CN104374924B - 一种α1-抗胰蛋白酶免疫比浊法检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种α1-抗胰蛋白酶免疫比浊法检测试剂盒，属于临床体外检测试剂技术领域。本发明试剂盒包括试剂R1、试剂R2、校准品。通过在试剂R1中加入一定量的二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒，在试剂R2中加入一定量的牛血清白蛋白和Proclin-300，有效的提高了试剂盒的分析灵敏度和稳定性，其线性范围也较好，试剂的准确度高，有利于在市场中进一步的推广使用。
Description
技术领域
本发明涉及临床体外检测试剂技术领域，特别涉及一种α1-抗胰蛋白酶免疫比浊法检测试剂盒。
背景技术
α1-抗胰蛋白酶（简称α1-AT或AAT）是一种糖蛋白。含糖10%～20%，主要由肝脏合成。它是血清中最主要的蛋白酶抑制剂，对凝血酶、尿激酶等其他酶也有抑制作用；也是一种急性时相反应蛋白，在炎症性疾患时，α1-抗胰蛋白酶可透过毛细血管进入组织液，在炎症局部往往浓度很高，对急性炎性疾病有一定限制作用。α1-抗胰蛋白酶为呼吸系统的非特异性可溶因子，与呼吸道抵抗力关系密切，它可抑制多种酶的活性，包括细菌的酶，以及中性白细胞溶酶体分泌的蛋白酶、弹性蛋白酶、胶原酶、纤维蛋白溶酶和凝血酶。α1-抗胰蛋白酶的缺乏与慢性阻塞性肺病的形成关系密切，因为它的缺乏，不能及时控制感染和炎症产生的多种蛋白酶，而造成肺组织破坏。
与α1-抗胰蛋白酶缺乏直接相关的疾病主要是肺气肿和肝脏硬化。目前α1-抗胰蛋白酶主要用于因遗传性α1-抗胰蛋白酶缺乏引起的肺气肿患者的终身替补治疗和肺部炎症性疾病的防止，如慢性阻塞性肺气肿、肺囊性纤维化、急性肺损伤等。
α1-抗胰蛋白酶的检测方法有血清胰蛋白酶抑制容量试验、单项免疫扩散法、免疫比浊法。血清胰蛋白酶抑制容量试验操作过程复杂，易受血清中非抗胰蛋白酶的干扰，结果不够稳定，不宜用于开发临床检测试剂盒。而单向免疫扩散法操作简单，灵敏度尚可，但实验分析需要1-2天，并且沉淀环的直径很难精确测量，因此结果的特异性和精密度不高。
α1-抗胰蛋白酶免疫比浊法检测试剂盒是一种无需预处理样本，技术和设备要求不高，而精密度和特异性更高的分析方法。由于该方法不需要昂贵的设备，可以实现自动化，且可测定大量标本，因此受到临床广泛推广。但是普通的α1-抗胰蛋白酶检测试剂分析灵敏度不高，准确性和稳定性也不好，不利于临床分析检测的推广应用。
发明内容
针对于常规的α1-抗胰蛋白酶检测试剂盒存在的问题，本发明提供了一种α1-抗胰蛋白酶免疫比浊法检测试剂盒，稳定性和线性范围比常规的检测试剂盒要好，分析灵敏度高，有利于试剂在临床上的推广应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种α1-抗胰蛋白酶免疫比浊法检测试剂盒，其特征在于，它包含试剂R1、试剂R2和校准品，其中试剂R1组成为：50mmol/LpH7.2的磷酸盐缓冲液、0.1mmol/L的氯化钠、40g/L聚乙二醇400、0.1%-2%二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒；试剂R2组成为：6ml/L羊抗人α1-胰蛋白酶抗体、0.1mmol/L的氯化钠、20-40g/L牛血清白蛋白BSA、1ml/LProclin-300。
所述二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒为Fe3O4/SiO2复合纳米粒子，粒径为20-50nm。
所述试剂R1和试剂R2在使用时的体积比为R1：R2=200：80。
本发明所使用的二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒是采用以下方法制备的：
采用多元醇法制备Fe3O4纳米粒子。取一定的乙酰丙酮铁和三甘醇加入到回流加热反应装置中，在磁力搅拌和Ar气保护的条件下，将装置缓慢加热至沸腾，并保持回流一段时间。冷却后向反应溶液中加入乙酸乙酯使生成的四氧化三铁纳米粒子产生絮凝，磁性分离黑色产物，清洗数次，分散到乙醇中，即得到稳定的Fe3O4纳米粒子乙醇胶体溶液。之后将所得Fe3O4纳米粒子采用Stober水解法制得SiO2包覆的Fe3O4纳米粒子。所得Fe3O4/SiO2复合纳米粒子的粒径为20-50nm。
本发明所使用的校准品为宁波普瑞柏生物技术有限公司生产的α1-AT校准品。
本发明的试剂盒在具有双试剂功能的自动生化分析仪上进行，其具体使用方法如下：
加入生理盐水、样本或校准品8μl，之后再加入R1试剂200μl预孵育5min后读取吸光度A1，之后再加入80μl的试剂R2反应5min后，读取吸光度A2，并计算ΔA。
本发明的有益效果：
本发明提供的分析灵敏度高的α1-抗胰蛋白酶免疫比浊法检测试剂盒，通过在试剂R1中加入二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒，使该磁性纳米颗粒在静电吸附的作用下与羊抗人α1-胰蛋白酶抗体结合，从而使抗体在磁性纳米颗粒上形成凝集，大大的提高了试剂的分析灵敏度。同时在试剂R2中加入牛血清白蛋白，解决了抗体在稀溶液中不稳定这一难题，在试验中它能使抗体稳定，且相对地中性，但不会影响抗体的性质，而Proclin-300是高效的防腐剂，对各种细菌、霉菌、酵母及藻类有很强的抑制作用，从而解决了BSA长时间保存易发霉的缺点，因此BSA与Proclin-300的共同作用有效地增强了试剂盒的稳定性，有利于该试剂在市场中进一步的推广。
附图说明
图1实施例2准确度验证实验检测结果与对照组检测结果相关性；
图2实施例3准确度验证实验检测结果与对照组检测结果相关性；
图3实施例4准确度验证实验检测结果与对照组检测结果相关性。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例来进一步详细的说明。
实施例1
一种市面上常规的α1-抗胰蛋白酶免疫比浊法检测试剂盒，它包括试剂R1、试剂R2、校准品。
其中，试剂R1组成为：
pH7.2磷酸盐缓冲液50mmol/L
氯化钠0.1mmol/L
聚乙二醇40040g/L
试剂R2组成为：
羊抗人α1-胰蛋白酶抗体6ml/L
氯化钠0.1mmol/L
本实施例描述的α1-抗胰蛋白酶检测试剂盒，在使用时，其测定方法是采用具有双试剂功能的东芝120自动分析仪，操作如下：
加入生理盐水、样本或校准品8μl，之后再加入R1试剂200μl预孵育5min后读取吸光度A1，之后再加入80μl的试剂R2反应5min后，读取吸光度A2，并计算ΔA。
本实施例所使用的校准品为宁波普瑞柏生物技术有限公司生产的α1-AT校准品。
实施例2
一种α1-抗胰蛋白酶免疫比浊法检测试剂盒，它包括试剂R1、试剂R2、校准品。
其中，试剂R1组成为：
pH7.2磷酸盐缓冲液50mmol/L
氯化钠0.1mmol/L
聚乙二醇40040g/L
二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒0.1%
试剂R2组成为：
羊抗人α1-胰蛋白酶抗体6ml/L
氯化钠0.1mmol/L
牛血清白蛋白（BSA）20g/L
Proclin-3001ml/L
具体测定方法同实施例1。
实施例3
一种α1-抗胰蛋白酶免疫比浊法检测试剂盒，它包括试剂R1、试剂R2、校准品。
其中，试剂R1组成为：
pH7.2磷酸盐缓冲液50mmol/L
氯化钠0.1mmol/L
聚乙二醇40040g/L
二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒1%
试剂R2组成为：
羊抗人α1-胰蛋白酶抗体6ml/L
氯化钠0.1mmol/L
牛血清白蛋白（BSA）30g/L
Proclin-3001ml/L
具体测定方法同实施例1。
实施例4
一种α1-抗胰蛋白酶免疫比浊法检测试剂盒，它包括试剂R1、试剂R2、校准品。
其中，试剂R1组成为：
pH7.2磷酸盐缓冲液50mmol/L
氯化钠0.1mmol/L
聚乙二醇40040g/L
二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒2%
试剂R2组成为：
羊抗人α1-胰蛋白酶抗体6ml/L
氯化钠0.1mmol/L
牛血清白蛋白（BSA）40g/L
Proclin-3001ml/L
具体测定方法同实施例1。
对上述实施例1-4中制得的试剂盒进行实验验证。
准确度验证实验：
将实施例2、3、4的试剂盒作为实验组，市场上获得认可的一种准确度优异的α1-抗胰蛋白酶免疫比浊法检测试剂盒（上海某公司生产）作为对照组进行对比实验，检测的结果如图1-图3。
通过检测数据可知，实施例2、3、4检测试剂盒与对照组检测试剂盒的检测结果相关性分别为0.9960、0.9968、0.9961，均大于要求的0.990，相关性比较好，表明本发明的试剂盒与市场获得认可的具有优异准确度的α1-抗胰蛋白酶检测试剂盒有较好的一致性，证明本发明试剂盒添加的其他各种成分对其准确性不会造成影响，试剂盒依然保持较好的准确度。
线性相关性验证实验：
找到α1-抗胰蛋白酶高值样本为640mg/dL，用生理盐水进行系列稀释，配制6个不同浓度的样本，依次为640mg/dL、512mg/dL、384mg/dL、256mg/dL、128mg/dL、40mg/dL浓度的样本，每个浓度水平各样本分别测定三次，分别取其平均值。分别利用实施例1、2、3、4的试剂进行检测。检测结果如表1所示：
表1实施例1-4线性相关性验证实验数据结果
| 理论浓度（mg/dL） | 实施例1检测结果（mg/dL） | 实施例2检测结果（mg/dL） | 实施例3检测结果（mg/dL） | 实施例4检测结果（mg/dL） |
| 640 | 634.92 | 647.28 | 649.99 | 653.49 |
| 512 | 523.71 | 511.42 | 512.87 | 515.66 |
| 384 | 383.24 | 386.53 | 386.74 | 385.65 |
| 256 | 249.66 | 256.45 | 258.35 | 255.18 |
| 128 | 126.34 | 128.92 | 126.48 | 129.33 |
| 40 | 41.33 | 40.67 | 41.67 | 41 |
| 相关系数r | 0.9990 | 0.9999 | 0.9998 | 0.9997 |
检测结果显示，实施例1-实施例4检测结果相关性均大于0.990，但是实施例2-4的检测结果相关性均大于0.9997，说明本发明的试剂盒具有更好的线性相关性。
稳定性验证实验：
在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存试剂，检测四种实施例试剂的稳定性。四种试剂每月选取同一样本测定其吸光度三次，取平均值，与新鲜的实施例1试剂检测结果进行对比，从而确定试剂的稳定时间。检测数据如表2。
表2实施例1-4稳定性验证实验结果
| 时间 | 实施例1试剂检测结果 | 实施例2试剂检测结果 | 实施例3试剂检测结果 | 实施例4试剂检测结果 | 新鲜的实施例1试剂检测结果 |
| 12个月 | 1.6940 | 1.6501 | 1.6821 | 1.6625 | 1.6501 |
| 13个月 | 1.5232 | 1.4955 | 1.5721 | 1.5656 | 1.5421 |
| 14个月 | 1.6401 | 1.5892 | 1.5899 | 1.6404 | 1.6234 |
| 15个月 | 1.6096 | 1.6132 | 1.5797 | 1.6721 | 1.6254 |
| 16个月 | 1.6207 | 1.5898 | 1.6076 | 1.5911 | 1.5876 |
| 17个月 | 1.5300 | 1.4911 | 1.4923 | 1.4742 | 1.4902 |
| 18个月 | 1.0300 | 1.7200 | 1.6688 | 1.7410 | 1.6988 |
| 19个月 | 0.5209 | 1.5122 | 1.4954 | 1.4897 | 1.4962 |
| 20个月 | 0.0031 | 1.6011 | 1.6809 | 1.6813 | 1.6398 |
| 21个月 | 0.00000 | 1.5668 | 1.6032 | 1.5776 | 1.5874 |
| 22个月 | 0.00000 | 1.7612 | 1.7810 | 1.7428 | 1.7468 |
| 23个月 | 0.00000 | 1.7221 | 1.7135 | 1.6997 | 1.7041 |
| 24个月 | 0.00000 | 1.5756 | 1.5877 | 1.5969 | 1.6023 |
| 25个月 | 0.00000 | 1.0100 | 1.0437 | 1.0716 | 1.9870 |
| 26个月 | 0.00000 | 0.3822 | 0.4212 | 0.3854 | 1.3987 |
上述实验结果显示，实施例1试剂在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存15个月稳定，而实施例2、3、4试剂在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存24个月稳定，说明在试剂中加入牛的血清白蛋白和Proclin-300能有效的提高α1-抗胰蛋白酶检测试剂盒的稳定性。
分析灵敏度验证实验：
用实施例1-4制得的α1-抗胰蛋白酶免疫比浊法检测试剂盒测试已知浓度在56.8mg/dL的样本，记录吸光度差值ΔA。分别利用实施例1、2、3、4的试剂进行检测。检测结果如表3所示：
表3检测结果
| 理论浓度（mg/dL） | 实施例1检测结果ΔA | 实施例2检测结果ΔA | 实施例3检测结果ΔA | 实施例4检测结果ΔA |
| 56.8 | 1.0254 | 1.6871 | 1.6799 | 1.6864 |
通过检测数据可知，实施例2、3、4检测试剂盒的吸光度差值均比实施例1的高，说明在试剂中加入二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒在静电吸附的作用下与羊抗人α1-胰蛋白酶抗体结合，从而使抗体在磁性纳米颗粒上形成凝集，扩大了响应信号，大大的提高了试剂的分析灵敏度。
综合以上分析，本发明提供的α1-抗胰蛋白酶免疫比浊法检测试剂盒，在试剂R1中通过加入一定量的二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒和在试剂R2中加入一定量的牛血清白蛋白和Proclin-300能够有效的提高试剂盒的分析灵敏度和稳定性，而对试剂的准确度没有影响。因此，本发明提供的α1-抗胰蛋白酶免疫比浊法检测试剂盒有利于在市场中进一步的推广使用。
Claims (3)
1.一种α1-抗胰蛋白酶免疫比浊法检测试剂盒，其特征在于，它包含试剂R1、试剂R2和校准品，其中试剂R1组成为：50mmol/LpH7.2的磷酸盐缓冲液、0.1mmol/L的氯化钠、40g/L聚乙二醇400、0.1%-2%二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒；试剂R2组成为：6ml/L羊抗人α1-抗胰蛋白酶抗体、0.1mmol/L的氯化钠、20-40g/L牛血清白蛋白BSA、1ml/LProclin-300。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒为Fe3O4/SiO2复合纳米粒子，粒径为20-50nm。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1和试剂R2在使用时的体积比为R1：R2=200：80。
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| Date | Code | Title | Description |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |