JP3288930B2 - 凝集試験用プレート、その製造方法、抗原又は抗体の検出方法及び検出用キット並びに免疫グロブリンクラスの検定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、唾液、血液、リン
パ液、糞尿などの生物学的液体中の抗原又は抗体を抗原
抗体反応に基づく凝集反応によって検出する際に使用す
る凝集試験用プレート、その製造方法、抗原又は抗体の
検出方法及び検出用キット並びに免疫グロブリンクラス
の検定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】検体（血清、体液など）に含まれている
特定の抗体量を測定する方法として、抗原を固定したゼ
ラチン、カオリン、合成ポリマーなどの凝集性複合体粒
子を用いた凝集反応法が従来から使用されている。この
ような凝集反応の判定には複数の穴を有するプレートが
使用され、検体の希釈列が作製される。判定は、凝集反
応が起こると（陽性）、穴の壁に凝集物が一様に広がっ
たマット状の凝集像が形成されるが、凝集が起こらない
場合（陰性）、凝集物は穴の壁をすべり落ちて穴の底に
円形ボタン状に集合することで行われる。しかしなが
ら、陽性・陰性の判定が明確でない像（中間的な像）が
生じたり、プレートの穴の形状によって使用できなかっ
たり、感度が他の測定方法に比べて低いなどの問題点が
ある。また、従来の凝集法による生化学的検査では測定
対象の抗体のクラスの判別ができない。そのため、確定
診断を行うためには他の試験方法や臨床病状の検討を必
要とした。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、簡単な操作
で、しかも迅速に高感度で生物学的液体中の抗原又は抗
体を検出することができる凝集試験用プレート及びその
製造方法、該プレートを用いた抗原又は抗体の検出方法
及び検出用キット並びに免疫グロブリンクラスの判別方
法を提供することを目的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、凝集試験に使
用されるマイクロプレートの内側表面にアビジン又はス
トレプトアビジンを吸着させ、これにビオチン標識抗原
又は抗体と反応させることにより上記目的を達成しうる
ことを見出し、この知見に基づいて完成したものであ
る。

【０００５】すなわち、本発明による凝集試験用プレー
トは、底部の断面形状がＶ字形、Ｕ字形又はその変形で
ある穴を複数個有するプレートの各穴の底部の内側表面
にアビジン若しくはストレプトアビジン又はこれらの誘
導体を付着させたことを特徴とする。また、本発明によ
る凝集試験用プレートの製造方法は、底部の断面形状が
Ｖ字形、Ｕ字形又はその変形である穴を複数個有するプ
レートの各穴の底部にアビジン若しくはストレプトアビ
ジン又はこれらの誘導体含有溶液を満たし、その溶液を
捨てた後、プレートを乾燥させることを特徴とする。

【０００６】本発明は、さらに、上記の本発明になる凝
集試験用プレートの各穴の底部の内側表面に付着したア
ビジン若しくはストレプトアビジン又はこれらの誘導体
にビオチン標識抗原又は抗体を反応させた後、各穴に被
検生物学的液体を入れ、さらに粒状固定化抗体又は抗原
を加えて凝集反応を観察することを特徴とする抗原又は
抗体の検出方法を提供するものである。また、本発明
は、上記の本発明になる凝集試験用プレートと、ビオチ
ン標識抗原又は抗体と、粒状固定化抗原又は抗体とから
成ることを特徴とする抗原又は抗体の検出用キットを提
供するものである。

【０００７】本発明は、さらに、本発明に係る凝集試験
用プレートの各穴の底部の内側表面に付着したアビジン
若しくはストレプトアビジン又はこれらの誘導体にビオ
チン標識抗ＩｇＧ抗体、ビオチン標識抗ＩｇＭ抗体、ビ
オチン標識抗ＩｇＥ抗体及びビオチン標識抗ＩｇＡ抗体
のうちの１種を反応させたプレートを少なくとも１種類
準備し、そのプレートの各穴に被検生物学的液体を入
れ、さらに粒状固定化抗原を加えて凝集反応を観察する
ことを特徴とする免疫グロブリンクラスの判別方法を提
供するものである。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明において使用するプレート
は、複数の穴を有し、希釈列を作製できるものであれば
制限はないが、一般には、穴の底部の断面形状がＶ字
形、Ｕ字形又はその変形であるプレート又はストリップ
である。その材質としては、ポリスチレン、ポリプロピ
レン、ポリ塩化ビニルなどが使用される。本発明の凝集
試験用プレートは、このようなプレートの各穴の底部、
すなわち断面形状がＶ字、Ｕ字又はその変形の部分の内
側表面にアビジン若しくはストレプトアビジン又はこれ
らの誘導体を付着させたものである。ここで、誘導体と
しては、アビジンより糖鎖部分を除いたもの、例えばニ
ュートラアビジン（NeutraAvidin）、ウルトラアビジン
などが挙げられる。このうちニュートラアビジンは、非
特異的結合性の非常に低いビオチン−結合蛋白生成物を
生ずることが知られている。

【０００９】アビジン若しくはストレプトアビジン又は
これらの誘導体の付着量は、極めて少量であってよく、
ビオチンとの反応量を考慮して決定すればよいが、一般
に特定濃度の溶液をプレートの各穴に満たし、その溶液
を捨てた後に穴の表面に付着している量でよい。この付
着に用いる溶液は、１μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌの
濃度の溶液であるのが好ましく、５μｇ／ｍｌ〜１００
μｇ／ｍｌの濃度の溶液であるのがいっそう好ましい。
この付着に用いる溶液濃度が１μｇ／ｍｌ未満では、最
終的に観察される凝集像が不安定であり、２００μｇ／
ｍｌを超えると、経済性が悪くなる。

【００１０】アビジン、ストレプトアビジン及びこれら
の誘導体は、ビオチンに対して極めて高い親和性を有
し、他方、ビオチンは抗体や多くの酵素に容易に結合さ
せることができるので、上記のように付着したアビジン
若しくはストレプトアビジン又はこれらの誘導体と、ビ
オチン標識抗原又は抗体とを反応させることにより、プ
レートの各穴内で正しい配向性を以て固定化された抗原
又は抗体を有する凝集試験用プレートが得られる。

【００１１】本発明の凝集試験用プレートを製造するに
は、プレートの各穴の底部にアビジン若しくはストレプ
トアビジン又はこれらの誘導体含有溶液を満たし、その
溶液を捨てた後、プレートを乾燥させればよい。アビジ
ン若しくはストレプトアビジン又はこれらの誘導体含有
溶液は、アビジン若しくはストレプトアビジン又はこれ
らの誘導体を水、生理的塩類溶液、生理食塩水などを溶
媒とする溶液であり、その濃度には特に制限はなく、上
記の濃度範囲の溶液を用いる。各穴に上記のような溶液
を入れ、一般には、数分以上そのまま静置してアビジン
若しくはストレプトアビジン又はこれらの誘導体を穴の
表面に確実に付着させた後、その溶液を捨てるのが好ま
しいが、その静置時間は溶液中のアビジン若しくはスト
レプトアビジン又はこれらの誘導体の濃度によって左右
され、濃度が高い（５０μｇ／ｍｌ以上）場合には、ほ
とんど静置時間を設けなくてもよい。

【００１２】また、アビジン若しくはストレプトアビジ
ン又はこれらの誘導体含有溶液をプレートの各穴に入れ
て静置し、その溶液を捨てた後、水、生理的塩類溶液、
生理食塩水などで洗浄することにより、穴に充分に固着
せず、遊離しているアビジン若しくはストレプトアビジ
ン又はこれらの誘導体を除去した後、乾燥し、凝集試験
用プレートとして使用するのが好ましい。乾燥は自然乾
燥でよいが、加温して水分の蒸発を促進することもでき
る。

【００１３】こうして得られた凝集試験用プレートは、
各穴の表面に一様にアビジン若しくはストレプトアビジ
ン又はこれらの誘導体が付着しており、室温で長期間保
存しても安定であり、例えば、４〜２５℃で７日以上保
管した後も効果に変化はなかった。なお、各穴の表面に
付着したアビジン若しくはストレプトアビジン又はこれ
らの誘導体の未付着部位をブロッキング剤でマスキング
することにより、その後の生化学的反応の精度を向上す
ることができる。ブロッキング剤としては、各穴の内側
表面の未吸着部位に吸着されるものであって、かつ、そ
の後に反応させるビオチン標識抗原又は抗体に対して特
異性の低い蛋白質であれば特に制限はないが、カゼイ
ン、アルブミン、ゼラチンなどの蛋白質が好適である。

【００１４】また、上記の未付着部位のマスキングを行
う前に、固定化剤で処理してアビジン等の付着を増強す
ることもできるが、この場合には、アビジン同士が架橋
され、アビジン等の活性が損なわれることがあるため、
固定化処理を行わない場合より、高濃度のアビジン等の
溶液を用いてアビジン等の付着量を増加させるのが好ま
しい。使用しうる固定化剤としては、アルデヒド基又は
エポキシ基を少なくとも１個有する架橋剤、グルタール
アルデヒド、ホルムアルデヒド、３−グリシドキシプロ
ピルトリメトキシシラン、ビスオキシラン、エピクロロ
ヒドリンなどが挙げられる。

【００１５】本発明による凝集試験用プレートを用いて
抗原又は抗体の検出を行うには、プレートの各穴の底部
の内側表面に付着しているアビジン若しくはストレプト
アビジン又はこれらの誘導体にビオチン標識抗原又は抗
体を反応させた後、各穴に被検生物学的液体を入れ、さ
らに粒状固定化抗体又は抗原を加えて凝集反応を観察す
ればよい。プレートの各穴にビオチン標識抗原又は抗体
の溶液を加え、放置し、アビジン等とビオチンを結合さ
せる。その後、水によりプレートを洗浄することにより
余剰のビオチン化抗原又は抗体を除き、水滴を除去した
後、被検生物学的液体の希釈列を加え、被検液体中の抗
体又は抗原の量の検定に用いるのが好ましい。

【００１６】本発明による抗原又は抗体の検出方法に用
いる粒状固定化抗原又は抗体としては、特に制限はない
が、抗原又は抗体をセラミックス−ポリマー複合体、ラ
テックス、ゼラチン、カオリンなどに固定した凝集性複
合体粒子として使用するのが好ましい。抗原又は抗体を
セラミックス−ポリマー複合体に固定した凝集性複合体
粒子としては、例えば、ポリマー粒子の表面がリン酸カ
ルシウム系化合物で被覆されており、前記ポリマー粒子
が染色されているか、又は全体が染色されている粒状ポ
リマー複合体に抗原又は抗体を吸着させ、固定化し、未
吸着部位をブロッキング剤で処理したもの（特願平５−
２４９５０６号参照）などが挙げられる。この粒状ポリ
マー複合体としては、ポリマー粒子にリン酸カルシウム
系化合物粒子を物理的に衝突させることによりポリマー
粒子表面をリン酸カルシウム系化合物で被覆することに
よって製造されたものが好ましい。

【００１７】上記のリン酸カルシウム系化合物として
は、Ｃａ／Ｐ比が１．０〜２．０であれば各種のリン酸
カルシウム系化合物を使用することができ、例えば、Ｃ
ａ₁₀（ＰＯ₄)₆(ＯＨ)₂、Ｃａ₁₀（ＰＯ₄)₆ Ｆ₂ 、Ｃａ₁₀
（ＰＯ₄)₆ Ｃl₂、Ｃａ₃(ＰＯ₄)₂ 、Ｃａ₂ Ｐ₂ Ｏ₇ 、Ｃ
ａ₄ Ｏ（ＰＯ₄)₂ 及びＣａＨＰＯ₄ のうちから選ばれた
１種又は２種以上を使用することができる。これらのう
ちハイドロキシアパタイト及びリン酸三カルシウムが好
ましく、特にハイドロキシアパタイトを主成分とするも
のが最も好ましい。フッ素アパタイトを用いる場合、全
リン酸カルシウム系化合物中のフッ素含有率が５重量％
以下であるのが好ましい。フッ素含有率が５重量％を超
えると、フッ素の溶出が起こり好ましくない。これらの
リン酸カルシウム系化合物は、公知の湿式合成法、乾式
合成法などによって合成することができる。リン酸カル
シウム系化合物の粒子は、例えばリン酸カルシウム系化
合物のスラリーを噴霧乾燥することによって造粒し、こ
れを焼成することによって調製することができるが、こ
の方法に限らず他の造粒法によって調製することも可能
である。なお、ふるい分けなどの手段により、粒子の粒
度を目的に応じて所定の範囲に選定して用いることがよ
り好ましい。

【００１８】上記のビオチン標識抗体としては、ビオチ
ン標識抗ＩｇＧ抗体、ビオチン標識抗ＩｇＭ抗体、ビオ
チン標識抗ＩｇＥ抗体又はビオチン標識抗ＩｇＡ抗体を
用いることができる。こうして、プレートの各穴の底部
の内側表面にアビジン若しくはストレプトアビジン又は
これらの誘導体を吸着させ、これに上記のようなビオチ
ン標識抗体を結合させることにより抗体のクラスあるい
はサブクラスを特定し、特定されたクラスの抗体の中の
特異的抗体を粒状固定化抗原で検出することにより、生
物学的液体中の免疫グロブリンクラスを判別することが
できる。

【００１９】例えば、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＭ抗体、抗
ＩｇＥ抗体及び抗ＩｇＡ抗体のうちの１種を吸着させた
プレートを用意した場合、初感染の場合には抗ＩｇＭ抗
体を吸着させたプレートに抗体価のピークが現れ、感染
時間の経過とともに抗ＩｇＧ抗体を吸着させたプレート
に抗体価のピークが現れる。したがって、かつて感染し
た患者の検体では抗ＩｇＧ抗体を吸着させたプレートに
抗体価のピークが現れる。また、抗ＩｇＥ抗体は寄生
虫、花粉症、アレルギーを調べるとき、抗ＩｇＡ抗体は
鼻汁、唾液などの粘液類を調べるときに使用される。こ
のようにして、本発明のプレートを１種類又は２種類以
上を組み合わせて用いることにより生物学的液体中の免
疫グロブリンクラスを容易に判別することができ、感染
の確定診断を行うことができる。

【００２０】

【実施例】次に、実施例に基づいて本発明をさらに詳細
に説明するが、本発明はこれによって制限されるもので
はない。

【００２１】参考例１（日本脳炎北京株固定セラミック
ス−ポリマー複合粒子の製造） アントラキノン系分散染料である商品名 MITSUI ML Col
ors ML red VF-２（三井東圧染料（株）製）で染色した
平均粒径５μｍのナイロンビーズ５０ｇとハイドロキシ
アパタイト粒子７．５ｇを奈良ハイブリダイゼーション
システムＮＨＳ−１を８０００回転／分で３２〜５０℃
で５分間稼動させてナイロンビーズ表面をハイドロキシ
アパタイトで被覆した。得られた複合体ビーズは、ハイ
ドロキシアパタイト被覆層の厚さが平均０．４４μｍ、
平均粒径５．８μｍであった。日本脳炎北京株ウイルス
（３２μｇ／ｍｌ）と上記複合体ビーズの１０％溶液
（ｗ／ｖ）を当量混合し、１時間ローテータで混和し、
ウイルス抗原をビーズに吸着させた。ビースを遠心機で
１０００ｒｐｍで５分間遠心沈降させ、ペレットを作
り、上澄みを捨てた。ペレットをほぐし、０．０５％の
グルタールアルデヒド（ＰＢＳ（ｐＨ７．２）希釈液）
で抗原を固定した。室温でローテータで攪拌した後、ビ
ーズを遠心機で１０００ｒｐｍで５分間遠心沈降させ、
ペレットを作り、上澄みを捨てた。ビーズの抗原未吸着
部位をマスキングするため１％ブロックエース溶液（ｗ
／ｖ）溶液でマスキングを１時間、ローテータで攪拌し
ながら行った。室温でローテータで攪拌した後、ビーズ
を遠心機で１０００ｒｐｍで５分間遠心沈降させ、ペレ
ットを作り、上澄みを捨てた。ブロックエースの離脱を
防ぐために、０．０５％のグルタールアルデヒド（ＰＢ
Ｓ（ｐＨ７．２）希釈液）で固定を行った。室温でロー
テータで攪拌した後、ビーズを遠心機で１０００ｒｐｍ
で５分間遠心沈降させ、ペレットを作り、上澄みを捨て
た。グルタールアルデヒドの活性残基を不活化するため
に、１％ブロックエース溶液（ｗ／ｖ）でマスキングを
行い、その後、０．４％ブロックエース液中で保存し
た。

【００２２】参考例２（肺吸虫抗原固定セラミックス−
ポリマー複合粒子の製造） 抗原タンパク量２５μｇ／ｍｌを用いた以外は、参考例
１と同様にして肺吸虫抗原固定セラミックス−ポリマー
複合粒子を製造した。

【００２３】参考例３（インフルエンザ抗原固定セラミ
ックス−ポリマー複合粒子の製造） Ａ型インフルエンザ抗原２０μｇ／ｍｌを用いた以外
は、参考例１と同様にしてインフルエンザ抗原固定セラ
ミックス−ポリマー複合粒子を製造した。

【００２４】実施例１ （１）日本脳炎特異的ＩｇＭ測定プレートの作製 ニュートラアビジン（ＰＩＥＲＣＥ社製）を２５μｇ／
ｍｌに炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で希釈した溶液をグラ
イナー社製の９６個（１２個×８個）のＶ形穴を有する
マイクロタイタープレートの各穴に５０μｌ加え、室温
で１時間静置した後、溶液を捨てた。こうして得られた
アビジン固定プレートの各穴をイオン交換水で洗浄後、
ブロックエース（大日本製薬株式会社）の４倍希釈液
〔ｐＨ７．２のリン酸緩衝液（以下、ＰＢＳと略すこと
がある）中１％重量／容量〕を各穴に１００μｌ加え、
室温で１時間静置し、ブロックエースの希釈液を捨てた
後、自然乾燥してアビジン固定プレートを得た。このア
ビジン固定プレートの各穴に、抗ヒトＩｇＭビオチン標
識抗体０．５ｍｇ／ｍｌを２０００倍〜１６０００倍ま
で倍々希釈で抗体濃度を変化したものを５０μｌずつ入
れた。室温で１時間静置し、アビジンとビオチンの結合
を行い、日本脳炎特異的ＩｇＭ測定プレートを作製し
た。

【００２５】（２）患者血清の測定 日本脳炎患者の血清（ＨＩ価３２０）を１００倍に希釈
し、上記（１）で作製したプレートの第１〜第１２番目
の穴まで倍々希釈を行い、各穴に被検血清希釈物５０μ
ｌを入れた。この状態で室温で１時間静置した後、プレ
ートをイオン交換水で洗浄し、次いで、参考例１で調製
した日本脳炎北京株固定セラミックス−ポリマー複合粒
子の０．１％溶液を１００μｌずつ各穴に加え、静置
し、１時間後に凝集像の判定を行った。ビオチン標識抗
体の固定濃度２０００倍及び４０００倍では被検血清希
釈倍率２０４８００まで明確な陽性凝集像を示した。ま
た、ビオチン標識抗体の固定濃度８０００倍及び１６０
００倍においても被検血清希釈倍率１０２４００倍まで
明確な陽性凝集像が認められた。また、この凝集像は１
週間後においても変化を起こさなかった。

【００２６】実施例２ （１）日本脳炎特異的ＩｇＭ測定プレートの作製 ウルトラアビジン（ Leinco Technologies, Inc.製）を
５μｇ／ｍｌに炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で希釈した溶
液をグライナー社製の９６個（１２個×８個）のＶ形穴
を有するマイクロタイタープレートの各穴に５０μｌ加
え、室温で１時間静置した。その後、イオン交換水で５
回洗浄し、自然乾燥してアビジン固定プレートを得た。
このアビジン固定プレートの各穴に、抗ヒトＩｇＭビオ
チン標識抗体０．５ｍｇ／ｍｌを２０００倍〜１６００
０倍まで倍々希釈で抗体濃度を変化したものを５０μｌ
ずつ入れた。室温で１時間静置し、アビジンとビオチン
の結合を行い、日本脳炎特異的ＩｇＭ測定プレートを作
製した。

【００２７】（２）患者血清の測定 実施例１で用いたのと同じ日本脳炎患者血清（ＨＩ価３
２０）及び日本脳炎北京株固定セラミックス−ポリマー
複合粒子を用いて、実施例１と全く同様にして凝集試験
を行い、凝集像の判定を行った。ビオチン標識抗体の固
定濃度２０００倍では被検血清希釈倍率２０４８００ま
で明確な陽性凝集像を示した。また、ビオチン標識抗体
の固定濃度４０００倍では被検血清希釈倍率１０２４０
０倍、８０００倍では被検血清希釈倍率５１２００倍、
１６０００倍においても被検血清希釈倍率２５６００倍
まで明確な陽性凝集像が認められた。また、この凝集像
は１週間後においても変化を起こさなかった。この結果
は、実施例１の結果には若干劣るものの充分な感度を有
することを示すものである。

【００２８】実施例３ （１）日本脳炎特異的ＩｇＭ測定プレートの作製 ウルトラアビジン（ Leinco Technologies, Inc.製）を
１００μｇ／ｍｌにリン酸緩衝液（以下、ＰＢＳと略す
ことがある。ｐＨ７．２）で希釈した溶液をグライナー
社製の９６個（１２個×８個）のＶ形穴を有するマイク
ロタイタープレートの各穴に５０μｌ加え、室温で１時
間静置した。その後、イオン交換水で５回洗浄し、０．
１％グルタールアルデヒド溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）
を各穴に５０μｌ加え、室温で１時間静置し、溶液を捨
てた。こうして得られたアビジン固定プレートの各穴を
イオン交換水で洗浄後、ブロックエース（大日本製薬株
式会社）の４倍希釈液（ｐＨ７．２のＰＢＳ中１％重量
／容量）を各穴に１００μｌ加え、室温で１時間静置
し、ブロックエースの希釈液を捨てた後、自然乾燥して
アビジン固定プレートを得た。このアビジン固定プレー
トの各穴に、抗ヒトＩｇＭビオチン標識抗体０．５ｍｇ
／ｍｌを２０００倍〜１６０００倍まで倍々希釈で抗体
濃度を変化したものを５０μｌずつ入れた。室温で１時
間静置し、アビジンとビオチンの結合を行い、日本脳炎
特異的ＩｇＭ測定プレートを作製した。

【００２９】（２）患者血清の測定 日本脳炎患者の血清（ＨＩ価３２０）を１００倍に希釈
し、上記（１）で作製したプレートの第１〜第１２番目
の穴まで倍々希釈を行い、各穴に被検血清希釈物５０μ
ｌを入れた。この状態で室温で１時間静置した後、プレ
ートをイオン交換水で洗浄し、次いで、参考例１で調製
した日本脳炎北京株固定セラミックス−ポリマー複合粒
子の０．１％溶液を１００μｌずつ各穴に加え、静置
し、１時間後に凝集像の判定を行った。ビオチン標識抗
体の固定濃度２０００倍及び４０００倍では被検血清希
釈倍率２０４８００まで明確な陽性凝集像を示した。ま
た、ビオチン標識抗体の固定濃度８０００倍及び１６０
００倍においても被検血清希釈倍率１０２４００倍まで
明確な陽性凝集像が認められた。また、この凝集像は１
週間後においても変化を起こさなかった。

【００３０】実施例４ （１）日本脳炎特異的ＩｇＭ測定プレートの作製 ウルトラアビジン（ Leinco Technologies, Inc.製）を
１００μｇ／ｍｌにＰＢＳ（ｐＨ７．２）で希釈した溶
液をグライナー社製の９６個（１２個×８個）のＶ形穴
を有するマイクロタイタープレートの各穴に５０μｌ加
え、室温で１時間静置し、溶液を捨てた。こうして得ら
れたアビジン固定プレートの各穴をイオン交換水で洗浄
後、ブロックエース（大日本製薬株式会社）の４倍希釈
液（ｐＨ７．２のＰＢＳ中１％重量／容量）を各穴に１
００μｌ加え、室温で１時間静置し、ブロックエースの
希釈液を捨てた後、自然乾燥してアビジン固定プレート
を得た。このアビジン固定プレートの各穴に、抗ヒトＩ
ｇＭビオチン標識抗体０．５ｍｇ／ｍｌを２０００倍〜
１６０００倍まで倍々希釈で抗体濃度を変化したものを
５０μｌずつ入れた。室温で１時間静置し、アビジンと
ビオチンの結合を行い、日本脳炎特異的ＩｇＭ測定プレ
ートを作製した。

【００３１】（２）患者血清の測定 実施例１で用いたのと同じ日本脳炎患者血清（ＨＩ価３
２０）及び日本脳炎北京株固定セラミックス−ポリマー
複合粒子を用いて、実施例１と全く同様にして凝集試験
を行い、凝集像の判定を行った。ビオチン標識抗体の固
定濃度２０００倍及び４０００倍では被検血清希釈倍率
２０４８００まで明確な陽性凝集像を示した。また、ビ
オチン標識抗体の固定濃度８０００倍及び１６０００倍
においても被検血清希釈倍率１０２４００倍まで明確な
陽性凝集像が認められた。また、この凝集像は１週間後
においても変化を起こさなかった。

【００３２】実施例５ （１）肺吸虫特異的ＩｇＧ測定プレートの作製 ウルトラアビジン（ Leinco Technologies, Inc.製）を
１００μｇ／ｍｌにＰＢＳ（ｐＨ７．２）で希釈した溶
液をグライナー社製の９６個（１２個×８個）のＶ形穴
を有するマイクロタイタープレートの各穴に２５μｌ加
え、室温で１時間静置した。その後、イオン交換水で５
回洗浄し、０．１％グルタールアルデヒド溶液（ＰＢ
Ｓ、ｐＨ７．２）を各穴に５０μｌ加え、室温で１時間
静置した。こうして得られたアビジン固定プレートの各
穴をイオン交換水で洗浄後、ブロックエース（大日本製
薬株式会社）（ｐＨ７．２のＰＢＳ中２％重量／容量）
を各穴に１００μｌ加え、室温で１時間静置し、ブロッ
クエースを捨てた後、自然乾燥してアビジン固定プレー
トを得た。このアビジン固定プレートの各穴に、抗ヒト
ＩｇＧビオチン標識抗体０．５ｍｇ／ｍｌを４００倍に
希釈したものを５０μｌずつ入れた。室温で１時間静置
し、アビジンとビオチンの結合を行い、肺吸虫特異的Ｉ
ｇＧ測定プレートを作製した。

【００３３】（２）肺吸虫患者の血清の測定 肺吸虫陽性血清を１０００倍に希釈し、上記（１）で作
製したプレートの第１〜第１２番目の穴まで倍々希釈を
行い、各穴に被検血清希釈物５０μｌを入れた。この状
態で室温で１時間静置した後、プレートをイオン交換水
で洗浄し、次いで、参考例２で調製した肺吸虫抗原固定
セラミックス−ポリマー複合粒子の０．１％溶液を１０
０μｌずつ各穴に加え、静置し、１時間後に凝集像の判
定を行った。結果は、２０４８００倍希釈まで明瞭な陽
性凝集像を示した。

【００３４】実施例６ （１）肺吸虫特異的ＩｇＥ測定プレートの作製 ウルトラアビジン（ Leinco Technologies, Inc.製）を
１００μｇ／ｍｌにＰＢＳ（ｐＨ７．２）で希釈した溶
液をグライナー社製の９６個（１２個×８個）のＶ形穴
を有するマイクロタイタープレートの各穴に２５μｌ加
え、室温で１時間振盪した。その後、イオン交換水で５
回洗浄し、０．１％グルタールアルデヒド溶液（ＰＢ
Ｓ、ｐＨ７．２）を各穴に５０μｌ加え、室温で１時間
静置した。こうして得られたアビジン固定プレートの各
穴をイオン交換水で洗浄後、ブロックエース（大日本製
薬株式会社）（ｐＨ７．２のＰＢＳ中２％重量／容量）
を各穴に１００μｌ加え、室温で１時間静置し、ブロッ
クエースを捨てた後、自然乾燥してアビジン固定プレー
トを得た。このアビジン固定プレートの各穴に、抗ヒト
ＩｇＥビオチン標識抗体０．５ｍｇ／ｍｌを２００倍に
希釈したものを５０μｌずつ入れた。室温で１時間静置
し、アビジンとビオチンの結合を行い、肺吸虫特異的Ｉ
ｇＥ測定プレートを作製した。

【００３５】（２）患者血清の測定 肺吸虫陽性血清を１０倍に希釈し、上記（１）で作製し
たプレートの第１〜第１２番目の穴まで倍々希釈を行
い、各穴に被検血清希釈物５０μｌを入れた。この状態
で室温で１時間静置した後、プレートをイオン交換水で
洗浄し、次いで、参考例２で調製した肺吸虫抗原固定セ
ラミックス−ポリマー複合粒子の０．１％溶液を１００
μｌずつ各穴に加え、静置し、１時間後に凝集像の判定
を行った。結果は、１６０倍希釈まで明瞭な陽性像を示
した。

【００３６】実施例７ （１）インフルエンザ抗原特異的ＩｇＡ測定プレートの
作製 実施例１（１）と同様にしてアビジンを吸着させ、抗ヒ
トＩｇＡビオチン標識抗体を結合させることにより、イ
ンフルエンザ抗原特異的ＩｇＡ測定プレートを作製し
た。

【００３７】（２）血清中のＩｇＡの測定 健常人の鼻腔に市販のインフルエンザワクチンを左右
０．２５ｍｌずつスプレー式噴霧器で投与し、顔を仰向
けにして左右鼻腔より生理食塩水を２ｍｌずつ入れ、鼻
先を閉じて頭を上下に数回ふった後、左及び右の鼻腔よ
り試験管に生理食塩水を採取して検体とする。検体は、
噴霧前、噴霧後１週間、２週間、３週間、４週間と経時
的に採取した。試験管内に採取した鼻汁生理食塩水溶液
は、超音波処理を行い、その後２０００回転で３分間遠
心分離を行い、上澄みを採取した。こうして採取した上
澄み中の総ＩｇＡ量をネフロメータで測定した。次に、
特異的ＩｇＡを測定する。総ＩｇＡ量を測定し、検体濃
度をＩｇＡ５ｍｇ／ｄｌにそろえ、上記（１）で作製し
たプレートの各穴に入れ、参考例３で調製したインフル
エンザ抗原固定セラミックス−ポリマー複合粒子の０．
１％溶液を１００μｌずつ各穴に加え、静置し、１時間
後に凝集像の判定を行った。その結果、市販ワクチン投
与前の鼻汁では、ビーズ抗体価は２単位未満であった
が、投与後１週間では６４単位、２週間では１２８単
位、３週間では６４単位、４週間では３２単位であっ
た。

【００３８】実施例８ （１）日本脳炎特異的ＩｇＭ測定プレートの作製 ウルトラアビジン（ Leinco Technologies, Inc.製）を
２５μｇ／ｍｌに炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で希釈した
溶液をグライナー社製の９６個（１２個×８個）のＶ形
穴を有するマイクロタイタープレートの各穴に５０μｌ
加え、室温で１時間静置し、溶液を捨てた。こうして得
られたアビジン固定プレートの各穴をイオン交換水で洗
浄後、ブロックエース（大日本製薬株式会社）の４倍希
釈液（ｐＨ７．２のＰＢＳ中１％重量／容量）を各穴に
１００μｌ加え、室温で１時間静置し、ブロックエース
希釈液を捨てた後、自然乾燥してアビジン固定プレート
を得た。このアビジン固定プレートの各穴に、抗ヒトＩ
ｇＭビオチン標識抗体０．５ｍｇ／ｍｌを２０００倍〜
１６０００倍まで倍々希釈で抗体濃度を変化したものを
５０μｌずつ入れた。室温で１時間静置し、アビジンと
ビオチンの結合を行い、日本脳炎特異的ＩｇＭ測定プレ
ートを作製した。 （２）日本脳炎特異的ＩｇＧ測定プレートの作製 上記（１）において、抗ヒトＩｇＭビオチン標識抗体の
代わりに抗ヒトＩｇＧビオチン標識抗体を用いた以外
は、同様にして日本脳炎特異的ＩｇＧ測定プレートを作
製した。

【００３９】（３）患者血清の測定 この実施例では、日本脳炎ウイルスとデング熱ウイルス
とが類似構成のため、日本脳炎患者血清及びデング熱患
者血清について、日本脳炎特異的ＩｇＧ及びＩｇＭの測
定を行い、その鑑別及び確定診断を行う。日本脳炎ウイ
ルス抗原としては、日本脳炎ウイルスＢｅｉｊｉｎｇ−
１株を用いた。上記（１）及び（２）で作製したプレー
トを用いて、実施例１と全く同様にして日本脳炎患者及
びデング熱患者血清について、日本脳炎特異的ＩｇＭ及
びＩｇＧの力価をそれぞれ測定した。ＩｇＧプレートの
凝集反応だけでは、どちらも反応を起こし、判別できな
いが、ＩｇＭプレートの凝集反応も行うと、日本脳炎患
者の血清にだけ凝集反応が起こった。したがって、Ｉｇ
ＧプレートとＩｇＭプレートを組み合わせて用いること
により、構成の類似した日本脳炎とデング熱の確定診断
を行うことができる。

【００４０】比較例１ 日本脳炎患者の第３病日、第６病日及び第９病日の血清
を用い、参考例１で作製したビーズを用い、従来法によ
るcapture ＥＬＩＳＡ法によりＩｇＭを測定したとこ
ろ、第３病日では血清希釈倍率５０倍以下で測定限界で
あった。第６病日で抗体価は２００倍、第９病日で１６
００倍であった。一方、実施例２（１）で作製したＩｇ
Ｍ測定用プレート用いて実施例２（２）により測定した
場合、第３病日で血清希釈倍率８０倍まで抗血清の抗体
価の測定ができた。また、第６病日では抗体価２５６０
倍、第９病日で１２８００倍まで測定を行うことができ
た。したがって、本発明によれば、従来のＥＬＩＳＡ法
に比べてはるかに高感度な測定を行うことができる。

【００４１】

【発明の効果】本発明によれば、簡単な操作で、しかも
迅速に高感度で生物学的液体中の抗原又は抗体を検出す
ることができる凝集試験用プレートを提供することがで
き、該プレートを用いて抗原又は抗体を容易に高い精度
で検出することができ、免疫グロブリンクラスの判別を
容易に高精度で行うことができ、感染の確定診断を行う
ことができる。また、本発明の凝集試験用プレートと、
ビオチン標識抗体又は抗原と、粒状固定化抗原又は抗体
とからなる抗原又は抗体の検出用キットを提供すること
により、特別の熟練検査技師の居ない小さな診療所や個
人病院においても容易に抗原又は抗体を検出することが
可能となる。

フロントページの続き (56)参考文献 特開 平５−149950（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−35752（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−235351（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−30667（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−66871（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−236353（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−223815（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−63758（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−296151（ＪＰ，Ａ) 特開 平９−133683（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/53 - 33/579

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 底部の断面形状がＶ字形、Ｕ字形又はそ
   の変形である穴を複数個有するプレートの各穴の底部の
   内側表面にアビジン若しくはストレプトアビジン又はこ
   れらの誘導体を付着させたことを特徴とする凝集試験用
   プレート。
2. 【請求項２】 プレートの各穴に１μｇ／ｍｌ〜２００
   μｇ／ｍｌの濃度に調整した水溶液でアビジン若しくは
   ストレプトアビジン又はこれらの誘導体を付着させた請
   求項１記載の凝集試験用プレート。
3. 【請求項３】 アビジン若しくはストレプトアビジン又
   はこれらの誘導体を付着させた後、ブロッキング剤で処
   理した請求項１記載の凝集試験用プレート。
4. 【請求項４】 さらにビオチン標識抗原又は抗体を反応
   させた請求項１記載の凝集試験用プレート。
5. 【請求項５】 ビオチン標識抗体がビオチン標識抗Ｉｇ
   Ｇ抗体、ビオチン標識抗ＩｇＭ抗体、ビオチン標識抗Ｉ
   ｇＥ抗体又はビオチン標識抗ＩｇＡ抗体である請求項４
   記載の凝集試験用プレート。
6. 【請求項６】 底部の断面形状がＶ字形、Ｕ字形又はそ
   の変形である穴を複数個有するプレートの各穴の底部に
   アビジン若しくはストレプトアビジン又はこれらの誘導
   体の溶液を満たし、その溶液を捨てた後、プレートを乾
   燥させることを特徴とする凝集試験用プレートの製造方
   法。
7. 【請求項７】 アビジン若しくはストレプトアビジン又
   はこれらの誘導体の溶液を捨てた後、ブロッキング剤で
   処理し、そのブロッキング剤を捨てた後、プレートを乾
   燥させる請求項６記載の凝集試験用プレートの製造方
   法。
8. 【請求項８】 請求項１記載の凝集試験用プレートの各
   穴の底部の内側表面に付着したアビジン若しくはストレ
   プトアビジン又はこれらの誘導体にビオチン標識抗原又
   は抗体を反応させた後、各穴に被検生物学的液体を入
   れ、さらに粒状固定化抗体又は抗原を加えて凝集反応を
   観察することを特徴とする抗原又は抗体の検出方法。
9. 【請求項９】 請求項１記載の凝集試験用プレートと、
   ビオチン標識抗原又は抗体と、粒状固定化抗原又は抗体
   とから成ることを特徴とする抗原又は抗体の検出用キッ
   ト。
10. 【請求項１０】 請求項１記載の凝集試験用プレートの
    各穴の底部の内側表面に付着したアビジン若しくはスト
    レプトアビジン又はこれらの誘導体にビオチン標識抗Ｉ
    ｇＧ抗体、ビオチン標識抗ＩｇＭ抗体、ビオチン標識抗
    ＩｇＥ抗体及びビオチン標識抗ＩｇＡ抗体のうちの１種
    を反応させたプレートを少なくとも１種類準備し、その
    プレートの各穴に被検生物学的液体を入れ、さらに粒状
    固定化抗原を加えて凝集反応を観察することを特徴とす
    る免疫グロブリンクラスの検定方法。