JPH1082787A - 免疫測定方法及びその測定試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 検体中に含まれる低濃度のカルシトニン等の
抗原性物質を免疫測定する方法とその測定試薬の提供。 【解決手段】 抗原性物質のそれぞれ異なる抗原決定基
と反応する少なくとも２種の抗体と標識物とが結合した
標識物と、前記抗原決定基とは異なる抗原決定基と反応
する抗体が結合した固相と、検体とを混合して免疫複合
体を形成させた後、固相に結合した標識物又は未結合の
標識物を測定して検体中の前記抗原決定基を有する抗原
性物質を免疫測定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、免疫測定方法及び
その測定試薬に関する。更に詳しくは抗体と標識物とが
結合した標識抗体と、前記抗体の抗原決定基とは異なる
抗原決定基と反応する抗体と固相とが結合した感作固相
と、検体とを混合して免疫複合体を形成し、固相に結合
した標識物又は未結合の標識物を測定する免疫測定法に
おいて、標識抗体の抗体にそれぞれ異なる抗原決定基と
反応する２種以上の抗体を使用する検体中の前記抗原決
定基を有する抗原性物質の該測定法、及びそれぞれ異な
る抗原決定基と反応する２種以上の抗体と固相とが結合
した感作固相と、前記抗原決定基とは異なる抗原決定基
と反応する抗体と標識物とが結合した標識抗体とからな
る抗原決定基を有する抗原性物質の免疫測定試薬に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】生体内に存在する微量物質を測定する方
法として、例えばエンザイムイムノアッセイ（ＥＩ
Ａ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）等の免疫測定法
が知られている。特にＥＩＡは特異性が高く、放射性物
質を使用せずに低濃度の測定対象物の高感度測定が行え
ることから、近年臨床検査の分野で広く使用されるよう
になった。これらの免疫測定に用いられる標識抗体の具
備すべき要件としては、測定対象物質に対して特異性、
親和性が高く、さらに使用する固相に対して非特異吸着
が少ないことが挙げられる。

【０００３】そこで免疫測定に用いられる抗体を取得す
るには、免疫された動物から得られたポリクローナル抗
体を含む生体成分をアフィニティークロマトグラフィ
ー、ゲルクロマトグラフィー等を用いて精製する方法、
抗原との親和性の高いモノクローナル抗体を作成し選別
して用いる方法等が行われていた。しかしながらこれら
の方法で取得された抗体においても、低濃度の測定対象
物の測定には十分な測定感度を有しているとは言えず、
更に親和力の高い抗体の出現が望まれていた。この抗体
と抗原との親和力を増強する方法として、標識物に同一
の抗原決定基と反応する抗体を複数結合させた標識抗体
を用いる方法等が試みられた。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】近年癌疾患、感染症等
の早期診断、治療のモニター等を実施するために検体中
の低濃度の抗原、抗体等の測定対象物を測定する方法が
求められている。しかしながら、従来の製造法に従い取
得した抗体を用いて標識抗体を作成し、測定に使用する
方法では、未だ満足する結果を得ることができなかっ
た。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者等は鋭意研究し
た結果、それぞれ異なる抗原決定基と反応する２種以上
の抗体と標識物とが結合した標識抗体と、固相試薬と、
検体とを混合して免疫複合体を形成させた後、固相に結
合した標識物又は未結合の標識物を測定して検体中の前
記抗原決定基を有する抗原性物質を免疫測定する方法を
見出し本発明を完成するに至った。

【０００６】すなわち本発明の標識抗体は、それぞれ異
なる抗原決定基と反応する少なくとも２種の抗体と標識
物とを結合させて製造することができる。この抗体とし
ては、抗原性物質のそれぞれ異なる抗原決定基と反応す
るポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の中から
選択することができる。

【０００７】本発明の前記抗原決定基を有する抗原性物
質としては、少なくとも３個の抗原決定基を有するポリ
ペプチド等を挙げることができる。この抗原性物質とし
ては例えばヒト等の動物由来のカルシトニン、カルシト
ニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、ナトリウム利尿
ペプチド（心房性ナトリウム利尿ペプチド：ＡＮＰ；Ｂ
型ナトリウム利尿ペプチド：ＢＮＰ等）等を挙げること
がきる。これらの抗原性物質に対する抗体は、前記ポリ
ペプチド又はポリペプチドを構成するペプチドフラグメ
ントを免疫原として用い、公知のポリクローナル抗体又
はモノクローナル抗体の製造法に従い製造することがで
きる。モノクローナル抗体の製造法としては、例えば
「モノクローナル抗体とがん」（株）サイエンスフォー
ラム（１９８５年）等に記載された方法により行うこと
ができる。このペプチドフラグメントとしては少なくと
も４個のアミノ酸からなるペプチドを用いることができ
る。更に、これらのペプチドとアルブミン又はキーホー
ルリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）との複合体を形成
し、免疫原とすることもできる。得られた抗体は抗原性
物質のそれぞれの異なる抗原決定基と反応するものであ
ればよく、同一若しは異なるクラス又はサブクラスであ
り、抗体を酵素処理及び／又は還元処理して製造したＦ
ａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂ 等の抗体フラグメント
であってもよい。

【０００８】本発明の標識物としては酵素の他、各種蛍
光物質、発光物質、着色粒子等を挙げることができる。
酵素としては、例えばペルオキシダーゼ、アルカリ性ホ
スファターゼ、β−ガラクトシダーゼ等、蛍光物質とし
ては、例えばフルオレセイン、ローダミン、ウンベリフ
ェロン、シアン化白金等、発光物質としては、例えばル
ミノール、ルシフェリン等を挙げることができる。これ
らの標識物において、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホ
スファターゼ、β−ガラクトシダーゼ等の酵素を用いる
ことが好ましい。

【０００９】また抗体と標識物とを結合させるには、前
記の２種以上の抗体と標識物とを公知の共有結合又は非
共有結合を作る方法を利用して結合し製造することがで
きる。前記抗体と標識物とを結合する方法としては、例
えばグルタールアルデヒド法、過ヨウ素酸法、マレイミ
ド法、ピリジル・ジスルフィド法、公知の各種架橋剤を
用いる方法等を挙げることができる（例えば「蛋白質核
酸酵素」別冊３１号、３７〜４５頁（１９８５）参
照）。共有結合による方法では、モノクローナル抗体に
存在する官能基を利用できるほか、抗体に例えばチオー
ル基、アミノ基、カルボキシル基、水酸基等の基を導入
した後、前記共有結合に従い反応を行うことができる。
また同様に酵素に官能基を導入するための処理を行った
後反応に用いることもできる。得られる標識抗体は、例
えばゲルクロマトグラフィー等の分子量による分別によ
り酵素と２種以上の混合抗体との割合が１：２以上結合
した画分を分取し得ることができる。通常、酵素と抗体
との割合が１：６以上の標識抗体を作成することは難し
く、また経済的でもないことから、その割合は１：３か
ら１：５程度であることが好ましい。

【００１０】さらに固相試薬は、前記標識抗体とは異な
る抗原決定基と反応する抗体と固相とを結合させて製造
することができる。この抗体としては、前記標識物質に
結合した抗体とは異なる抗原決定基と反応する抗体であ
り、その抗体は前記標識抗体と同様に酵素処理及び／又
は還元処理した抗体であってもよい。固相としては免疫
測定用の各種固相であり、例えばプラスチック製の試験
管、マイクロプレート、ガラスビーズ、ポリスチレン等
のプラスチックビーズ、セルロース、ニトロセルロース
等のメンブレン、フェライト粒子（例えば特開平３−１
１５８６２号参照）等を挙げるとができる。

【００１１】前記固相と抗体とを結合させるには前記標
識抗体を製造する方法に従い製造することができる。こ
の方法には前記共有結合による方法の他、非共有結合に
よる前記抗体と固相とを混合して行う物理吸着法等を挙
げることができる。

【００１２】本発明でヒトカルシトニンを測定する場合
には、標識抗体としてヒトカルシトニンペプチドのＣ末
端部と反応する抗体とＮ末端部と反応する抗体とを組み
合わせて用いることができ、固相抗体としては、例えば
このＣ末端部とＮ末端部との中間部ペプチドを認識する
抗体を組み合わせて用いることができる。

【００１３】本発明の免疫測定方法は、標識抗体と固相
試薬とを用いて周知の１ステップ法、ディレイ１ステッ
プ法、２ステップ法等のサンドイッチ法を組み合わせて
行い、免疫反応により固相上に形成された免疫複合体の
標識物を測定すること又は未結合の溶液中の標識物を測
定することにより実施することができる。例えば２ステ
ップ法ではまず固相試薬と抗原性物質を含む検体とを緩
衝液中でインキュベーション（例えば５〜５０℃、５分
〜１日）した後、固相を洗浄する。次に標識抗体を含む
緩衝液中に固相を移し、さらにインキュベーション（例
えば５〜５０℃、５分〜１日）した後固相を再び洗浄す
る。このようにして固相上に形成された免疫複合体から
標識物の測定を行う方法である。

【００１４】標識物の測定には、標識物に対応した装置
として放射性同位元素を放射線測定装置で測定する他、
発光、蛍光、発色等を目視又は比色計、蛍光光度計、フ
ォトンカウンター、感光フィルム等の測定機器を用いて
測定し行うことができる。標識物質が酵素の場合には、
その酵素活性を発光基質、蛍光基質、発色基質等を加え
て反応を行い前記測定機器により測定を行うことができ
る。本発明の測定に用いられる検体としては、例えば全
血、血清、血漿、尿、リンパ液等の体液を挙げることが
できる。

【００１５】

【実施例】以下、本発明を実施例及び比較例によりさら
に詳細に説明する。

【００１６】実施例１ 抗カルシトニン抗体の消化 ヒトカルシトニンのＮ末端と反応する抗カルシトニン抗
体ＯＣＴ１及びヒトカルシトニンのＣ末端と反応する抗
カルシトニン抗体ＣＴ−０８（株式会社関西新技術研究
所）をそれぞれ１ｍｇ／ｍｌ（２００ｍＭ酢酸ソーダ緩
衝液（ｐＨ ４．２））２ｍｌに４０μｇのペプシン
（ベーリンガーマンハイム、コード：１０８０５７）を
加え３７℃、１０時間インキュベートした。ｐＨを７．
０に合わせてあらかじめ０．１Ｍリン酸ソーダ、１ｍＭ
ＥＤＴＡ，２Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したス
ーパーデックスＧ−２００、ゲル濾過カラム（ファルマ
シア、１６／６０）で６３ｍｌから７９ｍｌに溶出され
た分画をセントプレップ３０００（アミコン）によって
濃縮した。ＯＣＴ１のＦ（ａｂ’）₂ 分画を７３０μ
ｇ、ＣＴ−０８のＦ（ａｂ’）₂ 分画を６７０μｇ得
た。

【００１７】実施例２ マレイミド化アルカリ性ホスフ
ァターゼ ウシ小腸アルカリ性ホスファターゼ（オリエンタル酵
母）１．０ｍｇ（０．１Ｍリン酸ソーダ緩衝液（ｐＨ
７．０））にＤＭＦに溶解したＮ−スクシンイミジル−
４−マレイミド酪酸（ＧＭＢＳ，同仁化学）１０ｍｇ／
ｍｌを８μｌ混合し、２５℃１時間インキュベートし
た。あらかじめ０．１Ｍリン酸ソーダ緩衝液（ｐＨ７．
０）で平衡化したＰＤ−１０により未反応のＧＭＢＳを
除きマレイミド化アルカリ性ホスファターゼ７４０μｇ
を得た。

【００１８】実施例３ 抗体の還元 実施例１で調製したＯＣＴ１及びＣＴ−０８のＦ（ａ
ｂ’）₂ 分画、それぞれ７３０μｇ、６７０μｇに２−
メルカプトエタノールアミンを加え１０ｍＭとして３７
℃、２時間インキュベートした。あらかじめ０．１Ｍリ
ン酸ソーダ、１ｍＭＥＤＴＡ，２Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．
０）で平衡化したＰＤ−１０により２−メルカプトエタ
ノールアミンを除いた。ＯＣＴ１及びＣＴ−０８のＦａ
ｂ’分画をそれぞれ６１０μｇ及び５８０μｇ得た。

【００１９】実施例４ 酵素標識ＯＣＴ１／ＣＴ−０８
抗体の製造 実施例３で調製したＯＣＴ１（Ｆａｂ’分画）１８５μ
ｇとＣＴ−０８（Ｆａｂ’分画）１８５μｇを混合した
溶液に、実施例２で製造したマレイミド化アルカリ性ホ
スファターゼを２０９μｇを加え２５℃２時間インキュ
ベートした。あらかじめ１０ｍＭトリス−塩酸、１００
ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．１
ｍＭ塩化亜鉛（ｐＨ６．８）で平衡化したスーパーデッ
クスＧ−２００、ゲル濾過カラム（ファルマシア、１６
／６０）で平均分子量が１９万である分画６８μｇ、平
均分子量が２９万である分画７５μｇ、平均分子量が３
９万である分画７７μｇを得た。それぞれにウシ血清ア
ルブミンを濃度が０．１％になるように添加し、４℃で
保存した。

【００２０】比較例１ 酵素標識ＯＣＴ１抗体及び酵素
標識ＣＴ−０８抗体の製造 実施例３で調製したＯＣＴ１（Ｆａｂ’分画）３７０μ
ｇに、実施例２で調製したマレイミド化アルカリ性ホス
ファターゼを２０９μｇ加えた。実施例４と同じ方法で
各分画の酵素標識抗体を得た。また、ＣＴ−０８の場合
も同様にして各分画の酵素標識抗体を作成した。それぞ
れの酵素標識抗体にはウシ血清アルブミンを濃度が０．
１％になるように添加し、４℃で保存した。

【００２１】実施例５ 抗ヒトカルシトニン抗体結合フ
ェライト粒子の製造 ２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ３．０）５ｍｌに特開平３
−１１５８６２号実施例４に記載の方法に従い製造した
５％カルボキシル化フェライト粒子５０ｍｇを分散さ
せ、これに水溶性カルボジイミド５０ｍｇを加えた。室
温で２０分間反応させた後、上清を除去し、前記抗ヒト
カルシトニン抗体ＣＴ−０２（株式会社関西新技術研究
所，１ｍｇ／ｍｌ，２０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ３．
０）５ｍｌを加え、エンドオーバーエンドミキサーで攪
拌した。２時間後、この粒子を２％ＢＳＡ（０．１Ｍト
リス−塩酸，１ｍＭ塩化マグネシウム，０．１ｍＭ塩化
亜鉛，ｐＨ７．５）で５回洗浄し、これを同じＢＳＡ溶
液に分散させ抗ヒトカルシトニン抗体ＣＴ−０２結合フ
ェライト粒子（以下ＣＴ−０２抗体結合粒子という）を
得た。

【００２２】実施例６ ヒトカルシトニンの測定 ヒトカルシトニン抗原５００ｐｇ／ｍｌを含むサンプル
７０μｌと実施例４で作成した酵素標識ＯＣＴ１／ＣＴ
−０８抗体、比較例１で作成した酵素標識ＯＣＴ１抗体
又は酵素標識ＣＴ−０８抗体の各分子量分画０．５μｇ
／ｍｌを７０μｌ混合しカートリッジ中３７℃で１０分
間反応させた。この混合液１００μｌを実施例５で調製
したＣＴ−０２抗体結合粒子２５０μｌに加えさらにカ
ートリッジ中３７℃で１０分間反応させた。このカート
リッジを磁石に接して粒子を集磁させ、上清を廃液し洗
浄を行った。

【００２３】この粒子を含むカートリッジに発光基質の
３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４
−（３’’−ホスフォリルオキシ）フェニル−１，２−
ジオキセタン・２ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ、２００μ
ｇ／ｍｌを含む基質液（０．１ＭＤＥＡ−塩酸，１ｍＭ
塩化マグネシウム，ｐＨ１０．０）を２００μｌ加え３
７℃、５分間反応させ、フォトンカウンターで測定し
た。測定は全自動化学発光酵素免疫測定システム（ルミ
パルス１２００，富士レビオ社製）で行った。

【００２４】各分画の酵素標識抗体の抗体結合割合は、
分子量から算出すると平均分子量１９万がアルカリ性ホ
スファターゼ（Ａｌｐ）：抗体（Ｆａｂ）＝１：１、平
均分子量２９万がＡｌｐ：Ｆａｂ＝１：３、平均分子量
３９万がＡｌｐ：Ｆａｂ＝１：５として図には記載し
た。図１には測定結果のシグナル値、図２にはブランク
値、図３にはシグナル／ノイズ（Ｓ／Ｎ）を示す。図３
より、ＡｌｐとＦａｂとの割合が１：１であるＯＣＴ１
又はＣＴ−０８抗体のいずれか一つの抗体が結合した標
識抗体ではＳ／Ｎ比の向上が見られなかったが、その割
合が１：３〜１：５では３倍〜１０倍のＳ／Ｎ比の改善
が認められた。しかしながら、図３よりＯＣＴ１又はＣ
Ｔ−０８抗体単独で酵素と抗体との結合割合が１：３以
上においてもＳ／Ｎ比の向上は見られなかった。又、標
識ＯＣＴ１／ＣＴ−０８抗体を用いる測定では２Ｓ／Ｎ
＝１．１ｐｇ／ｍｌであった。

【００２５】

【発明の効果】本発明の免疫測定方法は、従来の測定法
に比べ検体中の低濃度の抗原性物質を感度よく測定する
ことができる。その結果、本発明は体液中に極微量含ま
れる腫瘍関連抗原、ホルモン、ウイルス等の抗原性物質
の検出に応用可能となり、各種癌疾患、感染症等の早期
診断、治療のモニター等に利用することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】標識ＯＣＴ１／ＣＴ−０８抗体、標識ＯＣＴ１
抗体又は標識ＣＴ−０８抗体を用いてヒトカルシトニン
を測定した時のシグナル値を示す図である。

【図２】標識ＯＣＴ１／ＣＴ−０８抗体、標識ＯＣＴ１
抗体又は標識ＣＴ−０８抗体を用いて測定した時のブラ
ンク値を示す図である。

【図３】標識ＯＣＴ１／ＣＴ−０８抗体、標識ＯＣＴ１
抗体又は標識ＣＴ−０８抗体を用いてヒトカルシトニン
を測定した時のＳ／Ｎ値を示す図である。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 抗体と標識物とが結合した標識抗体と、
   前記抗体の抗原決定基とは異なる抗原決定基と反応する
   抗体と固相とが結合した感作固相と、検体とを混合して
   免疫複合体を形成し、固相に結合した標識物又は未結合
   の標識物を測定する免疫測定法において、標識抗体の抗
   体にそれぞれ異なる抗原決定基と反応する２種以上の抗
   体を使用する検体中の前記抗原決定基を有する抗原性物
   質の該測定法。
2. 【請求項２】 標識抗体が、感作固相と抗原性物質との
   結合によって抗原性物質との反応性が向上する抗体であ
   る請求項１記載の測定方法。
3. 【請求項３】 抗体がモノクローナル抗体である請求項
   １又は２記載の測定方法。
4. 【請求項４】 抗原性物質が少なくとも３つの抗原決定
   基を有する抗原性物質である請求項１ないし３のいずれ
   か１項に記載の測定方法。
5. 【請求項５】 抗原性物質がカルシトニンである請求項
   ４記載の測定方法。
6. 【請求項６】 それぞれ異なる抗原決定基と反応する２
   種以上の抗体と固相とが結合した感作固相と、前記抗原
   決定基とは異なる抗原決定基と反応する抗体と標識物と
   が結合した標識抗体とからなる抗原決定基を有する抗原
   性物質の免疫測定試薬。
7. 【請求項７】 標識抗体が、感作固相と抗原性物質との
   結合によって抗原性物質との反応性が向上する抗体であ
   る請求項６記載の測定試薬。
8. 【請求項８】 抗体がモノクローナル抗体である請求項
   ６又は７記載の測定試薬。
9. 【請求項９】 抗原性物質が少なくとも３つの抗原決定
   基を有する抗原性物質である請求項６ないし８のいずれ
   か１項に記載の測定試薬。
10. 【請求項１０】 抗原性物質がカルシトニンである請求
    項９記載の測定試薬。