CZ20004867A3 - Způsob stanovení protilátky pro vyhodnocování účinku léčení - Google Patents
Způsob stanovení protilátky pro vyhodnocování účinku léčení Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20004867A3 CZ20004867A3 CZ20004867A CZ20004867A CZ20004867A3 CZ 20004867 A3 CZ20004867 A3 CZ 20004867A3 CZ 20004867 A CZ20004867 A CZ 20004867A CZ 20004867 A CZ20004867 A CZ 20004867A CZ 20004867 A3 CZ20004867 A3 CZ 20004867A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- antibody
- complex
- solid phase
- bound
- sample
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 147
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 title claims 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims abstract description 45
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 40
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 28
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 26
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 22
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 95
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 62
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 57
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 53
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 42
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims description 34
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical group N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 32
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 claims description 32
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 28
- 230000003266 anti-allergic effect Effects 0.000 claims description 26
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 26
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 claims description 24
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 21
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 18
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 16
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 16
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 16
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 16
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 15
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 claims description 13
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 12
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 claims description 11
- 230000007815 allergy Effects 0.000 claims description 11
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 claims description 10
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 9
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 8
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 claims description 4
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 claims description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 2
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims 2
- WZZBNLYBHUDSHF-DHLKQENFSA-N 1-[(3s,4s)-4-[8-(2-chloro-4-pyrimidin-2-yloxyphenyl)-7-fluoro-2-methylimidazo[4,5-c]quinolin-1-yl]-3-fluoropiperidin-1-yl]-2-hydroxyethanone Chemical compound CC1=NC2=CN=C3C=C(F)C(C=4C(=CC(OC=5N=CC=CN=5)=CC=4)Cl)=CC3=C2N1[C@H]1CCN(C(=O)CO)C[C@@H]1F WZZBNLYBHUDSHF-DHLKQENFSA-N 0.000 claims 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 abstract 2
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 47
- 230000004044 response Effects 0.000 description 40
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 39
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 22
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 22
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 229960004784 allergens Drugs 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 235000009109 Betula pendula Nutrition 0.000 description 13
- 241000219430 Betula pendula Species 0.000 description 13
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- -1 acridinium compound Chemical class 0.000 description 12
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 12
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 12
- 241000238740 Dermatophagoides pteronyssinus Species 0.000 description 11
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 11
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 9
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 9
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 9
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 9
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- 241000223602 Alternaria alternata Species 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 108010061629 Dermatophagoides pteronyssinus antigen p 1 Proteins 0.000 description 7
- ATYCFNRXENKXSE-MHPIHPPYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 6-[6-[5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]hexanoylamino]hexanoate Chemical compound C([C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1)CCCC(=O)NCCCCCC(=O)NCCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O ATYCFNRXENKXSE-MHPIHPPYSA-N 0.000 description 6
- BAQMYDQNMFBZNA-UHFFFAOYSA-N N-biotinyl-L-lysine Natural products N1C(=O)NC2C(CCCCC(=O)NCCCCC(N)C(O)=O)SCC21 BAQMYDQNMFBZNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 5
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 5
- 235000018185 Betula X alpestris Nutrition 0.000 description 4
- 235000018212 Betula X uliginosa Nutrition 0.000 description 4
- UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N Iron oxide Chemical compound [Fe]=O UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 238000010181 skin prick test Methods 0.000 description 4
- UVGHPGOONBRLCX-NJSLBKSFSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 6-[5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]hexanoate Chemical compound C([C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1)CCCC(=O)NCCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O UVGHPGOONBRLCX-NJSLBKSFSA-N 0.000 description 3
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 3
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- UEEJHVSXFDXPFK-UHFFFAOYSA-N N-dimethylaminoethanol Chemical compound CN(C)CCO UEEJHVSXFDXPFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 3
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 3
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 3
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 3
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 3
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108050001427 Avidin/streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 241001227713 Chiron Species 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000238711 Pyroglyphidae Species 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- BAQMYDQNMFBZNA-MNXVOIDGSA-N biocytin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)NCCCC[C@H](N)C(O)=O)SC[C@@H]21 BAQMYDQNMFBZNA-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 2
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229940046533 house dust mites Drugs 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 2
- 229940043517 specific immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 239000013026 undiluted sample Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RNIPJYFZGXJSDD-UHFFFAOYSA-N 2,4,5-triphenyl-1h-imidazole Chemical compound C1=CC=CC=C1C1=NC(C=2C=CC=CC=2)=C(C=2C=CC=CC=2)N1 RNIPJYFZGXJSDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AAYSIOJYGRABGS-UHFFFAOYSA-N 3-[9-[4-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxycarbonyl-2,6-dimethylphenoxy]carbonylacridin-10-ium-10-yl]propane-1-sulfonate Chemical compound C=1C(C)=C(OC(=O)C=2C3=CC=CC=C3[N+](CCCS([O-])(=O)=O)=C3C=CC=CC3=2)C(C)=CC=1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O AAYSIOJYGRABGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 235000003932 Betula Nutrition 0.000 description 1
- 241000219429 Betula Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 241000238713 Dermatophagoides farinae Species 0.000 description 1
- 108010061608 Dermatophagoides pteronyssinus antigen p 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000193690 San Angelo virus Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 241001661641 Verrucosa Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000013568 food allergen Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000013569 fungal allergen Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 1
- 231100001039 immunological change Toxicity 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- KNJDBYZZKAZQNG-UHFFFAOYSA-N lucigenin Chemical compound [O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O.C12=CC=CC=C2[N+](C)=C(C=CC=C2)C2=C1C1=C(C=CC=C2)C2=[N+](C)C2=CC=CC=C12 KNJDBYZZKAZQNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000011236 particulate material Substances 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 101150046192 sav gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká způsobu detekce specifické protilátky v kapalném vzorku.
Dosavadní stav techniky
Dokument WO 94/11734 popisuje imunologický test na protilátku využívající chemiluminiscenční značky a ligand navázaný na biotin, kde tento test se provádí způsobem zahrnujícím kroky (a) smíchání 10 kapalného vzorku s ligandovým antigenem, protilátkou nebo haptenem navázanými na biotin nebo jejich funkčním derivátem, protilátkou proti detekované protilátce navázanou na paramagnetické částice a chemiluminiscenční akridiniovou sloučeninou navázanou na avidin, streptavidin, nebo jejich funkční derivát, za vytvoření komplexu na 15 pevné fázi, (b) magnetickou separaci pevné fáze od kapalné fáze, (c) zahájení chemiluminiscenční reakce, pokud k ní dojde, na oddělené pevné fázi a (d) analýzu oddělené pevné fáze na přítomnost chemiluminiscenční fáze, která je ukazatelem přítomnosti protilátky ve vzorku.
2o Způsob podle dosavadního stavu techniky je zvláště vhodný pro měření koncentrace specifických imunoglobulinů v tělesných tekutinách, jako jsou například specifické imunoglobuliny zvolené ze skupiny IgA, IgD, IgE, IgG, IgM a jejich podtříd.
Způsob podle dosavadního stavu techniky je vhodný také pro 25 detekci a kvantifikaci celkového obsahu imunoglobulinů v třídě nebo podtřídě, jako jsou IgA, IgD, IgE, IgG, IgM a jejich podtřídy.
Ve výhodném provedení způsobu podle dosavadního stavu techniky se uskutečňuje tvorba komplexu na pevné fázi ve dvou
-- - * W · « Φ « « • · · φ φ φ φ · φ φ · • φ φ φ φ φ φφφφ » φφφ φφ ΦΦ·· · · ·♦ φφφ φφ φφφ
-2krocích, tj. při prvním kroku, kdy se vzorek mísí s ligandovým antigenem, protilátkou nebo haptenem navázaným na biotin a protilátkou navázanou na paramagnetické částice, takže dojde k vytvoření prvního komplexu na pevné fázi, a při druhém kroku, kdy 5 se k prvnímu komplexu na pevné fázi přidá chemiluminiscenční akridiniová sloučenina za vytvoření druhého komplexu na pevné fázi.
Praktické použití tohoto způsobu podle dosavadního stavu techniky však ukázalo, že při některých použitích tohoto způsobu dochází k interferenci jiných typů imunoglobulinů a/nebo jiných typů 10 imunologicky aktivních složek séra, než jsou měřené interakce, což vede k chybám v získaných výsledcích. Článek „Capture assay for specific IgE“, V. Olivieri a další, Journal of Immunological Methods, 157 (1993), 65 - 72 popisuje test pro měření specifických IgE v séru alergických pacientů využívající monoklonální protilátku proti lidskému 15 IgE (potaženou v jamkách mikrotitrační destičky) a biotinylovaných alergenů v roztoku. Při jediné inkubaci se IgE naváže na pevnou fázi prostřednictvím fragmentu Fc a biotinylované alergeny reagují s jejich specifickými oblastmi Fab IgE. Ve druhém kroku se přidá konjugát streptavidin - křenová peroxidáza pro určení množství biotinu 2o fixovaného na pevné fázi. Článek studuje interferenci způsobenou vysokými hladinami nespecifických IgE a IgG specifických pro alergen. Bylo zjištěno, že tento test není ovlivňován IgE specifickými pro alergen.
WO 98/16829 popisuje test, při kterém se antiimunoglobulin 25 naváže na jamku mikrotitrační destičky, která se potom promyje.
Testované sérum se potom přidá do jamky pro zachycení veškerého cílového imunoglobulinu v testovaném vzorku. Potom se vzorek biologické kapaliny odsaje a mikrotitrační destička se promyje. Protilátka zachycená na mikrotitrační destičce se potom vystaví 30 biotinylovanému antigenu, destička se promyje a přidá se konjugát streptavidin/alkalická fosfatáza a destička se znovu promyje. Test
podle dosavadního stavu techniky může být používán pro monitorování účinku léčení na infekci H. pylorí standardní antibíotickou terapií.
Podstata vynálezu
Prvním předmětem vynálezu je poskytnutí způsobu takového typu, při kterém se vytvoří komplex cílové (targeted) protilátky s protilátkou zaměřenou proti oblasti Fc navázanou na pevné částici a s ligandem zaměřeným proti oblasti Fab, který netrpí výše uvedenými nevýhodami interference s jinými složkami testovaného vzorku.
Tohoto prvního předmětu vynálezu se dosahuje použitím způsobu podle vynálezu, jehož první hledisko je definováno v nárocích 1 až 6, přičemž podstatným novým prvkem vynálezu je, že se před přidáním ligandu provede další sekvence separace a praní meziproduktu komplexu na pevné fázi obsahujícího částice s protilátkou reakčního činidla a protilátku vzorku.
Způsob podle vynálezu je založen na zjištění, že přidáním dodatečné sekvence separace a praní může být z kapalného vzorku odstraněn potenciálně interferující nadbytečný materiál stejně jako potenciálně interferující nadbytek složky (ii), což odstraní riziko 20 interference uvedených faktorů v následujících krocích. Překvapivě bylo zjištěno, že dodatečná sekvence separace a praní podstatně snížila, a za určitých okolností odstranila technický problém interference mezi různými typy imunologicky aktivních složek séra.
Snížení interference dosažené tímto způsobem přináší celou 25 řadu technických výhod. Umožní zvláště přesnější měření problematických sér, která mají obtížný a nepředvídatelný poměr směsi protilátek. Navíc je možno vyhnout se falešně pozitivním identifikacím protilátky. Snížení interference také umožní provádění přesných měření v širším rozmezí koncentrace protilátky, než tomu 30 bylo u způsobů podle dosavadního stavu techniky.
* ·· β ·· «·· »« ···
-4Druhým předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí způsobu, který je schopen vyhodnotit a/nebo předpovídat účinek specifické protialergické vakcinace (Specific Allergy Vaccination, SAV). Tohoto druhého předmětu se dosahuje pomocí druhého 5 hlediska vynálezu, které je definováno v nárocích 7 až 12. Podle tohoto hlediska se jako parametry pro vyhodnocování/předpovídání účinku specifické protialergické vakcinace používá povaha a dočasný vývoj interference mezi různými typy imunologicky aktivních složek séra, například protilátek. Bylo tedy překvapivě zjištěno, že tyto io parametry obsahují cenné informace o imunologickém stavu pacienta stejně jako o odpovědi pacienta na zvolené schéma ošetření.
Třetím předmětem vynálezu je poskytnutí způsobu vyhodnocení imunologického stavu pacienta.
Tento třetí předmět vynálezu se uskutečňuje pomocí třetího 15 hlediska vynálezu, které je definováno v nárocích 20 až 31. Podle tohoto hlediska se jako parametru pro vyhodnocování imunologického stavu pacienta, zvláště pro vyhodnocování/předpovídání účinku léčení alergie, léčení protialergickou vakcinací nebo léčení specifickou protialergickou vakcinací používá povaha a dočasný vývoj interference 20 mezi různými typy imunologicky aktivních složek séra, například protilátek. Bylo tedy překvapivě zjištěno, že uvedený parametr obsahuje cenné informace o imunologickém stavu pacienta stejně jako odpověď pacienta na zvolené schéma ošetření.
Čtvrtým předmětem předkládaného vynálezu je poskytnuti 25 způsobu vyhodnocení vlivu protialergického léčení u pacienta.
Tento čtvrtý předmět vynálezu se uskutečňuje pomocí čtvrtého hlediska vynálezu, které je definováno v nárocích 32 až 35. Toto hledisko vynálezu je založeno na zjištění, že měření získané v dílčích testech 1, A a C (viz nároky 20, 21 a 29), tj. měření, které se provádí v 3o přítomnosti interferujících faktorů ve vzorku, je zvláště užitečné pro vyhodnocení účinku protialergického léčení, léčení protialergickou • · * I « «Μ · » w • · · · » « I · · ·» • · · » ····· ·· · ·· ··· 9»a·*
-5vakcinací a specifického protialergického léčení (SAV). Měření získaná tímto způsobem se tedy získávají za podmínek, které odpovídají podmínkám in vivo, čímž se dosahuje fyziologičtějšího a klinicky relevantnějšího měření pro hodnocení efektů léčení.
První hledisko vynálezu
Výhodné provedení prvního hlediska vynálezu je charakterizováno tím, že složka (iii) kroku (r’)t (r) nebo (r”) a složka (iv) kroku (s’), (s) nebo (s”) se přidávají při jedné operaci.
io První alternativní provedení prvního hlediska vynálezu je charakterizováno tím, že se třísložkový komplex na pevné fázi vytvořený v kroku (r’), (r) nebo (r”) před vystvením kroku (s1), (s) nebo (s”) promyje pro odstranění sloučenin, které nejsou navázány v komplexu.
Druhé hledisko vynálezu
Specifická protialergická vakcinace (SAV), dříve známá jako specifická imunoterapie nebo hyposenzitizace, byla používána od počátku tohoto století pro léčení alergických onemocnění typu 1 podmíněných IgE.
Obecný přínos získaný metodou SAV je následující: a) omezení alergických příznaků a spotřeby léků, b) zlepšení tolerance k alergenům v očích, nosu a plicích, a c) snížená kožní reaktivita (reakce časné a pozdní fáze).
Základní mechanismus, který stojí za zlepšením získaným pomocí SAV není znám, ale z četných studií SAV provedených v posledních několika desetiletích je možno vybrat řadu společných rysů: 1) množství celkových IgE se v průběhu léčení nemění, 2) množství IgE specifických pro alergen v průběhu zvyšování dávky
3o přechodně stoupá, potom opět klesá na původní hodnotu (hodnota • · · ·· • Φ ·
-6pred ošetřením), 3) specificia a afinita IgE epitopu zůstává nezměněná, 4) množství IgE specifických pro alergen, zvláště IgE 4, v průběhu SAV prudce stoupá, 5) je zjevně zahájena nová odpověď ThO/1, a 6) odpověď Th2 se zdá být nezměněná. Neexistuje žádná s korelace mezi účinkem indukovaným SAV a nástupem specifických IgG.
SAV indukuje novou imunitní odpověď, která dozrává v průběhu období léčení (vznikají ThO/1 T-buňky, jsou iniciovány IgX specifické pro alergen (X může být A1, A2, G1, G2, G3, G4, M nebo D). Protože io afinita (nebo poměr množství/afinita) nové protilátkové odpovědi, IgX, dozrála, IgX může účinně soutěžit s IgE o alergen (alergeny), přičemž dochází k inhibici „normální“ alergické odpovědi založené na Th2 charakterizované zesítěnim IgE navázaných na receptor na povrchu žírných buněk a bazofilů. Proto bude docházet k postupnému 15 omezování klinických příznaků.
Předkládaný vynález je založen na hypotéze, že pokud se měří množství specifických IgE v přítomnosti a nepřítomnosti soutěžících sloučenin (IgX a/nebo jakákoli jiná interferující látka), je možno vypočíst míru kompetitivní schopnosti imunitních odpovědí 20 u jednotlivého pacienta, a tato míra by korelovala s příslušným parametrem účinku.
Většina „kvantitativních“ testů na IgE podle dosavadního stavu techniky měří IgE v nepřítomnosti soutěžících látek. Předkládaný vynález popisuje měření IgE v přítomnosti a nepřítomnosti jakékoli 25 soutěžící látky (pocházející ze séra). Způsoby definované v nárocích 1 až 6 (srv. obr. 2a - c) měří IgE v nepřítomnosti soutěžících látek, zatímco způsob definovaný v krocích (i’), (i), (i”), (y’)< (y) a (y”) podle nároků 7 až 12 měří IgE v přítomnosti soutěžících látek.
Předpokládá se, že způsob účinku metody podle předkládaného 30 vynálezu může být vysvětlen následujícím způsobem: Jestliže SAV indukuje odpověď, která soutěží s IgE o vazbu alergenu, mělo by být * ·♦♦ •· · ♦· *·· *·
-7možné měřit účinek ošetření porovnáním IgE stanoveným dvěma výše uvedenými metodami. Jestliže tyto dvě metody poskytnou stejný výsledek, nebyla indukována žádná interferující látka a není přítomen žádný účinek. Navíc, jestliže měření naposledy uvedenou metodou (v přítomnosti soutěžících látek) poskytne nižší výsledek než měření první metodou (v nepřítomnosti soutěžících látek), došlo k soutěživé odpovědi a je přítomen účinek léčení.
Ve druhém hledisku vynálezu (nároky 7 až 12) se při tomto způsobu používají dva dílčí testy, tj. dílčí testy, při kterých se reakce mezi protilátkou a alergenem ve vzorku uskutečňuje v nepřítomnosti (dílčí test (h’), (h), (h), (x’), (x) a (x”) a v přítomnosti (dílčí test (i’), (i), (i”), (y )> (y) a (y) jiných složek vzorku.
V dílčích testech (h) a (h”) může být chemiluminiscenční značkou akridiniová sloučenina.
Výhodné provedení dílčích testů (h’), (h) a (h”) je charakterizováno tím, že v krocích (a’), (a) nebo (a”) se složky (i), (ii) a (iii) míchají pří jedné operaci (obr. 3b).
První alternativní provedeni dílčích testů (h*), (h) a (h) je charakterizováno tím, že v krocích (a’), (a) nebo (a”) se složky (i) a (ii) míchají při první operaci a složka (iii) se přidá v druhé operaci (obr. 3c).
Druhé alternativní dílčí testy (h'), (h) a (h”) jsou charakterizovány tím, že v krocích (a'), (a) nebo (a”) se složky (i) a (iii) míchají při první operaci a složka (ii) se přidá ve druhé operaci (obr. 3a).
Výhodné provedení druhého hlediska vynálezu je charakterizováno tím, že krok (ia’), (ia), (ia), (ya1), (ya) nebo (ya”) se provádí míšením složek (i) a (ii), potom přidáním složky (iii), a nakonec, pokud se přidává, přidáním složky (iv).
• *** • · · · · · · · · · « * * * · · ···· ·· · ·· ··· ·· ···
-8Další výhodné provedení druhého hlediska vynálezu je charakterizováno tím, že krok (ia’), (ia), (ia), (ya’), (ya) nebo (ya”) se provádí míšením složek (i), (ii) a (iii), a potom, pokud se přidává, přidáním složky (iv).
Další výhodné provedení je charakterizováno tím, že porovnání kroku (j’), (j), (j”), (z’), (z) nebo (z) se provádí výpočtem poměru měření uvedených dvou kroků. Alternativně se porovnání provádí výpočtem rozdílu mezi dvěma měřeními.
Ještě další provedení vynálezu je charakterizováno tím, že 10 porovnání kroku (j’), (j), (j”), (z’), (z) nebo (z”) se provádí v průběhu času na začátku a v průběhu doby léčení vícekrát, a že jako základ pro vyhodnocení a/nebo předpovědění účinku léčení se použije jakákoli časová změna, která může být pozorována.
is Třetí hledisko vynálezu
Třetí hledisko vynálezu je založeno na stejných poznatcích a stejné hypotéze jako druhé provedení, přičemž rozdíl je v tom, že třetí hledisko není omezeno na nějaký určitý postup imunologického testu. Podle třetího aspektu může být také test použit pro 20 předpovězení účinku všech typů léčení alergie. Dvě získaná měření mohou být uvedena do vztahu výpočtem poměru nebo rozdílu mezi měřením.
Termín „léčení alergie znamená jakékoli léčení alergie. Termín „vakcinační léčení alergie'1 znamená jakékoli vakcinační léčení alergie.
Termín „léčení specifickou vakcinací“ (Specific Vaccination Treatment, SAV) se popisuje výše.
Definice
V předkládaném vynálezu znamenají výrazy „protilátka vzorku 30 a “vzorková protilátka jakýkoli specifický imunoglobulin, s výhodou • · * ♦ « »· · φ «« • · · · * « · φ ·* • · · φ , « · φ «· ·♦ ♦ ·· ♦·· «··
-9specifický imunoglobulin ze tříd IgA, IgD, IgE, IgG, IgM a jejich podtřid. Tato protilátka může být obecně jakákoli složka krevního séra nebo plasmy, která je schopna specificky interferovat s interakcí mezi imunoglobuliny a ligandem ve formě antigenu, protilátky nebo haptenu, 5 například enzymové inhibitory a receptory.
Termín „kapalný vzorek“ znamená jakýkoli kapalný nebo zkapalněný vzorek, včetně roztoků, emulzí, disperzí a suspenzí. Vzorkem může být biologická kapalina, jako je krev, plasma, sérum, moč, sliny a jakákoli jiná kapalina, která je vylučována, sekrenována io nebo transportována uvnitř biologického organismu.
Výraz „ligand ve formě antigenu, protilátky nebo haptenu“ může být jakákoli imunologicky aktivní látka. „Antigen“ může být alergen, například pyl ze stromů, trav, plevelů atd., plísňové alergeny, alergeny roztočů a zvířat, jako jsou kočky, psi, koně, dobytek a ptáci, alergeny 15 bodavého hmyzu a inhalované alergeny pocházející ze hmyzu a potravinářské alergeny; „protilátka“ může být monoklonální nebo polyklonální protilátka včetně rekombinantních a fragmentovaných protilátek; a „hapten mohou být uhlohydrátové skupiny nebo jejich fragmenty, inhibitory enzymů nebo léčiva, například penicilín nebo 20 jejich deriváty.
Výraz „značený ligand“ znamená jakýkoli ligand obsahující značený atom nebo část, například radioaktivně značený atom.
Výraz „značící sloučenina“ (label compound) znamená jakýkoli systém pro značení běžně používaný v imunologických testech 25 zahrnující luminiscenční značení, chemiluminiscenční značení, enzymatické značení, radioaktivní značení, fluorescenční značení a absorbanční značení.
Termín „nosič“ znamená jakýkoli pevný nosič, který může být použit při imunologickém testu, například mikrotitrační destička, 30 částice, trubička, houba polymerního materiálu (matrice) atd.
• · · · · ♦·· ·· · • · · 0 0 0 · 0 00 0 • · · *0 0 0*0 ·* · ·· ·0· ♦· 0*0
- 10 Termín „pevná částice“ znamená jakýkoli materiál ve formě částic, který může být suspendován v kapalině, například skleněné kuličky, kovové, například železné částice, částice polymerního materiálu apod.
s Separace komplexu pevné fáze od kapalné fáze může být prováděna v závislosti na typu použitých pevných částic například magnetickým dělením, filtrací, sedimentací, centrifugací, chromatografii nebo chromatografii na koloně.
Termín „pevná paramagnetická částice“ znamená jakoukoli io paramagnetickou částici, která může být dispergována nebo suspendována v kapalném médiu, například částice „Biomag“ (částice oxidu železa potažené skupinami zakončenými aminovými skupinami) dodávané firmou Advanced Magnetics lne., USA a „Dynabeads“ (částice oxidu železa potažené polymerem) dodávané firmou Dynal A. 15 S., Norsko.
Termín „reaktivní protilátka“ znamená jakoukoli protilátku nebo jiné biologicky specifické reakčni činidlo schopné reagovat se vzorkem protilátky, zahrnující monoklonální a polyklonální protilátky včetně rekombinantních a fragmentovaných protilátek, například monoklonální 20 protilátka, „MAb A 5697-1A3 (920325)“, dodávaná firmou Btolnvent International AB, Švédsko, „Protein A“ nebo „Protein G“ dodávané firmou Sigma Chemical Company, Saint Louis, USA.
Chemiiuminiscenční sloučenina je s výhodou akridiniová sloučenina, jako je N-hydroxysukcinimiddimethylakridiniumester (NHS25 DMAE). Avidin/streptavidin a DMAE mohou být navázány metodami popsanými v Weeks a další, Clinical Chem., 29, 1474 - 1479 (1983).
Další příklady chemiluminiscenčních sloučenin vhodných pro použití v rámci předkládaného vynálezu jsou luminol, lucigenin a lophin.
• 0 • · ·· · * · · ··· • a · • · 0 a ·· · «· »··
- 11 Přehled obrázků na výkresech
V následující části bude vynález popsán podrobněji na obrázcích, ve kterých:
Obr. 1a - b jsou schematická znázornění dvou provedení (způsob A 5 a B podle dosavadního stavu techniky) testů podle dosavadního stavu techniky popisovaných ve WO 94/11734.
Obr. 2a - c jsou schematická znázornění tří výhodných testů vhodných *
pro použití v metodách definovaných v nárocích 7 až 9 (vedlejší τ metody).
io Obr. 3a - c jsou schematická znázornění tří výhodných testů podle prvního hlediska vynálezu.
Obr. 4 - 6 ukazují úroveň chemiluminiscence jako funkci koncentrace specifického IgE pro způsob podle dosavadního satvu techniky B, způsob 1 podle vynálezu a vedlejší metodu 1 podle vynálezu.
Obr. 7 ukazuje relativní hladinu chemiluminiscence jako funkci obsahu interferujících protilátek podle dosavadního stavu techniky metoda B, metoda 1 podle vynálezu a vedlejší metoda 1 podle vynálezu.
Obr. 8 - 12 ukazují vypočtenou úroveň chemiluminiscence vzhledem k očekávané úrovni jako funkci faktoru ředění pro metodu B podle dosavadního stavu techniky a metodu 1 podle vynálezu pro čtyři vzorky pacientů léčených specifickou protialergickou vakcinací a jeden referenční vzorek (obr. 12).
Obr. 13-14 ukazují relativní odpověď pro pacienty léčené specifickou 25 protialergickou vakcinací a léčené placebem v čase 0, 6 a 12 měsíců pro metodu B podle dosavadního stavu techniky a metodu 1.
Obr. 15 ukazuje poměr odpovědi získaných metodou B podle dosavadního stavu techniky k odpovědím získaným metodou 1.
• « ··· ·· · ·♦ ···
-12Obr. 16-18 ukazují relativní hladiny IgE v časech 0, 6, 12 a 24 měsíců pro tri skupiny rozdělené podle klinického účinku, tedy účinkuje, neúčinkuje a pochybný účinek.
Obr. 19 ukazuje poměr odpovědí získaných metodou 1 k odpovědím 5 získaným metodou B podle dosavadního stavu techniky jako funkci času pro různé dávky léčení SAV.
Obr. 20 ukazuje poměr středních hodnot odpovědí získaných metodou 1 k odpovědím získaným metodou B podle dosavadního stavu techniky jako funkci času pro pacienty io s klinickým účinkem a pacienty bez klinického účinku.
Obr. 21 ukazuje poměr odpovědí získaných metodou 1 k odpovědím získaným metodou B podle stavu techniky jako funkci času pro jednotlivé pacienty, u kterých se projevil klinický účinek.
Obr. 22 ukazuje poměr odpovědí získaných metodou 1 k odpovědím 15 získaným metodou B podle dosavadního stavu techniky jako funkci času pro jednotlivé pacienty, u kterých se neprojevil účinek.
Obr. 1a ukazuje princip jednoho provedení testu popsaného ve WO 94/11734. Při testu se smísí protilátka (specifický IgE), která má 20 být detekována ve vzorku (i) s reaktivní protilátkou navázanou na paramagnetickou částici (ii) za vytvoření dvojsložkového komplexu, který se inkubuje, a potom se přidá biotinylovaný alergen (iii) za vytvoření trojsložkového systému, který se inkubuje a potom se přidá chemiluminiscenční akridiniová sloučenina navázaná na 25 avidin/streptavidin (iv) za vytvoření čtyřsložkového komplexu, který se promyje a měří se chemiluminiscence promytého komplexu.
Obr. 1b ukazuje další provedení testu podle dosavadního stavu techniky, při kterém se složky (i) a (iii) míchají za vytvoření dvousložkového komplexu, potom se přidají složky (ii) a (iv) a získaná * * · · i ··♦ • · · · · * • · ♦ · · ·· · ·· ···
-13směs se inkubuje za vytvoření čtyřsložkového komplexu, který se promyje a u kterého se provede měření chemiluminiscence.
V testech podle obr. 1a a 1b jsou přítomny všechny složky vzorku včetně křížově reagujících protilátek IgE a protilátek jiných než 5 IgE specifické pro alergen, při následujících reakcích vedoucích k vytvořeni čtyřsložkového komplexu.
Obr. 2a ukazuje výhodné provedení (nárok 2) druhého hlediska vynálezu, při kterém se složky (i) a (ii) smíchají a inkubují za vytvoření dvousložkového komplexu, který se promyje. Potom se přidá složka io (iii) za vytvoření třísložkového komplexu, potom se přidá složka (iv) za vytvoření čtyřsložkového komplexu, který se promyje a u kterého se měří chemiluminiscence.
Obr. 2b ukazuje další výhodné provedení (nárok 5) druhého hlediska vynálezu, které odpovídá provedení ukázanému na obr. 2a 15 s tím rozdílem, že složky (iii) a (iv) se přidají při jedné operaci.
Obr. 2c ukazuje další výhodné provedení (nárok 6) druhého hlediska vynálezu, které odpovídá provedení ukázanému na obr. 2a s tím rozdílem, že vytvořený třísložkový komplex se promyje před přidáním složky (iv). Při testech podle obr. 2a, 2b a 2c se složky 20 vzorku, včetně jakýchkoli křížově reagujících protilátek IgE a protilátek jiných než IgE specifických pro alergen odstraní po reakci se složkou (ii) a tím již nejsou přítomny v následujících reakčních krocích vedoucích k vytvoření čtyřsložkového komplexu.
Obr. 3a ukazuje výhodné provedeni vedlejších testů (h‘), (h) a 25 (h”) podle nároků 7 až 9, kde složky (i) a (iii) se smíchají při první operaci za vytvoření dvousložkového komplexu, ke kterému se potom přidá ve druhé operací složka (ii) a získaná směs se inkubuje za vytvoření třísložkového komplexu, který se promyje před přidáním složky (iv) za vytvoření čtyřsložkového komplexu, který se potom 30 promyje před provedením chemiluminiscenčního měření.
« «
• · · • ··· • « ·· ··· • · · ··
- 14 Obr. 3b ukazuje další výhodné provedení vedlejších testů <h’), (h) a (h”) podle nároků 7 až 9, při kterém se složky (i) a (ii) smíchají za vytvoření dvousložkového komplexu, ke kterému se potom přidá složka (iii) za vytvoření třísložkového komplexu, který se promyje před přidáním složky (iv) za vytvoření čtyřsložkového komplexu, který se také promyje před provedením chemiluminiscenčního měření.
V testech podle obr. 3a, 3b a 3c se odstraní složky vzorku včetně jakýchkoli křížově reagujících protilátek IgE a protilátek jiných než IgE specifických pro alergen, před reakcí se složkami (ii) a (iii) a tím již nejsou přítomny v následujícím reakčním kroku vedoucím k vytvoření čtyřsložkového komplexu.
V následujícím textu bude vynález popsán podrobněji na příkladech.
* ' Λ
Příklady provedení vynálezu
Příprava reakčních činidel
Biotinylovaný Dermatophaqoides pteronyssinus
Extrakt Dermatophagoides pteronyssinus (ALK-ABELLÓ A/S, HOrsholm, Dánsko), se biotinyluje v molárním poměru 3:1. Biotinamidokaproát-N-hydroxysukcinimidester (Biotin-XX-NHS,
Clontech, USA) se rozpustí v dimethylformamidu (Měrek) na konečnou koncentraci 25 mg/ml. 55,4 yl tohoto roztoku Biotin-XX-NHS se přidá k 1 ml 2,44 mg/ml Dermatophagoides pteronyssinus v 0,1 M NaHCO3, pH 8,5. Reakční činidla se inkubují 15 min při 25 °C v mísiči typu „end over end. Biotinylovaný extrakt se čistí od nenavázaného biotinu size exclusion chromatografií na koloně PD10-column (Pharmacia). Frakce obsahující alergeny se jímá. Biotinylovaný Dermatophagoides pteronyssinus se zředí fyziologickým roztokem s fosfátovým pufrem pH 7,2 (PBS), obsahujícím 0,1% lidský sérový albumin (Sigma) a 0,09% NaN3 (Měrek).
| • 4 | *44 | 4 * | * |
| 4 · 4 | 4 | 4 4 4 | 4 |
| 4 ♦ | 4 | 4 4 | 4 |
| 44 | *44 | 44 | 44 4 |
• 44 • 4·
444
- 15 Biotinylovanv Alternaria alternata
Extrakt Alternaria alternata (ALK-ABELLÓ A/S, H0rsholm, Dánsko) se biotinyluje v molárním poměru 30 : 1. BiotinamidokaproátN-hydroxysukcinimidester (Biotin-XX-NHS, Clontech, USA) se rozpustí v dimethylformamidu (Měrek) na konečnou koncentraci 25 mg/ml. 38,6 μΙ tohoto roztoku Biotin-XX-NHS se přidá k 1 ml 1,7 mg/ml Alternaria alternata v 0,1 M NaHCO3, pH 8,5. Reakční činidla se inkubují 15 min při 25 °C v mísiči typu „end over end“. Biotinylovaný extrakt se čistí od nenavázaného biotinu size exclusion chromatografií na koloně PD10-column (Pharmacia). Frakce obsahující alergeny se jímá. Biotinylovaný Alternaria alternata se zředí fyziologickým roztokem s fosfátovým pufrem pH 7,2 (PBS), s obsahem 0,1% lidského sérového albuminu (Sigma) a 0,09% NaN3 (Měrek).
Biotinylovaná Betula verrucosa (Silver birch, bříza bradavičnatá)
Extrakt z pylu Betula verrucosa (ALK-ABELLÓ A/S, H0rsholm, Dánsko) se biotinyluje v molárním poměru 10:1. Biotinamidokaproát-N-hydroxysukcinímidester (Biotin-XX-NHS, Clontech, USA) se rozpustí v dimethylformamidu (Měrek) na konečnou koncentraci 25 mg/ml. 33,5 μΙ tohoto roztoku Biotin-XX-NHS se přidá k 1 ml 4,4 mg/ml Betula verrucosa v 0,1 M NaHCO3, pH 8,5. Reagencie se inkubují 15 min při 25 °C v mísiči typu „end over end“. Biotinylovaný extrakt se čistí od nenavázaného biotinu size exclusion chromatografií na koloně PD10-column (Pharmacia). Frakce obsahující alergeny se jímá. Biotinylovaná Betula verrucosa se zředí fyziologickým roztokem s fosfátovým pufrem pH 7,2 (PBS), obsahujícím 0,1% lidský sérový albumin (Sigma) a 0,09% NaN3 (Měrek).
• · ··· ·· * ·· <·· ·· «·*
- 16 Příprava značky streptavidinakridiníového esteru
Streptavidin (Boehringer Mannheim) byl konjugován s NSPDMAE-NHS {(2!,6'-dimethyl-4'-(N-sukcinimidyloxykarbonyl)fenyl-10-(3-sulfopropyl)-akridinium-9-karboxylát} s použitím modifikované metody Weeks a další (lan Weeks, Iraj Beheshti, Frank McCapra, anthony K. Campbell a J. Stuart Woodhead, Clinicai Chemistry, 1983, 29, 1474 1479 (1983).
Výroba značky streptavidin-akridiniového esteru (činidlo lite)
NSP-DMAE-NHS (Chiron Diagnostics, MA, USA) se rozpustí v dimethylformamidu (Měrek) na konečnou koncentraci 1 mg/ml. K 0,5 ml tohoto roztoku se přidá 1,7 ml 5,88 mg/ml streptavidinu v0,1M pufru s fosforečnanem sodným, 0,15 M NaCI, pH 8,5. Reagencie se inkubují 30 min při 25 °C za míchání. Po inkubaci se přidá 0,4 ml 20 mg/ml kyseliny 6-amino-n-hexanové (Sigma). Pro odstranění nenavázané DMAE se roztok nanese na kolonu PD-10 column (Pharmacia, Uppsala, Švédsko). Konjugovaný streptavidin se eluuje fyziologickým roztokem s fosfátovým pufrem pH 7,2 (PBS) a frakce obsahující konjugovaný streptavidin se jímá. Konjugovaný streptavidin se ředí na konečnou koncentraci fyziologickým roztokem s fosfátovým pufrem, pH 7,2 (PBS) s obsahem 0,1% HSA (Sigma), 1% Tween 20 (Měrek) a 0,09% NaN3.
Imobilizace protilátky na paramaqnetické Částice
6,5 g paramagnetických částic (Chiron Diagnostics, MA, USA) se třikrát promyje v 650 ml 0,01 M acetátového pufru pH 5,5 s použitím magnetické separace. Částice se aktivuji v 6,25% glutaraldehydu (Měrek), 0,01 M acetátovém pufru pH 5,5 3 hod při 25 °C. Částice se promyjí šestkrát v 650 ml acetátového pufru pH 5,5. Částice se navážou s 1625 mg monoklonální protilátky anti-lgE • · ·· · ·· ··· ·♦ ··«
-17(Biolnvent International AB, Švédsko) specifické proti doméně Fc IgE, 16 hod při 25 °C. Částice se dvakrát promyjí 650 ml 0,01 M fosfátového pufru pH 7,4. Blokování nadbytečných aktivních skupin se provede 1083 mg HSA (Sigma) rozpuštěnými v 0,01 M fosfátovém 5 pufru pH 7,4 20 hod při 25 °C. Částice se promyjí 650 ml 0,01 M fosfátového pufru pH 7,4 a potom třikrát 650 ml 1 M NaCI (Měrek).
Částice se třikrát promyjí v 0,01 M fosfátového pufru pH 7,4 a potom 650 ml PBS pH 7,4, 0,1% HSA (Sigma). Částice se resuspendují v 325 ml a působí se na ně teplem po dobu 16 hod při 50 °C. Částice io se čtyřikrát promyjí v 650 ml 0,01 M fosfátového pufru pH 7,4, 0,1%
HSA. Na částice se působí teplem při 37 Ό 7 dnů 650 ml 0,01 M fosfátového pufru pH 7,4, 0,1% HSA, přičemž výměna pufru se provede v den 3 a den 5. Částice se zředí na konečnou koncentraci fyziologickým roztokem s fosfátovým pufrem pH 7,2 (PBS) s obsahem 15 0,1 % HSA (Sigma) a 0,09% NaN3.
Promyvací pufr pro testy
Promývací pufr pro testy je složen z 200 mM pufru fosforečnanu draselného pH 7,4, 100 mM chloridu draselného, 0,1% Tween 20 a 20 0,09% NaN3. Všechna činidla jsou od firmy Měrek.
Příklad 1
Určení specifické protilátky (specifického IgE)
Určení specifických protilátek IgE proti alergenu Betula
Verrucosa (Silver Birch, bříza bradavičnatá) bylo prováděno třemi různými metodami použitím činidel popsaných výše v pracovních ředěních definovaných u každé metody. Použité tri metody byly metoda B podle dosavadního stavu techniky (obr. 1b), metoda 1 podle vynálezu (obr. 2a, nárok 2) a vedlejší metoda 1 podle vynálezu (obr.
3a).
| • · | «» | « « | 0 |
| • 0 0 | • 4 | * 0 | Φ |
| • 0 | • | 0 0 | * |
| 00 | • 0· | • · | 00 0 |
Metoda B podle stavu techniky
Tato metoda se provádí na stolním analyzátoru Ciba Corning ACS: 180 Benchtop Immunoassay Analyzer popsaném v odkazu 2 (J. Boland, G. Carey, E. Krodel a M. Kwiatkowski, Clinical Chemistry, 1990, 36, 1598 - 1602). Analyzátor je na zakázku opatřen softwarem s cyklem v trvání 40 s pro dosažení inkubačních časů dvojnásobných proti normálu. 50 μί vzorku a 50 μ) biotinylovaného alergenu Betula verrucosa zředěného 1 : 1 500 se rozplní vzorkovací pipetou do kyvety. Když kyveta po 12 min inkubace dosáhne pipety na reagencie R2, současně se přidá 100 μΙ paramagnetických částic ředěných 1 : 20 a 200 μί činidla lite zředěného 1:10 000 a kyveta se pohybuje dolů po pásu. Magnety a promývací stanice jsou dosaženy po dalších 12 min a inkubaci 40 s. Dvakrát se provede promytí 750 μί deionizované vody. Po ukončení pracího cyklu se paramagnetické částice resuspendují v 300 μΙ 0,5 g/l H2O2 v 0,1 Μ HNO3. Kyveta vstoupí do luminometrické komory a před fotonásobičem se přidá 300 μΙ 25 mM roztoku NaOH a měří se fotony emitovaného světla, které se kvantifikují a vyjádří jako relativní světelné jednotky (RLU). Množství RLU je úměrné množství IgE ve vzorku. Doba od rozplnění vzorku do prvního výsledku je 30 min a nový výsledek následuje každých 40 s. Výsledky jsou vyjádřeny jako RLU experimentu/RLU pozadí, kde RLU pozadí byla chemiiumuniscenční reakce v nepřítomnosti IgE.
Metoda 1
Tato metoda se provádí na analyzátoru Ciba corning ACS: 180 Benchtop Immunoassay Analyzer v modifikované verzi, popsaném, výše. 25 μΙ vzorku se pipetuje vzorkovací pipetou do kyvety a ihned se přidá 100 μΙ paramagnetických částic zředěných 1 : 20 pomocí fixní pipety. Po 8 min inkubace se paramagnetické částice magneticky oddělí a jednou promyjí 1 ml promývacího pufru. Paramagnetické » · ·
• i · částice se resuspendují ve 100 μΙ promývacího pufru a do kyvety se přidá 50 μΙ biotinylovaného alergenu Betula verrucosa zředěného 1 : 1 500. Po 10 min inkubace se napipetuje fixní pipetou 100 μΙ činidla lite zředěného 1 : 5 000 a po dalších 8 min inkubace se paramagnetické částice magneticky oddělí a třikrát promyjí 1 ml promývacího pufru. Po ukončení pracího cyklu se paramagnetické částice resuspendují v 300 μΙ 0,5 g/l H2O2 v 0,1 Μ HNO3, Kyveta vstupuje do luminometrické komory a před fotonásobičem se přidá 300 μΙ 25 mM roztoku NaOH a měří se a kvantifikují fotony vyzářeného světla, které se vyjádří jako relativní světelné jednotky (RLU). Množství RLU je úměrné množství IgE ve vzorku. Výsledky byly vyjádřeny jako RLU experiment/RLU pozadí, kde RLU pozadí byla chemiluminiscenční reakce v nepřítomnosti IgE.
Vedlejší metoda 1
Tato metoda se provádí manuálně v 5 ml polystyrénových zkumavkách (Sarstedt). 25 μΙ vzorku se smíchá s 50 μΙ biotinylovaného alergenu Betula verrucosa zředěného 1 : 50. Po 12 min inkubace při 37 °C se přidá 100 μΙ paramagnetických částic zředěných 1 : 20 a směs se inkubuje 5 min a 30 s při 37 °C před magnetickou separací paramagnetických částic a jedním promytím 3 ml promývacího pufru na přístroji Magie Lite Multitube Washer (ALKABELLÓ A/S, HOrsholm, Dánsko). Paramagnetické částice se resuspendují v 200 ml činidla lite zředěného 1 : 10 000 a inkubují se 7 min a 30 s při 37 °C před magnetickou separací paramagnetických částic a promytím dvakrát 3 ml promývacího pufru na přístroji Magie Lite Multitube Washer (ALK-ABELLÓ A/S, HOrsholm, Dánsko). Paramagnetické částice se resuspendují ve 100 μΙ deionizované vody a chemiluminiscenční reakce se měří na přístroji na přístroji Magie Lite Analyzer II (ALK-ABELLÓ A/S, H0rsholm, Dánsko) přidáním nejprve 300 μΙ 0,5 g/l H2O2 v 0,1 Μ HNO3 a potom 300 μΙ 25 mM roztoku
NaOH. Měří se a kvantifikují fotony vyzářeného světla, které se vyjádří jako relativní světelné jednotky (RLU). Množství RLU je úměrné množství IgE ve vzorku. Výsledky byly vyjádřeny jako RLU experiment/RLU pozadí, kde RLU pozadí byla chemiluminiscenční reakce v nepřítomnosti IgE.
Shromážděné sérum pěti pacientů citlivých na pyl břízy bylo sériově zředěno faktorem 2 z 140 SU/ml na 1,1 SU/ml za získání osmi vzorků. Těchto osm vzorků bylo testováno spolu s negativním vzorkem (pozadí) a osmi vzorky jednotlivců citlivých na pyl břízy každou ze tří výše popsaných metod, viz obr. 4, 5 a 6.
Je možno uzavřít, že všechny testované vzorky mohou být detekovány s použitím všech tří metod jako pozitivní.
Příklad 2
Interference se specifickými protilátkami z jiných tříd (IgG)
Určení specifického IgE proti alergenu Betula verrucosa (bříza bradavičnatá) bylo provedeno třemi různými metodami podle popisu v příkladu 1 v přítomnosti různých množství soutěžících specifických protilátek. Konkrétně bylo smíseno shromážděné sérum pěti pacientů citlivých na pyl břízy v poměru 1 : 5 s IgE-negativním sérem obsahujícím různé titry králičí polyklonulní protilátky proti Betula verrucosa (ALK-ABELLÓ A/S, HOrsholm, Dánsko). Kontrola neobsahovala žádnou králičí protilátku.
Výsledky ukázané v obr. 7 jsou vyjádřeny jako procenta odezvy vypočtená jako odpověď získaná s králičí protilátkou ve vzorku proti kontrole. Odpovědi jsou uváděny jako poměr signál/pozadí. Odezvy nižší než 100 % znamenají, že přídavek soutěžící protilátky snižuje odpověď, zatímco odezvy vyšší než 100 % ukazují, že přídavek soutěžící protilátky zvyšuje odpověď.
• ··· ·· · ♦· ··· ·» ··· -21 Závěrem je možno uvést, že metoda 1 má nižší interferenci při soutěžení protilátek z jiných tříd, než souběžně prováděná metoda. Zatímco přidání soutěžících protilátek vede k výrazné pozitivní interferenci vedlejší metody 1, zvláště při vysokých množstvích 5 interferujících protilátek, metoda 1 pravděpodobně interferenci úplně odstraní.
Příklad 3
Křivky ředění u vzorků pacientů se specifickou protialerqickou io vakcinací (SAV)
Stanovení specifického IgE proti alergenu Alternaria alternata (plíseň) bylo provedeno metodou B podle dosavadního stavu techniky a metodou 1 popisovanou v příkladu 1 s tím rozdílem, že namísto biotinylovaného alergenu Betula verrucosa byl použit biotinylovaný 15 alergen Alternaria alternata. Pracovní ředění biotinylovaného alergenu
Alternaria alternata bylo 1 : 400 jak u metody podle dosavadního stavu techniky, tak u metody 1.
Séra čtyř pacientů léčených specifickou protialergickou vakcinací (SAV) byla sériově ředěna faktorem 2 za získání čtyř vzorků 20 před analýzou každou ze dvou různých metod. Jako referenční vzorek bylo použito sérum odebrané pěti pacientům citlivým na alternaria alternata.
Obr. 8 až 12 ukazují výsledky pro vzorky ze čtyř pacientů SAV a referenčního vzorku. Výsledky ukázané v obr. 8 až 12 jsou odpovědi 25 dosažené různými ředěními sér relativně k očekávaným odpovědím.
Procento odezvy se vypočte jako (faktor ředění) x (pozorovaná odpověď)/(odpověď neředěného vzorku). Odpovědi byly uváděny jako poměr signál/pozadí. Odezvy nižší než 100 % ukazují, že odpovědi zředěných sér jsou nižší než očekávané, zatímco odezvy vyšší než 30 100 % ukazují, že odpovědi jsou vyšší než očekávané. Odezvy vyšší • ··· ·· ♦ ♦· ··· ·· ·«· -22než 100 % proto ukazují, že odezva získaná u neředěného vzorku je podhodnocena ve srovnání se správnou hodnotou.
Z obr. 8 až 12 se zdá, že pro vzorky SAV podhodnocuje metoda podle dosavadního stavu techniky skutečnou hodnotu neředěných 5 vzorků SAV, zatímco metoda 1 poskytuje mnohem správnější odhady. Pro séra odebraná pcientům neléčeným SAV obě metody pracují uspokojivě, protože poskytují mnohem přesnější hodnoty.
Závěrem je možno uvést, že metoda 1 obsahující dva kroky praní, může mnohem spolehlivěji odhadnou množství IgE specifického to pro alergen ve vzorcích sér pacientů léčených SAV, než metoda B podle dosavadního stavu techniky.
Příklad 4
Monitorování imunitní odpovědi v průběhu SAV proti roztočům domácího prachu
Určení specifického IgG proti alergenu Dermatophagoides pteronyssinus (roztoč domácího prachu) byl prováděn metodou B podle dosavadního stavu techniky a metodou 1 jak bylo popsáno v příkladu 1 s tím rozdílem, že namísto biotinylovaného alergenu 20 Betula verrucosa byl použit biotinylovaný alergen Dermatophagoides pteronyssinus. Pracovní řádění biotinylovaného alergenu Dermatophagoides pteronyssinus bylo 1 : 250 v metodě B podle stavu techniky i v metodě 1.
Vzorky séra byly získány od pacientů, kteří se účastnili klinické 25 studie. Celkem 30 pacientů bylo léčeno buď placebem (N = 14) nebo SAV směsí alergenů Dermatophagoides pteronyssinus a Dermatophagoides farinae v poměru 1 : 1 (Alutard, ALK-ABELLÓ A/S, H0rsholm, Dánsko) (N = 16). Vzorky byly odebírány před léčbou (t = 0), po 6 měsících léčby (t = 6) a po 12 měsících léčby (t = 12) 30 a všechny vzorky byly analyzovány dvěma různými metodami.
φ · ··· « · · • · · *··· · • · · · · · ·· ··· *· ···
Výsledky byly získány jako relativní odpověď = (signál pozadíj/signálvysoký - pozadí), kde signálvysoký je signál shromážděného séra s vysokým obsahem specifické protilátky, která má být detekována. Tyto výsledky jsou ukázány v obr. 13 až 14. Další soubor 5 údajů byl vytvořen tak, že se vzal poměr mezi výsledky získanými metodou B podle dosavadního stavu techniky a metodou 1. Tyto výsledky jsou ukázány v obr. 15.
Závěr io Žádná z metod (metoda B podle dosavadního stavu techniky nebo metoda 1) použitá pro určení specifického IgG v séru není schopna rozlišit skupiny léčené placebem a léčené aktivní látkou v průběhu SAV (obr. 13 - 14). Poměr výsledků získaných metodou podle dosavadního stavu techniky a metodou podle vynálezu (poměr =
IgE (metoda B podle stavu techniky)t/lgE (metoda 1)t) překvapivě rozlišuje skupiny léčené účinnou látkou a placebem 6 a 12 měsíců po zahájení SAV (obr. 15). Navíc je pravděpodobné, že poměr hraniční hodnoty přibližně 1 může předpovídat, zda jednotlivý pacient patřil do skupiny, které bylo podáno placebo, nebo do skupiny ošetřené účinnou látkou (obr. 17, t = 12), tj. parametr účinnosti SAV.
Statistika
Statistické analýzy byly prováděny neparametrickými testy (Utest Mann-Whitney). Všechny dvousměrné stochastické 25 pravděpodobnosti menší než 0,05 byly považovány za signifikantní. NS označuje nesignifikantní, jinak jsou skutečné pravděpodobnosti uvedeny v obrázcích.
• ··· ·· · ·· ··» *· ·«·
-24Příklad 5
Monitorování imunitní odpovědi v průběhu SAV proti roztočům domácího prachu
Stanovení specifických protilátek IgE proti alergenu 5 Dermatophagoides pteronyssinus (roztoč domácího prachu) bylo prováděno dvěma rozdílnými metodami s použitím činidel popsaných výše v pracovních ředěních definovaných v každé metodě. Byla použita metoda A podle stavu techniky (obr. 1a) a metoda 1 podle vynálezu (obr. 2a, nárok 2).
Metoda A podle dosavadního stavu techniky
Tato metoda je prováděna na modifikované verzi analyzátoru Ciba Corning ACS: 180 Benchtop Immunoassay Analyzer popsané v odkazu 3. 25 μΙ vzorku se rozplní vzorkovací pipetou do kyvety 15 a okamžitě se přidá 100 μΙ paramagnetických částic ředěných 1 : 20 pomocí fixní pipety. Po 8 min inkubace se paramagnetické částice magneticky oddělí a neprovede se promytí. Paramagnetické částice se resuspendují ve 100 μΙ promývacího pufru a do kyvety se přidá 50 μΙ biotinylovaného alergenu Dermatophagoides pteronyssinus zředěného 20 1 : 250. Po 10 min inkubace se přidá 100 μΙ činidla lite zředěného : 5 000 fixní pipetou a po dalších 8 min inkubace se paramagnetické částice magneticky oddělí a třikrát promyjí 1 ml promývacího pufru. Po ukončení promývacího cyklu se paramagnetické částice resuspendují v 300 μΙ roztoku 0,5 g/l HěO2 v 0,1 M HNO3. Kyveta vstoupí do komory 25 luminometru a před fotonásobičem se přidá 300 μΙ 25 mM roztoku NaOH a fotony emitovaného světla se měří, kvantifikují a vyjádří jako relativní světelné jednotky (RLU). Množství RLU je úměrné množství IgE ve vzorku. Výsledky byly vyjádřeny jako RLU experiment/RLU pozadí, kde RLU pozadí byla chemiluminiscenční reakce 3o v nepřítomnosti IgE.
• ···
·*·
Metoda 1
Tato metoda se provádí na modifikované verzi analyzátoru Ciba Corning ACS: 180 Benchtop Immunoassay Analyzer popsaném v J.
Boland, G. Carey, E. Krodel a M, Kwiatkowski, Clinical Chemistry, 1990, 36, 1598 - 1602. 25 μΙ vzorku se pipetuje vzorkovací pipetou do kyvety a ihned se přidá 100 μΙ paramagnetických částic rozředěných 1 : 20 pomoci fixní pipety. Po 8 min inkubace se paramagnetické částice magneticky oddělí a jednou promyjí 1 ml promývacího pufru.
io Paramagnetické částice se resuspendují ve 100 μ! promývacího pufru a do kyvety se přidá 50 μΙ biotinylovaného alergenu Dermatophagoides pteronyssinus rozředěného 1 : 250. Po 10 min inkubace se přidá 100 μΙ činidla lite zředěného 1 : 5000 fixní pipetou a po dalších 8 min inkubace se paramagnetické částice magneticky oddělí a třikrát promyjí 1 ml promývacího pufru. Po ukončení promývacího cyklu se paramagnetické částice resuspendují ve 300 pl roztoku 0,5 g/l H2O2 v 0,1 Μ HNO3. Kyveta vstoupí do komory luminometru a před fotonásobičem se přidá 300 μΙ 25 mM roztoku NaOH a fotony emitovaného světla se měří, kvantifikují a vyjádří jako relativní světelné jednotky (RLU). Množství RLU je úměrné množství IgE ve vzorku. Výsledky byly vyjádřeny jako RLU experiment/RLU pozadí, kde RLU pozadí byla chemiluminiscenční reakce v nepřítomnosti IgE.
Předkládaná experimentální práce se týká celkem 28 pacientů.
Třináct pacientů nebylo žádným způsobem léčeno, sedm pacientů bylo léčeno SAV v dávce 100 a osm pacientů bylo léčeno SAV v dávce 300. Léčení SAV spočívalo v podávání dávek alergenu Dermatophagoides pteronyssinus (roztoč domácího prachu) pacientům podkožní injekcí na počátku v průběhu období zvyšování dávky týdnů ve formě týdenních injekcí a potom v průběhu dvou let ·· · ·· ··· ·· ·«·
-26s dávkami 100 nebo 300 jednotek SQ podávaných každých 6 až 8 týdnů.
Studie používá parametru účinku založeného na testu vpichem do kůže (skin prick test (SPT) a testu bronchiální provokace (bronchial 5 provocation test (BPT). Parametr klinického účinku používaný v této studii byl získán následujícím způsobem: relativní kožní indexy (Sl(čas = x) - Sl(čas = 0)) byly použity pro rozdělení pacientů do dvou skupin (účinek = pokles kožní citlivosti a bez účinku = nezměněná kožní citlivost). Podobně test relativní provokace (logBPT(čas = x) io logBPT(čas = 0)) byl použit pro roztřídění pacientů do dvou skupin (účinek = snížená bronchiální senzitivita a bez účinku = nezměněná bronchiální senzitivita). Tato dvě měření byla spojena do jednoho parametru klinického účinku: klinický účinek = účinek při obou měřeních, bez klinického účinku - žádný účinek v obou měřeních 15 a neprůkazný klinický účinek = účinek v jednom z měření a bez účinku v druhém měření.
Obr. 16 až 18 ukazují relativní hladinu IgE v časech 0 (LT_S0_0), 6 (LT_S6_0), 12 (LT_S12_0) a 24 (LT_S24_0) měsíců pro tři skupiny klinického účinku, tedy účinný, neúčinný a neprůkazný 20 účinek. Čas = 0 je hodnota před začátkem ošetření. Údaje u křivek ve formátu nnjii jsou identifikační čísla pacienta (nn) a typ ošetření (iii), kde iii = 0 znamená bez ošetření a iii = 100 nebo 300 znamená ošetření s dávkami 100, popřípadě 300. Čára u hodnoty 0,14 je arbitrátní mezní hodnota. Relativní koncentrace IgE je definována 25 následujícím způsobem:
log (odpověď(metoda 1)/odpověď (metoda A podle stavu techniky))t=x - log (odpověď(metoda 1)/odpověď (metoda A podle stavu techniky))t=o, kde t = čas, x = 0, 6, 12 nebo 24 měsíců a odpověď = hodnota 30 signál/pozadí.
• ··· ·
·· * ·· ··· ·· Μ»
-27Jak bude zřejmé z obr. 16, odpověď pro metodu 1 je vyšší než odpověď pro metodu A podle dosavadního stavu techniky u všech pacientů, u kterých se ukázal klinický účinek, což znamená, že byla iniciována odpověď soutěžící protilátky jiné než IgE schopná účinně 5 reagovat s alergenem. Z obr. 17 se zdá, že u žádného z pacientů ve skupině bez klinického účinku se nevyvinula soutěžící protilátková odpověď. Nakonec se z obr. 18 zdá, že se u jednoho pacienta v klinicky neprůkazné skupině vyvinula pozitivní odpověď na soutěžící protilátku, která je detekována pouze testem vpichu do kůže. Test io rozlišuje mezi léčenými a neléčenými pacienty, protože žádný z pacientů z kontrolní skupiny (nn_0) není posuzován, jako kdyby u něj došlo k vytvoření odpovědi na soutěžící protilátku.
Závěr
Poměr IgE měřený v nepřítomnosti a přítomnosti soutěžících látek ve vzorku séra, tj. měřený metodou 1 a metodou A podle dosavadního stavu techniky, se zdá předpovídat účinek SAV. Navíc je efekt měřený in vitro pozorovatelný již velmi časně ve schématu léčení. Je však pravděpodobné, že soutěžící látka je protilátka jiná než 20 IgE - jakákoli látka přítomná v séru reagující specificky s alergeny by se podle očekávání chovala podobně.
Příklad 6
Biotinylovaný Der p
Der p 1 obsahuje pouze jeden lysylový zbytek a jednu NH2koncovou aminokyselinu, které jsou schopné biotinylace. Jestliže se biotinyluje surový extrakt Der p použitím „normálních značících reakčních činidel (jejichž cílem jsou skupiny NFh), získaný značený extrakt Der p má sklon přesunovat citlivost směrem k Der p 2 a jiným 30 alergenům.
• ··φ* tet • · · t Φ t t t • · · · φ φ ·· ♦·· ·· Φ·Φ • · · • φ φ φ · φ • · 9
-28Vyváženější činidlo Der p je možno získat následujícím způsobem: surový extrakt Der p byl biotinylován podle popisu a byla přidána příprava biotinylovaného Der p 1 značeného pomocí biotinových činidel schopných derivatizovat zbytky tyrosinu a histidinu. 5 Získaná směs byla použita při následujících testech.
Biotinylace Der p 1
Der p 1 (ALK-Abelló A/S, H0rsholm, Dánsko) byl biotinylován p-diazobenzoyl Biocytinem, který byl připraven ze stabilního prekurzoru io p-aminobenzoyl Biocytinu (Pierce, USA) podle instrukcí výrobce. Získaný roztok p-diazobenzoyl Biocytinu měl teoretickou koncentraci 1,82 mg/ml (ekvivalent k 3,38 mM), za předpokladu 100% účinnosti konverze p-aminobenzoyl Biocytinu na p-diazobenzoyl Biocytin. Der p 1 byl biotinylován v molárním poměru 17 : 1 za předpokladu 15 molekulové hmotnosti Der p 1 25 kD přídavkem 343 μΙ roztoku p-diazobenzoyl Biocytinu k 1 ml 1,74 mg/ml Der p 1 v 0,1 M NaHCO3, pH -8,5. Následující kroky způsobu byly popsány výše pro biotinylaci esterem Biotin-XX-NHS.
Přístrojové vybavení
Vzorky byly analyzovány na analyzátoru ADVIA Centaur (Bayer Diagnostics). Množství IgE specifického pro Der p v každém vzorku bylo určováno použitím dvou protokolů: dvoustupňové metody (T) zahrnující kroky praní, které odstraní interferující látky (např. protilátky 25 jiné než IgE) před přidáním biotinylovaných alergenů a současného protokolu (S), který umožní přítomnost interferujících látek (například protilátky jiné než IgE) při přídavku biotinylovaných alergenů. Metoda T a metoda S odpovídají metodě 1 a metodě A podle stavu techniky popsaných v příkladu 5 s tím rozdílem, že alergen byl biotinylován jak 30 bylo popsáno výše.
Materiály a metody
Činidlo biotinylovaný alergen bylo připraveno připravením ředění 1 : 250 biotinylovaného Der p 1 a smícháním jednoho dílu 5 tohoto činidla se čtyřmi díly normálního činidla Der P připraveného a naředěného jak bylo popsáno výše.
Vzorky séra z (N = 48) pacientů alergických na Der p, kteří dostali SAV s Der p, byly získány v čase 0, 0,5, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 18 a 24 měsíců po zahájení SAV. Pacienti byli zařazení do čtyř skupin io podle ošetření: kontrolní (N = 15), dávka _10 (N = 12), dávka_100 (N = 9) a dávka_300 (N = 11) a léčeni látkou Der p Alutard 24 měsíců s použitím uvedené dávky.
Před SAV a po něm byly měřeny klinické parametry SPT (Skin Prick Test), BPT (Bronchial Provocation Test) a CPT (Conjunctival 15 Provocation Test) a z klinických parametrů analyzovaných pro každou skupinu byla získána účinnost. SAV bylo považováno za účinné, jestliže dva ze tři parametrů byly pozitivní, a za neúčinné, jestliže jeden nebo žádný z parametrů byl pozitivní.
IgE bylo měřeno ve vzorcích séra podle těchto dvou protokolů (T 20 a S) a parametr účinnosti in vitro korigovaný na základní hodnotu byl vypočten podle rovnice: LN(Ti/SÍ) - LN(TO/S0), kde i je čas (>0<24) a 0 je hodnota před ošetřením.
Výsledky
Existuje jasný vztah závislý na dávce mezi LN(Ti/Si) - LN(T0/S0) a podanou dávkou (obr. 19; vztah dávka - odpověď parametru účinnosti) ukazující, že tento parametr měří imunologickou změnu u pacientů závislou na dávce. Obr. 20 (střední parametr účinnosti) ilustruje střední hodnoty získané pro parametr účinnosti in vitro pro pacienty s a bez klinických účinků, a parametr in vitro je ukázán pro « · ··· ·· · ··· «·> -30jednotlivé pacienty v obr. 21 (s účinkem: jednotliví pacienti) a obr. 22 (bez účinku: jednotliví pacienti). Všichni pacienti s pozitivním klinickým vývojem ukazují vzrůst parametru in vitro nad rozmezí kontrolní skupiny od času 6 až 24 měsíců a všichni tito pacienti dostávali aktivní 5 SAV Der p. Čtyři pacienti (14 %) bez zřejmého klinického účinku jsou hodnoceni tak, že došlo k účinku parametrem účinku in vitro.
Závěr
Parametry účinku in vitro se zdají být v dobré korelací io s klinickým hodnocením stavu pacienta a parametr in vitro předpovídá výsledek SAV po 6 měsících SAV, zatímco klinické účinky jsou za normálních okolností zřejmé po 12 nebo 24 měsících.
Claims (5)
1) urči se obsah protilátky v kapalném vzorku odebraném subjektu použitím imunologického testu, kde reakce mezi protilátkou vzorku a ligandem ve formě antigenu, protilátky nebo haptenu, kde ligand je zaměřen proti oblasti Fab protilátky vzorku, se provádí v přítomnosti dalších složek vzorku pro získání měření 1,
1. Způsob vyhodnocování a/nebo předpovídání účinku léčení
5 specifickou protialergickou vakcinací, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:
(h’) stanoví se obsah protilátky v kapalném vzorku s použitím následujícího testu:
(a’) poskytne se směs kapalné fáze a trísložkového io komplexu pevné fáze složeného z (i) protilátky vzorku, (ii) reaktivní protilátky zaměřené proti protilátce vzorku, kde reaktivní protilátka je navázána na pevnou částici, a (iii) ligandu ve formě antigenu, protilátky nebo haptenu, (b’) třísložkový komplex pevné fáze se oddělí od kapalné 15 fáze, (c1) oddělený třísložkový komplex pevné fáze se promyje pro odstranění sloučenin, které nejsou vázány v komplexu, (ď) ke komplexu třísložkové pevné fáze se přidá roztok
2o (iv) značící sloučeniny za vytvoření čtyřsložkového komplexu, (e1) čtyřsložkový komplex pevné fáze se oddělí od roztoku, (f) oddělený čtyřsložkový komplex pevné fáze se promyje pro odstranění sloučeniny (iv) nenavázané na komplex,
25 (g1) provede se detekce/měření promytého značeného čtyřsložkového komplexu, (i') stanoví se obsah uvedené protilátky s použitím následujícího testu:
2) určí se obsah protilátky v kapalném vzorku použitím imunologického testu, kde reakce mezi protilátkou vzorku a ligandem ve formě antigenu, protilátky nebo haptenu, kde ligand je zaměřen proti oblasti Fab protilátky vzorku, se provádí v nepřítomnosti dalších složek vzorku pro získání měření 2,
2. Způsob vyhodnocování a/nebo předpovídání účinku léčení specifickou protialergickou vakcinací, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:
(h) stanoví se obsah protilátky v kapalném vzorku s použitím následujícího testu:
(a) poskytne se směs kapalné fáze a třísložkového komplexu pevné fáze složeného z (i) protilátky vzorku, (ii) reaktivní protilátky zaměřené proti protilátce vzorku, kde reaktivní protilátka je navázána na pevnou částici, a (iii) ligandu ve formě antigenu, protilátky nebo haptenu, který je navázán na biotin nebo jeho funkční derivát, • * • · * ··· ·· · ·· ··· ·· ··· -33- (b) třísložkový komplex pevné fáze se oddělí od kapalné fáze, (c) oddělený třísložkový komplex pevné fáze se promyje pro odstranění sloučenin, které nejsou vázány v komplexu, (d) ke komplexu třísložkové pevné fáze se přidá roztok (iv) chemiluminiscenční sloučeniny kovalentně navázané na avidin, streptavidin nebo jejich funkční derivát, za vytvoření čtyrsložkového komplexu pevné fáze, (e) čtyřsložkový komplex pevné fáze se oddělí od roztoku, (f) oddělený čtyřsložkový komplex pevné fáze se promyje pro odstranění sloučeniny (iv) nenavázané na komplex, (g) provede se zahájení chemiluminiscenční reakce v promytém čtyřsložkovém komplexu pevné fáze a detekce/měření získané chemiluminiscence, pokud je přítomna, (i) stanoví se obsah uvedené protilátky s použitím následujícího testu:
(ia) poskytne se směs kapalné fáze a čtyrsložkového komplexu pevné fáze složeného z (i) protilátky vzorku, (ii) reaktivní protilátky zaměřené proti protilátce vzorku, kde reaktivní protilátka je navázána na pevnou částici, a (iii) ligandu ve formě antigenu, protilátky nebo haptenu, který je navázán na biotin nebo jeho funkční derivát, a (iv) chemiluminiscenční sloučeniny kovalentně navázané na avidin, streptavidin nebo jejich funkční derivát, za vytvoření čtyřsložkového komplexu pevné fáze, (ib) čtyřsložkový komplex pevné fáze se oddělí od kapalné fáze, « · * · ··· • 9 ♦· · ·· ··· >·
-34(ic) oddělený čtyřsložkový komplex pevné fáze se promyje pro odstranění sloučenin, které nejsou vázány v komplexu, (id) zahájí se chemiluminiscenční reakce v promytém
5 čtyřsložkovém komplexu pevné fáze a měří se získaná chemiluminiscence, pokud je přítomná, (j) porovnají se měření získaná v kroku (h) a kroku (i) a srovnání se použije pro vyhodnocení a/nebo předpovězení účinku léčení specifickou protialergickou vakcinací.
3) měření 1 a 2 se uvedou do vztahu pro vyjádření vzájemného působení a toto vzájemné působení se použije jako parametr pro vyhodnocení imunologického stavu subjektu.
12. Způsob vyhodnocování imunologického stavu subjektu, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:
• ··· • ·
A) stanoví se obsah protilátky v kapalném vzorku odebraném subjektu s použitím následujícího protokolu testu (test A):
(Aa) smíchá se (i) protilátka vzorku, (ii) protilátka zaměřená proti oblasti Fc protilátky vzorku, kde reaktivní protilátka je navázána na pevný nosič, a (iii) ligand ve formě antigenu, protilátky nebo haptenu, kde ligand je zaměřen proti oblasti Fab protilátky vzorku, za vytvoření směsi třísložkového komplexu pevné fáze a kapalné fáze, (Ab) třísložkový komplex se uvede do styku s (iv) značící sloučeninou za vytvoření směsi čtyřsložkového komplexu a kapalné fáze, (Ac) čtyřsložkový komplex pevné fáze se promyje pro odstranění sloučenin nenavázaných na komplex, (Ad) provede se detekce/méření promytého značeného čtyřsložkového komplexu pro získání měření A;
B) stanoví se obsah uvedené protilátky v tomto vzorku s použitím následujícího protokolu testu (test B):
(Ba) smíchá se (i) protilátka vzorku, a (ii) reaktivní protilátka zaměřená proti oblasti Fc protilátky vzorku, kde reaktivní protilátka je navázána na pevný nosič, za vytvoření směsi dvousložkového komplexu pevné fáze a kapalné fáze, (Bb) dvousložkový komplex pevné fáze se promyje pro odstranění sloučenin nenavázaných na komplex, (Bc) promytý dvousložkový komplex pevné fáze se přivede do styku s (iii) ligandem ve formě antigenu, protilátky nebo haptenu, kde ligend je navázán na oblast Fab protilátky vzorku, a (iv) značící sloučeninu, za vytvoření směsi čtyřsložkového komplexu pevné fáze a kapalné fáze, (Bd) čtyřsložkový komplex pevné fáze se promyje pro odstranění sloučenin nenavázaných na komplex,
9 · (Be) provede se detekce/měření promytého značeného čtyřsložkového komplexu za získání měření B; a
E) měření A a B se uvedou do vztahu pro vyjádření vzájemného působení a toto vzájemné působení se použije 5 jako parametr pro vyhodnocení imunologického stavu subjektu.
13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, ž e krok Ab se uskuteční přidáním uvedené (iv) značící sloučeniny k uvedené směsi třísložkového komplexu pevné io fáze a kapalné fáze v kroku Aa.
14. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, ž e krok Ab se uskutečňuje promytím třísložkového komplexu získaného v kroku Aa pro odstranění sloučenin nenavázaných
15 na komplex, a následným přidáním uvedené (iv) značící sloučeniny k promytému třísložkovému komplexu.
15. Způsob podle některého z nároků 12 až 14, vyznačující se tím, že krok Bd se uskutečňuje
20 současnou inkubací uvedeného (iii) ligandu a uvedené (iv) značící sloučeniny s dvojsložkovým komplexem.
16. Způsob podle některého z nároků 12 až 14, vyznačující se tím, že na počátku se
25 k dvojsložkovému komplexu přidá uvedený (iii) ligand, za vytvoření třísložkového komplexu, který se potom promyje pro odstranění ligandu (iii) nenavázaného na komplex, a potom se přidá uvedená značící sloučenina (iv) za vytvoření čtyřsložkového komplexu.
• * • ···
17. Způsob podle některého z nároků 11 až 16, vyznačující se tím, že značící sloučeninou je luminiscenční značící sloučenina, chemiluminiscenční značící sloučenina, enzymatická značící sloučenina, radioaktivní značící sloučenina, fluorescenční značící sloučenina nebo absorbanční značící sloučenina.
18. Způsob podle některého z nároků 11 až 17, vyznačující se tím, že ligand (iii) je biotinylovaný.
19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, ž e značící sloučenina (iv) je chemiluminiscenční sloučenina kovalentně navázaná na avidin, streptavidin nebo jejich funkční derivát.
20. Způsob vyhodnocování imunologického stavu subjektu, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:
C) stanoví se obsah protilátky v kapalném vzorku odebraném subjektu s použitím následujícího protokolu testu (test C):
(Ca) smíchá se (i) protilátka vzorku, (ii) protilátka zaměřená proti oblasti Fc protilátky vzorku, kde reaktivní protilátka je navázána na pevný nosič, a (iii) značený ligand ve formě antigenu, protilátky nebo haptenu, kde ligand je zaměřen proti oblasti Fab protilátky vzorku, za vytvoření směsi třísložkového komplexu pevné fáze a kapalné fáze,
-46(Cb) třísložkový komplex pevné fáze se promyje pro odstranění sloučenin nenavázaných na komplex, (Cc) provede se detekce/měření promytého značeného třísložkového komplexu pro získání měření C;
5 D) stanoví se obsah uvedené protilátky s použitím následujícího protokolu testu (test D):
(Da) smíchá se (i) protilátka vzorku, a (ii) reaktivní protilátka zaměřená proti oblasti Fc protilátky vzorku, kde reaktivní protilátka je navázána na pevný nosič, za vytvoření směsi 10 dvousložkového komplexu pevné fáze a kapalné fáze, (Db) dvousložkový komplex pevné fáze se promyje pro odstranění sloučenin nenavázaných na komplex, (Dc) promytý dvousložkový komplex pevné fáze se přivede do styku s (iii) značeným ligandem ve formě antigenu, protilátky 15 nebo haptenu, kde ligend je navázán na oblast Fab protilátky vzorku, za vytvoření směsi třísložkového komplexu pevné fáze a kapalné fáze, (Dd) třísložkový komplex pevné fáze se promyje pro odstranění sloučenin nenavázaných na komplex,
20 (De) provede se detekce/měření promytého značeného třísložkového komplexu za získání měření D; a
E) měření C a D se uvedou do vztahu pro vyjádření jejich vzájemného působení a toto vzájemné působení se použije jako parametr pro vyhodnocení imunologického stavu subjektu.
21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, ž e značený ligand je značený radioaktivním atomem.
t ♦'
22. Způsob podle některého z nároků 11 až 21, vyznačující se tím, že u hodnoceného subjektu se provádí léčení alergie, vakcinační léčení alergie nebo specifická protialergická vakcinace, SAV.
23. Způsob vyhodnocení účinku léčení alergie na subjekt, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:
A) stanoví se obsah uvedené protilátky s použitím následujícího protokolu testu (test A):
(Aa) smíchá se (i) protilátka vzorku, (li) protilátka zaměřená proti oblasti Fc protilátky vzorku, kde reaktivní protilátka je navázána na pevný nosič, a (iii) ligand ve formě antigenu, protilátky nebo haptenu, kde ligand je zaměřen proti oblasti Fab protilátky vzorku, za vytvoření směsi třísložkového komplexu pevné fáze a kapalné fáze, (Ab) třísložkový komplex se uvede do styku s (iv) značící sloučeninou za vytvoření směsi čtyřsložkového komplexu a kapalné fáze, (Ac) čtyřsložkový komplex pevné fáze se promyje pro odstranění sloučenin nenavázaných na komplex, (Ad) provede se detekce/měření promytého značeného čtyřsložkového komplexu pro získání měření A;
E) použije se měření A jako parametr pro vyhodnocení účinku léčení.
24. Způsob vyhodnocování účinku léčení alergie na subjekt, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:
• 4
- w w * ·· · • 4*44 · 4* • · · 4 4 4 φφ • · ♦ · 4· · ···44
C) stanoví se obsah uvedené protilátky s použitím následujícího protokolu testu (test C):
(Ca) smíchá se (i) protilátka vzorku, (ii) protilátka zaměřená proti oblasti Fc protilátky vzorku, kde reaktivní protilátka je 5 navázána na pevný nosič, a (iii) značený ligand ve formě antigenu, protilátky nebo haptenu, kde ligand je zaměřen proti oblasti Fab protilátky vzorku, za vytvoření směsi třísložkového komplexu pevné fáze a kapalné fáze, (Cb) třísložkový komplex pevné fáze se promyje pro odstranění io sloučenin nenavázaných na komplex, (Cc) provede se detekce/měření promytého značeného třísložkového komplexu pro získání měření C;
E) použije se měření C jako parametr pro vyhodnocení účinku léčení.
25. Způsob podle nároku 23 nebo 24, vyznačující se tím, ž e u hodnoceného subjektu se provádí vakcinace proti alergii nebo specifická protialergická vakcinace, SAV.
20 26. Způsob podle některého z nároků 22 až 25, vyznačující se tím, že vyhodnocení v kroku
E) se provádí v radě bodů v průběhu času na začátku a během období léčení, a každá změna s časem, která může být pozorována, se použije jako základ pro vyhodnocení a/nebo 25 předpovězení účinku léčení.
27. Způsob podle některého z nároků 11 až 25, vyznačující se tím, že jako nosič se použije částice.
• «
9 ttt ··<
28. Způsob podle nároku 27, vyznačující se tím, ž e jako nosič se použije paramagnetická částice.
3. Způsob vyhodnocování a/nebo předpovídání účinku léčení specifickou protialergickou vakcinací, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:
(h) stanoví se obsah protilátky v kapalném vzorku s použitím 15 následujícího testu:
(a) poskytne se směs kapalné fáze a třísložkového komplexu pevné fáze složeného z (i) protilátky vzorku, (ii) reaktivní protilátky zaměřené proti protilátce vzorku, kde reaktivní protilátka je navázána na pevnou 20 paramagnetickou částici, a (iii) ligandu ve formě antigenu, protilátky nebo haptenu, který je navázán na biotin nebo jeho funkční derivát, (b”) třísložkový komplex pevné fáze se magneticky oddělí od kapalné fáze,
25 (c”) oddělený třísložkový komplex pevné fáze se promyje pro odstranění sloučenin, které nejsou vázány v komplexu, (d”) ke komplexu třísložkové pevné fáze se přidá roztok (iv) chemiluminiscenční sloučeniny kovalentně navázané • · ··· • · · · · «··* ·· · ·* ··· ·« ···
-35 na avidin, streptavidin nebo jejich funkční derivát, za vytvoření čtyřsložkového komplexu pevné fáze, (e”) čtyřsložkový komplex pevné fáze se magneticky oddělí od roztoku, (f”) oddělený čtyřsložkový komplex pevné fáze se promyje pro odstranění sloučeniny (iv) nenavázané na komplex, (g”) provede se zahájení chemiluminiscenční reakce v promytém čtyřsložkovém komplexu pevné fáze a detekce/měření získané chemiluminiscence, pokud je přítomna, (i”) stanoví se obsah uvedené protilátky s použitím následujícího testu:
(ia) poskytne se směs kapalné fáze a čtyřsložkového komplexu pevné fáze složeného z (i) protilátky vzorku, (ii) reaktivní protilátky zaměřené proti protilátce vzorku, kde reaktivní protilátka je navázána na pevnou paramagnetickou částici, (iii) ligandu ve formě antigenu, protilátky nebo haptenu, který je navázán na biotin nebo jeho funkční derivát, a (iv) chemiluminiscenční sloučeniny kovalentně navázané na avidin, streptavidin nebo jejich funkční derivát, za vytvoření čtyřsložkového komplexu pevné fáze, (ib”) čtyřsložkový komplex pevné fáze se magneticky oddělí od kapalné fáze, (ic”) oddělený čtyřsložkový komplex pevné fáze se promyje pro odstranění sloučenin, které nejsou vázány v komplexu, (id”) zahájí se chemiluminiscenční reakce v promytém čtyřsložkovém komplexu pevné fáze a měří se získaná chemiluminiscence, pokud je přítomná,
4. Způsob vyhodnocování a/nebo předpovídání účinku léčení specifickou protialergickou vakcinací, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:
(x’) stanoví se obsah protilátky v kapalném vzorku s použitím následujícího testu:
(o1) poskytne se směs kapalné fáze a dvojsložkového komplexu pevné fáze složeného z (i) protilátky vzorku, a (ii) reaktivní protilátky zaměřené proti protilátce vzorku, kde reaktivní protilátka je navázána na pevnou částici, (p’) dvojsložkový komplex pevné fáze se oddělí od kapalné fáze, (q’) oddělený dvojsložkový komplex pevné fáze se promyje pro odstranění sloučenin, které nejsou vázány v komplexu, (r’) ke komplexu promyté dvojsiožkové pevné fáze se přidá roztok (iii) ligandu ve formě antigenu, protilátky nebo haptenu, který je popřípadě značený, za vytvoření třísložkového komplexu pevné fáze, (s') k třísložkovému komplexu pevné fáze se popřípadě přidá roztok (iv) značící sloučeniny za vytvoření čtyřsložkového komplexu pevné fáze, (ť) třísložkový nebo čtyřsložkový komplex pevné fáze získaný v kroku (r'), popřípadě <s’) se oddělí od roztoku, (ď) oddělený vícesložkový komplex pevné fáze se promyje pro odstranění sloučenin nenavázaných na komplex, ··» • · · ·· ·»· (ν’) provede se detekce/měření promytého značeného vícesložkového komplexu, (y’) stanoví se obsah uvedené protilátky s použitím následujícího testu:
5 (ya’) poskytne se směs kapalné fáze a třísložkového komplexu pevné fáze složeného z (i) protilátky vzorku, (ii) reaktivní protilátky zaměřené proti protilátce vzorku, kde reaktivní protilátka je navázána na pevnou částici, a (iii) ligandu ve formě antigenu, protilátky nebo haptenu, 10 který je značený nebo navázaný na (iv) značící sloučeninu, za vytvoření vícesložkového komplexu pevné fáze, (yb’) vícesložkový komplex pevné fáze se oddělí od kapalné fáze,
15 (yC) oddělený vícesložkový komplex pevné fáze se promyje pro odstranění sloučenin, které nejsou navázány v komplexu, (yď) provede se detekce/měření značeného vícesložkového komplexu,
20 (z’) porovnají se měření získaná v kroku (x’) a kroku (y’) a srovnání se použije pro vyhodnocení a/nebo předpovězení účinku léčení specifickou protialergickou vakcinací.
5. Způsob vyhodnocování a/nebo předpovídání účinku léčení
25 specifickou protialergickou vakcinací, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:
(x) stanoví se obsah protilátky v kapalném vzorku s použitím následujícího testu:
• · • · » * · ·· *
··· (o) poskytne se směs kapalné fáze a dvojsložkového komplexu pevné fáze složeného z (i) protilátky vzorku, a (ii) reaktivní protilátky zaměřené proti protilátce vzorku, kde reaktivní protilátka je navázána na pevnou částici,
5 (p) dvojsložkový komplex pevné fáze se oddělí od kapalné fáze, (q) oddělený dvojsložkový komplex pevné fáze se promyje pro odstranění sloučenin, které nejsou vázány v komplexu,
10 (r) ke komplexu promyté dvojsložkové pevné fáze se přidá roztok (iii) ligandu ve formě antigenu, protilátky nebo haptenu, který je navázán na biotin nebo jeho funkční derivát, za vytvoření třísložkového komplexu pevné fáze, (s) k třísložkovému komplexu pevné fáze se přidá roztok
15 (iv) chemiluminiscenční sloučeniny kovalentně navázané na avidin, streptavidin nebo jejich funkční derivát, za vytvoření čtyřsložkového komplexu pevné fáze, (t) čtyřsložkový komplex pevné fáze se oddělí od roztoku, (u) oddělený čtyřsložkový komplex pevné fáze se promyje
20 pro odstranění sloučeniny (iv) nenavázané na komplex, (v) provede se zahájení chemiluminiscenční reakce v promytém čtyřsložkovém komplexu pevné fáze a detekce/měření získané chemiluminiscence, pokud je přítomna,
25 (y) stanoví se obsah uvedené protilátky s použitím následujícího testu:
(ya) poskytne se směs kapalné fáze a čtyřsložkového komplexu pevné fáze složeného z (i) protilátky vzorku, (ii) reaktivní protilátky zaměřené proti protilátce vzorku,
3o kde reaktivní protilátka je navázána na pevnou částici, a (iii) ligandu ve formě antigenu, protilátky nebo haptenu, který je navázaný na biotin nebo jeho funkční derivát, a (iv) chemiluminiscenční sloučeniny kovalentně navázané na avidin, streptavidin nebo jejich funkční derivát, za 5 vytvoření čtyřsložkového komplexu pevné fáze, (yb) čtyřsložkový komplex pevné fáze se oddělí od kapalné fáze, (yc) oddělený čtyřsložkový komplex pevné fáze se promyje pro odstranění sloučenin, které nejsou navázány
10 v komplexu, (yd) zahájí se chemiluminiscenční reakce v promytém čtyřsložkovém komplexu pevné fáze a provede se měření získané chemiluminiscence, pokud je přítomna, (z) porovnají se měřeni získaná v kroku (x) a kroku (y)
15 a srovnání se použije pro vyhodnocení a/nebo předpovězení účinku léčení specifickou protialergickou vakcinací.
6. Způsob vyhodnocování a/nebo předpovídáni účinku léčení specifickou protialergickou vakcinací, vyznačující
20 s e t í m , ž e zahrnuje následující kroky:
(x”) stanoví se obsah protilátky v kapalném vzorku s použitím následujícího testu:
(o”) poskytne se směs kapalné fáze a dvojsložkového komplexu pevné fáze složeného z (i) protilátky vzorku, a 25 (ii) reaktivní protilátky zaměřené proti protilátce vzorku, kde reaktivní protilátka je navázána na pevnou paramagnetickou částici, (p”) dvojsložkový komplex pevné fáze se magneticky oddělí od kapalné fáze, • Φ·· ·· ·
-40·· ··♦ · · (q) oddělený dvousložkový komplex pevné fáze se promyje pro odstranění sloučenin, které nejsou vázány v komplexu, (r”) ke komplexu promyté dvojsložkové pevné fáze se
5 přidá roztok (iii) ligandu ve formě antigenu, protilátky nebo haptenu, který je navázán na biotin nebo jeho funkční derivát, za vytvoření trísložkového komplexu pevné fáze, (s”) k třísložkovému komplexu pevné fáze se přidá roztok (iv) chemiluminiscenční sloučeniny kovalentně navázané
10 na avidin, streptavidin nebo jejich funkční derivát, za vytvoření čtyřsložkového komplexu pevné fáze, (t”) čtyřsložkový komplex pevné fáze se magneticky oddělí od roztoku, (u) oddělený čtyřsložkový komplex pevné fáze se
15 promyje pro odstranění sloučeniny (iv) nenavázané na komplex, (v”) provede se zahájení chemiluminiscenční reakce v promytém čtyřsložkovém komplexu pevné fáze a provede se detekce/měření získané chemiluminiscence, 20 pokud je přítomna, (y) stanoví se obsah uvedené protilátky s použitím následujícího testu:
(ya”) poskytne se směs kapalné fáze a čtyřsložkového komplexu pevné fáze složeného z (i) protilátky vzorku, 25 (ii) reaktivní protilátky zaměřené proti protilátce vzorku, kde reaktivní protilátka je navázána na pevnou paramagnetickou částici, a (iii) ligandu ve formě antigenu, protilátky nebo haptenu, který je navázaný na biotin nebo jeho funkční derivát, a (iv) chemiluminiscenční sloučeniny 30 kovalentně navázané na avidin, streptavidin nebo jejich funkční derivát, za vytvoření čtyřsložkového komplexu pevné fáze, (yb”) čtyřsložkový komplex pevné fáze se magneticky oddělí od kapalné fáze,
5 (yc) oddělený čtyřsložkový komplex pevné fáze se promyje pro odstranění sloučenin, které nejsou navázány v komplexu, (yd”) zahájí se chemiluminiscenční reakce v promytém čtyřsložkovém komplexu pevné fáze a provede se měření
10 získané chemiluminiscence, pokud je přítomna, (z) porovnají se měřeni získaná v kroku (x”) a kroku (y”) a srovnání se použije pro vyhodnocení a/nebo předpovězení účinku léčení specifickou protialergickou vakcinací.
15 7. Způsob podle některého z nároků 1, 2, 3, 4, 5 nebo 6, vyznačující se tím, že krok (1a’), (ia), (ia”), (ya’), (ya) nebo (ya”) se provádí míšením složek (i) a (ii) a potom přidáním složky (iii), a nakonec přidáním složky (ív), pokud se přidává.
8. Způsob podle některého z nároků 1, 2, 3, 4, 5 nebo 6, vyznačující se tím, že krok (ia’), (ia), (ia”), (ya’), (ya) nebo (ya”) se provádí míšením složek (i), (ii) a (iii) a potom přidáním složky (iv), pokud se přidává.
9. Způsob podle některého z nároků 1, 2, 3, 4, 5 nebo 6, vyznačující se tím, že porovnání kroků (j’), (j), (j”). (z’)r (z) nebo (z”) se provádí výpočtem poměru měřeni získaných ve dvou uvedených krocích.
10. Způsob podle některého z nároků 1, 2, 3, 4, 5 nebo 6, vyznačující se tím, že porovnání kroků (j’), (j), (j”), (z'), (z) nebo (z”) se provádí v řadě bodů v průběhu času na začátku a během období léčení, a každá změna s časem, která může být pozorována, se použije jako základ pro vyhodnocení a/nebo předpovězení účinku léčení.
11. Způsob vyhodnocení imunologického stavu subjektu, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:
(j”) porovnají se měření získaná v kroku (h) a kroku (i) a srovnání se použije pro vyhodnocení a/nebo předpovězení účinku léčení specifickou protialergickou vakcinací.
• · ♦·· » 4 « • ♦ · · · f · * * · · · · ·· · ·· ··· *· ··· -32(ia’) poskytne se směs kapalné fáze a čtyřsložkového komplexu pevné fáze složeného z (i) protilátky vzorku, (ii) reaktivní protilátky zaměřené proti protilátce vzorku, kde reaktivní protilátka je navázána na pevnou částici, a (iii) ligandu ve formě antigenu, protilátky nebo haptenu, a (iv) značící sloučeniny, za vytvoření čtyřsložkového komplexu pevné fáze, (ib’) čtyřsložkový komplex pevné fáze se oddělí od kapalné fáze, (íc’) oddělený čtyřsložkový komplex pevné fáze se promyje pro odstranění sloučenin, které nejsou vázány v komplexu, (iď) provede se detekce/měření značeného čtyřsložkového komplexu, (j’) porovnají se měření získaná v kroku (h’) a kroku (i’) a srovnání se použije pro vyhodnocení a/nebo předpovězení účinku léčení specifickou protialergickou vakcinací.
5 29. Způsob podle některého z nároků 11 až 28, vyznačující se tím, že protilátkou vzorku je specifický IgE.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DKPA199800821 | 1998-06-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20004867A3 true CZ20004867A3 (cs) | 2001-08-15 |
| CZ300237B6 CZ300237B6 (cs) | 2009-03-25 |
Family
ID=8097940
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20004867A CZ300237B6 (cs) | 1998-06-24 | 1999-06-24 | Zpusob vyhodnocování a/nebo predpovídání úcinku lécení specifickou protialergickou vakcinací |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1090297B1 (cs) |
| JP (1) | JP4523156B2 (cs) |
| KR (1) | KR20010053162A (cs) |
| CN (1) | CN1189749C (cs) |
| AT (1) | ATE403866T1 (cs) |
| AU (1) | AU752093B2 (cs) |
| CA (1) | CA2335615C (cs) |
| CZ (1) | CZ300237B6 (cs) |
| DE (1) | DE69939260D1 (cs) |
| DK (1) | DK1090297T3 (cs) |
| ES (1) | ES2310939T3 (cs) |
| HK (1) | HK1035227A1 (cs) |
| HU (1) | HU228049B1 (cs) |
| PL (1) | PL198236B1 (cs) |
| WO (1) | WO1999067642A2 (cs) |
| ZA (1) | ZA200007681B (cs) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7548839B2 (en) | 1999-10-15 | 2009-06-16 | Hemopet | System for animal health diagnosis |
| US8234099B2 (en) | 1999-10-15 | 2012-07-31 | Hemopet | Computer program for determining a nutritional diet product for a canine or feline animal |
| US6730023B1 (en) | 1999-10-15 | 2004-05-04 | Hemopet | Animal genetic and health profile database management |
| EP2361635A3 (en) * | 2000-08-30 | 2011-09-14 | Pfizer Products Inc. | Anti IgE vaccines |
| US20050069962A1 (en) | 2001-10-12 | 2005-03-31 | Archer Robert M | Antibody complexes and methods for immunolabeling |
| AU2005217696B2 (en) * | 2004-02-26 | 2008-02-14 | Alk-Abello A/S | Method of evaluating the therapeutic potential of a vaccine for mucosal administration |
| US7873482B2 (en) | 2008-12-16 | 2011-01-18 | Bruno Stefanon | Diagnostic system for selecting nutrition and pharmacological products for animals |
| US7867720B2 (en) | 2009-01-26 | 2011-01-11 | Dodds W Jean | Food sensitivity testing in animals |
| US7892763B2 (en) | 2009-01-26 | 2011-02-22 | Dodds W Jean | Multi-stage nutrigenomic diagnostic food sensitivity testing in animals |
| US8450074B2 (en) | 2009-01-26 | 2013-05-28 | W. Jean Dodds | Multi-stage nutrigenomic diagnostic food sensitivity testing in animals |
| CN105277689A (zh) * | 2015-11-17 | 2016-01-27 | 苏州浩欧博生物医药有限公司 | 纳米磁微粒化学发光法检测血清总IgE的试剂盒及方法 |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4444879A (en) * | 1981-01-29 | 1984-04-24 | Science Research Center, Inc. | Immunoassay with article having support film and immunological counterpart of analyte |
| CA1240937A (en) * | 1982-07-26 | 1988-08-23 | Gordon R. Dreesman | Monoclonal igm antibodies and method of preparation |
| US4539292A (en) * | 1982-12-29 | 1985-09-03 | Reid Michael J | Immunoassay technique for specific immunoglobulin E |
| AU2582984A (en) * | 1983-03-17 | 1984-09-20 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Fluorometric assay of total ige levels |
| US5028524A (en) * | 1987-04-24 | 1991-07-02 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Assay for anti-pre-S antibody |
| DE3717401A1 (de) * | 1987-05-23 | 1988-12-08 | Behringwerke Ag | Einschritt-immuntest zur bestimmung von antigen-spezifischen antikoerpern aus einer der immunglobulin-klassen a, m, d oder e und dazu geeignetes mittel |
| AU3696289A (en) * | 1988-06-08 | 1990-01-05 | Cambridge Bioscience Corporation | Anti-fc assay for detection of antibodies |
| AU640635B2 (en) * | 1989-01-30 | 1993-09-02 | Epitope, Inc. | Avidin-biotin assisted immunoassay |
| US5965702A (en) * | 1991-10-21 | 1999-10-12 | Abbott Laboratories | Borrelia burgdorferi antigens and uses thereof |
| DK137992D0 (da) * | 1992-11-13 | 1992-11-13 | Alk Lab As | Fremgangsmaade til paavisning af et immunologisk aktivt stof i en proeve under anvendelse af et maerkningsstof |
| EP0705426A4 (en) * | 1993-06-09 | 1998-07-08 | Quidel Corp | SPECIFIC ONE-STEP TITRATIONS OF AN ANTIGEN |
| US5556759A (en) * | 1993-08-02 | 1996-09-17 | Beach; Peter G. | Assay and method for determining newborn risk for sudden infant death syndrome |
| WO1997001758A1 (en) * | 1995-06-29 | 1997-01-16 | Dako A/S | Method for the simultaneous detection of different antibodies and/or antigens |
| WO1998016829A1 (en) * | 1996-10-15 | 1998-04-23 | Enteron, L.P. | Organism-specific and allergen-specific antibody capture assay and compositions for detection of disease-causing organisms and allergens |
-
1999
- 1999-06-24 DE DE69939260T patent/DE69939260D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-24 DK DK99929109T patent/DK1090297T3/da active
- 1999-06-24 AU AU46033/99A patent/AU752093B2/en not_active Ceased
- 1999-06-24 CA CA2335615A patent/CA2335615C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-06-24 PL PL345727A patent/PL198236B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1999-06-24 CZ CZ20004867A patent/CZ300237B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-06-24 HU HU0103177A patent/HU228049B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1999-06-24 WO PCT/DK1999/000362 patent/WO1999067642A2/en active IP Right Grant
- 1999-06-24 ES ES99929109T patent/ES2310939T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-24 JP JP2000556248A patent/JP4523156B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-06-24 KR KR1020007014736A patent/KR20010053162A/ko not_active Application Discontinuation
- 1999-06-24 EP EP99929109A patent/EP1090297B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-24 AT AT99929109T patent/ATE403866T1/de active
- 1999-06-24 CN CNB998088463A patent/CN1189749C/zh not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-12-20 ZA ZA200007681A patent/ZA200007681B/en unknown
-
2001
- 2001-08-22 HK HK01105917A patent/HK1035227A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUP0103177A2 (hu) | 2001-12-28 |
| KR20010053162A (ko) | 2001-06-25 |
| DK1090297T3 (da) | 2009-01-19 |
| HK1035227A1 (en) | 2001-11-16 |
| PL345727A1 (en) | 2002-01-02 |
| HUP0103177A3 (en) | 2005-11-28 |
| AU752093B2 (en) | 2002-09-05 |
| CN1189749C (zh) | 2005-02-16 |
| CA2335615C (en) | 2010-08-10 |
| ZA200007681B (en) | 2001-06-06 |
| WO1999067642A3 (en) | 2000-06-02 |
| EP1090297A2 (en) | 2001-04-11 |
| DE69939260D1 (de) | 2008-09-18 |
| CA2335615A1 (en) | 1999-12-29 |
| JP4523156B2 (ja) | 2010-08-11 |
| AU4603399A (en) | 2000-01-10 |
| ATE403866T1 (de) | 2008-08-15 |
| WO1999067642A2 (en) | 1999-12-29 |
| CN1310799A (zh) | 2001-08-29 |
| PL198236B1 (pl) | 2008-06-30 |
| EP1090297B1 (en) | 2008-08-06 |
| JP2002519638A (ja) | 2002-07-02 |
| CZ300237B6 (cs) | 2009-03-25 |
| HU228049B1 (en) | 2012-09-28 |
| ES2310939T3 (es) | 2009-01-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Petersen et al. | Performance evaluation of a specific IgE assay developed for the ADVIA Centaur® immunoassay system | |
| RU2058032C1 (ru) | Способ определения веществ, имеющих по меньшей мере одну область антигенной детерминанты | |
| JP3517652B2 (ja) | 中枢神経系の損傷を検出するためのアッセイ | |
| CZ20004867A3 (cs) | Způsob stanovení protilátky pro vyhodnocování účinku léčení | |
| Van Lieshout et al. | Detection of the circulating antigens CAA and CCA in a group of Dutch travellers with acute schistosomiasis | |
| JP3194585B2 (ja) | 化学発光ラベル及びビオチン結合リガンドによる抗体の２サイトイムノアッセイ | |
| US20050239151A1 (en) | Method of detecting an antibody in a liquid sample | |
| CA3181751A1 (en) | Detection of antibodies to sars-cov-2 | |
| US7759133B2 (en) | Method of detecting and/or quantifying a specific IgE antibody in a liquid sample | |
| US20110136261A1 (en) | Method of assaying complex and kit to be used therefor | |
| Ara et al. | Dot‐Elisa for the rapid detection of gentamicin in milk | |
| CN112129933B (zh) | 一种免疫分析系统中抗生物素干扰的试剂、试剂盒及方法 | |
| US20070254322A1 (en) | Complement-based analyte assay | |
| Goryacheva | Rapid tests progress through the years | |
| JPH0688822A (ja) | 水性試料中の被分析物の測定法、測定試薬及び測定試薬キット | |
| JP3309900B2 (ja) | 抗ｆｋｂｐ１２自己抗体の検出方法 | |
| JPH08509064A (ja) | 化学的に架橋したタンパクの固相支持体上の固定化 | |
| JPH06109730A (ja) | Ｔー抗原とｈー抗原を同時に検出する方法 | |
| JP2000187034A (ja) | 免疫測定法 | |
| WO2007137120A1 (en) | In-situ equilibrium dialysis | |
| JP2005308701A (ja) | 抗腎タイプｉｖモノクロ−ナル抗体 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20130624 |