PL198236B1 - Sposób określania działania swoistego szczepienia przeciw alergii oraz sposób określania stanu immunologicznego osobnika alergicznego - Google Patents
Sposób określania działania swoistego szczepienia przeciw alergii oraz sposób określania stanu immunologicznego osobnika alergicznegoInfo
- Publication number
- PL198236B1 PL198236B1 PL345727A PL34572799A PL198236B1 PL 198236 B1 PL198236 B1 PL 198236B1 PL 345727 A PL345727 A PL 345727A PL 34572799 A PL34572799 A PL 34572799A PL 198236 B1 PL198236 B1 PL 198236B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- complex
- antibody
- solid phase
- component
- sample
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 158
- 239000007788 liquid Substances 0.000 title claims abstract description 15
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims abstract description 99
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 68
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 67
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims abstract description 54
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 44
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 42
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims abstract description 39
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 39
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 33
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 claims abstract description 31
- 230000007815 allergy Effects 0.000 claims abstract description 31
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 claims abstract description 31
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 claims abstract description 28
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 28
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 23
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 21
- 239000013566 allergen Substances 0.000 claims description 54
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 44
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 claims description 33
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical group N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 26
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 21
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 19
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 18
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 14
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 13
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 13
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 13
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 12
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 claims description 11
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 claims description 11
- 235000018185 Betula X alpestris Nutrition 0.000 claims description 8
- 235000018212 Betula X uliginosa Nutrition 0.000 claims description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 7
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 claims description 6
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims description 5
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 3
- 206010016256 fatigue Diseases 0.000 claims description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 3
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 claims description 2
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 claims description 2
- 235000003932 Betula Nutrition 0.000 claims 1
- 241000219429 Betula Species 0.000 claims 1
- 101100406516 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) orb6 gene Proteins 0.000 claims 1
- 239000013575 birch pollen allergen Substances 0.000 claims 1
- 230000009747 swallowing Effects 0.000 claims 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 70
- 230000004044 response Effects 0.000 description 32
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 27
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 25
- -1 acridinium compound Chemical class 0.000 description 20
- 229960004784 allergens Drugs 0.000 description 16
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 235000009109 Betula pendula Nutrition 0.000 description 13
- 241000219430 Betula pendula Species 0.000 description 13
- 241000238740 Dermatophagoides pteronyssinus Species 0.000 description 12
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 11
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 9
- 241000223602 Alternaria alternata Species 0.000 description 8
- 108010061629 Dermatophagoides pteronyssinus antigen p 1 Proteins 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 7
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 7
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 7
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 7
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 7
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 7
- BAQMYDQNMFBZNA-UHFFFAOYSA-N N-biotinyl-L-lysine Natural products N1C(=O)NC2C(CCCCC(=O)NCCCCC(N)C(O)=O)SCC21 BAQMYDQNMFBZNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 5
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 5
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 5
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 5
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N Iron oxide Chemical compound [Fe]=O UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 4
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 4
- 238000010181 skin prick test Methods 0.000 description 4
- YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoate Chemical compound C([C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1)CCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N 0.000 description 3
- ATYCFNRXENKXSE-MHPIHPPYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 6-[6-[5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]hexanoylamino]hexanoate Chemical compound C([C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1)CCCC(=O)NCCCCCC(=O)NCCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O ATYCFNRXENKXSE-MHPIHPPYSA-N 0.000 description 3
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 3
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 208000010216 atopic IgE responsiveness Diseases 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 3
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 3
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 3
- AAYSIOJYGRABGS-UHFFFAOYSA-N 3-[9-[4-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxycarbonyl-2,6-dimethylphenoxy]carbonylacridin-10-ium-10-yl]propane-1-sulfonate Chemical compound C=1C(C)=C(OC(=O)C=2C3=CC=CC=C3[N+](CCCS([O-])(=O)=O)=C3C=CC=CC3=2)C(C)=CC=1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O AAYSIOJYGRABGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108050001427 Avidin/streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 241001227713 Chiron Species 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UEEJHVSXFDXPFK-UHFFFAOYSA-N N-dimethylaminoethanol Chemical compound CN(C)CCO UEEJHVSXFDXPFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FFBHFFJDDLITSX-UHFFFAOYSA-N benzyl N-[2-hydroxy-4-(3-oxomorpholin-4-yl)phenyl]carbamate Chemical compound OC1=C(NC(=O)OCC2=CC=CC=C2)C=CC(=C1)N1CCOCC1=O FFBHFFJDDLITSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 2
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RNIPJYFZGXJSDD-UHFFFAOYSA-N 2,4,5-triphenyl-1h-imidazole Chemical compound C1=CC=CC=C1C1=NC(C=2C=CC=CC=2)=C(C=2C=CC=CC=2)N1 RNIPJYFZGXJSDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000238713 Dermatophagoides farinae Species 0.000 description 1
- 108010061608 Dermatophagoides pteronyssinus antigen p 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 238000000585 Mann–Whitney U test Methods 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000238711 Pyroglyphidae Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000013568 food allergen Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 229940046533 house dust mites Drugs 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 1
- KNJDBYZZKAZQNG-UHFFFAOYSA-N lucigenin Chemical compound [O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O.C12=CC=CC=C2[N+](C)=C(C=CC=C2)C2=C1C1=C(C=CC=C2)C2=[N+](C)C2=CC=CC=C12 KNJDBYZZKAZQNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N phenyl 10-methylacridin-10-ium-9-carboxylate Chemical compound C12=CC=CC=C2[N+](C)=C2C=CC=CC2=C1C(=O)OC1=CC=CC=C1 RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 229940043517 specific immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000002993 sponge (artificial) Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000001521 two-tailed test Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013026 undiluted sample Substances 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
1. Sposób okre slania dzia lania swoistego szczepienia przeciw alergii, znamienny tym, ze obejmuje etapy, zgodnie z którymi: (h') okre sla si e zawartosc przeciwcia la w p lynnej próbce stosuj ac nast epuj acy test: (a') dostarcza si e mieszanin e fazy ciek lej i kompleksu trzysk ladnikowego fazy sta lej sk ladaj ac a si e z (i) przeciwcia la w próbce, (ii) reaguj acego przeciwcia la skierowanego przeciw przeciwcia lu z próbki, gdzie reaguj ace przeciwcia lo zwi azane jest z cz astk a stala, i (iii) ligandu w postaci antygenu, przeciwcia la lub haptenu, (b') oddziela si e kompleks trzy sk ladnikowy fazy sta lej od fazy ciek lej, (c') p lucze si e oddzielony kompleks trzysk ladnikowy fazy sta lej dla usuni ecia zwi azków zwi azanych nienalezacych do kompleksu, (d') dodaje si e do kompleksu trzysk ladnikowego fazy sta lej roztwór (iv) zwi azku znakowanego dla utworzenia komplek- su czterosk ladnikowego, (e') oddziela si e kompleks czterosk ladnikowy fazy sta lej od roztworu, (f) p lucze si e oddzielony kompleks czterosk ladnikowy fazy sta lej dla usuni ecia zwi azku (iv) zwi azanego nienalezacego do kompleksu, (g') przeprowadza si e wykrywanie/mierzenie wyp lukanego znakowanego kompleksu czterosk ladnikowego, (i') okre sla si e zawartosc wymienionego przeciwcia la stosuj ac nast epuj acy test: (ia') dostarcza si e mieszanin e fazy ciek lej i kompleksu czterosk ladnikowego fazy sta lej sk ladaj ac a si e z (i) przeciwcia la w próbce, (ii) reaguj acego przeciwcia la skierowanego przeciw przeciwcia lu z próbki, gdzie reaguj ace przeciwcia lo zwi azane jest z cz astk a stala, (iii) ligandu w postaci antygenu, przeciwcia la lub haptenu i (iv) zwi azku znakowanego, dla utworzenia komplek- su czterosk ladnikowego fazy sta lej, (ib') oddziela si e kompleks czterosk ladnikowy fazy sta lej od fazy ciek lej, (ic') p lucze si e oddzielony kompleks czterosk ladnikowy fazy sta lej dla usuni ecia zwi azków zwi azanych nienalezacych do kompleksu, (id') przeprowadza si e wykrywanie/mierzenie wyp lukanego znakowanego kompleksu czterosk ladnikowego, (j') porównuje si e pomiary uzyskane w etapie (h') i w etapie (i') oraz stosuje si e porównanie dla okre slenia dzia lania swoistego szczepienia przeciw alergii. PL PL PL PL
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób określania działania swoistego szczepienia przeciw alergii oraz sposób określania stanu immunologicznego osobnika alergicznego.
Publikacja WO 94/11734 opisuje test dwustronny dla przeciwciała przy zastosowaniu znakowania chemiluminescencyjnego i ligandu związanego z biotyną, gdzie podany sposób obejmuje następujące etapy: a) miesza się z płynną próbką, antygen, przeciwciało lub hapten jako ligand związany z biotyną lub jej funkcjonalną pochodną, przeciwciało skierowane przeciw wykrywanemu przeciwciału związane z cząstkami paramagnetycznymi oraz chemiluminescencyjny związek akrydynowy związany z awidyną, streptawidyną lub ich funkcjonalną pochodną, dla utworzenia kompleksu fazy stałej, b) magnetycznie oddziela się fazę stałą od fazy ciekłej, c) inicjuje się reakcję chemiluminescencyjną, która jeśli zachodzi, to w wydzielonej fazie stałej i d) poddaje się analizie oddzieloną fazę stałą na obecność fazy chemiluminescencyjnej, która jest wskaźnikiem obecności wymienionego przeciwciała w próbce.
Sposób według stanu techniki jest szczególnie odpowiedni do mierzenia stężenia swoistych immunoglobulin w płynach ustrojowych, takich jak swoista immunoglobulina wybrana spośród grupy IgA, IgD, IgE, IgG, IgM i ich podklas.
Sposób według stanu techniki jest również szczególnie odpowiedni do wykrywania i analizy ilościowej całkowitej zawartości immunoglobulin w klasie lub podklasie, takiej jak IgA, IgD, IgE, IgG, IgM i w ich podklasach.
W korzystnym przykładzie realizacji sposobu według stanu techniki utworzenie kompleksu fazy stałej można osiągnąć w dwóch etapach, a mianowicie w pierwszym etapie, w którym próbka zmieszana zostaje z ligandem antygenu związanym z biotyną, przeciwciałem lub haptenem i z przeciwciałem związanym z cząstkami paramagnetycznymi, dla utworzenia pierwszego kompleksu fazy stałej, oraz w drugim etapie, w którym chemiluminescencyjny związek akrydynowy dodany zostaje do pierwszego kompleksu fazy stałej, dla utworzenia drugiego kompleksu fazy stałej.
Jednak, praktyczne zastosowanie sposobu według stanu techniki ujawniło, że w pewnych zastosowaniach tego sposobu zachodzi interferencja z innymi rodzajami immunoglobulin i/lub z innymi rodzajami immunologicznie aktywnych składników osocza, co powoduje błędy w uzyskanych rezultatach.
Artykuł „Capture assay for specific IgE” autorstwa V. Olivieri i wsp., Journal of Immunological Methods, 157 (1993) 65-72 ujawnia test do pomiaru swoistych IgE w osoczu pacjentów alergicznych przy zastosowaniu monoklonalnych anty-ludzkich IgE (umieszczonych w jamkach płytki do miareczkowania) i biotynylowanych alergenów w roztworze. Podczas pojedynczej inkubacji IgE ulega związaniu z fazą stałą poprzez fragment Fc, a biotynylowane alergeny reagują z ich rejonami Fab swoistego IgE. W drugim etapie, dodawany jest konjugat streptawidyny i peroksydazy chrzanowej w celu wykrycia ilości biotyny związanej z fazą stałą. Artykuł ten analizuje interferencje przy wysokich poziomach nieswoistych IgE i przy obecności IgG swoistych wobec alergenu.
Publikacja WO 98/16829 przedstawia test, w którym antyimmunoglobulina związana jest z jamką płytki do mikromiareczkowania, która następnie ulega płukaniu. Do jamki następnie dodawane jest osocze testowe w celu wychwycenia wszystkich docelowych immunoglobulin znajdujących się w testowanej próbce. Pobierana jest wówczas biologiczna próbka płynna, a płytka do mikromiareczkowania ulega płukaniu. Wychwycone przeciwciało na płytce wystawione jest na działanie antygenu biotynylowanego, płytka zostaje wypłukana, dodawany jest konjugat streptawidyny i fosfatazy zasadowej, po czym płytka jest ponownie płukana. Test według stanu techniki może być używany do monitorowania skutku leczenia infekcji H. pylori przy zastosowaniu standardowej terapii antybiotykowej.
Zgodnie z wynalazkiem, sposób określania działania swoistego szczepienia przeciw alergii, charakteryzuje się tym, że obejmuje etapy, zgodnie z którymi:
(h') określa się zawartość przeciwciała w płynnej próbce stosując następujący test:
(a') dostarcza się mieszaninę fazy ciekłej i kompleksu trzyskładnikowego fazy stałej składającą się z (i) przeciwciała w próbce, (ii) reagującego przeciwciała skierowanego przeciw przeciwciału z próbki, gdzie reagujące przeciwciało związane jest z cząstką stałą, i (iii) ligandu w postaci antygenu, przeciwciała lub haptenu, (b') oddziela się kompleks trzyskładnikowy fazy stałej od fazy ciekłej, (c') płucze się oddzielony kompleks trzyskładnikowy fazy stałej dla usunięcia związków związanych nienależących do kompleksu,
PL 198 236 B1 (d') dodaje się do kompleksu trzyskładnikowego fazy stałej roztwór (iv) związku znakowanego dla utworzenia kompleksu czteroskładnikowego, (e') oddziela się kompleks czteroskładnikowy fazy stałej od roztworu, (f) płucze się oddzielony kompleks czteroskładnikowy fazy stałej dla usunięcia związku (iv) związanego nienależącego do kompleksu, (g') przeprowadza się wykrywanie/mierzenie wypłukanego znakowanego kompleksu czteroskładnikowego, (i') określa się zawartość wymienionego przeciwciała stosując następujący test:
(ia') dostarcza się mieszaninę fazy ciekłej i kompleksu czteroskładnikowego fazy stałej składającą się z (i) przeciwciała w próbce, (ii) reagującego przeciwciała skierowanego przeciw przeciwciału z próbki, gdzie reagujące przeciwciało związane jest z cząstką stałą, (iii) ligandu w postaci antygenu, przeciwciała lub haptenu i (iv) związku znakowanego, dla utworzenia kompleksu czteroskładnikowego fazy stałej, (ib') oddziela się kompleks czteroskładnikowy fazy stałej od fazy ciekłej, (ic') płucze się oddzielony kompleks czteroskładnikowy fazy stałej dla usunięcia związków związanych nienależących do kompleksu, (id') przeprowadza się wykrywanie/mierzenie wypłukanego znakowanego kompleksu czteroskładnikowego, (j') porównuje się pomiary uzyskane w etapie (h') i w etapie (i') oraz stosuje się porównanie dla określenia działania swoistego szczepienia przeciw alergii.
Korzystnie, w sposobie tym w etapie (a') i w etapie (ia') ligand związany jest z biotyną lub jej funkcjonalną pochodną, w etapie (d') i w etapie (ia') związek znakowany jest związkiem chemiluminescencyjnym kowalencyjnie związanym z awidyną, streptawidyną lub ich funkcjonalną pochodną, w etapie (g') i w etapie (id') wykrywanie/mierzenie przeprowadza się przez inicjowanie reakcji chemiluminescencyjnej w wypłukanym kompleksie czteroskładnikowym fazy stałej i wykrywanie/mierzenie powstałej chemiluminescencji, jeśli występuje.
Korzystnie, w etapie (a') i w etapie (ia') cząstka stała jest cząstką stałą paramagnetyczną, w etapie (b') i w etapie (ib') oddzielenie kompleksu fazy stałej od fazy ciekłej dokonuje się magnetycznie.
Zgodnie z wynalazkiem też, sposób określania działania swoistego szczepienia przeciw alergii, charakteryzuje się tym, że obejmuje etapy, zgodnie z którymi:
(x') określa się zawartość przeciwciała w płynnej próbce stosując następujący sposób:
(o') dostarcza się mieszaninę fazy ciekłej i kompleksu dwuskładnikowego fazy stałej składającą się z (i) przeciwciała w próbce, i (ii) reagującego przeciwciała skierowanego przeciw przeciwciału z próbki, gdzie reagujące przeciwciało związane jest z cząstką stałą, (p') oddziela się kompleks dwuskładnikowy fazy stałej od fazy ciekłej, (q') płucze się oddzielony kompleks dwuskładnikowy fazy stałej dla usunięcia związków związanych nienależących do kompleksu, (r') dodaje się do wypłukanego kompleksu dwuskładnikowego fazy stałej roztwór (iii) ligandu w postaci antygenu, przeciwciała lub haptenu, który jest opcjonalnie znakowany, dla utworzenia kompleksu trzyskładnikowego fazy stałej, (s') opcjonalnie dodaje się do kompleksu trzyskładnikowego fazy stałej roztwór (iv) związku znakowanego dla utworzenia kompleksu czteroskładnikowego fazy stałej, (t') oddziela się kompleks trzy- lub czteroskładnikowy fazy stałej uzyskany, odpowiednio, w etapach (r') lub (s'), od roztworu, (u') płucze się oddzielony kompleks trzy- lub czteroskładnikowy fazy stałej dla usunięcia związków związanych nienależących do kompleksu, (v') przeprowadza się wykrywanie/mierzenie wypłukanego znakowanego kompleksu trzy- lub czteroskładnikowego, (y') określa się zawartość wymienionego przeciwciała stosując następujący test:
(ya') dostarcza się mieszaninę fazy ciekłej i kompleksu trzyskładnikowego fazy stałej składającą się z (i) przeciwciała w próbce, (ii) reagującego przeciwciała skierowanego przeciw przeciwciału z próbki, gdzie reagujące przeciwciało związane jest z cząstką stałą, (iii) ligandu w postaci antygenu, przeciwciała lub haptenu, który jest znakowany lub związany ze (iv) związkiem znakowanym, dla utworzenia kompleksu wieloskładnikowego fazy stałej,
PL 198 236 B1 (yb') oddziela się kompleks wieloskładnikowy fazy stałej od fazy ciekłej, (yc') płucze się oddzielony kompleks wieloskładnikowy fazy stałej dla usunięcia związków związanych nienależących do kompleksu, (yd') przeprowadza się wykrywanie/mierzenie wypłukanego znakowanego kompleksu wieloskładnikowego, (z') porównuje się pomiary uzyskane w etapie (x') i w etapie (y') oraz stosuje się porównanie dla określenia działania swoistego szczepienia przeciw alergii.
Korzystnie w sposobie tym, w etapie (r') i w etapie (ya') ligand związany jest z biotyną lub jej funkcjonalną pochodną, etap (s') jest etapem koniecznym, w etapie (s') i w etapie (ya') związek znakowany jest związkiem chemiluminescencyjnym kowalencyjnie związanym z awidyną, streptawidyną lub ich funkcjonalną pochodną, w etapie (v') i w etapie (yd') wykrywanie/mierzenie przeprowadza się przez inicjowanie reakcji chemiluminescencyjnej w wypłukanym kompleksie czteroskładnikowym fazy stałej i wykrywanie/mierzenie powstałej chemiluminescencji, jeśli występuje.
Korzystnie, w etapie (o') i w etapie (ya') cząstka stała jest cząstką stałą paramagnetyczną, w etapie (p'), w etapie (t') i w etapie (yb') oddzielenie kompleksu fazy stałej od fazy ciekłej dokonuje się magnetycznie.
Korzystnie, etap (ia'), (ia), (ia), (ya'), (ya) lub (ya), odpowiednio, przeprowadza się przez zmieszanie składników (i) i (ii), następnie przez dodanie składnika (iii), i ostatecznie przez dodanie składnika (iv), jeśli jest on dodawany.
Korzystnie, etap (ia'), (ia), (ia), (ya'), (ya) lub (ya), odpowiednio, przeprowadza się przez zmieszanie składników (i), (ii) i (iii), a następnie przez dodanie składnika (iv), jeśli jest on dodawany.
Korzystnie, porównanie etapu (j'), (j), (j), (z'), (z) lub (z), odpowiednio, przeprowadza się przez obliczenie proporcji pomiarów uzyskanych w dwóch wymienionych etapach.
Korzystnie, porównanie etapu (j'), (j), (j), (z'), (z) lub (z), odpowiednio, przeprowadza się w szeregu punktach czasowych od rozpoczęcia leczenia i podczas okresu leczenia, i że wszelkie zmiany w czasie, możliwe do zaobserwowania, służą jako podstawa do określenia działania swoistego szczepienia przeciw alergii.
Natomiast, sposób określania stanu immunologicznego osobnika alergicznego, charakteryzuje się tym, że obejmuje etapy, zgodnie z którymi:
A/ określa się zawartość przeciwciała w płynnej próbce uzyskanej od osobnika stosując następujący protokół (test A):
(Aa) miesza się (i) przeciwciało w próbce, (ii) przeciwciało skierowane przeciw rejonowi Fc przeciwciała z próbki, gdzie reagujące przeciwciało związane jest z nośnikiem stałym i (iii) ligand w postaci antygenu, przeciwciała lub haptenu, gdzie ligand skierowany jest do rejonu Fab przeciwciała z próbki, dla utworzenia mieszaniny kompleksu trzyskładnikowego fazy stałej i fazy ciekłej, (Ab) łączy się kompleks trzyskładnikowy ze (iv) związkiem znakowanym dla utworzenia mieszaniny kompleksu czteroskładnikowego i fazy ciekłej, (Ac) płucze się czteroskładnikową fazę stałą dla usunięcia związków związanych nienależących do kompleksu, (Ad) przeprowadza się wykrywanie/mierzenie wypłukanego znakowanego kompleksu czteroskładnikowego dla uzyskania pomiaru A;
B/ określa się zawartość wymienionego przeciwciała w tej próbce stosując następujący protokół (test B):
(Ba) miesza się (i) przeciwciało w próbce, i (ii) reagujące przeciwciało skierowane przeciw rejonowi Fc przeciwciała z próbki, gdzie reagujące przeciwciało związane jest z nośnikiem stałym, dla utworzenia mieszaniny kompleksu dwuskładnikowego fazy stałej i fazy ciekłej, (Bb) płucze się kompleks dwuskładnikowy fazy stałej dla usunięcia związków związanych nienależących do kompleksu, (Bc) łączy się wypłukany kompleks dwuskładnikowy fazy stałej z (iii) ligandem w postaci antygenu, przeciwciała lub haptenu, gdzie ligand związany jest z rejonem Fab przeciwciała z próbki, i ze (iv) związkiem znakowanym, dla utworzenia mieszaniny kompleksu czteroskładnikowego fazy stałej i fazy ciekłej, (Bd) płucze się kompleks czteroskładnikowy fazy stałej dla usunięcia związków związanych nienależących do kompleksu, (Be) przeprowadza się wykrywanie/mierzenie wypłukanego znakowanego kompleksu czteroskładnikowego dla uzyskania pomiaru B; oraz
PL 198 236 B1 (E) ustala się wzajemne relacje między pomiarem A i B dla określenia interferencji i stosuje się te interferencje jako parametr do określenia stanu immunologicznego osobnika.
Korzystnie, etap Ab przeprowadza się przez dodanie wymienionego (iv) związku znakowanego do wymienionej mieszaniny kompleksu trzyskładnikowego fazy stałej i fazy ciekłej w etapie Aa.
Korzystnie, etap Ab przeprowadza się przez płukanie kompleksu trzyskładnikowego uzyskanego w etapie Aa dla usunięcia związków związanych nienależących do kompleksu i przez kolejne dodanie wymienionego (iv) związku znakowanego do wypłukanego kompleksu trzyskładnikowego.
Korzystnie, etap Bd przeprowadza się przez jednoczesną inkubację wymienionego (iii) ligandu i wymienionego (iv) związku znakowanego z kompleksem dwuskładnikowym.
Korzystnie, początkowo wymieniony (iii) ligand dodaje się do kompleksu dwuskładnikowego dla utworzenia kompleksu trzyskładnikowego, który następnie płucze się dla usunięcia (iii) ligandu związanego nienależącego do kompleksu, po czym dodaje się wymieniony (iv) związek znakowany dla utworzenia kompleksu czteroskładnikowego.
Korzystnie, znakowanie związku jest znakowaniem luminescencyjnym, znakowaniem chemiluminescencyjnym, znakowaniem enzymatycznym, znakowaniem radioaktywnym, znakowaniem fluorescencyjnym lub znakowaniem absorbancyjnym.
Korzystnie, (iii) ligand jest biotynylowany.
Korzystnie, (iv) związek znakowany jest związkiem chemiluminescencyjnym kowalencyjnie związanym z awidyną, streptawidyną lub ich funkcjonalną pochodną.
Zgodnie z wynalazkiem też, sposób określania stanu immunologicznego osobnika alergicznego, charakteryzuje się tym, że obejmuje etapy, zgodnie z którymi:
C/ określa się zawartość przeciwciała w płynnej próbce uzyskanej od osobnika stosując następujący protokół (test C):
(Ca) miesza się (i) przeciwciało w próbce, (ii) przeciwciało skierowane przeciw rejonowi Fc przeciwciała z próbki, gdzie reagujące przeciwciało związane jest z nośnikiem stałym, i (iii) ligand znakowany w postaci antygenu, przeciwciała lub haptenu, gdzie ligand skierowany jest do rejonu Fab przeciwciała z próbki, dla utworzenia mieszaniny kompleksu trzyskładnikowego fazy stałej i fazy ciekłej, (Cb) płucze się kompleks trzyskładnikowy fazy stałej dla usunięcia związków związanych nienależących do kompleksu, (Cc) przeprowadza się wykrywanie/mierzenie wypłukanego znakowanego kompleksu trzyskładnikowego dla uzyskania pomiaru C; oraz
D/ określa się zawartość wymienionego przeciwciała stosując następujący protokół (test D):
(Da) miesza się (i) przeciwciało w próbce, i (ii) reagujące przeciwciało skierowane przeciw rejonowi Fc przeciwciała z próbki, gdzie reagujące przeciwciało związane jest z nośnikiem stałym, dla utworzenia mieszaniny kompleksu dwuskładnikowego fazy stałej i fazy ciekłej, (Db) płucze się kompleks dwuskładnikowy fazy stałej dla usunięcia związków związanych nienależących do kompleksu, (Dc) łączy się wypłukany kompleks dwuskładnikowy fazy stałej z (iii) ligandem znakowanym w postaci antygenu, przeciwciała lub haptenu, gdzie ligand związany jest z rejonem Fab przeciwciała z próbki, dla utworzenia mieszaniny kompleksu trzyskładnikowego fazy stałej i fazy ciekłej, (Dd) płucze się kompleks trzyskładnikowy fazy stałej dla usunięcia związków związanych nienależących do kompleksu, (De) przeprowadza się wykrywanie/mierzenie wypłukanego znakowanego kompleksu trzyskładnikowego dla uzyskania pomiaru D; oraz (E) ustala się wzajemne relacje między pomiarem C i D dla określenia interferencji i stosuje się te interferencje jako parametr do określenia stanu immunologicznego osobnika.
Korzystnie, znakowany ligand jest znakowany atomem radioaktywnym.
Korzystnie, osobnik, którego stan jest określany przechodzi leczenie alergii, leczenie alergii szczepieniem lub leczenie swoistym szczepieniem przeciw alergii (SAV, Specific Allergy Vaccination).
Dzięki sposobowi według wynalazku możliwa jest ocena i/lub przewidywanie efektu swoistego szczepienia przeciw alergii (SAV).
Zgodnie z tym pierwszym aspektem (zastrz. 1-6), poziom, charakter oraz chwilowe wywoływanie interferencji między różnymi rodzajami immunologicznie aktywnych składników osocza, na przykład, przeciwciał, stosowane są jako parametry do oceny i/lub przewidywania efektu leczenia za pomocą swoistego szczepienia przeciw alergii (SAV). W ten sposób nieoczekiwanie stwierdzono,
PL 198 236 B1 że parametry te dostarczają cennych informacji o stanie odporności danej osoby, jak i odpowiedź jej organizmu na wybrany sposób leczenia.
Dzięki wynalazkowi możliwe jest też zapewnienie sposobu określania stanu immunologicznego osobnika alergicznego.
Zgodnie z tym drugim aspektem (zastrz. 11-21), poziom, charakter oraz chwilowe wywoływanie interferencji między różnymi rodzajami immunologicznie aktywnych składników osocza, na przykład, przeciwciał, stosowane są jako parametry do oceny stanu odporności badanego osobnika, a w szczególności do oceny/przewidywania skutków leczenia alergii, leczenia za pomocą szczepienia przeciw alergii lub leczenia za pomocą swoistego szczepienia przeciw alergii (SAV). W ten sposób nieoczekiwanie stwierdzono, że parametry te dostarczają cennych informacji o stanie odporności danej osoby, jak i odpowiedź jej organizmu na wybrany sposób leczenia.
Swoiste szczepienie przeciw alergii (SAV), uprzednio znane jako swoista immunoterapia lub hiposensytyzacja, stosowane było do leczenia choroby alergicznej zachodzącej z udziałem IgE typu I od początku obecnego stulecia.
Główne korzyści uzyskane w rezultacie stosowania szczepienia SAV to a/ zmniejszenie symptomów alergii i spożywania leków b/ zwiększona tolerancja na alergeny w obrębie oczu, nosa i płuc i c/ zmniejszona reaktywność skórna (wczesne i późne reakcje fazy).
Podstawowy mechanizm poza poprawą uzyskaną przez SAV nie jest znany, ale można wyodrębnić wiele wspólnych cech tego procesu z licznych badań nad SAV, przeprowadzanych w ostatnich dekadach, jak to, że: 1/ całkowita ilość IgE pozostaje niezmieniona w okresie leczenia, 2/ ilość IgE swoistych w stosunku do alergenu wzrasta przejściowo podczas zwiększania dawek, a następnie spada do poziomu wyjściowego (jak przed leczeniem), 3/ swoistość epitopu i powinowactwo IgE pozostają niezmienione, 4/ IgG swoiste w stosunku do alergenu, w szczególności IgG4, silnie wzrasta w trakcie SAV, 5/ prawdopodobnie inicjowana jest nowa odpowiedź Th0/1, i 6/ odpowiedź Th2 wydaje się pozostawać jako niezmieniona, przy czym nie ma korelacji pomiędzy efektem indukowanym przez SAV a początkiem pojawienia się swoistych IgG.
SAV indukuje nową odpowiedź immunologiczną, która dojrzewa w okresie leczenia (rekrutowane są komórki Th0/1 T, indukowane są swoiste IgX w stosunku do antygenu (gdzie X może być A1, A2, G1, G2, G3, G4, M lub D). Gdy powinowactwo (lub ilość/powinowactwo) nowej odpowiedzi przeciwciał IgX wzrośnie, IgX mogą skutecznie rywalizować z IgE o alergen(y), hamując „normalną” odpowiedź alergiczną opartą na Th2, charakteryzująca się krzyżowym wiązaniem z IgE połączonymi z receptorami na powierzchni komórek tucznych i zasadochłonnych, skutkiem tego, kliniczne symptomy będą ulegać stopniowemu zmniejszaniu.
Niniejszy wynalazek opiera się na hipotezie, że jeśli mierzy się ilość swoistych IgE w obecności i przy nieobecności związków współzawodniczących (IgX i/lub innych interferujących substancji), to możliwy jest pomiar takiej odpowiedzi immunologicznej u indywidualnych pacjentów i pomiar taki będzie korelował z odpowiednim parametrem skutku.
Większość testów na IgE według stanu techniki, mierzy IgE przy nieobecności związków współzawodniczących. Niniejszy wynalazek opisuje pomiar IgE w obecności i przy nieobecności wszelkich (pochodzących z osocza) związków współzawodniczących.
Tak więc, sposoby te (patrz fig. 2a-c) służą do pomiaru IgE przy nieobecności czynników współzawodniczących, podczas gdy sposoby określone, odpowiednio, w etapach (i'), (i), (i), (y'), (y) i (y) według zastrz. 1-6, służą do pomiaru IgE w obecności czynników współzawodniczących.
Uważa się, że funkcjonowanie sposobu według niniejszego wynalazku może być wyjaśnione jak następuje: jeśli SAV indukuje odpowiedź, która współzawodniczy z IgE w wiązaniu alergenu, powinno być możliwe zmierzenie efektów leczenia poprzez porównanie IgE, oznaczonych w oparciu o podane sposoby. Jeśli dwa sposoby dają taki sam rezultat, to nie pojawiła się żadna substancja interferującą i stąd brak jest jakiegokolwiek efektu leczenia. Ponadto, jeśli pomiar według ostatniego sposobu (w obecności substancji współzawodniczących) jest niższy niż pomiar według wcześniejszego sposobu (przy nieobecności substancji współzawodniczących), to pojawia się odpowiedź równoległa i stąd wynika efekt leczenia.
W tym aspekcie wynalazku (zastrz. 1-6), w sposobie zastosowano dwa podtesty, a mianowicie podtesty, w których reakcja między przeciwciałem w próbce i alergenem zachodzi, odpowiednio, przy nieobecności [podtest (h'), (h), (h), (x'), (x) i (x)] i w obecności [podtest (i'), (i), (i), (y'), (y) i (y)] innych składników próbki.
PL 198 236 B1
W podteście (h) i (h) znakowanie chemiluminescencyjne może pochodzić od związku akrydynowego.
Korzystny przykład wykonania według podtestów (h'), (h) i (h) charakteryzuje się tym, że w etapach (a'), (a) lub (a) składniki (i), (ii) i (iii) ulegają zmieszaniu w trakcie jednego zabiegu (fig. 3b).
Pierwszy alternatywny przykład wykonania według podtestów (h'), (h) i (h) charakteryzuje się tym, że w etapie (a'), (a) lub (a) składniki (i) i (ii) ulegają zmieszaniu w czasie pierwszego zabiegu, a składnik (iii) dodany zostaje w czasie drugiego zabiegu (fig. 3c).
Drugi alternatywny przykład wykonania według podtestów (h'), (h) i (h) charakteryzuje się tym, że w etapach (a'), (a) lub (a) składniki (i) i (iii) ulegają zmieszaniu w czasie pierwszego zabiegu, a składnik (ii) dodany zostaje w czasie drugiego zabiegu (fig. 3a).
Korzystny przykład wykonania według pierwszego aspektu wynalazku charakteryzuje się tym, że etap (ia'), (ia), (ia), (ya'), (ya) lub (ya) przeprowadzany jest przez zmieszanie składników (i) i (ii), następnie przez dodanie składnika (iii), i ostatecznie przez dodanie składnika (iv), jeśli jest on dodawany.
Inny korzystny przykład wykonania według tego pierwszego aspektu wynalazku charakteryzuje się tym, że etap (ia'), (ia), (ia), (ya'), (ya) lub (ya) przeprowadzany jest przez zmieszanie składników (i), (ii) i (iii), a następnie przez dodanie składnika (iv), jeśli jest on dodawany.
Dalszy korzystny przykład wykonania charakteryzuje się tym, że porównanie etapów (j'), (j), (j), (z'), (z) lub (z) przeprowadza się poprzez obliczenie proporcji pomiarów według tych dwóch etapów. Alternatywnie, porównanie przeprowadza się przez obliczenie różnicy tych dwóch pomiarów.
Dalszy korzystny przykład wykonania według wynalazku charakteryzuje się tym, że porównanie etapów (j'), (j), (j), (z'), (z) lub (z) przeprowadza się w szeregu punktach czasowych, od momentu rozpoczęcia leczenia i w okresie trwania leczenia, i że każda chwilowa zmiana, która może być zaobserwowana służy jako podstawa do oceny i/lub przewidywania efektu leczenia.
Drugi aspekt niniejszego wynalazku opiera się na tych samych rozpoznaniach i hipotezie jak w przypadku pierwszego aspektu, a istniejące różnice wynikają stąd, że drugi aspekt nie jest ograniczony do żadnej specyficznej procedury stosowania testów odpornościowych. Również, zgodnie z drugim aspektem, test może być używany do przewidywania skutku wszystkich sposobów leczenia alergii.
Powiązanie ze sobą dwóch uzyskanych pomiarów może nastąpić poprzez obliczenie proporcji pomiarów lub różnicy między pomiarami.
Termin „leczenie alergii” oznacza każde leczenie alergii. Termin „leczenie alergii przez szczepienie” oznacza każde leczenie alergii przez szczepienie. Termin „leczenie przez swoiste szczepienie (SAV)” został opisany powyżej.
W niniejszym wynalazku wyrażenia „przeciwciało w próbce” i „przeciwciało z próbki” może oznaczać swoistą immunoglobulinę, korzystnie swoistą immunoglobulinę z klas IgA, IgD, IgE, IgG, IgM i ich podklas. Zwykle, wymienione przeciwciało może być każdym składnikiem krwi lub osocza, mającym możliwość specyficznych interferencji z oddziaływaniami między immunoglobulinami i ligandem w postaci antygenu, przeciwciała lub haptenu, na przykład, inhibitorami enzymu i receptorami.
Termin „płynna próbka” oznacza każdą płynną lub skroploną próbkę, włączając w to roztwory, emulsje, dyspersje i zawiesiny. Próbka może być płynem biologicznym, takim jak krew, plazma, osocze, mocz, ślina i inne płyny, które ulegają wydzielaniu z organizmu, sekrecji lub są transportowane w organizmie.
Określenie „ligand w postaci antygenu, przeciwciała lub haptenu” może być immunologicznie substancją czynną. „Antygen” może być alergenem, na przykład, pyłkiem drzew, traw, chwastów, itp., alergenami pleśni, alergenami z roztoczy i zwierząt, takich jak kot, pies, koń, cielę i ptak, alergenami kąsających owadów i alergenami wziewnymi pochodzącymi od owadów, również alergenami pokarmowymi; „przeciwciało” może być przeciwciałem monoklonalnym lub poliklonalnym, włączając w to zrekombinowane i pofragmentowane przeciwciała; „hapten” może być nieokreślonymi częściami węglowodanów z próbki lub ich fragmentami, inhibitorami enzymów lub leków, na przykład, penicylina lub jej pochodna.
Wyrażenie „ligand znakowany” oznacza każdy ligand zawierający znaczony atom lub element, na przykład, znacznik atomu radioaktywnego.
Wyrażenie „związek znakowany” oznacza każdy odpowiedni system znakowania używany konwencjonalnie w testach immunologicznych, zawierający znakowania luminescencyjne, znakowania
PL 198 236 B1 chemiluminescencyjne, znakowania enzymatyczne, znakowania radioaktywne, znakowania fluorescencyjne, i znakowania absorbancyjne.
Termin „nośnik” oznacza każde stałe podłoże, które może być użyte w teście immunologicznym, na przykład, płytka do mikromiareczkowania, cząstka, rurka, gąbka z polimeru (matryca), itp.
Termin „cząstka stała” oznacza każdą substancję zanieczyszczającą, która może być zawieszona w płynie, na przykład, kuleczki szklane, metal, na przykład, cząstki żelaza, cząstki polimeru, itp.
Oddzielenie kompleksu fazy stałej od fazy ciekłej może być przeprowadzone, zależnie od rodzaju użytych stałych cząstek, poprzez oddzielenie magnetyczne, filtracje, osadzanie, wirowanie, chromatografię lub chromatografię kolumnową.
Termin „cząstka stała paramagnetyczna” oznacza każdą cząstkę paramagnetyczną, która może ulec rozproszeniu lub zawieszeniu w środowisku płynnym, na przykład, cząstki „Biomag” (cząstki tlenku żelaza pokryte grupami o końcach aminowych), sprzedawane przez Advanced Magnetic Inc., U.S.A., i „Dynabeads” (cząstki tlenku żelaza pokryte polimerem) sprzedawane przez Dynal A.S., Norwegia.
Termin „reagujące przeciwciało” oznacza każde przeciwciało lub inne biospecyficzne reagenty mogące reagować z przeciwciałem z próbki, zawierające przeciwciała monoklonalne i poliklonalne, włączając w to zrekombinowane i fragmentaryczne przeciwciała, na przykład, przeciwciało monoklonalne „MAb A 5697-1A3(920325) dostarczane przez Biolnvent International AB, Szwecja, „Protein A” lub „Protein G” dostarczane przez Sigma Chemical Company, Saint Louis, USA.
Związkiem chemiluminescencyjnym jest korzystnie związek akrydynowy, taki jak ester N-hydroksysukcynimidu i dimetyloakrydyny (NHS-DMAE). Awidyna/streptawidyna i DMAE mogą być związane zgodnie ze sposobami opracowanymi przez: Weeks i wsp., Clinical Chem., 29, 1474-1479 (1983).
Inne przykłady związków chemiluminescencyjnych odpowiednich do zastosowania w niniejszym wynalazku to luminol, lucigenin i lophine.
Poniżej wynalazek opisany zostanie szczegółowo w odniesieniu do rysunku, na którym fig. 1a-b przedstawia diagramy dwóch przykładów wykonania (Sposoby A i B według stanu techniki) testów według stanu techniki przedstawione w publikacji WO 94/11734, fig. 2a-c przedstawia diagramy trzech korzystnych testów odpowiednich do zastosowania w sposobach określonych w zastrzeżeniach 1-3 (podsposoby), fig. 3a-c przedstawia diagramy trzech korzystnych testów, fig. 4-6 pokazuje poziom chemiluminescencji jako funkcję stężenia swoistych IgE, odpowiednio, dla Sposobu B według stanu techniki, Sposobu 1 według wynalazku i Podsposobu 1 według wynalazku, fig. 7 pokazuje względny poziom luminescencji jako funkcję zawartości interferujących przeciwciał, odpowiednio, dla Sposobu B według stanu techniki, Sposobu 1 według wynalazku i Podsposobu 1 według wynalazku, fig. 8-12 przedstawiają poziom chemiluminescencji obliczony w stosunku do poziomu spodziewanego jako funkcję czynnika rozcieńczenia dla Sposobu B według stanu techniki i Sposobu 1 według niniejszego wynalazku dla czterech próbek od pacjentów poddanych swoistemu szczepieniu przeciw alergii i dla próbki odniesienia (kontrolnej) (fig. 12), fig. 13-14 przedstawiają odpowiedź względną pacjentów poddanych swoistemu szczepieniu przeciw alergii i po podaniu placebo po 0, 6 i 12 miesiącach mierzoną, odpowiednio, Sposobem B według stanu techniki i Sposobem 1, fig. 15 przedstawia proporcje odpowiedzi uzyskanych Sposobem B według stanu techniki w stosunku do odpowiedzi uzyskanych Sposobem 1, fig. 16-18 przedstawiają względny poziom IgE w czasie po 0, 6, 12 i 24 miesiącach dla trzech grup klinicznych oznaczonych odpowiednio „Efekt”, „Brak efektu” i „Niepewny Efekt”, fig. 19 przedstawia proporcje odpowiedzi uzyskanych Sposobem 1 w stosunku do odpowiedzi uzyskanych Sposobem B według stanu techniki, jako funkcję czasu dla różnych dawek leczniczych szczepionki SAV, fig. 20 przedstawia proporcje średnich odpowiedzi uzyskanych Sposobem 1 w stosunku do odpowiedzi uzyskanych Sposobem B według stanu techniki, jako funkcję czasu odpowiednio dla pacjentów, u których uzyskano efekt kliniczny i pacjentów, u których nie otrzymano efektu klinicznego, fig. 21 przedstawia proporcje odpowiedzi uzyskanych Sposobem 1 w stosunku do odpowiedzi uzyskanych Sposobem B według stanu techniki, jako funkcje czasu dla poszczególnych pacjentów, u których uzyskano efekt kliniczny, a fig. 22 przedstawia proporcje odpowiedzi uzyskanych Sposobem 1 w stosunku do odpowiedzi uzyskanych Sposobem B według stanu techniki, jako funkcje czasu dla poszczególnych pacjentów, u których nie uzyskano efektu.
Figura 1a przedstawia zasadę według jednego przykładu wykonania testu ujawnionego w publikacji WO 94/11734. W teście tym przeciwciało, które ma być wykryte (swoiste IgE) w próbce (i) zostaje zmieszane z przeciwciałem reagującym związanym z cząstką paramagnetyczną (ii) tworząc
PL 198 236 B1 kompleks dwuskładnikowy, który ulega inkubacji, następnie dodawany jest biotynylowany alergen (iii), dla utworzenia kompleksu trzyskładnikowego, który jest inkubowany, i wówczas dodany zostaje chemiluminescencyjny związek akrydynowy związany z awidyną/streptawidyną (iv), dla utworzenia kompleksu czteroskładnikowego, który zostaje przepłukany, po czym następuje pomiar chemiluminescencji wypłukanego kompleksu.
Figura 1b pokazuje inny przykład wykonania testu według stanu techniki, gdzie składniki (i) i (iii) zostają zmieszane dla utworzenia kompleksu dwuskładnikowego, następnie dodawane są składniki (ii) i (iv), a otrzymana mieszanina jest inkubowana, dla utworzenia kompleksu czteroskładnikowego, który jest płukany i poddany pomiarowi chemiluminescencji.
W testach przedstawionych na fig. 1a i 1b wszystkie składniki próbki, włączając w to wszystkie krzyżowo reagujące przeciwciała IgE i przeciwciała nie będące IgE swoiste w stosunku do alergenu, obecne są w kolejnych reakcjach, co prowadzi do utworzenia kompleksu czteroskładnikowego.
Figura 2a pokazuje sposób, gdzie składniki (i) i (ii) ulegają zmieszaniu i inkubacji, dla utworzenia kompleksu dwuskładnikowego, który następnie jest płukany. Następnie dodawany jest składnik (iii), dla utworzenia kompleksu trzyskładnikowego, po czym dodawany jest składnik (iv), dla utworzenia kompleksu czteroskładnikowego, który jest płukany i poddany pomiarowi chemiluminescencji.
Figura 2b pokazuje sposób, który odpowiada temu przedstawionemu na fig. 2a z wyjątkiem tego, że składniki (iii) i (iv) dodawane są w trakcie jednej operacji.
Figura 2c pokazuje sposób, który odpowiada temu przedstawionemu na fig. 2a z wyjątkiem tego, że otrzymany kompleks trzyskładnikowy poddawany jest etapowi płukania przed dodaniem składnika (iv).
W testach przedstawionych w fig. 2a, 2b i 2c składniki próbki, włączając w to wszystkie krzyżowo reagujące przeciwciała IgE i przeciwciała nie będące IgE, swoiste w stosunku do alergenu, usuwane są po reakcji ze składnikiem (ii), i stąd są nieobecne w dalszych etapach reakcji prowadzących do utworzenia kompleksu czteroskładnikowego.
Figura 3a przedstawia korzystny przykład wykonania podtestów (h'), (h) oraz (h) wg zastrz. 1-3, w których składniki (i), (ii) i (iii) zostają zmieszane w pierwszej operacji, dla utworzenia kompleksu dwuskładnikowego, do którego następnie w trakcie drugiej operacji dodawany jest drugi składnik (ii), a otrzymana mieszanina zostaje inkubowana, dla utworzenia kompleksu trzy składnikowego, który jest płukany przed dodaniem składnika (iv), dla utworzenia kompleksu czteroskładnikowego, który jest w dalszej kolejności płukany i poddany pomiarowi chemiluminescencji.
Figura 3b przedstawia inny korzystny przykład wykonania podtestów (h'), (h) i (h) wg zastrz. 1-3, w których składniki (i), (ii) i (iii) dodane są w pierwszej operacji, dla utworzenia kompleksu trzyskładnikowego, który jest następnie płukany przed dodaniem składnika (iv), dla utworzenia kompleksu czteroskładnikowego, który jest w dalszej kolejności płukany i poddany pomiarowi chemiluminescencji.
Figura 3c przedstawia dalszy korzystny przykład wykonania podtestów (h'), (h) i (h) wg zastrz. 1-3, w których składniki (i) i (ii) zostają zmieszane, dla utworzenia kompleksu dwuskładnikowego, do którego następnie dodawany jest składnik (iii), dla utworzenia kompleksu trzyskładnikowego, który ulega płukaniu przed dodaniem składnika (iv), dla utworzenia kompleksu czteroskładnikowego, który jest także płukany przed poddaniem go pomiarowi chemiluminescencji.
W testach przedstawionych w fig. 3a, 3b i 3c składniki próbki, włączając w to wszystkie krzyżowo reagujące przeciwciała IgE i przeciwciała nie będące IgE swoiste w stosunku do alergenu, usuwane są po reakcji ze składnikami (ii) i (iii), i dlatego są nieobecne w dalszych etapach reakcji prowadzących do utworzenia kompleksu czteroskładnikowego.
Niniejszy wynalazek zostanie szczegółowo opisany poniżej w odniesieniu do przykładów.
Przygotowanie reagentów
Biotynylowany ekstrakt z Dermatophagoides pteronyssinus
Ekstrakt z Dermatophagoides pteronyssinus, (ALK-ABELLÓ A/S, H0rsholm, Dania) biotynylowany jest w proporcji molarnej 30:1. Ester amidoheksanianu N-hydroksysukcynoimidu biotyny (Biotin-XX-NHS, Clontech, USA) rozpuszczany jest w dimetylformamidzie (Merck) do końcowego stężenia 25 mg/ml. 55,4 pl tak otrzymanego roztworu Biotin-HH-NHS dodane jest do 1 ml roztworu ekstraktu Dermatophagoides pteronyssinus w 0,1 M NaHCO3, przy pH 8,5, o stężeniu 2,44 mg/ml. Reagenty ulegają inkubacji przez 15 minut w 25°C w mieszadle typu „end over end”. Biotynylowany ekstrakt zostaje następnie oczyszczony z niezwiązanej biotyny poprzez chromatografię rozdzielającą według wielkości cząstek na kolumnie PD10 (Pharmacia). Frakcja zawierająca alergeny zostaje zebrana. Biotynylowany ekstrakt Dermatophagoides pteronyssinus rozcieńczany jest w soli z fosforanowym
PL 198 236 B1 roztworem buforowym, o pH 7,2 (PBS), zawierającym 0,1% albuminy ludzkiego osocza (Sigma) i 0,09% NaNs (Merck).
Biotynylowany ekstrakt z Alternaria alternata
Ekstrakt z Alternaria alternata (ALK-ABELLÓ A/S, Horsholm, Dania) biotynylowany jest w proporcji molarnej 30:1. Ester amidoheksanianu N-hydroksysukcynoimidu biotyny (Biotin-XX-NHS, Clontech, USA) rozpuszczany jest w dimetylformamidzie (Merck) do końcowego stężenia 25 mg/ml. 38,6 ąl tak otrzymanego roztworu Biotin-HH-NHS dodane jest do 1 ml roztworu ekstraktu Alternaria alternata w 0,1 M NaHCOs, przy pH 8,5, o stężeniu 1,7 mg/ml. Reagenty ulegają inkubacji przez 15 minut w 25°C w mieszadle typu „end over end”. Biotynylowany ekstrakt Alternaria alternata zostaje następnie oczyszczony z niezwiązanej biotyny poprzez chromatografię rozdzielającą według wielkości cząstek na kolumnie PD10 (Pharmacia). Frakcja zawierająca alergeny zostaje zebrana. Biotynylowany ekstrakt rozcieńczany jest w soli z fosforanowym roztworem buforowym, o pH 7,2 (PBS), zawierającym 0,1% albuminy ludzkiego osocza (Sigma) i 0,09% NaN3 (Merck).
Biotynylowany ekstrakt z Betula verrucosa (brzoza brodawkowata)
Ekstrakt z pyłku Betula verrucosa (ALK-ABELLÓ A/S, H0rsholm, Dania) biotynylowany jest w proporcji molarnej 10:1. Ester amidoheksanianu N-hydroksysukcynoimidu biotyny (Biotin-XX-NHS, Clontech, USA) rozpuszczany jest w dimetylformamidzie (Merck) do końcowego stężenia 25 mg/ml. 33,5 ąl tak otrzymanego roztworu Biotin-HH-NHS dodane jest do 1 ml roztworu ekstraktu w Betula verrucosa 0,1 M NaHCO3, przy pH 8,5, o stężeniu 4,4 mg/ml. Reagenty ulegają inkubacji przez 15 minut w 25°C w mieszadle typu „end over end”. Biotynylowany ekstrakt Betula verrucosa zostaje następnie oczyszczony z niezwiązanej biotyny poprzez chromatografię rozdzielająca według wielkości cząstek na kolumnie PD10 (Pharmacia). Frakcja zawierająca alergeny zostaje zebrana. Biotynylowany ekstrakt Betula verrucosa rozcieńczany jest w soli z fosforanowym roztworem buforowym, o pH 7,2 (PBS), zawierającym 0,1% albuminy ludzkiego osocza (Sigma) i 0,09% NaN3 (Merck).
Przygotowanie znakowanego estru streptawidyny i akrydyny
Streptawidyna (Boehringer Mannheim) była koniugowana z NSP-DMAE-NHS (2',6'-dimethyl-4'-(N-succinimidyloxycarbonyl)phenyl-10-(3-sulfopropyl)-acridinum-9-carboxylate) przy zastosowaniu zmodyfikowanego sposobu opracowanego przez: Weeks i wsp. (poz. literaturowa 1).
Przygotowanie znakowanego estru streptawidyny i akrydyny (reagent świecący)
NSP-DMAE-NHS (Chiron Diagnostic, USA) rozpuszczany jest w dimetylformamidzie (Merck) do końcowego stężenia 1 mg/ml. 0,5 ml tego roztworu dodawane jest do 1,7 ml roztworu streptawidyny o stężeniu 5,88 mg/ml w 0,1 M buforze fosforanowym, 0,15 M NaCl, o pH 8,5. Reagenty inkubowane są przez 30 minut w 25°C przez mieszanie. Po inkubacji dodawane jest 0,4 ml roztworu kwasu 6-amino-n-heksanowego (Sigma) o stężeniu 20 mg/ml. W celu usunięcia niezwiązanego DMAE roztwór wprowadzany jest na kolumnę PD10 (Pharmacia, Uppsala, Szwecja). Skonjugowana streptawidyna jest eluowana za pomocą fosforanowej soli buforowej, o pH 7,2 (PBS) i zbierana jest frakcja zawierająca skonjugowaną streptawidynę. Skonjugowana streptawidyna rozcieńczana jest do końcowego stężenia za pomocą fosforanowej soli buforowej, o pH 7,2 (PBS), która zawiera 0,1% HSA (Sigma), 1% Tween 20 (Merck) i 0,09% NaN3.
Immobilizacja przeciwciała względem cząstek paramagnetycznych
6,5 g cząstek paramagnetycznych (Chiron Diagnostick, MA, USA) płukane jest 3 razy w 650 ml 0,01 M octanowego roztworu buforowego o pH 5,5 przy użyciu oddzielania magnetycznego. Cząstki są aktywowane w 6,25% glutaraldehydzie (Merck), 0,01 M buforze octanowym, o pH 5,5 przez 3 godziny w 25°C. Cząstki są płukane 6 razy w 650 ml octanowego roztworu buforowego o pH 5,5. Następnie cząstki łączone są z 1625 mg przeciwciała monoklonalnego anty-IgE (Biolnvent International AB, Szwecja), które jest swoiste w stosunku do domeny Fc IgE, co zachodzi przez 16 godzin w 25°C. Dalej cząstki płukane są dwukrotnie w 650 ml 0,01 M fosforanowego roztworu buforu o pH 7,4. Blokowanie nadmiaru grup aktywnych przeprowadzane jest przy pomocy 1083 mg HSA (Sigma) rozpuszczonych w 0,01 M fosforanowym roztworze buforowym, o pH 7,4 przez 20 godzin w 25°C. Cząstki płukane są w 650 ml 0,01 M fosforanowego roztworu buforowego, o pH 7,4, po czym następują 3 płukania w 650 ml 1 M NaCl (Merck). Cząstki płukane są 3 razy w 0,01 M fosforanowego roztworu buforowego o pH 7,4 i następnie w 650 ml PBS o pH 7,4, 0,1% HSA (Sigma). Cząstki są ponownie zawieszane w 325 ml i podgrzewane przez 16 godzin w 50°C. Cząstki płukane są dalej 4 razy w 650 ml 0,01 M fosforanowego roztworu buforowego o pH 7,4, z 0,1% HSA. Cząstki podgrzewane są w 37°C przez 7 dni w 650 ml 0,01 M fosforanowego roztworu buforowego o pH 7,4, z 0,1% HSA, z wymianą roztworu buforowego 3-go i 5-go dnia. Cząstki zostają rozcieńczone do końcowego
PL 198 236 B1 stężenia za pomocą fosforanowej soli buforowej, o pH 7,2 (PBS), zawierającej 0,1% HSA (Sigma) i 0,09% NaNs.
Bufor do płukania stosowany w testach
Bufor do płukania stosowany w testach składa się z 200 mM roztworu buforowego fosforanu potasu, o pH 7,4, 100 mM chlorku potasu, 0,18% Tween 20 i 0,09% NaN8. Wszystkie związki pochodzą z firmy Merck.
P r z y k ł a d 1
Wyznaczenie swoistego przeciwciała IgE skierowanego przeciw alergenowi Betula verrucosa (brzoza brodawkowata) przeprowadzano za pomocą trzech różnych sposobów stosując reagenty opisane powyżej w roboczych stężeniach zdefiniowanych w każdym sposobie. Tymi sposobami były Sposób B według stanu techniki (fig. 1b), Sposób 1 według niniejszego wynalazku (fig. 2a) i Podsposób 1 według niniejszego wynalazku (fig. 3a).
Sposób B według stanu techniki
Sposób ten jest przeprowadzany przy użyciu Analizatora Benchtop do testów immunologicznych Ciba Corning ACS:180 opisanego w poz. literaturowej 2. Analizator wyposażony jest w specjalnie zamówiony program do ustawiania 40 sek. cykli dla czasów inkubacji dwa razy dłuższych niż normalnie. 50 μΙ próbki i 50 μΙ biotynylowanego alergenu Betula verrucosa rozcieńczonego w stosunku 1:1500 dozowane są sondą próbkującą do kuwety. Gdy kuweta po 12 minutach inkubacji osiągnie poziom reagenta R2, to 100 μl cząstek paramagnetycznych, rozcieńczonych w stosunku 1:20 i 200 μl świecącego reagenta rozcieńczonego w stosunku 1:10000 ulegają równoczesnemu dozowaniu i kuweta przesuwa się w dół po ścieżce. Magnesy i stacja płukania osiągane są po dodatkowych 12 min. i 40 sek. inkubacji. Następnie zachodzi dwukrotne płukanie w 750 μl dejonizowanej wody. Po zakończeniu cyklu płukania cząstki paramagnetyczne są ponownie zawieszane w 300 μl 0,5 g/l H2O2 w 0,1 M HNO3. Kuweta osiąga komorę luminometryczną i od strony przedniej fotopowielacza dodane zostaje 300 μl 25 mM roztworu NaOH, po czym następuje pomiar fotonów emitowanego światła, który jest wyrażony w jednostkach względnych światła (RLU). Ilość RLU jest proporcjonalna do ilości IgE w próbce. Czas upływający od dozowania próbki do pierwszego wyniku wynosi 30 min., a następne wyniki otrzymywane są co 40 sek. Wyniki wyrażano ilorazem jednostki RLU doświadczalne/jednostki RLU tła, gdzie RLU tła stanowiła reakcja chemiluminescencji przy nieobecności IgE.
Sposób 1
Sposób ten jest przeprowadzany przy użyciu zmodyfikowanej wersji Analizatora Benchtop do testów immunologicznych Ciba Corning ACS:180 opisanego w poz. literaturowej 2. 25 μl próbki dozowane jest sondą próbkującą do kuwety i niezwłocznie po tym 100 μl cząstek paramagnetycznych rozcieńczonych w proporcji 1:20 dozowanych jest za pomocą sondy stałej. Po 8 min. inkubacji cząstki paramagnetyczne oddzielane są magnetycznie i płukane raz w 1 ml roztworu buforowego do płukania. Cząstki paramagnetyczne są ponownie zawieszane w 100 μl roztworu buforowego do płukania, a do kuwety dodawane jest 50 μl biotynylowanego alergenu Betula verrucosa rozcieńczonego w stosunku 1:1500. Po 10 min. inkubacji, 100 μl świecącego reagenta rozcieńczonego w stosunku 1:5000 ulega dozowaniu stałą sondą i po dodatkowych 8 min. inkubacji cząstki paramagnetyczne oddzielane są magnetycznie i płukane 3 razy w 1 ml roztworu buforowego do płukania. Po zakończeniu cyklu płukania cząstki paramagnetyczne są ponownie zawieszane w 300 μl 0,5 g/l H2O2 w 0,1 M HNO3. Kuweta przesuwa się do komory luminometrycznej i od strony przedniej fotopowielacza dodane zostaje 300 μl 25 mM roztworu NaOH, po czym następuje pomiar fotonów emitowanego światła, który jest wyrażony w jednostkach względnych światła (RLU). Ilość RLU jest proporcjonalna do ilości IgE w próbce. Wyniki wyrażono ilorazem jednostki RLU doświadczalne / jednostki RLU tła, gdzie RLU tła stanowiła reakcja chemiluminescencji przy nieobecności IgE.
Podsposób 1
Sposób ten jest realizowany ręcznie w testowych 5 ml probówkach polistyrenowych (Sarstedt). 25 μl próbki jest mieszane z 50 μl biotynylowanego alergenu Betula verrucosa rozcieńczonego w stosunku 1:50. Po 12 min. inkubacji w 37°C dodawane jest 100 μl cząstek paramagnetycznych rozcieńczonych w stosunku 1:20, a mieszanina inkubowana jest przez 5 min. i 30 sek. w 37°C, zanim cząstki paramagnetyczne zostaną magnetycznie oddzielone i wypłukane 1 raz w 3 ml roztworu buforowego do płukania przy użyciu aparatu płuczącego Magic Lite Multitube Washer (ALK-ABELLÓ A/S, H0rsholm, Dania). Cząstki paramagnetyczne są ponownie zawieszane w 200 μl świecącego reagenta rozcieńczonego w stosunku 1:10000 i inkubowane przez 7 min. i 30 sek. w 37°C, zanim cząstki paramagnetyczne zostają magnetycznie oddzielone i wypłukane 2 razy w 3 ml roztworu buforowego do
PL 198 236 B1 płukania przy użyciu aparatu płuczącego Magic Lite Multitube Washer (ALK-ABELLÓ A/S, Horsholm, Dania). Cząstki paramagnetyczne są ponownie zawieszane w 100 ąl dejonizowanej wody i następuje pomiar reakcji chemiluminescencyjnej w urządzeniu Magic Lite Analyzer (ALK-ABELLÓ A/S, H0rsholm, Dania) poprzez dodanie najpierw 300 μΙ 0,5 g/l H2O2 w 0,1 M HNO3 i następnie 300 μΙ 25 mM roztworu NaOH. Pomiar fotonów emitowanego światła wyrażony jest we jednostkach względnych światła (RLU). Ilość RLU jest proporcjonalna do ilości IgE w próbce. Wyniki wyrażono ilorazem jednostki RLU doświadczalne/jednostki RLU tła, gdzie RLU tła stanowiła reakcja chemiluminescencji przy nieobecności IgE.
Zbiorcze osocze 5 pacjentów uczulonych na pyłek brzozy było sukcesywnie rozcieńczane przez czynnik rozcieńczenia wynoszący 2, od 140 SU/ml do 1,1 SU/ml i otrzymano 8 próbek. Te 8 próbek testowano razem z próbką negatywną (tło) jak i z 8 próbkami z osocza poszczególnych pacjentów uczulonych na pyłek brzozy, każdym z 3 sposobów opisanych powyżej, patrz odpowiednio fig. 4, 5 i 6. Stwierdzono, że wszystkie testowane próbki można było uznać za pozytywne stosując wszystkie trzy sposoby.
P r z y k ł a d 2
Interferencja ze swoistymi przeciwciałami należącymi do innych klas (IgG)
Oznaczenie swoistych IgE skierowanych przeciwko alergenowi Betula verrucosa przeprowadzono trzema różnymi sposobami, jak to opisano w Przykładzie 1 w obecności różnych ilości współzawodniczących swoistych przeciwciał. Dokładniej, zbiorcze osocze od 5 pacjentów uczulonych na pyłek brzozy zmieszano w proporcji 1:5 z osoczem nie zawierającym IgE, zawierającym różne miana króliczego przeciwciała poliklonalnego skierowanego przeciw alergenowi Betula verrucosa (ALK-ABELLÓ A/S, H0rsholm, Dania). Sprawdzenie nie wykazywało przeciwciała króliczego.
Rezultaty przedstawione na fig. 7 wyrażone są jako % odzysku, obliczony jako odpowiedź uzyskana z przeciwciałem króliczym w próbce w stosunku do kontroli. Odpowiedzi podano jako sygnał/tło. Odzyski mniejsze niż 100% wskazują, że dodanie współzawodniczącego przeciwciała redukuje odpowiedź, podczas gdy odzyski większe niż 100% wskazują, że dodanie przeciwciała współzawodniczącego zwiększa odpowiedź.
W tej sytuacji można stwierdzić, że Sposób 1 w mniejszym stopniu interferuje ze współzawodniczącymi przeciwciałami z innych klas niż pozostałe metody. Podczas gdy dodanie współzawodniczących przeciwciał powoduje istotną pozytywną interferencję w Podsposobie 1, szczególnie z wysokimi ilościami interferujących przeciwciał, to interferencja wydaje się zupełnie wyeliminowana w Sposobie 1.
P r z y k ł a d 3
Krzywe rozcieńczenia próbek od pacjentów przechodzących swoiste szczepienie przeciw alergii (SAV)
Wyznaczenie swoistych IgE przeciw Alternaria alternata (pleśń) przeprowadzono Sposobem B według stanu techniki i Sposobem 1, jak to opisano w Przykładzie 1 z wyjątkiem tego, że biotynylowany alergen Alternaria alternata użyty został zamiast biotynylowanego alergenu Betula verrucosa. Robocze rozcieńczenie biotynylowanego alergenu Alternaria alternata wynosiło 1:400 w obu sposobach, sposobie według stanu techniki i w Sposobie 1.
Osocza od czterech pacjentów poddanych swoistemu szczepieniu przeciw alergii (SAV) były sukcesywnie rozcieńczane stosując czynnik rozcieńczania 2, aż otrzymano cztery próbki przeznaczone do analizy w każdym z dwóch różnych sposobów. Jako próbkę odniesienia użyto zbiorcze osocze 5 pacjentów uczulonych na alergen Alternaria alternata.
Figury 8-12 przedstawiają wyniki dla próbek od 4 pacjentów poddanych SAV i dla próbki odniesienia. Wyniki przedstawione na fig. 8-12 są odpowiedziami uzyskanymi z różnych rozcieńczonych osoczy w stosunku do spodziewanych odpowiedzi. Procent (%) odzysku liczony jest jako wartość: (czynnik rozcieńczenia) x (obserwowana odpowiedź) / odpowiedź nierozcieńczonej próbki. Odpowiedzi podawano jako sygnał/tło. Odzyski mniejsze niż 100% wskazują, że odpowiedzi rozcieńczonego osocza są mniejsze niż się spodziewano, podczas gdy odzyski większe niż 100% wskazują, że odpowiedzi są większe niż się spodziewano. Tak więc odzyski większe niż 100% wskazują, że odpowiedzi uzyskane z nierozcieńczonych próbek są niedoszacowywane w stosunku do wartości rzeczywistej.
Na podstawie fig. 8-12 wydaje się, że dla próbek SAV sposób według stanu techniki niedoszacowuje prawdziwej wartości nierozcieńczonych próbek SAV, podczas gdy Sposób 1 pozwala na uzyskanie bardziej prawidłowych wyników.
PL 198 236 B1
W przypadku osoczy pacjentów nie poddanych szczepieniu SAV oba sposoby zapewniają bardziej zadowalające wyniki.
Można stwierdzić, że Sposób 1, zawierający 2 etapy płukania, jest w stanie o wiele bardziej prawdziwie oszacować ilość IgE swoistych w stosunku do alergenu w próbce osocza od pacjentów poddanych szczepieniu SAV, aniżeli Sposób B według stanu techniki.
P r z y k ł a d 4
Monitorowanie odpowiedzi immunologicznej podczas szczepienia SAV przeciw alergenowi roztoczy kurzu domowego
Wyznaczenie swoistych IgE przeciw Dermatophagoides pteronyssinus (roztocze kurzu domowego) przeprowadzono Sposobem B według stanu techniki i Sposobem 1, jak to opisano w Przykładzie 1 z wyjątkiem tego, że zamiast biotynylowanego alergenu Betula verrucosa użyto biotynylowany alergen Dermatophagoides pteronyssinus. Robocze rozcieńczenie biotynylowanego alergenu Dermatophagoides pteronyssinus wynosiło 1:250 w obu sposobach, to jest w Sposobie według stanu techniki i w Sposobie 1.
Próbki osocza uzyskano od pacjentów włączonych w badania kliniczne. W sumie 30 pacjentów otrzymało albo placebo (N=14) albo szczepionkę SAV z mieszaniną 1:1 alergenów Dermatophagoides pteronyssinus i Dermatophagoides farinae (Alutard, ALK-ABELLÓ A/S, H0rsholm, Dania) (N-16). Próbki pobierano przed leczeniem (t=0), po 6 miesiącach leczenia (t=6) i po 12 miesiącach leczenia (t=12), i wszystkie próbki analizowano z wykorzystaniem dwóch różnych sposobów. Uzyskane wyniki wyrażano jako wartość: Względna odpowiedź = (Sygnał -Tło) / (Sygnałwysoki -Tło), gdzie Sygnałwysoki to sygnał osocza zbiorczego mającego wysoką zawartość swoistych przeciwciał, które będą wykrywane. Wyniki są przedstawione na fig. 13-14. Dodatkowy zestaw wyników otrzymano przez obliczenie proporcji między wynikami uzyskanymi Sposobem B według stanu techniki i Sposobem 1. Wyniki te przedstawiono na fig. 15.
Wnioski
Żaden ze sposobów (Sposób B według stanu techniki czy Sposób 1) użyte do określenia swoistych przeciwciał IgE osocza nie jest w stanie zróżnicować pacjentów otrzymujących placebo od pacjentów leczonych szczepionką SAV (fig. 13-14). Jednak, proporcja wyników uzyskanych sposobem według stanu techniki i sposobem według niniejszego wynalazku (Proporcja = IgE (Sposób B według stanu techniki) / IgE (Sposób 1)t) pozwala rozróżnić leczenie szczepionką i placebo po 6 i 12 miesiącach po rozpoczęciu podawania SAV (fig. 15). Co więcej, wydaje się, że na podstawie odpowiedniej wartości proporcji w stosunku do arbitralnie wyznaczonej wartości różnicującej, można przewidzieć czy pacjent należy do grupy otrzymującej placebo czy szczepionkę (fig. 17, t=12), to znaczy uzyskuje się parametr skuteczności SAV.
Statystyka
Analizę statystyczną przeprowadzono stosując testy nieparametryczne (test U Mann'a-Whitney'a). Wszystkie dwustronne prawdopodobieństwa zmiennej losowej mniejsze niż 0,05 były istotne statystycznie. NS oznacza wartość nieistotną statystycznie, w innym przypadku prawdopodobieństwa podane zostały na rysunku.
P r z y k ł a d 5
Monitorowanie odpowiedzi immunologicznej podczas leczenia szczepionką SAV przeciw roztoczom kurzu domowego
Oznaczenie swoistych przeciwciał IgE skierowanych przeciwko alergenowi Dermatophagoides pteronyssinus (roztocze kurzu domowego) przeprowadzono dwoma różnymi sposobami stosując reagenty opisane wyżej w rozcieńczeniach roboczych zdefiniowanych w każdym sposobie. Tymi sposobami były Sposób A według stanu techniki (fig. 1a) i Sposób 1 według niniejszego wynalazku (fig. 2a, zastrzeżenie 2).
Sposób A według stanu techniki
Sposób ten przeprowadzono przy użyciu analizatora do testów immunologicznych Benchtop Ciba Corning ACS:180 opisanego w poz. literaturowej 3. 25 ul próbki dozowane jest sondą próbkującą do kuwety i niezwłocznie po tym 100 ąl cząstek paramagnetycznych rozcieńczonych w stosunku 1:20 dozowane jest przez sondę stałą. Po 8 min. inkubacji cząstki paramagnetyczne oddzielane są magnetycznie, lecz nie są płukane. Cząstki paramagnetyczne są ponownie zawieszane w 100 ąl roztworu buforowego do płukania i do kuwety dodawane jest 50 ąl biotynylowanego alergenu Dermatophagoides pteronyssinus rozcieńczonego w stosunku 1:250. Po 10 min. inkubacji, 100 ąl świecącego reagenta rozcieńczonego w stosunku 1:5000 dozowane jest stałą sondą, a po dodatkowych 8 min.
PL 198 236 B1 inkubacji cząstki paramagnetyczne oddzielane są magnetycznie i płukane 3 razy w 1 ml buforu do płukania. Po zakończeniu cyklu płukania cząstki paramagnetyczne są ponownie zawieszane w 300 μΙ roztworu H2O2 o stężeniu 0,5 g/l w 0,1 M HNO3. Kuweta przesuwa się do komory luminometrycznej i od strony przedniej fotopowielacza dodane zostaje 300 μl 25 mM roztworu NaOH i następuje pomiar fotonów emitowanego światła, który wyrażony jest w jednostkach względnych światła (RLU). Ilość RLU jest proporcjonalna do ilości IgE w próbce. Wyniki wyrażano ilorazem jednostki RLU doświadczalne / jednostki RLU tła, gdzie RLU tła stanowiła reakcja chemiluminescencji przy nieobecności IgE.
Sposób 1
Sposób ten przeprowadzono przy użyciu analizatora do testów immunologicznych Benchtop Ciba Corning ACS:180 opisanego w poz. literaturowej 2. 25 μl próbki dozowane jest sondą próbkującą do kuwety i niezwłocznie po tym 100 μl cząstek paramagnetycznych rozcieńczonych w stosunku 1:20 dozowane jest przez sondę stałą. Po 8 min. inkubacji cząstki paramagnetyczne oddzielane są magnetycznie i płukane 1 raz w 1 ml roztworu buforowego do płukania. Cząstki paramagnetyczne są ponownie zawieszane w 100 μl roztworu buforowego do płukania i do kuwety dodawane jest 50 μl biotynylowanego alergenu Dermatophagoides pteronyssinus rozcieńczonego w stosunku 1:250. Po 10 min. inkubacji, 100 μl świecącego reagenta rozcieńczonego w stosunku 1:5000 dozowane jest stałą sondą i po dodatkowych 8 min. inkubacji cząstki paramagnetyczne oddzielane są magnetycznie i płukane 3 razy w 1 ml roztworu buforowego do płukania. Po zakończeniu cyklu płukania cząstki paramagnetyczne są ponownie zawieszane w 300 μl roztworu H2O2 o stężeniu 0,5 g/l w 0,1 M HNO3. Kuweta przesuwa się do komory luminometrycznej i od strony przedniej fotopowielacza dodane zostaje 300 μl 25 mM roztworu NaOH i następuje pomiar fotonów emitowanego światła, który jest wyrażony w jednostkach względnych światła (RLU). Ilość RLU jest proporcjonalna do ilości IgE w próbce. Wyniki wyrażano ilorazem jednostki RLU doświadczalne / jednostki RLU tła, gdzie RLU tła stanowiła reakcja chemiluminescencji w nieobecności IgE.
Niniejsza praca eksperymentalna zawiera dane 28 pacjentów. 13 pacjentów nie było leczonych, 7 pacjentów leczono szczepionką SAV o poziomie dawkowania 100, a 8 pacjentów leczono szczepionką na poziomie dawkowania 300. Leczenie szczepionka SAV polegało na podawaniu pacjentom dawek alergenu Dermatophagoides pteronyssinus (roztocze kurzu domowego) poprzez iniekcje podskórne wstępnie podczas okresu 21 miesięcy podwyższonego dawkowania z cotygodniowymi iniekcjami, i dalej podczas 2-letniego okresu z dawkowaniem 100 do 300 jednostek SQ, podawanych co 6-8 tygodni.
Badania operują parametrami opisującymi efekty, opartymi na punktowym teście skórnym (SPT) i oskrzelowym teście prowokacyjnym (BPT). Parametry opisujące efekty kliniczne, wykorzystane w niniejszej pracy uzyskano jak następuje: względny indeks skórny (SI(czas=x) - SI(czas=0)) używano do dzielenia pacjentów na dwie grupy (efekt=spadek wrażliwości skóry i brak efektu=niezmieniona wrażliwość skóry). Podobnie względny test prowokacyjny (logBPT(Czas=x) - logBPT(czas=0)) stosowano do podzielenia pacjentów na dwie grupy (efekt=spadek wrażliwości oskrzeli i brak efektu = niezmieniona wrażliwość oskrzeli). Dwa pomiary łączono w jeden parametr opisujący kliniczną efektywność: efekt kliniczny=efekt w dwóch pomiarach, brak efektu klinicznego =brak efektu w dwóch pomiarach i niepewny efekt kliniczny=efekt jednego pomiaru i brak efektu w drugim pomiarze.
Figury 16-18 przedstawiają względny poziom IgE w czasie 0 (LT_S0_0), 6 (LT_S6_0), 12 (LT_S12_0) i 24 (LT_S24_0) miesięcy dla trzech klinicznych grup: Efekt, Brak Efektu i Efekt Niepewny. Czas=0 to okres przed rozpoczęciem leczenia. Wskazania krzywej mają postać nn_iii oznaczające numery identyfikacyjne pacjentów (nn) i sposób leczenia (iii), gdzie iii=0 oznacza brak leczenia, a iii=100 lub 300 oznacza leczenie odpowiednio przy poziomie dawkowania 100 i 300. Linia o wartości 0,14 jest arbitralnie wyznaczona wartością różnicująca.
Względny poziom IgE zdefiniowany jest jak następuje:
log (Odpowiedź (Sposób 1)/Odpowiedź (Sposób A według stanu techniki))t=x - log (Odpowiedź (Sposób 1)/Odpowiedź (Sposób A według stanu techniki))t=0, gdzie t=czas, x=0, 6, 12 lub 24 miesiące i odpowiedź=Sygnał/Tło.
Jak wynika z fig. 16, odpowiedź określona według Sposobu 1 jest wyższa niż odpowiedź określona Sposobem A według stanu techniki dla wszystkich pacjentów wykazujących efekt kliniczny, co oznacza, że pojawia się odpowiedź współzawodniczących przeciwciał nie będących IgE, reagujących efektywnie z alergenem. Z fig. 17 wynika, że u żadnego z pacjentów z grupy bez efektu klinicznego nie rozwinęła się odpowiedź współzawodniczących przeciwciał. Ostatecznie, z fig. 18 wynika, że tylko
PL 198 236 B1 u jednego z pacjentów z grupy o klinicznie niepewnym efekcie rozwinęła się pozytywna odpowiedź współzawodniczących przeciwciał, co wykryto jedynie punktowym testem skórnym. Test różnicuje pomiędzy leczonymi i nieleczonymi pacjentami jako, że u żadnego z pacjentów z grupy kontrolnej (nn_0) nie podwyższyła się odpowiedź przeciwciał współzawodniczących.
Wnioski
Proporcja mierzonych IgE przy nieobecności i w obecności współzawodniczących substancji w próbce osocza, tzn. mierzona odpowiednio Sposobem 1 i Sposobem A według stanu techniki, wydaje się przewidywać efekt stosowania szczepionki SAV. Co więcej, efekt mierzony in vitro daje się zaobserwować wcześnie w trakcie leczenia. Chociaż możliwe jest, że czynnik współzawodniczący to przeciwciało nie będące IgE, to wydaje się, że każda substancja osocza reagująca swoiście z alergenami zachowywałaby się podobnie.
P r z y k ł a d 6
Biotynylowane Der p:
Der p 1 posiada tylko jedną resztę lizynową i NH2-końcowy aminokwas, który może ulec biotynylowaniu. Jeśli biotynylowaniu poddaje się surowy ekstrakt Der p, stosując „normalne” reagenty znakujące (które przyłączają się do grup NH2) to otrzymany znakowany ekstrakt Der p. wykazuje zwiększoną wrażliwość na Der p 2 i inne alergeny.
Bardziej zbalansowany reagent Der p może być uzyskany jak następuje: surowy ekstrakt Der p biotynylowany jest jak to opisano powyżej, i dodaje się doń biotynylowany Der p 1, znakowany przy użyciu reagentów biotyny, zdolnych do derywatyzacji reszt tyrozynowych i histydynowych. Tak otrzymana mieszanina została zastosowana w poniższych testach.
Biotynylacja Der p 1
Der p 1 (ALK-ABELLÓ A/S, H0rsholm, Dania) był biotynylowany przez p-Diazobenzoil Biocytynę, która została przygotowana ze stabilnego prekursora p-Aminobenzoil Biocytyny (Pierce, USA) zgodnie z firmową instrukcją. Otrzymany roztwór p-Diazobenzoil Biocytyny miał teoretycznie stężenie 1,82 mg/ml (odpowiednik 3,38 mM), zakładając 100% skuteczność konwersji od p-Aminobenzoil Biocytyny do p-Diazobenzoil Biocytyny. Der p 1 był biotynylowany w proporcji molarnej 17:1, zakładając, że masa cząsteczkowa Der p 1 wynosi 25 kDa, przez dodanie 343 ąl roztworu p-Diazobenzoil Biocytyny do 1 ml roztworu Der p 1 o stężeniu 1,74 mg/ml w 0,1 M NaHCO3, o pH 8,5. Dalsze etapy tego procesu są takie, jak zostały opisane wcześniej dla procesu biotynylowania za pomocą estru Biotin-XX-NHS.
Oprzyrządowanie
Próbki analizowano przy użyciu analizatora ADVIA Centaur (Bayer Diagnostics). Ilość IgE swoistych w stosunku do Der p w każdej próbce wyznaczano korzystając z dwóch protokołów: sposób składający się z dwóch etapów (T) obejmujący procedury płukania, usuwające substancje interferujące (na przykład, przeciwciała inne niż IgE), zanim dodano biotynylowane alergeny; i równoczesny protokół (S), w którym substancje interferujące (na przykład, przeciwciała inne niż IgE) były obecne, gdy dodawano biotynylowane alergeny. Sposób T i Sposób S odpowiadają Sposobowi 1 i Sposobowi A według stanu techniki opisanym w Przykładzie 5, z wyjątkiem tego, że alergen był biotynylowany jak to opisano powyżej.
Materiały i sposoby
Biotynylowany alergen otrzymywano przez rozcieńczenie w proporcji 1:250 biotynylowanego Der p 1 i zmieszanie 1 części tego reagenta z 4 częściami normalnego reagenta Der p, przygotowanego i rozcieńczonego, jak to opisano uprzednio.
Próbki osocza od alergicznych pacjentów Der p (N=48) otrzymujących szczepionkę SAV z Der p, uzyskano po 0, 0,5, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 18 i 24 miesiącach od rozpoczęcia szczepienia SAV. Pacjenci zostali podzieleni na cztery grupy lecznicze: kontrole (N=15), dawka_10 (N=12), dawka_100 (N=9) i dawka_300 (N=11) i byli leczeni wskazanymi dawkami Der p Alutard przez 24 miesiące.
Parametry kliniczne SPT (Punktowy Test Skórny), BPT (Oskrzelowy Test Prowokacyjny) i CPT (Spojówkowy Test Prowokacyjny) mierzono przed, podczas i po szczepieniu SAV, a skuteczność pomiarów oceniano na podstawie zgrupowanych analizowanych parametrów. Szczepienie SAV oceniano jako skuteczne, jeśli były pozytywne dwa lub trzy parametry, a nieskuteczne, jeśli tylko jeden parametr był pozytywny lub żaden z parametrów nie był pozytywny.
IgE mierzono w próbkach osocza zgodnie z dwoma protokołami (T i S) a linię podstawową korygowanych in vitro parametrów opisujących skuteczność obliczano zgodnie ze wzorem: LN (Ti/Si) - LN (T0/S0), gdzie i oznacza czas (>0<=24), a 0 to wartość przed rozpoczęciem leczenia.
PL 198 236 B1
Wyniki
Istnieje wyraźna zależność odpowiedzi od dawki między wartościami LN (Ti/Si) - LN (T0/S0) i stosowaną dawką (fig. 19; zależność dawka-odpowiedź dla parametru efektywności) wskazując, że parametr mierzy u pacjentów zmiany immunologiczne zależne od dawki, fig. 20 (parametr średniego efektu) przedstawia średnie wartości, uzyskane dla parametru skuteczności in vitro dla pacjentów z i bez klinicznego efektu, a parametr in vitro pokazany jest dla poszczególnych pacjentów na fig. 21 (Efekt: poszczególni pacjenci) i na fig. 22 (Brak efektu: poszczególni pacjenci). Wszyscy pacjenci z pozytywną reakcją kliniczną wykazali wzrost parametru in vitro powyżej zakresu grupy kontrolnej w czasie od 6 do 24 miesięcy i wszyscy ci pacjenci otrzymywali aktywną szczepionkę Der p SAV. Czterech pacjentów (14%), u których nie otrzymano wyraźnego klinicznego efektu zapewne mieli efekt w postaci parametru efektywności in vitro.
Wnioski
Parametr efektywności in vitro wydaje się być dobrze skorelowany z kliniczną oceną stanu pacjenta, i tenże parametr in vitro służy do przewidywania wyniku szczepienia SAV po 6 miesiącach stosowania SAV, podczas gdy kliniczne efekty normalnie są widoczne po 12 do 24 miesiącach.
Claims (21)
1. Sppsóóokreślaniaddiałaniaswoisteegszzczeieniaprzzeiw alergii, z znmieenntym, żż ooejmuje etapy, zgodnie z którymi:
(h') określa się zawartość przeciwciała w płynnej próbce stosując następujący test:
(a') dostarcza się mieszaninę fazy ciekłej i kompleksu trzyskładnikowego fazy stałej składającą się z (i) przeciwciała w próbce, (ii) reagującego przeciwciała skierowanego przeciw przeciwciału z próbki, gdzie reagujące przeciwciało związane jest z cząstką stałą, i (iii) ligandu w postaci antygenu, przeciwciała lub haptenu, (b') oddziela się kompleks trzy składnikowy fazy stałej od fazy ciekłej, (c') płucze się oddzielony kompleks trzyskładnikowy fazy stałej dla usunięcia związków związanych nienależących do kompleksu, (d') dodaje się do kompleksu trzyskładnikowego fazy stałej roztwór (iv) związku znakowanego dla utworzenia kompleksu czteroskładnikowego, (e') oddziela się kompleks czteroskładnikowy fazy stałej od roztworu, (f) płucze się oddzielony kompleks czteroskładnikowy fazy stałej dla usunięcia związku (iv) związanego nienależącego do kompleksu, (g') przeprowadza się wykrywanie/mierzenie wypłukanego znakowanego kompleksu czteroskładnikowego, (i') określa się zawartość wymienionego przeciwciała stosując następujący test:
(ia') dostarcza się mieszaninę fazy ciekłej i kompleksu czteroskładnikowego fazy stałej składającą się z (i) przeciwciała w próbce, (ii) reagującego przeciwciała skierowanego przeciw przeciwciału z próbki, gdzie reagujące przeciwciało związane jest z cząstką stałą, (iii) ligandu w postaci antygenu, przeciwciała lub haptenu i (iv) związku znakowanego, dla utworzenia kompleksu czteroskładnikowego fazy stałej, (ib') oddziela się kompleks czteroskładnikowy fazy stałej od fazy ciekłej, (ic') płucze się oddzielony kompleks czteroskładnikowy fazy stałej dla usunięcia związków związanych nienależących do kompleksu, (id') przeprowadza się wykrywanie/mierzenie wypłukanego znakowanego kompleksu czteroskładnikowego, (j') porównuje się pomiary uzyskane w etapie (h') i w etapie (i') oraz stosuje się porównanie dla określenia działania swoistego szczepienia przeciw alergii.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie (a') i w etapie (ia') ligand związany jest z biotyną lub jej funkcjonalną pochodną, w etapie (d') i w etapie (ia') związek znakowany jest związkiem chemiluminescencyjnym kowalencyjnie związanym z awidyną, streptawidyną lub ich funkcjonalną pochodną, w etapie (g') i w etapie (id') wykrywanie/mierzenie przeprowadza się przez inicjowanie reakcji chemiluminescencyjnej w wypłukanym kompleksie czteroskładnikowym fazy stałej i wykrywanie/mierzenie powstałej chemiluminescencji, jeśli występuje.
PL 198 236 B1
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że w etapie (a') i w etapie (ia') cząstka stała jest cząstką stałą paramagnetyczną, w etapie (b') i w etapie (ib') oddzielenie kompleksu fazy stałej od fazy ciekłej dokonuje się magnetycznie.
4. Sspoóóo oreślaniad diałaniaswoisteegszzczeieniap rzzeiw alergig z znmieenntym. żż o oejmuje etapy, zgodnie z którymi:
(x') określa się zawartość przeciwciała w płynnej próbce stosując następujący sposób:
(o') dostarcza się mieszaninę fazy ciekłej i kompleksu dwuskładnikowego fazy stałej składającą się z (i) przeciwciała w próbce, i (ii) reagującego przeciwciała skierowanego przeciw przeciwciału z próbki, gdzie reagujące przeciwciało związane jest z cząstką stałą, (p') oddziela się kompleks dwuskładnikowy fazy stałej od fazy ciekłej, (q') płucze się oddzielony kompleks dwuskładnikowy fazy stałej dla usunięcia związków związanych nienależących do kompleksu, (r') dodaje się do wypłukanego kompleksu dwuskładnikowego fazy stałej roztwór (iii) ligandu w postaci antygenu, przeciwciała lub haptenu, który jest opcjonalnie znakowany, dla utworzenia kompleksu trzy składnikowego fazy stałej, (s') opcjonalnie dodaje się do kompleksu trzyskładnikowego fazy stałej roztwór (iv) związku znakowanego dla utworzenia kompleksu czteroskładnikowego fazy stałej, (t') oddziela się kompleks trzy- lub czteroskładnikowy fazy stałej uzyskany, odpowiednio, w etapach (r') lub (s'), od roztworu, (u') płucze się oddzielony kompleks trzy- lub czteroskładnikowy fazy stałej dla usunięcia związków związanych nienależących do kompleksu, (v') przeprowadza się wykrywanie/mierzenie wypłukanego znakowanego kompleksu trzy- lub czteroskładnikowego, (y') określa się zawartość wymienionego przeciwciała stosując następujący test:
(ya') dostarcza się mieszaninę fazy ciekłej i kompleksu trzyskładnikowego fazy stałej składającą się z (i) przeciwciała w próbce, (ii) reagującego przeciwciała skierowanego przeciw przeciwciału z próbki, gdzie reagujące przeciwciało związane jest z cząstką stałą, (iii) ligandu w postaci antygenu, przeciwciała lub haptenu, który jest znakowany lub związany ze (iv) związkiem znakowanym, dla utworzenia kompleksu wieloskładnikowego fazy stałej, (yb') oddziela się kompleks wieloskładnikowy fazy stałej od fazy ciekłej, (yc') płucze się oddzielony kompleks wieloskładnikowy fazy stałej dla usunięcia związków związanych nienależących do kompleksu, (yd') przeprowadza się wykrywanie/mierzenie wypłukanego znakowanego kompleksu wieloskładnikowego, (z') porównuje się pomiary uzyskane w etapie (x') i w etapie (y') oraz stosuje się porównanie dla określenia działania swoistego szczepienia przeciw alergii.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że w etapie (r') i w etapie (ya') ligand związany jest z biotyną lub jej funkcjonalną pochodną, etap (s') jest etapem koniecznym, w etapie (s') i w etapie (ya') związek znakowany jest związkiem chemiluminescencyjnym kowalencyjnie związanym z awidyną, streptawidyną lub ich funkcjonalną pochodną, w etapie (v') i w etapie (yd') wykrywanie/mierzenie przeprowadza się przez inicjowanie reakcji chemiluminescencyjnej w wypłukanym kompleksie czteroskładnikowym fazy stałej i wykrywanie/mierzenie powstałej chemiluminescencji, jeśli występuje.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że w etapie (o') i w etapie (ya') cząstka stała jest cząstką stałą paramagnetyczną, w etapie (p'), w etapie (f) i w etapie (yb') oddzielenie kompleksu fazy stałej od fazy ciekłej dokonuje się magnetycznie.
7. Sppsóó woeług zastrZi1,2,3,4,5 albb6, zznmieenytym. żż o0dPwieeniOie-aa (i^S' (ΐθλ (ia), (ya'), (ya) lub (ya) przeprowadza się przez zmieszanie składników (i) i (ii), następnie przez dodanie składnika (iii), i ostatecznie przez dodanie składnika (iv), jeśli jest on dodawany.
8. Sppsóó woeług zastrZzl ,2,3,4,5 albb6, zzamieenytym, żż o0dPwieeniOi e^^aO^S' (iał> (ia), (ya'), (ya) lub (ya) przeprowadza się przez zmieszanie składników (i), (ii) i (iii), a następnie przez dodanie składnika (iv), jeśli jest on dodawany.
PL 198 236 B1
9. Sposóbwedług zastrz. 1,2, 3, 4, 5 albo 6, znamienny tym, że od powiednio, porównań ie etapu (j'), (j), (j), (z'), (z) lub (z) przeprowadza się przez obliczenie proporcji pomiarów uzyskanych w dwóch wymienionych etapach.
10. Sposób według z^^Sir^^. 1, 2, 3, 4, 5 albo 6, znamienny tym. że odpowiednio, porównanie etapu (j'), (j), (j), (z'), (z) lub (z) przeprowadza się w szeregu punktach czasowych od rozpoczęcia leczenia i podczas okresu leczenia, i że wszelkie zmiany w czasie, możliwe do zaobserwowania, służą jako podstawa do określenia działania swoistego szczepienia przeciw alergii.
11. Sposób określania stanu immunologicznego osobnika alergicznego, zyaminyyy tym, że obejmuje etapy, zgodnie z którymi:
A/ określa się zawartość przeciwciała w płynnej próbce uzyskanej od osobnika stosując następujący protokół (test A):
(Aa) miesza się (i) przeciwciało w próbce, (ii) przeciwciało skierowane przeciw rejonowi Fc przeciwciała z próbki, gdzie reagujące przeciwciało związane jest z nośnikiem stałym i (iii) ligand w postaci antygenu, przeciwciała lub haptenu, gdzie ligand skierowany jest do rejonu Fab przeciwciała z próbki, dla utworzenia mieszaniny kompleksu trzy składnikowego fazy stałej i fazy ciekłej, (Ab) łączy się kompleks trzyskładnikowy ze (iv) związkiem znakowanym dla utworzenia mieszaniny kompleksu czteroskładnikowego i fazy ciekłej, (Ac) płucze się czteroskładnikową fazę stałą dla usunięcia związków związanych nienależących do kompleksu, (Ad) przeprowadza się wykrywanie/mierzenie wypłukanego znakowanego kompleksu czteroskładnikowego dla uzyskania pomiaru A;
B/ określa się zawartość wymienionego przeciwciała w tej próbce stosując następujący protokół (test B):
(Ba) miesza się (i) przeciwciało w próbce, i (ii) reagujące przeciwciało skierowane przeciw rejonowi Fc przeciwciała z próbki, gdzie reagujące przeciwciało związane jest z nośnikiem stałym, dla utworzenia mieszaniny kompleksu dwuskładnikowego fazy stałej i fazy ciekłej, (Bb) płucze się kompleks dwuskładnikowy fazy stałej dla usunięcia związków związanych nienależących do kompleksu, (Bc) łączy się wypłukany kompleks dwuskładnikowy fazy stałej z (iii) ligandem w postaci antygenu, przeciwciała lub haptenu, gdzie ligand związany jest z rejonem Fab przeciwciała z próbki, i ze (iv) związkiem znakowanym, dla utworzenia mieszaniny kompleksu czteroskładnikowego fazy stałej i fazy ciekłej, (Bd) płucze się kompleks czteroskładnikowy fazy stałej dla usunięcia związków związanych nienależących do kompleksu, (Be) przeprowadza się wykrywanie/mierzenie wypłukanego znakowanego kompleksu czteroskładnikowego dla uzyskania pomiaru B; oraz (E) ustala się wzajemne relacje między pomiarem A i B dla określenia interferencji i stosuje się te interferencje jako parametr do określenia stanu immunologicznego osobnika.
12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, ze etap Ab pr^eprr^i^^i^^^ się przez dodanie wymienionego (iv) związku znakowanego do wymienionej mieszaniny kompleksu trzyskładnikowego fazy stałej i fazy ciekłej w etapie Aa.
13. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że etap Ab pr^^prr^i^^i^^^ się przez płukane kompleksu trzyskładnikowego uzyskanego w etapie Aa dla usunięcia związków związanych nienależących do kompleksu i przez kolejne dodanie wymienionego (iv) związku znakowanego do wypłukanego kompleksu trzyskładnikowego.
14. Sposób według z^^tιr^^. 11 albo 12, albo 13, znamienny t^r^, że etap Bd przeprowadza się przez jednoczesną inkubację wymienionego (iii) ligandu i wymienionego (iv) związku znakowanego z kompleksem dwuskładnikowym.
15. Sposób według zastrz. 11 albo 12, albo 13, znamienny tym, że początkowo wymieniony (iii) ligand dodaje się do kompleksu dwuskładnikowego dla utworzenia kompleksu trzyskładnikowego, który następnie płucze się dla usunięcia (iii) ligandu związanego nienależącego do kompleksu, po czym dodaje się wymieniony (iv) związek znakowany dla utworzenia kompleksu czteroskładnikowego.
16. Sposób wed^zes^-z. 11 albo 12, albol 3, albo 14, albo 15, znamiennytym. że znakowanie związku jest znakowaniem luminescencyjnym, znakowaniem chemiluminescencyjnym, znakowaniem enzymatycznym, znakowaniem radioaktywnym, znakowaniem fluorescencyjnym lub znakowaniem absorbancyjnym.
PL 198 236 B1
17. Sposób według zastrz. 11 albo 12, albo 13, albo 11, albo 15, albo 16, znamienny tym, że (iii) ligsnd jdót oistynylswsny.
18. Sposób według zaltrz. 17, znamienny tym, że (iv) związek znakowany 1eet związkiem chdmilgmindócdncyjnym kswsldncyjnid awiąasnym a swidyną, ótrdptswidyną lgo ich fgnkcjsnslną pschsdną.
19. Sposób określania stanu immunologicznego osobnika alergiccnego, znamienny tym, że sodjmgjd dtspy, agsdnid a którymi:
C/ skrdśls óię aswsrtsść pradciwcisłs w płynndj prbocd gayóksndj sd sósoniks ótsógjąc nsótępgjący prstskbł (tdót C):
(Cs) midóas óię (i) orzdciwcilłs w prbocd, (ii) pradciwcisłs ókidrswsnd pradciw rdjsnswi Fc Ρ^ο^οιιΙι a prboki, gdaid rdsggjącd pradciwcisłs awiąasnd jdót a nsśnikidm ótsłym, i (iii) ligsnd anskswsny w psótsci sntygdng, orzdciwcisłs lgo hsptdng, gdaid ligsnd ókidrswsny jdót ds rdjsng Fso pradciwcisłs a orboki, dls gtwsradnis midóasniny ksmpldkóg trzyókłsdnikswdgs fsay ótsłdj i fsay cidkłdj, (Co) płucad óię ksmpldkó trayókłsdnikswy fsay ótsłdj dls gógnięcis awiąakbw awiąasnych nidnsldżących ds ksmpldkóg, (Cc) oradorswsdas óię wykrywsnid/midradnid wypłgksndgs anskswsndgs ksmpldkóg trayókłsdnikswdgs dls gayóksnis osmisrg C; srsa
D/ skrdśls óię aswsrtsść wymidnisndgs oradciwcisłs ótsógjąc nsótępgjący orstskbł (tdót D):
(Ds) midóas óię (i) oradciwcisłs w prbocd, i (ii) rdsggjącd oradciwcisłs ókidrswsnd pradciw rdjsnswi Fc oradciwcisłs a orboki, gdaid rdsggjącd oradciwcisłs awiąasnd jdót a nsśnikidm ótsłym, dls gtwsradnis midóasniny ksmpldkóg dwuókłsdnikswdgs fsay ótsłdj i fsay cidkłdj, (Do) płgcad óię ksmpldkó dwgókłsdnikswy fsay ótsłdj dls gógnięcis awiąakbw awiąasnych nidnsldżących ds ksmpldkóg, (Dc) łącay óię wypłgksny ksmpldkó dwgókłsdnikswy fsay ótsłdj a (iii) ligsnddm anskswsnym w osótsci sntygdng, oradciwcisłs lgo hsptdng, gdaid ligsnd awiąasny jdót a rdjsndm Fso oradciwcisłs a orboki, dls gtwsradnis midóasniny ksmpldkóg trayókłsdnikswdgs fsay ótsłdj i fsay cidkłdj, (Dd) płgcad óię ksmpldkó trayókłsdnikswy fsay ótsłdj dls gógnięcis awiąakbw awiąasnych nidnsldżących ds ksmpldkóg, (Dd) oradorswsdas óię wykrywsnid/midradnid wypłgksndgs anskswsndgs ksmpldkóg trayókłsdnikswdgs dls gayóksnis osmisrg D; srsa (E) gótsls óię wasjdmnd rdlscjd międay psmisrdm C i D dls skrdśldnis intdrfdrdncji i ótsógjd óię td intdrfdrdncjd jsks psrsmdtr ds skrdśldnis ótsng immgnslsgicandgs sósoniks.
20. Sposób wwdług zastrz. 11, tym, że zzakoweny 1 źggnd j j^só zzakoweny ztomem rsdissktywnym.
21. Sposóbwwdkjg ζζιΤζ. Halbo H^lbo H, albo 11, albo H, albo H, albo 11, albo 11, albo 19, slos 20, nnaminnny tym, żd sósonik, ktbrdgs ótsn jdót skrdślsny oradchsdai ldcadnid sldrgii, ldcadnid sldrgii óacadoidnidm lgo ldcadnid ówsiótym óacadoidnidm pradciw sldrgii (SAV).
PL 198 236 B1
Rysunki
PL 198 236 Β1
FIG. lb
Sposób B według stanu techniki (iii) (i)
Odczyt świecenia
PL198 236 Β1
FIG. 2a
Sposób według wynalazku zastrzeżenie 2 (Sposób 1)
Faza stała
IgE (i) +
l .Inkubacja w · Płukanie
IgE dodanie alergenu (ill) biotynyIowanego/wC
IgE dodanie świecącego reagenta streptawidynowego
I • Odczyt świecenia
PL 198 236 Β1
FIG. 2b
Sposób według wynalazku zastrzeżenie 5 (i·)
Faza stała + (IgE
Inkubacja
Płukanie
IgE (u.) dodanie biotyny lowanegę/b\ alergenu dodanie świecącego reagenta streptawidynowego
Odczyt świecenia
PL 198 236 Β1
FIG. 2c
Sposób według wynalazku zastrzeżenie 6
Faza stała
IgE (0 + —< ) X
I · Inkubacja w . Płukanie (iii) i B «dodanie biotynylowanegoX<^ φ alergenu
J ‘Płukanie
IsE dodanie świecącego reagenta streptawidynowego
IgE
I « Odczyt świecenia
PL 198 236 Β1
FIG. 3a
Podsposób według wynalazku (1»)
Biotynylowany alergen (i) + —< )
X
IgE
() dodanie fazy stałej
Inkubacja
I . Odczyt świecenia
PL 198 236 Β1
FIG. 3b
Podsposób według wynalazku (iii) <
Bi otynylowany IgE alergen . Inkubacja • Płukanie
Odczyt świecenia
PL 198 236 Β1
FIG. 3c
Podsposób według wynalazku
Faza stała (ii) (i) + —<)
X
IgE dodanie /Τ' biotynylowanego alergenu Inkubacja
Płukanie
IgE (iv) &
dodanie świecącego reagenta streptawidynowego
Płukanie
IgE
Odczyt świecenia
PL 198 236 B1
FIG. 4
Stężenie swoistych IgE w stosunku do alergenu pyłku brzozy SU/ml
FIG. 5
Stężenie swoistych IgE w stosunku do pyłku brzozy
SU/ml
PL 198 236 Β1
FIG.6
Stężenie swoistych IgE w stosunku do pyłku brzozy
SU / nil
Względne miano króliczego przeciwciała poiiklonalnego skierowanego przeciw Betula verucoza (brzoza brodawkowata)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DKPA199800821 | 1998-06-24 | ||
| PCT/DK1999/000362 WO1999067642A2 (en) | 1998-06-24 | 1999-06-24 | Method of detecting an antibody in a liquid sample |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL345727A1 PL345727A1 (en) | 2002-01-02 |
| PL198236B1 true PL198236B1 (pl) | 2008-06-30 |
Family
ID=8097940
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL345727A PL198236B1 (pl) | 1998-06-24 | 1999-06-24 | Sposób określania działania swoistego szczepienia przeciw alergii oraz sposób określania stanu immunologicznego osobnika alergicznego |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1090297B1 (pl) |
| JP (1) | JP4523156B2 (pl) |
| KR (1) | KR20010053162A (pl) |
| CN (1) | CN1189749C (pl) |
| AT (1) | ATE403866T1 (pl) |
| AU (1) | AU752093B2 (pl) |
| CA (1) | CA2335615C (pl) |
| CZ (1) | CZ300237B6 (pl) |
| DE (1) | DE69939260D1 (pl) |
| DK (1) | DK1090297T3 (pl) |
| ES (1) | ES2310939T3 (pl) |
| HK (1) | HK1035227A1 (pl) |
| HU (1) | HU228049B1 (pl) |
| PL (1) | PL198236B1 (pl) |
| WO (1) | WO1999067642A2 (pl) |
| ZA (1) | ZA200007681B (pl) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6730023B1 (en) | 1999-10-15 | 2004-05-04 | Hemopet | Animal genetic and health profile database management |
| US8234099B2 (en) | 1999-10-15 | 2012-07-31 | Hemopet | Computer program for determining a nutritional diet product for a canine or feline animal |
| US7548839B2 (en) | 1999-10-15 | 2009-06-16 | Hemopet | System for animal health diagnosis |
| EP2065052A3 (en) * | 2000-08-30 | 2009-08-19 | Pfizer Products Inc. | Anti-IgE vaccines |
| US20050069962A1 (en) | 2001-10-12 | 2005-03-31 | Archer Robert M | Antibody complexes and methods for immunolabeling |
| RU2006134031A (ru) * | 2004-02-26 | 2008-04-10 | Альк-Абелло А/С (Dk) | Способ оценки терапевтического потенциала вакцины для введения через слизистые оболочки |
| US7873482B2 (en) | 2008-12-16 | 2011-01-18 | Bruno Stefanon | Diagnostic system for selecting nutrition and pharmacological products for animals |
| US7867720B2 (en) | 2009-01-26 | 2011-01-11 | Dodds W Jean | Food sensitivity testing in animals |
| US8450074B2 (en) | 2009-01-26 | 2013-05-28 | W. Jean Dodds | Multi-stage nutrigenomic diagnostic food sensitivity testing in animals |
| US7892763B2 (en) | 2009-01-26 | 2011-02-22 | Dodds W Jean | Multi-stage nutrigenomic diagnostic food sensitivity testing in animals |
| CN105277689A (zh) * | 2015-11-17 | 2016-01-27 | 苏州浩欧博生物医药有限公司 | 纳米磁微粒化学发光法检测血清总IgE的试剂盒及方法 |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4444879A (en) * | 1981-01-29 | 1984-04-24 | Science Research Center, Inc. | Immunoassay with article having support film and immunological counterpart of analyte |
| CA1240937A (en) * | 1982-07-26 | 1988-08-23 | Gordon R. Dreesman | Monoclonal igm antibodies and method of preparation |
| US4539292A (en) * | 1982-12-29 | 1985-09-03 | Reid Michael J | Immunoassay technique for specific immunoglobulin E |
| DE3485839T2 (de) * | 1983-03-17 | 1993-03-04 | Biowhittaker Inc | Fluorometrische pruefung des gesamten ige niveaus und reagens dafuer. |
| US5028524A (en) * | 1987-04-24 | 1991-07-02 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Assay for anti-pre-S antibody |
| DE3717401A1 (de) * | 1987-05-23 | 1988-12-08 | Behringwerke Ag | Einschritt-immuntest zur bestimmung von antigen-spezifischen antikoerpern aus einer der immunglobulin-klassen a, m, d oder e und dazu geeignetes mittel |
| AU3696289A (en) * | 1988-06-08 | 1990-01-05 | Cambridge Bioscience Corporation | Anti-fc assay for detection of antibodies |
| AU640635B2 (en) * | 1989-01-30 | 1993-09-02 | Epitope, Inc. | Avidin-biotin assisted immunoassay |
| US5965702A (en) * | 1991-10-21 | 1999-10-12 | Abbott Laboratories | Borrelia burgdorferi antigens and uses thereof |
| DK137992D0 (da) * | 1992-11-13 | 1992-11-13 | Alk Lab As | Fremgangsmaade til paavisning af et immunologisk aktivt stof i en proeve under anvendelse af et maerkningsstof |
| EP0705426A4 (en) * | 1993-06-09 | 1998-07-08 | Quidel Corp | SPECIFIC ONE-STEP TITRATIONS OF AN ANTIGEN |
| US5556759A (en) * | 1993-08-02 | 1996-09-17 | Beach; Peter G. | Assay and method for determining newborn risk for sudden infant death syndrome |
| EP0835449A1 (en) * | 1995-06-29 | 1998-04-15 | Dako A/S | Method for the simultaneous detection of different antibodies and/or antigens |
| AU4821497A (en) * | 1996-10-15 | 1998-05-11 | Enteron, L.P. | Organism-specific and allergen-specific antibody capture assay and compositions for detection of disease-causing organisms and allergens |
-
1999
- 1999-06-24 JP JP2000556248A patent/JP4523156B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-06-24 KR KR1020007014736A patent/KR20010053162A/ko not_active Application Discontinuation
- 1999-06-24 DK DK99929109T patent/DK1090297T3/da active
- 1999-06-24 HU HU0103177A patent/HU228049B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1999-06-24 CA CA2335615A patent/CA2335615C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-06-24 ES ES99929109T patent/ES2310939T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-24 CZ CZ20004867A patent/CZ300237B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-06-24 PL PL345727A patent/PL198236B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1999-06-24 DE DE69939260T patent/DE69939260D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-24 AT AT99929109T patent/ATE403866T1/de active
- 1999-06-24 EP EP99929109A patent/EP1090297B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-24 CN CNB998088463A patent/CN1189749C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-06-24 AU AU46033/99A patent/AU752093B2/en not_active Ceased
- 1999-06-24 WO PCT/DK1999/000362 patent/WO1999067642A2/en active IP Right Grant
-
2000
- 2000-12-20 ZA ZA200007681A patent/ZA200007681B/en unknown
-
2001
- 2001-08-22 HK HK01105917A patent/HK1035227A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUP0103177A3 (en) | 2005-11-28 |
| PL345727A1 (en) | 2002-01-02 |
| WO1999067642A2 (en) | 1999-12-29 |
| CA2335615C (en) | 2010-08-10 |
| CZ300237B6 (cs) | 2009-03-25 |
| AU752093B2 (en) | 2002-09-05 |
| CA2335615A1 (en) | 1999-12-29 |
| ATE403866T1 (de) | 2008-08-15 |
| ES2310939T3 (es) | 2009-01-16 |
| DE69939260D1 (de) | 2008-09-18 |
| JP2002519638A (ja) | 2002-07-02 |
| WO1999067642A3 (en) | 2000-06-02 |
| KR20010053162A (ko) | 2001-06-25 |
| HU228049B1 (en) | 2012-09-28 |
| DK1090297T3 (da) | 2009-01-19 |
| CZ20004867A3 (cs) | 2001-08-15 |
| HUP0103177A2 (hu) | 2001-12-28 |
| CN1189749C (zh) | 2005-02-16 |
| CN1310799A (zh) | 2001-08-29 |
| EP1090297A2 (en) | 2001-04-11 |
| HK1035227A1 (en) | 2001-11-16 |
| JP4523156B2 (ja) | 2010-08-11 |
| AU4603399A (en) | 2000-01-10 |
| ZA200007681B (en) | 2001-06-06 |
| EP1090297B1 (en) | 2008-08-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1396724B1 (en) | Method of assay by immunoreaction and reagent for use in the immunoreaction assay | |
| CN104165987A (zh) | 屋尘螨过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒及其制备方法 | |
| PL198236B1 (pl) | Sposób określania działania swoistego szczepienia przeciw alergii oraz sposób określania stanu immunologicznego osobnika alergicznego | |
| JPH0565029B2 (pl) | ||
| CA2149340C (en) | Two-site immunoassay for an antibody with chemiluminescent label and biotin bound ligand | |
| US20070224654A1 (en) | Method of detecting an antibody in a liquid sample | |
| CA3181751A1 (en) | Detection of antibodies to sars-cov-2 | |
| JPWO2004027424A1 (ja) | 蛍光化抗体を用いた蛍光分析方法 | |
| WO2002027316A2 (en) | Methods and kits for decreasing interferences of assays samples containing plasma or serum in specific binding assays by using a large polycation | |
| CA2355294C (en) | A method of detecting and/or quantifying a specific ige antibody in a liquid sample | |
| US20110136261A1 (en) | Method of assaying complex and kit to be used therefor | |
| US4113433A (en) | Radioimmunoassay of hormones and metabolites in blood serum and plasma | |
| US20070254322A1 (en) | Complement-based analyte assay | |
| JP2716227B2 (ja) | 磁性マーカー粒子を用いた免疫学的測定方法 | |
| JP2684425B2 (ja) | ラテックス試薬 | |
| EP0260079A1 (en) | Method of assay | |
| JP3288930B2 (ja) | 凝集試験用プレート、その製造方法、抗原又は抗体の検出方法及び検出用キット並びに免疫グロブリンクラスの検定方法 | |
| SU1323959A1 (ru) | Способ определени специфичности иммунных комплексов | |
| JP2001099838A (ja) | 化学発光反応に基づく糖尿病診断のための多項目検査項目の同時測定方法 | |
| Haik et al. | The Detection of the Severity of Acute Myocardial Infarction (AMI) Using Magnetic Microspheres | |
| JPH11142407A (ja) | 抗ｆｋｂｐ１２自己抗体の検出方法 | |
| JPS60146155A (ja) | 物質の検出及び定量に用いる免疫学的方法 | |
| JPH0238970A (ja) | 免疫測定方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20140624 |