CN102095845A

CN102095845A - 糖链抗原19-9化学发光定量检测试剂盒

Info

Publication number: CN102095845A
Application number: CN200910200379XA
Authority: CN
Inventors: 穆海东; 汪宁梅; 穆宇豪; 李胡丹
Original assignee: Shanghai Yulong Biological Science and Technology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Yulong Biological Science and Technology Co Ltd
Priority date: 2009-12-11
Filing date: 2009-12-11
Publication date: 2011-06-15

Abstract

本发明公开了一种用于糖链抗原19-9检测的化学发光定量检测试剂盒，该试剂盒包括CA19-9检测反应板，反应板包被有抗CA19-9抗体。CA19-9检测试剂盒，还包括：酶结合物，发光底物，校准品，质控品，浓缩洗涤液。本发明可以专一的定量检测出病人血清CA19-9的含量，判断预后水平及鉴别胰腺良恶性肿瘤。与传统的ELISA技术相比，本发明不仅保留了ELISA技术的高度特异性，检测结果的稳定性、可靠性和操作的简便性，同时采用的化学发光法能提高检测的灵敏度。

Description

糖链抗原19-9化学发光定量检测试剂盒

技术领域

本发明属于体外临床检验和化学发光免疫法技术领域，尤其涉及一种用于结、直肠癌和胰腺癌相关指标检测的反应板及试剂盒。

背景技术

近半个世纪以来，肿瘤的发病率和死亡率逐年升高，成为医学界热点中的热点。20世纪70年代，美国提出的向“肿瘤进军”反映了社会对肿瘤死亡率居高不下的焦虑，同时，在过去的几十年中，肿瘤标志在技术上和定义上有了突破，这一切都促使了肿瘤标志研究的快速发展。

糖链抗原19-9(Carbohydrate Antigen 19-9，CA19-9)是1979年Koprowski等用结肠癌细胞免疫小鼠，并与骨髓瘤杂交所得116NS19-9单克隆抗体。它是一种高相对分子量(200～1000kD)的糖蛋白混合物，其结构为Le^a血型抗原的唾液酸衍生物——唾液酸化的lacto-N-fucopenteose II神经节苷脂(sLNF-GM)，被称为Le^xa。

CA19-9结、直肠癌和胰腺癌的标志，它已通过FDA的批准，可以用于胰腺癌患者血清的定量检测和辅助检测。Centocor法检测CA19-9正常参考值上限为37kU/L，99％正常人低于上限值。CA19-9脏器特异性不强，在各种腺癌中都可升高，如99％的胰腺癌、67％的肝胆管癌、40％～50％的肝癌、30％的结直肠癌以及15％的乳腺癌，有报道说10％～20％的良性胰腺炎和胃肠道疾病CA19-9均可升高，但其值很少超过120kU/L。CA19-9水平还和胰腺癌的临床分期有关，在37～1000kU/L时，有67％的患者可经手术切除，当CA19-9＞1000kU/L时仅有5％患者可以手术。CA19-9有助于胰腺癌和结、直肠癌的监测，其水平升高预示着肿瘤复发，比超声和临床诊断早1～7个月。

上世纪70年代中期Arakawe首次报道用发光信号进行酶免疫分析，利用发光的化学反应分析超微量物质，特别是用于临床免疫分析中检验超微量活性物质。目前，这一技术已从实验室的稀有技术过渡到临床医学的常规检测手段。化学发光免疫分析(ChemiluminescenceImmunoassay，CLIA)是将化学发光或生物发光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。其检测原理与放射免疫(RIA)和酶免疫(EIA)相似，不同之处是以发光物质作为底物，并藉助其自身的发光强度直接进行测定。

在化学发光免疫分析中包含两个部分，即免疫反应系统和化学发光系统。免疫反应系统，其基本原理同酶联免疫技术(ELISA)。化学发光系统的原理在于免疫反应中的酶作用于发光底物。发光底物在酶的作用下，底物发生化学反应并释放出大量的能量，产生激发态的中间体。这种激发态中间体，当其回到稳定的基态时，可同时发射出光子。利用发光信号测量仪器即可测量光量子产额，该光量子产额与样品中的待测物质的量成正比。由此可以建立标准曲线并计算样品中待测物质的含量。

化学发光免疫分析既具有放射免疫的高灵敏度，又具有酶联免疫的操作简便、快速的特点，易于标准化操作。且测试中不使用有害的试剂，试剂保持期长，应用于生物学、医学研究和临床实验诊断工作，成为非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。

发明内容

本发明将化学发光技术与免疫分析技术相结合，提供了一种简便，快速，稳定的检测CA19-9的试剂盒。

本发明的技术方案如下：

一种糖链抗原19-9化学发光定量检测试剂盒，包括反应板，酶结合物，发光底物，校准品，质控品，浓缩洗涤液，所述的反应板包被有抗糖链抗原19-9抗体。

所述的校准品以糖链抗原19-9纯品配制，浓度为0、7.5、30、60、120、240、480U/ml。

所述的质控品以糖链抗原19-9纯品配制，由质控品I和质控品II两部分组成，质控品I的浓度为10-50U/ml，质控品II的浓度为100-150U/ml。

所述的质控品I的浓度优选为30.8U/ml，质控品II的浓度优选为120.6U/ml。

所述的酶结合物为HRP标记的抗糖链抗原19-9抗体；所述的反应板材质是不透明的聚苯乙烯或聚乙烯，所述的发光底物为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物，所述的浓缩洗涤液是pH7.0-pH8.0的中性缓冲液。

本发明可以专一的定量检测出病人血清CA19-9的含量，判断预后水平及鉴别胰腺良恶性肿瘤。与传统的ELISA技术相比，本发明不仅保留了ELISA技术的高度特异性，检测结果的稳定性、可靠性和操作的简便性，同时采用的化学发光法能提高检测的灵敏度。本试剂盒设计完善，包含各种应有试剂，使检测结果更为精确、可信。

附图说明

图1本发明的CA19-9定量检测试剂盒的血清检测结果与罗氏试剂盒检测结果的相关性。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：

CA19-9定量检测试剂盒的制备

其步骤主要是：(1)抗CA19-9的抗体包被板制备(CA19-9检测反应板的制备)；(2)酶标抗体的制备；(3)CA19-9校准品的制备；(4)CA19-9质控品的制备；(5)化学发光底物液的制备；(6)洗涤液制备；(7)半成品及成品组成

(1)抗CA19-9的抗体包被板制备

a.包被：取1mol/L Na₂HPO₄ 77.4ml和1mol/L NaH₂PO₄ 22.6ml混匀，加入去离子水定容至1000ml即成10倍包被液，临用前稀释十倍，加入适量抗CA19-9单抗(购自瑞典康乃格)混匀，然后加入到微孔板板孔中，100μl/孔，4℃ 16小时；

b.封闭：弃去包被液，在吸水纸纸上拍干，加入含有3％ BSA和0.05％防腐剂(Proclin^TM 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，200μl/孔，37℃ 2小时；

c.封袋：弃去封闭液，在吸水纸上拍干，室温下于真空干燥箱中抽5小时，立即进行真空封袋，检查有无漏气，如有重新封袋，贴上标签后于2-8℃保存。

(2)酶标抗体的制备

抗CA19-9单抗用过碘酸盐氧化法与辣根过氧化物酶交联，通过方阵滴定，确定酶标抗体的使用浓度。

(3)CA19-9校准品的制备

用含有3％ BSA和0.05％防腐剂(Proclin^TM 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)稀释CA19-9(购自瑞典康乃格)，分装0、7.5、30、60、120、240、480U/ml。

(4)CA19-9质控品的制备

用含有3％ BSA，1％海藻糖和0.05％防腐剂(Proclin^TM 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)稀释CA19-9配制质控品1，2。浓度分别为30.8U/ml和120.6U/ml。

(5)化学发光底物液的制备

购买(购自ThermoFisher)商品化发光底物液进行分装。

(6)20×浓缩洗涤液制备

取NaCl 170g吐温-20 10ml加水定容至1L即成，临用前稀释20倍

(7)半成品及成品组成

上述步骤所得产品分装后即为半成品。抽检合格后组装成试剂盒成品，成品还需抽检，合格后才能出厂。

综上，本发明的研究过程中，本发明的发明人首先对本发明所用的原材料进行了筛选实验和质量鉴定，包括标记抗体及包被抗体的活性，载体的颜色、吸附性和变异大小，化学发光的发光强度、持续时间。然后对包被方法进行了研究，用不同的包被缓冲液和保护液进行了实验，选出最适合的包被缓冲液和保护液，通过抗体不同包被浓度实验，找到最佳的浓度条件，同时也对真空干燥的时间和温度也进行了研究，最后确定了干燥时间最短，稳定性最好的时间。对于HRP的标记可以有不同的方法，通过反复探索和对比实验最终找到简便，产率高，成本低，质量可靠的标记方法。

实施例2：

CA19-9定量检测试剂盒的使用方法

1.试剂和样本准备

(1)试剂准备

a.将试剂盒置室温(18～26℃)平衡20分钟。

b.从试剂盒中取出浓缩洗涤液，用新鲜的纯化水1∶20稀释后加入洗板机的洗液瓶中。

(2)样本准备

使用前将待测的合格血清或血浆置室温(18～26℃)平衡20分钟。

2.操作步骤

a.取出所需的CA19-9抗体包被微孔板置于微孔架上

b.加入校准品1～6、质控品1～2和待测样本，每孔50μl，充分混匀，置37℃恒温箱孵育90分钟。

c.手工洗涤：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔、静置5秒，甩干，重复5此后拍干。或者洗板机洗涤：每孔350μl，重复4次，洗涤后拍干。

d.加入酶结合物，每孔50μl，充分混匀，置37℃恒温箱孵育60分钟。

e.重复步骤c。

f.加发光底物A、B每孔各50μl，充分混匀，立刻加入化学发光仪中检测信号值。

3.实验结果的计算

可以采用作图法或计算法进行结果计算

作图法：以标准品抗原含量的lg值为横坐标(X)，以其对应的信号值为纵坐标(Y)绘制出标准曲线，然后根据检测样本测得的信号值在标准曲线上查出相应的抗原含量lg值，在计算出抗原含量。

计算法：以标准品抗原含量的lg值为自变量(X)，以其对应的信号值为因变量(Y)，求出回归方程，将待测标本的信号值带入回归方程，求得相应的抗原含量。

实施例3：

CA19-9定量检测试剂盒的方法学鉴定

按照本领域中常规的制造及鉴定规程对实施例1中制备的试剂盒进行检定结果如下：

1.准确性

将已知含量样品用本发明实施例1中制备的试剂盒进行检测，计算回收率(回收率＝回收量/加入量×100％)，样本量不低于10，结果如下：

加入量 (U/ml)	30	30	60	60	120	120	240	240	400	400
											回收量 (U/ml)	28.2	29.3	58.3	62.4	126.8	124.3	252.4	248.6	378.2	396.7
回收率 (％)	94	98	97	104	106	104	105	104	95	99

2.特异性

将已知含量类似物用本发明实施例中制备的试剂盒进行检测，计算交叉反应率(交叉反应率＝检测值/加入量×100％)，结果如下：

名称	AFP (ng/ml)	CEA(ng/ml)	tPSA(ng/ml	CA125(U/ml)	CA153(U/ml)	SCC(ng/ml)	CYFR21-1(ng/ml)	NSE(ng/ml)
									加入量	1000	200	100	1000	500	200	200	500
检测值	1.23	0.56	0.43	2.38	1.53	0.38	0.23	0.79
									交叉反应率(％)	0.123	0.28	0.43	0.238	0.306	0.19	0.115	0.158

3.精密性

将质控品1和质控品2分别做10个平行孔，计算检测值的标准CV(CV＝标准偏差/平均值×100％)，结果如下：

4.灵敏度

标准品1做10个平行孔，计算其“浓度”均值x及标准差sd。按95％可信限，确定其“浓度”均值加2倍标准差(x+2sd)即为本试剂盒的灵敏度，结果如下：

5.稳定性

试剂盒中各组分置4℃和置37℃三天后同时进行实验，OD值下降不超过10％，结果如下：

标准品和质控品	标准品1	标准品2	标准品3	标准品4	标准品5	标准品6	标准品7	质控品1	质控品2
										4℃放置试剂盒检测信号值	3	69	260	613	1013	1751	3289	262	1028
37℃放置3天后试剂盒检测信号值	4	64	248	589	987	1643	3198	243	992

将以上结果汇总得出：

检测项目	检验标准	检验结果
			准确性	回收率在90％~110％	符合标准
特异性	与类似物的交叉反应率≤0.5％	符合标准
			精密性CV(％)	≤15％(n＝10)	符合标准
灵敏度	0.5U/ml	符合标准
			稳定性	试剂盒中各组分置37℃至少三天	符合标准

说明本试剂盒各项性能指标均合格。

实施例4：

正常人的CA19-9的含量和临界值的确定

随机取300例健康人血清用实施例1中的制备的CA19-9定量检测试剂盒进行测定，汇总所有测定值，以百分位数法确定其临界值(97.5％位数的参考限)，最终确定其临界值为35U/ml。

实施例5：

临床血清的收集。

收集临床肿瘤病人血清20份，10份正常人血清。

使用CA19-9试剂盒和罗氏试剂盒同时检测上述血清比较两种检测结果。

方法：

收集的血清样本分别使用本发明实施例1的糖链抗原19-9定量检测试剂盒，按实施例2的步骤进行操作，和罗氏试剂盒(按其操作说明书进行操作)，经统计学处理结果确定两种方法检测结果相关的相关性。

结果：

结果如图1显示，两种方法检测结果相关性为0.9973，两种方法检测的结果高度相关，说明两种方法具有同等使用价值。

Claims

1.一种糖链抗原19-9化学发光定量检测试剂盒，其特征在于，包括反应板，酶结合物，发光底物，校准品，质控品，浓缩洗涤液，所述的反应板包被有抗糖链抗原19-9抗体。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的校准品以糖链抗原19-9纯品配制，浓度为0、7.5、30、60、120、240、480U/ml。

3.如权利要求1所述的定量检测试剂盒，其特征在于，所述的质控品以糖链抗原19-9纯品配制，由质控品I和质控品II两部分组成，质控品I的浓度为10-50U/ml，质控品II的浓度为100-150U/ml。

4.如权利要求3所述的定量检测试剂盒，其特征在于，所述的质控品I的浓度为30.8U/ml，质控品II的浓度为120.6U/ml。

5.如权利要求1所述的定量检测试剂盒，其特征在于，所述的酶结合物为HRP标记的抗糖链抗原19-9抗体；所述的反应板材质是不透明的聚苯乙烯或聚乙烯，所述的发光底物为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物，所述的浓缩洗涤液是pH7.0-pH8.0的中性缓冲液。