CN116539897A - 用于生长分化因子15检测的磁微球电化学发光免疫检测试剂盒及其该试剂盒制备 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及电化学检测领域，特别涉及用于生长分化因子15检测的磁微球电化学发光免疫检测试剂盒及其该试剂盒制备。本发明提供了组合物及其在制备GDF‑15检测试剂盒中的应用。GDF‑15分子量小，做成商业化诊断产品较难满足重复性、稳定性要求。本发明将抗体‑抗原反应的高度特异性与三联吡啶钌发光的高度灵敏性结合起来，利用三联吡啶钌在DBAE下产生的光子以检测产物浓度，提高了灵敏度、稳定性、重复性，缩短反应时间、抗干扰性高、操作简单。

Description

用于生长分化因子15检测的磁微球电化学发光免疫检测试剂 盒及其该试剂盒制备
技术领域
本发明涉及电化学检测领域，特别涉及用于生长分化因子15检测的磁微球电化学发光免疫检测试剂盒及其该试剂盒制备。
背景技术
GDF-15是转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族亚群中的骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)家族成员之一，参与调节多种细胞内的生物过程。GDF-15是一种分泌型蛋白，其前体蛋白含308个氨基酸，N端含有12个氨基酸的疏水性信号肽，中间(193～196位氨基酸，PXXR)为保守的蛋白酶水解位点，C端含有保守的胱氨酸结(cystine knot)结构域。GDF-15前体蛋白经酶切后成为112个氨基酸的成熟蛋白，通过二硫键连接成具有生物活性的同源二聚体，相对分子质量为25000。
GDF-15是一种应激反应蛋白，生理情况下GDF-15在前列腺和胎盘中高表达，在多数其他组织中微弱表达，包括心脏组织。但是在病理和环境应激情况下，如缺血/再灌注损伤、心脏高压力负荷、心力衰竭和动脉粥样硬化等，GDF-15在心肌细胞中大量表达，对心肌细胞结构和凋亡程序发挥调节作用，特殊生理病理下，GDF-15表达量也显著上升如手术、缺血、缺氧等引起的心肌、肾、肺或肝损伤，前列腺癌、乳腺癌、结肠癌等肿瘤病灶部位也存在高表达。
心力衰竭(简称心衰)是由于任何心脏结构或功能异常导致心室充盈或射血能力受损的一组复杂临床综合征，其主要临床表现为呼吸困难和乏力(活动耐量受限)，以及液体潴留(肺淤血和外周水肿)。心衰为各种心脏疾病的严重和终末阶段，发病率高，是当今最重要的心血管病之一。
依据左心室射血分数(LVEF)，心衰可分为LVEF降低的心衰(heart failure withreduced left ventricular ejection fraction，HF-REF)和LVEF保留的心衰(heartfailure with preserved left ventricular ejection fraction，HF-PEF)。LVEF是心衰患者分类的重要指标，也与预后及治疗反应相关。
射血分数保持的心力衰竭是一种具有许多潜在病因和许多病理生理学改变而导致异质性疾病状态的综合征。HFpEF患者的心肌重构和功能障碍包括心肌肥厚、进行性心肌纤维化和心肌细胞刚度增加。细胞外基质积累和纤维化经常被描述，并可能显著导致左室充盈受损，这是疾病的一个标志。纤维化是夸大胶原合成和不变或抑制胶原降解之间不平衡的结果。
GDF-15可作为一种新的评价心肌纤维化的生物标志物。GDF-15的表达与房颤患者的心脏纤维化程度呈正相关。在终末期非缺血性扩张型心肌病患者中，血清GDF-15水平与心肌纤维化的严重程度相关。GDF-15的表达在心肌细胞中被强烈诱导，以应对代谢应激，如心脏缺血(一氧化氮依赖)、组织损伤或压力过载状态(血管紧张素2依赖)。血清GDF-15水平与老年患者左室质量呈正相关，血浆GDF-15高水平是高血压患者左室肥厚的独立预测因子。
目前关于GDF-15与心力衰竭、心房颤动等疾病的关系还需要更长期、样本更大的前瞻性临床研究，GDF-15在心血管疾病中的作用机制和信号通路以及其是否可作为心血管疾病的治疗靶点也仍待探讨。未来，GDF-15很有可能作为心血管疾病的新诊断标志物以及危险分层的重要评价指标。除此之外，GDF-15还可用于各种脏器的纤维化，包括且不限于：心脏、肾脏、肝脏等。
到目前为止，用于检测人血清中生长分化因子15(GDF-15)的方法主要有：酶联免疫法(ELISA)和酶促磁微粒化学发光。GDF-15分子量较小，且在各个组织器官中都有，正常人当中也有，因此其检测数据基础数据较高，现有技术及产品检测的重复性、灵敏度、特异性、稳定性和检测时间长等不能满足商业化的临床诊断的需要。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了用于生长分化因子15检测的磁微球电化学发光免疫检测试剂盒及其该试剂盒制备。本发明提供了组合物及其在制备生长分化因子15(GDF-15)磁微粒电化学发光检测试剂盒中的应用。本发明通过实验发现将抗体-抗原反应的高度特异性与三联吡啶钌发光的高度灵敏性结合起来，利用三联吡啶钌在DBAE下产生的光子以检测产物浓度，具有灵敏度更高、反应时间短、操作简单、抗干扰性高的特点。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了组合物，包括含有生物素标记的可特异性结合GDF-15的抗体、含有三联吡啶钌标记的可特异性结合GDF-15的抗体和链霉亲和素超顺磁微球；
所述链霉亲和素超顺磁微球的粒径包括1.0～6.0μm。
在本发明的一些具体实施方案中，所述可特异性结合GDF-15的抗体包括抗GDF-15单克隆抗体。
在本发明的一些具体实施方案中，可特异性结合GDF-15的抗体分子表面的生物素分子标记量包括2～5个。
在本发明的一些具体实施方案中，所述可特异性结合GDF-15的抗体包括抗GDF-15单克隆抗体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述可特异性结合GDF-15的抗体分子表面的钌分子标记量包括2～10个。
在本发明的一些具体实施方案中，所述链霉亲和素超顺磁微球的粒径包括3μm。
在本发明的一些具体实施方案中，所述组合物还包括缓冲液；
所述缓冲液包括：
20mmol/L～200mmol/L磷酸盐缓冲液，pH＝7.4；和/或
20mmol/L～200mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液，pH＝7.4。
在本发明的一些具体实施方案中，所述组合物还包括第一清洗液；
所述第一清洗液包括2-N-二丁氨基乙醇；
所述第一清洗液还包括磷酸盐缓冲液。
在本发明的一些具体实施方案中，所述第一清洗液包括浓度90mmol/L的二丁基乙醇胺，其中含浓度300mmol/L的磷酸盐缓冲液。
在本发明的一些具体实施方案中，所述组合物还包括稳定剂；
所述稳定剂包括甘氨酸、蛋氨酸、PEG20000、葡聚糖200000、普鲁兰多糖或聚乙烯比咯烷酮360中的一种或多种。
在本发明的一些具体实施方案中，所述稳定剂包括：
在本发明的一些具体实施方案中，所述稳定剂与所述缓冲液的体积比为5：100。
在本发明的一些具体实施方案中，所述组合物还包括第二清洗液；
所述第二清洗液包括清洗液1、清洗液2、清洗液3和/或清洗液4；
所述清洗液1包括聚合度为14的异辛醇聚氧基乙烯醚、聚合度为9的月桂醇聚氧乙烯醚和/或Proclin950；
所述清洗液2包括氢氧化钠、氯化钠和/或次氯酸钠溶液；
所述清洗液3包括聚合度为14的异辛醇聚氧基乙烯醚、聚合度为9的月桂醇聚氧乙烯醚和/或氢氧化钾；
所述清洗液4包括85wt％的磷酸、二氯乙酰胺、聚合度为14的异辛醇聚氧基乙烯醚、聚合度为9的月桂醇聚氧乙烯醚、磷酸二氢钾和/或二丁基乙醇胺。
在本发明的一些具体实施方案中，所述清洗液1包括：
聚合度为14的异辛醇聚氧基乙烯醚 1.0g/L
聚合度为9的月桂醇聚氧乙烯醚 10g/L
Proclin950 75g/L
在本发明的一些具体实施方案中，所述清洗液2包括：
氢氧化钠 120g/L
氯化钠 87.75g/L
次氯酸钠溶液 25g/L
在本发明的一些具体实施方案中，所述清洗液3包括：
聚合度为14的异辛醇聚氧基乙烯醚 1.0g/L
聚合度为9的月桂醇聚氧乙烯醚 10g/L
氢氧化钾 9.856g/L
在本发明的一些具体实施方案中，所述清洗液4包括：
本发明还提供了所述组合物的制备方法，所述含有生物素标记的可特异性结合GDF-15的抗体的制备方法包括：取可特异性结合GDF-15的抗体和生物素，混匀，反应结束后去除未标记的生物素，制得所述含有生物素标记的可特异性结合GDF-15的抗体；
所述含有三联吡啶钌标记的可特异性结合GDF-15的抗体的制备方法包括：取可特异性结合GDF-15的抗体和三联吡啶钌，混匀，反应结束后去除未标记的三联吡啶钌，制得所述含有三联吡啶钌标记的可特异性结合GDF-15的抗体；
所述链霉亲和素超顺磁微球的制备方法包括：取超顺磁微球，包被链霉亲和素，制得所述链霉亲和素超顺磁微球。
在本发明的一些具体实施方案中，所述含有生物素标记的可特异性结合GDF-15的抗体的制备方法包括：取2.0mg的用于标记生物素GDF-15抗体，使用脱盐柱PD10更换缓冲液为磷酸盐缓冲液(pH＝7.8)，使用超滤管浓缩后调整浓度为2.0mg/mL，加入80μg的生物素(使用DMF溶解)，混匀反应30分钟，使用脱盐柱PD10去除未标记的生物素，制得所述含有生物素标记的可特异性结合GDF-15的抗体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述含有三联吡啶钌标记的可特异性结合GDF-15的抗体的制备方法包括：取2.0mg的用于标记三联吡啶钌的GDF-15抗体，使用脱盐柱PD10更换缓冲液为磷酸盐缓冲液(PH＝7.8)，使用超滤管浓缩后调整浓度为2.0mg/mL，加入80μg的三联吡啶钌(使用DMF溶解)，混匀反应30分钟，使用脱盐柱PD10去除未标记的钌，制得所述含有三联吡啶钌标记的可特异性结合GDF-15的抗体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述链霉亲和素超顺磁微球为表面包裹带有链霉亲和素的超顺磁微球，所述磁微球的粒径在1.0～6.0微米，所述磁微粒包被物缓冲液为20mmol/L～200mmol/L磷酸盐缓冲液，PH＝7.4或20mmol/L～200mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液，PH＝7.4。
本发明还提供了所述组合物在制备GDF-15检测试剂盒中的应用。
本发明还提供了试剂盒，其包括所述组合物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂盒包括：GDF-15试剂Ra、GDF-15试剂Rb、链霉亲和素超顺磁微球、定标品、二丁基乙醇胺清洗液、管路清洗液。
在本发明的一些具体实施方案中，所述GDF-15试剂Ra为含生物素标记的抗GDF-15单克隆抗体，每个抗体分子表面的生物素分子标记量在2～5个，缓冲液为20mmol/L～200mmol/L磷酸盐缓冲液，PH＝7.4或20mmol/L～200mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液，PH＝7.4。
在本发明的一些具体实施方案中，所述GDF-15试剂Rb为含三联吡啶钌标记的抗GDF-15单克隆抗体，每个抗体分子表面的钌分子标记量在2～10个，缓冲液为20mmol/L～200mmol/L磷酸盐缓冲液，pH＝7.4或20mmol/L～200mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液，pH＝7.4。
在本发明的一些具体实施方案中，所述链霉亲和素超顺磁微球为表面包裹带有链霉亲和素的超顺磁微球，所述磁微球的粒径在1.0～6.0微米，所述磁微粒包被物缓冲液为20mmol/L～200mmol/L磷酸盐缓冲液，pH＝7.4或20mmol/L～200mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液，pH＝7.4。
本发明还提供了以下任意项在GDF-15检测中的应用：
(I)、所述组合物；和/或
(II)、所述试剂盒。
本发明还提供了GDF-15磁微球电化学发光检测方法，其基于如下任意项对GDF-15进行检测：
(I)、所述组合物；和/或
(II)、所述试剂盒。
本发明还提供了一种GDF-15磁微球电化学发光试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
步骤1、取待测样本15μL加入反应管中，再依次加入GDF-15试剂Ra70μL和GDF-15试剂Rb70μL，于37℃孵育9min，最后加入链霉亲和素超顺磁微球40μL，于37℃孵育9min；
步骤2、将孵育反应完成的反应管通过吸液钢针吸入电化学流通池，并被流通池的磁铁吸附；
步骤3、吸液钢针吸取第二清洗液，未结合到超顺磁微球上的标记钌的抗体和样本被清洗后，流通池加电，在DBAE存在的条件下三联吡啶钌发光。
步骤4、光电倍增管记录发光值，根据建立的标准曲线，计算样本中GDF-15的浓度。
本发明包括但不限于取得如下有益效果：
本发明将抗体-抗原反应的高度特异性与三联吡啶钌发光的高度灵敏性结合起来，利用三联吡啶钌在DBAE下产生的光子以检测产物浓度，具有灵敏度更高、反应时间短、操作简单、抗干扰性高的特点。
提供一种生长分化因子15(GDF-15)磁微粒电化学发光试剂盒及其该试剂盒制备与检测方法，具有携带污染率低、灵敏度高、准确度高、储存效期以及开瓶效期长等优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示采用实施例7中的反应方法的线性范围；
图2示试剂瓶结构；
图3示装置结构；
图4示信号测试结果。
具体实施方式
本发明公开了用于生长分化因子15检测的磁微球电化学发光免疫检测试剂盒及其该试剂盒制备，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用方法为电化学发光法，采用吡啶钌作为化学发光标记物具有明显优势，主要表现在：稳定性更好，钌是金属离子，分子量小，不影响抗体的空间位阻。生产过程短，重复性好。检测范围宽，重复性好。电化学发光反应可控，降低信号采集难度。
磁微粒可以作为生物大分子的载体，抗体包被的磁微粒称为免疫磁微粒，由于其既有结合抗原的特性又有磁性的特点，因此，在从复杂样品中分离、纯化与浓集目的微生物、细胞和生物大分子等方面具有较多优势，包括快速、特异性强、操作简便、使用范围广等。纳米材料是20世纪90年代后得到迅猛发展的新材料，纳米磁微粒(粒径小于10nm～100nm)在磁结构和磁性方面与一般磁微粒有很大区别：纳米磁性颗粒，单位体积颗粒数目更多，比表面积更大；具有超顺磁性，磁相互作用很弱；它可在外加磁场作用下定向运动，使得某些特殊成份得以分离、浓集或纯化等。本发明建立的磁微粒化学发光法灵敏度高、特异性强、准确快速、检测时间短、检测结果具有更高的准确性与重复性。
本发明提供了一种GDF-15磁微球电化学发光试剂盒，包括：GDF-15试剂Ra、GDF-15试剂Rb、链霉亲和素超顺磁微球、定标品、二丁基乙醇胺清洗液、管路清洗液。
上述一种GDF-15磁微球电化学发光试剂盒，其中，GDF-15试剂Ra为含生物素标记的抗GDF-15单克隆抗体，每个抗体分子表面的生物素分子标记量在2～5个，所述的缓冲液为20mmol/L～200mmol/L磷酸盐缓冲液，pH＝7.4或20mmol/L～200mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液，pH＝7.4。GDF-15试剂Rb为含三联吡啶钌标记的抗GDF-15单克隆抗体，每个抗体分子表面的钌分子标记量在2～10个，所述的缓冲液为20mmol/L～200mmol/L磷酸盐缓冲液，pH＝7.4或20mmol/L～200mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液，pH＝7.4。
上述一种GDF-15磁微球电化学发光试剂盒，其中，所述链霉亲和素超顺磁微球为表面包裹带有链霉亲和素的超顺磁微球，所述磁微球的粒径在1.0～6.0微米，所述磁微粒包被物缓冲液为20mmol/L～200mmol/L磷酸盐缓冲液，pH＝7.4或20mmol/L～200mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液，pH＝7.4。
上述一种GDF-15磁微球电化学发光试剂盒，其中，所述生物素标记的GDF-15抗体为单克隆抗体；
上述一种GDF-15磁微球电化学发光试剂盒的检测方法，其中，所述清洗液为浓度90mmol/L的二丁基乙醇胺，其中含浓度300mmol/L的磷酸盐缓冲液。
一种GDF-15磁微球电化学发光试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
1)取样本15μL加入反应管中，再依次加入GDF-15试剂Ra70μL和GDF-15试剂Rb70μL，于37℃孵育9min，最后加入链霉亲和素超顺磁微球40μL，于37℃孵育9min；
2)将孵育反应完成的反应管通过吸液钢针吸入电化学流通池，并被流通池的磁铁吸附；
3)吸液钢针吸取清洗液(DBAE)，未结合到超顺磁微球上的标记钌的抗体和样本被清洗后，流通池加电，在DBAE存在的条件下三联吡啶钌发光。
4)光电倍增管记录发光值，根据建立的标准曲线，计算样本中GDF-15的浓度。
2、统计及计算模型
这样的评估通常不会对所有(即100％)待鉴定的受试者是正确的。然而可以鉴定到有统计学显著意义的受试者(例如，在人群研究中的一个群组)。是否有统计学显著性可以由本领域技术人员使用各种已知的统计学评估工具确定，如置信区间、P-值、斯氏t检验、Mann-Whitney检验等，详情可参考Dowdy和Wearden的《Statistics for Research(用于研究的统计学)》(John Wiley&Sons公司，纽约，1983)。置信区间可以设置为90％，至少95％，至少97％，至少98％或至少99％。p值可以设定为0.1、0.05、0.01、0.005或0.000l。群体可以设置为至少60％，至少70％，至少80％或至少90％的受试者可以通过本发明的方法正确鉴定。
优点和积极效果
1)电化学发光免疫分析技术具有灵敏度高、快速、准确、重复性好并安全无毒无污染等优点。鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物是最早使用的一类化学发光物质，但其应用于化学发光免疫分析，需要使用催化剂和增强剂，这将导致背景发光增强，从而限制了这一技术的灵敏度和它的应用及发展。吖啶酯发光体系简单，不需要催化剂，置于H2O2溶液中即可发光，无需催化过程、增强剂，所以降低了背景发光，提高了灵敏度且干扰作用小，但是由于吖啶酯容易水解，同时吖啶酯的发光释放迅速。发光峰值在0.4s，所以需要原位进样，对设备要求高。而三联吡啶钌易于蛋白质联结，分子量小，对联结后抗体构象影响小，标记物是金属离子，稳定性好，发光需要在加电条件下，所以发光可控。所以在GDF-15的检测上应用电化学的方法可以提高产品的灵敏度、缩短工艺标记时间，提高线性范围、缩短试验时间为临床及时应对脑外伤处理提供依据。
电化学发光标记物吡啶钌性质非常稳定，其发光效率不受温度、pH、离子强度等因素的影响。电化学发光试剂信号值与新鲜试剂相比信号值下降在3％以内。开瓶效期为三个月，2～8℃可稳定15个月以上。
发光体系 辣根酶-鲁米诺 碱性磷酸酶 电化学发光
标记时间 大于24小时 大于24小时 60分钟
试验时间 60分钟 30分钟 18分钟
试剂有效期 12个月 12个月 大于15个月
电化学标记反应迅速，整个反应只需半小时。标记效率达到70％。标记的比例可以通过投料比进行控制，提高产能50％以上。钌的分子量小(800D)空间位阻小，抗体活性好。455nm的吸收峰，可以控制投料比来控制批间差。
链霉亲和素与生物素具有高特异性的结合能力，链霉亲和素与生物素标记的高纯度抗体非共价键特异性结合，具有级联放大的作用，其反应呈高度专一性。因此，在提高灵敏度的同时，并不增加非特异性干扰，而且结合特性不会因反应试剂的高度稀释而受影响，使其在实际应用中可最大限度地降低反应试剂的非特异作用。
本发明将抗体-抗原反应的高度特异性与三联吡啶钌发光的高度灵敏性结合起来，利用三联吡啶钌在DBAE下产生的光子以检测产物浓度，具有灵敏度更高、反应时间短、操作简单、抗干扰性高的特点。
2)磁微粒选择，灵敏度高。
3)携带污染率低，灵敏度以及准确度高。
4)效期长和开瓶效期长。
使用的设备为北京联众泰克科技有限公司生产的全自动化学发光免疫分析仪(型号UD90DT)。
如无特殊说明，本发明提供的用于生长分化因子15检测的磁微球电化学发光免疫检测试剂盒及其该试剂盒制备中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1磁微粒的选择
①实验材料
名称 粒径(μm) 批号
备选磁珠1 3.0 ----
备选磁珠2 1.0 ----
备选磁珠3 6.0 ----
②仪器
③实验地点：
地点：公司研发实验室
④实验过程：
实验方法：
TSH(夹心法)、T4(竞争法)的具体实验步骤：
TSH(夹心法)：
第1步：样本50μL、含生物素化的TSH特异性单克隆抗体的Ra60μL和含钌(Ru)复合物标记的TSH特异性单克隆抗体Ra50μL一起孵育，形成抗原抗体免疫复合物。
第2步：加入含有包被链霉亲和素的磁珠微粒的磁分离试剂40μL进行孵育，让上述形成的免疫复合物通过生物素与链霉亲和素间的相互作用结合到磁珠微粒上。
第3步：孵育结束后将反应混和液吸到测量池中，磁珠微粒通过磁铁吸附到电极上，未结合的物质被清洗液洗去，电极加电压后产生化学发光，通过光电倍增管进行测定获得发光值。
主曲线信息通过试剂条码扫描入仪器后，扫描定标品信息卡，将定标品的信息和浓度扫入仪器，对主曲线进行校正获得校准曲线，软件自动通过校准曲线进行计算得到检测结果。
T4(竞争法)：
总甲状腺素(TT4)测定采用竞争法，其检测步骤如下：
第1步：样本15μL、含钌(Ru)复合物标记的T4抗体的Ra75μL一起孵育；样本中与结合蛋白结合的T4经ANS作用而释放。
第2步：加入含生物素化的T4的Rb75μL和含包被链霉亲和素的磁珠微粒的磁分离试剂30μL，生物素化的T4与未结合的标记抗体结合，形成抗体-半抗原复合物，上述形成的免疫复合物通过生物素与链霉亲和素间的相互作用结合到磁珠微粒上。
第3步：孵育结束后将反应混和液吸到测量池中，磁珠微粒通过磁铁吸附到电极上，未结合的物质被清洗液洗去，电极加电压后产生化学发光，通过光电倍增管进行测定获得发光值。
主曲线信息通过试剂条码扫描入仪器后，扫描定标品信息卡，将定标品的信息和浓度扫入仪器，对主曲线进行校正获得校准曲线，软件自动通过校准曲线进行计算得到检测结果。
用两个厂家的链霉亲和素磁珠(1、Thermo Fisher Scientific Inc；2、JSR LifeSciences)检测TSH(夹心法)和T4(竞争法)低值血清和高值血清的信号值，比较本底信号值以及信噪比。血清的浓度值由罗氏诊断的“cobas e 411”及配套试剂定值，磁珠稀释液采用罗氏磁珠稀释液。
⑤实验结果
表1 TSH(夹心法)
表2 T4(竞争法)
⑥实验结论：
从结果(表1、表2)可以看出：可见不同粒径的链霉亲和素磁珠信噪比差距明显，信噪比越大，意味着灵敏度越高，决定采用粒径3.0μm的链霉亲和素磁珠。统计学P值大于0.05，符合正态分布。
实施例2携带污染率的检测
清洗液1配方：(1L)
聚合度为14的异辛醇聚氧基乙烯醚 1.0g/L
聚合度为9的月桂醇聚氧乙烯醚 10g/L
Proclin950 75g/L
清洗液2配方：(1L)
氢氧化钠 120g/L
氯化钠 87.75g/L
次氯酸钠溶液 25g/L
清洗液3配方：(1L)
聚合度为14的异辛醇聚氧基乙烯醚 1.0g/L
聚合度为9的月桂醇聚氧乙烯醚 10g/L
氢氧化钾 9.856g/L
清洗液4配方：(1L)
携带污染率的测试流程：
携带污染率分析中需要得到三种信号值，本底测值(简称ProCellRef，为设备使用清洗液清洗并测试的本底发光值)，携带污染率高浓度测试值(简称ProCellSAP，为测试高剂量钌(浓度为1nmol/L)的发光值)，携带污染率低浓度测试值(简称ProCellCo，为高剂量钌使用后经过清洗液清洗，再次测试本底的发光值)。测试中按照清洗液(5次)、高剂量钌(3次)、清洗液(3次)放在全自动化学发光免疫分析仪(型号UD90DT)的测试位，启动测光程序。分别得到的5个ProCellRef，3个ProCellSAP，3个ProCellCo值。测定的发光值用于计算carryover，在相同的高剂量钌情况下，计算的值越小，说明清洗效果更好。
这四个清洗液即第二清洗液的使用可以减小测量池的交叉污染率从而提高GDF-15检测的准确度以及灵敏度。
携带污染率的计算公式如下：
改善前：
根据上述公式计算得到Carryover＝93.06
改善后：
根据上述公式计算得到Carryover＝30.96
从上面携带污染检测数据可以看出这四个清洗液的联合使用降低了测试的携带污染率，经统计学分析具有显著(P＜0.05)差异。携带污染率的降低意味着更高的灵敏度以及准确度。
实施例3效期和开瓶效期
我们在试剂组分中加入一种复合稳定剂，该稳定剂可以显著延长GDF-15试剂的储存效期以及开瓶效期。
该稳定剂配方如下：
合格标准：空白限需满足≤60pg/mL；线性相关系数r需满足≥0.99；准确度需满足偏差在±10％以内；精密度需满足：CV≤10％。
表3 GDF-15稀释液未添加稳定剂时试剂的实时稳定性数据
表4 GDF-15稀释液添加稳定剂(5％v/v)后试剂的实时稳定性数据
从以上数据可以看出：在未添加稳定剂之前，在第15个月，GDF-15试剂出现了线性相关系数小于0.99，且准确度偏差＞10％，表明试剂此时已经不稳定，相关性能低于了既定指标。当加入稳定剂后，无论是第15个月还是第18个月，GDF-15试剂性能均符合既定指标，可以看出稳定剂的加入，对试剂稳定性的提升有明显的作用。
表5 GDF-15稀释液未添加稳定剂时试剂的开瓶稳定性数据
表6 GDF-15稀释液添加稳定剂(5％v/v)后试剂的开瓶稳定性数据
以上数据可以看出：在未添加稳定剂之前，在第12周，GDF-15试剂出现了线性相关系数小于0.99，且准确度偏差＞10％，表明试剂此时已经不稳定，相关性能低于了既定指标。当加入稳定剂后，无论是第12周还是第24周，GDF-15试剂性能均符合既定指标，可以看出稳定剂的加入，对试剂开盖稳定性的提升有明显的作用。
实施例4生物素标记GDF-15抗体和试剂Ra的制备
用于标记生物素的GDF-15抗体购自北京缘田馨野科技有限公司，货号为YT-GDF-15-002，克隆号为7F12。
取2.0mg的用于标记生物素GDF-15抗体，使用脱盐柱PD10更换缓冲液为磷酸盐缓冲液(pH＝7.8)，使用超滤管浓缩后调整浓度为2.0mg/mL，加入80μg的生物素(使用DMF溶解)，混匀反应30分钟，使用脱盐柱PD10去除未标记的生物素，收集的抗体使用BCA法测定蛋白浓度，使用的试剂盒为Thermo的商品化试剂盒，货号为23225。使用含1％的牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)稀释标记生物素的GDF-15抗体到1mg/L，作为GDF-15试剂Ra。
实施例5钌标记GDF-15抗体和试剂Rb的制备
用于标记三联吡啶钌的GDF-15抗体购自北京缘田馨野科技有限公司，货号为YT-GDF-15-003，克隆号为3G2。
取2.0mg的用于标记三联吡啶钌的GDF-15抗体，使用脱盐柱PD10更换缓冲液为磷酸盐缓冲液(pH＝7.8)，使用超滤管浓缩后调整浓度为2.0mg/mL，加入80μg的三联吡啶钌(使用DMF溶解)，混匀反应30分钟，使用脱盐柱PD10去除未标记的钌，收集的抗体使用BCA法测定蛋白浓度，使用的试剂盒为Thermo的商品化试剂盒，货号为23225。使用含1％的牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)稀释标记钌的GDF-15抗体到1mg/L，作为GDF-15试剂Rb。
实施例6夹心法测定GDF-15
GDF-15测定采用夹心法，其检测原理如下：
1)取样本15μL加入反应管中，再依次加入实施例4中制备的GDF-15试剂Ra70μL和实施例5中制备的GDF-15试剂Rb70μL，于37℃孵育9min，最后加入链霉亲和素磁微球40μL，于37℃孵育9min；
2)将孵育反应完成的反应混合液管通过吸液钢针吸入电化学流通池，并被流通池的磁铁吸附；
3)吸液钢针吸取第二清洗液，未结合到超顺磁微球上的标记钌的抗体和样本被清洗后，流通池加电，在DBAE存在的条件下三联吡啶钌发光。
4)光电倍增管记录发光值，根据企业提供的曲线使用定标品的发光值进行校正后建立的标准曲线，计算样本中GDF-15的浓度。
第1步：取样本15μL加入反应管中，再依次加入实施例4中制备的GDF-15试剂Ra70μL和实施例5中制备的GDF-15试剂Rb70μL，于37℃孵育9min，形成抗原抗体免疫复合物。
第2步：加入包被链霉亲和素的磁珠微粒进行孵育，让上述形成的免疫复合物通过生物素与链霉亲和素间的相互作用结合到磁珠微粒上，形成反应混合液。
第3步：将上述形成的反应混合液吸到测量池中，加入第二清洗液后，结合的复合物通过磁铁吸附复合物中的磁珠微粒被吸附到电极上，未结合的物质被清洗液洗去，电极加电压后产生化学发光，通过光电倍增管进行测定获得发光值。
主曲线信息通过试剂条码扫描入仪器后，扫描定标品信息卡，将定标品的信息和浓度扫入仪器，对主曲线进行校正获得校准曲线。上述测得的发光值通过校准曲线软件自动进行计算得到检测结果。
效果例1空白限测试
以实施例7中反应方法，用零浓度稀释液作为样本，得到20次测量结果的RLU值(相对发光值)，计算其平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD，同时相邻浓度的样品重复测试2次，根据零浓度稀释液和相邻低浓度样品之间的浓度-RLU进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD的RLU值代入上述方程中，求出对应的浓度值即为空白限(表7，表10)。
表7实施例7中反应方法空白限
效果例2线性范围的验证
以实施例6中反应方法，将接近线性范围(20000pg/mL)上限的高值样品按一定比例稀释为6种浓度，其中低值浓度的样品须接近100pg/mL。对每一浓度的样品均重复检测2次，计算其平均值，即为实测浓度，将稀释浓度和实测浓度用最小二乘法进行直线拟合，并计算线性相关系数r，r不小于0.99。稀释浓度与实测浓度的直线拟合结果如图1，表8所示。
表8实施例7中反应方法
项目 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5 样本6
稀释浓度 100 400 2500 5000 10000 20000
实测浓度1 104 396 2480 5026 9876 19856
实测浓度2 102 388 2508 5003 9912 18737
实测浓度 97 392 2494 5014.5 9894 19296.5
对比例1反应体系的对比
目前市面上电化学发光免疫分析方法大多采用吡啶钌复合物和三丙胺(TPA)的反应体系，比如罗氏诊断，本发明电化学发光免疫分析方法选择了吡啶钌复合物和2-N-二丁氨基乙醇(DBAE)的反应体系。其优点如下：
1、DBAE水溶解度更好，20℃时溶解度约为4g/L；三丙胺(TPA)20℃时的溶解度约为2.6g/L；如果采用三丙胺(TPA)的反应体系，三丙胺的工作浓度约为26g/L，是其溶解度的10倍，为了增加三丙胺的(TPA)的溶解度，就需要添加表面活性剂和磷酸，此外还需要满足一定的搅拌时间和搅拌速度，大大增加生产工艺的难度。
2、三丙胺(TPA)毒性分级为高毒，DBAE毒性分级为中毒，使用DBAE能减小底物液的毒性，对检验工作者健康以及环境更为友好。
3、DBAE和吡啶钌的反应体系发光效率更高，分别使用2g/L的DBAE缓冲液以及2g/L的三丙胺(TPA)进行信号测试结果如图4所示。
同等浓度的DBAE的发光强度大约是同等浓度三丙胺(TPA)的6倍。
此外在研究中我们还发现使用吡啶钌和DBAE的反应体系能够提高测试的灵敏度，我们分别用这两个体系检测了生长分化因子15(GDF-15)灵敏度，以空白限作为反应灵敏度的指标，测试方法如下：用零浓度稀释液作为样本，得到20次测量结果的RLU值(相对发光值)，计算其平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD，同时相邻浓度的样品重复测试2次，根据零浓度稀释液和相邻低浓度样品之间的浓度-RLU进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD的RLU值代入上述方程中，求出对应的浓度值即为空白限。吡啶钌复合物和三丙胺(TPA)反应体系灵敏度如表9所示，吡啶钌复合物和二丁基乙醇胺(DBAE)反应体系灵敏度如表10、表7所示。
表9吡啶钌复合物和三丙胺(TPA)反应体系灵敏度
表10吡啶钌复合物和二丁基乙醇胺(DBAE)反应体系灵敏度
由此可见专利中声明的方法比常规方法具有更高的灵敏度。
由于采用DBAE和吡啶钌的反应体系，26g/L的DBAE与吡啶钌反应产生的信号是26g/LTPA与吡啶钌反应产生信号的4倍，所以需要更少量的抗体就能检测到信号。
基于实施例5中方法收集的抗体使用BCA法测定蛋白浓度，使用的试剂盒为Thermo的商品化试剂盒，货号为23225。
由此可见本发明中声明的方法比常规方法具更节约抗体。
对比例2试剂盒的情况对比
如实施例7所述，GDF-15磁微球电化学发光试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
1)取样本15μL加入反应管中，再依次加入GDF-15试剂Ra 70μL和GDF-15试剂Rb 70μL，于37℃孵育9min，最后加入链霉亲和素超顺磁微球40μL，于37℃孵育9min；
2)将孵育反应完成的反应管通过吸液钢针吸入电化学流通池，并被流通池的磁铁吸附；
3)吸液钢针吸取第二清洗液，未结合到超顺磁微球上的标记钌的抗体和样本被清洗后，流通池加电，在DBAE存在的条件下三联吡啶钌发光。
4)光电倍增管记录发光值，根据建立的标准曲线，计算样本中GDF-15的浓度。
酶联免疫吸附实验方法试剂盒为R&Dsystem公司的Human GDF-15 QuantikineELISAKit(目录号DGD150)：
1)取用需要的反应孔，加入100μL的稀释液，然后加入1：8稀释的血清、标准品50μL，在500RPM的水平振荡器上室温孵育120min；
2)去掉孵育的液体，使用含表面活性剂的清洗液体清洗4次后，加入200μL的GDF-15的辣根酶抗体试剂，在500RPM的水平振荡器上室温孵育60min；
3)去掉孵育的液体，使用含表面活性剂的清洗液体清洗4次后，加入底物200μL，避光室温孵育30分钟后加入50μL终止液。
4)使用酶标仪，选择450nm滤光片，测试每个样品孔的OD值。
5)根据标准品建立的标准曲线，计算样本中GDF-15的浓度。
表11汇总对比的试剂盒的情况
本例 对照组1
方法学 电化学发光夹心法 酶联免疫吸附试验
是否要预稀释 否 是
灵敏度 11.77～54.4pg/mL 16pg/mL
线性范围 〔100-20000.0〕pg/mL 〔187.2-12000.0〕pg/mL
检测时间 18分钟 3.5小时
抗体处理 60分钟 大于10小时
上述步骤表明，本发明采用的夹心法的反应模式，利用磁微球电化学的原理，定量检测人血清或血浆样品中的GDF-15含量，确保了检测的灵敏度。并适合用于全自动设备使用。加大了检测速度和检测通量，提高了检测效率，同时避免了人为操作导致的误差。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.组合物，其特征在于，包括含有生物素标记的可特异性结合GDF-15的抗体、含有三联吡啶钌标记的可特异性结合GDF-15的抗体和链霉亲和素超顺磁微球；
所述链霉亲和素超顺磁微球的粒径包括1.0～6.0μm。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述链霉亲和素超顺磁微球的粒径包括3μm。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，还包括缓冲液；
所述缓冲液包括：
20mmol/L～200mmol/L磷酸盐缓冲液，pH＝7.4；和/或
20mmol/L～200mmol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲液，pH＝7.4。
4.如权利要求1至3任一项所述的组合物，其特征在于，还包括第一清洗液；
所述第一清洗液包括2-N-二丁氨基乙醇；
所述第一清洗液还包括磷酸盐缓冲液。
5.如权利要求1至4任一项所述的组合物，其特征在于，还包括稳定剂；
所述稳定剂包括甘氨酸、蛋氨酸、PEG20000、葡聚糖200000、普鲁兰多糖或聚乙烯比咯烷酮360中的一种或多种。
6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述稳定剂包括：
7.如权利要求5或6所述的组合物，其特征在于，所述稳定剂与所述缓冲液的体积比为5：100。
8.如权利要求1至7任一项所述的组合物，其特征在于，还包括第二清洗液；
所述第二清洗液包括清洗液1、清洗液2、清洗液3和/或清洗液4；
所述清洗液1包括聚合度为14的异辛醇聚氧基乙烯醚、聚合度为9的月桂醇聚氧乙烯醚和/或Proclin 950；
所述清洗液2包括氢氧化钠、氯化钠和/或次氯酸钠溶液；
所述清洗液3包括聚合度为14的异辛醇聚氧基乙烯醚、聚合度为9的月桂醇聚氧乙烯醚和/或氢氧化钾；
所述清洗液4包括85wt％的磷酸、二氯乙酰胺、聚合度为14的异辛醇聚氧基乙烯醚、聚合度为9的月桂醇聚氧乙烯醚、磷酸二氢钾和/或二丁基乙醇。
9.如权利要求1至8任一项所述的组合物在制备GDF-15检测试剂盒中的应用。
10.试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1至8任一项所述的组合物。
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