JPH0238970A - 免疫測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は臨床検査における免疫測定法、さらに詳しくは
螢光剤粒子を用いた抗原抗体反応による免疫測定方法に
関するものである。

（従来の技術） 従来の免疫測定技術としては古典的測定法として沈降反
応、赤血球凝集反応、細菌凝集反応、補体結合反応、受
身赤血球凝集反応、溶血反応等があるがいづれも免疫反
応の有無を定性的、あるいは半定量的に測定することし
ができない。また近年発達した免疫測定法としては最も
高性能といわれる放射性同位体をトレーサーとしたラジ
オイムノアッセイ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ
　（ＲＩＡ））は種々の免疫成分の定量が可能であり、
古典的免疫測定法にくらべれば革命的進歩であったが、
放射性物質を取扱うため特別な注意が必要であり、法律
的にも規制を受ける、また放射性廃棄物の処理、処分の
方法にも未解決な点を残しているなど問題が多い。

またＲＩＡ以後に開発された酵素免疫測定法（ＨＩＡ：
Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）はかなりの高
感度が期待でき、廃棄物の処理も問題ないが分析操作が
複雑で測定の自動化に問題を残している。

またラテックス免疫測定法、螢光免疫測定法があり、操
作性は良いが感度が悪いなどの欠点があり、全体的にみ
て理想的免疫測定法は未だ確立していないといえる。

（本発明が解決しようとする問題点） ラテックス免疫測定法や螢光免疫測定法は酵素免疫測定
法（ＥｒＡ）に比較して反応に要する時間が短く、高度
に自動化された装置がある等の特長を持つがＲ１＾やＥ
ＲＡに比べ感度が低く、極く微量な成分の検出には適当
でない。またこれらの測定法は濁度を測定するあるいは
螢光を測定するため光散乱に影響を与える検体中の共存
物質、例えば乳び血清、自己免疫複合体が測定結果に影
響を与える、あるいは溶血等により試料の着色が螢光の
自己吸収を引起すなどにより、測定結果に影響をおよぼ
す等の問題を持っている。これらの問題を回避するため
濁度の計測にあたり波長を選択することによって乳びや
自己免疫複合体の影響を軽減する、あるいは励起光の照
射と螢光の測定に成る時間差を設け、シグナル／ノイズ
比（Ｓ　／　Ｎ比）の増大を計ること、三波長の測定を
行ない上記の影響を軽減するなどの工夫がなされている
が、いづれの方法も期待通りの結果を得るには到ってい
ない 本発明の解決しようとする問題点の一つはこれら上記の
欠点を回避した操作性が良く、かつ共存物質の影響を受
けない測定法を提供することである。

またＲ１＾やＥＩＡは感度が高く微量成分の測定には適
しているが放射性廃棄物を往する問題や測定操作が面倒
であるなどの問題があり、理想的計測法とはなっていな
い。本発明の解決しようとする問題点の他の一つはこれ
ら上記の欠点を回避した廃棄物の問題を生ぜず、かつ高
感度で操作性の良い測定法を提供することである。

（問題点を解決するための手段） 発明者等は以上の問題点を解決するため、鋭意検討の結
果、本発明を完成させたものである。本発明に使用する
抗原または抗体を感作した螢光剤粒子としては、フルオ
レセイン、ローダミン、ナフタールイミド型の化合物、
ｐ−ベンゾトリアゾール型の化合物などの有機螢光物質
、シアン化白金やアルカリ土類金属の硫化物などの無機
螢光物質を単独または混合して用いることができる。こ
れらは螢光ラテックスとして用いてもよい。ラテックス
はポリスチレン以外にもスチレン−ブタジェン共重合体
、スチレン−アクリル酸共重合体なども用いることがで
きる。

本発明における固相としては通常ＥＩＡのＥＬＩＳＡ用
プレート　（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎ
ｏ　５ｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙ）が広（用いられまたチ
ューブコーティング法に用いられる各種試験管が使用で
きる。感作に用いられる抗原または抗体は限定的でなく
、あらゆる抗原、抗体が使用できる。例えばそれらのも
のは腫瘍マーカー、ＨＢｓなどの抗原、ＩｇＧ　、　Ｉ
ｇＭなどの抗体またはその分解物等であって良い。感作
方法は物理的な吸着や粒子上の官能基を利用した化学的
な反応が使用できる。

用いられる螢光剤粒子の大きさは螢光強度を計測する面
からは粒子当りの光量が多ければ多い程良い。また固相
への粒子の結合という反応的な面からみると、粒子を含
んだ系でのＢ／Ｆ分離を安定に行なうためには、その大
きさは小さなものが好都合である。また粒子は小さけれ
ば小さい程結合が安定化し、かつ反応も早い。従って、
この両方の条件を勘案して、実際的な螢光剤粒子が選定
される。

以下にナフトールイミド、ベンゾトリアゾール型の化合
物の螢光剤の微結晶を担体とし、この表面に抗原あるい
は抗体を感作したものを例にとって説明する。本発明に
使用される螢光剤粒子の大きさは　０．０５〜１μｍ好
ましくは０．１〜０．５μｍの直径のものを用いて構成
される。本発明の測定の面からはあまり粒径が小さくな
ると、感作粒子の洗浄や濃縮に通常の遠心法が適用困難
となるなどの問題が生ずる。このため上記粒径の範囲が
実質的には好適であった。

以上の固相と螢光剤粒子を用いての操作を以下に説明す
る。

まず固相に測定しようとする免疫成分に相補的な成分、
すなわち抗原に対しては抗体を感作しておく。これに検
体、例えば血清の適当に希釈した溶液を加え、抗原抗体
反応を行なう。この後、抗原抗体にサンドイッチ式に結
合する感作螢光剤粒子を反応させ、固相−螢光剤粒子の
結合を形成させる。次いで固相に結合しなかった螢光剤
粒子を洗浄により除去する。しかる後に固相に結合した
螢光剤粒子をエタノール等の有機溶媒に溶解し、その螢
光濃度を螢光々度計で測定し、免疫成分の量と螢光強度
を関連づけた検量線を得る。

（作　用） 本発明の特徴は固相表面に結合した螢光剤粒子を結合し
なかった粒子と分離し、結合した粒子のみを溶解するた
め極めて大きな増巾率をもって計測できることにある。

従って極めて高感度な検出が行なえる。

また固相に結合した粒子を螢光顕微鏡、ＴＶカメラを介
して画像処理法によって定量する方法にくらべ使用する
測定装置が従来汎用されてきた螢光々度計であり極めて
簡単であることである。

（実施例） （］）　　Ｐ、　　　　　・　−パの１′１例えば抗牲
トα−フェトプロティン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体
のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（例
えばトリス緩衝液、抗体濃度；１００μｇ／　ｍｌ、　
　１　ｍｆｆ１）に平均粒径０．３μｍの螢光剤粒子（
例えばナフタールイミド、ベンゾトリアゾール型の化合
物の螢光剤、固型分濃度２．５ｗｔ％）（１００μりを
加え、適当な温度（例えば３７°Ｃ）に於て適当な時間
（例えば１時間）攪拌後、遠心分離（例えば１２００Ｏ
ｒ、ｐ、ｍ、　　３０ｉ＋ｉｎ）を行ない、分離した抗
ＡＦＰモノクローナル抗体感作粒子を緩衝液（例えば牛
血清アルブミンを１．０ｗｔ％含むトリス）で３回洗浄
後、適当な濃度（例えば０．００２％）によるよう懸濁
させ、感作螢光剤粒子を調製する。

（２）　　感　プレートのＵ 酵素免疫測定法で用いられる平底プレートに上記（１）
テ使用した抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体とは抗原認
識部位の異なる例えば抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体
のリン酸緩衝液（例えば抗体濃度；１０μｇ／ｍｆ）を
適当な量（例えば５０ｕｌ／１ｙｅｌｌ）を加え、室温
に於て適当な時間（例えば４時間）静置後、適当な濃度
（例えば０．０１ｗＬ％）のＴｓｙｅｅｎ　２０を含む
リン酸緩衝生理食塩水にて３回洗浄し、その後リン酸緩
衝液（例えば１．０ｗｔ％の牛血清アルブミンを含む）
の適当量（例えば１００　ｔｔ　ｌ　／ｗｅｌｌ）を加
え、例えば４°Ｃに於て１晩放置後Ｔｗｅｅｎ　２０を
含むリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、感作プレート
を調製する。

（３）盈垂直綴夏１戊 上記（２）で調製した感作プレートにトリス緩衝液（例
えば１．０ｗｔ％の牛血清アルブミンを含む）を適当量
（例えば４０μｊ！／ｗｅｌｌ）加え、さらに濃度の異
るＡＦＰを含む標準ＡＦＰ溶液を適当量（例えば１０μ
ｆｆ／ｗｅｌｌ）添加して室温に於て１時間、抗原抗体
反応を行ない続いて上記（１）で調製した感作螢光剤粒
子を適当量（例えば５０μρ／ｗｅｌｌ）添加して室温
に於て３時間抗原抗体反応を行う。

その後０．０１ｗｔ％のＴｗｅｅｎ　２０を含むリン酸
緩衝生理食塩水で各ウェルの内壁をきすつけないように
注意深く３回洗浄してプレートに結合しなかった粒子を
除去する。次いで各ウェルにエチルアルコール等を添加
し、充分攪拌しプレートに結合した螢光剤粒子を溶解す
る。この後螢光マイクロプレートリーダーを用いて各ウ
ェルの螢光量を計測して標準曲線を得ることができる。

（発明の効果） 前述したように本発明によれば反応速度の高い小さな粒
径の螢光剤粒子を用い、雑音成分となる未結合螢光粒子
を除去し、結合螢光剤粒子のみを溶解し、さらに螢光光
度針で測定を行うため、螢光光度計の増幅率を高（して
もＳ／Ｎ比の良好な結果が得られ、極めて高感度の迅速
な測定が可能である。

特許出願人　冨士レビオ株式会社

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）固相と螢光剤粒子を用いた抗原抗体反応により形
   成された固相に結合した螢光剤粒子を結合しなかった螢
   光剤粒子と分離した後、結合した螢光剤粒子を溶解し、
   螢光々度計で計測することを特徴とする免疫測定方法。
2. （２）螢光剤粒子が０．０５〜１μｍである特許請求の
   範囲第１項記載の方法。