕し、得られた粗い粉末を、10mMのNaH2PO4、15mMのN
a2HPO4、100mMのKCl、2mMのEDTA、2mMのチオ尿素、1mM
のPMSF及び1mg/のロイペプチンを含有する氷冷抽出緩
衝液（extraction buffer）２を使用して４℃で２時
間抽出した。ホモジネート（homogenate）をチーズクロ
ス（cheesecloth）を通して絞り、遠心分離により清澄
化した（5000 x gで５分間）。上澄液に固体硫酸アンモ
ニウムを添加して相対飽和度（relative saturation）
を35％とし、室温で１時間放置後に生成した沈殿を遠心
分離により除去した（5000 x gで10分間）。上澄液の硫
酸アンモニウムの相対飽和度を65％に調節しついで室温
で一夜放置して生成した沈殿を遠心分離により捕集した
（5000 x gで30分間）。ペレットを10mM燐酸ナトリウム
緩衝液（pH6）に再度溶解させた後、溶液を75℃で10分
間加熱した。凝集した不溶性物質を遠心分離の後に排棄
し（5000 x gで20分間）、上澄液を2000Daの分子量カッ
トオッフ（molecular weight cut off）を有するベンゾ
イル化セルロースチューブ（benzoylated cellulose tu
bing）（Sigma）を使用して蒸留水に対して長時間（ext
ensively）透析した。透析後、10倍に濃縮した緩衝液
（ten−fold concentratred buffer）を添加することに
より溶液を50mM Tris−HCl（pH9）に調整し、ついで、5
0mM Tris−HCl（pH9）と平衡なＱ−セファロースファス
トフロー（Ｑ−Sepharose Fast Flow）カラム（Pharmac
ia）（12x 5cm）上を通過させた。75％の相対飽和度に
なるまで硫酸アンモニウムを添加することにより非結合
フラクション（unbound fraction）中の蛋白質を沈殿さ
せた。沈殿を遠心分離により捕集し（5000 x gで20分
間）、ペレットを15mの燐酸塩緩衝食塩水（phosphate
buffered saline）（PBS）に再溶解させた。この材料
によりＭヤラパ種子の塩基性熱安定性蛋白質フラクショ
ンが提供され、これをＭヤラパ抗菌性蛋白質の単離と精
製のための出発原料として使用した。
実施例 ２
抗菌活性の評価。
抗菌活性は従来の文献（Broekaert,WF等;1990;FEMS M
icrobiol Lett,69,55−60）に記載されているごとき顕
微分光分析（microspectrophotometry）により測定し
た。試験は、慣用的に、20μの（フィルター−殺菌）
試験溶液と、1/2濃度の（half strength）馬鈴薯デキス
トロースブロス（Potato Dexitrose Broth）（Difco）
中の菌胞子懸濁液（胞子数2 x104/m）80μを使用し
て行った。対照ミクロ培養液（control microculture）
は20μの（殺菌）蒸留水と80μの菌胞子懸濁液を含
有していた。特に説明がない限り、供試微生物はフサリ
ウム クルモルム（Fusarium culmorum）であり、イン
キュベーションは25℃で48時間行った。生長抑制率
（％）は595nmにおける対照ミクロ培養液の修正吸光度
（corrected absorbance）に対する、対照ミクロ培養液
の修正吸光度から供試ミクロ培養液の修正吸光度を差し
引いたものの比の100倍と定義される。修正吸光度値は4
8時間後に測定した培養液の595nmでの吸光度から、30分
後に測定した595nmでの吸光度を差し引いたものに等し
い。10％より低い生長抑制率の値はクロマトグラムに示
されない。
icrobiol Lett,69,55−60）に記載されているごとき顕
微分光分析（microspectrophotometry）により測定し
た。試験は、慣用的に、20μの（フィルター−殺菌）
試験溶液と、1/2濃度の（half strength）馬鈴薯デキス
トロースブロス（Potato Dexitrose Broth）（Difco）
中の菌胞子懸濁液（胞子数2 x104/m）80μを使用し
て行った。対照ミクロ培養液（control microculture）
は20μの（殺菌）蒸留水と80μの菌胞子懸濁液を含
有していた。特に説明がない限り、供試微生物はフサリ
ウム クルモルム（Fusarium culmorum）であり、イン
キュベーションは25℃で48時間行った。生長抑制率
（％）は595nmにおける対照ミクロ培養液の修正吸光度
（corrected absorbance）に対する、対照ミクロ培養液
の修正吸光度から供試ミクロ培養液の修正吸光度を差し
引いたものの比の100倍と定義される。修正吸光度値は4
8時間後に測定した培養液の595nmでの吸光度から、30分
後に測定した595nmでの吸光度を差し引いたものに等し
い。10％より低い生長抑制率の値はクロマトグラムに示
されない。
実施例 ３
Ｍヤラパ種子からの抗菌性蛋白質の精製。
Ｍヤラパ抗菌性蛋白質の単離のための出発原料とし
て、成熟した種子から抽出した塩基性熱安定性蛋白質フ
ラクションを使用した。図1Aには抗菌性蛋白質をゲル濾
過クロマトグラフィーにより精製した結果が示されてい
る。1mのフラクションを予めPBSで平衡化したスーパ
ーロース−12（Superose−12）カラム（50 x 1.6cm）上
に充填した。移動緩衝液（running buffer）はPBSであ
り、その流率は1m／分であった。溶出液を280nmでの
吸光度について監視し、2.5mフラクションを捕集し、
その２μを実施例２で記載した顕微分光分析による抗
菌活性の評価に使用した（その結果は図1Aの上方パネル
に示されている）。分画の際に、混合物は３個のピーク
に分離し（resolve）、それによって、抗菌活性は最も
遅延したピーク（most retarded peak）と共に共溶離
（coelute）した。抗菌活性を含有するフラクション
（上記した最も遅延したピークからの材料）を集め、50
mMのNa−MES（pH5）に対して透析しついでカチオン交換
クロマトグラフィーにかけた。３つの平行的なゲル濾過
クロマトグラフィー操作からのものを一緒にした活性フ
ラクションを,50mMのNa−MES（pH5）で平衡化したＳ−
セファロース高性能カラム（Ｓ−Sepharose High Perfo
rmance column）（10 x 1.6cm）上に充填した。カラム
の溶離は全体で450mのNa−MES（pH5）を使用しかつNa
Clの濃度を0mMから150mMまで直線的な勾配で変動させ
て、3m／分の速度で行った。溶出液は280nmでの吸光
度を測定することにより蛋白質について監視し（その結
果は図1Bの下方パネルに示されている）、15mのフラ
クションを捕集し、その２μを顕微分光分析による抗
菌活性評価試験で試験した（その結果は図1Bの上方パネ
ルに示されている）。非結合フラクション（unbound fr
action）では抗菌活性は認められなかった。NaClの濃度
を直線的な勾配で変動させることにより抗菌活性を有す
る２種の因子（factor）が分離された。Mj−AMP1［ミラ
ビリス ヤラパ−抗菌性蛋白質１（Mirabilis jalapa−
antimicrobial protein 1）］と称される第１の因子は5
0mM付近のNaCl濃度で主ピークとして溶離され、これに
対して、同様にMj−AMP2と称される第２の因子は100mM
のNaCl濃度で溶離された。
て、成熟した種子から抽出した塩基性熱安定性蛋白質フ
ラクションを使用した。図1Aには抗菌性蛋白質をゲル濾
過クロマトグラフィーにより精製した結果が示されてい
る。1mのフラクションを予めPBSで平衡化したスーパ
ーロース−12（Superose−12）カラム（50 x 1.6cm）上
に充填した。移動緩衝液（running buffer）はPBSであ
り、その流率は1m／分であった。溶出液を280nmでの
吸光度について監視し、2.5mフラクションを捕集し、
その２μを実施例２で記載した顕微分光分析による抗
菌活性の評価に使用した（その結果は図1Aの上方パネル
に示されている）。分画の際に、混合物は３個のピーク
に分離し（resolve）、それによって、抗菌活性は最も
遅延したピーク（most retarded peak）と共に共溶離
（coelute）した。抗菌活性を含有するフラクション
（上記した最も遅延したピークからの材料）を集め、50
mMのNa−MES（pH5）に対して透析しついでカチオン交換
クロマトグラフィーにかけた。３つの平行的なゲル濾過
クロマトグラフィー操作からのものを一緒にした活性フ
ラクションを,50mMのNa−MES（pH5）で平衡化したＳ−
セファロース高性能カラム（Ｓ−Sepharose High Perfo
rmance column）（10 x 1.6cm）上に充填した。カラム
の溶離は全体で450mのNa−MES（pH5）を使用しかつNa
Clの濃度を0mMから150mMまで直線的な勾配で変動させ
て、3m／分の速度で行った。溶出液は280nmでの吸光
度を測定することにより蛋白質について監視し（その結
果は図1Bの下方パネルに示されている）、15mのフラ
クションを捕集し、その２μを顕微分光分析による抗
菌活性評価試験で試験した（その結果は図1Bの上方パネ
ルに示されている）。非結合フラクション（unbound fr
action）では抗菌活性は認められなかった。NaClの濃度
を直線的な勾配で変動させることにより抗菌活性を有す
る２種の因子（factor）が分離された。Mj−AMP1［ミラ
ビリス ヤラパ−抗菌性蛋白質１（Mirabilis jalapa−
antimicrobial protein 1）］と称される第１の因子は5
0mM付近のNaCl濃度で主ピークとして溶離され、これに
対して、同様にMj−AMP2と称される第２の因子は100mM
のNaCl濃度で溶離された。
単離した抗菌活性因子の純度を逆相クロマトグラフィ
ーにより確認した。200μｇの量のMj−AMP1及び200μｇ
の量のMj−AMP2を0.1％TFAで平衡化したPep−Ｓ（多孔
質シリカC2/C18）カラム（2.5 x 0.4cm）（Pharmacia）
上に充填することにより、精製Mj−AMPのHPLCプロフィ
ールを得た。カラムの溶離は1m／分の速度でかつ下記
の濃度勾配で行った（溶剤Ｂは0.1％TFAを含有するメタ
ノールである）:0−１分、B 0％;1−３分、B 0−30％;3
−23分、B 30−80％;23−25分、B 80−100％。溶出液は
280nmでの吸光度を測定することにより蛋白質について
監視した。溶出液の1mのフラクションを捕集し、凍結
乾燥し、最後に100μの蒸留水に溶解させた；その20
μを顕微分光分析による抗菌活性評価試験で使用し
た。クロマトグラフィーはウオータース（Waters）600H
PLCステーション上で行った。
ーにより確認した。200μｇの量のMj−AMP1及び200μｇ
の量のMj−AMP2を0.1％TFAで平衡化したPep−Ｓ（多孔
質シリカC2/C18）カラム（2.5 x 0.4cm）（Pharmacia）
上に充填することにより、精製Mj−AMPのHPLCプロフィ
ールを得た。カラムの溶離は1m／分の速度でかつ下記
の濃度勾配で行った（溶剤Ｂは0.1％TFAを含有するメタ
ノールである）:0−１分、B 0％;1−３分、B 0−30％;3
−23分、B 30−80％;23−25分、B 80−100％。溶出液は
280nmでの吸光度を測定することにより蛋白質について
監視した。溶出液の1mのフラクションを捕集し、凍結
乾燥し、最後に100μの蒸留水に溶解させた；その20
μを顕微分光分析による抗菌活性評価試験で使用し
た。クロマトグラフィーはウオータース（Waters）600H
PLCステーション上で行った。
図2A及び図2Bに、それぞれ、精製Mj−AMP1及びMj−AM
P2のHPLCプロフィールが示されている。下方パネルには
280nmでの吸光度を測定することによる溶出液の蛋白質
についての監視結果が示されている。顕微分光分析によ
る抗菌活性評価の結果は上方パネルに示されている。Mj
−AMP1及びMj−AMP2の両者から、抗菌活性と共に正確に
共溶離される、単一の、十分に分離された（resolved）
主ピークが得られた。
P2のHPLCプロフィールが示されている。下方パネルには
280nmでの吸光度を測定することによる溶出液の蛋白質
についての監視結果が示されている。顕微分光分析によ
る抗菌活性評価の結果は上方パネルに示されている。Mj
−AMP1及びMj−AMP2の両者から、抗菌活性と共に正確に
共溶離される、単一の、十分に分離された（resolved）
主ピークが得られた。
実施例 ４
精製抗菌性蛋白質の分子構造。
更に、Mj−AMPsの分子構造を分析した。ファストシス
テム（PhastSystem）（Pharmacia）電気泳動装置を使用
して、プレキャストした市販のゲル［ファストゲル ハ
イ デンシテイ（PhastGel High Density）、Pharmacia
製］上で電気泳動を行った。試料緩衝液（sample buffe
r）は200mMのTris−HCl（pH8.3）、１％（w/v）のSDS、
1mMのEDTA、0.005％のブロムフェノールブルー及び、特
に説明のない限り、１％（w/v）のジチオトレイトール
（DTT）を含有していた。ゲル中の蛋白質の銀染色（sil
ver staining）をファストシステム（スエーデン、ウプ
サラ（Uppsala）、Pharmcia LKB Biotechnology）の開
発技術ファイル（Development Technique File）No.210
に従って行い、ブロット（blot）の拡散ブロッテイング
（diffusion blotting）とその後の銀染色とをファスト
システムの開発技術ファイルNo.222に記載されるごとく
行った。
テム（PhastSystem）（Pharmacia）電気泳動装置を使用
して、プレキャストした市販のゲル［ファストゲル ハ
イ デンシテイ（PhastGel High Density）、Pharmacia
製］上で電気泳動を行った。試料緩衝液（sample buffe
r）は200mMのTris−HCl（pH8.3）、１％（w/v）のSDS、
1mMのEDTA、0.005％のブロムフェノールブルー及び、特
に説明のない限り、１％（w/v）のジチオトレイトール
（DTT）を含有していた。ゲル中の蛋白質の銀染色（sil
ver staining）をファストシステム（スエーデン、ウプ
サラ（Uppsala）、Pharmcia LKB Biotechnology）の開
発技術ファイル（Development Technique File）No.210
に従って行い、ブロット（blot）の拡散ブロッテイング
（diffusion blotting）とその後の銀染色とをファスト
システムの開発技術ファイルNo.222に記載されるごとく
行った。
非還元（unreduced）Mj−AMPsのドデシル硫酸ナトリ
ウムポリアクリルアミドゲル電気泳動は蛋白質の存在を
示さなかった。しかしながら、上記のゲルからニトロセ
ルロースブロットを調製した場合には、Mj−AMP1及びMj
−AMP2は、それぞれ、8kDa及び7kDaの分子量についての
単一バンドとしてブロット上に出現した。非還元蛋白質
試料（200ng）をDTTを含有していない試料緩衝液に溶解
し、ファストゲル ハイ デンシテイ（Pharmacia）上
で分離し、ニトロセルロース上でブロットしついでブロ
ット上で銀染色した。ミオグロビンフラグメントを分子
量マーカー（molecular weight marker）として使用し
た。還元されたMj−AMPsはゲル内でSDS−PAGE上で直接
的に染色する（stain）ことができ、むしろ、３〜4kDa
の見掛分子量帯域に拡散バンド（diffuse band）を示
す。蛋白質試料（200ng）をDTTを含有する試料緩衝液中
で還元し、ファストゲル ハイ デンシテイ上で分離
し、ついでゲル中で銀染色した。図３は精製抗菌性蛋白
質のSDS−PAGE分析の結果を示している。図３のパネル
Ａは非還元蛋白質試料：レイン（lane）１、Mj−AMP2;
レイン２、Mj−AMP1;レインＲ、パネルＢの右側にkDaで
示される分子量を有するミオグロビンフラグメントを示
す。図３のパネルＢは還元蛋白質試料：レイン１、Mj−
AMP2;レイン２、Mj−AMP1;レインＲ、分子量マーカーと
してのミオグロビンフラグメントを示す。
ウムポリアクリルアミドゲル電気泳動は蛋白質の存在を
示さなかった。しかしながら、上記のゲルからニトロセ
ルロースブロットを調製した場合には、Mj−AMP1及びMj
−AMP2は、それぞれ、8kDa及び7kDaの分子量についての
単一バンドとしてブロット上に出現した。非還元蛋白質
試料（200ng）をDTTを含有していない試料緩衝液に溶解
し、ファストゲル ハイ デンシテイ（Pharmacia）上
で分離し、ニトロセルロース上でブロットしついでブロ
ット上で銀染色した。ミオグロビンフラグメントを分子
量マーカー（molecular weight marker）として使用し
た。還元されたMj−AMPsはゲル内でSDS−PAGE上で直接
的に染色する（stain）ことができ、むしろ、３〜4kDa
の見掛分子量帯域に拡散バンド（diffuse band）を示
す。蛋白質試料（200ng）をDTTを含有する試料緩衝液中
で還元し、ファストゲル ハイ デンシテイ上で分離
し、ついでゲル中で銀染色した。図３は精製抗菌性蛋白
質のSDS−PAGE分析の結果を示している。図３のパネル
Ａは非還元蛋白質試料：レイン（lane）１、Mj−AMP2;
レイン２、Mj−AMP1;レインＲ、パネルＢの右側にkDaで
示される分子量を有するミオグロビンフラグメントを示
す。図３のパネルＢは還元蛋白質試料：レイン１、Mj−
AMP2;レイン２、Mj−AMP1;レインＲ、分子量マーカーと
してのミオグロビンフラグメントを示す。
従って、抗菌性因子はジスルフィドブリッジにより安
定化された二量体状蛋白質からなり、その各々は、２個
の同一のサブユニット（それぞれ、Mj−AMP1及びMj−AM
P2について、約4kDa及び3.5kDa）からなると考えられ
る。スーパーロース−12又はスーパーデックス（Superd
ex）上でのゲル濾過により天然Mj−AMPsの分子量を測定
することを試みたところ、恐らく、ゲルマトリックスと
の相互反応によると思われる、明らかに過少な値（unde
restimated value）（１〜2kDa）が得られた。
定化された二量体状蛋白質からなり、その各々は、２個
の同一のサブユニット（それぞれ、Mj−AMP1及びMj−AM
P2について、約4kDa及び3.5kDa）からなると考えられ
る。スーパーロース−12又はスーパーデックス（Superd
ex）上でのゲル濾過により天然Mj−AMPsの分子量を測定
することを試みたところ、恐らく、ゲルマトリックスと
の相互反応によると思われる、明らかに過少な値（unde
restimated value）（１〜2kDa）が得られた。
SDS−PAGEにより分離された還元Mj−AMPsの定期的ア
シッドシッフ（PAS）染色（Periodic Acid Schiff's（P
AS）staining）は陰性であり、そのポリペプチドはグリ
コシル化されていない（non−glycosylated）ことを示
していた。陽性対照試料としてオボアルブミン（3.2％
炭水化物）を使用して、Zacharius等の方法（1969;Anal
Biochem,30,148−152）に従って、糖蛋白質についての
PAS染色（PAS staining）を行った。Mj−AMP1及びMj−A
MP2のpI値を等電点電気泳動により測定したところ、両
者の蛋白質について約10.5であることが判った。等電点
電気泳動はpI範囲が4.7〜10.6のマーカー蛋白質（Pharm
acia）を使用してプレキャスト インムービリン ドラ
イ ストリップ（precast Immobiline Dry Stripe）（P
harmacia）上で行った。
シッドシッフ（PAS）染色（Periodic Acid Schiff's（P
AS）staining）は陰性であり、そのポリペプチドはグリ
コシル化されていない（non−glycosylated）ことを示
していた。陽性対照試料としてオボアルブミン（3.2％
炭水化物）を使用して、Zacharius等の方法（1969;Anal
Biochem,30,148−152）に従って、糖蛋白質についての
PAS染色（PAS staining）を行った。Mj−AMP1及びMj−A
MP2のpI値を等電点電気泳動により測定したところ、両
者の蛋白質について約10.5であることが判った。等電点
電気泳動はpI範囲が4.7〜10.6のマーカー蛋白質（Pharm
acia）を使用してプレキャスト インムービリン ドラ
イ ストリップ（precast Immobiline Dry Stripe）（P
harmacia）上で行った。
非還元Mj−AMP2は遊離のチオール基を含有していない
ので、Mj−AMP2の全てのシステイン残基はジスルフィド
結合に関与している思われた。同様に、Mj−AMP1だけが
その非還元状態ではなしに、還元状態でチオール反応剤
と反応した。チオール基の測定は、Ellman,GLのジチオ
ニトロ安息香酸法（1959;Arch Biochem Biophys,82,70
−74）により10nモルの蛋白質を使用して行った。還元
蛋白質試料は、10mMのDTTと45℃で１時間反応させつい
で2kDaの分子量カットオッフを有するベンゾイル化セル
ロースチューブ（Sigma）を使用して蒸留水に対して長
時間の透析を行うことにより調製した。
ので、Mj−AMP2の全てのシステイン残基はジスルフィド
結合に関与している思われた。同様に、Mj−AMP1だけが
その非還元状態ではなしに、還元状態でチオール反応剤
と反応した。チオール基の測定は、Ellman,GLのジチオ
ニトロ安息香酸法（1959;Arch Biochem Biophys,82,70
−74）により10nモルの蛋白質を使用して行った。還元
蛋白質試料は、10mMのDTTと45℃で１時間反応させつい
で2kDaの分子量カットオッフを有するベンゾイル化セル
ロースチューブ（Sigma）を使用して蒸留水に対して長
時間の透析を行うことにより調製した。
実施例 ５
Mj−AMPsのアミノ酸配列。
抗菌性蛋白質のシステイン残基を以下に述べるごとく
Ｓ−カルボキシアミドメチル化（Ｓ−carboxyamidometh
ylation）により変性した:100μｇの量の精製蛋白質
を、30mMのDTTを含有する0.3M Tris−HCl（pH8.6）150
μに溶解し、45℃で１時間反応させた。ヨードアセト
アミドを最終濃度が100mMになるまで添加し、混合物を3
7℃で１時間暗所に放置した。最終的に、DTTを最終濃度
が100mMになるまで添加することにより反応を沈静化し
（quench）ついで37℃で１時間更に反応させた。脱塩
（desalting）はPeP−Ｓ（多孔質シリカC2/C18）（Phar
macia）カラム（2.5 x 0.4cm）上での高性能液体クロマ
トグラフィー（HPLC）により行った。濃度勾配を0.1％
トリフルオル酢酸（TFA）から、0.1％のTFAを含有する
２−プロパノールへと直線的に変化させてカラムを溶離
させることによりカルボキシアミドメチル化蛋白質を回
収した。得られた蛋白質フラクションを120Aアナライザ
ー（Applied Biosystem）中でのフェニルチオヒダント
インアミノ酸誘導体のオン−ライン検出を行う477A蛋白
質シークエンサー（Applied Biosystem）中でのアミノ
酸配列分析にかけた。
Ｓ−カルボキシアミドメチル化（Ｓ−carboxyamidometh
ylation）により変性した:100μｇの量の精製蛋白質
を、30mMのDTTを含有する0.3M Tris−HCl（pH8.6）150
μに溶解し、45℃で１時間反応させた。ヨードアセト
アミドを最終濃度が100mMになるまで添加し、混合物を3
7℃で１時間暗所に放置した。最終的に、DTTを最終濃度
が100mMになるまで添加することにより反応を沈静化し
（quench）ついで37℃で１時間更に反応させた。脱塩
（desalting）はPeP−Ｓ（多孔質シリカC2/C18）（Phar
macia）カラム（2.5 x 0.4cm）上での高性能液体クロマ
トグラフィー（HPLC）により行った。濃度勾配を0.1％
トリフルオル酢酸（TFA）から、0.1％のTFAを含有する
２−プロパノールへと直線的に変化させてカラムを溶離
させることによりカルボキシアミドメチル化蛋白質を回
収した。得られた蛋白質フラクションを120Aアナライザ
ー（Applied Biosystem）中でのフェニルチオヒダント
インアミノ酸誘導体のオン−ライン検出を行う477A蛋白
質シークエンサー（Applied Biosystem）中でのアミノ
酸配列分析にかけた。
ピログルタメートアミノペプチダーゼ（ブロックされ
たＮ−末端残基を除去するために使用）とトリプシン
（内部ペプチドを形成するために使用）で処理した後に
Mj−AMP1の37残基についての、アミノ酸配列データーを
得た。Mj−AMP1の分子量を迅速原子衝撃質量分光分析
（fast atom bombardment mass spectroscopy）により
確認した結果、予測した分子量に正確に一致する3796ダ
ルトン（dalton）であることが判った。アミノ酸配列は
Mj−AMP2と類似しており、アミノ酸28（アスパラギンが
グリシンにより置換されている）、アミノ酸33（バリン
がチロシンにより置換されている）及びアミノ酸35（ア
ルギニンがリシンにより置換されている）において相違
するとを特徴とする。更に、アミノ酸１においてグルタ
ミンが確認された。両者のペプチドは６個のシステイン
残基を含有している。図4AはMj−AMP1とMj−AMP2の完全
アミノ酸配列を示している；両者における相違は矢印で
示されている。
たＮ−末端残基を除去するために使用）とトリプシン
（内部ペプチドを形成するために使用）で処理した後に
Mj−AMP1の37残基についての、アミノ酸配列データーを
得た。Mj−AMP1の分子量を迅速原子衝撃質量分光分析
（fast atom bombardment mass spectroscopy）により
確認した結果、予測した分子量に正確に一致する3796ダ
ルトン（dalton）であることが判った。アミノ酸配列は
Mj−AMP2と類似しており、アミノ酸28（アスパラギンが
グリシンにより置換されている）、アミノ酸33（バリン
がチロシンにより置換されている）及びアミノ酸35（ア
ルギニンがリシンにより置換されている）において相違
するとを特徴とする。更に、アミノ酸１においてグルタ
ミンが確認された。両者のペプチドは６個のシステイン
残基を含有している。図4AはMj−AMP1とMj−AMP2の完全
アミノ酸配列を示している；両者における相違は矢印で
示されている。
Mj−AMPのアミノ酸配列はクモ（spider）アゲレノプ
シス アペルタ（Agelenopsis aperta）からのμ−アガ
トキシン（μ−agatoxin）（Skinner,WS等;1989;J Biol
Chem,264,2150−2155）、海産巻貝（marine snail）コ
ヌス種（Conus sp）からのコノトキシン（conotoxin）
（Olivera,BM等;1985,Socience,230,1338−1343）、ブ
トツス（Buthotus）サソリからの毒素（Fazal A等;198
9,FEBS Letters,257,260−２）及びクルタトキシン（cu
rtatoxin）（Stapleton等;1990,J Biol Chem,265
（４）,2054−2059）を包含する無脊椎動物の毒素中で
見出だされる神経毒に類似することが認められた。図4B
はMj−AMP1とMj−AMP2のアミノ酸配列とこれと並列して
神経毒のアミノ酸配列を示す。相同アミノ酸（homologo
us amino acid）は四角で囲まれている。点線はアミノ
酸配列の最適な整列（alignment）のために導入された
ギャップを示す。
シス アペルタ（Agelenopsis aperta）からのμ−アガ
トキシン（μ−agatoxin）（Skinner,WS等;1989;J Biol
Chem,264,2150−2155）、海産巻貝（marine snail）コ
ヌス種（Conus sp）からのコノトキシン（conotoxin）
（Olivera,BM等;1985,Socience,230,1338−1343）、ブ
トツス（Buthotus）サソリからの毒素（Fazal A等;198
9,FEBS Letters,257,260−２）及びクルタトキシン（cu
rtatoxin）（Stapleton等;1990,J Biol Chem,265
（４）,2054−2059）を包含する無脊椎動物の毒素中で
見出だされる神経毒に類似することが認められた。図4B
はMj−AMP1とMj−AMP2のアミノ酸配列とこれと並列して
神経毒のアミノ酸配列を示す。相同アミノ酸（homologo
us amino acid）は四角で囲まれている。点線はアミノ
酸配列の最適な整列（alignment）のために導入された
ギャップを示す。
実施例 ６
Mj−AMPsの抗菌活性の安定性。
Mj−AMPsの抗菌活性の安定性を更に試験した結果が表
１に要約されている。抗菌活性の試験は実施例２に記載
の評価方法に従って、フサリウム クルモルム胞子（胞
子数2 x104/m）を含有する増殖培地で５倍に稀酌した
20μの試料を使用して行った。対照試料は10mM燐酸ナ
トリウム緩衝液（pH7）中に500μg/mのMj−AMP1又は1
00μg/mのMj−AMP2を含有していた。2.5mMのDTTを添
加しついで37℃で２時間インキュベートすることにより
還元反応を行わせた。下記の緩衝液:20mMのグリシン−H
Cl（pH2及び３）;20mMのジエタノールアミン−HCl（pH1
0）；及び20mMのグリシン−NaOH（pH11）中でpH安定性
を試験した。適当な緩衝液中で１時間インキュベートし
た後、試料を10mM燐酸ナトリウム緩衝液（pH7）に対し
て16時間透析した。消化（digestion）のためにプロテ
アーゼを100μg/m添加し、37℃で16時間インキュベー
トした。
１に要約されている。抗菌活性の試験は実施例２に記載
の評価方法に従って、フサリウム クルモルム胞子（胞
子数2 x104/m）を含有する増殖培地で５倍に稀酌した
20μの試料を使用して行った。対照試料は10mM燐酸ナ
トリウム緩衝液（pH7）中に500μg/mのMj−AMP1又は1
00μg/mのMj−AMP2を含有していた。2.5mMのDTTを添
加しついで37℃で２時間インキュベートすることにより
還元反応を行わせた。下記の緩衝液:20mMのグリシン−H
Cl（pH2及び３）;20mMのジエタノールアミン−HCl（pH1
0）；及び20mMのグリシン−NaOH（pH11）中でpH安定性
を試験した。適当な緩衝液中で１時間インキュベートし
た後、試料を10mM燐酸ナトリウム緩衝液（pH7）に対し
て16時間透析した。消化（digestion）のためにプロテ
アーゼを100μg/m添加し、37℃で16時間インキュベー
トした。
Mj−AMPsはそのジスルフィド結合を還元した後にはＦ
クルモルムに対する抗菌活性を完全に失った。しかしな
がら、天然蛋白質は100℃まで10分の熱処理により影響
を受けず、２〜11のpHに亘って安定であった。Mj−AMP1
はプロテアーゼのキモトリプシンに対して感受性であっ
たが、プロナーゼＥ（Pronase E）、トリプシン及びプ
ロテイナーゼＫによる消化に対しては殆ど完全に耐久性
であった；これに対して、Mj−AMP2はプロナーゼＥによ
る処理に対して最も感受性であった。
クルモルムに対する抗菌活性を完全に失った。しかしな
がら、天然蛋白質は100℃まで10分の熱処理により影響
を受けず、２〜11のpHに亘って安定であった。Mj−AMP1
はプロテアーゼのキモトリプシンに対して感受性であっ
たが、プロナーゼＥ（Pronase E）、トリプシン及びプ
ロテイナーゼＫによる消化に対しては殆ど完全に耐久性
であった；これに対して、Mj−AMP2はプロナーゼＥによ
る処理に対して最も感受性であった。
実施例 ７
Mj−AMPsの抗菌効力（antifungal potency）。
Mj−AMPsの抗菌効力を13種の植物病原菌（plant path
ogenic fungus）について試験し、２種の既知の抗菌性
蛋白質、ウルチカジオカ アグルチニン（Urtica dioca
agglutinin）、即ち、UDA（Broekaert,WF等;1989;Soci
ence,245,1100−1102）及びβ−プロチオニン（β−pur
othionin）（Hernandez−Lucas,C等;1974;Appl Microbi
ol,28,165−168）の抗菌効力と比較した。菌類を白色蛍
光灯の下で６個の穀類アガー（cereal agar）上で生長
させ、胞子を回収し、従来の方法で貯蔵した（Broekaer
t,WF等;1990;FEMS Microbial Lett,69.55−60）。下記
のごとき菌株を使用した：アルテルナリア ブラシコラ
（Alternaria brassicola）MUCL 20297、アスコキタ
ピシ（Ascochyta pisi）MUCL 30164、ボトリチス シネ
レア（Botrytis cinerea）MUCL 30158、コレトトリクム
リンデムチアヌム（Colletotricum lindemuthianum）
MUCL 9577、フサリウム クルモルム（Fusarium culmor
um）IMI 180420、フサリウム オキシスポルムf.sp.ピ
シ（Fusarium oxysporum f.sp.pisi）IMI 236441、フサ
リウム オキシスポルムf.sp.リコペルシシ（Fusarium
oxysporum f.sp.lycopersici）MUCL909、ネクトリア
ハエマトコカ（Nectria haematococca）コレクション
ファンエッテン160−２−２（Collection van Etten 16
0−２−２），フォマベタエ（Phomabetae）MUCL 9916、
ピレノフォラ トリチシ−レペンチス（Pyrenophora tr
itici−repentis）MUCL 30217、ピリクラリ アオリザ
エ（Pyricularia oryzae）MUCL 30166、ベンツリア イ
ンアエクアリス（Venturia inaequalis）MUCL 15927、
ベルチシリウム ダリアエ（Verticillium dahliae）MU
CL 19210。UDAは従来の方法によりイラクサ属植物（sti
nging nettle）（Urtica dioica）の根茎から単離した
（Peumans WJ等;1983;FEBS Lett,177,99−103）。β−
プロチオニン（β−purothionin）はRedman,DG及びFish
er,Nの方法（1969;J Sci Fd Agric,20,427−432）によ
り小麦の内胚乳（endosperm）から精製した。
ogenic fungus）について試験し、２種の既知の抗菌性
蛋白質、ウルチカジオカ アグルチニン（Urtica dioca
agglutinin）、即ち、UDA（Broekaert,WF等;1989;Soci
ence,245,1100−1102）及びβ−プロチオニン（β−pur
othionin）（Hernandez−Lucas,C等;1974;Appl Microbi
ol,28,165−168）の抗菌効力と比較した。菌類を白色蛍
光灯の下で６個の穀類アガー（cereal agar）上で生長
させ、胞子を回収し、従来の方法で貯蔵した（Broekaer
t,WF等;1990;FEMS Microbial Lett,69.55−60）。下記
のごとき菌株を使用した：アルテルナリア ブラシコラ
（Alternaria brassicola）MUCL 20297、アスコキタ
ピシ（Ascochyta pisi）MUCL 30164、ボトリチス シネ
レア（Botrytis cinerea）MUCL 30158、コレトトリクム
リンデムチアヌム（Colletotricum lindemuthianum）
MUCL 9577、フサリウム クルモルム（Fusarium culmor
um）IMI 180420、フサリウム オキシスポルムf.sp.ピ
シ（Fusarium oxysporum f.sp.pisi）IMI 236441、フサ
リウム オキシスポルムf.sp.リコペルシシ（Fusarium
oxysporum f.sp.lycopersici）MUCL909、ネクトリア
ハエマトコカ（Nectria haematococca）コレクション
ファンエッテン160−２−２（Collection van Etten 16
0−２−２），フォマベタエ（Phomabetae）MUCL 9916、
ピレノフォラ トリチシ−レペンチス（Pyrenophora tr
itici−repentis）MUCL 30217、ピリクラリ アオリザ
エ（Pyricularia oryzae）MUCL 30166、ベンツリア イ
ンアエクアリス（Venturia inaequalis）MUCL 15927、
ベルチシリウム ダリアエ（Verticillium dahliae）MU
CL 19210。UDAは従来の方法によりイラクサ属植物（sti
nging nettle）（Urtica dioica）の根茎から単離した
（Peumans WJ等;1983;FEBS Lett,177,99−103）。β−
プロチオニン（β−purothionin）はRedman,DG及びFish
er,Nの方法（1969;J Sci Fd Agric,20,427−432）によ
り小麦の内胚乳（endosperm）から精製した。
表２に結果を要約して示す。Mj−AMP1、Mj−AMP2、UD
A及びβ−プロチオニンの一連の稀釈物（serial diluti
ons）を菌類に適用し、顕微分光分析（実施例２に記
載）により成長抑制率（％）を測定した。48時間のイン
キュベーションの後に成長を50％抑制するのに必要な濃
度をIC50値とし、これを投与−応答曲線から算定した。
成長の遅い菌、ベンツリア インアエクアリスのIC50は
10日間のインキュベーションの後に測定した。
A及びβ−プロチオニンの一連の稀釈物（serial diluti
ons）を菌類に適用し、顕微分光分析（実施例２に記
載）により成長抑制率（％）を測定した。48時間のイン
キュベーションの後に成長を50％抑制するのに必要な濃
度をIC50値とし、これを投与−応答曲線から算定した。
成長の遅い菌、ベンツリア インアエクアリスのIC50は
10日間のインキュベーションの後に測定した。
48時間のインキュベーションの後に菌の成長を50％抑
制するのに必要な濃度（IC50）は、供試微生物の種類に
応じて、Mj−AMP1については６〜300μg/m、Mj−AMP2
については0.5〜20μg/m、β−プロチオニンについて
は0.5〜15μg/m、UDAについては20〜1,000μg/mの
範囲で変動した。平均的には、得られた抗菌活性の順列
は次の通りであった:Mj−AMP2＝β−プロチオニン＞Mj
−AMP1＞UDA。Ｂシネレア、Ｃリンデムチアヌム及びＶ
インアエクアリスのごとき若干の菌類はβ−プロチオニ
ンに対するよりもMj−AMP2に対して明らかに感受性であ
った。これと反対に、β−プロチオニンはＦオキシスポ
ルムf.sp.ピシ及びＰトリチシ−レペンチスのごとき他
の菌類の成長を抑制するのに最も効果的であった。
制するのに必要な濃度（IC50）は、供試微生物の種類に
応じて、Mj−AMP1については６〜300μg/m、Mj−AMP2
については0.5〜20μg/m、β−プロチオニンについて
は0.5〜15μg/m、UDAについては20〜1,000μg/mの
範囲で変動した。平均的には、得られた抗菌活性の順列
は次の通りであった:Mj−AMP2＝β−プロチオニン＞Mj
−AMP1＞UDA。Ｂシネレア、Ｃリンデムチアヌム及びＶ
インアエクアリスのごとき若干の菌類はβ−プロチオニ
ンに対するよりもMj−AMP2に対して明らかに感受性であ
った。これと反対に、β−プロチオニンはＦオキシスポ
ルムf.sp.ピシ及びＰトリチシ−レペンチスのごとき他
の菌類の成長を抑制するのに最も効果的であった。
試験した抗菌性蛋白質の全てについて、成長抑制の程
度はインキュベーション時間が増大するにつれて減少す
る傾向を示した。例えば、Ｃリンデムチアヌムについて
のMj−AMP1のIC50値は、48時間のインキュベーションの
後の６μg/mから、72時間後には12μg/m上昇した。
しかしながら、時間依存性の抗菌活性の低下はMj−AMP1
又はUDAについてより、Mj−AMP2及びβ−プロチオニン
についてより少なかった。また、Mj−AMP2及びβ−プロ
チオニンは、特徴的に、Mj−AMP1又はUDAより急勾配の
投与−応答曲線を生じた。図５は次の蛋白質:Mj−AMP1
（パネルＡ及びＢ）、Mj−AMP2（パネルＣ及びＤ）、UD
A（パネルＥ及びＦ）及びβ−プロチオニン（パネルＧ
及びＨ）の濃度を変化させて測定した、菌類、即ち、コ
レトトリクム リンデムチアヌム（パネルA,C,E,G）及
びアルテルナリア ブラシコラ（パネルB,D,F,H）の時
間依存性成長抑制率曲線を示す。成長抑制率は48時間後 60時間後 及び72時間後 に記録した。
度はインキュベーション時間が増大するにつれて減少す
る傾向を示した。例えば、Ｃリンデムチアヌムについて
のMj−AMP1のIC50値は、48時間のインキュベーションの
後の６μg/mから、72時間後には12μg/m上昇した。
しかしながら、時間依存性の抗菌活性の低下はMj−AMP1
又はUDAについてより、Mj−AMP2及びβ−プロチオニン
についてより少なかった。また、Mj−AMP2及びβ−プロ
チオニンは、特徴的に、Mj−AMP1又はUDAより急勾配の
投与−応答曲線を生じた。図５は次の蛋白質:Mj−AMP1
（パネルＡ及びＢ）、Mj−AMP2（パネルＣ及びＤ）、UD
A（パネルＥ及びＦ）及びβ−プロチオニン（パネルＧ
及びＨ）の濃度を変化させて測定した、菌類、即ち、コ
レトトリクム リンデムチアヌム（パネルA,C,E,G）及
びアルテルナリア ブラシコラ（パネルB,D,F,H）の時
間依存性成長抑制率曲線を示す。成長抑制率は48時間後 60時間後 及び72時間後 に記録した。
実施例 ８
葉の病害に対するMj−AMPsの抗菌作用：生体内試験。
ミラビリス ヤラパからの塩基性熱安定性蛋白質フラ
クションとMj−AMP1の純粋な試料を下記の方法を使用し
て菌による植物の葉の病害について試験した。
クションとMj−AMP1の純粋な試料を下記の方法を使用し
て菌による植物の葉の病害について試験した。
植物を直径4cmの小鉢内のジョンインネス（John Inne
s）堆肥中で成長させた。蛋白質製剤の調製は殺菌脱イ
オン水に溶解しついで適当な濃度まで稀釈することによ
り使用直前に行った。蛋白質抽出物は約１％の活性成分
を含有しているものと推定された。Mj−AMP1の純粋な試
料を同様の方法で調製した。製剤は葉噴霧物として植物
に施用した。噴霧物は個々の小滴の滞留が最大になるま
で噴霧した。噴霧物を穀類に適用する場合にはトウイー
ン（Tween）20を最終濃度が0.05％になるまで添加し
た。植物に病原菌を接種する１日又は２日前に蛋白質製
剤を葉に（噴霧により）施した（保護用噴霧）。葉の病
原体は胞子懸濁物として供試植物の葉に適用した。接種
後、植物を適当な環境中に置いて感染を進行させついで
病害の評価が容易になるまでインキュベートした。接種
から評価までの期間は病害と環境に応じて４〜14日の間
で変動させた。
s）堆肥中で成長させた。蛋白質製剤の調製は殺菌脱イ
オン水に溶解しついで適当な濃度まで稀釈することによ
り使用直前に行った。蛋白質抽出物は約１％の活性成分
を含有しているものと推定された。Mj−AMP1の純粋な試
料を同様の方法で調製した。製剤は葉噴霧物として植物
に施用した。噴霧物は個々の小滴の滞留が最大になるま
で噴霧した。噴霧物を穀類に適用する場合にはトウイー
ン（Tween）20を最終濃度が0.05％になるまで添加し
た。植物に病原菌を接種する１日又は２日前に蛋白質製
剤を葉に（噴霧により）施した（保護用噴霧）。葉の病
原体は胞子懸濁物として供試植物の葉に適用した。接種
後、植物を適当な環境中に置いて感染を進行させついで
病害の評価が容易になるまでインキュベートした。接種
から評価までの期間は病害と環境に応じて４〜14日の間
で変動させた。
３種の病原菌：小麦について試験したセプトリア ノ
ドルム（Septoria nodorum）［ファンギ インペルフェ
クチ（Fungi Imperfecti）］、ブドウについて試験した
プラスモパラ ビチコラ（Plasmopara viticola）［フ
ィコミシテ（Phycomycete）］及びテンサイについて試
験したセルコスポラ ベチコラ（Cercospora beticol
a）についての結果を表３に示す。病害の抑制は次の等
級で表した:4＝病害なし;3＝痕跡〜非処理植物の病害の
５％;2＝非処理植物の病害の６〜25％;1＝非処理植物の
病害の26〜60％;0＝非処理植物の病害の60〜100％。
ドルム（Septoria nodorum）［ファンギ インペルフェ
クチ（Fungi Imperfecti）］、ブドウについて試験した
プラスモパラ ビチコラ（Plasmopara viticola）［フ
ィコミシテ（Phycomycete）］及びテンサイについて試
験したセルコスポラ ベチコラ（Cercospora beticol
a）についての結果を表３に示す。病害の抑制は次の等
級で表した:4＝病害なし;3＝痕跡〜非処理植物の病害の
５％;2＝非処理植物の病害の６〜25％;1＝非処理植物の
病害の26〜60％;0＝非処理植物の病害の60〜100％。
これらの結果から、ミラビリス蛋白質抽出物又は精製
Mj−AMP1ペプチドは、葉噴霧物として適用した場合、生
体内で殺菌剤として作用し得ることが確認される。
Mj−AMP1ペプチドは、葉噴霧物として適用した場合、生
体内で殺菌剤として作用し得ることが確認される。
実施例 ９
葉の病害に対するMj−AMPsの抗菌作用：生体外試験。
実施例８に記載したごとき蛋白質製剤を種々の病原菌
に対する活性について生体外で試験した。計量した製剤
物質（formulated material）のアリコートをアガー培
地（agar medium）［1000mの水中に2gのCa（N
O3）２、0.725gのMgSO4、0.725gのKH2PO4、0.6gのKCl、
17.2gのNaH2PO4及び17.725gのNa2HPO4を含有する塩溶液
と、800mの水中に10gのテクニカルアガー（Technical
agar）no 3（Oxoid）及び50gのスクロースを含有する
アガー溶液とからなるペトリス（Petris）最小培地］中
に分散させた。ついでこのアガー培地に胞子懸濁液を使
用するか又は菌糸体プラグ（mycelial plug）を使用し
てある範囲の病原体を接種した。ついでアガープレート
を評価する前に５日目まで接種した（inoculate）。
に対する活性について生体外で試験した。計量した製剤
物質（formulated material）のアリコートをアガー培
地（agar medium）［1000mの水中に2gのCa（N
O3）２、0.725gのMgSO4、0.725gのKH2PO4、0.6gのKCl、
17.2gのNaH2PO4及び17.725gのNa2HPO4を含有する塩溶液
と、800mの水中に10gのテクニカルアガー（Technical
agar）no 3（Oxoid）及び50gのスクロースを含有する
アガー溶液とからなるペトリス（Petris）最小培地］中
に分散させた。ついでこのアガー培地に胞子懸濁液を使
用するか又は菌糸体プラグ（mycelial plug）を使用し
てある範囲の病原体を接種した。ついでアガープレート
を評価する前に５日目まで接種した（inoculate）。
その結果を表４に示す。病害の抑制は次の等級で表し
た： ４＝病原体の成長なし（完全な抑制）;3＝病原体の成
長が痕跡程度;2＝病原体の成長が制限されるか又は中程
度;0＝病原体の成長が抑制されない;n＝結果は誤り。
た： ４＝病原体の成長なし（完全な抑制）;3＝病原体の成
長が痕跡程度;2＝病原体の成長が制限されるか又は中程
度;0＝病原体の成長が抑制されない;n＝結果は誤り。
蛋白質抽出物は試験した割合の両者において広範囲の
抗菌活性を示した。
抗菌活性を示した。
実施例 10
Mj−AMPsの酵母に対する抑制活性。
酵母サッカロミセス セレビシアエ（Saccharomyces
cerevisiae）に対するMj−AMPsの抑制活性も試験した。
表５に示す結果はMj−AMPsは500μg/m又はそれ以上の
濃度で酵母の成長を抑制することを示している。
cerevisiae）に対するMj−AMPsの抑制活性も試験した。
表５に示す結果はMj−AMPsは500μg/m又はそれ以上の
濃度で酵母の成長を抑制することを示している。
実施例 11
Mj−AMPsの抗菌活性：生体外試験。
ある範囲のグラム陽性及びグラム陰性バクテリア：バ
シルス メガテリウム（Bacillus megaterium）、セル
シナ ルテア（Sercina lutea）、エシエリチア コリ
（Escherichia coli）及びエルウイニア カロトボラ
（Erwinia carotovora）に対するMj−AMPsの抗菌活性を
試験した。比較のため、β−プロチオニンとUDAも試験
した（実施例７参照）。試験は１％のトリプトンを含有
する軟質アガロース培地中で、1mMのCaCl2及び50mMのKC
lの存在下と不存在下で行った。48時間後に培地の吸光
度、595nmを測定した。結果を表６に示す。
シルス メガテリウム（Bacillus megaterium）、セル
シナ ルテア（Sercina lutea）、エシエリチア コリ
（Escherichia coli）及びエルウイニア カロトボラ
（Erwinia carotovora）に対するMj−AMPsの抗菌活性を
試験した。比較のため、β−プロチオニンとUDAも試験
した（実施例７参照）。試験は１％のトリプトンを含有
する軟質アガロース培地中で、1mMのCaCl2及び50mMのKC
lの存在下と不存在下で行った。48時間後に培地の吸光
度、595nmを測定した。結果を表６に示す。
これらの結果は、Mj−AMPsはグラム陰性バクテリアに
対しては活性を示さないが、グラム陽性バクテリアの成
長は抑制することを示している。
対しては活性を示さないが、グラム陽性バクテリアの成
長は抑制することを示している。
実施例12
Mj−AMP cDNAの分子クローニング及び配列。
十分に成熟させたミラビリス ヤルパの種子を屋外で
成長させた植物から回収し、直ちに液体窒素中で凍結
し、−80℃で貯蔵した。De Vries等の方法（1988,Plant
Molecular Biology Manual,B6,1−13）により、15gの
粉砕した種子から全DNAを抽出した。Silflow等により文
献に記載されたオリゴ（dT）−セルロースアフィニテイ
クロマトグラフィー（1979,Biochemistry,18,2725−273
1）によりポリ（Ａ）+RNAを精製して、約10gのポリ
（Ａ）+RNAを得た。Gubler及びHoffmanの方法（1983,Ge
ne,25,263−269）に従って、アメルシャム（Amersham）
のcDNA合成システムプラス（cDNA Synthesis System Pl
us）を使用して2gのポリ（Ａ）+RNAから二重鎖cDNAsを
調製した。cDNAsを製造業者（Amersham）の取扱説明書
に従ってEcoRIリンカー（linker）に連結させた後、λg
t10ファージ中にクローンした。ファージDNAをギガパッ
クIIゴールドパッキングシステム（Gigapack II Gold p
acking system）（Stratagene）を使用して生体外にパ
ッケージ（package）した。
成長させた植物から回収し、直ちに液体窒素中で凍結
し、−80℃で貯蔵した。De Vries等の方法（1988,Plant
Molecular Biology Manual,B6,1−13）により、15gの
粉砕した種子から全DNAを抽出した。Silflow等により文
献に記載されたオリゴ（dT）−セルロースアフィニテイ
クロマトグラフィー（1979,Biochemistry,18,2725−273
1）によりポリ（Ａ）+RNAを精製して、約10gのポリ
（Ａ）+RNAを得た。Gubler及びHoffmanの方法（1983,Ge
ne,25,263−269）に従って、アメルシャム（Amersham）
のcDNA合成システムプラス（cDNA Synthesis System Pl
us）を使用して2gのポリ（Ａ）+RNAから二重鎖cDNAsを
調製した。cDNAsを製造業者（Amersham）の取扱説明書
に従ってEcoRIリンカー（linker）に連結させた後、λg
t10ファージ中にクローンした。ファージDNAをギガパッ
クIIゴールドパッキングシステム（Gigapack II Gold p
acking system）（Stratagene）を使用して生体外にパ
ッケージ（package）した。
cDNAライブラリーのスクリーニングのためのDNAプロ
ーブを以下の方法でポリメラーゼ鎖反応（PCR）により
製造した:2個の縮重（degenerate）オリゴヌクレオチ
ド： OWB3（5'TGYATHGGNAAYGGNGGNMGNTG）及び OWB4（5'ACNCCRTANCCYTGRTTNGGYTG）を合成した。OWB3
はMj−AMP2のアミノ酸１〜８に相当し、センス配向（se
nse orientation）を有する。OWB4はMj−AMP2のアミノ
酸25〜32に相当し、アンチセンス配向（antisense orie
ntation）を有する。PCRはアンプリファイアーとしてOW
B3及びOWB4を使用し、ターゲトDNAとして25ngのcDNAを
使用してかつTaqポリメラーゼを使用して標準的な条件
下（Sambrook等,1989,Molecular Cloning,Cold Spring
Harbour Lab Press）で行った。温度プログラムは94℃
で５分間の初期工程、30サイクル（94℃で１分間;45℃
で２分間;72℃で３分間）及び72℃で10分間の最終工程
から構成した。100bp PCR増幅生成物（amplification p
roduct）を３％アガロース（NuSieve,FMC）ゲル上で精
製しついで反応混合物に200μＭのdTTPの代わりに130μ
ＭのdTTPと70μＭのジゴキシゲニン−11−dUTP（digoxi
genin−11−dUTP）を含有させたこと以外、前記と同一
の条件下でPCRにより再増幅させた。ジゴキシゲニン標
識した（digoxigenin−labelled）PCR生成物を３％ヌシ
ーブアガロースゲル（NuSieve agarose gel）上で精製
した。
ーブを以下の方法でポリメラーゼ鎖反応（PCR）により
製造した:2個の縮重（degenerate）オリゴヌクレオチ
ド： OWB3（5'TGYATHGGNAAYGGNGGNMGNTG）及び OWB4（5'ACNCCRTANCCYTGRTTNGGYTG）を合成した。OWB3
はMj−AMP2のアミノ酸１〜８に相当し、センス配向（se
nse orientation）を有する。OWB4はMj−AMP2のアミノ
酸25〜32に相当し、アンチセンス配向（antisense orie
ntation）を有する。PCRはアンプリファイアーとしてOW
B3及びOWB4を使用し、ターゲトDNAとして25ngのcDNAを
使用してかつTaqポリメラーゼを使用して標準的な条件
下（Sambrook等,1989,Molecular Cloning,Cold Spring
Harbour Lab Press）で行った。温度プログラムは94℃
で５分間の初期工程、30サイクル（94℃で１分間;45℃
で２分間;72℃で３分間）及び72℃で10分間の最終工程
から構成した。100bp PCR増幅生成物（amplification p
roduct）を３％アガロース（NuSieve,FMC）ゲル上で精
製しついで反応混合物に200μＭのdTTPの代わりに130μ
ＭのdTTPと70μＭのジゴキシゲニン−11−dUTP（digoxi
genin−11−dUTP）を含有させたこと以外、前記と同一
の条件下でPCRにより再増幅させた。ジゴキシゲニン標
識した（digoxigenin−labelled）PCR生成物を３％ヌシ
ーブアガロースゲル（NuSieve agarose gel）上で精製
した。
約100,000プラーク形成単位（plaque forming unit）
のλgt10 cDANライブラリーを、ナイロン膜［ハイボン
ド−Ｎ（Hybond−Ｎ）Amersham］を使用するその場での
プラークハイブルダイゼーション（plaque hybridisati
on）によりジゴキシゲニン標識PCR生成物を使用してス
クリーンした。膜を風乾し、DNAを膜上でUV光線（0.15J
/cm2）の下で架橋させた。ハイブルダイゼーションは68
℃で16時間、5 x ssc、１％ブロッキング剤（blocking
agent）（Boehringer Mannheim）、0.1％Ｎ−ラウリル
サルコシン、10ng/mの熱変性（heat−denatuated）ジ
ゴキシゲニン標識プローブを含有する0.02％ドデシル硫
酸ナトリウム中で行った。2 x SSC/0.1％SDS中で25℃で
５分間、２回及び0.1 x SSC/0.1％SDS中で68℃で15分
間、２回、洗浄することにより、非特異的に結合した
（non−specifically bound）プローブを除去した。プ
ローブの検出（detection）はアルカリ燐酸塩及びその
基体、５−ブロム−４−クロル−３−インドリルホスフ
ェート（Boehringer Mannheim）に結合されたアンチ−
ジゴキシゲニン抗体（anti−digoxigenin antibody）
（Boehringer Mannheim）を使用してその製造業者の使
用説明書に従って行った。正のプラーク（positive pla
que）を同一のプローブを使用してかつ同一の条件下で
２回の追加的なスクリーニング工程を行うことにより精
製した。精製プラークからのインサートをpEMBL18のEco
R I部位（Dente等,1983,Nucl Acid Res,11,1145−115
5）中にサブクローンした。ヌクレオチドの配列決定（s
equencing）は、フルオレセイン標識M13前進及び逆行プ
ライマー（M13 forward and reverse primer）（Pharma
cia）を使用するALF自動シークエンサーを使用して行っ
た。配列分析はPC−遺伝子ソフトウエアー（PC−gene s
oftware）（Intelligenetics）により行った。
のλgt10 cDANライブラリーを、ナイロン膜［ハイボン
ド−Ｎ（Hybond−Ｎ）Amersham］を使用するその場での
プラークハイブルダイゼーション（plaque hybridisati
on）によりジゴキシゲニン標識PCR生成物を使用してス
クリーンした。膜を風乾し、DNAを膜上でUV光線（0.15J
/cm2）の下で架橋させた。ハイブルダイゼーションは68
℃で16時間、5 x ssc、１％ブロッキング剤（blocking
agent）（Boehringer Mannheim）、0.1％Ｎ−ラウリル
サルコシン、10ng/mの熱変性（heat−denatuated）ジ
ゴキシゲニン標識プローブを含有する0.02％ドデシル硫
酸ナトリウム中で行った。2 x SSC/0.1％SDS中で25℃で
５分間、２回及び0.1 x SSC/0.1％SDS中で68℃で15分
間、２回、洗浄することにより、非特異的に結合した
（non−specifically bound）プローブを除去した。プ
ローブの検出（detection）はアルカリ燐酸塩及びその
基体、５−ブロム−４−クロル−３−インドリルホスフ
ェート（Boehringer Mannheim）に結合されたアンチ−
ジゴキシゲニン抗体（anti−digoxigenin antibody）
（Boehringer Mannheim）を使用してその製造業者の使
用説明書に従って行った。正のプラーク（positive pla
que）を同一のプローブを使用してかつ同一の条件下で
２回の追加的なスクリーニング工程を行うことにより精
製した。精製プラークからのインサートをpEMBL18のEco
R I部位（Dente等,1983,Nucl Acid Res,11,1145−115
5）中にサブクローンした。ヌクレオチドの配列決定（s
equencing）は、フルオレセイン標識M13前進及び逆行プ
ライマー（M13 forward and reverse primer）（Pharma
cia）を使用するALF自動シークエンサーを使用して行っ
た。配列分析はPC−遺伝子ソフトウエアー（PC−gene s
oftware）（Intelligenetics）により行った。
２種の正のクローン、MJ1及びMJ2からのインサートを
ヌクレオチド配列分析にかけた。
ヌクレオチド配列分析にかけた。
MJ1は360ヌクレオチドの長さであり、5'末端でトラン
ケート（truncate）されていると考えられる。コード領
域はカルボキシ末端部分にMj−AMP1の37アミノ酸を包含
する61アミノ酸を含有する。同様に、アミノ末端部分
（24アミノ酸）は単一ペプチドの全ての特徴（featur
e）を有するが、最初の（initial）メチオニンに欠けて
いるのでトランケートされている。3'非翻訳領域は172
ヌクレオチドの長さであり、位置326における推定上の
ポリアデニル化シグナル（putative polyadenylation s
ignal）（AATAAG）と12−ヌクレオチドポリ（Ａ）テイ
ルを含有している。
ケート（truncate）されていると考えられる。コード領
域はカルボキシ末端部分にMj−AMP1の37アミノ酸を包含
する61アミノ酸を含有する。同様に、アミノ末端部分
（24アミノ酸）は単一ペプチドの全ての特徴（featur
e）を有するが、最初の（initial）メチオニンに欠けて
いるのでトランケートされている。3'非翻訳領域は172
ヌクレオチドの長さであり、位置326における推定上の
ポリアデニル化シグナル（putative polyadenylation s
ignal）（AATAAG）と12−ヌクレオチドポリ（Ａ）テイ
ルを含有している。
MJ2は433ヌクレオチドの長さであり、63アミノ酸のオ
ープンリーデイングフレーム（open reading frame）を
含有する。36カルボキシ末端アミノ酸はMj−AMP2のアミ
ノ酸配列に正しく一致するが、27アミノ末端アミノ酸は
（−1,−３）−ルール（von Heijne,1985,Mol.Biol,18
4,99−105）に従った、予測された（predicated）シグ
ナルペプチド構造を有する。MJ2は5'及び3'末端に、そ
れぞれ、34ヌクレオチド及び210ヌクレオチドの非翻訳
領域を有する。推定上のポリアデニル化シグナル（AATA
AG）は位置399にあり、11ヌクレオチド下流に18−ヌク
レオチドポリ（Ａ）テイルが続いている。
ープンリーデイングフレーム（open reading frame）を
含有する。36カルボキシ末端アミノ酸はMj−AMP2のアミ
ノ酸配列に正しく一致するが、27アミノ末端アミノ酸は
（−1,−３）−ルール（von Heijne,1985,Mol.Biol,18
4,99−105）に従った、予測された（predicated）シグ
ナルペプチド構造を有する。MJ2は5'及び3'末端に、そ
れぞれ、34ヌクレオチド及び210ヌクレオチドの非翻訳
領域を有する。推定上のポリアデニル化シグナル（AATA
AG）は位置399にあり、11ヌクレオチド下流に18−ヌク
レオチドポリ（Ａ）テイルが続いている。
図６及び７は、それぞれ、クローンMJ1及びMJ2のヌク
レオチド配列と推定（deduced）アミノ酸配列を示す。
解放されている四角形は成熟Mj−AMPsのアミノ酸配列に
相当する。停止コドンには星印が付されており、重要な
（potential）ポリアデニル化部位にはアンダーライン
が付されている。
レオチド配列と推定（deduced）アミノ酸配列を示す。
解放されている四角形は成熟Mj−AMPsのアミノ酸配列に
相当する。停止コドンには星印が付されており、重要な
（potential）ポリアデニル化部位にはアンダーライン
が付されている。
実施例 13
発現ベクターpMDB1の構築。
インサートMJ2（Mj−AMP2配列を含有）をBamH I消化
（digeation）によりpEMBL 18+ベクターから除去し、発
現ベクターpFAJ3002のBamH I部位にサブクローンした。
pFAJ3002は発現ベクターpFF19の修飾物（modificatio
n）（Zimmermans等,1990,J Biotechnology,14,333−34
4）であり、EcoR I部位のHind III置換とCaMV35S二重エ
ンハンサー配列（double enhancer sequence）を含有す
る。センス配向のMJ2を含有するクローンをpMDB1と称す
る：その構造は図８に示されている。
（digeation）によりpEMBL 18+ベクターから除去し、発
現ベクターpFAJ3002のBamH I部位にサブクローンした。
pFAJ3002は発現ベクターpFF19の修飾物（modificatio
n）（Zimmermans等,1990,J Biotechnology,14,333−34
4）であり、EcoR I部位のHind III置換とCaMV35S二重エ
ンハンサー配列（double enhancer sequence）を含有す
る。センス配向のMJ2を含有するクローンをpMDB1と称す
る：その構造は図８に示されている。
実施例 14
Mj−AMP 2の細胞外発現のための植物形質転換ベクタ
ーpMDB 2の構築． MJ2 CaMV35SプロモーターインサートをpMDB1からHind
III消化し、pBinRiのユニークHind III部位（unique H
ind III site）にサブクローンした。pBinRiは植物形質
転換ベクターpBin 19の修飾型（modified version）（B
evan,1984,Nucleic Acids,Research,12:22,8711−872
1）であり、、ユニークEcoR1とHind III部位がスイッチ
（switch）されておりかつ野生型（wild type）npt遺伝
子が図９に示されるごとく包含されている。新規な植物
形質転換ベクターをpMDB2と称し、図10に例示する。
ーpMDB 2の構築． MJ2 CaMV35SプロモーターインサートをpMDB1からHind
III消化し、pBinRiのユニークHind III部位（unique H
ind III site）にサブクローンした。pBinRiは植物形質
転換ベクターpBin 19の修飾型（modified version）（B
evan,1984,Nucleic Acids,Research,12:22,8711−872
1）であり、、ユニークEcoR1とHind III部位がスイッチ
（switch）されておりかつ野生型（wild type）npt遺伝
子が図９に示されるごとく包含されている。新規な植物
形質転換ベクターをpMDB2と称し、図10に例示する。
実施例15
Mj−AMP2の空胞発現（vacuolar expression）のため
の植物形質転換ベクターpVT2の構築。
の植物形質転換ベクターpVT2の構築。
Mj−AMP2のトランスジェニック植物の空胞（vacuol
e）への適当なプロセッシング（processing）と輸送（t
ransport）を行うために構築を行った。成熟蛋白質から
のプロペプチドの切断（cleavage）を促進するための追
加のアミノ酸を有する、15アミノ酸配列をコードするヌ
クレオチド配列（Bednarek S.Y.等,1991,Plant Cell 3,
1195−1206）を合成した。PCR技術を使用して、プロペ
プチドについての新規な合成配列をMj−AMP2ペプチドと
シグナルペプチド（MJ2）をコードする植物cDNAに連結
して、5'末端にKpn I部位及び3'末端Pst I部位を含有す
る、VTと称するインサートを得た。kpn I−Pst Iフラグ
メント（PCRにより生成）をpEMBL 18+のkpn I−Pst I部
位中にクローンして、図11に示すpVT0を得た。pVT0のkp
n I−Pst Iフラグメントを植物発現カセットpFF19のkpn
I−Pst I部位にクローンして、図12に示すpVT1を得
た。ついで、pVT1のHind III−EcoR IフラグメントをpB
inRiのHind III−EcoR I部位中にクローンして、図13に
示されるPVT2と称する植物形質転換ベクターを得た。
e）への適当なプロセッシング（processing）と輸送（t
ransport）を行うために構築を行った。成熟蛋白質から
のプロペプチドの切断（cleavage）を促進するための追
加のアミノ酸を有する、15アミノ酸配列をコードするヌ
クレオチド配列（Bednarek S.Y.等,1991,Plant Cell 3,
1195−1206）を合成した。PCR技術を使用して、プロペ
プチドについての新規な合成配列をMj−AMP2ペプチドと
シグナルペプチド（MJ2）をコードする植物cDNAに連結
して、5'末端にKpn I部位及び3'末端Pst I部位を含有す
る、VTと称するインサートを得た。kpn I−Pst Iフラグ
メント（PCRにより生成）をpEMBL 18+のkpn I−Pst I部
位中にクローンして、図11に示すpVT0を得た。pVT0のkp
n I−Pst Iフラグメントを植物発現カセットpFF19のkpn
I−Pst I部位にクローンして、図12に示すpVT1を得
た。ついで、pVT1のHind III−EcoR IフラグメントをpB
inRiのHind III−EcoR I部位中にクローンして、図13に
示されるPVT2と称する植物形質転換ベクターを得た。
実施例 16
植物形質転換。
Framond A等の方法（Biotechnology,1,262−９）を使
用して、アグロバクテリウム（Agrobacterium）菌株LBA
4404 ACH5［pAL 4404］を形質転換してベクターpMDB2又
はpVT2のいずれかを含有させた。
用して、アグロバクテリウム（Agrobacterium）菌株LBA
4404 ACH5［pAL 4404］を形質転換してベクターpMDB2又
はpVT2のいずれかを含有させた。
Hozsch等の方法（1985,Science,227,1229−31）に基
づいて、ニコチン タバクム サムスン（Nicotina tab
acum Samsun）の葉の円盤を使用してタバコの形質転換
を行い、pMDB2又はpVT2を含有するアグロバクテリウム
菌株と共に共培養した。共培養は100μg/mのカナマイ
シンの選択圧（selective pressure）下で行った。
づいて、ニコチン タバクム サムスン（Nicotina tab
acum Samsun）の葉の円盤を使用してタバコの形質転換
を行い、pMDB2又はpVT2を含有するアグロバクテリウム
菌株と共に共培養した。共培養は100μg/mのカナマイ
シンの選択圧（selective pressure）下で行った。
トランスジェニック植物（pMDB2又はpVT2で形質転
換）を再生した。標準ウエスタンブロッテイング技術を
使用して、これらのトランスジェニック植物を、新規に
導入された遺伝子の発現について分析した。導入された
遺伝子の構成的発現を行うことのできる植物が選択さ
れ、自花受粉して種子を与えるであろう。トランスジェ
ニック植物のF1苗木（F1 seedling）は更に分析される
であろう。
換）を再生した。標準ウエスタンブロッテイング技術を
使用して、これらのトランスジェニック植物を、新規に
導入された遺伝子の発現について分析した。導入された
遺伝子の構成的発現を行うことのできる植物が選択さ
れ、自花受粉して種子を与えるであろう。トランスジェ
ニック植物のF1苗木（F1 seedling）は更に分析される
であろう。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ
(72)発明者 カムエ，ブルノー，フイリツプ，アンジ
エロ
ベルギー国．ビイ−1652・アルセンベル
ク．ジエイ．ビイ．ウーテルストラー
ト．109エイ
(72)発明者 ヴアンデルレイデン，ヨセフ
ベルギー国．ビイ−3001・ヘヴエルレ
ー．カスタンエラーン．12
(72)発明者 リース，サラ，ブランウエン
イギリス国．バークシヤー・アルジイ
12・３エツクスエツクス．ブラツクネ
ル．フオーレスト・パーク．マイケルデ
ヴアー・ウエイ．32
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
ＣＡ（ＳＴＮ)
ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＰｕｂＭｅｄ
Claims (16)
- 【請求項１】ミラビリスの種子から単離されたかつ下記
（１）又は（２）のアミノ酸配列を有する抗菌性蛋白
質： - 【請求項２】ミラビリスの種子から単離することのでき
るかつ下記（１）のアミノ酸配列を有する、純粋な蛋白
質、Mj−AMP1: - 【請求項３】ミラビリスの種子から単離することのでき
るかつ下記（２）のアミノ酸配列を有する、純粋な蛋白
質、Mj−AMP2: - 【請求項４】請求の範囲１〜３のいずれかに記載の蛋白
質のアミノ酸配列を有する純粋な蛋白質。 - 【請求項５】合成物である、請求の範囲４に記載の蛋白
質。 - 【請求項６】請求の範囲１〜５のいずれかに記載の蛋白
質をコードする組換え体DNA。 - 【請求項７】請求の範囲６に記載のDNAを含有するベク
ター。 - 【請求項８】植物ゲノムから単離されたDNAを含有す
る、請求の範囲７に記載ベクター。 - 【請求項９】コードされた蛋白質の発現を可能にする、
請求の範囲６に記載のDNAを含有する微生物又は培養細
胞。 - 【請求項１０】請求の範囲６に記載のDNAの発現により
産生される蛋白質。 - 【請求項１１】請求の範囲１〜５又は請求の範囲10のい
ずれかに記載の蛋白質の１種又はそれ以上を含有する抗
菌性組成物。 - 【請求項１２】菌類又はバクテリアを、請求の範囲１〜
５又は10のいずれかに記載の蛋白質又は請求の範囲11に
記載の組成物に暴露することからなる、菌類又はバクテ
リアの撲滅方法。 - 【請求項１３】請求の範囲１〜５又は請求の範囲10のい
ずれかに記載の蛋白質を、これを含有する有機材料から
製造するための抽出方法であって、上記有機材料をマー
セレーション及び溶剤抽出にかけることからなる、殺生
物活性を有する蛋白質を製造するための抽出方法。 - 【請求項１４】蛋白質を引続いて遠心分離、クロマトグ
ラフィー及び透析により精製する、請求の範囲13に記載
の方法。 - 【請求項１５】有機材料がミラビリスの種子からなる、
請求の範囲13又は14に記載の抽出方法。 - 【請求項１６】有機材料が請求の範囲９に記載の微生物
からなる、請求の範囲13又は14に記載の抽出方法。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9105052.6 | 1991-03-11 | ||
| GB919105052A GB9105052D0 (en) | 1991-03-11 | 1991-03-11 | Biocidal proteins |
| GB919105684A GB9105684D0 (en) | 1991-03-19 | 1991-03-19 | Biocidal proteins |
| GB9105684.6 | 1991-03-19 | ||
| PCT/GB1992/000423 WO1992015691A1 (en) | 1991-03-11 | 1992-03-10 | Biocidal proteins |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06505160A JPH06505160A (ja) | 1994-06-16 |
| JP3410734B2 true JP3410734B2 (ja) | 2003-05-26 |
Family
ID=26298561
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50603392A Expired - Fee Related JP3410734B2 (ja) | 1991-03-11 | 1992-03-10 | 殺生物性蛋白質 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0576483B1 (ja) |
| JP (1) | JP3410734B2 (ja) |
| AT (1) | ATE204328T1 (ja) |
| AU (1) | AU652430B2 (ja) |
| BR (1) | BR9205760A (ja) |
| CA (1) | CA2106092A1 (ja) |
| DE (1) | DE69232005T2 (ja) |
| DK (1) | DK0576483T3 (ja) |
| ES (1) | ES2162796T3 (ja) |
| NZ (1) | NZ241910A (ja) |
| WO (1) | WO1992015691A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| DK0576483T3 (da) * | 1991-03-11 | 2001-10-08 | Syngenta Ltd | Biocide proteiner |
| US5514779A (en) * | 1991-06-07 | 1996-05-07 | Zeneca Limited | Biocidal proteins from plants |
| WO1994011511A1 (en) * | 1992-11-12 | 1994-05-26 | Zeneca Limited | Biocidal chitin binding proteins |
| BR9407163A (pt) * | 1993-08-04 | 1996-09-17 | Zeneca Ltd | Proteina antimicrobianca DNA codificador de proteina antimicrobiana sistema biológica e processo para combater fungos e bactérias |
| US20030033617A1 (en) * | 1996-04-10 | 2003-02-13 | Gyula Hadlaczky | Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes |
| US20020160970A1 (en) * | 1996-04-10 | 2002-10-31 | Gyula Hadlaczky | Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes |
| US6077697A (en) * | 1996-04-10 | 2000-06-20 | Chromos Molecular Systems, Inc. | Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes |
| US6025155A (en) * | 1996-04-10 | 2000-02-15 | Chromos Molecular Systems, Inc. | Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes |
| US6121436A (en) | 1996-12-13 | 2000-09-19 | Monsanto Company | Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi |
| GB9714564D0 (en) * | 1997-07-10 | 1997-09-17 | Zeneca Ltd | Composition |
| GB9911933D0 (en) * | 1999-05-21 | 1999-07-21 | Zeneca Ltd | Composition |
| AU2002218447C9 (en) * | 2000-09-28 | 2008-04-17 | Bioriginal Food & Science Corporation | Fad4, Fad5, Fad5-2, and Fad6, fatty acid desaturase family members and uses thereof |
| US20020065397A1 (en) | 2000-10-12 | 2002-05-30 | Joseph Roberts | Protecting therapeutic compositions from host-mediated inactivation |
| AU2005299413A1 (en) | 2004-10-22 | 2006-05-04 | Revivicor, Inc. | Ungulates with genetically modified immune systems |
| WO2007137329A2 (en) * | 2006-05-25 | 2007-12-06 | Hexima Limited | Multi-gene expression vehicle |
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| AR075257A1 (es) * | 2008-02-01 | 2011-03-23 | Hexima Ltd | Sistema de proteccion de plantas contra la infeccion por agentes patogenos |
| US9889184B2 (en) | 2008-08-05 | 2018-02-13 | Hexima Limited | Anti-pathogen systems |
| CA2733267A1 (en) * | 2008-08-05 | 2010-02-11 | Hexima Limited | Plant anti-pathogen systems |
| US9497908B2 (en) | 2011-02-07 | 2016-11-22 | Hexima Limited | Modified plant defensins useful as anti-pathogenic agents |
| CN111990258B (zh) * | 2019-12-27 | 2022-03-01 | 西南大学 | 喜马拉雅紫茉莉种苗规模化繁育方法 |
| WO2023245169A1 (en) | 2022-06-17 | 2023-12-21 | Vestaron Corporation | Antimicrobial peptide combinations |
Family Cites Families (4)
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