JP2005308701A - 抗腎タイプｉｖモノクロ−ナル抗体 - Google Patents

Abstract

【目的】
本発明は、腎糸球体由来タイプＩＶコラ−ゲン三本鎖螺旋領域（腎タイプＩＶ）及び／又は抗腎タイプＩＶ抗体を用いて、糸球体腎炎の早期を検出しようとするものである。更に治療に活用するものである。
【構成】ヒト及び又は動物の腎糸球体より精製した腎タイプＩＶ、ヒト及び又は動物の腎タイプＩＶに免疫反応をする抗腎タイプＩＶ抗体よりなる。本発明は、１）腎タイプＩＶを抗原として尿や血清などの試料より抗原抗体反応で抗腎タイプＩＶ抗体を検出する方法、２）免疫動物で作製した抗腎タイプＩＶ抗体で腎生検試料を免疫染色する方法、３）同抗腎タイプＩＶ抗体で尿や血清などの試料より抗原抗体反応で腎タイプＩＶ見出だす方法、４）抗腎タイプＩＶ抗体を用いて血清中の腎タイプＩＶを除去する方法、及び又は抗腎タイプＩＶ抗体で精製した腎タイプＩＶを用いて血清中の抗腎タイプＩＶ抗体を除去する方法、などより成る。

Description

本発明は、腎タイプＩＶや抗腎タイプＩＶモノクロ−ナル抗体を用いる腎炎検出方法及び検出試薬に関する。更に、治療の用具、医薬品を含む。

従来、腎炎検出の主な指標としては、尿中の蛋白、アルブミン、タイプＩＶコラ−ゲンの測定が行われている。特に、二次性の糸球体腎炎である糖尿病性腎症の時には、アルブミンより早期にタイプＩＶコラ−ゲンが尿中に出現するとして、これの測定が一時期注目された。即ち、糸球体腎炎になると、ろ過機能を持つ腎糸球体基底膜が壊れ、ろ過孔が拡大し尿中に血清成分の蛋白やアルブミンが流出するが、基底膜の構成成分であるタイプＩＶコラ−ゲンは、ろ過孔の拡大前に基底膜の破壊時点で尿に出現するので、早期に糸球体腎炎を検出できるとした。
又、従来の腎炎の確定診断法は、腎生検で得た腎切片を染色し、免疫グロブリンの沈着や半月体の形成などを観察することであった。免疫染色で、病気と正常を識別する方法はなかった。

発明が解決しょうとする課題

これらは次のような問題点があった。
従来の血清及び尿中のタイプＩＶコラ−ゲン測定は、胎盤タイプＩＶを抗原とした抗体（抗胎盤タイプＩＶ抗体）と標準に胎盤タイプＩＶを用いている。これは、タイプＩＶコラ−ゲンの由来組織による違いを考慮しなかった為であり、糸球体腎炎で出現する腎タイプＩＶの測定には相応しくない。
又、従来の確定診断は、経験豊富な病理専門医の高度な診断技術を求められた。更に、糸球体腎炎で免疫グロブリンの沈着段階までには時には数十年を経過しており、ジン機能も著しく低下している。それ故、免疫グロブリンの沈着や半月体の形成などの特異的な病理像が見られない早い段階で、極めて簡単に正確に確定診断できることが望まれていた。

課題を解決するための手段

本願発明は、腎糸球体由来タイプＩＶコラ−ゲン螺旋領域（腎タイプＩＶ）を用いることで、以上のような欠点を無くし、腎炎を早期の段階で検出できる方法と試薬、更には血清浄化方法を提供するものである。
タイプＩＶコラ−ゲンは生体組織基底膜に広く存在し、三本のα鎖から成る。α鎖はα１からα６までの６種類が知られ、組織により三本のα鎖の構成が異なる。胎盤ではα３、α４鎖が見られず、α１、α２鎖に富み、腎糸球体基底膜ではα３、α４鎖に富む。更に各α鎖間のアミノ酸配列の相同性を、ＤＮＡＳＩＳ Ｍａｃ ｖｅｒ３．５で求めた。α３鎖のアミノ酸配列１２０１〜１４３９に対する他α鎖の相同性はα１鎖が４７％、α２鎖が４６％、同様にα４鎖のアミノ酸配列１２２９〜１４５９に対する他α鎖の相同性はα１鎖が４９％、α２鎖が４５％で、部分測定とは言え、いずれも５０％以下であった。一方、動物種の異なる腎タイプＩＶを他動物の測定に利用できるか、前述と同様にアミノ酸配列の相同性から検討した。その結果、ヒトα３鎖に対しウシα３鎖が７６％、ヒトα４鎖に対しウシα４鎖が８２％であった。よって、同一動物の異なる組織よりも、異なる動物の同一組織の方が相同性が高いと言える。それ故、腎タイプＩＶや抗腎タイプＩＶ抗体の測定には、起源として胎盤タイプＩＶを用いるより、腎タイプＩＶを、望ましくは同一動物の腎タイプＩＶを用いる事が良い。
そこで、先ず本願発明者は、抗腎タイプＩＶ抗体検出方法をウシ腎タイプＩＶを抗原としたＥＬＩＳＡ法で開発し、糸球体腎炎の尿中にこの抗体の出現を見出だした。同時に、ヒト胎盤タイプＩＶ及びウシ胎盤タイプＩＶを抗原として測定した時には、尿中の抗胎盤タイプＩＶ抗体の反応がヒトとウシの胎盤タイプＩＶのどちらに対しても弱いことを見出だした。従って、尿中の、及びそれに先立ち出現する血清の抗腎タイプＩＶ抗体の測定は、糸球体腎炎検出の有用な指標となる。次に、本願発明者は、腎タイプＩＶを抗原として動物を免疫して得られる抗腎タイプＩＶ抗体を用いて、尿や血清中の腎タイプＩＶ測定キットを作製した。測定キットはポリクロ−ナル抗体のみのサンドイッチＥＬＩＳＡ法でも良いが、モノクロ−ナル抗体１種以上を組み入れたサンドイッチＥＬＩＳＡ法が望ましい。
具体的には、ウシ腎糸球体より分離精製した腎タイプＩＶをマウスに感作して抗腎タイプＩＶモノクロ−ナル抗体を作製し、ウエスタンブロット法や腎生検組織の免疫染色にも適合し得る「抗腎タイプＩＶモノクロ−ナル抗体」及び「標識抗腎タイプＩＶモノクロ−ナル抗体」を、又、「抗腎タイプＩＶモノクロ−ナル抗体」を組み入れた「サンドイッチ法による腎タイプＩＶ測定ＥＬＩＳＡキット」である。

その手順は次の通りである。
１［抗原の分離精製］ウシ腎糸球体を原料として、タイプＩＶコラ−ゲン三本鎖領域（以下腎タイプＩＶ）を分離し、カラムクロマトグラフィ−で分離精製する（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，１０４８１−８）。
２［抗腎タイプＩＶモノクロ−ナル抗体の作製と選択］モノクロ−ナル抗体は定法によりマウスを用いて作製する（単クロ−ン抗体実験マニュアル．講談社刊．１９８７）。融合細胞のスクリ−ニングではＥＬＩＳＡ法で抗体価の高い陽性穴を多数選び、次にウエスタンブロット法で腎タイプＩＶに反応する抗体を選ぶ。続いて免疫染色を行い、サル抗糸球体基底膜（ＧＢＭ）抗体腎炎の糸球体と反応するものを選ぶ。更に、サル正常腎と反応しないものを選ぶ。このようにしてＥＬＩＳＡ法でも、ウエスタンブロット法でも、免疫染色でも可能な抗腎タイプＩＶモノクロ−ナル抗体が得られる。
もちろん、抗腎タイプＩＶモノクロ−ナル抗体としては、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッテング、免疫染色、癌細胞の増殖抑制、その他の用途の一つだけしか機能を有しないものでも、複数機能するものでも良いが、全てに機能するものが望ましい。又免疫染色では、ラット、ヤギ、ウサギ他から作製したポリクロ−ナル抗体の如く正常の腎臓にも反応するものでも良いが、腎炎との識別には利用できない。組織の存在確認には使える。

本願発明の「抗腎タイプＩＶモノクロ−ナル抗体」及び「蛍光標識腎タイプＩＶモノクロ−ナル抗体」は、前者は間接染色法で後者は直接染色法でサル抗糸球体基底膜（ＧＢＭ）抗体腎炎やヒトＩｇＡ腎症の病理切片で腎の糸球体基底膜を染色する。もちろんラットやマウスその他の動物種、ＩｇＡ腎症以外の腎炎各種でも同様に染色する。

本発明者は、糸球体腎炎の初期検出の為に、「腎タイプＩＶ測定ＥＬＩＳＡキット」についても下記の具体的手段を確立した。即ち、糸球体腎炎において生ずる腎タイプＩＶを患者等の尿中から検出する方法と測定試薬について血清の場合も並べて例示するが、本発明は、記載の測定方法及び試薬に限定されるものではない。

１ 腎タイプＩＶを血清及び又は尿中から検出する方法と測定試薬。
試薬として、１）抗腎タイプＩＶ抗体（ウサギ由来）をコ−トしたプレ−ト、２）酵素（ＨＲＰ）標識抗腎タイプＩＶモノクロ−ナル抗体、３）発色基質（ＴＭＢ）、４）反応停止液（硫酸）を用いて測定する。
ここで、「２）」を無標識にし、「２）−２」として「酵素（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ（又はＩｇＭ）抗体」を加えても良い。又、「１）」と「２）」との抗体部分を入れ替えても、両方をモノクロ−ナル抗体にしてもポリクロ−ナル抗体にしても良い。抗体産生の免疫動物はいずれでも良く、ヤギ、ブタ、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、ニワトリ、サルなど動物種を選ばない。
この時、標準は、ヒトを対象の時にはヒト腎より製するのが最も望ましく、測定対象動物とアミノ酸配列の相同性が近い程次に望ましい。

免疫反応として、酵素免疫反応が代表的にあげられるが、それに限定されず、ＡＢ法、ＲＩＡ法，免疫発光法、沈降反応、凝集反応他を含む。酵素免疫反応において酵素標識の抗体としては、ポリクロ−ナル又はモノクロ−ナル抗体を問わない。又それを放射性物質（ＲＩＡ法）、発光物質で標識した物（免疫発光法）、無標識物（沈降法や凝集法）でも良い。
反応形式は、サンドイッチ法に囚われず、競合法他でも良いが、特にサンドイッチ法が望ましい。測定試薬の構成として、抗腎タイプＩＶ抗体をコ−トするプレ−トを、ガラスや磁性物質にしても良く、無しにして固相法を用いないことでも良い。
プレ−トに抗腎タイプＩＶ抗体（以下抗体）をコ−トする時、間接コ−トにしコ−ト物質をアビジン、ビオチン、又はこれらの結合した成分でも良い。
又、抗原は、生体抽出物やリコンビナントのみでなく、構成ペプタイド（特定分画、合成品を含む）でも良く、抗体はこれらの抗原から作製しても良い。
測定試薬に用いる抗原の動物種としては、ヒトが望ましく、サル、ウシ、ブタ、ニワトリ、羊、ヤギ、ウサギ、ラット他の動物でも良くこれに限定されない。更に、抗原は、複数動物種を混合したものでも良い。
抗原の由来組織は、腎臓が望ましいが、これに限定されない。

２ 抗腎タイプＩＶ抗体を取り除く器具及び又は腎タイプＩＶを取り除く器具。
抗腎タイプＩＶ抗体で作製したアフィニテ−カラムを用いて、血液を通すと血清中の腎タイプＩＶのみが除かれる。続いて、その血液を腎タイプＩＶで作製したアフィニテ−カラムに通して、血清中の抗腎タイプＩＶ抗体を除き、抗体も抗原もとり除かれた血液を再度体内に戻す。この原理を用いて、ラットの腎炎モデル（「Ｋ３５ ＮＣ１」（コラ−ゲン技術研修会製）で感作）で試すと、処置後の尿には、抗原も抗体も、処置前の１／５以下となった。従来の方法での透析は患者血清で、透析前後にこのような差は見られない。もちろん、血液中の腎タイプＩＶや抗腎タイプＩＶ抗体を除去できる器具であれば、前述器具に限定されない。又、腎タイプＩＶや抗腎タイプＩＶ抗体を、α３鎖やα４鎖あるいはα５鎖更にこれらの会合体及び又はその抗体に置き換えても、腎炎を惹起するα３鎖やα４鎖あるいはα５鎖更にこれらの会合体の特定部位及び又はその抗体に置き換えても良い。又、器具に用いる抗体は、ポリクロ−ナルでもモノクロ−ナルでも良いが、モノクロ−ナルは半永久的に同一性能のものが得られるのでより望ましい。

発明の効果

本発明は、腎炎の早期検出、確定診断及び腎炎や癌患者の改善に有用である。

［抗原の分離精製］ウシ腎糸球体を原料として、タイプＩＶコラ−ゲン三本鎖領域（以下腎タイプＩＶ）を分離し、カラムクロマトグラフィ−で精製する（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，１０４８１−８）。
［抗体の作製と選択］マウスを用いて作製する（単クロ−ン抗体実験マニュアル．講談社刊．１９８７）。融合細胞のスクリ−ニングでは培養上清を用いてＥＬＩＳＡ法で抗体価の高い陽性穴を多数選ぶ。次にマウス腹腔内にて細胞増殖させた後、腹水を集め、ウエスタンブロット法で腎タイプＩＶに反応するものを選ぶ。続いてカニクイサルの正常腎臓とサル腎炎モデル（抗ＧＢＭ抗体腎炎）の腎臓を用いて免疫染色を行い、サル抗ＧＢＭ抗体腎炎の糸球体と反応するもので、サル正常腎と反応しないものを選ぶ。
（ここで作製したカニクイサルの腎炎モデルは既に報告されている投与部位と異なり、背部皮内に初回ＮＣ１を１ｍｇ、追加免疫３ｍｇで作製している。足裏に打つのに比べ、サルの歩行に困難を与えず、感染の可能性も低い）
抗腎タイプＩＶモノクロ−ナル抗体は蛍光が未標識なので、免疫染色には間接法を用いるが、この時二次反応に用いた市販のロ−ダミン標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（コルテックス社、ＣＢ１５４５、ヒトの血清で吸収済み、５０倍希釈）が他種の免疫グロブリン（この場合サル腎糸球体に沈着するＩｇＧ）と反応すること、即ち非特異的反応が危惧される。そこでロ−ダミン標識抗マウス抗体を直接サル抗ＧＢＭ抗体腎炎の糸球体に振り掛けて試すと微かに染色する。しかし、本願発明品を用いた間接免疫染色に比べ、染色が明らかに弱い。
更に、抗腎タイプＩＶポリクロ−ナル抗体（ウサギ由来）を作製し、サル正常腎臓と腎炎モデルの腎臓とを間接染色法で比較した。その結果、正常腎臓も腎炎モデルの腎臓も共に染まる。逆に、本願発明の抗腎タイプＩＶモノクロ−ナル抗体は、腎炎の方に良く染まる。
よって、本願発明の抗腎タイプＩＶモノクロ−ナル抗体は糸球体腎炎の識別に有用な染色試薬である。
事実、このようにして選ばれた抗腎タイプＩＶモノクロ−ナル抗体は人の糸球体腎炎、例えばＩｇＡ腎症の腎凍結切片で糸球体基底膜や尿細管を染色する。
更に、この抗体の特性確認の為、タイプＩＶコラ−ゲン（ヒト胎盤由来、ペプシン処理）とタイプＩＶコラ−ゲン（ウシ腎糸球体由来、ペプシン処理）とを抗原としてウエスタンブロット法での免疫反応を見ると、腎タイプＩＶとは反応するが胎盤タイプＩＶとは反応しない。
ＥＬＩＳＡ法でも、ウエスタンブロット法でも、免疫染色でも使用可能な抗腎タイプＩＶモノクロ−ナル抗体である。
［蛍光標識抗腎タイプＩＶモノクロ−ナル抗体］
蛍光物質は、文献（「免疫研究の基礎技術」２５頁、羊土社刊）より緩和な条件（０．０５Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ８．０〜９．０、室温×３０分＋４Ｃ×２時間、ＩｇＧ：ＦＩＴＣ＝１：４（モル比率）／ＭＷ．ＩｇＧ１６０，０００ ＦＩＴＣ４００／＝１０ｍｇ：０．１ｍｇ）で標識し、カラムでフリ−の蛍光物質を除去する。標識後、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶かし、ＥＬＩＳＡ法で未標識の抗腎タイプＩＶモノクロ−ナル抗体と抗体価の比較を行い抗体の劣化が起きていない事を確認する。蛋白濃度（ＩｇＧ濃度）は吸光度（Ａ２８０ｎｍ）を測定して決定する。
Ｆ／Ｐｒａｔｉｏ＝０．６〜３．０のものが蛍光標識抗体としての能力を有するので、これを用い、６．０以上は、腎タイプＩＶとの反応性が失われたので用いない。又、抗腎タイプＩＶモノクロ−ナル抗体（以下モノクロ抗体）でサル抗ＧＢＭ抗体腎炎の腎臓の切片を直接免疫染色法で染色を確認する。更にヒトの腎炎の病理切片で確認する。

［抗腎タイプＩＶ抗体を取り除く器具及び又は腎タイプＩＶを取り除く器具］
抗腎タイプＩＶ抗体で作製したアフィニテ−カラムを用いて、血液を通すと血清中の腎タイプＩＶのみが除かれる。続いて、その血液を腎タイプＩＶで作製したアフィニテ−カラムに通して、血清中の抗腎タイプＩＶ抗体を除き、抗体も抗原もとり除かれた血液を再度体内に戻す。腎炎モデルのカニクイサル（雄、体重、推定年齢）から血清相当４ｍｌの血液を採取し、これを先述の２種のアフィニテ−カラムを通して、再度血管に戻す。この作業を３回繰り返す。その結果、作業前後の尿中の抗体価を測定したところ、１／５に抗体価が下がった。

［腎タイプＩＶを抗原とした抗腎タイプＩＶ抗体測定キット］及び［腎タイプＩＶを抗原として作製した抗腎タイプＩＶ抗体による腎タイプＩＶ測定キット］
腎タイプＩＶを得るには、ウシ腎より糸球体基底膜を取り出し定法のペプシン分解を行い抽出する。この時混入の恐れがあるＮＣ１微細末を、別途用意した抗ＮＣ１抗体のアフィニテ−カラムで除去する。この操作を行う事で、純粋の腎臓由来のタイプＩＶコラ−ゲンが得られる。又、これを抗原とする事で特異性の高い抗体が得られる。
「抗体測定キット」
９６穴プレ−トに抗原（ １）腎タイプＩＶ、２）ヒト胎盤由来ペプシン可溶化タイプＩＶコラ−ゲン）をコ−トし、検体１００ｕｌを加え、室温で２時間反応後、ＨＲＰ標識抗体（検体がマウス由来の時は抗マウス、ウサギの時は抗ウサギ、ヤギの時は抗ヤギの各抗体）を加え、室温で１時間反応後、ＴＭＢ液を加え、室温で１０分反応後、１Ｎ硫酸で反応を停止し、直ちに４５０ｎｍで測定する。
検体と結果；
・検体／抗ヒト胎盤由来タイプＩＶコラ−ゲンモノクロ抗体（免疫動物／マウス、３種類；１Ａ，１Ｂ，１Ｅ）；
１）いずれもマイナス（バックグランドを引いている、以下同じ）
２）１Ａ／１．８２６，１Ｂ／２．１８８，１Ｅ／２．２２２
・検体／抗ヒト胎盤由来タイプＩＶコラ−ゲンポリクロ抗体（免疫動物／ウサギ、ＹＯＫＯ） ； １）２．３９１ ２）２．２３１
・検体／市販抗ヒト胎盤由来タイプＩＶコラ−ゲンモノクロ抗体（免疫動物／マウス、Ｆ５９） ； １）０．０４７ ２）２．１３５
・検体／市販抗ヒト胎盤由来タイプＩＶコラ−ゲンポリクロ抗体（免疫動物／ヤギ）
； １）０．４５０ ２）２．０３７
・検体／ヒト糸球体腎炎患者尿（２４例）；
１）平均吸光度０．４８７ ２）平均吸光度０．１２４
・免疫動物では、抗体ＹＯＫＯのみが、ウシ腎糸球体由来ペプシン可溶化タイプＩＶコラ−ゲンとヒト胎盤由来ペプシン可溶化タイプＩＶコラ−ゲンの両者に反応したが、それ以外は、免疫抗原とした一方のタイプＩＶコラ−ゲンにしか反応しなかった。
・ヒト糸球体腎炎患者尿では、抗腎タイプＩＶ抗体が顕著に検出された。
結論；腎機能の評価に抗タイプＩＶコラ−ゲン抗体を測定する時は、抗原には腎臓由来のタイプＩＶコラ−ゲンを用いて測定する事が良い。
「抗原測定キット」
１）抗腎タイプＩＶ抗体（ウサギ由来）１０ｕｇ／ｍｌをコ−トした９６穴マイクロプレ−トに標準（ウシ腎タイプＩＶ）とヒト胎盤タイプＩＶを加え、４Ｃで１夜放置後洗浄し、２）抗腎タイプＩＶモノクロ−ナル抗体（マウス由来）を加え室温で２時間放置後洗浄し、２）−２ 酵素（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ抗体を加え室温で１時間放置後洗浄し、３）発色基質（ＴＭＢ）を加え室温で１０分放置後、４）反応停止液（１Ｎ硫酸）を加え、直ちに波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。
結果；
・標準（ウシ腎タイプＩＶ）は最低濃度０．１ｎｇ／ｍｌまで測定されたが、ヒト胎盤タイプＩＶは、検出できなかった。この測定において、「２）」を同時に作製した抗腎タイプＩＶポリクロ−ナル抗体（ラット由来）にし、「２）−２」を対応する酵素（ＨＲＰ）標識抗ラットＩｇＧ抗体にした所、標準（ウシ腎タイプＩＶ）は最低濃度１．０ｎｇ／ｍｌまで測定されたが、ヒト胎盤タイプＩＶも、最低１０ｎｇ／ｍｌまで測定された。
結論：測定対象が腎タイプＩＶの時には抗腎タイプＩＶ抗体を用いた測定キットが検出感度を高める。

Claims (7)

1. ヒト及び／又は動物の腎糸球体の機能把握の為に、ヒト及び／又は動物の腎糸球体由来のタイプＩＶコラ−ゲン三本鎖螺旋領域又はそのペプタイド（以下腎タイプＩＶ）を抗原として、免疫反応により、試料中の抗腎タイプＩＶ抗体を検出する方法とこれを用いて開発する医薬品、医療用具
2. 腎タイプＩＶと免疫反応をする抗腎タイプＩＶモノクロ−ナル抗体とこれを用いて開発する医薬品、医療用具
3. 腎タイプＩＶと免疫反応をするが、ヒト及び／又は動物の胎盤由来のタイプＩＶコラ−ゲン三本鎖螺旋領域又はそのペプタイド（以下胎盤タイプＩＶ）とは免疫反応をしない抗腎タイプＩＶモノクロ−ナル抗体とこれを用いて開発する医薬品、医療用具
4. 腎タイプＩＶを用いて作製した抗腎タイプＩＶ抗体を用いて、免疫反応により、腎タイプＩＶを標準として、試料中のタイプＩＶコラ−ゲンを検出する方法とこれを用いて開発する医薬品、医療用具
5. 糸球体腎炎の改善を目的に、免疫反応により、抗腎タイプＩＶ抗体を取り除く器具
6. 糸球体腎炎の改善を目的に、免疫反応により、腎タイプＩＶを取り除く器具
7. 腎タイプＩＶ又は抗腎タイプＩＶ抗体を用いて惹起した腎疾患モデル動物とこれを用いて開発する医薬品、医療用具