JP4523156B2 - 液体試料中における抗体の検出方法 - Google Patents
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Description
本発明は液体試料中において特異的抗体を検出する方法に関する。
【0002】
従来技術
WO 94/11734には、化学発光標識とビオチン結合リガンドを用いる抗体に対する2部位のイムノアッセイが記述されており、上記方法は、(a)液体試料と、リガンド抗原、ビオチンまたはその官能性誘導体に結合されている抗体またはハプテン、常磁性粒子に結合されている検出対象の抗体に特異的な抗体及びアビジン、ストレプトアビジンまたはこれらの官能性誘導体に結合されている化学発光を持つアクリジニウム化合物とを混合して、固相複合体を形成し、(b)液相から固相を磁気的に分離し、(c)存在する場合、分離された固相中で化学発光反応を開始し、そして、(d)試料中の上記抗体の存在を示す、化学発光相の存在について分離された固相を分析するステップを含んでなる。
【0003】
従来技術の方法は、IgA、IgD、IgE、IgG、IgM及びこれらのサブクラスの群から選ばれる特異的免疫グロブリン等の体液中の特異的免疫グロブリンの濃度を測定するのに特に好適である。
【0004】
従来技術の方法は、また、IgA、IgD、IgE、IgG、IgM及びこれらのサブクラス等のクラスまたはサブクラスにおける免疫グロブリンの全含量の検出及び定量にも好適である。
【0005】
従来技術の方法の好ましい実施形態において、固相複合体の形成は2ステップで、すなわち、試料と、ビオチンを結合したリガンド抗原、抗体またはハプテン及び常磁性粒子に結合されている抗体とを混合して、第1の固相複合体を形成させる第1のステップ、及び第1の固相複合体に化学発光を持つアクリジニウム化合物を添加して、第2の固相複合体を形成させる第2のステップで行われる。
【0006】
しかしながら、従来技術の方法の実際的な使用により、この方法のある用途においては、他の型の免疫グロブリン及び/または測定対象以外の他の型の免疫活性血清成分による干渉が起こり、得られる結果の誤差に至るという事実が明らかになった。
【0007】
「特異的IgEに対する捕捉アッセイ、V. Olivieriら、Journal of lmuuunological Methods,I57(1993)65−72」という論文には、溶液中でモノクローナル抗ヒトIgE(マイクロタイタープレートの穴にコートされた)とビオチニル化アレルゲンを用いてアレルギー患者の血清中の特異的IgEを測定するアッセイが開示されている。一度のインキューベーションにおいて、IgEは、Fcフラグメントにより固相に結合し、ビオチニル化アレルゲンは、特異的IgEのFab領域と反応する。第2のステップにおいては、ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ共役体が添加されて、固相に固定されたビオチン量を明らかにする。この論文は、高レベルの非特異的IgEと、アレルゲン特異的IgGによる干渉を研究する。このアッセイは、アレルゲン特異的IgGにより影響を受けないことがわかった。
【0008】
WO98/16829には、抗免疫グロブリンがマイクロタイタープレートの穴と結合し、次に洗浄されるアッセイが開示されている。次に、試験血清を穴に添加して、試験試料中の全標的免疫グロブリンをすべて捕捉する。次に、生物学的流体試料を吸引し、マイクロタイタープレートを洗浄する。マイクロタイタープレート上の捕捉抗体をビオチニル化アレルゲンに曝露し、プレートを洗浄し、ストレプトアビジン/アルカリ性ホスファターゼ共役体を添加し、再度プレートを洗浄する。標準的な抗生物質治療によるH.Pylori感染治療に及ぼす影響をモニターするために、従来技術のアッセイが使用されうる。
【0009】
発明の要約
本発明の第1の目的は、固体粒子に結合したFc特異的な抗体とFab特異的なリガンドに標的抗体を複合化させ、試験試料の他の成分からの干渉という上記に説明した欠点に悩まされないタイプの方法を提供することである。
【0010】
この第1の目的は本発明の方法により達成され、その第1の態様は請求項1から6に定義される。本発明の本質的な新しい特徴は、リガンドの添加に先立ち、反応物抗体を持つ粒子と試料抗体からなる中間の固相複合体を分離、洗浄する追加のシーケンスを行うことである。
【0011】
本発明の方法は、このような分離と洗浄の追加のシーケンスを導入することにより、液体試料から潜在的に干渉性の過剰な材料並びに潜在的に干渉性の過剰な成分(ii)をこの方法から除去し、それにより以降のステップにおける上記の因子の干渉のリスクが無くされるという認識に基づく。驚くべきことに、このような分離と洗浄の追加のシーケンスは、異るタイプの免疫活性血清成分の間の干渉の技術的問題を実質的に低減し、ある場合には無くすることがわかった。
【0012】
得られる干渉の低減は多くの技術的利点を含む。特に、困難で、予測できない比の抗体混合物を有する問題の血清を更に正確に測定することが可能になる。更に、抗体を誤って陽性に同定することが回避される。また、干渉の低減により、従来技術の方法によるよりも広い抗体濃度範囲で更に正確な測定が可能になる。
【0013】
本発明の第2の目的は、特異的アレルギーワクチン注射(Specific Allergy Vaccination)(SAV)の効果を評価及び/または予測することが可能な方法を提供することである。
【0014】
この第2の目的は、請求項7から12に定義される、本発明の第2の態様により得られる。この態様によれば、異るタイプの免疫活性血清成分、例えば抗体の間の干渉のレベル、性質及び一時的な発現は、特異的アレルギーワクチン注射治療の効果を評価及び/または予測するパラメーターとして使用される。このように、驚くべきことに、上記パラメーターは、人の免疫状態並びに選ばれた治療スキームへの応答について貴重な情報を保持することがわかった。
【0015】
本発明の第3の目的は、対象の免疫状態を評価する方法を提供することである。
【0016】
本発明の第3の目的は、請求項20から31に定義される、本発明の第3の態様により得られる。この態様によれば、異るタイプの免疫活性血清成分、例えば抗体の間の干渉のレベル、性質及び一時的な発現は、対象の免疫状態を評価するパラメーターとして、特にアレルギー治療、アレルギーワクチン注射治療または特異的アレルギーワクチン注射治療の効果を評価及び/または予測するパラメーターとして使用される。このように、驚くべきことに、上記パラメーターは人の免疫状態並びに選ばれた治療スキームへの応答についての貴重な情報を保持することがわかった。
【0017】
本発明の第4の目的は、対象のアレルギー治療の効果を評価する方法を提供することである。
【0018】
本発明の第4の目的は、請求項32から35に定義される、本発明の第4の態様により得られる。本発明のこの態様は、サブアッセイ1、A及びC(それぞれ、請求項20、21及び29を参照のこと)により得られる測定、すなわち、試料中の干渉性因子の存在下で行う測定は、アレルギー治療、アレルギーワクチン注射治療及び特異的アレルギーワクチン注射治療(SAV)の効果を評価するのに特に有用であるという認識に基づく。このように、この方法により得られる測定は、インビボ条件に相当する条件下で得られ、それゆえ、治療効果を評価するための更に生理学的で臨床的関連測定である。
【0019】
本発明の第1の態様
本発明の第1の態様の好ましい実施形態は、ステップ(r’)、(r)または(r”)の成分(iii)及びステップ(s’)、(s)または(s”)の成分(iv)をそれぞれ一つの操作で添加することを特徴とする。
【0020】
本発明の第1の態様の第1の別な実施形態は、ステップ(s’)、(s)または(s”)にかけるのに先立ち、ステップ(r’)、(r)または(r”)において形成される3成分固相複合体をそれぞれ洗浄して、非複合体結合化合物を除去することを特徴とする。
【0021】
本発明の第2の態様
以前、特異的免疫療法または減感作として知られていた特異的アレルギーワクチン注射(SAV)は、この世紀の初頭以来、タイプ1IgE仲介のアレルギー疾患の治療に使用されてきた。
【0022】
SAVにより得られる全般的な利益は、a)アレルギー症状及び薬の消費の減少、b)目、鼻及び肺中のアレルゲンに対する耐性の改善及びc)皮膚の反応性の低下(早期及び後期反応)である。
【0023】
SAVにより得られる改善の背後にある基本的な機構は未知であるが、最近数十年で行われた多数のSAVの研究から、次の多数の共通した特徴を抽出することができる:1)全IgEの量は治療期間の間変化しない、2)アレルゲン特異的IgEの量は、用量を上げる(updosing)時、過渡的に増加し、次に低下して、初期(前治療)レベルに戻る、3)IgEのエピトープ特異性及び親和性は、変化しないままである、4)アレルゲン特異的IgG、特にIgG4はSAV時急激に上昇する、5)新しいTh0/1応答は見掛け上開始する、6)Th2応答は変化しないように見える。SAVにより誘導される効果と特異的IgGの発現の間に相関はない。
【0024】
SAVは、治療期間の間成熟する新しい免疫応答を誘導する(Th0/1細胞が補強され、アレルゲン特異的IgX(XはA1、A2、G1、G2、G3、G4、MまたはDであってよい)が開始する)。新しい免疫応答のIgXの親和性(または量/親和性)が成熟したのに従い、IgXはアレルゲンに対してIgEと効率的に競合し、肥満細胞及び好塩基球の表面上の受容体を結合したIgEの架橋により特徴付けられるアレルギー応答に基づく「正常な」Th2を阻害する。それゆえ、臨床的な症状は徐々に低減される。
【0025】
本発明は、競合化合物(IgG及び/または任意の他の干渉物質)の存在下及び不在下で特異的IgEの量を測定すると、個別患者における免疫応答の競合能力の目安が計算され、この目安が適当な効果パラメーターと相関するという仮説に基づく。
【0026】
従来技術の「定量的な」IgEアッセイは大多数、競合化合物の不在下でIgEを測定する。本発明は、任意(血清起源の)の競合化合物の存在下及び不在下でのIgEの測定を記述する。このように、請求項1から6(図2aからcを参照)に定義される方法は、競合化合物の不在下でIgEを測定し、一方、請求項7から12のステップ(i’)、(i)、(i”)、(y’)、(y)及び(y”)に定義される方法は、それぞれ競合化合物の存在下でIgEを測定する。
【0027】
本発明の方法の作用モードは、次のように説明されると考えられる。SAVがアレルゲンの結合に対してIgEと競合する応答を誘導するならば、上述の2つの方法により定量されるIgEを比較することにより、治療の効果を測定することが可能であるはずである。2つの方法が同じ結果を生むならば、干渉物質は誘導されていず、効果はない。更に、後者の方法(競合化合物の存在下)の測定が前者の方法(競合化合物の不在下)の測定よりも低いならば、競合応答が組み込まれており、治療の効果がある。
【0028】
本発明の第2の態様(請求項7から12)として、この方法において2つのサブアッセイが使用される。それぞれ他の試料構成成分の不在下(サブアッセイ(h’)、(h)、(h”)、(x’)、(x)及び(x”))及び存在下(サブアッセイ(i’)、(i)、(i”)、(y’)、(y)及び(y”))で、試料抗体とアレルゲンの間の反応を行うサブアッセイである。
【0029】
サブアッセイ(h)及び(h”)においては、化学発光性標識はアクリジニウム化合物である。
【0030】
サブアッセイ(h’)、(h)及び(h”)の好ましい実施形態は、ステップ(a’)、(a)または(a”)において、成分(i)、(ii)及び(iii)を一つの操作で混合することを特徴とする(図3b)。
【0031】
サブアッセイ(h’)、(h)及び(h”)の第1の別の実施形態は、ステップ(a’)、(a)または(a”)において、成分(i)及び(ii)を第1の操作で混合し、成分(iii)を第2の操作で混合することを特徴とする(図3c)。
【0032】
第2の別のサブアッセイ(h’)、(h)及び(h”)は、ステップ(a’)、(a)または(a”)において、成分(i)及び(iii)を第1の操作で混合し、成分(ii)を第2の操作で混合することを特徴とする(図3a)。
【0033】
本発明の第2の態様の好ましい実施形態は、成分(i)と(ii)を混合し、次に、成分(iii)を添加し、最後に、添加する場合には、成分(iv)を添加することにより、ステップ(ia’)、(ia)、(ia”)、(ya’)、(ya)または(ya”)を行うことを特徴とする。
【0034】
本発明の第2の態様のもう一つの好ましい実施形態は、成分(i)、(ii)及び(iii)を混合し、次に、最後に、添加する場合には、成分(iv)を添加することにより、ステップ(ia’)、(ia)、(ia”)、(ya’)、(ya)または(ya”)を行うことを特徴とする。
【0035】
更なる好ましい実施形態は、上記2つのステップの測定の比を計算することにより、ステップ(j’)、(j)、(j”)、(z’)、(z)または(z”)の比較を行うことを特徴とする。あるいは、比較は、2つの測定の間の差を計算することにより行われる。
【0036】
本発明の次の更なる実施形態は、上記2つのステップの測定の比を計算することにより、治療期間のスタートの時点及び治療期間の間の多数のポイントにおいて、ステップ(j’)、(j)、(j”)、(z’)、(z)または(z”)の比較を行うこと、また、治療の効果を評価及び/または予測するための基礎として、観察されうるいいかなる一時的な変化も使用することを特徴とする。
【0037】
本発明の第3の態様
本発明の第3の態様は、第2の態様と同じ認識及び仮説に基づくが、その差異は、第3の態様がいかなる特定のイムノアッセイ法にも限定されないことである。また、第3の態様によれば、すべてのタイプのアレルギー治療の効果を予測するためにこのアッセイが使用されうる。
【0038】
2つの測定の間の比または差を計算することにより、得られた2つの測定の相互関係付けが行われる。
【0039】
「アレルギー治療」という用語は、アレルギーのいかなる治療も意味する。「アレルギーワクチン注射治療」という用語は、アレルギーのいかなるワクチン注射治療も意味する。「特異的アレルギーワクチン注射治療(SAV)」という用語は上述されている。
【0040】
定義
本発明においては、「試料の抗体」及び「試料抗体」という表現は、特異的免疫グロブリン、好ましくはクラスIgA、IgD、IgE、IgG、IgM及びこれらのサブクラスの特異的免疫グロブリンを意味する。一般に、上記抗体は、免疫グロブリンと抗原、抗体またはハプテン、例えば酵素阻害剤及び受容体の形のリガンドの間の相互作用を特異的に干渉することが可能ないかなる血清または血漿成分であってよい。
【0041】
「液体試料」という用語は、溶液、エマルジョン、分散剤及び懸濁剤を含む、いかなる液体あるいは液化試料も意味する。試料は、血液、血漿、血清、尿、唾液及び生物体内で排泄、分泌あるいは輸送される任意の他の流体等の生物学的流体であってよい。
【0042】
「抗原、抗体またはハプテンの形のリガンド」という表現は、いかなる免疫的に活性な物質であってもよい。「抗原」は、アレルゲン、例えば木、草、雑草などからの花粉、かびアレルゲン、コナダニ(ダニ)及び猫、犬、馬、牛及び鳥からのアレルゲン、刺す昆虫のアレルゲン、昆虫に起源する吸い込まれたアレルゲン、及び食物アレルゲンであってよい。「抗体」は組み替え型及びフラグメント化抗体を含む、モノクローナルあるいはポリクローナル抗体であってよい。「ハプテン」は、炭水化物部分またはそのフラグメント、酵素阻害剤または薬剤、例えばペニシリンまたはその誘導体であってよい。
【0043】
「標識されたリガンド」という表現は、標識された原子または部分、例えば放射性原子標識を含むいかなるリガンドも意味する。
【0044】
「標識化合物」という表現は、発光性標識、化学発光性標識、酵素標識、放射性標識、蛍光性標識、及び吸光性標識を含むイムノアッセイに慣用されるいかなる好適な標識系も意味する。
【0045】
「キャリア」という用語は、イムノアッセイに使用されるいかなる固体支持体も意味し、それは、例えば、マイクロタイタープレート、粒子、管、ポリマー材料のスポンジ(マトリックス)である。
【0046】
「固体粒子」という用語は、液体中に懸濁することができる、いかなる粒状物質も意味し、それは例えば、ガラスビーズ、金属、例えば鉄粒子、ポリマー材料の粒子である。
【0047】
液相からの固相複合体の分離は、使用される固体粒子のタイプに依り、磁気分離、濾過、沈降、遠心分離、クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィーにより行われる。
【0048】
「常磁性固体粒子」という用語は、液体媒体中に分散あるいは懸濁される、いかなる常磁性粒子も意味し、それは、例えば、米国、Advanced Magnetics Inc.,により販売されている「ビオマグ(Biomag)」粒子(アミン末端基で被覆された酸化鉄粒子)、及びノルウエー、Dynal A.S.により販売されている「ダイナビーズ(Dynabeads)」粒子(ポリマーで被覆された酸化鉄粒子)である。
【0049】
「反応物抗体」という用語は、組換え型及びフラグメント化抗体を含む、モノクローナルあるいはポリクローナル抗体を含んでなる試料抗体と反応することが可能ないかなる抗体または他の生物特異的試剤も意味し、それは、例えば、モノクローナル抗体、スエーデン、BioInvent International ABにより供給されている「プロテインA(Protein A)」または米国セントルイス、Sigma Chemical Company」により供給されている「プロテインG(Protein G)」を含む。
【0050】
化学発光化合物は、好ましくはN−ヒドロキシ−スクシニミドジメチルアクリジニウムエステル(NHS−DMAE)等のアクリジニウム化合物である。アビジン/ストレプトアビジン及びDMAEは、Weeksら,Clinical Chem.,29,1474−1479(1983)の方法にしたがって結合される。本発明における使用に好適な化学発光化合物の他の例は、ルミノール、ルシゲニン及びロフィンである。
【0051】
次に、図に関して本発明を更に詳細に説明する。
【0052】
図面の簡単な説明
図1aからbは、WO94/11734に開示されている従来技術のアッセイの2つの実施形態(従来技術の方法A及びB)の図表示である。
【0053】
図2aからcは、請求項7から9(サブの方法)に定義される方法における使用に好適な3つの好ましいアッセイの図表示である。
【0054】
図3aからcは、本発明の第1の態様による3つの好ましいアッセイの図表示である。
【0055】
図4から6は、それぞれ、従来技術の方法B、本発明の方法1及び本発明のサブの方法1による特異的IgEの濃度の関数としての化学発光レベルを示す。
【0056】
図7は、従来技術の方法B、本発明の方法1及び本発明のサブ方法1による干渉性抗体の含量の関数としての相対的な化学発光レベルを示す。
【0057】
図8から12は、特異的アレルギーワクチン注射を受けた患者からの4つの試料及び一つの参照試料(図12)についての従来技術の方法B及び本発明の方法1による希釈ファクターの関数としての化学発光レベルの予測レベルに対する計算発光レベルを示す。
【0058】
図13から14は、それぞれ、従来技術の方法B及び本発明の方法1による0、6及び12ケ月での特異的アレルギーワクチン注射及びプラセボ治療を受けた患者に対する相対的な応答を示す。
【0059】
図15は、方法1により得られた応答に対する従来技術の方法Bにより得られた応答の比を示す。
【0060】
図16から18は、有効、無効及び疑問の3つの臨床効果群に対する0、6及び12ケ月の時点での相対的なIgEレベルを示す。
【0061】
図19は、種々のSAV治療用量に対する方法1により得られた応答に対する従来技術の方法Bにより得られた応答の時間の関数としての比を示す。
【0062】
図20は、それぞれ臨床効果のある患者と臨床効果のない患者に対して、方法1により得られた応答に対する従来技術の方法Bにより得られた平均応答の時間の関数としての比を示す。
【0063】
図21は、臨床効果のある個別患者に対する方法1により得られた応答に対する従来技術の方法Bにより得られた応答の時間の関数としての比を示す。
【0064】
図22は、臨床効果のない個別の患者に対する方法1により得られた応答に対する従来技術の方法Bにより得られた応答の時間の関数としての比を示す。
【0065】
図1aは、WO94/11734に開示されているアッセイの一つの実施形態の原理を示す。このアッセイにおいては、試料(i)中の検出対象の抗体(特異性IgE)を常磁性粒子に結合した反応物抗体と混合して、2成分の複合体を形成し、インキュベートし、次に、ビオチニル化されたアレルゲン(iii)を添加して3成分の複合体を形成し、インキュベートして、次に、それに、アビジン/ストレプトアビジン(iv)に結合した化学発光性アクリジニウム化合物を添加して4成分の複合体を形成し、洗浄して、次に、洗浄した複合体の化学発光を測定する。
【0066】
図1bは、従来技術のアッセイのもう一つの実施形態を示す。そこでは、成分(i)及び(iii)を混合して2成分の複合体を形成し、また、次に成分(ii)及び(iv)を添加し、得られる混合物をインキュベートして4成分の複合体を形成し、洗浄し、化学発光の測定にかける。
【0067】
図1a及び1bのアッセイにおいては、交差反応性IgE抗体及びアレルゲン特異的非IgE抗体を含む、試料のすべての構成成分は、以降の反応中に存在して、4成分の複合体の形成につながる。
【0068】
図2aは、本発明の第2の態様の好ましい実施形態(請求項2)を示す。そこでは、成分(i)及び(ii)を混合し、インキュベートして2成分の複合体を形成し、洗浄する。次に、それに成分(iii)を添加して3成分の複合体を形成し、その後、成分(iv)を添加して4成分の複合体を形成し、洗浄して、化学発光の測定にかける。
【0069】
図2bは、本発明の第2の態様のもう一つの好ましい実施形態(請求項5)を示す。これは、成分(iii)及び(iv)を一つの操作で添加することを除いて、図2aに示したものに対応する。
【0070】
図2cは、本発明の第2の態様の更なる好ましい実施形態(請求項6)を示す。これは、成分(iv)の添加の前に、形成された3成分の複合体を洗浄ステップにかけることを除いて、図2aに示したものに対応する
図2a、2b及び2cのアッセイにおいては、交差反応性IgE抗体及びアレルゲン特異的非IgE抗体を含む、試料のすべての構成成分を、成分(ii)との反応の後除去する。それゆえ、以降の反応中には不在であって、4成分の複合体の形成につながる。
【0071】
図3aは、請求項7から9のサブアッセイ(h’)、(h)及び(h”)の好ましい実施形態を示す。そこでは、成分(i)及び(iii)を第1の操作で混合して、2成分の複合体を形成し、次に、それに成分(ii)を第2の操作で添加して、得られる混合物をインキュベートして3成分の複合体を形成し、成分(iv)を添加する前に洗浄して、化学発光の測定にかける。
【0072】
図3bは、請求項7から9のサブアッセイ(h’)、(h)及び(h”)のもう一つの好ましい実施形態を示す。そこでは、成分(i)、(ii)及び(iii)を一つの操作で混合して3成分の複合体を形成し、洗浄し、その後に、成分(iv)を添加して4成分の複合体を形成し、化学発光の測定にかける。
【0073】
図3cは、請求項7から9のサブアッセイ(h’)、(h)及び(h”)の更なる好ましい実施形態を示す。そこでは、成分(i)及び(ii)を混合して、2成分の複合体を形成し、それに成分(iii)を添加して3成分の複合体を形成し、それを洗浄して、その後、成分(iv)を添加して4成分の複合体を形成し、これも洗浄して、化学発光の測定にかける。
【0074】
図3a、3b及び3cのアッセイにおいては、交差反応性IgE抗体及びアレルゲン特異的非IgE抗体を含む、試料のすべての構成成分を、成分(ii)及び(iii)との反応の後除去する。それゆえ、以降の反応中には不在であって、4成分の複合体の形成につながる。
【0075】
次に、本発明は実施例を参照して更に詳細に説明される。
【0076】
試薬の調製
ビオチニル化ヤケヒョウヒダニ
ヤケヒョウヒダニ(Dermatophagoides pteronyssinus)抽出物(ALK−アベロウ A/S、ホーショルム、デンマーク)を30:1のモル比でビオチニル化する。ビオチンアミドカプロン酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(Biotin−XX−NHS、クロンテック社製、米国)をジメチルホルムアミド(メルク社製)に溶解し、最終濃度を25mg/mlとする。Biotin−XX−NHSのこの溶液55.4μlを、2.44mg/mlのヤケヒョウヒダニ1mlを含有するpH8.5、0.1MのNaHCO3に加える。その試薬を「振盪回転」ミキサーにおいて25℃で15分間インキュベートする。ビオチニル化抽出物はPD10−カラム(ファルマシア社製)のサイズ排除クロマトグラフィーによって非結合ビオチンから精製される。アレルゲンを含むその画分を収集する。ビオチニル化ヤケヒョウヒダニを0.1%ヒト血清アルブミン(シグマ社製)と0.09%NaN3(メルク社製)を含むpH7.2のリン酸緩衝食塩水(PBS)で希釈する。
【0077】
ビオチニル化アルテルナリアアルテルナータ
アルテルナリアアルテルナータ(Alternria alternata)抽出物(ALK−アベロウ A/S、ホーショルム、デンマーク)を30:1のモル比でビオチニル化する。ビオチンアミドカプロン酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(Biotin−XX−NHS、クロンテック社製、米国)をジメチルホルムアミド(メルク社製)に解し、最終濃度を25mg/mlとする。Biotin−XX−NHSのこの溶液38.6μlを、1.7mg/mlのアルテルナリアアルテルナータ1mlを含有するpH8.5、0.1MのNaHCO3に加える。その試薬を「振盪回転」ミキサーで25℃、15分間インキュベートする。ビオチニル化抽出物はPD10−カラム(ファルマシア社製)でのサイズ排除クロマトグラフィーにより非結合ビオチンから精製される。アレルゲンを含むその画分を収集する。ビオチニル化アルテルナリアアルテルナータを0.1%ヒト血清アルブミン(シグマ社製)と0.09%NaN3(メルク社製)を含むpH7.2のリン酸緩衝食塩水(PBS)で希釈する。
【0078】
ビオチニル化シラカンバ(シダレカンバ)
シラカンバ(Betula verrucosa)花粉抽出物(ALK−アベロウ A/S、ホーショルム、デンマーク)を10:1のモル比でビオチニル化する。ビオチンアミドカプロン酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(Biotin−XX−NHS、クロンテック社製、米国)をジメチルホルムアミド(メルク社製)に溶解し、最終濃度を25mg/mlとする。Biotin−XX−NHSのこの溶液33.5μlを、4.4mg/mlのシラカンバ1mlを含有するpH8.5、0.1MのNaHCO3に加える。その試薬を「振盪回転」ミキサーで25℃、15分間インキュベートする。ビオチニル化抽出物はPD10−カラム(ファルマシア社製)でのサイズ排除クロマトグラフィーによって非結合ビオチンから精製される。アレルゲンを含むその画分を収集する。ビオチニル化シラカンバを0.1%ヒト血清アルブミン(シグマ社製)と0.09%NaN3(メルク社製)を含むpH7.2のリン酸緩衝食塩水(PBS)で希釈する。
【0079】
ストレプトアビジンアクリジニウムエステル標識の調製
ウィークス(Weeks)らの変法を用いて、ストレプトアビジン(ベーリンガーマンハイム社製)をNSP−DMAE−NHS{2’,6’−ジメチル−4’−(N−スクシンイミジルオキシカルボニル)フェニル−10−(3−スルフォプロピル)−アクリジニウム−9−カルボン酸塩}でコンジュゲートする(参照文献1)。
【0080】
ストレプトアビジン−アクリジニウムエステル標識(ライト試薬)の調製:
NSP−DMAE−NHS(カイロンダイアグノスティクス社製、マサチューセッツ州、米国)をジメチルホルムアミド(メルク社製)に溶解し、最終濃度を1mg/mlとする。この溶液0.5mlを5.88mg/mlストレプトアビジンを含むpH8.5、0.15MのNaCl、0.1Mのリン酸ナトリウム緩衝液の1.7mlに加える。その試薬を25℃で30分間攪拌しながらインキュベートする。インキュベーション後に20mg/mlの6−アミノ−n−ヘキサン酸(シグマ社製)0.4mlを加える。非結合DMAEを除去するため、溶液をPD−10カラム(ファルマシア社製、ウプサラ市、スウェーデン)に充填する。コンジュゲート化ストレプトアビジンをpH7.2のリン酸緩衝食塩水(PBS)で溶離し、コンジュゲート化ストレプトアビジンを含んでいる画分を収集する。コンジュゲート化ストレプトアビジンを0.1%ヒト血清アルブミン(HSA)(シグマ社製)と1%Tween20(メルク社製)と0.09%NaN3を含むpH7.2のリン酸緩衝食塩水(PBS)で最終濃度まで希釈する。
【0081】
常磁性粒子への抗体の不動化:
6.5gの常磁性粒子(カイロンダイアグノスティクス社製、マサチューセッツ州、米国)を磁気分離を用いてpH5.5、0.01Mのアセテート緩衝液650mlで3回洗浄する。粒子を6.25%グルタルアルデヒド(メルク社製)とpH5.5の0.01Mアセテート緩衝液中で25℃で、3時間活性化する。粒子をpH5.5のアセテート緩衝液650mlで6回洗浄する。粒子をIgEのFc領域に対して特異的なモノクローナル抗IgE抗体(バイオインベントインターナショナルAB社製、スウェーデン)1625mgと25℃、16時間結合させる。粒子をpH7.4の0.01Mリン酸緩衝液650mlで2回洗浄する。過剰な活性群の阻止をpH7.4の0.01Mリン酸緩衝液に溶解したヒト血清アルブミン(HAS)1083mgで25℃で、20時間行なう。粒子をpH7.4の0.01Mリン酸緩衝液650mlで洗浄し、次いで1MのNaCl溶液(メルク社製)650mlで3回洗浄する。粒子をpH7.4の0.01Mリン酸緩衝液で3回洗浄し、次いでpH7.4の0.1%ヒト血清アルブミン、リン酸緩衝液650ml(シグマ社製)で洗浄する。粒子を325mlで再懸濁し、50℃で16時間加熱処理する。粒子をpH7.4の0.01Mリン酸緩衝液650mlと0.1%ヒト血清アルブミン中で4回洗浄する。粒子をpH7.4の0.1%ヒト血清アルブミン、0.01Mリン酸緩衝液650ml中で3日目と5日目に緩衝液を交換しながら、37℃で7日間加熱処理する。粒子を0.1%ヒト血清アルブミン(シグマ社製)と0.09%NaN3を含むpH7.2のリン酸緩衝食塩水(PBS)で最終濃度まで希釈する。
【0082】
アッセイ用洗浄緩衝液
アッセイ用洗浄緩衝液はpH7.4の200mMのリン酸カリウム緩衝液と、100mMの塩化カリウム溶液と、0.1%Tween20と、0.09%NaN3から成る。試薬は全てメルク社製である。
【0083】
実施例1
特異抗体の測定(特異的IgE)
シラカンバ(シダレカンバ)アレルゲンに対する特異的IgE抗体の測定をそれぞれの方法で定められた検量希釈において上記に詳述した試薬を用いて三つの異なる方法で行った。三方法は先行技術方法B(図1b)と、この発明に関する方法1(図2a、請求項2)およびこの発明に関する副法1(図3a)である。
【0084】
先行技術方法B
この方法は参照文献2に記載されるチバコーニング社製ACS:180ベンチトップ型免疫分析機で行なう。分析機は通常2回のインキュベーション時間を提供するため40秒周期のソフトウェアを特別に備えている。試料50μlと1:1500希釈したビオチニル化シラカンバアレルゲン50μlを試料プローブによってキュベットに分注する。インキュベーション12分後にキュベットが試薬プローブR2に達すると、1:20希釈した常磁性粒子100μlと1:10000希釈したライト試薬200μlが同時に分注されて、キュベットはトラックを降りる。磁石および洗浄位置には、さらに12分40秒のインキュベーション後に到達する。脱イオン水750μlで洗浄を2回行なう。洗浄サイクル完了後、0.5g/lH2O2を300μl含有する0.1MのHNO3で常磁性粒子を再懸濁する。キュベットはルミノメータチャンバーに入り、光電子倍増管の正面で25mMのNaOH溶液300μlが加えられ、放出される光の光子を測定、定性し、相対的光単位(RLU)として表す。RLUの量は試料中のIgEの量に比例する。試料分注から最初の結果が出るまでの時間は30分であり、40秒毎に新しい結果が続く。結果はRLU実測値/RLUバックグラウンドとして表し、ここでRLUバックグラウンドはIgEを欠いた化学発光反応とした。
【0085】
方法1
この方法は参照文献2に記載されるチバコーニング社製ACS:180ベンチトップ型免疫分析機の改良型で行なう。試料25μlを試料プローブでキュベットに分注し、その後直ちに1:20希釈した常磁性粒子100μlを固定されたプローブで分注する。8分のインキュベーション後、常磁性粒子を磁気的に分離し1mlの洗浄緩衝液で1回洗浄する。常磁性粒子を100μlの洗浄緩衝液に再懸濁し、1:1500希釈したビオチニル化シラカンバアレルゲン50μlをキュベットに加える。10分のインキュベーション後、1:1500希釈したライト試薬100μlを固定されたプローブで分注し、さらに8分のインキュベーション後、常磁性粒子を磁気的に分離し、1mlの洗浄緩衝液で3回洗浄する。洗浄サイクル完了後、0.5g/lH2O2を300μl含有する0.1MのHNO3に常磁性粒子を再懸濁する。キュベットはルミノメータチャンバーに入り、光電子倍増管の正面で25mMのNaOH溶液300μlが加えられ、放出される光の光子を測定、定量し、相対的光単位(RLU)として表す。RLUの量は試料中のIgEの量に比例する。結果はRLU実測値/RLUバックグラウンドとして表し、ここでRLUバックグラウンドはIgEを欠いた化学発光反応とした。
【0086】
副法1
この方法は5mlポリスチレン試験管(サーステッド社製)で手動で行なう。試料25μlを1:50希釈したビオチニル化シラカンバアレルゲン50μlと混合する。37℃で12分インキュベーション後、1:20希釈した常磁性粒子100μlを加え、常磁性粒子を磁気的に分離する前に混合物を37℃で5分30秒間インキュベートし、マジックライトマルチチューブウォッシャー(Magic Lite Multitube Washer)(ALK−アベロウ A/S、ホーショルム、デンマーク)を用いて洗浄緩衝液3mlで1回洗浄する。常磁性粒子を1:10000希釈したライト試薬200μlで再懸濁し、常磁性粒子を磁気的に分離する前に37℃で7分30秒間インキュベートし、マジックライトマルチチューブウォッシャー(Magic Lite Multitube Washer)(ALK−アベロウ A/S、ホーショルム、デンマーク)を用いて洗浄緩衝液3mlで2回洗浄する。常磁性粒子を100μlの脱イオン水に再懸濁し、まず0.5g/lH2O2を300μl含有する0.1MのHNO3を、次いで25mMのNaOH溶液300μlを加えて、化学発光反応をマジックライトアナライザーII(Magic Lite AnalyzerII)(ALK−アベロウ A/S、ホーショルム、デンマーク)で測定する。放出される光の光子を測定、定量し、相対的光単位(RLU)として表す。RLUの量は試料中のIgEの量に比例する。結果はRLU実測値/RLUバックグラウンドとして表し、ここでRLUバックグラウンドはIgEを欠いた化学発光反応とした。
【0087】
バーチ花粉感受性患者5人の血清プールを140SU/mlから1.1SU/mlまで8試料を与えるため2倍連続希釈した。これら8試料を陰性試料(バックグラウンド)とバーチ花粉感受性患者からの8試料と共に上述した三つの方法で同時に測定した。それぞれ図4、5および6を参照のこと。測定した全ての試料は三つの方法全てを用いて陽性として検出可能であると結論付けられる。
【0088】
実施例2
他のクラス(IgG)由来の特異的抗体との干渉
シラカンバ(シダレカンバ)アレルゲンに対する特異的IgEの測定を匹敵する特異的抗体の変化量の存在において、実施例1に記載したような異なる三つの方法で行った。より具体的には、バーチ花粉感受性患者5人の血清プールを異なる力価のウサギポリクロナール抗シラカンバ抗体(ALK−アベロウ A/S、ホーショルム、デンマーク)を含むIgE陰性血清と1:5の割合で混合した。対照はウサギ抗体を含まなかった。
【0089】
図7に示された結果を対照に対する試料中のウサギ抗体で得られた応答として計算した%回収として表す。応答はシグナル/バックグラウンドで与えられる。100%未満の回収は拮抗する抗体の付加により応答が減少するが、100%より上の回収は拮抗する抗体の付加により応答が増大することを示す。
【0090】
方法1は同時の方法よりも他のクラス由来の拮抗する抗体による干渉が少ないと結論付けられる。拮抗する抗体の添加が副法1において有意の陽性干渉で、特に高い量の干渉している抗体を伴う結果となるのに対し、方法1においては干渉は完全に除かれているように思われる。
【0091】
実施例3
特異的アレルギーワクチン(SAV)を接種している患者からの試料との希釈曲線
ビオチニル化アルテルナリアアルテルナータアレルゲンをビオチニル化シラカンバアレルゲンの代わりに用いることを以外は、アルテルナリアアルテルナータ(カビ)アレルゲンに対する特異的IgEの測定を実施例1に記載の先行技術方法Bおよび方法1で行なった。ビオチニル化アルテルナリアアルテルナータアレルゲンの検量希釈は先行技術方法および方法1の双方において1:400であった。
【0092】
特異的アレルギーワクチン(SAV)を接種した患者4人からの血清をそれぞれ異なる二つの方法での測定に先立ち、4つの試料を与えるため2倍連続希釈した。参照試料として、アルテルナリアアルテルナータ感受性患者5人の血清プールを用いた。
【0093】
図8から12はSAV患者4人の試料と参照試料に関する結果を示す。図8から12に示される結果は予想される応答に対して異なる希釈血清で得られた応答である。%回収は(希釈力価)×(観察された応答)/(希釈されない試料の応答)の形で計算される。応答はシグナル/バックグラウンドで与えられる。100%以下の回収は希釈した血清の応答が予想したよりも低いことを示すが、100%よりも高い回収は予想したよりも高いことを示す。それゆえに100%よりも高い回収は希釈していない試料で得られた応答が真の値よりも低く評価されていることを示す。
【0094】
図8から12からは、SAV試料については先行技術方法は希釈されないSAV試料の真の値を低く評価するものの、方法1ではより一層正確な評価結果となるようである。SAVを条件としない患者血清プールについてはどちらの方法も申し分無くより一層正確な値を与える。
【0095】
洗浄ステップを2回含む方法1は、SAVを条件とする患者からの血清試料中のアレルゲン特異的IgEの量を先行技術方法Bよりもさらに一層信頼のおける評価ができると結論付けられる。
【0096】
実施例4
家ぼこりダニSAV間の免疫応答のモニター観察
ビオチン化ベツラ・ヴェルコサ(Betula verrucosa)アレルゲンの代わりにビオチン化デルマトファゴイデス・プテロニシヌス(Dermatophagoides pteronyssinus)アレルゲンを用いる以外は、実施例1に記載するように従来の方法Bおよび方法1によりデルマトファゴイデス・プテロニシヌス(家ぼこりダニ)アレルゲンに対する特異的IgEの測定を実施した。従来の方法Bおよび方法1の両方においてビオチン化デルマトファゴイデス・プテロニシヌスアレルゲンの使用希釈率は1:250であった。
【0097】
臨床試験に参加している患者から血清試料を入手した。30人の全患者にプラセボ(N=14)またはデルマトファゴイデス・プテロニシヌスおよびデルマトファゴイデス・ファリーナ(Dermatophagoides farinae)アレルゲン(アルタード、ALK−アベロウ A/S、ホーショルム、デンマーク)の1:1の混合物を含むSAV(N=16)のいずれかを投与した。処置前(t=0)、処置の6か月後(t=6)および処置の12か月後(t=12)に試料を採り、全試料を2種の異なる方法により分析した。結果を相対的応答=(シグナル−バックグラウンド)/(シグナルhigh−バックグラウンド)(ここでシグナルhighとは検出すべき特異的抗体の含量が高い血清プールのシグナルである)として求めた。これらの結果を図13から14に示す。従来の方法Bおよび方法1で得られた結果の比率をとることによりさらに一連のデータを得た。これらの結果を図15に示す。
【0098】
結論
血清特異的IgEを測定するために用いたいずれの方法(従来の方法Bまたは方法1)でもSAV間の活性およびプラセボ処置群を判別することができなかった(図13から14)。しかしながら、驚くべきことに従来の方法および本発明の方法で得られた結果の比率(比率=IgE(従来の方法B)t/IgE(方法1)t)によりSAV開始後6および12か月で活性およびプラセボ処置群が判別される。さらに、ほぼ1個の比率の切り捨て値は、個々の患者がプラセボまたは活性処置群に属することが予測し得るほどであり(図17、t=12)、すなわちこれはSAV効果パラメーターである。
【0099】
統計:
ノンパラメトリック検定[マーン−ホイットニー・U−テスト(Mann−Whitney U−test)]により統計学的分析を実施した。0.05未満の推計学的な両側確率は有意であると考えられた。NSとは有意でないことを意味し、そうでない場合は実際の確率を図に記載している。
【0100】
実施例5
家ぼこりダニSAV間の免疫応答のモニター観察
前記の試薬を各方法で規定する使用希釈率で用いて2種の異なる方法によりデルマトファゴイデス・プテロニシヌス(家ぼこりダニ)アレルゲンに対する特異的IgE抗体の測定を実施した。用いた二つの方法は、従来の方法A(図1a)および本発明による方法1(図2a、請求項2)である。
【0101】
従来の方法A
この方法は参照文献に記載されているチバ・コーニングACS:180ベンチトップ・イムノアッセイ・アナライザーの改良版で実施した。試料プローブにより3.25μlの試料をキュベットに分注し、その後即座に固定したプローブで1:20に希釈した常磁性体粒子100μlを分注した。8時間のインキュベーションの後、常磁性体粒子を磁石で分離し、洗浄はしない。常磁性体粒子を100μlの洗浄バッファー中に再懸濁し、1:250に希釈したビオチン化デルマトファゴイデス・プテロニシヌスアレルゲン50μlをキュベットに加えた。10分間のインキュベーションの後、固定プローブで1:5000に希釈したライト(lite)試薬100μlを分注し、8分間のインキュベーションの後、常磁性体粒子を磁石で分離し、1mlの洗浄バッファーで3回洗浄した。洗浄サイクルが完了した後、常磁性体粒子を0.1M HNO3中0.5g/l H2O2300μlに再懸濁する。キュベットをルミノメーター・チャンバーに入れ、光電子増倍管の正面で25mM NaOH溶液300μlを加え、放出される光の光量子を測定し、定量して相対的光ユニット(relative light units:RLU)として表した。RLUの量は試料中のIgEの量に比例する。結果をRLU実験値/RLUバックグラウンド(ここでRLUバックグラウンドはIgE不在下の化学発光反応である)として表した。
【0102】
方法1
この方法は参照文献に記載されているチバ・コーニングACS:180ベンチトップ・イムノアッセイ・アナライザーの改良版で実施した。試料プローブにより2.25μlの試料をキュベットに分注し、その後即座に固定したプローブで1:20に希釈した常磁性体粒子100μlを分注した。8時間のインキュベーションの後、常磁性体粒子を磁石で分離し、1mlの洗浄バッファーで1回洗浄した。常磁性体粒子を100μlの洗浄バッファー中に再懸濁し、1:250に希釈したビオチン化デルマトファゴイデス・プテロニシヌスアレルゲン50μlをキュベットに加えた。10分間のインキュベーションの後、固定プローブで1:5000に希釈したライト(lite)試薬100μlを分注し、8分間のインキュベーションの後、常磁性体粒子を磁石で分離し、1mlの洗浄バッファーで3回洗浄した。洗浄サイクルが完了した後、常磁性体粒子を0.1M HNO3中0.5g/l H2O2300μlに再懸濁する。キュベットをルミノメーター・チャンバーに入れ、光電子増倍管の正面で25mM NaOH溶液300μlを加え、放出される光の光量子を測定し、定量して相対的光ユニット(relative light units:RLU)として表した。RLUの量は試料中のIgEの量に比例する。結果をRLU実験値/RLUバックグラウンド(ここでRLUバックグラウンドはIgE不在下の化学発光反応である)として表した。
【0103】
本試験には28人の患者が参加した。13人の患者にはなんら処置を施さず、7人の患者には投与量レベル100のSAV処置を施し、8人の患者には投与量レベル300のSAV処置を施した。SAV処置では最初の21週間の投与量増量期間中は毎週デルマトファゴイデス・プテロニシヌス(家ぼこりダニ)アレルゲンの投与量を皮下注射により患者に投与し、続いて2年間100または300SQユニットの投与量を6から8週間毎に投与した。
【0104】
この研究では皮膚プリック試験(skin prick test:SPT)および気管支刺激試験(broncial probacation test:BPT)に基づく効果パラメーターを用いる。ここで用いた臨床効果パラメーターは以下の通りにして得られた:相対皮膚指数(SI(時間=x)−SI(時間=0))を用いて患者を2群に集めた(有効=皮膚感受性の低下、および無効=皮膚感受性に変化無し)。同様に相対刺激試験(logBPT(時間=x)−logBPT(時間=0))を用いて患者を2群に集めた(有効=気管支感受性の低下、および無効=気管支感受性に変化無し)。二つの測定値を一つの臨床効果パラメーターにまとめた:臨床的有効=両測定で有効、臨床的無効=両測定で無効および臨床効果に疑いあり=一方の測定では有効であるが他方の測定では無効である。
【0105】
図16から18は臨床効果による3群、「有効」、「無効」および「疑いあり」に関して時間0(LT S0 0)、6(LT S6 0)、12(LT S12 0)および24(LT S24 0)か月での相対的IgEレベルを示している。時間=0は処置前の値である。nn iiiの様式の曲線の表示は患者認識番号(nn)および処置の形式(iii)を意味し、ここでiii=0は処置していないこと、ならびにiii=100またはiii=300は各々投与量レベル100および300で処置したことを意味する。0.14における直線は任意の切り捨て値である。相対的IgE値は以下のとおり定義する:
log(応答(方法1)/応答(従来の方法A))t=x−
log(応答(方法1)/応答(従来の方法A))t=0
ここでt=時間、x=0、6、12または24か月であり、応答=シグナル/バックグラウンドである。
【0106】
図16から明らかであるように、臨床効果を示した全ての患者で方法1の応答が従来の方法Aの応答より高く、このことはアレルゲンと効果的に反応できる非IgE競合抗体応答が始まっていることを意味する。図17から臨床上無効の群の患者には競合抗体応答が進行しているものはいないようである。最終的には、図18から臨床上疑わしい群の1人の患者で皮膚プリック試験でのみ検出される陽性の競合抗体応答が進行しているようである。対照群(nn 0)で競合抗体応答が上昇しているかのように判断された患者はいなかったので、この試験により処置および未処置患者が判別される。
【0107】
結論
血清試料中競合物質の存在および不在時に測定した、すなわち各々方法1および従来の方法Aにより測定したIgEの比率によりSAVの効果が予測されると考えられる。さらに、インビトロで測定した効果は処置スケジュールの初期に観察できる。恐らく競合物質は非IgE抗体であろうが、アレルゲンと特異的に反応するいかなる血清物質も同様に挙動するものと考えられる。
【0108】
実施例6
ビオチン化Der p:
Der p1はリシル残基を1個のみおよびNH2末端アミノ酸を含有し、これらはビオチン化に利用できる。「通常の」標識試薬(これらはNH2基を標的とする)を用いて粗Der p抽出物をビオチン化した場合、得られた標識Der p抽出物はDer p2およびその他のアレルゲンに対して偏向性のある感受性を有する傾向がある。
【0109】
よりバランスのとれたDer p試薬は以下のようにして得ることができる:粗Der p抽出物を記載のとおりビオチン化し、チロシンおよびヒスチジン残基を誘導できるビオチン試薬を用いて標識したビオチン化Der p1調製物を加えた。得られた混合物を以下の検定に用いた。
【0110】
Der p1のビオチン化:
製造指示書に従って、安定な前駆体p−アミノベンゾイル・ビオシチン(ピアース、米国)から調製したp−ジアゾベンゾイル・ビオシチンを用いてDer p1(ALK−アベロウ A/S、ホーショルム、デンマーク)をビオチン化した。得られたp−ジアゾベンゾイル・ビオシチン溶液は理論上の濃度1.82mg/ml(3.38mMと等価)であり、p−アミノベンゾイル・ビオシチンからp−ジアゾベンゾイル・ビオシチンに100%の効率で変換したと考えられる。343μlのp−ジアゾベンゾイル・ビオシチン溶液を0.1M NaHCO3(pH8.5)中1.74mg/ml Der p1 1mlに加えることにより、Der p1はモル比17:1でビオチン化され、Der p1の分子量は25kDaと考えられる。この方法のその後の工程はビオトキシン−XX−NHSエステルを用いるビオチン化に関して前記したとおりである。
【0111】
器具
アドゥヴィア・ケンタウロス・アナライザー(バイエル・ディアグノースティックス)を用いて試料を分析した。二つのプロトコルを用いて各試料中のDer p特異的IgEの量を決定した:二工程法(T)ではビオチン化したアレルゲンを加える前に干渉物質(例えば非IgE抗体)を除去する洗浄を行い、同時性プロトコル(S)ではビオチン化アレルゲンを加えるときに干渉物質(例えば非IgE抗体)が存在していてもよい。方法Tおよび方法Sはアレルゲンが前記のとおりビオチン化されていること以外は実施例5に記載の方法1および従来の方法Aに相当する。
【0112】
材料および方法
ビオチン化Der p1の1:250希釈物を作り、この試薬を前記のとおりに調製し希釈した通常のDer p試薬と1:4で混合してビオチン化アレルゲン試薬を作った。
【0113】
Der pを含むSAVを投与されたDer pアレルギー患者からSAV開始後0、0.5、1、2、3、6、9、12、18および24か月に血清試料(N=48)を採取した。患者を4つの処置群:対照(N=15)、用量10(N=12)、用量100(N=9)および用量300(N=11)に振り分け、Der pアルタードで24か月間示した用量で処置した。
【0114】
SAVの期間の前後で臨床パラメーターSPT(皮膚プリック試験:Skin Prick Test)、BPT(気管支刺激試験:Bronchial Provocation Test)およびCPT(角膜刺激試験:Conjunctival Provocation Test)を測定し、臨床パラメーターを分析した群から効果の測定法を構築した。2または3個のパラメーターが陽性である場合SAVは有効と判断され、1または0個のパラメーターが陽性である場合無効と判断された。
【0115】
二つのプロトコル(TおよびS)に従って血清試料中のIgEを測定し、LN(Ti/Si)−LN(T0/S0)(ここでiは時間(>0<=24)であり、0はパラメーター値である)に従って基底値補正したインビトロ効果パラメーターを算出した。
【0116】
結果
LN(Ti/Si)−LN(T0/S0)および投与量間で明らかな用量依存的応答の関係があり(図19;効果パラメーターの用量依存的応答)、これはパラメーターが用量依存的に患者の免疫学的変化を測定していることを示している。図20(平均効果パラメーター)は臨床効果が認められたおよび認められなかった患者に関してインビトロ効果パラメーターとして得られた値の平均値を表しており、図21(有効:個々の患者)および図22(無効:個々の患者)では個々の患者に関してインビトロパラメーターが示されている。臨床的に効果的な進展をみた全ての患者において6から24か月の時間で対照群の域を超えてインビトロパラメーターが上昇していることが示されており、これらの全ての患者は活性なDer pSAVの投与を受けていた。明らかな臨床効果が認められなかった4人の患者(14%)はインビトロ効果パラメーターによる効果はあると判断される。
【0117】
結論
インビトロ効果パラメーターは患者の状態の臨床評価とよく相関すると考えられ、インビトロパラメーターはSAV6か月後のSAVの結果を予測しており、一方臨床効果は通常12または24か月後に明らかになる。
【0118】
参照文献
1) Ian Weeks、Iraj Beheshti、Frank McCapra、Anthoney K.CampbellおよびJ.Stuart Woodhead、Clinical Chemistry、1983、29:1474−1479(1983)。
【0119】
2) J.Boland、G.Carey、E.KrodelおよびM.Kwiatkowski、Clinical Chemistry、1990、36:1598−1602。
【図面の簡単な説明】
【図1a】WO94/11734に開示されている従来技術のアッセイの2つの実施形態(従来技術の方法A及びB)の図表示である。
【図1b】WO94/11734に開示されている従来技術のアッセイの2つの実施形態(従来技術の方法A及びB)の図表示である。
【図2a】請求項7から9(サブの方法)に定義される方法における使用に好適な3つの好ましいアッセイの図表示である。
【図2b】請求項7から9(サブの方法)に定義される方法における使用に好適な3つの好ましいアッセイの図表示である。
【図2c】請求項7から9(サブの方法)に定義される方法における使用に好適な3つの好ましいアッセイの図表示である。
【図3a】本発明の第1の態様による3つの好ましいアッセイの図表示である。
【図3b】本発明の第1の態様による3つの好ましいアッセイの図表示である。
【図3c】本発明の第1の態様による3つの好ましいアッセイの図表示である。
【図4】図4は、それぞれ、従来技術の方法B、本発明の方法1及び本発明のサブの方法1による特異的IgEの濃度の関数としての化学発光レベルを示す。
【図5】図5は、それぞれ、従来技術の方法B、本発明の方法1及び本発明のサブの方法1による特異的IgEの濃度の関数としての化学発光レベルを示す。
【図6】図6は、それぞれ、従来技術の方法B、本発明の方法1及び本発明のサブの方法1による特異的IgEの濃度の関数としての化学発光レベルを示す。
【図7】図7は、従来技術の方法B、本発明の方法1及び本発明のサブ方法1による干渉性抗体の含量の関数としての相対的な化学発光レベルを示す。
【図8】図8は、特異的アレルギーワクチン注射を受けた患者からの4つの試料及び一つの参照試料(図12)についての従来技術の方法B及び本発明の方法1による希釈ファクターの関数としての化学発光レベルの予測レベルに対する計算発光レベルを示す。
【図9】図9は、特異的アレルギーワクチン注射を受けた患者からの4つの試料及び一つの参照試料(図12)についての従来技術の方法B及び本発明の方法1による希釈ファクターの関数としての化学発光レベルの予測レベルに対する計算発光レベルを示す。
【図10】図10は、特異的アレルギーワクチン注射を受けた患者からの4つの試料及び一つの参照試料(図12)についての従来技術の方法B及び本発明の方法1による希釈ファクターの関数としての化学発光レベルの予測レベルに対する計算発光レベルを示す。
【図11】図11は、特異的アレルギーワクチン注射を受けた患者からの4つの試料及び一つの参照試料(図12)についての従来技術の方法B及び本発明の方法1による希釈ファクターの関数としての化学発光レベルの予測レベルに対する計算発光レベルを示す。
【図12】図12は、特異的アレルギーワクチン注射を受けた患者からの4つの試料及び一つの参照試料(図12)についての従来技術の方法B及び本発明の方法1による希釈ファクターの関数としての化学発光レベルの予測レベルに対する計算発光レベルを示す。
【図13】図13は、それぞれ、従来技術の方法B及び本発明の方法1による0、6及び12ケ月での特異的アレルギーワクチン注射及びプラセボ治療を受けた患者に対する相対的な応答を示す。
【図14】図14は、それぞれ、従来技術の方法B及び本発明の方法1による0、6及び12ケ月での特異的アレルギーワクチン注射及びプラセボ治療を受けた患者に対する相対的な応答を示す。
【図15】図15は、方法1により得られた応答に対する従来技術の方法Bにより得られた応答の比を示す。
【図16】図16は、有効、無効及び疑問の3つの臨床効果群に対する0、6及び12ケ月の時点での相対的なIgEレベルを示す。
【図17】図17は、有効、無効及び疑問の3つの臨床効果群に対する0、6及び12ケ月の時点での相対的なIgEレベルを示す。
【図18】図18は、有効、無効及び疑問の3つの臨床効果群に対する0、6及び12ケ月の時点での相対的なIgEレベルを示す。
【図19】図19は、種々のSAV治療用量に対する方法1により得られた応答に対する従来技術の方法Bにより得られた応答の時間の関数としての比を示す。
【図20】図20は、それぞれ臨床効果のある患者と臨床効果のない患者に対して、方法1により得られた応答に対する従来技術の方法Bにより得られた平均応答の時間の関数としての比を示す。
【図21】図21は、臨床効果のある個別患者に対する方法1により得られた応答に対する従来技術の方法Bにより得られた応答の時間の関数としての比を示す。
【図22】図22は、臨床効果のない個別の患者に対する方法1により得られた応答に対する従来技術の方法Bにより得られた応答の時間の関数としての比を示す。
Claims (25)
- (h’)
(a’)液相と、(i)試料の抗体、(ii)固体粒子に結合している、試料抗体に特異的な反応物抗体、及び(iii)抗原、抗体またはハプテンの形のリガンドからなる3成分の固相複合体との混合物を準備し、
(b’)液相から3成分の固相複合体を分離し、
(c’)分離された3成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物を除去し、
(d’)この3成分の固相複合体に(iv)標識化合物の溶液を添加して、4成分の固相複合体を形成し、
(e’)液相から4成分の固相複合体を分離し、
(f’)分離された4成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物(iv)を除去し、
(g’)洗浄された標識された4成分の複合体の検出/測定を行うこと、
を含むアッセイを用いて液体試料中の抗体の含量を定量する工程、
(i’)
(i’a)液相と、(i)試料の抗体、(ii)固体粒子に結合している、試料抗体に特異的な反応物抗体、(iii)抗原、抗体またはハプテンの形のリガンド、及び(iv)標識化合物からなる4成分の固相複合体との混合物を準備して、4成分の固相複合体を形成し、
(ib’)液相から4成分の固相複合体を分離し、
(ic’)分離された4成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物を除去し、
(id’)洗浄された標識された4成分の複合体の検出/測定を行うこと、
を含むアッセイを用いて上記抗体の含量を定量する工程、および
(j’)
工程(h’)及び工程(i’)で得られた測定値を比較し、特異的アレルギーワクチン注射治療の効果を評価及び/または予測するために当該比較を用いる工程、
を含んでなる、抗体の含量を特異的アレルギーワクチン注射治療の効果の評価及び/または予測の指標とする方法。 - (h)
(a)液相と、(i)試料の抗体、(ii)固体粒子に結合している、試料抗体に特異的な反応物抗体、及び(iii)ビオチンまたはその官能性誘導体に結合した抗原、抗体またはハプテンの形のリガンドからなる3成分の固相複合体との混合物を準備し、
(b)液相から3成分の固相複合体を分離し、
(c)分離された3成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物を除去し、
(d)洗浄された3成分の固相複合体に、(iv)アビジン、ストレプトアビジンまたはこれらの官能性誘導体に共有結合した化学発光化合物の溶液を添加して、4成分の固相複合体を形成し、
(e)液相から4成分の固相複合体を分離し、
(f)分離された4成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物(iv)を除去し、
(g)洗浄された4成分の固相複合体中で化学発光反応を開始し、認められる場合には、得られる化学発光を検出/測定すること、
を含むアッセイを用いて液体試料中の抗体含量を定量する工程、
(i)
(ia)液相と、(i)試料の抗体、(ii)固体粒子に結合している、試料抗体に特異的な反応物抗体、(iii)ビオチンまたはその官能性誘導体に結合した抗原、抗体またはハプテンの形のリガンド、及び(iv)アビジン、ストレプトアビジンまたはこれらの官能性誘導体に共有結合した化学発光化合物からなる4成分の固相複合体との混合物を準備して、4成分の固相複合体を形成し、
(ib)液相から4成分の固相複合体を分離し、
(ic)分離された4成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物を除去し、
(id)洗浄された4成分の固相複合体中で化学発光反応を開始し、認められる場合には、得られる化学発光を測定すること、
を含むアッセイを用いて上記抗体含量を定量する工程、および
(j)
工程(h)及び工程(i)で得られる測定値を比較し、特異的アレルギーワクチン注射治療の効果を評価及び/または予測するために当該比較を用いる工程、
を含んでなる、抗体の含量を特異的アレルギーワクチン注射治療の効果の評価及び/または予測の指標とする方法。 - (h”)
(a”)液相と、(i)試料の抗体、(ii)固体常磁性粒子に結合している、試料抗体に特異的な反応物抗体、及び(iii)ビオチンまたはその官能性誘導体に結合した抗原、抗体またはハプテンの形のリガンドからなる3成分の固相複合体との混合物を準備し、
(b”)液相から3成分の固相複合体を磁気的に分離し、
(c”)分離された3成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合の化合物を除去し、
(d”)洗浄された3成分の固相複合体に、(iv)アビジン、ストレプトアビジンまたはこれらの官能性誘導体に共有結合した化学発光化合物の溶液を添加して、4成分の固相複合体を形成し、
(e”)液相から4成分の固相複合体を磁気的に分離し、
(f”)分離された4成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物(iv)を除去し、
(g”)洗浄された4成分の固相複合体中で化学発光反応を開始し、認められる場合には、得られる化学発光を検出/測定すること、
を含むアッセイを用いて液体試料中の抗体含量を定量する工程、
(i”)
(ia”)液相と、(i)試料の抗体、(ii)固体常磁性粒子に結合している、試料抗体に特異的な反応物抗体、(iii)ビオチンまたはその官能性誘導体に結合した抗原、抗体またはハプテンの形のリガンド、及び(iv)アビジン、ストレプトアビジンまたはこれらの官能性誘導体に共有結合した化学発光化合物からなる4成分の固相複合体との混合物を準備して、4成分の固相複合体を形成し、
(ib”)液相から4成分の固相複合体を磁気的に分離し、
(ic”)分離された4成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物を除去し、
(id”)洗浄された4成分の固相複合体中で化学発光反応を開始し、認められる場合には、得られる化学発光を測定すること、
を含むアッセイを用いて上記抗体含量を定量する工程、および
(j”)
工程(h”)及び工程(i”)で得られる測定値を比較し、特異的アレルギーワクチン注射治療の効果を評価及び/または予測するために当該比較を用いる工程、
を含んでなる、抗体の含量を特異的アレルギーワクチン注射治療の効果の評価及び/または予測の指標とする方法。 - (x’)
(o’)液相と、(i)試料の抗体及び(ii)固体粒子に結合している、試料抗体に特異的な反応物抗体からなる2成分の固相複合体との混合物を準備し、
(p’)液相から2成分の固相複合体を分離し、
(q’)分離された2成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物を除去し、
(r’)洗浄された2成分の固相複合体に(iii)標識されていないかまたは標識されている抗原、抗体またはハプテンの形のリガンドの溶液を添加して、3成分の固相複合体を形成し、
(s’)任意に、この3成分の固相複合体に(iv)標識化合物の溶液を添加して、4成分の固相複合体を形成し、
(t’)溶液からステップ(r’)または(s’)で得られた3成分または4成分の固相複合体をそれぞれ分離し、
(u’)分離された多成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物を除去し、
(v’)洗浄された標識された多成分の複合体の検出/測定を行うこと、
を含む方法を用いて液体試料中の抗体含量を定量する工程、
(y’)
(ya’)液相と、(i)試料の抗体、(ii)固体粒子に結合している、試料抗体に特異的な反応物抗体、及び(iii)標識されたあるいは(iv)標識化合物に結合した抗原、抗体またはハプテンの形のリガンドからなる3成分の固相複合体との混合物を準備して、多成分の固相複合体を形成し、
(yb’)液相から多成分の固相複合体を分離し、
(yc’)分離された多成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物を除去し、
(yd’)洗浄された標識された多成分の複合体の検出/測定を行うこと、
を含むアッセイを用いて上記抗体の含量を定量する工程、および
(z’)
工程(x’)及び工程(y’)で得られる測定値を比較し、特異的アレルギーワクチン注射治療の効果を評価及び/または予測するために当該比較を用いる工程、
を含んでなる、抗体の含量を特異的アレルギーワクチン注射治療の効果の評価及び/または予測の指標とする方法。 - (x)
(o)液相と、(i)試料の抗体及び(ii)固体粒子に結合している、試料抗体に特異的な反応物抗体からなる2成分の固相複合体との混合物を準備し、
(p)液相から2成分の固相複合体を分離し、
(q)分離された2成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物を除去し、
(r)洗浄された2成分の固相複合体に、(iii)ビオチンまたはその官能性誘導体に結合した抗原、抗体またはハプテンの形のリガンドの溶液を添加して、3成分の固相複合体を形成し、
(s)この3成分の固相複合体に(iv)アビジン、ストレプトアビジンまたはこれらの官能性誘導体に共有結合した化学発光化合物の溶液を添加して、4成分の固相複合体を形成し、
(t)この溶液から4成分の固相複合体を分離し、
(u)分離された4成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合の化合物(iv)を除去し、
(v)洗浄された4成分の固相複合体中で化学発光反応を開始し、認められる場合には、得られる化学発光を検出/測定することを含む方法、
を用いて液体試料中の抗体含量を定量する工程、
(y’)
(ya)液相と、(i)試料の抗体、(ii)固体粒子に結合している、試料抗体に特異的な反応物抗体、(iii)ビオチンまたはその官能性誘導体に結合した抗原、抗体またはハプテンの形のリガンド、及び(iv)アビジン、ストレプトアビジンまたはこれらの官能性誘導体に共有結合した化学発光化合物からなる4成分の固相複合体との混合物を準備して、4成分の固相複合体を形成し、
(yb)液相から4成分の固相複合体を分離し、
(yc)分離された4成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物を除去し、
(yd)洗浄された4成分の固相複合体中で化学発光反応を開始し、認められる場合には、得られる化学発光を測定すること、
を含むアッセイを用いて上記抗体の含量を定量する工程、および
(z)
工程(x)及び工程(y)で得られる測定値を比較し、特異的アレルギーワクチン注射治療の効果を評価及び/または予測するために当該比較を用いる工程、
を含んでなる、抗体の含量を特異的アレルギーワクチン注射治療の効果の評価及び/または予測の指標とする方法。 - (x”)
(o”)液相と、(i)試料の抗体及び(ii)固体常磁性体粒子に結合している、試料抗体に特異的な反応物抗体からなる2成分の固相複合体との混合物を準備し、
(p”)液相から2成分の固相複合体を磁気的に分離し、
(q”)分離された2成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物を除去し、
(r”)洗浄された2成分の固相複合体に、(iii)ビオチンまたはその官能性誘導体に結合した抗原、抗体またはハプテンの形のリガンドの溶液を添加して、3成分の固相複合体を形成し、
(s”)この3成分の固相複合体に(iv)アビジン、ストレプトアビジンまたはこれらの官能性誘導体に共有結合した化学発光化合物の溶液を添加して、4成分の固相複合体を形成し、
(t”)この溶液から4成分の固相複合体を磁気的に分離し、
(u”)分離された4成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物(iv)を除去し、
(v”)洗浄された4成分の固相複合体中で化学発光反応を開始し、認められる場合には、得られる化学発光を検出/測定することを含む方法、
を用いて液体試料中の抗体の含量を定量する工程、
(y”)
(ya”)液相と、(i)試料の抗体、(ii)固体常磁性粒子に結合している、試料抗体に特異的な反応物抗体、(iii)ビオチンまたはその官能性誘導体に結合した抗原、抗体またはハプテンの形のリガンド、及び(iv)アビジン、ストレプトアビジンまたはこれらの官能性誘導体に共有結合した化学発光化合物からなる4成分の固相複合体との混合物を準備して、4成分の固相複合体を形成し、
(yb”)液相から4成分の固相複合体を磁気的に分離し、
(yc”)分離された4成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物を除去し、
(yd”)洗浄された4成分の固相複合体中で化学発光反応を開始し、認められる場合には、得られる化学発光を測定することを含むアッセイ、
を用いて上記抗体の含量を定量する工程、および
(z”)
工程(x”)及び工程(y”)で得られる測定値を比較し、特異的アレルギーワクチン注射治療の効果を評価及び/または予測するために当該比較を用いる工程、
を含んでなる、抗体の含量を特異的アレルギーワクチン注射治療の効果の評価及び/または予測の指標とする方法。 - 成分(i)と(ii)を混合し、次に、成分(iii)を添加し、添加する場合には、最後に成分(iv)を添加することにより、ステップ(ia’)、(ia)、(ia”)、(ya’)、(ya)または(ya”)がそれぞれ行われる請求項1、2、3、4、5または6に記載の方法。
- 成分(i)、(ii)及び(iii)を混合し、次に、添加する場合には、成分(iv)を添加することにより、ステップ(ia’)、(ia)、(ia”)、(ya’)、(ya)または(ya”)がそれぞれ行われる1、2、3、4、5または6に記載の方法。
- ステップ(j’)、(j)、(j”)、(z’)、(z)または(z”)の比較が、2つの上記ステップにおいて得られる測定値の比を計算することにより行われる請求項1、2、3、4、5または6に記載の方法。
- 治療期間のスタートの時点及び治療期間の間の多数のポイントにおいて、ステップ(j’)、(j)、(j”)、(z’)、(z)または(z”)の比較が行われ、そしてまた、観察されるかもしれないいかなる一時的な変化も治療の効果を評価及び/または予測するための基礎として使用される請求項1、2、3、4、5または6に記載の方法。
- 1)試料の抗体と、試料抗体のFab領域に特異的である、抗原、抗体またはハプテンの形のリガンドとの間の反応を、試料の他の構成成分の存在下で行って測定値1を得るイムノアッセイを使用して、被験者からの液体試料中の抗体の含量を定量する工程、
2)試料の抗体と、抗原、抗体またはハプテンの形の試料抗体のFab領域に特異的であるリガンドとの間の反応を、試料の他の構成成分の不在下で行って測定値2を得るイムノアッセイを使用して、被験者からの液体試料中の抗体の含量を定量する工程、および
3)測定値1及び測定値2の相互関係付けを行って妨害を評価し、被験者の免疫状態を評価するパラメーターとして妨害を使用する工程、
を含んでなる、抗体の含量を被験者の免疫状態の評価の指標とする方法。 - A)
(Aa)(i)試料の抗体、(ii)固体キャリアに結合している、試料抗体のFc領域に特異的な抗体、及び(iii)試料抗体のFabに結合している、抗原、抗体またはハプテンの形のリガンドを混合して、3成分の固相複合体と液相の混合物を形成し、
(Ab)3成分の複合体を(iv)標識化合物と接触させて、4成分の固相複合体と液相の混合物を形成し、
(Ac)4成分の固相を洗浄して、非複合体結合化合物を除去し、
(Ad)洗浄された標識された4成分の複合体の検出/測定を行って、測定値Aを得ることを含むアッセイプロトコルAを用いて被験者からの液体試料中の抗体の含量を定量する工程、
B)
(Ba)(i)試料の抗体及び(ii)固体キャリアに結合している、試料抗体のFc領域に特異的な反応物抗体を混合して、2成分の固相複合体と液相の混合物を形成し、
(Bb)2成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物を除去し、
(Bc)洗浄された2成分の固相複合体を、(iii)試料抗体のFabに結合している、抗原、抗体またはハプテンの形のリガンド及び(iv)標識化合物と接触させて、4成分の固相複合体と液相の混合物を形成し、
(Bd)4成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物を除去し、
(Be)洗浄された標識された4成分の複合体の検出/測定を行って、測定値Bを得ることを含むアッセイプロトコルBを用いて上記試料中の上記抗体の含量を定量する工程、および
(E)
測定値A及びBの相互関係付けを行って、妨害を評価し、被験者の免疫状態を評価するパラメーターとして妨害を使用する工程を含んでなる、抗体の含量を被験者の免疫状態の評価の指標とする方法。 - ステップAaの3成分の固相複合体と液相の上記混合物に上記(iv)標識化合物を添加することにより、ステップAbが行われる請求項12に記載の方法。
- ステップAaで得られた3成分の固相複合体を洗浄して非複合体結合の化合物を除去し、そして引き続き、洗浄された3成分の複合体に上記(iv)標識化合物を添加することにより、ステップAbが行われる請求項12に記載の方法。
- 上記(iii)リガンドと上記(iv)標識化合物を2成分の複合体と同時にインキュベートすることによりステップBdが行われる、請求項12から14のいずれかに記載の方法。
- 上記(iii)リガンドを2成分の複合体に添加して、3成分の複合体を形成し、次にそれを洗浄して非複合体結合(iii)リガンドを除去し、次に上記(iv)標識化合物を添加して4成分の複合体を形成する、請求項12から14のいずれかに記載の方法。
- 標識化合物が発光性標識、化学発光性標識、酵素標識、放射性標識、蛍光性標識または吸光性標識である請求項11から16のいずれかに記載の方法。
- (iii)リガンドがビオチニル化されている請求項11から17のいずれかに記載の方法。
- 上記(iv)標識化合物がアビジン、ストレプトアビジンまたはこれらの機能的誘導体に共有結合した化学発光化合物である請求項18に記載の方法。
- C)
(Ca)(i)試料の抗体、(ii)固体キャリアに結合している、試料抗体のFc領域に特異的な抗体及び(iii)試料抗体のFabに特異的である、抗原、抗体またはハプテンの形の標識されたリガンドを混合して、3成分の固相複合体と液相の混合物を形成し、
(Cb)3成分の固相を洗浄して、非複合体結合化合物を除去し、
(Cc)洗浄された標識された3成分の複合体の検出/測定を行って、測定値Cを得ることを含むアッセイプロトコルCを用いて被験者からの液体試料中の抗体の含量を定量する工程、
D)
(Da)(i)試料の抗体及び(ii)固体キャリアに結合している、試料抗体のFc領域に特異的な反応物抗体を混合して、2成分の固相複合体と液相の混合物を形成し、
(Db)2成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物を除去し、
(Dc)洗浄された2成分の固相複合体を、(iii)試料抗体のFabに結合している、抗原、抗体またはハプテンの形の標識されたリガンドと接触させて、3成分の固相複合体と液相の混合物を形成し、
(Dd)3成分の固相複合体を洗浄して、非複合体結合化合物を除去し、
(De)洗浄された標識された3成分の複合体の検出/測定を行って、測定値Dを得ることを含むアッセイプロトコルDを用いて上記抗体の含量を定量する工程、および
(E)
測定値C及び測定値Dの相互関係付けを行って妨害を評価し、被験者の免疫状態を評価するパラメーターとして妨害を使用するステップを含んでなる、抗体の含量を被験者の免疫状態の評価の指標とする方法。 - 標識されたリガンドが放射性原子により標識されることを特徴とする請求項20に記載の方法。
- 評価対象の被験者がアレルギー治療、アレルギーワクチン注射治療または特異的アレルギーワクチン注射(SAV)治療を受けている請求項11から21のいずれかに記載の方法。
- キャリアが粒子である請求項12から22のいずれかに記載の方法。
- キャリアが常磁性粒子である請求項23に記載の方法。
- 試料抗体が特異的IgEである請求項11から22のいずれかに記載の方法。
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