CN1310799A - 检测液体样品中抗体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及评价患者免疫状态的方法,包括下列步骤:1)利用免疫测定法测定患者液体样品中抗体的含量,其中样品抗体与抗原、抗体或半抗原形式的配体之间的反应是在样品其它成分的存在下进行的,该配体是指向样品抗体的Fab区的,得到测量结果1,2)利用免疫测定法测定液体样品中抗体的含量,其中样品抗体与抗原、抗体或半抗原形式的配体之间的反应是在没有样品其它成分的存在下进行的,该配体是指向样品抗体的Fab区的,得到测量结果2,以及3)使测量结果1和2相互关联,以表达干扰作用,并用该干扰作用作为参数,用于评价患者的免疫状态。
Description
本发明涉及检测液体样品中特异性抗体的方法。
现有技术
WO 94/11734描述了抗体的双部位免疫测定法,该方法采用化学发光标记和生物素结合配体,所述方法包括如下步骤:(a)将液体样品与与生物素或其功能衍生物结合的配体抗原、抗体或半抗原、针对所检测的抗体的与顺磁性粒子结合的抗体和与抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素或其功能衍生物结合的化学发光性吖啶鎓化合物混合,形成固相配合物,(b)从液相中磁分离固相,(c)如果有的话,在所分离的固相中引发化学发光反应,和(d)分析所分离的固相中化学发光相的存在,指示样品中所述抗体的存在。
现有技术方法特别适合于测量体液中特异性免疫球蛋白的浓度,例如选自IgA、IgD、IgE、IgG、IgM及其小类的特异性免疫球蛋白。
现有技术方法也适合于一类或一小类免疫球蛋白总含量的检测和定量,例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM及其小类。
在现有技术方法的一个优选实施方式中,固相配合物的形成分两步进行,即第一步将样品与生物素结合配体抗原、抗体或半抗原和与顺磁性粒子结合的抗体混合,形成第一固相配合物,第二步向第一固相配合物中加入化学发光性吖啶鎓化合物,形成第二固相配合物。
不过,现有技术方法的实际应用揭示了这样一个事实,在该方法的某些应用中,会发生来自不同于所测量种类的其它类型免疫球蛋白和/或其它类型免疫活性血清组分的干扰而引起所得结果产生误差。
V.Olivieri等发表在《免疫学方法杂志》157(1993)65-72上的“特异性IgE的捕捉试验”一文公开了变应性患者血清中特异性IgE的测量方法,该方法采用单克隆抗人IgE(涂在微量滴定板小孔上)和生物素基化变应原溶液。在单一温育中,IgE通过Fc片段与固相结合,生物素基化变应原与它们的特异性IgE Fab区反应。第二步,加入抗生蛋白链菌素-辣根过氧化物酶缀合物,以揭示固定在固相上的生物素的量。该文研究了来自高水平非特异性IgE和变应原-特异性IgG的干扰。发现该测定不受变应原-特异性IgG的影响。
WO 98/16829公开了这样一种测定法,其中将抗免疫球蛋白与微量滴定板小孔偶联,然后洗涤。然后向孔中加入测试血清,以捕捉试样中所有的目标免疫球蛋白。然后,吸出生物流体样品,洗涤微量滴定板。然后使微量滴定板上所捕捉的抗体与生物素基化抗原接触,洗涤滴定板,加入抗生蛋白链菌素/碱性磷酸酶缀合物,再次洗涤滴定板。现有技术测定法可用于监测标准抗生素疗法对幽门螺杆菌感染的治疗效果。
发明概述
本发明的第一个目的是提供这样一种类型的方法,其中将目标抗体与指向Fc的抗体(该抗体与固体粒子偶联)和指向Fab的配体配合,该方法不会有上述解释的受到来自试样其它组分的干扰这个缺陷。
借助本发明的方法达到第一个目的,其第一方面是由权利要求1-6所限定的,发明的新的必要特征是在加入配体之前另外按顺序进行中间体固相配合物的分离和洗涤,该配合物由带有反应物抗体的粒子和样品抗体组成。
本发明方法基于如下认识:通过另外引入这样一个分离和洗涤顺序,可能产生干扰的液体样品中的过量原料以及可能产生干扰的过量组分(ⅱ)可以从方法中除去,于是消除所述因素在随后步骤中产生干扰的危险。已经惊人地发现,另外的分离和洗涤顺序已经基本上减少了、在某些情况下消除了不同类型免疫活性血清组分之间产生干扰的技术问题。
减少干扰涉及许多技术优点。特别是可以更精确地测量有疑难的血清,它们具有难以预测和不可预测比例的抗体混合物。此外,可以避免抗体的假阳性鉴别。减少干扰还可在比现有技术方法更为广泛的抗体浓度范围内进行精确地测量。
本发明的第二个目的是提供能够评价和/或预测特异性变应性疫苗接种(SAV)的效果。
借助本发明的第二方面达到第二个目的,它是由权利要求7-12所限定的。按照此方面,利用不同类型免疫活性血清组分(例如抗体)之间的干扰的水平、性质和暂时发展作为参数,用于评价特异性变应性疫苗接种治疗效果。于是,已经惊人地发现,所述参数具有关于人免疫状态以及人对所选择的治疗方案的反应的重要信息。
本发明的第三个目的是提供评价患者免疫状态的方法。
借助本发明的第三方面达到第三个目的,它是由权利要求20-31所限定的。按照此方面,利用不同类型免疫活性血清组分(例如抗体)之间的干扰的水平、性质和暂时发展作为参数,用于评价患者免疫状态,特别是用于评价/预测变应性治疗、变应性疫苗接种治疗或特异性变应性疫苗接种治疗的效果。于是,已经惊人地发现,所述参数具有关于人免疫状态以及人对所选择的治疗方案的反应的重要信息。
本发明的第四个目的是提供评价患者变应性治疗效果的方法。
借助本发明的第四方面达到第四个目的,它是由权利要求32-35所限定的。该方面发明基于这样的认识:借助子测定1、A和C(分别见权利要求20、21和29)所得测量、也就是在样品中干扰因素存在下所进行的测量特别可用于评价变应性治疗、变应性疫苗接种治疗和特异性变应性治疗(SAV)的效果。于是,借助该方法所得测量是在相当于体内条件的条件下得到的,因此在评价治疗效果时是更具生理学和临床相关性的测量。
发明的第一方面
第一方面发明的一个优选实施方式的特征在于在一步操作中分别加入步骤(r’)、(r)或(r”)的组分(ⅲ)和步骤(s’)、(s)或(s”)的组分(ⅳ)。
第一方面发明的第一种备选实施方式的特征在于在进行步骤(s’)、(s)或(s”)之前分别洗涤步骤(r’)、(r)或(r”)中所形成的三组分固相配合物,以除去没有配位结合的化合物。
发明的第二方面
特异性变应性疫苗接种(SAV)以前称为特异性免疫疗法或脱敏作用,自本世纪初以来已经用于1型IgE介导的变应性疾病的治疗。
通过SAV获得的一般好处是:a)减少变应性症状和药品消耗,b)提高对眼、鼻和肺中变应原的耐受性,和c)减少皮肤反应性(早期和晚期反应)。
通过SAV所获得的改善的基本机理是未知的,但是从近几十年所进行的大量SAV研究可以得出许多普遍特征:1)IgE总量在治疗阶段中是不变的,2)变应原特异性IgE的量随剂量上升而瞬时增加,然后降回到最初(治疗前)水平,3)IgE的表位特异性和亲和性保持不变,4)变应原特异性IgG、特别是IgG4在SAV过程中迅速升高,5)明显地引发新的Th0/1应答,和6)Th2应答似乎不变。由SAV诱导的效果与特异性IgG起始之间没有相互关联。
SAV诱导新的免疫应答,在治疗阶段中成熟(Th0/1 T-细胞被募集,变应原特异性IgX(X可以是A1、A2、G1、G2、G3、G4、M或D)被引发)。由于新抗体应答IgX的亲和性(或数量/亲和性)已经成熟,IgX可以与IgE有效地竞争变应原,抑制“正常的”基于Th2的变应原应答,后者是以受体结合IgE在肥大细胞和嗜碱细胞表面上的交联为特征的。于是,临床症状得以逐步减轻。
本发明基于这样的假设,如果在有和没有竞争性化合物(IgX和/或任意其它干扰物)的存在下测量特异性IgE的量,个体患者免疫应答的竞争能力测量可以进行计算,该测量将与适当的效果参数相互关联。
大多数现有技术“定量的”IgE测定法测量在没有竞争性化合物存在下的IgE。本发明描述在有和没有任意(血清来源的)竞争性物质的存在下的IgE测量。于是,由权利要求1-6所限定的方法(参照图2a-c)在没有竞争剂的存在下测量IgE,而分别由权利要求7-12的步骤(i’)、(i)、(i”)、(y’)、(y)和(y”)所限定的方法在有竞争剂的存在下测量IgE。
据信,本发明方法的作用方式可以解释如下:如果SAV诱导与IgE竞争与变应原结合的应答,那么通过比较上述两种方法测定的IgE来测量治疗效果应当是可能的。如果两种方法产生相同的结果,那么没有引发干扰物,没有治疗效果。此外,如果后者方法(有竞争性物质的存在)的测量结果低于前者方法(没有竞争性物质的存在)的测量结果,那么竞争性应答已经建立,有治疗效果。
第二方面发明(权利要求7-12)中,在该方法中采用两种子测定法,即,其中样品抗体与变应原之间的反应分别在没有(子测定法(h’)、(h)、(h”)、(x’)、(x)和(x”))和有其它样品成分的存在(子测定法(i’)、(i)、(i”)、(y’)、(y)和(y”))下进行。
在子测定法(h)和(h”)中,化学发光标记可以是吖啶鎓化合物。
子测定法(h’)、(h)和(h”)的一个优选实施方式的特征在于在步骤(a’)、(a)或(a”)中,将组分(ⅰ)、(ⅱ)和(ⅲ)在一步操作中混合(图3b)。
子测定法(h’)、(h)和(h”)的第一种备选实施方式的特征在于在步骤(a’)、(a)或(a”)中,将组分(ⅰ)和(ⅱ)在第一步操作中混合,在第二步操作中加入组分(ⅲ)(图3c)。
第二种备选子测定法(h’)、(h)和(h”)的特征在于在步骤(a’)、(a)或(a”)中,将组分(ⅰ)和(ⅲ)在第一步操作中混合,在第二步操作中加入组分(ⅱ)(图3a)。
第二方面发明的一个优选实施方式的特征在于如下进行步骤(ia’)、(ia)、(ia”)、(ya’)、(ya)或(ya”):混合组分(ⅰ)和(ⅱ),然后加入组分(ⅲ),最后如果要加入的话,加入组分(ⅳ)。
第二方面发明的另一种优选实施方式的特征在于如下进行步骤(ia’)、(ia)、(ia”)、(ya’)、(ya)或(ya”):混合组分(ⅰ)、(ⅱ)和(ⅲ),然后如果要加入的话,加入组分(ⅳ)。
进一步优选的实施方式的特征在于如下进行步骤(j’)、(j)、(j”)、(z’)、(z)或(z”)的比较:计算所述两个步骤的测量结果之比。或者,如下进行比较:计算两个测量结果之间的差异。
发明的进一步实施方式的特征在于在治疗阶段开始和过程中的多个时间点进行步骤(j’)、(j)、(j”)、(z’)、(z)或(z”)的比较,采用任何可以观察到的暂时性改变作为评价和/或预测治疗效果的基础。
发明的第三方面
第三方面发明基于与第二方面相同的认识和假设,区别在于第三方面不限于任何具体的免疫测定程序。另外,按照第三方面,测定法可以用于预测所有类型变应性治疗的效果。
如下可以进行所得两种测量结果的相互关联:计算测量结果之比或者测量结果之间的差异。
术语“变应性治疗”指任意变应性的治疗。术语“变应性疫苗接种治疗”指任意变应性的疫苗接种治疗。术语“特异性疫苗接种治疗(SAV)”如上所述。
定义
本发明中,表达方式“样品的抗体”和“样品抗体”可以指具体的免疫球蛋白,优选是来自IgA、IgD、IgE、IgG、IgM类及其小类的具体免疫球蛋白。一般来说,所述抗体可以是任意的血清或血浆组分,它能够特异性地干扰免疫球蛋白与配体之间的相互作用,该配体呈抗原、抗体或半抗原的形式,例如酶抑制剂和受体。
术语“液体样品”指任意液体或液化样品,包括溶液、乳液、分散液和悬浮液。样品可以是生物流体,例如血液、血浆、血清、尿、唾液和任意其它在生物有机体内排泄、分泌或转运的流体。
表达方式“抗原、抗体或半抗原形式的配体”可以是任意的免疫活性物质。“抗原”可以是变应原,例如来自树、草、杂草等的花粉,霉菌变应原,来自螨(螨虫)和动物的变应原,动物例如猫、狗、马、牛和鸟,叮咬昆虫变应原和来源于昆虫的吸入变应原,和食物变应原;“抗体”可以是单克隆或多克隆抗体,包括重组体和片段化的抗体;“半抗原”可以是它们的碳水化合物部分或片段、酶抑制剂或药物,例如青霉素或其衍生物。
表达方式“标记的配体”指任意包含标记原子或部分(例如放射性原子标记)的配体。
表达方式“标记化合物”指任意适合的免疫测定法中常用的标记系统,包含发光标记、化学发光标记、酶标记、放射性标记、荧光标记和吸收标记。
术语“载体”指任意可以用于免疫测定法中的固体载体,例如微量滴定板、粒子、试管、聚合材料(基质)海绵等。
术语“固体粒子”指任意可以悬浮在液体中的颗粒物,例如玻璃珠、金属(例如铁粒子)、聚合材料粒子等。
根据所用固体粒子的类型,固相配合物从液相中的分离例如可以这样进行:磁分离、过滤、沉积、离心、色谱、柱色谱。
术语“固体顺磁性粒子”指任意可以分散或悬浮在液体介质中的顺磁性粒子,例如“Biomag”粒子(涂有胺末端基团的氧化铁粒子),Advanced Magnetics Inc.,U.S.A.有售,和“Dynabeads”(涂有聚合物的氧化铁),Dynal A.S.,Norway有售。
术语“反应物抗体”指任意能够与包括单克隆和多克隆抗体在内的样品抗体反应的抗体或其它生物特异性试剂,包括重组体和片段化的抗体,例如单克隆抗体、由BioInvent International AB,Sweden供应的“MAb A 5697-1A3(920325)”、由Sigma Chemical Company,Saint Louis,USA供应的“蛋白A”或“蛋白G”。
化学发光化合物优选为吖啶鎓化合物,例如N-羟基琥珀酰亚胺二甲基吖啶鎓酯(NHS-DMAE)。抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素和DMAE可以按照Weeks等《临床化学》29,1474-1479(1983)的方法进行偶联。其它适用于本发明的化学发光化合物的例子是鲁米诺、光泽精和洛粉碱。
下面将结合附图详细描述发明,其中
图1a-b是WO 94/11734所公开的现有技术测定法的两种实施方式(现有技术方法A和B)的图面说明。
图2a-c是适用于权利要求7-9所限定方法(子方法)的三种优选测定法的图面说明。
图3a-c是根据第一方面发明的三种优选测定法的图面说明。
图4-6分别显示现有技术方法B、发明方法1和发明子方法1的化学发光水平,它是特异性IgE浓度的函数。
图7显示现有技术方法B、发明方法1和发明子方法1的相对化学发光水平,它是干扰性抗体含量的函数。
图8-12显示现有技术方法B和发明方法1的相对于预期水平而计算后的化学发光水平,它是稀释因子的函数,数据来自四份接受特异性变应性疫苗接种的患者样品和一份参照样品(图12)。
图13-14分别显示现有技术方法B和方法1的接受特异性变应性疫苗接种和安慰剂治疗的患者在0、6和12个月时的相对应答。
图15显示现有技术方法B所得应答相对于方法1所得应答之比。
图16-18分别显示三种临床效果组(有效、无效和可疑)在0、6、12和24个月时的相对IgE水平。
图19显示方法1所得应答相对于现有技术方法B所得应答之比,它是各种SAV治疗剂量下的时间的函数。
图20显示方法1所得平均应答相对于现有技术方法B所得应答之比,它是分别对临床有效患者和临床无效患者的时间的函数。
图21显示方法1所得应答相对于现有技术方法B所得应答之比,它是对临床有效的个体患者的时间的函数。
图22显示方法1所得应答相对于现有技术方法B所得应答之比,它是对无效的个体患者的时间的函数。
图1a显示WO 94/11734所公开测定法的一种实施方式的原理。该测定法中,样品(ⅰ)中待检测抗体(特异性IgE)与反应物抗体结合,后者是与顺磁性粒子(ⅱ)结合的,形成两组分配合物,保温,然后加入生物素基化的变应原(ⅲ),形成三组分配合物,保温,然后加入与抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素(ⅳ)结合的化学发光吖啶鎓化合物,形成四组分配合物,洗涤,然后测量洗涤后的配合物的化学发光。
图1b显示现有技术测定法的另一种实施方式,其中组分(ⅰ)和(ⅲ)混合,形成两组分配合物,然后加入组分(ⅱ)和(ⅳ),所得混合物保温,形成四组分配合物,洗涤后进行化学发光测量。
在图1a和1b的测定法中,所有样品成分、包括任意对变应原呈特异性的交叉反应IgE抗体和非IgE抗体,都存在于随后导致四组分配合物形成的反应步骤中。
图2a显示第二方面发明的优选实施方式(权利要求2),其中组分(ⅰ)和(ⅱ)混合,保温,形成两组分配合物,洗涤之。然后加入组分(ⅲ),形成三组分配合物,之后加入组分(ⅳ),形成四组分配合物,洗涤后进行化学发光测量。
图2b显示第二方面发明的另一种优选实施方式(权利要求5),相当于图2a所示,但是在一步操作中加入组分(ⅲ)和(ⅳ)。
图2c显示第二方面发明的进一步优选的实施方式(权利要求6),相当于图2a所示,但是在加入组分(ⅳ)之前,所形成的三组分配合物进行洗涤步骤。
在图2a、2b和2c的测定法中,样品成分、包括任意对变应原呈特异性的交叉反应IgE抗体和非IgE抗体,都在与组分(ⅱ)的反应之后被除去了,因此不存在于随后导致四组分配合物形成的反应步骤中。
图3a显示权利要求7-9的子测定法(h’)、(h)和(h”)的一种优选实施方式,其中组分(ⅰ)和(ⅲ)在第一步操作中混合,形成两组分配合物,然后在第二步操作中向其中加入组分(ⅱ),所得混合物保温,形成三组分配合物,洗涤后加入组分(ⅳ),形成四组分配合物,洗涤后进行化学发光测量。
图3b显示权利要求7-9的子测定法(h’)、(h)和(h”)的另一种优选实施方式,其中在一步操作中加入组分(ⅰ)、(ⅱ)和(ⅲ),形成三组分配合物,洗涤后加入组分(ⅳ),形成四组分配合物,洗涤后进行化学发光测量。
图3c显示权利要求7-9的子测定法(h’)、(h)和(h”)的进一步优选的实施方式,其中组分(ⅰ)和(ⅱ)混合形成两组分配合物,然后向其中加入组分(ⅲ),形成三组分配合物,洗涤后加入组分(ⅳ),形成四组分配合物,洗涤后进行化学发光测量。
在图3a、3b和3c的测定法中,样品成分、包括任意对变应原呈特异性的交叉反应IgE抗体和非IgE抗体,都在与组分(ⅱ)和(ⅲ)的反应之后被除去了,因此不存在于随后导致四组分配合物形成的反应步骤中。
下面将参照实施例详细描述发明。
试剂的制备
生物素基化欧洲家刺皮螨
欧洲家刺皮螨提取物(ALK-ABELLóA/S,Hφrsholm,Denmark)按30∶1摩尔比进行生物素基化。将生物素酰氨基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(生物素-XX-NHS,Clontech,USA)溶于二甲基甲酰胺(Merck),最终浓度为25mg/ml。将55.4μl该生物素-XX-NHS溶液加入到1ml2.44mg/ml欧洲家刺皮螨的0.1M NaHCO3,pH 8.5溶液中。试剂在25℃“末端到末端”混合器内保温15分钟。在PD10-柱(Pharmacia)上通过尺寸排阻色谱法从未结合的生物素中纯化出生物素基化提取物。收集含有变应原的部分。将生物素基化欧洲家刺皮螨用磷酸盐缓冲盐水pH 7.2(PBS)稀释,后者含有0.1%人血清白蛋白(Sigma)和0.09%NaN3(Merck)。
生物素基化链格孢
链格孢提取物(ALK-ABELLóA/S,Hφrsholm,Denmark)按30∶1摩尔比进行生物素基化。将生物素酰氨基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(生物素-XX-NHS,Clontech,USA)溶于二甲基甲酰胺(Merck),最终浓度为25mg/ml。将38.6μl该生物素-XX-NHS溶液加入到1ml 1.7mg/ml链格孢的0.1M NaHCO3,pH 8.5溶液中。试剂在25℃“末端到末端”混合器内保温15分钟。在PD10-柱(Pharmacia)上通过尺寸排阻色谱法从未结合的生物素中纯化出生物素基化提取物。收集含有变应原的部分。将生物素基化链格孢用磷酸盐缓冲盐水pH 7.2(PBS)稀释,后者含有0.1%人血清白蛋白(Sigma)和0.09%NaN3(Merck)。
生物素基化疣皮桦(银桦)
疣皮桦花粉提取物(ALK-ABELLóA/S,Hφrsholm,Denmark)按10∶1摩尔比进行生物素基化。将生物素酰氨基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(生物素-XX-NHS,Clontech,USA)溶于二甲基甲酰胺(Merck),最终浓度为25mg/ml。将33.5μl该生物素-XX-NHS溶液加入到1ml4.4mg/ml疣皮桦的0.1M NaHCO3,pH 8.5溶液中。试剂在25℃“末端到末端”混合器内保温15分钟。在PD10-柱(Pharmacia)上通过尺寸排阻色谱法从未结合的生物素中纯化出生物素基化提取物。收集含有变应原的部分。将生物素基化疣皮桦用磷酸盐缓冲盐水pH 7.2(PBS)稀释,后者含有0.1%人血清白蛋白(Sigma)和0.09%NaN3(Merck)。
抗生蛋白链菌素吖啶鎓酯标记的制备
利用Weeks等人的改进方法(参考文献1),将抗生蛋白链菌素(Boehringer Mannheim)与NSP-DMAE-NHS{2’,6’-二甲基-4’-(N-琥珀酰亚胺氧基羰基)苯基-10-(3-硫代丙基)-吖啶鎓-9-羧酸酯}缀合。
抗生蛋白链菌素吖啶鎓酯标记(lite试剂)的制备
将NSP-DMAE-NHS(Chiron Diagnostics,MA,USA)溶于二甲基甲酰胺(Merck),最终浓度为1mg/ml。将0.5ml该溶液加入到1.7ml5.88mg/ml抗生蛋白链菌素的0.1M磷酸钠缓冲液、0.15M NaCl,pH8.5溶液中。在搅拌下,试剂在25℃下保温30分钟。保温后,加入0.4ml20mg/ml 6-氨基正己酸(Sigma)。为了除去未结合的DMAE,将溶液装到PD-10柱(Pharmacia,Uppsala,Sweden)上。缀合的抗生蛋白链菌素用磷酸盐缓冲盐水pH 7.2(PBS)洗脱,收集含有缀合抗生蛋白链菌素的部分。缀合抗生蛋白链菌素用磷酸盐缓冲盐水pH 7.2(PBS)稀释至最终浓度,后者含有0.1%HSA(Sigma)、1%Tween 20(Merck)和0.09%NaN3。
抗体在顺磁性粒子上的固定化
利用磁分离法,将6.5g顺磁性粒子(Chiron Diagnostics,MA,USA)在650ml 0.01M乙酸盐缓冲液pH 5.5中洗涤3次。将粒子在25℃下6.25%戊二醛(Merck)、0.01M乙酸盐缓冲液pH 5.5中活化3小时。将粒子在650ml乙酸盐缓冲液pH 5.5中洗涤6次。在25℃下,将粒子与1625mg单克隆抗IgE抗体(BioInvent International AB,Sweden)偶联16小时,后者特异性地对抗IgE Fc功能域。将粒子在650ml 0.01M乙酸盐缓冲液pH 7.4中洗涤2次。在25℃下,用1083mgHSA(Sigma)的0.01M磷酸盐缓冲液pH 7.4溶液进行过量活性基团的阻滞达20小时。将粒子在650ml 0.01M磷酸盐缓冲液pH 7.4中洗涤,然后在650ml 1M NaCl(Merck)中洗涤3次。将粒子在0.01M磷酸盐缓冲液pH 7.4中洗涤3次,然后用650ml PBS pH 7.4、0.1%HSA(Sigma)洗涤。将粒子再次悬浮至325ml,在50℃下加热处理16小时。将粒子在650ml 0.01M磷酸盐pH 7.4、0.1%HSA中洗涤4次。将粒子在37℃650ml 0.01M磷酸盐pH 7.4、0.1%HSA中加热处理7天,在第3天和第5天交换缓冲液。将粒子用磷酸盐缓冲盐水pH 7.2(PBS)稀释至最终浓度,后者含有0.1%HSA(Sigma)和0.09%NaN3。
测定用洗涤缓冲液
测定用洗涤缓冲液由200mM磷酸钾缓冲液pH 7.4、100mM氯化钾、0.1%Tween 20和0.09%NaN3组成。所有试剂均来自Merck。
实施例1
特异性抗体(特异性IgE)的测定
按照三种不同的方法进行对抗疣皮桦(银桦)变应原的特异性IgE抗体的测定,在每种方法所定义的稀释液中采用上述试剂。所用三种方法是现有技术方法B(图1b)、根据本发明的方法1(图2a,权利要求2)和根据本发明的子方法1(图3a)。
现有技术方法B
该方法在如参考文献2所述Ciba Corning ACS:180 Benchtop免疫测定分析仪上进行。分析仪习惯上装有40秒时间循环软件,以给出两倍于正常水平的保温时间。利用样品探针,将50μl样品和按1∶1500稀释的50μl生物素基化疣皮桦变应原分散在比色杯内。当保温12分钟后比色杯达到试剂探针R2时,将按1∶20稀释的100μl顺磁性粒子和按1∶10000稀释的200μl lite试剂同时分散,将比色杯移下轨道。另外12分又40秒保温后,到达磁体和洗涤位置。用750μl去离子水洗涤两次。洗涤循环完成后,将顺磁性粒子再次悬浮在300μl0.5g/l H2O2的0.1M HNO3溶液中。比色杯进入发光计腔内,在光电倍增管前面加入300μl 25mM NaOH溶液,测量并定量所发射的光子,以相对光单位(RLU)表示。RLU的量与样品中IgE的量成正比。从样品分散到第一次结果的时间为30分钟,以后每40秒钟出一个新结果。结果以RLU实验/RLU背景表示,其中RLU背景是在没有IgE的存在下的化学发光反应。
方法1
该方法在如参考文献2所述Ciba Corning ACS:180 Benchtop免疫测定分析仪的改进版本上进行。利用样品探针,将25μl样品分散在比色杯内,然后立即用固定探针将按1∶20稀释的100μl顺磁性粒子分散。保温8分钟后,将顺磁性粒子磁分离,用1ml洗涤缓冲液洗涤一次。将顺磁性粒子再次悬浮在100μl洗涤缓冲液中,向比色杯内加入按1∶1500稀释的50μl生物素基化疣皮桦变应原。保温10分钟后,将按1∶5000稀释的100μl lite试剂用固定探针分散,另外保温8分钟后,将顺磁性粒子磁分离,用1ml洗涤缓冲液洗涤3次。洗涤循环完成后,将顺磁性粒子再次悬浮在300μl 0.5g/l H2O2的0.1M HNO3溶液中。比色杯进入发光计腔内,在光电倍增管前面加入300μl 25mMNaOH溶液,测量并定量所发射的光子,以相对光单位(RLU)表示。RLU的量与样品中IgE的量成正比。结果以RLU实验/RLU背景表示,其中RLU背景是在没有IgE的存在下的化学发光反应。
子方法1
该方法是在5ml聚苯乙烯试管(Sarstedt)内用手工方法进行的。将25μl样品与按1∶50稀释的50μl生物素基化疣皮桦变应原混合。在37℃下保温12分钟后,加入按1∶20稀释的100μl顺磁性粒子,混合物在37℃下保温5分又30秒,然后将顺磁性粒子磁分离,用3ml洗涤缓冲液洗涤一次,洗涤时使用Magic Lite Multitube Washer(ALK-ABELLóA/S,Hφrsholm,Denmark)。将顺磁性粒子再次悬浮在按1∶10000稀释的200μl lite试剂中,在37℃下保温7分又30秒,然后将顺磁性粒子磁分离,用3ml洗涤缓冲液洗涤2次,洗涤时使用Magic Lite Multitube Washer(ALK-ABELLóA/S,Hφrsholm,Denmark)。将顺磁性粒子再次悬浮在100μl去离子水中,先加入300μl0.5g/l H2O2的0.1M HNO3溶液,再加入300μl 25mM NaOH溶液,在Magic Lite AnalyzerⅡ(ALK-ABELLóA/S,Hφrsholm,Denmark)中测量化学发光反应。测量并定量所发射的光子,以相对光单位(RLU)表示。RLU的量与样品中IgE的量成正比。结果以RLU实验/RLU背景表示,其中RLU背景是在没有IgE的存在下的化学发光反应。
-oOo-
将5名桦花粉敏感性患者的血清汇集样品从140SU/ml至1.1SU/ml连续稀释两倍,得到8份样品。按上述3种方法,将这8份样品和阴性样品(背景)及8份桦花粉敏感性个体样品一起测定,分别见图4、5和6。可以得出结论,利用全部三种方法都可以检测全部所测定样品为阳性。
实施例2
来自其它类的特异性抗体(IgG)的干扰
在不同量竞争性特异性抗体的存在下,利用如实施例1所述三种不同方法进行对抗疣皮桦(银桦)变应原的特异性IgE的测定。具体来说,将5名桦花粉敏感性患者的血清汇集样品按1∶5比率与IgE阴性血清混合,后者含有不同滴定度的兔多克隆抗疣皮桦抗体(ALK-ABELLóA/S,Hφrsholm,Denmark)。对照不含兔抗体。
图7所示结果以回收%表示,它是用样品中兔抗体所得应答相对于对照的计算值。应答以信号/背景给出。回收率低于100%说明竞争性抗体的加入减少了应答,回收率高于100%说明竞争性抗体的加入提高了应答。
可以得出结论,方法1比同时进行的方法具有较少的来自其它类的竞争性抗体的干扰。尽管加入竞争性抗体时,尤其是在大量干扰性抗体的情况下,在子方法1中导致显著的阳性干扰,但干扰在方法1中似乎完全消除了。
实施例3
来自接受特异性变应性疫苗接种(SAV)患者的样品的稀释曲线
利用现有技术方法B和实施例1所述方法1进行对抗链格孢(霉菌)变应原的特异性IgE的测定,但是使用生物素基化链格孢变应原代替生物素基化疣皮桦变应原。在现有技术方法和方法1中,生物素基化链格孢变应原的稀释比例都是1∶400。
将四名接受特异性变应性疫苗接种(SAV)的患者血清连续稀释两倍,得到四份样品,然后各自用两种方法进行分析。参照样品使用5名链格孢敏感性患者的血清汇集样品。
图8-12显示四名SAV患者样品和参照样品的结果。图8-12所示为用不同稀释比血清所得应答相对于预期应答的结果。回收%的计算方法是(稀释因子)*(观测应答)/(未稀释样品的应答)。应答以信号/背景给出。回收率低于100%说明稀释血清的应答低于预期,回收率高于100%说明应答高于预期。回收率高于100%因此说明,用未稀释样品所得应答比真实值偏低。
从图8-12可以明显看出,对SAV样品来说,现有技术方法低估了未稀释SAV样品的真实值,而方法1所估计的结果准确得多。对没有接受SAV的患者血清汇集样品来说,两种方法都是令人满意的,所给出的数值精确得多。
可以得出结论,含有2步洗涤步骤的方法1比现有技术方法B更可靠地估计接受SAV患者血清样品中变应原特异性IgE的量。
实施例4
监测家尘螨SAV过程中的免疫应答
利用现有技术方法B和实施例1所述方法1进行对抗欧洲家刺皮螨(家尘螨)变应原的特异性IgE的测定,但是使用生物素基化欧洲家刺皮螨代替生物素基化疣皮桦变应原。在现有技术方法B和方法1中,生物素基化欧洲家刺皮螨变应原的稀释比例都是1∶250。
从参加临床研究的患者得到血清样品。总共30名患者给以安慰剂治疗(N=14)或SAV,后者使用欧洲家刺皮螨和美洲家刺皮螨变应原的1∶1混合物(Alutard,ALK-ABELLóA/S,Hφrsholm,Denmark)(N=16)。取样时间为治疗前(t=0)、治疗6个月后(t=6)和治疗12个月后(t=12),所有样品都用两种不同方法进行分析。所得结果为相对应答=(信号-背景)/(信号高-背景),其中信号高是具有高含量待检测特异性抗体的血清汇集样品信号。这些结果如图13-14所示。采取现有技术方法B与方法1所得结果之间的比例产生另一套数据。这些结果如图15所示。
结论:
用于测定血清特异性IgE的方法(现有技术方法B或方法1)都不能区别SAV过程中的活性与安慰剂治疗组(图13-14)。不过,现有技术方法和发明方法所得结果之比(比例=IgE(现有技术方法B)t/IgE(方法1)t)惊人地在SAV开始后6和12个月区别开活性与安慰剂治疗组(图15)。而且可能的是,比例截止值大约为1可以预知个体患者是否属于安慰剂或活性治疗组(图17,t=12),即SAV有效参数。
统计学:
利用非参数检验(Mann-Whithey U检验)进行统计学分析。小于0.05的全部两侧随机概率被认为是显著的。NS表示不显著,否则实际概率会标在图中。
实施例5
监测家尘螨SAV过程中的免疫应答
利用两种不同方法进行对抗欧洲家刺皮螨(家尘螨)变应原的特异性IgE抗体的测定,使用按各方法所限定的稀释比的上述试剂。所用两种方法是现有技术方法A(图1a)和根据本发明的方法1(图2a,权利要求2)。
现有技术方法A
该方法在如参考文献3所述Ciba Corning ACS:180 Benchtop免疫测定分析仪的改进版本上进行。利用样品探针,将25μl样品分散在比色杯内,然后立即用固定探针将按1∶20稀释的100μl顺磁性粒子分散。保温8分钟后,将顺磁性粒子磁分离,不洗涤。将顺磁性粒子再次悬浮在100μl洗涤缓冲液中,向比色杯内加入按1∶250稀释的50μl生物素基化欧洲家刺皮螨变应原。保温10分钟后,将按1∶5000稀释的100μl lite试剂用固定探针分散,另外保温8分钟后,将顺磁性粒子磁分离,用1ml洗涤缓冲液洗涤3次。洗涤循环完成后,将顺磁性粒子再次悬浮在300μl 0.5g/l H2O2的0.1M HNO3溶液中。比色杯进入发光计腔内,在光电倍增管前面加入300μl 25mM NaOH溶液,测量并定量所发射的光子,以相对光单位(RLU)表示。RLU的量与样品中IgE的量成正比。结果以RLU实验/RLU背景表示,其中RLU背景是在没有IgE的存在下的化学发光反应。
方法1
该方法在如参考文献2所述Ciba Corning ACS:180 Benchtop免疫测定分析仪的改进版本上进行。利用样品探针,将25μl样品分散在比色杯内,然后立即用固定探针将按1∶20稀释的100μl顺磁性粒子分散。保温8分钟后,将顺磁性粒子磁分离,用1ml洗涤缓冲液洗涤一次。将顺磁性粒子再次悬浮在100μl洗涤缓冲液中,向比色杯内加入按1∶250稀释的50μl生物素基化欧洲家刺皮螨变应原。保温10分钟后,将按1∶5000稀释的100μl lite试剂用固定探针分散,另外保温8分钟后,将顺磁性粒子磁分离,用1ml洗涤缓冲液洗涤3次。洗涤循环完成后,将顺磁性粒子再次悬浮在300μl 0.5g/l H2O2的0.1MHNO3溶液中。比色杯进入发光计腔内,在光电倍增管前面加入300μl25mM NaOH溶液,测量并定量所发射的光子,以相对光单位(RLU)表示。RLU的量与样品中IgE的量成正比。结果以RLU实验/RLU背景表示,其中RLU背景是在没有IgE的存在下的化学发光反应。
-oOo-
本实验操作共涉及28名患者。13名患者没有接受任何治疗,7名患者接受剂量水平为100的SAV治疗,8名患者接受剂量水平为300的SAV治疗。SAV治疗的方法是将欧洲家刺皮螨(家尘螨)变应原通过皮下注射对患者给药,开始在21周的剂量上升期间每周注射,随后在两年期间内,剂量为100或300 SQ-单位,每6-8周给药。
研究采用基于皮刺试验(SPT)和支气管刺激试验(BPT)的效果参数。这里所用临床效果参数如下得到:使用相对皮肤指数(SI(时间=x)-SI(时间=0))将患者分为两组(有效=皮肤敏感性降低,无效=皮肤敏感性不变)。同样,使用相对刺激试验(logBPT(时间=x)-logBPT(时间=0))将患者分为两组(有效=支气管敏感性降低,无效=支气管敏感性不变)。将两种测量结果合并为一个临床效果参数:临床有效=两种测量结果都有效,临床无效=两种测量结果都无效,可疑的临床效果=一种测量结果有效,另一种测量结果无效。
图16-18显示三个临床效果组(有效、无效和可疑)在0(LT_S0_0)、6(LT_S6_0)、12(LT_S12_0)和24(LT_S24_0)个月时的相对IgE水平。时间=0是治疗前的值。具有nn_ⅲ格式的曲线说明代表患者鉴别号(nn)和治疗类型(ⅲ),其中ⅲ=0指没有治疗,ⅲ=100或300分别指剂量水平为100和300的治疗。0.14处的直线是任意的截止值。相对IgE水平定义如下:
log(应答(方法1)/应答(现有技术方法A))t=x-log(应答(方法1)/应答(现有技术方法A))t=0,
其中t=时间,x=0、6、12或24个月,应答=信号/背景。
图16表明,对所有显示临床有效的患者来说,方法1的应答高于现有技术方法A的应答,这说明能够有效地与变应原反应的非IgE竞争性抗体应答已被引发了。图17表明,临床无效组患者没有产生竞争性抗体应答。最后,图18表明,一名临床可疑组患者似乎产生阳性竞争性抗体应答,这仅由皮刺试验检测到。该试验区分开治疗组患者和未治疗组患者,因为对照组患者(nn_0)没有被判断为他们的竞争性抗体应答升高了。
结论
在血清样品中没有和有竞争性物质的存在下所测IgE之比、即分别利用方法1和现有技术方法A所测IgE之比,似乎预示了SAV的效果。此外,在治疗阶段早期可观察到体外测量效果。尽管竞争剂很可能是一种非IgE抗体,不过,任何特异性地与变应原反应的血清物质都预期具有相似的行为。
实施例6
生物素基化Der p:
Der p1仅含有一个赖氨酸残基和NH2-末端氨基酸,它们对生物素基化作用来说是可利用的。如果利用“正常的”标记试剂(它们以NH2-基团为目标)生物素基化粗的Der p提取物,那么所得被标记的Der p提取物趋于对Der p2和其它变应原具有偏敏感性。
如下可以得到更平衡的Der p试剂:将粗的Der p提取物按所述方法进行生物素基化,加入生物素基化Der p1制剂,后者已用能够衍生酪氨酸和组氨酸残基的生物素试剂标记。所得混合物用在下列测定法中。
Der p1的生物素基化:
将Der p1(ALK-Abell6 A/S,Hφrsholm,Denmark)用对重氮苯甲酰生物胞素进行生物素基化,后者是按照制造商说明从稳定的前体对氨基苯甲酰生物胞素(Pierce,USA)制备的。所得对重氮苯甲酰生物胞素溶液的理论浓度为1.82mg/ml(相当于3.38mM),假定对氨基苯甲酰生物胞素向对重氮苯甲酰生物胞素转化的效率为100%。将343μl对重氮苯甲酰生物胞素溶液加入到1ml 1.74mg/ml Der p1的0.1MNaHCO3溶液pH 8.5中,按17∶1摩尔比使Der p1生物素基化,假定Der p1的分子量为25kDa。该方法随后的步骤如前用生物素-XX-NHS酯进行生物素基化所述。
器械:
样品用ADVIA Centaur分析仪(Bayer Diagnostics)进行分析。利用两种方案测定各样品中Der p特异性IgE的量:两步法(T),涉及在加入生物素基化变应原之前的洗涤程序,以除去干扰物(例如非IgE抗体);同时方案(S),在加入生物素基化变应原时允许干扰物(例如非IgE抗体)的存在。方法T和方法S相当于实施例5所述的方法1和现有技术方法A,但是变应原如上所述被生物素基化。
材料和方法:
如下制备生物素基化变应原试剂:按1∶250稀释生物素基化Derp1,将1份该试剂与4份正常的Der p试剂混合,后者是如前所述制备和稀释的。
在SAV开始后0、0.5、1、2、3、6、9、12、18和24个月得到接受Der p SAV的Der p变应性患者血清样品(N=48)。将患者分为四个治疗组:对照(N=15)、剂量_10(N=12)、剂量_100(N=9)和剂量300(N=11),用所示剂量的Der p Alutard治疗24个月。
在SAV之前、之中和之后测量临床参数SPT(皮刺试验)、BPT(支气管刺激试验)和CPT(结膜刺激试验),由按类分析的临床参数进行功效测量。如果两个或三个参数为阳性,则判断SAV有效,如果只有一个参数为阳性或者所有参数都不为阳性,则判断无效。
按照两种方案(T和S)测量血清样品中的IgE,按照LN(Ti/Si)-LN(T0/S0)计算基线校正后的体外功效参数,其中i是时间(>0<=24),0是治疗前的值。
结果:
在LN(Ti/Si)-LN(T0/S0)和所给剂量之间存在明显的剂量应答关系(图19;效果参数的剂量-应答关系),这说明参数测量了患者的剂量依赖性免疫改变。图20(平均效果参数)阐述有和没有临床效果的患者的体外功效参数所得的平均值,个体患者的体外参数显示在图21(有效:个体患者)和图22(无效:个体患者)中。所有阳性临床结果的患者都显示在从6至24月的时间内,体外参数的增加超过对照组的范围,所有这些患者都在接受活性Der p SAV。四名患者(14%)没有明显的临床效果,体外效果参数判断他们有效。
结论:
体外效果参数似乎与患者状态的临床评价充分相关,体外参数预示了SAV 6个月后的SAV结果,而临床效果通常在12或24个月后才明显。
参考文献
1)Ian Weeks,Iraj Beheshti,Frank McCapra,Anthony K.Campbell和J.Stuart Woodhead,《临床化学》,1983,29,1474-1479(1983)。
2)J.Boland,G.Carey,E.Krodel和M.Kwiatkowski,《临床化学》,1990,36,1598-1602。
Claims (38)
1、检测和/或量化液体样品中抗体的方法,包括下列步骤:
(o’)提供液相和两组分固相配合物的混合物,该配合物由(ⅰ)样品的抗体和(ⅱ)针对该样品抗体的反应物抗体组成,该反应物抗体是与固体粒子结合的,
(p’)从液相中分离两组分固相配合物,
(q’)洗涤所分离的两组分固相配合物,以除去没有与配合物结合的化合物,
(r’)向洗涤后的两组分固相配合物中加入(ⅲ)抗原、抗体或半抗原形式的配体的溶液,该配体是可选被标记的,形成三组分固相配合物,
(s’)可选地向三组分固相配合物中加入(ⅳ)标记化合物的溶液,形成四组分固相配合物,
(t’)从溶液中分离分别在步骤(r’)或(s’)中得到的三或四组分固相配合物,
(u’)洗涤所分离的多组分固相配合物,以除去没有与配合物结合的化合物,
(v’)进行洗涤后的经过标记的多组分配合物的检测/测量。
2、检测和/或量化液体样品中抗体的方法,包括下列步骤:
(o)提供液相和两组分固相配合物的混合物,该配合物由(ⅰ)样品的抗体和(ⅱ)针对该样品抗体的反应物抗体组成,该反应物抗体是与固体粒子结合的,
(p)从液相中分离两组分固相配合物,
(q)洗涤所分离的两组分固相配合物,以除去没有与配合物结合的化合物,
(r)向洗涤后的两组分固相配合物中加入(ⅲ)抗原、抗体或半抗原形式的配体的溶液,该配体是与生物素或其功能衍生物结合的,形成三组分固相配合物,
(s)向三组分固相配合物中加入(ⅳ)化学发光化合物的溶液,该化合物是与抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素或其功能衍生物共价结合的,形成四组分固相配合物,
(t)从溶液中分离四组分固相配合物,
(u)洗涤所分离的四组分固相配合物,以除去没有与配合物结合的化合物(ⅳ),
(v)在洗涤后的四组分固相配合物中开始化学发光反应,如果有的话,检测/测量所产生的化学发光。
3、检测和/或量化液体样品中抗体的方法,包括下列步骤:
(o”)提供液相和两组分固相配合物的混合物,该配合物由(ⅰ)样品的抗体和(ⅱ)针对该样品抗体的反应物抗体组成,该反应物抗体是与固体顺磁性粒子结合的,
(p”)从液相中磁分离两组分固相配合物,
(q”)洗涤所分离的两组分固相配合物,以除去没有与配合物结合的化合物,
(r”)向洗涤后的两组分固相配合物中加入(ⅲ)抗原、抗体或半抗原形式的配体的溶液,该配体是与生物素或其功能衍生物结合的,形成三组分固相配合物,
(s”)向三组分固相配合物中加入(ⅳ)化学发光化合物的溶液,该化合物是与抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素或其功能衍生物共价结合的,形成四组分固相配合物,
(t”)从溶液中磁分离四组分固相配合物,
(u”)洗涤所分离的四组分固相配合物,以除去没有与配合物结合的化合物(ⅳ),
(v”)在洗涤后的四组分固相配合物中开始化学发光反应,如果有的话,检测/测量所产生的化学发光。
4、根据权利要求2或3的方法,其特征在于该化学发光化合物是吖啶鎓化合物。
5、根据权利要求1-3任一项的方法,其特征在于步骤(r’)、(r)或(r”)的组分(ⅲ)和步骤(s’)、(s)或(s”)的组分(ⅳ)分别是在一步操作中加入的。
6、根据权利要求1-3任一项的方法,其特征在于在进行步骤(s’)、(s)或(s”)之前分别洗涤步骤(r’)、(r)或(r”)中形成的三组分固相配合物,以除去没有与配合物结合的化合物。
7、评价和/或预测特异性变应性疫苗接种治疗效果的方法,包括下列步骤:
(h’)利用下列测定法,测定液体样品中抗体的含量:
(a’)提供液相和三组分固相配合物的混合物,该配合物由(ⅰ)样品的抗体,(ⅱ)针对该样品抗体的反应物抗体,该反应物抗体是与固体粒子结合的,和(ⅲ)抗原、抗体或半抗原形式的配体组成,
(b’)从液相中分离三组分固相配合物,
(c’)洗涤所分离的三组分固相配合物,以除去没有与配合物结合的化合物,
(d’)向三组分固相配合物中加入(ⅳ)标记化合物的溶液,形成四组分配合物,
(e’)从溶液中分离四组分固相配合物,
(f’)洗涤所分离的四组分固相配合物,以除去没有与配合物结合的化合物(ⅳ),
(g’)进行洗涤后的经过标记的四组分配合物的检测/测量。
(i’)利用下列测定法,测定所述抗体的含量:
(ia’)提供液相和四组分固相配合物的混合物,该配合物由(ⅰ)样品的抗体,(ⅱ)针对该样品抗体的反应物抗体,该反应物抗体是与固体粒子结合的,(ⅲ)抗原、抗体或半抗原形式的配体,和(ⅳ)标记化合物组成,形成四组分固相配合物,
(ib’)从液相中分离四组分固相配合物,
(ic’)洗涤所分离的四组分固相,以除去没有与配合物结合的化合物,
(id’)进行洗涤后的经过标记的四组分配合物的检测/测量。
(j’)比较步骤(h’)和步骤(i’)中所得测量结果,利用该比较结果评价和/或预测特异性变应性疫苗接种治疗效果。
8、评价和/或预测特异性变应性疫苗接种治疗效果的方法,包括下列步骤:
(h)利用下列测定法,测定液体样品中抗体的含量:
(a)提供液相和三组分固相配合物的混合物,该配合物由(ⅰ)样品的抗体,(ⅱ)针对该样品抗体的反应物抗体,该反应物抗体是与固体粒子结合的,和(ⅲ)抗原、抗体或半抗原形式的配体组成,该配体是与生物素或其功能衍生物结合的,
(b)从液相中分离三组分固相配合物,
(c)洗涤所分离的三组分固相配合物,以除去没有与配合物结合的化合物,
(d)向三组分固相配合物中加入(ⅳ)化学发光化合物的溶液,该化合物是与抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素或其功能衍生物共价结合的,形成四组分固相配合物,
(e)从溶液中分离四组分固相配合物,
(f)洗涤所分离的四组分固相配合物,以除去没有与配合物结合的化合物(ⅳ),
(g)在洗涤后的四组分固相配合物中开始化学发光反应,如果有的话,检测/测量所产生的化学发光。
(i)利用下列测定法,测定所述抗体的含量:
(ia)提供液相和四组分固相配合物的混合物,该配合物由(ⅰ)样品的抗体,(ⅱ)针对该样品抗体的反应物抗体,该反应物抗体是与固体粒子结合的,(ⅲ)抗原、抗体或半抗原形式的配体,该配体是与生物素或其功能衍生物结合的,和(ⅳ)化学发光化合物组成,该化合物是与抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素或其功能衍生物共价结合的,形成四组分固相配合物,
(ib)从液相中分离四组分固相配合物,
(ic)洗涤所分离的四组分固相,以除去没有与配合物结合的化合物,
(id)在洗涤后的四组分固相配合物中开始化学发光反应,如果有的话,测量所产生的化学发光。
(j)比较步骤(h)和步骤(ⅰ)中所得测量结果,利用该比较结果评价和/或预测特异性变应性疫苗接种治疗效果。
9、评价和/或预测特异性变应性疫苗接种治疗效果的方法,包括下列步骤:
(h”)利用下列测定法,测定液体样品中抗体的含量:
(a”)提供液相和三组分固相配合物的混合物,该配合物由(ⅰ)样品的抗体,(ⅱ)针对该样品抗体的反应物抗体,该反应物抗体是与固体顺磁性粒子结合的,和(ⅲ)抗原、抗体或半抗原形式的配体组成,该配体是与生物素或其功能衍生物结合的,
(b”)从液相中磁分离三组分固相配合物,
(c”)洗涤所分离的三组分固相配合物,以除去没有与配合物结合的化合物,
(d”)向三组分固相配合物中加入(ⅳ)化学发光化合物的溶液,该化合物是与抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素或其功能衍生物共价结合的,形成四组分固相配合物,
(e”)从溶液中磁分离四组分固相配合物,
(f”)洗涤所分离的四组分固相配合物,以除去没有与配合物结合的化合物(ⅳ),
(g”)在洗涤后的四组分固相配合物中开始化学发光反应,如果有的话,检测/测量所产生的化学发光。
(i”)利用下列测定法,测定所述抗体的含量:
(ia”)提供液相和四组分固相配合物的混合物,该配合物由(ⅰ)样品的抗体,(ⅱ)针对该样品抗体的反应物抗体,该反应物抗体是与固体顺磁性粒子结合的,(ⅲ)抗原、抗体或半抗原形式的配体,该配体是与生物素或其功能衍生物结合的,和(ⅳ)化学发光化合物组成,该化合物是与抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素或其功能衍生物共价结合的,形成四组分固相配合物,
(ib”)从液相中磁分离四组分固相配合物,
(ic”)洗涤所分离的四组分固相,以除去没有与配合物结合的化合物,
(id”)在洗涤后的四组分固相配合物中开始化学发光反应,如果有的话,测量所产生的化学发光。
(j”)比较步骤(h”)和步骤(i”)中所得测量结果,利用该比较结果评价和/或预测特异性变应性疫苗接种治疗效果。
10、评价和/或预测特异性变应性疫苗接种治疗效果的方法,包括下列步骤:
(x’)利用权利要求1的方法测定液体样品中抗体的含量,
(y’)利用下列测定法,测定所述抗体的含量:
(ya’)提供液相和三组分固相配合物的混合物,该配合物由(ⅰ)样品的抗体,(ⅱ)针对该样品抗体的反应物抗体,该反应物抗体是与固体粒子结合的,(ⅲ)抗原、抗体或半抗原形式的配体组成,该配体是被标记的或者是与(ⅳ)标记化合物结合的,形成多组分固相配合物,
(yb’)从液相中分离多组分固相配合物,
(yc’)洗涤所分离的多组分固相,以除去没有与配合物结合的化合物,
(yd’)进行洗涤后的经过标记的多组分配合物的检测/测量。
(z’)比较步骤(x’)和步骤(y’)中所得测量结果,利用该比较结果评价和/或预测特异性变应性疫苗接种治疗效果。
11、评价和/或预测特异性变应性疫苗接种治疗效果的方法,包括下列步骤:
(x)利用权利要求2的方法测定液体样品中抗体的含量,
(y)利用下列测定法,测定所述抗体的含量:
(ya)提供液相和四组分固相配合物的混合物,该配合物由(ⅰ)样品的抗体,(ⅱ)针对该样品抗体的反应物抗体,该反应物抗体是与固体粒子结合的,(ⅲ)抗原、抗体或半抗原形式的配体,该配体是与生物素或其功能衍生物结合的,和(ⅳ)化学发光化合物组成,该化合物是与抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素或其功能衍生物共价结合的,形成四组分固相配合物,
(yb)从液相中分离四组分固相配合物,
(yc)洗涤所分离的四组分固相,以除去没有与配合物结合的化合物,
(yd)在洗涤后的四组分固相配合物中开始化学发光反应,如果有的话,测量所产生的化学发光。
(z)比较步骤(x)和步骤(y)中所得测量结果,利用该比较结果评价和/或预测特异性变应性疫苗接种治疗效果。
12、评价和/或预测特异性变应性疫苗接种治疗效果的方法,包括下列步骤:
(x”)利用权利要求3的方法测定液体样品中抗体的含量,
(y”)利用下列测定法,测定所述抗体的含量:
(ya”)提供液相和四组分固相配合物的混合物,该配合物由(ⅰ)样品的抗体,(ⅱ)针对该样品抗体的反应物抗体,该反应物抗体是与固体顺磁性粒子结合的,(ⅲ)抗原、抗体或半抗原形式的配体,该配体是与生物素或其功能衍生物结合的,和(ⅳ)化学发光化合物组成,该化合物是与抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素或其功能衍生物共价结合的,形成四组分固相配合物,
(yb”)从液相中磁分离四组分固相配合物,
(yc”)洗涤所分离的四组分固相,以除去没有与配合物结合的化合物,
(yd”)在洗涤后的四组分固相配合物中开始化学发光反应,如果有的话,测量所产生的化学发光。
(z”)比较步骤(x”)和步骤(y”)中所得测量结果,利用该比较结果评价和/或预测特异性变应性疫苗接种治疗效果。
13、根据权利要求7、8、9、10、11或12的方法,其中步骤(ia’)、(ia)、(ia”)、(ya’)、(ya)或(ya”)分别是这样进行的:混合组分(ⅰ)和(ⅱ),然后加入组分(ⅲ),最后如果加入的话,加入组分(ⅳ)。
14、根据权利要求7、8、9、10、11或12的方法,其中步骤(ia’)、(ia)、(ia”)、(ya’)、(ya)或(ya”)分别是这样进行的:混合组分(ⅰ)、(ⅱ)和(ⅲ),然后如果加入的话,加入组分(ⅳ)。
15、根据权利要求7、8、9、10、11或12的方法,其中步骤(j’)、(j)、(j”)、(z’)、(z)或(z”)的比较分别是这样进行的:计算所述两个步骤中所得测量结果之比。
16、根据权利要求7、8、9、10、11或12的方法,其中步骤(j’)、(j)、(j”)、(z’)、(z)或(z”)的比较分别是在治疗阶段开始和过程中的多个时间点进行的,采用任何可以观察到的暂时性改变作为评价和/或预测治疗效果的基础。
17、根据权利要求1的方法,其特征在于该标记化合物是发光标记、化学发光标记、酶标记、放射性标记、荧光标记或吸收标记。
18、根据权利要求1的方法,其特征在于该被标记的配体是被放射性原子标记的。
19、根据权利要求1的方法,其特征在于固相配合物从液相中的分离是这样进行的:磁分离、过滤、沉积、离心、色谱或柱色谱。
20、评价患者免疫状态的方法,包括下列步骤:
1)利用免疫测定法测定患者液体样品中抗体的含量,其中样品抗体与抗原、抗体或半抗原形式的配体之间的反应是在样品其它成分的存在下进行的,该配体是指向样品抗体的Fab区的,得到测量结果1,
2)利用免疫测定法测定液体样品中抗体的含量,其中样品抗体与抗原、抗体或半抗原形式的配体之间的反应是在没有样品其它成分的存在下进行的,该配体是指向样品抗体的Fab区的,得到测量结果2,
3)使测量结果1和2相互关联,以表达干扰作用,并用该干扰作用作为参数,用于评价患者的免疫状态。
21、评价患者免疫状态的方法,包括下列步骤:
A)利用下列测定方案(测定法A)测定患者液体样品中抗体的含量:
(Aa)混合(ⅰ)样品的抗体,(ⅱ)针对样品抗体Fc区的抗体,该反应物抗体是与固体载体结合的,和(ⅲ)抗原、抗体或半抗原形式的配体,该配体是指向样品抗体的Fab区的,形成三组分固相配合物和液相的混合物,
(Ab)使三组分配合物与(ⅳ)标记化合物接触,形成四组分配合物和液相的混合物,
(Ac)洗涤四组分固相,以除去没有与配合物结合的化合物,
(Ad)进行洗涤后的经过标记的四组分配合物的检测/测量,得到测量结果A;
B)利用下列测定方案(测定法B)测定所述样品中抗体的含量:
(Ba)混合(ⅰ)样品的抗体,和(ⅱ)针对样品抗体Fc区的反应物抗体,该反应物抗体是与固体载体结合的,形成两组分固相配合物和液相的混合物,
(Bb)洗涤两组分固相配合物,以除去没有与配合物结合的化合物,
(Bc)使洗涤后的两组分固相配合物与(ⅲ)抗原、抗体或半抗原形式的配体,该配体是与样品抗体Fab区结合的,和(ⅳ)标记化合物接触,形成四组分固相配合物和液相的混合物,
(Bd)洗涤四组分固相配合物,以除去没有与配合物结合的化合物,
(Be)进行洗涤后的经过标记的四组分配合物的检测/测量,得到测量结果B;
(E)使测量结果A和B相互关联,以表达干扰作用,并用该干扰作用作为参数,用于评价患者的免疫状态。
22、根据权利要求21的方法,其中步骤Ab是这样进行的:将所述(ⅳ)标记化合物加入到步骤Aa所述三组分固相配合物和液相的混合物中。
23、根据权利要求21的方法,其中步骤Ab是这样进行的:洗涤步骤Aa中所得三组分配合物,以除去没有与配合物结合的化合物,随后将所述(ⅳ)标记化合物加入到洗涤后的三组分配合物中。
24、根据权利要求21-23任一项的方法,其中步骤Bd是这样进行的:同时将所述(ⅲ)配体和所述(ⅳ)标记化合物与两组分配合物进行保温。
25、根据权利要求21-23任一项的方法,其中最初将所述(ⅲ)配体加入到两组分配合物中,形成三组分配合物,然后将其洗涤以除去没有与配合物结合的(ⅲ)配体,然后加入所述(ⅳ)标记化合物,形成四组分配合物。
26、根据权利要求20-25任一项的方法,其中该标记化合物是发光标记、化学发光标记、酶标记、放射性标记、荧光标记或吸收标记。
27、根据权利要求20-26任一项的方法,其中该(ⅲ)配体是被生物素基化的。
28、根据权利要求27的方法,其中该(ⅳ)标记化合物是与抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素或其功能衍生物共价结合的化学发光化合物。
29、评价患者免疫状态的方法,包括下列步骤:
C)利用下列测定方案(测定法C)测定患者液体样品中抗体的含量:
(Ca)混合(ⅰ)样品的抗体,(ⅱ)针对样品抗体Fc区的抗体,该反应物抗体是与固体载体结合的,和(ⅲ)抗原、抗体或半抗原形式的被标记的配体,该配体是指向样品抗体的Fab区的,形成三组分固相配合物和液相的混合物,
(Cb)洗涤三组分固相,以除去没有与配合物结合的化合物,
(Cc)进行洗涤后的经过标记的四组分配合物的检测/测量,得到测量结果C;
D)利用下列测定方案(测定法D)测定所述抗体的含量:
(Da)混合(ⅰ)样品的抗体,和(ⅱ)针对样品抗体Fc区的反应物抗体,该反应物抗体是与固体载体结合的,形成两组分固相配合物和液相的混合物,
(Db)洗涤两组分固相配合物,以除去没有与配合物结合的化合物,
(Dc)使洗涤后的两组分固相配合物与(ⅲ)抗原、抗体或半抗原形式的被标记的配体接触,该配体是与样品抗体Fab区结合的,形成三组分固相配合物和液相的混合物,
(Dd)洗涤三组分固相配合物,以除去没有与配合物结合的化合物,
(De)进行洗涤后的经过标记的三组分配合物的检测/测量,得到测量结果D;以及
(E)使测量结果C和D相互关联,以表达干扰作用,并用该干扰作用作为参数,用于评价患者的免疫状态。
30、根据权利要求29的方法,其中该被标记的配体是被放射性原子标记的。
31、根据权利要求20-30任一项的方法,其中所要评价的患者正在接受变应性治疗、变应性疫苗接种治疗或特异性变应性疫苗接种(SAV)治疗。
32、评价患者变应性治疗效果的方法,包括下列步骤:
A)利用下列测定方案(测定法A)测定所述抗体的含量:
(Aa)混合(ⅰ)样品的抗体,(ⅱ)针对样品抗体Fc区的抗体,该反应物抗体是与固体载体结合的,和(ⅲ)抗原、抗体或半抗原形式的配体,该配体是指向样品抗体的Fab区的,形成三组分固相配合物和液相的混合物,
(Ab)使三组分配合物与(ⅳ)标记化合物接触,形成四组分配合物和液相的混合物,
(Ac)洗涤四组分固相,以除去没有与配合物结合的化合物,
(Ad)进行洗涤后的经过标记的四组分配合物的检测/测量,得到测量结果A;
(E)利用测量结果A作为参数,用于评价治疗效果。
33、评价患者变应性治疗效果的方法,包括下列步骤:
C)利用下列测定方案(测定法C)测定所述抗体的含量:
(Ca)混合(ⅰ)样品的抗体,(ⅱ)针对样品抗体Fc区的抗体,该反应物抗体是与固体载体结合的,和(ⅲ)抗原、抗体或半抗原形式的被标记的配体,该配体是指向样品抗体的Fab区的,形成三组分固相配合物和液相的混合物,
(Cb)洗涤三组分固相,以除去没有与配合物结合的化合物,
(Cc)进行洗涤后的经过标记的四组分配合物的检测/测量,得到测量结果C;
(E)利用测量结果C作为参数,用于评价治疗效果。
34、根据权利要求32或33的方法,其中所要评价的患者正在接受变应性疫苗接种治疗或特异性变应性疫苗接种(SAV)治疗。
35、根据权利要求31-34任一项的方法,其中步骤E)中的评价是在治疗阶段开始和过程中的多个时间点进行的,采用任何可以观察到的暂时性改变作为评价和/或预测治疗效果的基础。
35、根据权利要求20-34任一项的方法,其中该载体是粒子。
36、根据权利要求35的方法,其中该载体是顺磁性粒子。
37、根据权利要求20-36任一项的方法,其中该样品抗体是特异性IgE。
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