JP6088651B2 - 粒子操作方法および粒子操作デバイス - Google Patents

Description

本発明は、目的物質の分離、抽出、精製、反応等の化学操作を行うための粒子の操作方法、およびそれに用いられる操作用デバイスに関する。

医学的検査、食品安全衛生上の管理、環境保全のためのモニタリング等では、多種多様な夾雑物を含む試料から、目的物質を抽出して、検出や反応に供することが求められる。例えば、医学的検査では、動植物から分離取得される血液、血清、細胞、尿、糞便等の生体試料中に含まれる、核酸、タンパク質、糖、脂質、細菌、ウィルス、放射性物質等を検出、同定、定量する必要がある。これらの検査に際しては、夾雑物に起因するバックグランド等の悪影響を排除するために、目的物質を分離・精製することが必要となる場合がある。

例えば、遺伝子検査では、生体試料中の核酸を、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）等の遺伝子増幅法により増幅させて、その配列決定が行われる。ＰＣＲ等の遺伝子増幅法によって核酸を効率的に増幅させるためには、各種の夾雑物を含む生体試料から、核酸を抽出・精製して、反応に供する必要がある。生体試料中の核酸の抽出・精製においては、旧来からフェノール・クロロホルム法が標準的に使用されていた。しかしながら、フェノール・クロロホルム法は、操作が煩雑である上に、使用する試薬が有害であり、廃液処理にコストがかかるとの問題がある。

特許文献１では、核酸がシリカに特異的に吸着する性質を利用して、粒子操作により、生体試料から核酸を抽出・精製する方法（ブーム法）が提案されている。この方法では、まず、プロテアーゼおよび界面活性剤の存在下で試料を処理して得られた溶解液を、グアニジン塩、ヨウ化物塩、尿素等のカオトロピック物質の存在下で、シリカ粒子と混合して、粒子表面に核酸を吸着させる。核酸が吸着したシリカ粒子は、夾雑物を除去するために、数回の洗浄が行われる。その後、塩濃度が低い溶液（溶出液）に、シリカ粒子複合体を投入すると、精製された核酸が溶出液中に溶出し、核酸の精製試料が得られる。このような粒子操作を適用した化学操作は、核酸を対象としたものの他、抗原抗体反応を利用したイムノアッセイ等への応用も進んでいる（例えば特許文献２参照）。

粒子を用いた操作では、核酸等の目的試料が吸着した粒子（固相）と、粒子に吸着されていない夾雑物を含有する水系液体（液相）とを適切に分離する必要がある。このような分離操作（Ｂ／Ｆ分離）として、粒子を分散させた水系液体を、水系液体と混和しない液体（例えばオイル）中に液滴として存在させ、この水系液体の液滴中で核酸等を粒子表面に吸着させた後、核酸が吸着した粒子のみを液滴からオイル中へ移動させる方法が提案されている。また、粒子の選択的な移動を容易とする観点から、シリカコートされた磁性体粒子等を用い、磁場操作によって、粒子を移動させる方法が提案されている。

水系液体がオイル中に液滴として存在する場合、オイルの流体抵抗や、オイルと水系液体の界面での撥水力、粒子表面の親水性基と水系液体との相互作用等が、液滴の位置や形状を保持する力として働き得る。そのため、水系液体の液滴から磁性体粒子のみをオイル中へ移動して分離させようとしても、液滴が磁性体粒子を伴ったまま磁場に追従するため、水系液体の液滴から粒子のみをオイル中へ分離させることは容易ではない。

このような問題に鑑み、水系液体の液滴の移動を抑制して、粒子のみを選択的にオイル中に移動させる方法が提案されている。例えば、特許文献３では、液滴およびオイルが封入される容器の内面に、隔壁等の物理的構造体を設けることによって液滴を堰き止め、間隙の一部から磁性体粒子のみを移動させ分離する方法が開示されている。しかしながら、特許文献３に開示の方法は、オイル封入部分に特殊な微細加工を施す必要があるため、デバイスの構成が複雑となる。また、物理的構造を設けても、粒子の周囲に付着した水系液体を完全に堰き止めることはできないため、Ｂ／Ｆ分離性が十分とはいえない。

特許文献４では、液滴の搬送面に電場を印加することにより、搬送面の所定位置に液滴を固定させた状態で、磁性体粒子のみを分離させる方法が開示されている。しかしながら、この方法は、デバイスに常に電場を印加しておかなければ液滴を固定できないため、デバイスの構成が複雑となる上、電力等のエネルギー供給が不足している環境では使用できないとの問題がある。そのため、途上国等のインフラ整備が遅れている環境や、テロや災害等の緊急事態等、短時間で多数の検体を検査することが求められる環境での使用に適しているとはいえない。また、生体試料の操作に用いられるデバイスは、コンタミネーション等の不具合の抑制や、感染防止等の観点から、使い捨てであることが好ましい。このような観点から、簡便、迅速、低コスト、かつ、あらゆる現場で、精製や検査等を行い得る化学操作方法、およびそれに用いられるデバイスの開発が求められている。

特許文献５では、水系液体と混和しない液体（シリコーンオイル等）に、ヒドロキシ脂肪酸、デキストリン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル等の低分子ゲル化剤を添加して、物理ゲルを形成し、オイル中の所定位置に水系液体の液滴を固定する方法が開示されている。物理ゲルは、ゾル・ゲル転移温度より高温では流動性を有するゾルとなり、ゾル・ゲル転位温度より低温では流動性を有さない半固体のゲル状となる。そのため、ゾル・ゲル転移温度以上に加熱されたゾル状のオイル中に水系液体を投入した後、冷却によりオイルをゲル化させると、ゲル中に水系液体の液滴が包埋固定される。この方法によれば、水系液体の液滴をゲル内の所定位置に固定したまま、磁場操作によって、磁性体粒子のみをゲルの内部に移動させることができる。そのため、夾雑物を含む水系液体と、目的試料が固定された粒子とを簡便かつ効率よく分離できる。

また、特許文献５の方法では、オイルを加熱してゾル状にすれば、液滴が包埋固定状態から解放され、ゾル状のオイル中を移動可能となる。そのため、物理ゲルが封入された容器内に温度勾配を設け、オイルがゲル状態の領域とゾル状態の領域とを共存させることによって、低温のゲル領域で核酸抽出・精製操作を行い、高温のゾル領域のオイル中で粒子と共に液滴を移動させることによってＰＣＲの温度サイクルを行うことができる。この方法によれば、所定位置での液滴の固定を要する核酸の抽出・精製と、液滴の移動を要するＰＣＲとを、密閉状態を保ったまま一つのデバイス内で行うことが可能となる。

特開平２−２８９５９６号公報 ＷＯ２００２／０９５４０７号国際公開パンフレット ＷＯ２００５／０６９０１５号国際公開パンフレット 特開２００９−１６２５８０号公報 特開２０１１−２３２２６０号公報

特許文献５に開示の方法では、物理ゲルを加熱してゾル化させた上で液滴を封入する必要があるため、デバイスの使用開始時に、加熱手段が必要となる。そのため、電力等のエネルギー供給が不足している環境での使用に適しているとは言い難い。また、デバイス作製の際、容器中にゲルを封入するためには、オイルにゲル化剤を添加し、ゾル・ゲル転位温度以上に加熱して混和させた後、ゾル状態を保ったまま容器内へ封入し、容器内でゲル化する必要があり、ゲルの装填作業が煩雑である。

さらに、特許文献５に開示の発明は、ゾル・ゲル転移を生じる物理ゲルを用いることによって、その目的を達成するものであるが、物理ゲルは高温環境でゾル化するため、高温環境においては、「ゲル中に水系液体の液滴を包埋固定して水系液体と粒子とを分離する」との所期の目的を達成できない場合がある。また、物理ゲルは、水素結合、ファンデルワールス力、疎水的相互作用、静電的吸引力等の弱い分子間結合力により、三次元ネットワークを形成しているため、常温環境下でも、輸送時の振動等によってゲルに剪断力や圧力等の外力が付加されると、分子間結合ネットワークが破壊されてゾル化を生じる場合がある。

また、本発明者らの検討によると、物理ゲルを用いた粒子操作により、核酸の分離・精製を行った際に、核酸溶液に不純物に由来する吸収ピークが確認された。このような不純物は、目的物の検出、同定、定量等の解析作業において、測定データに高いバックグラウンドを発生させ、解析精度の低下や誤判定等の不具合を生じる場合がある。

これらに鑑み、本発明は、簡便、迅速、低コストで、環境に左右されず使用可能な、粒子操作方法、および当該粒子操作を行うためのデバイスの提供を目的とする。

上記のような物理ゲルを用いた粒子操作における不純物の混入に関して、本発明者らが検討の結果、当該不純物は、ゲル中を粒子が透過する際に生じた穿孔を介して他の液体分画から混入した液体や、ゲルの構成成分に由来するものと推定された。一方、ゲル媒体として化学ゲルを用いた場合は、ゲルの装填操作が容易である上に、物理ゲルを用いた場合のような不純物混入の問題が解消されることを見出し、本発明に至った。

本発明は、粒子の操作方法に関する。本発明の粒子の操作方法は、水系液体中に存在する粒子が、水系液体に不溶または難溶であるゲル状媒体の内部へ移動させられるステップ；およびゲル状媒体の内部に存在する粒子が、ゲル状媒体の外部へ移動させられるステップを有する。好ましい形態において、ゲル状媒体の外部への粒子の移動は、最初に粒子が含まれていた水系液体とは別の水系液体中への移動である。

上記粒子操作は、例えば、複数の水系液体が各水系液体の間にゲル状媒体を介して装填されたデバイス内で行われる。当該デバイス内では、水系液体中に存在する粒子がゲル状媒体の内部へ移動させられるステップと、ゲル状媒体の内部に存在する粒子が他の水系液体中に移動させられるステップとが、複数回行われることが好ましい。一実施形態では、デバイス内の複数の水系液体のうち、少なくとも２つが、互いに異なる組成を有する。当該形態では、１つのデバイス内において、複数種の化学操作（分離、抽出、精製、反応等）を行い得る。

ゲル状媒体は、化学架橋ポリマーを含有するゲルであることが好ましく、例えば、架橋型オルガノポリシロキサンを含有するシリコーンゲルが好適に用いられる。また、ゲル状媒体の稠度は３４０〜４７５が好ましい。一実施形態において、ゲル状媒体は、さらに油剤を含有する。

本発明の粒子の操作方法において、粒子が水系液体からゲル状媒体の内部へ移動させられる際、および粒子がゲル状媒体内を移動させられる際に、粒子に付随する水系液体が、粒子から分離されることが好ましい。

本発明に用いられる粒子は、特定の物質を選択的に固定し得る粒子であることが好ましい。粒子に選択的に固定され得る物質としては、例えば、核酸、タンパク質、糖、脂質、抗体、受容体、抗原、リガンド、細胞等の生体由来物質が挙げられる。なお、「生体由来物質」とは、必ずしも生体から採取された試料に由来する必要はなく、ｉｎ ｖｉｖｏで得られた物質（例えば、ＰＣＲにより増幅された核酸等）も含まれる。

本発明の一実施形態において、粒子操作の対象となる粒子は磁性体粒子である。この場合、磁場の操作によって、粒子の移動が行われることが好ましい。

本発明の粒子操作は、例えば、粒子に固定された核酸の抽出や、粒子表面での抗原抗体反応等に適用できる。

さらに、本発明は、上記粒子操作に好適に用いられるデバイスに関する。本発明のデバイスは、水系液体と、水系液体に不溶性又は難溶性であるゲル状媒体と、水系液体およびゲル状媒体を保持する容器と、容器内において移動されるべき粒子とを有する。

また、本発明は、上記デバイスを作製するためのキットに関する。本発明のデバイス作製用キットは、水系液体、ゲル状媒体、および粒子を含む。当該キットは、これらの構成要素の一部が所定の容器内に予め装填されたものでもよい。

本発明の粒子操作方法では、目的物質が固定された粒子を、所定のゲルに接触させる、あるいはゲル内を通過させることによって、目的物質が固定された状態が保持されながら、粒子に付随する水系液体が、粒子から分離される。そのため、簡便、迅速、低コストで、Ｂ／Ｆ分離を実施できる。また、ゲル由来の夾雑物がほとんど発生しないため、夾雑物に起因するバックグランド等の悪影響が排除される。そのため、目的物質の分離・精製や、反応等の化学操作を、正確かつ高効率で行い得る。また、本発明の方法によれば、ゲルや水系液体が装填された容器を開閉することなく、複数の化学操作を１つのデバイス内の密閉系で行い得る。そのため、操作が簡便であることに加えて、コンタミネーション等の悪影響も排除できる。

本発明の粒子操作方法の概要を模式的に示す図である。 磁場操作により粒子の移動を行う実施形態を模式的に表す図である。 遠心力により粒子の移動を行うためのデバイス、および粒子操作の実施形態を模式的に表す図である。 核酸の分離・精製に用いられるデバイス、および当該デバイスにおける粒子操作の実施形態を模式的に表す図である。 実施例および比較例の粒子操作によって抽出・精製された核酸のＵＶ吸収スペクトルである。

まず、本発明の粒子操作方法の概要および原理について説明する。
図１は、本発明の粒子操作に用いられるデバイス５０の一実施形態、および当該デバイスを用いた粒子操作方法を説明するための模式図である。図１（ａ）において、容器１０内には、底部側から第二水系液体３２、ゲル状媒体２１、および第一水系液体３１がこの順に装填されている。ゲル状媒体２１は、第一水系液体３１および第二水系液体３２と混和性を有さず、これらの水系液体に対して、不溶または難溶である。

第一水系液体３１中には、粒子７１が含まれている。この粒子７１の表面または内部には、核酸等の目的物質が固定されている。粒子７１への目的物質の固定は、例えば、第一水系液体３１中で行われる。予め目的物質を表面に固定させた粒子７１が第一水系液体中に添加されてもよい。また、第二水系液体３２およびゲル２１が装填された容器１０開口部から、目的物質を表面に固定させた粒子７１を含む第一水系液体３１を、ゲル状媒体２１上に注入してもよい。

粒子７１は、磁場や重力場等の作用により、第一水系液体３１からゲル状媒体２１側へと移動させられる（図１（ｂ））。粒子７１の周囲に液滴として物理的に付着している水系液体の大半は、粒子７１が、ゲル状媒体２１の表面から内部に進入する際に、粒子表面から脱離して、第一水系液体３１の液画分に残る。一方、粒子７１は、粒子に固定した目的物質を保持したまま、ゲル状媒体２１内を容易に移動できる。

粒子７１が磁性体粒子であり、磁場操作によって、第一水系液体３１からゲル状媒体２１側へと粒子が移動させられる場合、粒子が塊状となって移動し、塊の中に水系液体の液滴が残る場合がある。このように、水系液体が粒子７１に付随してゲル状媒体２１内へ移動した場合でも、当該水系液体の液滴は、個々の粒子に比して容量が大きいため、粒子７１に付随してゲル内を移動することができない。また、粒子７１がゲル状媒体２１の内部を通過する際のゲルの復元力が、粒子７１に付随する水系液体を搾り取る作用を奏する。そのため、粒子７１とそれに付随する水系液体の液滴とは、ゲル状媒体２１内で分離される。

ゲル状媒体２１内への粒子７１の進入および移動により、ゲル状媒体が穿孔されるが、ゲルの復元力による自己修復作用により、ゲル状媒体２１の孔は直ちに塞がれる。そのため、粒子の貫通孔を介して、水系液体がゲル内へ流入することは、ほとんど生じない。

ゲル状媒体２１内を通過した粒子７１は、ゲル状媒体２１から第二水系液体３２へと移動させられる（図１（ｃ））。この際、粒子７１に第一水系液体からの液滴が付随していても、当該液滴よりも先に粒子７１が第二水系液体と接触する。この際、粒子表面に付随した第一水系液体由来の液滴は、直ちに第二水系液体に置換され、第一水系液体由来の液滴はゲル状媒体内に残される。そのため、第二水系液体３２内への、第一水系液体由来の液滴の混入が防止される。

このように、本発明の粒子操作方法では、第一水系液体３１中に存在する粒子７１を、ゲル状媒体２１の内部へ移動させた後、ゲル状媒体の外部（上記の例では、第二水系液体３２中）へ移動させる。この操作により、粒子７１が目的物質を固定した状態を保ったまま、その周囲に付随する第一水系液体の液滴が除去される。このように、ゲル状媒体内を通過するように粒子を行うことによって、固体である粒子に固定されている目的物質（Ｂｉｎｄ）と、第一水系液体内で粒子に固定されていない夾雑物等の物質（Ｆｒｅｅ）とが適切に分離され、Ｂ／Ｆ分離が可能となる。

上記方法によれば、第一水系液体３１と第二水系液体３２との間に、流動性を有していない（あるいは低流動性の）ゲル状媒体２１が装填されているため、磁場や重力場によって粒子を移動させても、水系液体のゲル状媒体内への移動はほとんど生じない。そのため、水系液体の不用意な移動を防止するための電場制御等を行う必要がなく、簡便な機構でＢ／Ｆ分離が可能となる。したがって、固相抽出法での固相表面の洗浄や液置換が迅速に実施できる。

また、粒子７１を固相、第二水系液体３２を液相として、液相−固相での化学反応を行う場合、粒子７１が第二水系液体３２内に移動すると、その表面が、反応基質、触媒、その他反応に必要な成分を含んだ溶液に置換され、迅速に反応を開始することができる。さらに、ゲル状媒体２１を粒子が通過することにより、第一水系液体由来の液滴の大部分は粒子表面から除去されるため、副次的反応等による目的外物質の生成が抑制され、検出時のバックグラウンドが低く抑えられる。

一方、化学的相互作用を利用した目的物質の分離や検出を行う場合、目的物質が粒子に特異的に固定されていれば、それ以外の夾雑物はゲル状媒体の通過時に殆ど除去される。また、ゲル自体からの新たな夾雑物の発生もなく、目的物の正確な定性的、定量的検出が可能となる。

以下、本発明の実施形態につき、より詳細に説明する。

［粒子操作］
本発明では、目的物質が固定された粒子を、液体からゲル状媒体内へ移動させることにより、Ｂ／Ｆ分離を行い得る。また、ゲル状媒体中の粒子を、他の液体へ移動させることによって、目的物質の抽出、精製、反応、分離、検出、定性・定量分析等の化学操作を行い得る。このような粒子操作は、各種分析に先立って行われる前処理や、目的物質の分取（分離）処理、溶解処理、混合処理、希釈処理、撹拌処理、温度調節（加熱あるいは冷却）処理等へも適用可能である。

前記反応としては、無機化学反応や有機化学反応の他に、酵素反応、免疫化学反応等の生体物質の変化を伴う生物学的反応も含まれる。生物学的反応としては、例えば、核酸、タンパク質、脂質、糖などの生体物質の、合成系、代謝系および免疫系の反応が挙げられる。反応や分析の対象となる目的物質は、化学物質や生体物質に限らず、核物質や放射化学物質等も適用可能である。例えば、本発明の粒子操作によって、核分裂、核融合、放射化物質の生成等の反応や、放射性物質の定量、核種の同定等の分析を行うこともできる。

［粒子］
本発明に用いられる粒子は、磁場、電場、重力場、超音波場等の作用によって、液体中あるいはゲル状媒体中において、凝集、分散、移動等の操作を行い得る。粒子は、固体、または半固体であればよく、動植物や微生物の細胞を粒子として扱うことも可能である。液体中およびゲル状媒体中での粒子操作を容易とする観点から、粒子の粒径は１ｍｍ以下が好ましく、０．１μｍ〜５００μｍがより好ましい。粒子の形状は、粒径が揃った球形が望ましいが、粒子操作が可能である限りにおいて、不規則な形状で、ある程度の粒径分布を持っていてもよい。粒子の構成成分は単一物質でもよく、複数の成分からなるものでも良い。

本発明に用いられる粒子は、目的物質を固定できるものが好ましい。粒子表面あるいは粒子内部に目的物質を保持できるものであれば、固定方法は特に限定されず、物理吸着、化学吸着等の各種公知の固定化メカニズムが適用可能である。例えば、ファンデルワールス力、水素結合、疎水相互作用、イオン間相互作用、π−πスタッキング等の種々の分子間力により、粒子の表面あるいは内部に目的物質が固定される。

粒子に固定される目的物質としては、例えば核酸、タンパク質、糖、脂質、抗体、受容体、抗原、リガンド等の生体由来物質や細胞自身が挙げられる。目的物質が生体由来物質である場合は、分子認識等により粒子、あるいは粒子表面の物質に目的物質が固定されてもよい。例えば、目的物質が核酸である場合は、シリカ粒子、あるいはシリカコーティングされた粒子を用いることにより、粒子表面に核酸を特異的に吸着させることができる。また、目的物質が、抗体(例えば、標識抗体)、受容体、抗原およびリガンド等である場合、粒子表面のアミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、アピジン、ビオチン、ジゴキシゲニン、プロテインＡ、プロテインＧ等により、目的物質を粒子表面に選択的に固定できる。

磁場操作により、凝集、分散および移動を簡便かつ正確に行い得ることから、磁性体粒子が好適に用いられる。磁性体としては、鉄、コバルト、ニッケル、ならびにそれらの化合物、酸化物、および合金等が挙げられる。具体的には、マグネタイト（Ｆｅ_３Ｏ_４）、ヘマタイト（Ｆｅ_２Ｏ_３、またはαＦｅ_２Ｏ_３）、マグヘマイト（γＦｅ_２Ｏ_３）、チタノマグネタイト（ｘＦｅ_２ＴｉＯ_４・（１−ｘ）Ｆｅ_３Ｏ_４、イルメノヘマタイト（ｘＦｅＴｉＯ_３・（１−ｘ）Ｆｅ_２Ｏ_３、ピロタイト（Ｆｅ_１−ｘＳ（ｘ＝０〜０．１３）‥Ｆｅ_７Ｓ_８（ｘ〜０．１３））、グレイガイト（Ｆｅ_３Ｓ_４）、ゲータイト（αＦｅＯＯＨ）、酸化クロム（ＣｒＯ_２）、パーマロイ、アルコニ磁石、ステンレス、サマリウム磁石、ネオジム磁石、バリウム磁石が挙げられる。

磁性体粒子としては、上記磁性体の表面に、目的物質を特異的に固定させるための物質、例えば、各種官能基を有する化合物、シリカ、ストレプトアビジン、黄色ブドウ球菌、プロテインＡ、プロテインＧ，免疫グロブリン等が付着したもの、あるいは当該物質で被覆されたものが好適に用いられる。このような磁性体粒子は、例えば、ライフテクノロジーズから販売されているＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）や、東洋紡から販売されているＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（登録商標）等の市販品を用いることもできる。

［ゲル状媒体］
本発明に用いられるゲル状媒体は、共有結合を介してゲル状態を維持する半固体材料である。ゲル状媒体を構成するゲル材料は、少なくとも粒子操作前においてゲル状、若しくはペースト状であり、用いる水系液体に不溶性または難溶性である。

ゲルは、物理ゲルと化学ゲルに大別される。物理ゲルは、水素結合、ファンデルワールス力、疎水的相互作用、静電的吸引力等の弱い分子間結合力により、三次元ネットワークを形成しており、熱などの外部刺激により可逆的にゾル・ゲル転移する。ゲル状物質がゾル化すると、流動性を有するために、水系液体の位置固定が行われず、粒子の移動に伴って水系液体も移動してしまうため、本発明の用途には不向きである。また、物理ゲル中を粒子が通過する際は、ゲルの三次元ネットワークを破壊しながら粒子が移動する。そのため、ゲルが通過した部分で局所的にゾル化を生じ易く、ゲル由来の夾雑物等が粒子表面に付着して、ゲル外に持ち出される場合がある。

一方、化学ゲルは、化学反応によって複数のポリマー鎖が共有結合を介して架橋されたものであり、架橋構造が維持されている限り、ゲル状態を保持できる。そのため、本発明に用いられるゲル状物質は、化学架橋ポリマーを含有する化学ゲルであることが好ましい。化学ゲル中を粒子が通過する際は、一時的にゲルが穿孔されるが、前述のように、ゲルの復元力によって直ちに修復されるため、ゲル由来の夾雑物等の混入が抑止される。なお、架橋点が可動であるトポロジカルゲル（環動高分子）は、架橋の位置が変化し得るものの、ゲル中を粒子が通過する前後で架橋が破壊されずにゲル状態が保持される。そのため、本明細書においては、トポロジカルゲルも化学ゲルに含まれるものとする。

本発明において、ゲル状媒体の稠度は、３４０〜４７５が好ましく、３５５〜４６０がより好ましい。稠度は、ＪＩＳ Ｋ２２２０：２００３に規定される、混和稠度試験により求められる。本明細書では、特に断りがない限り、稠度は２５℃における混和稠度を指す。なお、稠度とは、ゲル状あるいはペースト状の（半）固体物質の見かけの硬さを表す指標であり、規定円すいが試料に貫入した深さを、ｍｍの１０倍で表した数値である。稠度が大きいほど（すなわち、規定円すいが深くまで貫入するほど）、試料が柔らかいことを表す。稠度３４０〜４７５の範囲は、National Lubricating Grease Institute（米国潤滑グリース協会）の定めたＮＬＧＩ稠度番号のＮｏ．０〜Ｎｏ．０００に相当する。

ゲル状媒体の稠度が４７５以下であれば、流動性が低いため、ゲル内を粒子が移動する際に、ゲルの復元力によって、粒子表面に付随する液滴の分離が促進される。また、ゲル状媒体の稠度が３６０以上であれば、ゲルが適度の流動性を有するため、磁場や重力場等の作用によって、粒子を水系液体からゲル内に進入させ、ゲル内を移動させることができる。

本発明に用いられるゲル状媒体は、稠度の温度依存性が小さいことが好ましい。例えば、温度６０℃に加熱した場合でも、ゲル状媒体の稠度が上記範囲内であることが好ましい。稠度の温度依存性が小さければ、使用環境に依存することなく、適切に粒子操作を行い得る。かかる観点からも、本発明のゲル状媒体としては、前述のように化学ゲルを用いることが好ましい。

ゲル状媒体としては、例えばシリコーンゲルが好適に用いられる。シリコーンゲルを構成するポリマーとしては、架橋型オルガノポリシロキサン、アルキル変性部分架橋型オルガノポリシロキサン、シリコーン分岐型アルキル変性部分架橋型オルガノポリシロキサン等の架橋型オルガノポリシロキサンが挙げられる。オルガノポリシロキサンとしては、ジメチコン、ビニルジメチコン、メチルトリメチコン、メチルビニルシロキサン、ラウリルジメチコン、あるいはこれらの共重合体等が用いられる。ポリマーの分子構造は特に限定されず、直鎖、分枝状直鎖、環状、または網状であってもよい。

シリコーンゲルは、上記ポリマーに加えて、油剤を含有することが好ましい。油剤としては、上記ポリマーを膨潤させ、かつ水系液体と混和しない溶剤が好適に用いられる。このような溶媒としては、シクロペンタシロキサン、シクロメチコン、ジメチコン、ジメチコノール、メチルトリメチコン、フェニルトリメチコーン、シクロペンタシロキサン、ジフェニルシロキシフェニルトリメチコン、ミネラルオイル、イソドデカン、ネオペンタン酸イソドデシル、トリオクタノイン、スクワラン等が挙げられる。例えば、上記ポリマーを微粒子化したものを、油剤と混合することにより、ゲル状あるいはペースト状のシリコーンゲルが得られる。

ゲル状媒体中の上記ポリマーの含有量は、ゲル状媒体が適度の稠度を有するように、ポリマーの分子量や架橋度等に応じて、適宜に設定される。ゲル状媒体中のポリマーの含有量は、例えば、０．０１〜１００重量％であり、好ましくは０．１〜９０重量％、より好ましくは０．５〜８５重量％である。なお、ゲル状媒体として、予めポリマーと油剤とが混合されたシリコーンゲルの市販品を用いることもできる。このような市販品は、例えば信越化学工業やダウ・コーニングから入手できる。

本発明に用いられるゲル状媒体は、水系液体に不溶あるいは難溶の物質であれば、シリコーンゲルに限定されず、各種のゲル材料を使用可能である。上記のように、ゲル材料は、化学ゲルであることが好ましい。また、ゲル材料は、稠度が３４０〜４７５であることが好ましい。また、ゲル材料は、動粘度が高く流動性が低いことが好ましく、例えば２５℃における動粘度が５０ｍｍ^２／ｃｍ以上であることが好ましい。

このような要求を満たし得るゲル材料としては、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、（メタ）アクリル系ポリマー等の炭化水素系ゲル；ポリシロキサン、ＰＤＭＳ、シリコーンハイドロゲル等のシリコーン系ゲル；ＰＴＦＥ、ＰＦＡ、ＦＥＰ、ＥＴＦＥ、ＰＣＴＦＥ等のフッ素系ゲル；およびこれらを主成分とするゲル状、あるいはペースト状の混合物等も使用できる。上記炭化水素系ゲルの具体例としては、ポリエチレンを主成分としたプラスチベース（登録商標）等が挙げられる。

［水系液体］
水系液体は、粒子表面に固定された目的物質の、抽出、精製、反応、分離、検出、分析等の化学操作の場を提供するものである。水系液体は、これら化学操作のための単なる媒体として機能し得る他に、化学操作に直接関与するか、あるいは当該操作に関与する化合物を成分として含んでいてもよい。水系液体に含まれる物質としては、粒子に固定された反応性物質と反応する物質、当該反応によって粒子表面に固定された物質と更に反応する物質、反応試薬、蛍光物質、各種の緩衝剤、界面活性剤、塩類、およびその他の各種補助剤、並びに、アルコール等の有機溶剤等を例示することができる。水系液体は、水、水溶液、水懸濁液等の任意の態様で提供され得る。容器中に、ゲル状媒体を間に介して複数の水系液体が封入される場合、各水系液体は同一であってもよく、異なるものでもよい。

上記水系液体の例として、以下では、粒子操作により核酸の分離・精製を行う場合、および酵素免疫反応を行う場合について例示する。

＜核酸の分離・精製＞
粒子操作により核酸の分離・精製が行われる場合、粒子を移動させる方向に沿って、核酸抽出液、洗浄液および核酸遊離液が、それぞれの間にゲル状媒体を介して装填されたデバイスを用いることが好ましい（図４参照）。

核酸を含む試料は、特に限定されず、例えば、動植物組織、体液、排泄物等の生体試料、細胞、原虫、真菌、細菌、ウィルス等の核酸包含体を挙げることができる。体液には血液、髄液、唾液、乳等が含まれ、排泄物には糞便、尿、汗等が含まれる。また、これらの複数の組合せを用いることもできる。細胞には血液中の白血球、血小板や、口腔細胞等の粘膜細胞の剥離細胞、唾液中白血球が含まれ、これらの組合せを用いることもできる。核酸を含む試料は、例えば、細胞懸濁液、ホモジネート、細胞溶解液との混合液などの態様で調製されてもよい。

（核酸抽出液）
核酸の抽出を行うために用いられる核酸抽出液としては、カオトロピック物質、ＥＤＴＡ、トリス塩酸などを含有する緩衝液が挙げられる。カオトロピック物質としては、グアニジン塩酸塩、グアニジンイソチオシアン酸塩、ヨウ化カリウム、尿素などが挙げられる。これらの物質の存在下で、核酸は、シリカ粒子（あるいはシリカ被覆粒子）の表面に特異的に吸着する。そのため、上記の核酸を含む試料とシリカ粒子を、核酸抽出液中に添加すれば、核酸が粒子表面に選択的に固定される。核酸を含む試料からの核酸抽出の具体的な方法は、適宜決定することができる。例えば、特開平２−２８９５９６号公報を参考に、核酸を含む試料からの磁性体粒子を用いた核酸の抽出、精製を実施することができる。

（洗浄液）
洗浄液としては、核酸が粒子表面に固定された状態を保持したまま、試料中に含まれる核酸以外の成分（例えばタンパク質、糖質等）や、核酸抽出等の処理に用いられた試薬等を洗浄液中に遊離させ得るものであればよい。洗浄液としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸アンモニウム等の高塩濃度水溶液、エタノール、イソプロパノール等のアルコール水溶液等が挙げられる。

核酸が固定された粒子の洗浄方法は、当業者が適宜決定することができる。試料の種類や分離の目的、用途等に応じて、２種以上の洗浄液による洗浄を行うこともできる。一方、分離の目的や用途における不所望の阻害が生じない範囲において、洗浄を省略することもできる。

（核酸遊離液）
核酸遊離液としては、水または低濃度の塩を含む緩衝液を用いることができる。具体的には、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、蒸留水などを用いることができる。中でも、ｐＨ７〜９に調整された５〜２０ｍＭトリス緩衝液を用いることが一般的である。核酸が固定された粒子が核酸遊離液中に移動することにより、粒子表面から核酸を遊離させることができる。核酸が固定された粒子から核酸を溶出させる具体的方法は、上記溶出液中で粒子を懸濁させる方法が挙げられる。懸濁方法、懸濁のための撹拌時間、溶出時の温度等の溶出条件は、核酸の回収量を増加させ得るように適宜決定することができる。

＜ＥＬＩＳＡ法＞
粒子操作により、酵素免疫吸着測定法（Enzyme-linked immuno-sorbent
assay）を行う場合、例えば、粒子を移動させる方向に沿って、第一水系液体、第二水系液体、第三水系液体、第四水系液体および第五水系液体が、それぞれの間にゲル状媒体を介して容器内に封入されたデバイスを用いることができる。

この場合、粒子は、第一水系液体側から、第五水系液体へと順次移動させられる。第一水系液体中で、中で粒子表面に固定されている第一次抗体と試料中の被検抗原（被検物質）との聞の抗原反応を行わせ；第二水系液体中で、洗浄処理を行い；第三水系液体中で、酵素標識第二次抗体と被検抗原との抗原抗体反応を行わせ；第四水系液体中で、再度洗浄処理し；第五水系液体中で、粒子表面に固定された第二次抗体に結合している酵素と水系液体に含まれる発色物質との問で発色反応を一定時間行わせる。このように、ＥＬＩＳＡ法では、発色物質を用いた発色反応が行われるため、抗原抗体反応が可視化される。

さらに必要に応じて、第六水系液体に粒子を移動させて、さらなる処理（例えば、混合）を行った後に、第五水系液体中での反応結果を測定してもよい。第五水系液体中での反応結果は、分光光度計による吸光度測定により、定量的に評価できる。なお、定性評価であれば、目視により発色反応を確認してもよい。

従来のＥＬＩＳＡ法で定量分析を行う場合は、発色反応開始後の所定時間経過時に、水酸化ナトリウム等の反応停止試薬を新たに加えて、発色反応を停止させる必要があった。これに対して、上記方法によれば、粒子を第五水系液体の系外へ移動させることによって反応を停止できるため、反応停止試薬を追加することなく、閉鎖系において簡便に反応結果を得ることが可能となる。

上記ＥＬＩＳＡ法に用いられる各種の水系液体の組成は、各処理に適したものを当業者が適宜に選択され得る。また、上記操作の一部をデバイスの外部で予め行った後に、残りの操作を粒子操作により行ってもよく、上記操作の一部を粒子操作により行った後、残りの操作をデバイスの外部で行ってもよい。

なお、上記ではデバイス内で核酸の分離抽出を行う例、およびＥＬＩＳＡ法を行う例にについて説明したが、適宜の水系液体を用いることによって、上記以外の各種の抽出、精製、反応、分離、検出、分析等の化学操作を、１つのデバイス内で行うことができる。

［容器］
上記のゲル状媒体および水系液体は、所定の容器内に封入して用いられる。容器は、ゲル状媒体および水系液体を保持できるものであれば、その材質や形状は特に限定されない。例えば内径１〜２ｍｍ程度、長さ５０ｍｍ〜２００ｍｍ程度の直管状構造体（キャピラリー）や、幅１〜２ｍｍ程度、深さ０．５〜１ｍｍ程度、長さ５０ｍｍ〜２００ｍｍ程度の直線状溝が形成された平面板材の上面に、別の平面板材を貼り合わせた構造体等が用いられる。

容器の大きさを極力小さくすれば、微小液体操作用マイクロデバイス、または微小液体操作用チップとしても使用できる。なお、容器の形状は管状や面状に限定されず、粒子の移動経路が、十字あるいはＴ字等の分岐を有する構造であってもよい。また、エッペンドルチューブ等の錐形状の容器を用いてもよい。

本発明では、磁場や重力場等の操作によって、容器内の粒子を移動可能であるため、試料投入後の容器を密閉系とすることができる。容器を密閉系とすれば、外部からのコンタミネーションを防止できる。そのため、ＲＮＡ等の分解しやすい物質を操作する場合に、特に有用である。容器を密閉系とする場合、容器の開口部を熱融着する方法や、適宜の封止手段を用いて封止することができる。操作後の粒子や水系液体を容器外に取り出す必要がある場合は、樹脂栓等を用いて、取り外し可能に開口部を封止することが好ましい。

磁場操作によって磁性体粒子を移動させる場合、容器の外壁面に沿って磁石を移動させる。この操作により、磁性体粒子は、磁石に追随して、容器の内壁面に沿って移動する。このように、容器の内壁面が粒子の搬送面となる場合、搬送の際の摩擦抵抗を小さくするために、容器の内壁面は、平滑であることが好ましく、例えば、内壁面の算術平均粗さＲａは、０．１μｍ以下が好ましい。また、容器の内壁面は撥水性を有することが好ましい。容器の内壁面が撥水性であれば、粒子搬送の際の摩擦抵抗が低減されるとともに、粒子からの水系液体の分離が促進され得る。容器の内壁面は、２５℃における水系液体の接触角が９５°〜１３５°程度であることが好ましい。

このような特性を備える材質としては、ポリプロピレンやポリエチレン等のポリオレフィン、テトラフルオロエチレン等のフッ素系樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリカーボネート、環状ポリオレフィン等の樹脂材料が挙げられる。これらの素材の他、セラミック、ガラス、シリコーン、金属等も用いられ得る。容器内壁面の撥水性を高めるために、フッ素系樹脂やシリコーン等によるコーティングが行われてもよい。

粒子の操作中あるいは操作後に、吸光度、蛍光、化学発光、生物発光、屈折率変化等の光学的測定が行われる場合や、光照射が行われる場合は、光透過性を有する容器が好ましく用いられる。また、容器が光透過性であれば、容器内の粒子操作の状況を目視確認できることからも好ましい。一方、水系液体や粒子等を遮光する必要がある場合は、光透過性を有していない金属等の容器が好ましく用いられる。使用目的等によって、光透過部分と遮光部分とを有する容器を採用することもできる。

［ゲル状媒体および水系液体の装填］
容器内へのゲル状媒体および水系液体の装填は、適宜の方法により行い得る。管状の容器が用いられる場合、装填に先立って容器の一端の開口が封止され、他端の開口部からゲル状媒体および水系液体が順次装填されることが好ましい。内径が１〜２ｍｍ程度のキャピラリーのような小さな構造体へ、ゲル状媒体を装填する場合、例えば、ルアーロック式シリンジに金属製注射針を装着して、キャピラリー内の所定位置へゲル状媒体を押し出す方法により、装填が行われる。

容器内に装填されるゲル状媒体および水系液体の容量は、操作対象となる粒子の量や、操作の種類等に応じて適宜に設定され得る。容器内に複数のゲル状媒体領域や水系液体領域が設けられる場合、各領域の容量は同一でも異なっていてもよい。各領域の厚みも適宜に設定され得るが、操作性等を考慮した場合、例えば、２ｍｍ〜２０ｍｍ程度が好ましい。

［粒子操作デバイスおよびキット］
容器内へのゲル状媒体および水系液体の装填は、粒子操作の直前に行われてもよく、粒子操作前に十分な時間をおいて行われてもよい。前述のように、ゲル状媒体と水系液体とが混和しないため、装填後に長時間が経過しても、両者の間での反応や吸収はほとんど生じない。また、本発明で用いられるゲル状媒体は、物理ゲルに比して安定性が高いため、ゲルを装填後の運搬時の振動等の物理的作用や、高温環境に暴露された際の加熱によっても、ゾル化を生じ難い。そのため、本発明の粒子操作デバイスは、水系液体およびゲル状媒体が予め容器内に装填された状態で提供することができる。また、デバイス内に予め粒子が添加された状態で提供することもできる。

また、デバイス本体とは別に、粒子単体あるいは水系液体に含有された粒子が、独立に提供されてもよい。この場合、粒子は、デバイスを作製するためのキットの一構成部材としてとして提供されてもよい。例えば、容器、ゲル状媒体、水系液体等の他の構成部材とともに、キットの構成要素として、粒子を含めることができる。また、容器内に水系液体および／またはゲル状媒体が装填された状態で、さらにその上に、必要に応じて水系液体および／またはゲル状媒体を追加装填できるように、キットが構成されていてもよい。

デバイス内あるいはキットに含まれる粒子の量は、対象となる化学操作の種類や、各水系液体の容量等に応じて適宜に決定される。例えば、容器として、内径１〜２ｍｍ程度の細長い円筒形のキャピラリーが用いられる場合、粒子の量は、通常、１０〜２００μｇ程度の範囲が好適である。

［粒子操作手段］
水系液体からゲル状媒体への粒子の移動操作、およびゲル状媒体から水系液体への粒子の移動操作は、各種の方法により行い得る。例えば、磁性体粒子を磁場により操作する場合は、永久磁石（例えばフェライト磁石やネオジム磁石）や電磁石等の磁力源を用いて磁場操作を行い得る。図２は、磁場による粒子操作方法の一例を模式的に表す図である。

図２（ａ）において、第一水系液体３３中に、粒子７２が分散している。磁力源である磁石９を容器の外側に配置することにより、容器１１内の水系液体中に分散していた磁性体粒子７２を、容器の内壁面に凝集させることができる（図２（ｂ））。これによって、磁力源が容器の壁面を介して磁性体粒子に対して磁場を生じさせ、磁性体粒子を所期の位置へと操作できる。図２（ｃ）に示すように、磁石９を容器の長手方向に移動させることにより、磁性体粒子の凝集体は、磁力源の移動に追随して管の内面を、第一水系液体３３から、ゲル状媒体２２、第二水系液体３４へと順次移動する。磁性体粒子７２を第二水系液体３４へ移動させた後、磁石９を往復運動させたり、磁石９と容器１１との距離を変化させることによって、磁性体粒子７２を第二水系液体３４内で分散させることができる（図２（ｄ））。

第二水系液体のみを回収する場合や、第二水系液体の光学特性の測定を行う場合は、磁性体粒子を第二水系液体３４の領域外へ移動させることが好ましい。例えば、図２（ｅ）に示すように、再度磁場操作を行い、磁性体粒子７２をゲル状媒体２２内へ移動させることにより、第二水系液体３４の領域外へ磁性体粒子７２を除去できる。なお、図２では、容器内に２つの水系液体領域を有する例が図示されているが、３以上の水系液体領域を有する場合は、水系液体内での磁性体粒子の分散を行った後、再度磁性体粒子の凝集および移動を繰り返せばよい。

磁場以外による粒子の操作方法としては、重力場や、電場を用いる方法が挙げられる。重力場を用いた粒子操作としては、例えば、遠心機を用いた遠心場を利用して、粒子を移動させることができる。また、粒子がアルミニウム等の金属粒子である場合は、電磁誘導によって粒子を移動させることができる。その他、ゲル状媒体の物性や、粒子と目的物質との固定状態に影響を与えなければ、超音波振動を利用した粒子操作を行うこともできる。これらの操作を行う場合、粒子は磁性体でも非磁性体でもよい。

図３は、重力場により粒子操作を行うためのデバイスの一例、および当該デバイス５２を用いた粒子操作の実施形態を模式的に表す図である。図３（ａ）において、容器１２内には、底部から、第三水系液体３７、第二ゲル状媒体２４、第二水系液体３６、第一ゲル状媒体２３、および第一水系液体３５がこの順に重層されている。第一水系液体内には、粒子７３が分散されている。遠心機を用いて、このデバイス５３を所定の回転数で回転させ、遠心操作を行うことにより、第一水系液体３５内の粒子７３は、第一ゲル状媒体２３、第二水系液体３６、第二ゲル状媒体２４、および第三水系液体３７へと順次移動させられる（図３（ｂ），（ｄ））。なお、粒子の移動操作は、遠心機を用いる以外に、容器１２の上部を保持した状態で、容器を振ることによって、重力場を付与する方法等によっても行い得る。

容器内に複数のゲル状媒体２３，２４が重層される場合、一実施形態では、容器の上部から底部に向けて、ゲル状媒体の稠度が順次小さくなるように、複数のゲル状媒体が容器内に装填される。例えば、図３の図示例では、上側に位置する第一ゲル状媒体２３の稠度が、底側に位置する第二ゲル状媒体２４の稠度よりも大きい（第一ゲル状媒体の方が柔らかい）。

このような形態によれば、第一重力場が付与された際に、粒子７３は、第一ゲル状媒体２３を通過するが、第二ゲル状媒体２４を通過しないようにデバイスを設計できる。第一重力場が付与された後のデバイスでは、第二水系液体３６内に粒子７３が留まる（図３（ｂ））。この状態で、デバイスを振とうすれば、粒子７３を第二水系液体３６内で分散させて、当該水系液体内での化学操作を適切に行うことができる（図３（ｃ））。
その後、第一重力場よりも大きい第二重力場を付与することにより、第二水系液体内の粒子７３を、第二ゲル状媒体２４を通過させ、第三水系液体３７内へと移動させることができる（図３（ｄ））。さらに、必要に応じて、デバイスを振とうして、粒子７３を第三水系液体３７内で分散させることができる（図３（ｅ））。

このように、稠度が異なる複数種のゲル状媒体を用いることにより、磁場操作以外の方法によっても、複数の水系液体内で、所期の化学操作を適切に行うことが可能となる。重力場の調整方法としては、例えば、遠心機を用いる場合は、第二遠心場を付与するための回転数Ｒ_２を、第一遠心場を付与するための回転数Ｒ_１よりも大きくすればよい。

上記のような遠心場を利用したデバイスは、例えば試料の精製や前処理に用いるスピンカラム等としても利用可能である。特に、本発明においては、ゲル状媒体として化学ゲルが用いられるため、遠心力等の外力の付加、振とう等の操作が行われた場合でも、ゲルの三次元ネットワークが保持され、ゲル状態が保たれる。そのため、物理ゲルを用いた場合のような、ゾル化に伴うゲル状媒体由来の夾雑物混入等の不具合を生じることなく、粒子操作を行うことができる。

［実施例１］
実施例１では、磁気ビーズを用いて、ヒト全血からゲノムＤＮＡの抽出を行った。磁気ビーズは、東洋紡製の核酸抽出キット（ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ^ＴＭ−Ｇｅｎｏｍｅ）に付属の磁気ビーズを、濃度６５０ｍｇ／ｍＬとなるように蒸留水に再懸濁したものを用いた。

＜分離・精製用デバイスの作製＞
まず、ポリプロピレン製パイプ（内径２ｍｍ，外径３．８ｍｍ、仁礼工業製）の一端を加熱溶融させて封止して容器とした。この容器に、溶出液（蒸留水：ＤＮａｓｅ，ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ；ナカライテスク製）１５０μＬ、シリコーンゲル（商品名「ＫＳＧ-１５」、信越化学工業製）２０μＬ、第二洗浄液（７０％エタノール，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）１５０μＬ、シリコーンゲル（ＫＳＧ-１５）２０μＬ、第一洗浄液（３０％ エタノール，２Ｍ グアニジン塩酸塩）１５０μＬ、およびシリコーンゲル（ＫＳＧ-１５）２０μＬを、底部から順に装填した。このようにして、図４（ａ）に示すように、容器１１０の開口端側から、第一ゲル状媒体１２１、第一洗浄液１３１、第二ゲル状媒体１２２、第二洗浄液１３２、第三ゲル状媒体１２３、および溶出液１３３が重層された、分離・精製用の管状デバイス１５０を得た。ここで用いたシリコーンゲル（ＫＳＧ-１５）は、ジメチコンとビニルジメチコンの共重合体の架橋物をシクロペンタシロキサンで膨潤させた物理ゲルであり、２５℃における稠度は４２０である。

＜細胞溶解およびプロテアーゼ処理＞
ヒト保存血２００μＬを１．５ｍＬのエッペンドルチューブに取り分け、１００μＬの細胞溶解液（４Ｍ ＧｕＳＣＮ，４０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ水溶液、ｐＨ６．５）および２０ｍｇ／ｍＬのプロテアーゼＫ（ロシュアプライドサイエンス製）水溶液を加え、ボルテックスミキサーで約１０秒間攪拌した。その後直ちに６８℃に加熱し、５分間の酵素反応を行った。反応後の液に１００μＬのイソプロピルアルコール、および磁気ビーズ懸濁液１０μＬを加え、ボルテックスミキサーで約１０秒間攪拌して、磁気ビーズ表面に細胞溶解液中のＤＮＡを吸着させた。

＜ＤＮＡの抽出・分離操作＞
上記管状デバイスの上端開口部から、上記の細胞溶解液１４１を磁気ビーズ１７１とともにデバイス１５０内へ投入した（図４（ｂ））。ネオジウム磁石（直径６ｍｍ、長さ２３ｍｍの円柱形、二六製作所製 商品名「ＮＥ１２７」）を用い、図４（ｃ）〜（ｆ）に示す要領で、デバイス１５０の下端底部に向けて、毎秒０．５〜５ｍｍの速度で、容器１１０の側面をなぞるように磁石９を移動させ、磁性体ビーズを操作した。

まず、管状容器１１０の側面に磁石９を近付け、細胞溶解液１４１内の磁気ビーズ１７１を磁石９の近傍に集めた後（図４（ｃ））、細胞溶解液１４１の側面から、第一洗浄液１３１の側面に向けて磁石９を移動させた。これにより、磁気ビーズ１７１を、細胞溶解液１４１から、第一ゲル状媒体１２１を介して第一洗浄液１３１内へ移動させた（図４（ｄ））。洗浄効率を高めるために、磁石９を往復移動させ、磁気ビーズ１７１が第一洗浄液１３１内で分散するように操作を行った。

その後、第一洗浄液１３１の側面から、第二洗浄液１３２の側面へ向けて磁石９を移動させ、磁気ビーズ１７１を、第一洗浄液１３１から、第二ゲル状媒体１２２を介して第二洗浄液１３２内へ移動させた（図４（ｅ））。磁石９を往復移動させ、磁気ビーズ１７１が第二洗浄液１３２内で分散するように操作を行った後、第二洗浄液１３２の側面から溶出液１３３の側面へ向けて磁石９を移動させ、磁気ビーズ１７１を、第二洗浄液１３２から、第三ゲル状媒体１２３を介して溶出液１３３内へ移動させた（図４（ｆ））。

磁石９を往復移動させ、磁気ビーズ１７１が溶出液１３３内で分散するように操作を行い、磁気ビーズに吸着しているＤＮＡを、溶出液（蒸留水）中に溶出させた。その後、溶出液１３３の側面から第三ゲル状媒体１２３へと磁石９を移動させ、ＤＮＡが溶出した磁気ビーズ１７１を、第三ゲル状媒体へ移動させた（図４（ｇ））。溶出液１３３の第三ゲル状媒体１２３との界面近傍のポリプロピレン管表面に、カッターナイフを用いて切れ込みを入れて、管を破断させ、開口部からＤＮＡ溶出液１４３を回収した（図４（ｈ））。

［比較例１］
比較例１では、実施例１と同様に、磁気ビーズを用いて、ヒト全血からゲノムＤＮＡの抽出を行ったが、分離に用いるゲルが化学ゲルから物理ゲルに変更された点において実施例１と異なっていた。

＜物理ゲルの準備＞
シリコーンオイル（信越シリコーン製 ＫＦ−５６）に、ゲル化剤として１２−ヒドロキシステアリン酸（和光純薬）を１％となるように添加し、９０℃に加熱して、完全にシリコーンオイルと混和させた。その後、オイル温度を約６０℃まで下げた状態で保持した。

＜分離・精製用デバイスの作製＞
実施例１と同様のポリプロピレン製パイプに、溶出液１５０μＬ、ゲル化剤添加オイル２０μＬ、第二洗浄液１５０μＬ、ゲル化剤添加オイル２０μＬ、第一洗浄液１５０μＬ、およびゲル化剤添加オイル２０μＬを、底部から順に装填した後、室温まで放冷し、オイルをゲル化させた。

＜ＤＮＡの抽出・分離操作＞
上記の物理ゲルを装填したデバイスを用い、実施例１と同様の磁石の操作により、ヒト保存血からＤＮＡの抽出・分離操作を行った。

［実施例１と比較例１の対比］
実施例１および比較例により回収された溶出液のＵＶ吸収スペクトルを、分光光度計（島津製作所製 「ＢｉｏＳｐｅｃ
ｎａｎｏ」）により測定した。結果を図５に示す。
図５から明らかなように、物理ゲルを用いた比較例１では、２２０ｎｍ付近に強い吸収がみられた。これは細胞溶解液、および第一洗浄液に含まれるグアニジウム塩の吸収波長と一致している。このように、比較例１では、試薬成分の除去が不十分であり、ＤＮＡ溶出液の波長２６０ｎｍにおける吸光度と波長２８０ｎｍにおける吸光度の比（Ａ_２６０／Ａ_２８０）が約１．４と、ＤＮＡの純度が低いことがわかる。そのため、得られたＤＮＡをＰＣＲ等の反応に供する場合や、他の分析に用いる際に、上記不純物が悪影響を及ぼすことが懸念された。

これに対して、化学ゲルを用いた実施例１では、比較例１のような波長２２０ｎｍ付近にピークを有する吸収は確認されず、ＤＮＡに特異的な波長２６０ｎｍ付近の吸収ピークが明確に確認された。実施例１のＤＮＡ溶出液のＡ_２６０／Ａ_２８０は約１．７であった。この結果から、シリコーンゲルを用いることで、Ｂ／Ｆ分離性が向上し、高純度の核酸を、容易に高回収率で抽出できることが分かる。

［実施例２］
実施例２では、磁気ビーズを用いて、酵素免疫化学測定用試料の調製を行った。磁気ビーズは、プロテインＧ被覆磁性体粒子（ライフテクノロジーズ製、Dynabeads Protein
G）を用いた。

＜デバイスの作製＞
ホウケイ酸ガラス製のキャピラリー（ＨＩＲＳＣＨＭＡＮＮ ＬＡＢＯＲＧＥＲＡＴＥ製、ｒｉｎｇｃａｐｓ、２００μｌ）の管内壁面をシリコンコートするために、管内にシリコンコート剤（富士理化工製、シリコナイズＬ−２５溶液）を充填し、１０分後に液を抜き取った。蒸留水で洗浄後、窒素で管内を乾燥させた。その後、キャピラリーの一方の末端の開口部を封止剤（ｃｈａ−ｓｅａｌ）により塞いだ。このキャピラリーの他方の開口部から、ＰＢＳＴ溶液（０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝食塩水)６０μＬ、およびシリコーンゲル（ＫＳＧ−１５）２０μＬを、底部から順に装填した。これを３回繰り返した後、最後にＰＢＳＴ溶液４０μＬを装填した。管内への気泡の混入を防止するため、キャピラリーを垂直に立てた状態で、これらのゲルおよび溶液の装填を行った。

＜陽性コントロールおよび陰性コントロールの作製＞
１００μＬのＰＢＳＴが分注されている容量１．５μｍＬのポリプロピレンチューブに、３μＬの磁気ビーズ懸濁液を添加し、ボルテックスミキサーで懸濁させた。その後、遠心分離（１０００ｒｐｍ，５秒）を行い、マグネティックスタンド（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）にチューブを立てて、１分間静置後、上澄液を除去した。その後、チューブ内にＰＢＳＴ１００ｍＬを加え、再度、懸濁、遠心および上澄除去を行った。

続いて、濃度１００ｐｇ／μＬに調整したＡＰ（アルカリファスファターゼ）ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）、および１％ＢＳＡ・ＰＢＳ（１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝食塩水）溶液５０μＬをチューブに加え、チューブミキサー上、室温で１５分間インキュベートして、陽性コントロールを作製した。また、ＡＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧを加えず、ＢＳＡ・ＰＢＳ溶液のみを加えたものを、陰性コントロールとして作製した。

＜分離操作＞
上記管状デバイスの開口部から、上記の各コントロール液を磁気ビーズとともに、デバイス内へ投入し、実施例１と同様の磁性操作により、デバイスの下端底部に向けて、毎秒０．５〜５ｍｍの速度で、容器の側面をなぞるように磁石を移動させ、磁気ビーズを操作した。各ＰＢＳＴ溶液中では、磁気ビーズを溶液中で分散させるため、キャピラリー側面からの磁石の脱着を数回繰り返し行った。最後にキャピラリーのｃｈａ−ｓｅａｌで閉じた部分を開放し、ＰＢＳＴに分散した磁気ビーズをチューブ内に回収した。

＜ＥＬＩＳＡ法による分析＞
操作後の磁気ビーズが入っているチューブを、マグネティックスタンドに立て、１分静置後、上澄液を除去し、ＰＮＰＰ発色試薬（Ｔｈｅｒｍｏ製）１００μＬを加えて、ボルテックスミキサーで磁気ビーズを懸濁させた後、チューブミキサー上、室温で１５分間アルカリフォスファターゼ反応を行った。続いて反応停止剤（２Ｎ
水酸化ナトリウム水溶液）５０μＬを加えて混合後、遠心（１０００ｒｐｍ，５秒）した。マグネティックスタンドにチューブを立て、１分間静置後、発色反応溶液を５０μＬ抜き取り、分光光度計（島津製作所製 「ＢｉｏＳｐｅｃ ｎａｎｏ」）で波長４０５ｎｍにおける吸光度測定した。

陽性コントロール（ｎ＝３）の吸光度は、９．２９７、９．２５４、９．３１１（平均９．２８７）であり、汎用チューブを用いる従来法によりＢ／Ｆ分離を行った場合（吸光度の平均値９．２１３）と同様の高い値を示した。一方、陰性コントロール（ｎ＝２）の吸光度は、０．３１４、０．３２９（平均０．３２２）であり、従来法によりＢ／Ｆ分離を行った場合（吸光度の平均値０．３３１）と同様の低い値であった。

実施例２の結果から、プロテインＧのＡＰ
ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｇｏａｔ ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧが固定された粒子においても、シリコーンゲル内を通過させた際に、その固定状態を保ったままで粒子操作を行い、高効率でＢ／Ｆ分離が可能であることが示された。また、ゲルからの夾雑成分も発生しないため、極めて低いバックグラウンドで、目的成分の高感度検出が可能となる。

上記実施例１および実施例２から、一の水系液体内に存在する粒子を、化学ゲル通過させて他の水系液体へ移動させる操作によって、水系液体を伴うことなく、粒子のみを移動させて、Ｂ／Ｆ分離を行い得ることが確認できた。また、本発明では、粒子に目的物質が固定された状態を保持したまま、ゲルや水系液体由来の夾雑物の悪影響を生じることなく、化学操作が可能であることがわかる。さらに、本発明の方法では、容器を開閉することなく、複数の化学操作を１つのデバイス内の密閉系で行い得るため、操作が簡便であることに加えて、コンタミネーション等の悪影響を排除できる。

５０，５２，５３ 粒子操作デバイス
１０〜１２ 容器
２１〜２４ ゲル状媒体
３１〜３７ 水系液体
７１〜７３ 粒子
９ 磁石
１５０ 粒子操作デバイス（核酸抽出分離用デバイス）
１１０ 容器（キャピラリー）
１２１〜１２３ ゲル状媒体（シリコーンゲル）
１３１，１３２ 水系液体（洗浄液）
１３３ 水系液体（溶出液）
１４１ 水系液体（細胞溶解液）
１７１ 粒子（磁気ビーズ）

Claims (12)

1. 複数の水系液体が水系液体に不溶または難溶であるゲル状媒体を間に介して装填されたデバイス内における粒子の操作方法であって、
   水系液体中に存在する粒子が、ゲル状媒体の内部へ移動させられるステップ；および
   前記ゲル状媒体の内部に存在する前記粒子が、他の水系液体中へ移動させられるステップを有し、
   前記粒子が、核酸、タンパク質、糖、脂質、抗体、受容体、抗原、リガンドおよび細胞からなる群から選択される１以上の特定の物質を選択的に固定し得る粒子であり、
   前記ゲル状媒体が、架橋型オルガノポリシロキサンを含有するシリコーンゲルであり、
   前記粒子に前記特定の物質が固定された状態で、前記水系液体から前記ゲル状媒体への前記粒子の移動、および前記ゲル状媒体から前記他の水系液体への前記粒子の移動が行われる、粒子の操作方法。
2. 前記ゲル状媒体の稠度が３４０〜４７５である、請求項１に記載の粒子の操作方法。
3. 前記ゲル状媒体が、さらに油剤を含有する、請求項１または２に記載の粒子の操作方法。
4. 前記粒子が前記水系液体からゲル状媒体の内部へ移動させられる際、および前記粒子がゲル状媒体内を移動させられる際に、前記粒子に付随する水系液体が、前記粒子から分離される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の粒子の操作方法。
5. ３以上の水系液体が各水系液体の間に前記ゲル状媒体を介して装填されたデバイス内において、
   前記他の水系液体へ移動させられた前記粒子が他のゲル状媒体の内部へ移動させられるステップと、前記他のゲル状媒体の内部に存在する前記粒子がさらに他の水系液体中に移動させられるステップと、をさらに有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の粒子の操作方法。
6. 前記複数の水系液体のうち、少なくとも２つが、互いに異なる組成を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の粒子の操作方法。
7. 前記粒子が磁性体粒子であり、磁場の操作によって、前記粒子の移動が行われる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の粒子の操作方法。
8. 少なくとも一つの水系液体内で、前記粒子に固定された核酸の溶出が行われる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の粒子の操作方法。
9. 少なくとも一つの水系液体内で、抗原抗体反応が行われる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の粒子の操作方法。
10. 容器内に複数の水系液体が水系液体に不溶または難溶であるゲル状媒体を間に介して装填されており、さらに前記容器内において移動されるべき粒子を有し、
    前記粒子が、核酸、タンパク質、糖、脂質、抗体、受容体、抗原、リガンドおよび細胞からなる群から選択される１以上の特定の物質を選択的に固定し得る粒子であり、
    前記ゲル状媒体が、架橋型オルガノポリシロキサンを含有するシリコーンゲルである、粒子操作デバイス。
11. 前記ゲル状媒体の稠度が３４０〜４７５である、請求項１０に記載の粒子操作デバイス。
12. 請求項１０または１１に記載の粒子操作デバイスを作製するためのキットであり、
    水系液体、前記水系液体に不溶または難溶であるゲル状媒体、および粒子を含み、
    前記粒子が、核酸、タンパク質、糖、脂質、抗体、受容体、抗原、リガンドおよび細胞からなる群から選択される１以上の特定の物質を選択的に固定し得る粒子であり、
    前記ゲル状媒体が、架橋型オルガノポリシロキサンを含有するシリコーンゲルである、粒子操作デバイス作製用キット。

Images