CN1320160A - 果糖胺氧化酶测定的方法和材料 - Google Patents

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Abstract

通过本发明的方法,根据患者或患者群血浆中果糖胺氧化酶活性,可以评估出现糖尿病相关血管并发症危险,鉴定候选果糖胺氧化酶抑制和/或拮抗剂,以及测定抑制和/或拮抗剂对患者抑制/或拮抗作用。

Description

果糖胺氧化酶测定的方法和材料
当前发明
本发明涉及用于患者的果糖胺氧化酶测定的方法和材料，尤其是，但不仅仅是用于那些易患有或者已患有糖尿病的患者。
糖尿病是一种常见病，其特征是严重长期的血管并发症。糖尿病患者有失明的危险上升25倍，肾衰竭的危险上升20倍，截肢和其结果导致坏疽的危险上升20倍，以及患冠状动脉疾病和局部缺血的脑部损害的危险上升2-6倍。见克雷恩等人在“糖尿病护理”一文(KleinR.klein B,Davis M,DeMets D,Diabetes Care 8:311-5(1985))。几乎一半在31岁前被诊断为糖尿病的患者，到达50岁前就去逝，大部分是由于心脏血管或肾脏的并发症，并常常伴随多年的跛足和残废疾病。见德科特等人在“糖尿病学”中的一文(Deckert T.,Poulsen J,LarsenM,Diabetologia 14:363-70(1978))。
现在认为血糖水平升高是糖尿病并发症的病因，其根据是糖尿病并发症和控制试验(DCCT)和英国糖尿病预期研究结果(the UnitedKingdom Prospective Diabetes Study(UKPDS)。参见“糖尿病控制与并发症实验研究组”一文(The Diabetes Control and Complications TrialResearch Group.N.Eng.J Med.379:977-85(1993))和Lancet352:837-53(1998)。DCCT和UKPDS都证明糖尿病并发症的发展与高糖血水平和长期症状通过严格的治疗可以改善。在控制当前的HbA1C水平以后，DCCT患者的微血管并发症的发展与结构蛋白如皮肤胶原的非酶促糖基化有关，但与高度糖基化的末端产品(AGE)的水平无关，如戊糖胺，carboxymethylsine和组织荧光(V Monnier-personalcommunication)。这些结果显示组织蛋白的非酶促糖基化具有比AGE形成更重要的病理生理学意义。
糖尿病血管疾病的许多特点可以归因于氧化应激，定义为稳定状态的反应氧和生物系统中氧基团水平的上升，见Baynes JW,Diabetes40:405-12(1991)。例如，超氧化物阴离子增加细胞内的钙离子，钙离子在内皮里调节硝基氧化物合成酶的活力。硝基氧化物是一种有效的血管扩张药，这已经在糖尿病早期的血管机能不良中发现，见Ido Y,Kilo C,Williamson JR,Nephrol Dial Tansplant 11 Suppl 5:72-5(1996)。在硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的从头合成中反应氧种类促使显著的剂量依赖性降低，导致基底膜上阴离子位点的去极化和对带正电荷蛋白如白蛋白的通透性增加，见Kashira N,Watanabe Y,Makin H,Wallner EI,& Kanwar YS.Proc Natl Acad Sci USA 89:6309-13(1992)。这种有渗漏毛细管临床上表现为视网膜病和微球蛋白尿。反过来，微球蛋白尿被认为是IDDM中糖尿病视网膜病和冠状动脉疾病和在晚期糖尿病视网膜病中突发死亡的危险因素，见Mogensen CE,Christensen CK,NEng J Med 311:89-93(1984)& Mogensen CE,Damsgaard EM,FrolandA.et al Clin Nephrol 38(suppl 1)；528-39(1992)。
一旦天然的抗氧化屏障被突破，这里有一种经过铜离子催化的Haber-Weiss反应从超氧化物产生的氢氧根基团的潜在性，见Halliwell B&Gutteridge JMC”生物学和药物中的自由基团”Clarendon Press Oxford(pp.136-76 1989)。氢氧根基团是导致严重的位点特异性损害的极其活泼的反应物。
氧基团参与了低密度脂蛋白(LDL)的氧化修饰，见Witztum JL.Br Heart J 69；S12-S18(1993)。氧化的LDL是一种动脉粥样硬化的危险因素，与组织巨噬细胞上的清洁剂受体结合导致泡沫细胞的形成和胆固醇酯在内皮脂肪层的聚集，是动脉粥样化的斑块形成的特点。
目前，糖尿病中氧化应激的来源还没有鉴定。我分离到一种新的细胞外酶，它能催化从糖基化蛋白中消除果糖胺。这个酶的存在在以前的世界文献中没有提到过。这个反应是重要的，因为果糖胺是所有美拉德产物的前体。根据它对糖基化蛋白底物的高特异性和它用氧作为受体，这种酶可以归类于果糖胺氧化酶1.5.3，见国际生化联合会命名委员会推荐的酶命名法，Academic Press,London PP.19-22(1979)。果糖胺氧化酶是一种有铜离子和醌协同因子的金属酶。反应产物是游离的非糖基化的蛋白，碳酸盐糖和超氧化物(见图1)。
发明概述
果糖胺氧化酶的存在在以前世界范围内的文献中都未提及，这是一种新酶。本发明涉及检测果糖胺氧化酶抑制和/或拮抗患者的方法，测定或鉴定果糖胺氧化酶抑制剂的方法，筛选患者来判定患者对血管(特别微血管)损害危险的方法和鉴定那些使用果糖胺氧化酶抑制剂和/或拮抗物患者所得到的好处的方法，测定哺乳动物果糖胺氧化酶水平的方法，确定糖尿病患者或可疑患者的血浆果糖胺氧化酶水平的方法，在体外测定血清或血浆中的方法以及相关的方法和程序。
一方面，本发明包括一种测定哺乳动物患者群或将哺乳动物患者血浆内果糖胺氧化酶活性从而判断患者群或患者有无血管损伤危险的方法，该方法包括测定患者群的果糖胺氧化酶和/或果糖胺氧化酶超氧化反应产物和/或果糖胺氧化酶的其他任一氧自由基产物的水平，并根据这个水平作出判断。
优选的所述患者是糖尿病患者或易感者。
优选的上述果糖胺氧化酶活性是对从每个患者采集血液进行测定的。
优选地体外测量是超氧化反应的产物或果糖胺氧化酶的任何其他氧自由基产物。
优选地危险期患者群或患者，除此之外，然后对其进行治疗来抑制和/或拮抗果糖胺氧化酶。
因此，在另一方面，本发明包括一种筛选哺乳动物病例(优选地糖尿病患者或易感患者)来确定患者遭受血管(特别是微血管)损伤的危险的方法，这种方法包括确定病例全体的果糖胺氧化酶的水平和/或果糖胺氧化酶的超氧化反应的产物(或果糖胺氧化酶的任何其他氧自由基)，并根据这个水平作出判断。
优选地上述的筛选是从每个患者采集血液。
优选地在体外进行测定的是果糖胺氧化酶的超氧化反应的产物(或果糖胺氧化酶的任何其他氧自由基)。
优选地危险期患者，除此之外用治疗来抑制和/或拮抗果糖胺氧化酶。
优选的实施步骤基本如下所述。
另一方面，本发明包括一种鉴定那些用果糖胺氧化酶抑制剂和/或拮抗剂治疗获得益处的患者的方法，这种方法包括测定一个患者或一群患者的血液中果糖胺氧化酶或相关的果糖胺氧化酶的超氧化反应的产物(或果糖胺氧化酶的任何其他氧自由基)。
优选地危险期患者，除上述步骤之外通过治疗来抑制和/或拮抗果糖胺氧化酶。
在另一方面，本发明包括一种监测患者果糖胺氧化酶抑制剂和/或拮抗剂的方法，这种方法包括测定(直接或间接地)这个患者果糖胺氧化酶的水平。
优选地这种测定是根据患者血液中的果糖胺氧化酶的超氧化反应的产物(或果糖胺氧化酶的任何其他氧自由基)。
优选地上述每种方法都涉及果糖胺氧化酶的特定水平和/或对应这种水平的患者(看情况)的反应产物，患者可能不在血管损伤的危险期，或没有从果糖胺氧化酶抑制剂和/或拮抗剂的治疗获得好处或还不需要果糖胺氧化酶抑制剂和/或拮抗剂。
在其他方面，本发明包括一种测定和/或鉴定果糖胺氧化酶抑制剂和/或拮抗剂的方法，这种方法包括测量一种后选底物或多种后选底物对果糖胺氧化酶的一种或多种醌协同因子或铜协同因子的影响。
在另一方面，本发明包括一种鉴定为了改善哺乳动物糖尿病引起血管损伤的实验用后选底物，这种方法包括测量这种底物对果糖胺氧化酶抑制和/或拮抗和选择实验的底物如
(ⅰ)它对这种酶或其协同因子是特异的
和
(ⅱ)它对这种动物已知没有毒性或未被禁止的剂量水平上的抑制
和/或拮抗是有效的。
在其他更多方面，本发明包括通过利用它的还原特性或氧化特性或通过美学方法在体外测定哺乳动物血液中果糖胺氧化酶超氧化反应产物(和/或果糖胺氧化酶的任何其他氧自由基产物)。
在一个优选的实施方式中，上述的测定程序包括使{优选地pH7～8(最优选地pH大于7.8)}超氧化物清除无效的机制(如超氧化物歧化酶)(SOD)[例如使用氢化钾或(更优选地)用抗人CuZn SOD抗血清进行预处理]和随后接触(例如加入)一种适合的果糖胺氧化酶底物[例如糖基化的牛血清白蛋白修饰来排除铜离子螯合活性，它能是果糖胺氧化酶无效。
优选地测定紧接着上述的优选程序，包括的考虑修饰实例中指示剂的吸附变化(如测定)，化学发光的变化或一些其他特征变化。
在其他更多方面，本发明包括一种确定哺乳动物(人或动物)果糖胺氧化酶水平的方法，这种方法至少包括上述的程序。
在其他更多方面，本发明包括一种确定糖尿病患者或可疑糖尿病患者的血浆果糖胺氧化酶水平的方法，这种方法至少包括上述方法的步骤。
在其他更多方面，本发明包括一种患者的血清或血浆样品，其中的超氧化物清除机制已失活和pH的范围是7～8。
优选地上述实例也包括或通过接触一种适合的果糖胺氧化酶底物。
优选地上述果糖胺氧化酶底物是糖基化的牛血清白蛋白修饰来清除铜离子螯合活性，它能使果糖胺氧化酶失活。
在其他更多方面，本发明包括为上述任何方法的目的根据本发明使用一样品。
读者应当注意的是我同时申请的PCT申请(要求New Realand对NZ332084,NZ332079,NZ334471的优先权)其中公开了许多涉及果糖胺氧化酶抑制和/或拮抗来对患者(尤其不仅是糖尿病或可疑糖尿病患者)血管(特别是微血管)的损伤进行治疗的步骤、方法、药物化合物、剂量单位等。
优选地任一种抑制剂或拮抗剂选自：
(ⅰ)铜离子螯合试剂(如triethylenetetramine，二氢氯化物，草
    霉胺，sar,diamsar，乙二胺，tetraacetic acid,δ-菲洛林和组
    氨酸)
(ⅱ)底物类似物(如N-乙酰胱胺，casptropril,enalapril)
(ⅲ)肼化合物(如二氨基胍，肼屈嗪和甲基多巴肼)本发明包括所附的权利要求，所使用的术语“和/或”意思是“和”和“或”。同时申请的PCT国际专利说明书的全部内容在此引证供作参考。
附图简述
图1显示从果糖和蛋白到形成果糖胺和Maillard产物的详细反应机制。果糖胺氧化酶通过两步反应降解果糖胺，首先释放一个α-dicarbonyl糖和接着氧化酶/蛋白复合体来释放游离的未糖基化的蛋白。还原态的铜协同因子在体内通过分子氧进行氧化和氧化产物是超氧化物。
图2显示果糖胺氧化酶测定和血浆果糖胺之间的关系。线性回归公式(y=0.0349x-5.9589；i2=0.7455)。
图3显示果糖胺氧化酶抑制剂对人血浆里酶活性作用。只经过实例，从这3类抑制酶活性的化合物里选择了3个抑制剂(如卡托普利是底物类似物，Carbidopa是肼化合物，和氰化钾是铜离子螯合剂)。
发明详述
(ⅰ)实验原理
果糖胺氧化酶催化果糖胺的降解，同时还原分子氧产生过氧化物反应产物(图1)。超氧化物是在水溶液里不稳定，自发歧化成过氧化氢和氧原子。歧化反应是强烈的pH依赖性反应，在酸性溶液里反应最快和在碱性溶液中降低反应。因此，酶活力是在pH值7～8和最优选是pH7.5时确定的，其中使用表1中列举的一种化合物，超氧化物更加稳定。
                      表1实验化合物              实验pH       反应类型     参考文献Ferncytochrome c          7.8          还原        McCord J & Fridovich I.J Biol Chem
                                               244:8087-93(1969)Nitroblue tetrazollum     7.8          还原        Halliwell B
                                               FEBS Lett 72:8(1976)Dichlorphenol靛酚         7.0          还原        Greenstock CL & Ruddock GW.
                                               Int J Radlat Phys Chem 8:367(1976)肾上腺素                  7.8          氧化        Misra HP & Fridovich I
                                               J Biol Chem 247:3170-5(1972)羟胺                      7.8          氧化        Elstner EF,Heupal A.
                                               Anal Biochem 70；616-20(1976)过氧化物酶                7.8           酶         Misra HP Fridovich I
                                               Anal Biochem 79；553-60(1977)NADH…LDH                 7.0           酶         Chan PC & Blelski BHJ
                                               J Biol Chem 249；1317-9(1974)NADH..GDH                 7.2           酶         Chan PC & Blelski BHJ
                                               J Biol Chem 255；87-(1980)
(ⅱ)因为超氧化物是一种潜在的毒性物质，超氧化物降解酶-超氧
化物歧化酶(SOD)在血浆中作用，作为对上升的超氧化物浓
度的一种生理反应。与健康的没有糖尿病的个体比较，SOD水
平在有糖尿病的患者血浆中显著上升，尤其是在那些有微血管
病如糖尿病的肾病和糖尿病的视网膜病。见Mizobuchi N,
Nakata H,Horimi T,Takahashi I.Rinsho Byori 41；673-8(1993)。
细胞外体液如血浆中的主要SOD同工酶是细胞外SOD，它是
一个含有4个同原子和4个锌原子的4聚体糖蛋白。见Karlsson
K & Marklund SL.Biochem J 242；55-9(1987)。除非它失活，否
则这种SOD活性将显著干涉根据在表1列举的检测系统中任
何血浆实验。
    几乎所有的人血浆SOD活性都对毫摩尔浓度的氢化钾，叠
氮钠或氟化钠的抑制敏感。选择地血浆SOD活性可以通过用抗
人CuZn SOD抗血清预处理血浆样品来排除。见Marklund SL.
Holme E,Hellner L Clin Chim Aeta 126；41-51(1982)。(ⅲ)步骤
果糖胺氧化酶活性可以用氧化还原反应活性染料，铁细胞色素
(ferricytochrome)C，它容易被超氧化物还原形成铁细胞色素
(ferricytochrome)C，其特征是550nM(ε250=22.1nm-1.cm-1)。试剂是50mMTES缓冲液pH7.4含有10μM细胞色素C(Sigma)，和50μM果糖胺作为糖基化的牛血清白蛋白。Cobas Bio(Roche)自动分析仪中执行实验的参数在表2中列出。
                  表2
PARAMETER LISTNG1   UNITS                               U/L2   CALCULATION FACTOR                  473.93   STANDARD 1 CONCENTRATION             04   STANDARD 2 CONCENTRATION             05   STANDARD 3 CONCENTRATION             06   LIMIT                                07   TEMPERATURE [DEG.C]                  30.08   TYPE OF ANALYSIS                     69   WAVELENGTH [NM]                      55010  SAMPLE VOLUME [UL]                   511  DILUENT VOLUME[UL]                   4512  REAGENT VOLUME [UL]                  20013  UNCUBATION TIME [SEC]                30014  START REAGENT VOLUME [UL]            2515  TIME OF FIRST READING [SEC]          0.516  TIME INTERVAL [SEC]                  30017  NUMBER OF READINGS                   218  BLANKING MODE                        119  PRINTOUT MODE                        1
一个酶单位定义为在上述实验条件下每分钟还原溶液中1μmol的细胞色素C的酶量。计算因子是根据下面公式从对铁细胞色素(ferricytochrome)C摩尔吸光系数来确定。
U/L(μmol.min-1.L-1)=TV×103/ε250×SV这里TV=总反应体积
SV=样品体积(ⅳ)材料糖基化的牛血清白蛋白底物按下面方法制备：(a)用氢硼化钠还原牛血清白蛋白(BSA)(Sigma)以除去蛋白氢
过氧化物。BSA(60g/L)溶解于0.145M NaCl,pH用NaOH
调整到9.0，加入氢硼化钠(200mmol/L)，溶液在室温温和
搅拌24小时。用冰乙酸排除多余的氢硼化钠和溶液在4℃对
0.145M NaCl完全透析。(b)．氢硼化还原的BSA通过将蛋白溶液与等体积的含有50mM葡萄
糖和0.02％叠氮钠的0.4M Na2PO4缓冲液pH7.4混合和在37℃
温育7天。多余的葡萄糖通过对0.145M NaCl完全透析而
除去。(c)糖基化的BSA(gBSA)进行乙酰化是通过加入0.2M碘乙酸，
调整pH到6.8和在室温温育24小时来进行的。多余的碘乙酸
通过对0.145M NaCl完全透析而除去。(d)gBSA上仍然存在的铜离子结合位点通过对含有100μM硫酸铜
的的0.145M NaCl透析而饱和。多余的铜离子通过对0.145M
NaCl完全透析而除去。(e)gBSA底物的糖基化程度通过果糖胺实验来确定(Hoffmann
La-Roche)。(ⅴ)底物特异性
对反应氧种类试验的特异性是在向反应混合物加入下列没有氧基团的清洁剂后：(a)超氧化物歧化酶来选择除去超氧化物；(b)过氧化氢酶来选择除去过氧化氢；&(ⅲ)甘露糖醇来清除羟基基团，测定抑制铁细胞色素(ferricytochrome)C还原的程度而进行测定的。结果在表3列出。
                     表3
游离基团清除剂         酶活性*      显著性
                       (U/L)         (P)
对比                   15.34±0.16    -
超氧化歧化酶(20Ku/l)   9.99±0.03     ＜0.0001
催化酶(1000kU/L)       12.23±0.03    ＜0.0001
超氧化歧化酶+催化酶    6.78±0.12     ＜0.0001
甘露糖醇(50mmol/L)     14.96±0.19    0.0421*确定加入溶剂中的游离基团清除剂。结果表明试验反应是测量从超氧化物和过氧化氢反应形成的超氧化物和羟基基团。(ⅴ)特异性细胞色素C是一种非特异性的还原剂和血清内其他还原物质或在样品采集时加入血液样品抗凝剂可能干扰实验，在表4中表示。
                             表4
添加剂*                     与对照相比的活性(％)
对照                         100
肝素(1000U/L)                24.4
EDTA(100μM)                 26.3*在溶剂加入和未加入(对照)添加剂分析人果糖胺氧化酶。(ⅵ)与果糖胺浓度的比较
在非糖尿病的血清里测量果糖胺氧化酶活性，并将结果与图2的血清果糖胺浓度相比较。(ⅶ)鉴定果糖胺氧化酶抑制剂
本活性实验的重要应用是作为一种方法来鉴定潜在的果糖胺氧化酶拮抗剂和抑制剂。果糖胺氧化酶抑制剂可以是结合或阻断醌协同因子的肼化合物，结合或阻断铜协同因子的铜离子螯合剂，或与酶正常底物相似的底物类似物。毫摩尔量的侯选物质加入反应混合物，对人血清样品的果糖胺氧化酶活性的降低进行了测量。carbidopa(肼化合物)，氢化钾(铜离子螯合剂)和卡托普利(底物类似物)的抑制能力显示于图3。
酶抑制剂的有效性通常用速度常数(K)表示，它通过特定浓度的抑制剂在给定的时间里抑制酶部分来确定。对酶活性中心的抑制剂的特异性用引起50％酶活力丧失(IC50)的抑制剂浓度来表示。这个体外实验的结果表示在1μM抑制剂浓度，最有效的酶抑制剂是甲基多巴肼(K=15％/分钟)，卡托普利(K=2.6％/分钟)次之，氢化钾(K=1.2％/分钟)最差。甲基多巴肼还表现对果糖胺氧化酶活性中心高度的特异性(IC50=0.50μM)，卡托普利(IC50=0.83μM)，氢化钾(IC50=6.36μM)。

Claims (27)

1．一种测定哺乳动物群或个体患者血浆内果糖胺氧化酶活性，判断患者群或患者有无血管损伤危险的方法，该方法包括测定患者群的果糖胺氧化酶和/或果糖胺氧化酶超氧化反应产物和/或果糖胺氧化酶的其他任一氧自由基产物的水平，并根据这个水平作出判断。
2．如权利要求1的方法，其中患者是患有或者易感糖尿病的人。
3．如权利要求1或2中方法，其中所述的果糖胺氧化酶活性是对从每个患者采集到的血样进行测定。
4．如权利要求3的方法，其中体外测量的是果糖胺氧化酶超氧化反应产物或其他任一氧自由基产物。
5．如上述权利要求中任何一项的方法，其中，对所述处于危险期的患者群或个体患者进行治疗从而抑制和/或拮抗果糖胺氧化酶。
6．一种鉴定那些用果糖胺氧化酶抑制剂和/或拮抗剂治疗获得益处的患者的方法，该方法包括：直接地或者根据果糖胺氧化酶的超氧化反应的产物或果糖胺氧化酶的任何其他氧自由基产物测定个体患者或患者群血液中果糖胺氧化酶。
7．如权利要求6的方法，其中所述处于危险期的患者群进行治疗从而抑制和/或拮抗果糖胺氧化酶。
8．一种监测患者果糖胺氧化酶抑制剂和/或拮抗剂的方法，该方法包括直接或间接地测定该患者果糖胺氧化酶的水平。
9．如权利要求8的方法，其中所述的测定是根据患者血液中的果糖胺氧化酶的超氧化反应的产物或果糖胺氧化酶的任何其他氧自由基产物。
10．前述的权利要求中任何一项的方法，它涉及果糖胺氧化酶和/或相关反应产物的特定水平的测定，并比较不处于血管损伤危险期的或没有从果糖胺氧化酶抑制剂和/或拮抗剂的治疗获得好处的或还不需要果糖胺氧化酶抑制剂和/或拮抗剂的患者或患者群的这种水平。
11．一种测定和/或鉴定果糖胺氧化酶抑制剂的方法，该方法包括测量一种或多种候选物质对果糖胺氧化酶的一种或多种醌协同因子或铜协同因子或至少一种果糖胺氧化酶底物类似物的影响。
12．一种鉴定用于改善哺乳动物糖尿病引发血管损伤的实验用后选物质的方法，这种方法包括测量这种物质对果糖胺氧化酶的抑制和/或拮抗以及选择筛选底物，其中：
(ⅰ)它对这种酶或其协同因子是特异的，
和
(ⅱ)在对所述哺乳动物已知没有毒性或副作用的剂量水平上，它可
以有效地实现所述抑制和/或拮抗。
13．哺乳动物血液中果糖胺氧化酶超氧化物反应产物(和/或任何其他氧自由基团产物)的体外测量方法，通过利用它的还原特性或它的氧化特性或通过酶促方式来实现。
14．如权利要求13的测量方法，其中的步骤涉及灭活超氧化物清除机制(如超氧化物歧化酶)(SOD)和随后接触到适合的果糖胺氧化酶底物。
15．如权利要求14的测量方法，它是在pH7到8的条件下进行的。
16．如权利要求15的测量方法，其中所述的pH值大于7.5。
17．如权利要求16的测量方法，其中所述灭活通过用抗人CuZnSOD抗血清预先处理血浆样品来实现。
18．如权利要求16中的测量方法，其中所述果糖胺氧化酶底物是进行了修饰以除去可能灭活果糖胺氧化酶的铜离子螯合活性糖基化的牛血清白蛋白。
19．如权利要求16中的测量方法，它涉及修饰样品指示剂中的吸附变量、化学发光变量或其它一些特征变量的测量。
20．一种测定哺乳动物的果糖胺氧化酶水平的方法，它包括权利要求19中要求的测量方法。
21．一种测定糖尿病患者或可疑糖尿病患者的血浆果糖胺氧化酶水平的方法，它包括权利要求19所述的测量方法中的步骤。
22．一种体外直接和/或间接测定血清或血浆中果糖胺氧化酶的方法，它包括权利要求19所述的测量方法中的步骤。
23．如权利要求11或12的方法，它包括权利要求13到22的任何一项的方法。
24．患者的血清或血浆样品，其中的超氧化物清除机制已经被灭活，且其pH的范围为7到8。
25．如权利要求24的样品，它已经通过接触一种适合的果糖胺氧化酶底物进行了修饰。
26．如权利要求25的样品，其中所述果糖胺氧化酶底物是进行了修饰以除去可能灭活果糖胺氧化酶的铜离子螯合活性的、糖基化的牛血清白蛋白。
27．对权利要求24至26所述的任何一项的样品的应用。
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