KR20140037094A - 신부전의 예후 측정 방법 - Google Patents

신부전의 예후 측정 방법 Download PDF

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다카유키 하마노
요시타카 이사카
이사오 마츠이
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교와 메덱스 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은, 생물학적 샘플 중의 섬유아세포 증식 인자-23 및 25-히드록시비타민 D 를 측정하는 것을 특징으로 하는 신부전의 예후 측정 방법; 및 섬유아세포 증식 인자-23 측정용 시약 및 25-히드록시비타민 D 측정용 시약을 포함하는 것을 특징으로 하는 신부전의 예후 측정용 키트에 관한 것이다. 본 발명에 의해, 투여할 약제 선정, 보다 엄격한 식이요법 도입 및 투석 치료 조기 도입을 포함하는 치료 방침 결정에 유용한, 신부전의 예후 측정 방법 및 신부전의 예후 측정용 키트가 제공된다.

Description

신부전의 예후 측정 방법 {METHOD FOR DETERMINING PROGNOSIS OF RENAL FAILURE}
본 발명은 신부전의 예후 측정 방법 및 신부전의 예후 측정용 키트에 관한 것이다.
섬유아세포 증식 인자-23 (이하, FGF-23 으로 지칭함) 은 섬유아세포 증식 인자 (FGF) 패밀리의 일원이며, 주로 골 조직에서 생성되는 251 개 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드이고, 신장에 작용하여 신장 요세관에서의 인의 재흡수를 저해한다. 최근, 저인산혈증성 구루병, 종양성 골연화증 및 신부전과 같은 질환에 있어서의 FGF-23 의 관여가 제시되고 있다 (비특허 문헌 1 참조). 혈중의 FGF-23 을 측정하는 것은 이들 질환의 병리학적 상태의 모니터링에 유용한 것으로 인지되고 있으며, 따라서 FGF-23 은 최근 마커로서 주목을 받고 있다 (특허 문헌 1).
25-히드록시비타민 D (이하, 25(OH)D 로 지칭함) 는, 체내에 흡수된 비타민 D 의 측쇄에서의 위치 25 의 간에서의 히드록실화에 의해 생성되는 물질이다. 체내에서, 이는 위치 1 또는 24 에서의 히드록실화에 의해 신장에서 1α,25-디히드록시비타민 D [1α,25(OH)2D] 또는 24,25-디히드록시비타민 D [24,25(OH)2D] 로 추가 대사된다.
비타민 D 자체는 생리적 활성을 거의 갖지 않고, 이의 혈중 농도가 대사, 지방 조직으로의 전달 등으로 인해 크게 가변적이므로, 일반적으로는 좀처럼 측정되지 않는다. 체내에서, 비타민 D 는 간에서 25-히드록실라아제에 의해 신속히 대사되고 25(OH)D 로 변환되어, 이는 이후 신장에서 1α-히드록실라아제에 의한 위치 1α 에서의 히드록실화에 의해 활성 형태 1α,25-디히드록시비타민 D 로 추가 대사된다.
활성 형태의 1α,25-디히드록시비타민 D 는 소장으로부터의 칼슘 및 인의 흡수를 촉진하며, 뼈로부터의 골 무기질 (bone mineral) 의 용출을 촉진한다. 또한, 이는 신장에서 칼슘 및 인의 재흡수를 촉진하고 생체 내의 칼슘 및 인의 항상성 유지에 기여한다.
비타민 D 결핍은 소아에서는 구루병, 그리고 성인에서는 골연화증 및 골다공증을 초래한다. 25(OH)D 의 측정은 비타민 D 결핍 및 부족증의 병리학적 상태를 모니터링하는데 유용한 것으로 인지되고 있다 (비특허 문헌 2).
[선행 기술 문헌]
[특허 문헌]
[특허 문헌 1] WO 2003/057733
[비특허 문헌]
[비특허 문헌 1] Kidney and Metabolic Bone Diseases, vol. 15(4), p. 351-356 (2002)
[비특허 문헌 2] Kidney Int. Vol. 55(6), p. 2169-2177 (1999)
본 발명의 목적은, 신부전 환자에 대한 치료 방침 결정에 유효한 신부전의 예후 측정 방법 및 예후 측정용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명자들은, 상기 기재한 문제점을 해결하기 위하여 예의 검토한 결과, 샘플 중의 FGF-23 및 25(OH)D 를 측정하고 이들 측정치를 조합하여 평가함으로써 신부전의 예후를 측정할 수 있다는 것을 발견하였고, 본 발명을 완성하였다. 보다 구체적으로, 본 발명은 하기의 [1] ~ [6] 에 관한 것이다:
[1] 생물학적 샘플 중의 FGF-23 및 25(OH)D 를 측정하는 것을 포함하는, 신부전의 예후 측정 방법;
[2] 상기 [1] 에 있어서, FGF-23 을 면역학적 측정 방법에 의해 측정하는 방법;
[3] 상기 [1] 또는 [2] 에 있어서, 25(OH)D 를 면역학적 측정 방법에 의해 측정하는 방법;
[4] FGF-23 측정용 시약 및 25(OH)D 측정용 시약을 포함하는, 신부전의 예후 측정용 키트;
[5] 상기 [4] 에 있어서, FGF-23 측정용 시약이, FGF-23 에 결합하는 항체를 포함하는 시약인 키트; 및
[6] 상기 [4] 또는 [5] 에 있어서, 25(OH)D 측정용 시약이, 25(OH)D 에 결합하는 항체를 포함하는 시약인 키트.
본 발명에 의해, 불량한 예후를 갖는 신부전 환자군의 선정이 가능하고, 약제 선정, 보다 엄격한 식이요법 도입 및 투석 치료 조기 도입과 같은 치료 방침 결정에 유용한, 신부전의 예후 측정 방법 및 예후 측정용 키트가 제공된다.
도 1 은 기본적인 환자 정보 및 각종 측정치를 사용하는 신장 이벤트 (혈청 크레아티닌 배증 또는 투석 치료 도입) 의 발생 위험성에 대한 다변량 분석의 분석 도해를 나타낸다.
도 2 는 25(OH)D 농도를 기반으로 하는 환자군 (4 개 군) 및 FGF-23 농도를 기반으로 하는 환자군 (Q1~Q5 의 5 개 군) 의 각 군에서의, 신장 이벤트 (혈청 크레아티닌 배증 또는 투석 치료 도입) 의 발생 위험성에 대한 다변량 분석의 분석 도해를 나타낸다.
도 3 은 하기 4 개의 군: 25(OH)D 저수준 및 FGF-23 저수준 군 (df 군), 25(OH)D 고수준 및 FGF-23 저수준 군 (Df 군), 25(OH)D 저수준 및 FGF-23 고수준 군 (dF 군), 및 25(OH)D 고수준 및 FGF-23 고수준 군 (DF 군) 에 대한, 약 5 년 동안 신장 이벤트 (혈청 크레아티닌 배증 또는 투석 치료 도입) 가 없는 생존 확률을 나타내는 카플란-메이어 (Kaplan-Meier) 생존 곡선을 나타낸다.
도 4 는 연령, 성별, 당뇨병, 심혈관계 질환 이력, 고혈압, 헤모글로빈, 혈청 알부민, 요단백, 추정 사구체 여과율 (eGFR), 혈청 칼슘, 혈청 인, 칼시트리올 [1,25-디히드록시비타민 D3], 전체 1-84 부갑상선 호르몬 (전체 PTH), 채혈 시기, 안지오텐신-변환 효소 (ACE) 저해제/안지오텐신 수용체 차단제 (ARB) 의 투여, 활성 형태 비타민 D 투여 및 칼슘 투여에 대해 추가 보정한 도 3 의 검토의 카플란-메이어 생존 곡선을 나타낸다.
도 5 는 25(OH)D 농도 및 FGF-23 농도 조합의 4 개 군에 있어서, 신장 이벤트 (혈청 크레아티닌 배증 또는 투석 치료 도입) 의 발생 위험성에 대한 다변량 분석의 분석 도해를 나타낸다.
<신부전의 예후 측정 방법>
본 발명의 신부전 예후 측정 방법은, 생물학적 샘플 중의 FGF-23 및 25(OH)D 를 측정하는 것을 포함한다. 본 발명의 신부전 예후 측정 방법은, 예를 들어 하기 단계를 포함한다:
[1] 생물학적 샘플 중의 FGF-23 을 측정하는 단계;
[2] 단계 [1] 에서 수득한 측정치를, 미리 작성한, FGF-23 농도와 측정치 사이의 관계를 나타내는 교정 곡선과 비교하여, 생물학적 샘플 중의 FGF-23 농도를 측정하는 단계;
[3] 생물학적 샘플 중의 25(OH)D 를 측정하는 단계;
[4] 단계 [3] 에서 수득한 측정치를, 미리 작성한, 25(OH)D 농도와 측정치 사이의 관계를 나타내는 교정 곡선과 비교하여, 생물학적 샘플 중의 25(OH)D 농도를 측정하는 단계; 및
[5] 단계 [2] 에서 측정된 FGF-23 농도 및 단계 [4] 에서 측정된 25(OH)D 농도를 기반으로 하여, FGF-23 농도가 모든 측정 생물학적 샘플의 FGF-23 농도를 기반으로 측정된 중앙치 이상이고 25(OH)D 농도가 모든 측정 생물학적 샘플의 25(OH)D 농도를 기반으로 측정된 중앙치 미만인 경우 신부전의 예후가 불량한 것으로 측정하고; FGF-23 농도가 FGF-23 중앙치 미만이며 25(OH)D 농도가 25(OH)D 중앙치 이상인 경우 신부전의 예후가 양호한 것으로 측정하는 단계.
단계 [5] 에서, 모든 측정 생물학적 샘플의 FGF-23 농도 및 25(OH)D 농도를 기반으로 측정된 FGF-23 농도의 중앙치 및 25(OH)D 농도의 중앙치가 예를 들어 각각 49.4 pg/mL 및 23.0 ng/mL 인 경우, FGF-23 농도가 49.4 pg/mL 이상이고 25(OH)D 농도가 23.0 ng/mL 미만인 대상의 신부전 예후를 불량한 것으로 측정할 수 있으며, FGF-23 농도가 49.4 pg/mL 미만이고 25(OH)D 농도가 23.0 ng/mL 이상인 대상의 신부전 예후를 양호한 것으로 측정할 수 있다.
여기서, FGF-23 농도의 중앙치란, 모든 생물학적 샘플에 대해 측정된 FGF-23 농도를 낮은 값으로부터 차례대로 배열하였을 때, 정확히 한가운데에 위치하는 FGF-23 의 농도를 의미한다. 유사하게, 25(OH)D 농도의 중앙치란, 모든 생물학적 샘플에 대해 측정된 25(OH)D 농도를 낮은 값으로부터 차례대로 배열하였을 때, 정확히 한가운데에 위치하는 25(OH)D 의 농도를 의미한다.
본 발명의 생물학적 샘플로서는, FGF-23 및 25(OH)D 를 측정할 수 있는 샘플이면 특별히 제한되지 않으며, 그 예는 전혈, 혈청 및 혈장을 포함하고; 혈청 및 혈장이 바람직하다.
FGF-23 의 측정 방법으로서는, FGF-23 을 측정할 수 있는 방법이면 특별히 제한되지 않으며, 그 예는 FGF-23-결합 항체를 사용하여 측정하는 면역학적 측정 방법을 포함한다. 면역학적 측정 방법의 예는 면역검정, 면역블롯팅, 응집 반응, 보체 결합 반응, 용혈 반응, 침강 반응, 금 콜로이드 법, 크로마토그래피 및 면역염색과 같은 항원-항체 반응을 이용하는 임의의 방법을 포함하고; 면역검정이 바람직하다.
면역검정은, 각종 유형의 표지로 표지된 항원 또는 항체를 사용하여 항체 또는 항원을 검출 또는 정량하는 방법이며, 항원 또는 항체의 표지 방법에 의존적이고, 그 예는 방사면역검정 (RIA), 효소 면역검정 (EIA 또는 ELISA), 화학발광 효소 면역검정 (CLEIA 또는 CLIA), 형광 면역검정 (FIA), 발광 면역검정, 물리화학적 측정법 (TIA, LAPIA 및 PCIA) 및 유세포 분석을 포함하고; 화학발광 효소 면역검정 등이 바람직하다. 또한, 면역검정은 샌드위치법 또는 경합법일 수 있다.
면역검정을 사용하는 생물학적 샘플 중의 FGF-23 측정은, 예를 들어 하기의 방법에 의해 실행될 수 있다:
[1] 생물학적 샘플 중의 FGF-23 을, 담체 상에 고정화되며 FGF-23 에 결합하는 제 1 항체 또는 이의 단편, 및 FGF-23 에 결합하는 제 2 항체 또는 이의 단편에 표지가 결합한 표지된 제 2 항체와 반응시켜, 담체 상에 제 1 항체, FGF-23 및 표지된 제 2 항체를 포함하는 면역복합체를 형성시키는 단계;
[2] 형성된 면역복합체 중의 표지를 측정하는 단계; 및
[3] 단계 [2] 에서 수득한 측정치를, 미리 작성한, FGF-23 농도와 측정치 사이의 관계를 나타내는 교정 곡선과 비교하여, 생물학적 샘플 중의 FGF-23 농도를 측정하는 단계.
상기 언급한 단계 [1] 과 단계 [2] 사이에 세정 단계를 삽입할 수도 있다.
표지로서는, 항-FGF-23 항체에 결합하고 FGF-23 의 측정을 가능하게 하는 표지이면 특별히 제한되지 않으며, 그 예는 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 형광 물질 및 발광 물질을 포함한다.
표지로서 퍼옥시다아제를 사용하는 경우, 후술한 표지 측정용 시약을 사용하여 FGF-23 을 측정할 수 있다. 보다 구체적으로, 면역복합체 중의 표지 (=퍼옥시다아제) 와 표지 측정용 시약 사이의 반응에 의해 생성되는 형광, 발광 등을 측정함으로써, FGF-23 을 측정할 수 있다.
표지로서 알칼리 포스파타아제를 사용하는 경우, 후술한 표지 측정용 시약을 사용하여 FGF-23 을 측정할 수 있다. 보다 구체적으로, 면역복합체 중의 표지 (=알칼리 포스파타아제) 와 표지 측정용 시약 사이의 반응에 의해 생성되는 형광, 발광 등을 측정함으로써, FGF-23 을 측정할 수 있다.
표지로서 β-갈락토시다아제를 사용하는 경우, 후술한 표지 측정용 시약을 사용하여 FGF-23 을 측정할 수 있다. 보다 구체적으로, 면역복합체 중의 표지 (=β-갈락토시다아제) 와 표지 측정용 시약 사이의 반응에 의해 생성되는 형광, 발광 등을 측정함으로써, FGF-23 을 측정할 수 있다.
표지로서 형광 물질을 사용하는 경우, 면역복합체 중의 표지 (=형광 물질) 유래의 형광을 측정함으로써, FGF-23 을 측정할 수 있다. 형광 물질의 예는 FITC (플루오레세인 이소티오시아네이트), RITC (로다민 B-이소티오시아네이트), 양자점 (Science, 281, 2016-2018, 1998), 피코빌리단백질 예컨대 피코에리트린, GFP (녹색 형광 단백질), RFP (적색 형광 단백질), YFP (황색 형광 단백질) 및 BFP (청색 형광 단백질) 을 포함한다.
표지로서 발광 물질을 사용하는 경우, 면역복합체 중의 표지 (=발광 물질) 유래의 발광을 측정함으로써, FGF-23 을 측정할 수 있다. 발광 물질의 예는 아크리디늄 및 이의 유도체, 루테늄 착물 화합물 및 로핀을 포함한다.
또한, FGF-23 은 시판 FGF-23-측정 키트를 사용하여 측정될 수 있다. 시판 FGF-23-측정 키트의 예는 "FGF-23 assay reagent" (KAINOS Laboratories, Inc. 사제) 를 포함한다.
25(OH)D 의 측정 방법으로서는, 25(OH)D 를 측정할 수 있는 방법이면 특별히 제한되지 않으며, 그 예는 25(OH)D 에 대한 항체를 사용하여 측정하는 면역학적 측정 방법을 포함한다. 면역학적 측정 방법은 면역검정, 면역블롯팅, 응집 반응, 보체 결합 반응, 용혈 반응, 침강 반응, 금 콜로이드 법, 크로마토그래피 및 면역염색과 같은 항원-항체 반응을 이용하는 임의의 방법을 포함한다. 25(OH)D 측정 방법은 바람직하게는, 예를 들어 면역검정 방법이다.
면역검정의 예는 전술한 측정법을 포함한다.
면역검정을 사용하는 생물학적 샘플 중의 25(OH)D 의 측정은, 예를 들어 하기의 방법에 의해 실행될 수 있다:
[1] 생물학적 샘플 중의 25(OH)D 를, 담체 상에 고정화되며 25(OH)D 에 결합하는 제 1 항체 또는 이의 단편, 및 25(OH)D 에 결합하는 제 2 항체 또는 이의 단편에 표지가 결합한 표지된 제 2 항체와 반응시켜, 담체 상에 제 1 항체, 25(OH)D 및 표지된 제 2 항체를 포함하는 면역복합체를 형성시키는 단계;
[2] 형성된 면역복합체 중의 표지를 측정하는 단계; 및
[3] 단계 [2] 에서 수득한 측정치를, 미리 작성한, 25(OH)D 농도와 측정치 사이의 관계를 나타내는 교정 곡선과 비교하여, 생물학적 샘플 중의 25(OH)D 농도를 측정하는 단계.
상기 언급한 단계 [1] 과 단계 [2] 사이에 세정 단계를 삽입할 수도 있다.
표지로서는, 항-25(OH)D 항체에 결합하고 25(OH)D 의 측정을 가능하게 하는 표지이면 특별히 제한되지 않으며, 그 예는 전술한 표지를 포함한다. 또한, 25(OH)D 는 시판 25(OH)D-측정 키트를 사용하여 측정될 수 있다. 시판 25(OH)D-측정 키트의 예는 "LIAISON 25 OH Vitamin D TOTAL Assay" (DiaSorin S.p.A. 사제) 및 "25-OH Vitamin D, Direct ELISA Kit" (Immundiagnostik AG 사제) 를 포함한다.
<신부전의 예후 측정용 키트>
본 발명의 신부전 예후 측정용 키트는, 본 발명의 신부전 예후 측정 방법에 사용되는 키트이며, FGF-23 측정용 시약 및 25(OH)D 측정용 시약을 포함한다. 본 발명의 키트는 또한 생물학적 샘플에 대한 희석제, 반응 완충액, 세정액, 표지 검출용 시약 등을 포함할 수 있다. 또한, 측정에 적합한 장치를 조합하여 본 발명의 키트를 생성시킬 수 있다.
(1) FGF-23 측정용 시약
FGF-23 측정용 시약으로서는, 생물학적 샘플 중의 FGF-23 을 측정할 수 있는 시약이면 특별히 제한되지 않으며, 그 예는: (1) 담체에 고정화되며 FGF-23 에 결합하는 제 1 항체, 및 FGF-23 에 결합하는 제 2 항체에 표지가 결합한 표지된 제 2 항체를 포함하는 시약; (2) 담체에 고정화되며 FGF-23 에 결합하는 항체, 및 FGF-23 과 경합하는 경합 물질에 표지가 결합한 표지된 경합 물질을 포함하는 시약; 및 (3) 담체에 고정화되며 FGF-23 과 경합하는 경합 물질, 및 FGF-23-결합 항체에 표지가 결합한 표지된 항체를 포함하는 시약을 포함한다. 필요에 따라, 생물학적 샘플에 대한 희석제, 반응 완충액, 세정액, 표지 검출용 시약, FGF-23 에 대한 표준 물질 등이 또한 FGF-23 측정용 시약에 포함될 수 있다.
FGF-23 에 결합하는 항체 (항-FGF-23 항체) 로서는, FGF-23 에 결합하는 항체이면 특별히 제한되지 않으며, 그 예는 염소, 토끼, 랫트, 마우스 등으로부터의 항-FGF-23 항체를 포함한다. 항-FGF-23 항체는 다중클론 항체 또는 단일클론 항체일 수 있다. 항-FGF-23 항체의 단편이 또한 사용될 수 있다. 항체 단편의 예는 항체의 파파인 처리에 의해 수득된 Fab, 항체의 펩신 처리에 의해 수득된 F(ab')2, 및 항체의 펩신 처리 및 환원 처리에 의해 수득된 Fab' 와 같은 Fc 부분을 제거한 항체 단편을 포함한다. 제 1 항체 및 제 2 항체를 사용하는 경우, 제 1 항체의 항원-인지 부위 및 제 2 항체의 항원-인지 부위는 동일하거나 상이할 수 있으며, 바람직하게는 상이하다.
FGF-23 과 경합하는 경합 물질로서는, FGF-23 과 경합할 수 있는 물질이면 특별히 제한되지 않으며, 그 예는 FGF-23 그 자체, 및 항-FGF-23 항체의 항원-인지 부위에 상응하는 펩티드를 포함하는 물질을 포함한다.
담체로서는, FGF-23 의 측정을 가능하게 하는 담체이면 특별히 제한되지 않으며, 그 예는 플레이트, 라텍스 및 자성 입자를 포함한다. 항-FGF-23 항체 및 경합 물질의 담체에 대한 고정화의 예는 물리적 방법 및 화학적 방법을 포함한다. 물리적 방법의 예는 물리적 흡착을 사용하는 방법을 포함한다. 화학적 방법의 예는 아비딘-비오틴 상호작용을 사용하는 방법 및 링커를 사용하는 방법을 포함한다.
생물학적 샘플에 대한 희석제로서는, FGF-23 의 측정을 가능하게 하는 희석제이면 특별히 제한되지 않으며, 그 예는 계면활성제, 단백질 등이 수성 매질 중에 함유되는 수용액을 포함한다. 수성 매질의 예는 탈이온수, 증류수 및 완충액을 포함한다. 완충액의 예는 인산 완충액 및 굿 완충액 (Good's buffer) 을 포함한다. 굿 완충액의 예는 2-모르폴리노에탄술폰산 (MES) 완충액, 비스(2-히드록시에틸)이미노트리스(히드록시메틸)메탄 (비스-트리스) 완충액, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (트리스) 완충액, N-(2-아세토아미도)이미노 이아세트산 (ADA) 완충액, 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산) (PIPES) 완충액, 2-[N-(2-아세트아미도)아미노]에탄술폰산 (ACES) 완충액, 3-모르폴리노-2-히드록시프로판술폰산 (MOPSO) 완충액, 2-[N,N-비스(2-히드록시에틸)아미노]에탄술폰산 (BES) 완충액, 3-모르폴리노프로판술폰산 (MOPS) 완충액, 2-{N-[트리스(히드록시메틸)메틸]아미노}에탄술폰산 (TES) 완충액, N-(2-히드록시에틸)-N'-(2-술포에틸)피페라진 (HEPES) 완충액, 3-[N,N-비스(2-히드록시에틸)아미노]-2-히드록시프로판술폰산 (DIPSO) 완충액, 2-히드록시-3-{[N-트리스(히드록시메틸)메틸]아미노}프로판술폰산 (TAPSO) 완충액, 피페라진-N,N'-비스(2-히드록시프로판-3-술폰산) (POPSO) 완충액, N-(2-히드록시에틸)-N'-(2-히드록시-3-술포프로필)피페라진 (HEPPSO) 완충액, N-(2-히드록시에틸)-N'-(3-술포프로필)피페라진 (EPPS) 완충액, [N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신] (트리신 (Tricine)) 완충액, [N,N-비스(2-히드록시에틸)글리신] (바이신 (Bicine)) 완충액, 3-[N-트리스(히드록시메틸)메틸]아미노프로판술폰산 (TAPS) 완충액, 2-(N-시클로헥실아미노)에탄술폰산 (CHES) 완충액, 3-(N-시클로헥실아미노)-2-히드록시프로판술폰산 (CAPSO) 완충액 및 3-(N-시클로헥실아미노)프로판술폰산 (CAPS) 완충액을 포함한다.
계면활성제로서는, FGF-23 의 측정을 가능하게 하는 계면활성제이면 특별히 제한되지 않으며, 그 예는 비이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제 및 양쪽성 계면활성제를 포함한다. 단백질의 예는 소 혈청 알부민 (BSA), 소 태아 혈청 (FBS), 카제인 및 BlockAce (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. 사제) 를 포함한다.
반응 완충액으로서는, FGF-23 의 측정을 가능하게 하는 완충액이면 특별히 제한되지 않으며, 그 예는 전술한 완충액을 포함한다. 필요에 따라, 계면활성제, 단백질, 금속 이온, 당류, 방부제 등이 반응 완충액에 포함될 수 있다. 계면활성제의 예는 전술한 계면활성제를 포함한다. 단백질의 예는 전술한 단백질을 포함한다. 금속 이온의 예는 마그네슘 이온, 망간 이온 및 아연 이온을 포함한다. 당류의 예는 만니톨 및 소르비톨을 포함한다. 방부제의 예는 나트륨 아자이드, 항생 물질 (스트렙토마이신, 페니실린, 겐타마이신 등) 및 BioAce 를 포함한다.
세정액으로서는, FGF-23 의 측정을 가능하게 하는 세정액이면 특별히 제한되지 않으며, 그 예는 인산 완충 생리식염수 (0.15 mol/L 염화나트륨을 함유하는 10 mmol/L 인산 완충액, pH 7.2) (PBS) 를 포함한다. 필요에 따라, 전술한 계면활성제, 단백질, 방부제 등이 세정액에 포함될 수 있다.
표지 측정용 시약은, 항원-항체 반응에 의해 생성된 면역복합체 중의 표지를 측정하기 위한 시약이며, FGF-23 의 측정을 가능하게 하는 표지 측정용 시약이면 특별히 제한되지 않는다. 표지로서는, 항-FGF-23 항체에 결합하며 FGF-23 의 측정을 가능하게 하는 표지이면 특별히 제한되지 않으며, 그 예는 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제 및 β-갈락토시다아제를 포함한다. 필요에 따라, 전술한 계면활성제, 단백질, 금속 이온, 당류, 방부제 등이 표지 측정용 시약에 포함될 수 있다.
표지로서 퍼옥시다아제를 사용하는 경우, 표지 측정용 시약의 예는 과산화수소 및 형광 기질을 포함하는 시약, 및 과산화수소 및 발광 기질을 포함하는 시약을 포함한다. 표지 (=퍼옥시다아제) 와 표지 측정용 시약 사이의 반응에 의해 생성된 형광, 발광 등을 측정함으로써, FGF-23 을 측정할 수 있다. 형광 기질의 예는 4-히드록시페닐 아세트산, 3-(4-히드록시페닐)프로피온산 및 쿠마린을 포함한다. 발광 기질의 예는 루미놀 화합물 및 루시게닌 화합물을 포함한다.
표지로서 알칼리 포스파타아제를 사용하는 경우, 표지 측정용 시약의 예는 알칼리 포스파타아제의 기질을 포함하는 시약을 포함한다. 표지 (=알칼리 포스파타아제) 와 표지 측정용 시약 사이의 반응에 의해 생성된 발광 등을 측정함으로써, FGF-23 을 측정할 수 있다. 알칼리 포스파타아제의 기질의 예는 3-(2'-스피로아다만탄)-4-메톡시-4-(3'-포스포릴옥시)페닐-1,2-디옥세탄 이나트륨 염 (AMPPD), 2-클로로-5-{4-메톡시스피로[1,2-디옥세탄-3,2'-(5'-클로로)트리시클로[3.3.1.13,7]칸]-4-일}페닐 포스페이트 이나트륨 염 (CDP-StarTM), 3-{4-메톡시스피로[1,2-디옥세탄-3,2'-(5'-클로로)트리시클로[3.3.1.13,7]데칸]-4-일}페닐포스페이트 이나트륨 염 (CSPDTM), [10-메틸-9(10H)-아크리디닐리덴]페녹시메틸포스페이트 이나트륨 염 (LumigenTM APS-5) 및 9-(4-클로로페닐티오포스포릴옥시메틸리덴)-10-메틸아크리돈 이나트륨 염을 포함한다.
표지로서 β-갈락토시다아제를 사용하는 경우, 표지 측정용 시약의 예는 β-갈락토시다아제의 기질을 포함하는 시약을 포함한다. 표지 (=β-갈락토시다아제) 와 표지 측정용 시약 사이의 반응에 의해 생성된 형광, 발광 등을 측정함으로써, FGF-23 을 측정할 수 있다. β-갈락토시다아제의 기질의 예는 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토피라노시드, Galacton-Plus (Applied Biosystems Inc. 사제) 및 기타 유사 화합물을 포함한다.
표준 물질의 예는 유전자 재조합 기술에 의해 수득되거나 생물학적 샘플로부터 수득되는 FGF-23, 및 FGF-23 발현 세포를 포함한다.
(2) 25(OH)D 측정용 시약
25(OH)D 측정용 시약으로서는, 생물학적 샘플 중의 25(OH)D 를 측정할 수 있는 시약이면 특별히 제한되지 않으며, 그 예는: (1) 담체에 고정화되며 25(OH)D 에 결합하는 제 1 항체, 및 25(OH)D 에 결합하는 제 2 항체에 표지가 결합한 표지된 제 2 항체를 포함하는 시약; (2) 담체에 고정화되며 25(OH)D 에 결합하는 항체, 및 25(OH)D 와 경합하는 경합 물질에 표지가 결합한 표지된 경합 물질을 포함하는 시약; 및 (3) 담체에 고정화되며 25(OH)D 와 경합하는 경합 물질, 및 25(OH)D 에 결합하는 항체에 표지가 결합한 표지된 항체를 포함하는 시약을 포함한다. 필요에 따라, 생물학적 샘플에 대한 희석제, 반응 완충액, 세정액, 표지 검출용 시약, 25(OH)D 에 대한 표준 물질 등이 25(OH)D 측정용 시약에 또한 포함될 수 있다.
25(OH)D 에 결합하는 항체 (항-25(OH)D 항체) 로서는, 25(OH)D 에 결합하는 항체이면 특별히 제한되지 않으며, 그 예는 염소, 토끼, 랫트, 마우스 등으로부터의 항-25(OH)D 항체를 포함한다. 항-25(OH)D 항체는 다중클론 항체 또는 단일클론 항체일 수 있다. 항-25(OH)D 항체의 단편이 또한 사용될 수 있다. 항체 단편의 예는 전술한 단편을 포함한다. 제 1 항체 및 제 2 항체를 사용하는 경우, 제 1 항체의 항원-인지 부위 및 제 2 항체의 항원-인지 부위는 동일하거나 상이할 수 있으며, 바람직하게는 상이하다.
25(OH)D 와 경합하는 경합 물질로서는, 25(OH)D 와 경합할 수 있는 물질이면 특별히 제한되지 않으며, 그 예는 25(OH)D 그 자체, 및 항-25(OH)D 항체의 항원-인지 부위에 상응하는 25(OH)D 분자의 부분적 구조를 갖는 물질을 포함한다.
담체로서는, 25(OH)D 의 측정을 가능하게 하는 담체이면 특별히 제한되지 않으며, 그 예는 전술한 담체를 포함한다. 항-25(OH)D 항체 및 경합 물질의 담체에 대한 고정화의 예는 전술한 고정화 방법을 포함한다.
생물학적 샘플에 대한 희석제로서는, 25(OH)D 의 측정을 가능하게 하는 희석제이면 특별히 제한되지 않으며, 그 예는 전술한 희석제를 포함한다.
반응 완충액으로서는, 25(OH)D 의 측정을 가능하게 하는 완충액이면 특별히 제한되지 않으며, 그 예는 전술한 완충액을 포함한다. 필요에 따라, 전술한 계면활성제, 단백질, 금속 이온, 당류, 방부제 등이 반응 완충액에 포함될 수 있다.
세정액으로서는, 25(OH)D 의 측정을 가능하게 하는 세정액이면 특별히 제한되지 않으며, 그 예는 전술한 세정액을 포함한다.
표지 측정용 시약으로서는, 25(OH)D 의 측정을 가능하게 하는 표지 측정용 시약이면 특별히 제한되지 않는다. 표지로서는, 항-25(OH)D 항체에 결합하며 25(OH)D 의 측정을 가능하게 하는 표지이면 특별히 제한되지 않으며, 그 예는 전술한 표지를 포함한다. 표지 측정용 시약의 예는 전술한 표지 측정용 시약을 포함한다. 필요에 따라, 전술한 계면활성제, 단백질, 금속 이온, 당류, 방부제 등이 표지 측정용 시약에 포함될 수 있다.
표준 물질의 예는 생물학적 샘플로부터 제조된 25(OH)D 또는 화학적으로 합성된 25(OH)D 를 포함한다. 시판 25(OH)D 를 표준 물질로서 또한 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 참조로 하여 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 상기 실시예가 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 간주해서는 안 된다.
[실시예 1]
<환자 배경>
오사카 비타민 D 연구 (Osaka Vitamin D Study) 에 등록되어 있는 만성 신장병 환자로부터 보존기의 만성 신장병 환자 738 명을 선정하고, 이들로부터 본 조사에 대한 사전 동의서를 얻었다. 이 조사는 오사카 대학 병원의 윤리 위원회에 의해 승인되었다. 2005 년 5 월부터 2007 년 7 월까지 환자를 등록하고, 2010 년 7 월까지 모니터링하였다.
<샘플 측정>
전혈, 혈청 및 혈장으로 이루어지는 혈액 샘플 뿐 아니라 요 샘플을 환자 등록시 수집하였다. 혈액 샘플을 30 분 내에 원심분리하고, 수득한 혈청을 측정할 때까지 -80℃ 에서 동결 보관하였다. 샘플 유형 각각에 대해 크레아티닌, 알부민, 칼슘 및 무기 인을 측정하고 eGFR 을 계산하였다. eGFR 을 이눌린 제거율 (inulin clearance) 을 기반으로 하는 일본 표준법에 따라 계산하였다.
전체 1-84 PTH 를 Scantibodies Laboratory Inc. 사제의 전체 PTH 검정 키트를 사용하여 측정하였다. FGF-23 을 KAINOS Laboratories, Inc. 사제의 키트를 사용하여 측정하였다. 칼시트리올을 Immunodiagnostic Systems, PLC. 사제의 TFB 1,25-히드록시비타민 D RIA 키트를 사용하여 측정하였다. 25(OH)D 를 DiaSorin S.p.A. 사제의 125I RIA 키트를 사용하여 측정하였다. 각 측정을 각 사의 첨부 문서에 기재된 조건 및 방법에 따라 실행하였다.
(1) 다변량 분석에 있어서의 신장 이벤트 (혈청 크레아티닌 배증 또는 투석 치료 도입) 에 대한 위험률 (hazard ratio) 및 95% 신뢰 구간의 검토
환자 기본 정보 및 각종 측정치를 사용하여 신장 이벤트 발생 위험성에 대해 다변량 분석을 실행하였다. 그 결과를 도 1 에 나타낸다. 도 1 은 각종 위험 인자와 위험률 사이의 관계를 나타내며, 각종 위험 인자의 3 개 수치는 왼쪽으로부터 위험률, 95% 신뢰 구간의 하한 및 95% 신뢰 구간의 상한을 의미한다. 여기서, 위험률이란 요단백에 대해 음성인 군 [단백뇨 (-)] 을 대조군으로서 사용하는 경우, 특정 위험 인자를 갖는 군에서 신장 이벤트 발생이 몇 회 증가하는지를 나타내는 값이다. 95% 신뢰 구간이란, 95% 의 확률로 모평균이 포함되는 범위이다.
도 1 에서 명백한 바와 같이, 25(OH)D 의 농도 [25 D] 가 10 ng/mL 까지 증가함에 따라 [25 D (10 ng/mL)], 연령이 10 세 증가하고 [연령 (10 세)], 성별이 여성이고 [성별 (여성)], 헤모글로빈 수치가 높고 (헤모글로빈), eGFR 수준이 높은 경우 [eGFR (10 mL/분/1.73 m2)], 신장병 진전이 늦어지는 경향이 있고; FGF-23 수준이 높고 (Log FGF-23), 심혈관계 질환 이력 (사전 CVD), 고혈압 (수축기 BP) 및 요단백 수준이 3+ 이상인 경우 [단백뇨≥(3+)], 신장병이 조기에 진전하는 경향이 있다는 것이 확인되었다.
(2) 25(OH)D 및 FGF-23 군 각각에 있어서의 신장 이벤트에 대한 위험률 및 95% 신뢰 구간의 검토
25(OH)D [25 D] 농도에 관해서, 10 ng/mL 미만; 10 ng/mL 내지 20 ng/mL 미만; 20 ng/mL 내지 30 ng/mL 미만; 및 30 ng/mL 이상의 4 개 군으로 나누었다. FGF-23 [FGF23] 농도에 관해서도, 31.7 pg/mL 내지 80.5 pg/mL 범위의 농도 범위를 기반으로, FGF-23 저농도에서 FGF-23 고농도로의 순서로 Q1 ~ Q5 의 5 개 군으로 나누었다. 위험률 (HR) 및 95% 신뢰 구간 (95% C.I.) 을 각 군에 대해 검토하였다. 그 결과를 도 2 에 나타낸다. 도 2 는 각종 위험 인자와 위험률 사이의 관계를 나타내며, 각종 위험 인자에 대한 괄호 안의 3 개 수치는, 왼쪽으로부터 위험률, 95% 신뢰 구간의 하한 및 95% 신뢰 구간의 상한을 의미한다.
25(OH)D [25 D] 농도에 관해서는, 고농도로부터 저농도로 이행함에 따라 신장 이벤트에 대한 위험률이 증가하는 경향이 나타났고, 최저 농도 군 (10 ng/mL 미만) 에서 위험률이 가장 높았다 (HR, 11.5).
FGF-23 [FGF23] 농도에 관해서는, 고농도 군에서 신장 이벤트에 대한 위험률이 증가하는 경향이 나타났고, FGF-23 농도가 증가함에 따라 군 Q2, 군 Q3, 군 Q4 및 군 Q5 의 순서로 위험률이 증가하는 것으로 나타났다.
(3) 25(OH)D 및 FGF-23 조합의 군 각각에 있어서의 신장 이벤트에 대한 카플란-메이어 생존 곡선의 검토
모든 대상의 25(OH)D 농도의 중앙치가 23.0 ng/mL 이고, 모든 대상의 FGF-23 농도의 중앙치가 49.4 pg/mL 이었다. 그러므로, 23.0 ng/mL 미만의 25(OH)D 농도를 저수준의 군으로 정의하고, 23.0 ng/mL 이상의 25(OH)D 농도를 고수준의 군으로 정의하였고; 49.4 pg/mL 미만의 FGF-23 농도를 저수준의 군으로 정의하고, 49.4 pg/mL 이상의 FGF-23 농도를 고수준의 군으로 정의하였다. 각각의 조합에 따라서, 대상을 25(OH)D 저농도 수준 및 FGF-23 저농도 수준 군 (df 군); 25(OH)D 고농도 수준 및 FGF-23 저농도 수준 군 (Df 군); 25(OH)D 저농도 수준 및 FGF-23 고농도 수준 군 (dF 군); 및 25(OH)D 고농도 수준 및 FGF-23 고농도 수준 군 (DF 군) 의 4 개 군으로 분류하였다. 이들의 약 5 년 동안의 신장 이벤트 (혈청 크레아티닌 배증 또는 투석 치료 도입) 에 대한 카플란-메이어 생존 곡선을 작성하였다. 이때 카플란-메이어 생존 곡선은, 4 개 군 각각에 대해, 신장 이벤트의 발병 없이 생존하는 확률을 일수에 관해 나타낸다.
도 3 은 연령, 성별, 당뇨병, 심혈관계 질환 이력, 고혈압, 헤모글로빈, 혈청 알부민, 요단백, eGFR, 혈청 칼슘, 혈청 인, 칼시트리올, 전체 PTH, 채혈 시기, ACE 저해제/ARB 의 투여, 활성 형태 비타민 D 투여 및 칼슘 투여에 대한 보정 전의 데이터를 기반으로 작성한 카플란-메이어 생존 곡선을 나타내고, 도 4 는 보정한 데이터를 기반으로 작성한 카플란-메이어 생존 곡선을 나타낸다.
도 3 및 도 4 에서 명백히 나타내는 바와 같이, 보정 전 데이터 및 보정 후 데이터 둘 모두에 있어서, 25(OH)D 저수준 및 FGF-23 고수준 군 (dF 군) 에서 신장 이벤트 발생이 유의하게 증가하였다는 것이 확인되었다.
(4) 25(OH)D 및 FGF-23 조합의 군 각각에 있어서의 신장 이벤트에 대한 위험률 및 95% 신뢰 구간의 검토
전술한 25(OH)D [25 D] 및 FGF-23 [FGF23] 조합의 4 개 군에서의 신장 이벤트에 대한 위험률 및 95% 신뢰 구간을 검토하였다. 그 결과를 도 5 에 나타낸다.
도 5 에서 나타낸 바와 같이, 25(OH)D 고농도 수준 및 FGF-23 저농도 수준 군 (Df 군) 을 기준으로 사용하였고, 25(OH)D 저농도 수준 및 FGF-23 저농도 수준 군 (df 군) 에 대한 위험률 (HR) 및 95% 신뢰 구간 (95% C.I.) 은 각각 1.47 및 0.63-3.43 이었고; 25(OH)D 고농도 수준 및 FGF-23 고농도 수준 군 (DF 군) 에 대한 위험률 (HR) 및 95% 신뢰 구간 (95% C.I.) 은 각각 1.96 및 0.88-4.36 이었고; 25(OH)D 저농도 수준 및 FGF-23 고농도 수준 군 (dF 군) 에 대한 위험률 (HR) 및 95% 신뢰 구간 (95% C.I.) 은 각각 2.53 및 1.14-5.64 였다. 그러므로, 25(OH)D 저농도 수준 및 FGF-23 고농도 수준 군 (dF 군) 이 신장 이벤트에 대한 최고 위험성을 나타낸다는 것이 확인되었다.
본 발명에 의해, 신부전 환자에 대한 치료 방침 결정에 유용한, 신부전의 예후 측정 방법 및 예후 측정용 키트가 제공된다.

Claims (6)

  1. 생물학적 샘플 중의 섬유아세포 증식 인자-23 및 25-히드록시비타민 D 를 측정하는 것을 포함하는, 신부전의 예후 측정 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 섬유아세포 증식 인자-23 을 면역학적 측정 방법에 의해 측정하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 25-히드록시비타민 D 를 면역학적 측정 방법에 의해 측정하는 방법.
  4. 섬유아세포 증식 인자-23 측정용 시약 및 25-히드록시비타민 D 측정용 시약을 포함하는, 신부전의 예후 측정용 키트.
  5. 제 4 항에 있어서, 섬유아세포 증식 인자-23 측정용 시약이, 섬유아세포 증식 인자-23 에 결합하는 항체를 포함하는 시약인 키트.
  6. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 25-히드록시비타민 D 측정용 시약이, 25-히드록시비타민 D 에 결합하는 항체를 포함하는 시약인 키트.
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