JP6378780B2 - 粒子操作方法および粒子操作用装置 - Google Patents

Description

本発明は、目的物質の分離、抽出、精製、反応等の化学操作を行うための粒子の操作方法、およびそれに用いられる粒子操作用装置に関する。

医学的検査、食品安全衛生上の管理、環境保全のためのモニタリング等では、多種多様な夾雑物を含む試料から、目的物質を抽出して、検出や反応に供することが求められる。例えば、医学的検査では、動植物から分離取得される血液、血清、細胞、尿、糞便等に含まれる、核酸、タンパク質、糖、脂質、細菌、ウィルス、放射性物質等を検出、同定、定量する必要がある。これらの検査に際しては、夾雑物に起因するバックグランド等の悪影響を排除するために、目的物質を分離・精製することが必要となる場合がある。

試料中の目的物質を分離・精製するために、粒径が０．５μｍ〜十数μｍ程度の磁性体の表面に、目的物質との化学的な親和力や分子認識機能を持たせた磁性体粒子を用いる方法が開発され、実用化されている。この方法では、磁性体粒子の表面に目的物質を固定させた後、磁場操作により磁性体粒子を液相から分離・回収し、必要に応じて、回収された磁性体粒子を洗浄液等の液相に分散させ、液相から磁性体粒子を分離・回収する工程が繰り返し行われる。その後、磁性体粒子が溶出液中に分散されることにより、磁性体粒子に固定されていた目的物質が溶出液中に遊離し、溶出液中の目的物質が回収される。磁性体粒子を用いることにより、磁石による目的物質の回収が可能となるため、化学抽出・精製の自動化に有利な特徴を持つ。

目的物質を選択的に固定可能な磁性体粒子は、分離・精製キットの一部として市販されている。キットは複数の試薬が別々の容器に入れられており、使用時はユーザーがピペット等で試薬を分取、分注する。これらのピペット操作や磁場操作を自動化するための装置も市販されている（特許文献１）。一方、ピペット操作に代えて、キャピラリー等の管状容器内に、溶解／固定液、洗浄液、溶出液等の液体層と、ゲル状媒体層とが交互に重層された管状デバイスを用い、このデバイス内で磁性体粒子を管の長手方向に沿って移動させることにより、目的物質を分離・精製する方法が提案されている（特許文献２）。また、液体層とゲル状媒体層とが交互に重層された管状デバイスを用い、液体層内で磁性体粒子表面に固定された物質の抗原抗体反応を行い、ＥＬＩＳＡ等の測定を行うことが提案されている（特許文献３）。

ＷＯ９７／４４６７１号国際公開パンフレット ＷＯ２０１２／０８６２４３号国際公開パンフレット ＷＯ２０１４／０５７９０７号国際公開パンフレット

磁性体粒子を用いた化学操作においては、粒子表面への目的物質の固定、粒子表面に付着した夾雑物等の洗浄除去、粒子表面に固定された目的物質の反応、目的物質の溶出等の各段階において、液体中に粒子を分散させ、粒子表面と液体とを十分に接触させる必要がある。磁性体粒子は、磁場操作により凝集するため、液体中への分散に際しては、磁性体粒子の凝集を解しながら操作を行う必要がある。

ピペット操作による液流では、凝集した磁性体粒子を解し、液体中に分散させることが困難な場合がある。また、ピペット操作は開放系で行う必要があるため、コンタミネーションが発生しやすい。特許文献２や特許文献３に開示の管状デバイスのように、容器内に液体が密閉封入されている場合は、ピペット操作を適用できない。

特許文献２では、ゲル状媒体の間に密閉封入された液体中で磁性体粒子を分散させる方法として、磁場の遮断又は減弱により、液体中に磁性体粒子を分散させる方法や、磁場の振幅移動、回転等の揺動運動により、磁性体粒子を移動させ、液体中で混合撹拌する方法が記載されている。特許文献３では、液体中で磁性体粒子を分散させる方法として、ローテーターを用いてデバイス（容器）を回転させる方法が開示されている。

しかしながら、これらの方法では、磁性体粒子を十分に分散できず、目的物質の収率低下や検査精度の低下を生じる場合があった。また、これらの管状デバイスでは、ゲル状媒体を通過させた後の磁性体粒子の表面に付着したゲルが磁性体粒子同士を凝集させる原因となり、液体中への磁性体粒子の分散がより困難となる場合がある。上記に鑑み、本発明は、磁性体粒子を用いた化学操作を行う際に、液体中での粒子の分散性を向上させるための、粒子の操作方法の提供を目的とする。

本発明者らが検討の結果、磁場の遮断・減弱や磁場の振幅移動や、容器を回転させる方法では、磁性体粒子が容器の内壁面近傍で移動するのみであり、液体全体への粒子の分散が困難であると考えられた。本発明の方法では、容器の内壁面に沿った周方向の運動と、容器の径方向の運動とを繰り返し行うことにより、液体中での粒子の分散性を高めることができる。

本発明は、管状容器内に装填された液体中で磁性体粒子を分散させるための粒子操作方法に関する。本発明の方法では、粒子を容器の内壁面に沿った周方向に移動させるステップ（周方向移動ステップ）と、粒子を容器の径方向を横断するように移動させるステップ（径方向移動ステップ）とが繰り返し行われる。磁性体粒子を周方向に移動させる際には、粒子が容器の内壁面に沿った帯状に分散することが好ましい。例えば、容器の回転速度を大きくすることにより、粒子を帯状に分散させることができる。

液体は、容器内に密封装填されていてもよい。粒子は特定の物質を選択的に固定し得る磁性体粒子である。特定の物質としては、核酸、タンパク質、糖、脂質、抗体、受容体、抗原、リガンド、細胞等が挙げられる。

本発明の一形態では、管状容器の長手方向が水平となるように配置した状態で、粒子操作が行われる。当該形態では、容器を回転させることにより、粒子が周方向に移動する。容器の回転を減速または停止すれば、粒子は、重力によって容器の径方向を横断するように径方向に移動する。その後、回転を増速または再開すれば、粒子は再び周方向に移動する。容器の回転方向を逆転させることにより、粒子の周方向移動と径方向移動とを繰り返し行ってもよい。

本発明の一形態では、磁場操作により粒子操作が行われる。例えば、容器の周方向に沿って磁場を変化させれば、粒子が周方向に移動する。周方向に沿った磁場の変化を停止または減速すれば、粒子は、磁場の変化に伴って容器の径方向を横断するように径方向に移動する。容器の外壁面側からの磁場の強度を変化させることにより粒子を径方向に移動させてもよい。容器を回転させた状態で、容器の外壁面側からの磁場の大きさを連続的に変化させることにより、磁性体粒子の周方向移動と径方向移動とを繰り返し行うこともできる。

上記の粒子操作を行う前に、容器の長手方向に沿って磁場操作を行うことにより、磁性体粒子を、他の媒体（第一の媒体）から液体中へ移動させてもよい。また、上記の粒子操作を行った後に、容器の長手方向に沿って磁場操作を行うことにより、磁性体粒子を、液体中から他の媒体（第二の媒体）中へ移動させてもよい。これらの「他の媒体」は、例えば液体であり、液体層間は、ゲル状媒体等により隔てられていることが好ましい。

さらに、本発明は上記粒子操作を行うための粒子操作用装置に関する。粒子操作用装置は、液体および磁性体粒子が装填された容器保持するための容器保持部を備える。容器保持部は、容器を回転させるための回転機構と連動されていてもよい。粒子操作用装置は、容器の長手方向に沿って磁場を変化可能に構成された磁場印加部を備えていてもよい。この磁場印加部からの磁場を利用して、液体中で粒子を分散させる粒子操作が行われてもよい。

本発明の方法によれば、液体中での磁性体の周方向の移動と径方向との移動が繰り返し行われるため、粒子を液体の全体にわたって分散させることができ、粒子の分散効率が高められる。そのため、化学操作の効率や、収率、検査制度の向上等が期待できる。また、本発明の方法は、簡便な操作であるため、自動化も容易になし得る。

磁性体粒子の操作が行われるデバイスの構成を模式的に示す図である。 容器内での磁性体粒子の動きを表す概念図である。 Ａ〜Ｃは、周方向に沿って磁場を変化させる形態を表す概念図である。 Ａ１，Ｂ１およびＣ１は、容器内での磁性体粒子の動きを表す概念図であり、Ａ２，Ｂ２およびＣ２は、それぞれの状態における容器正面からの観察写真である。 粒子操作用装置の一形態を表す構成概念図である。

図１は、本発明の粒子操作が適用されるデバイスの一例を示す模式的断面図である。図１Ａに示すように、このデバイスは、管状容器１０内に、容器底面側から、液体層３２，３５，３１とゲル状媒体層２２，２１とが交互に重層されている。ゲル状媒体は、隣接する液体層中の液体と混和性を有さず、これらの液体に対して、不溶または難溶である。

図１Ａにおいて、容器上部の液体層３１には、多数の磁性体粒子７０が含まれている。磁性体粒子７０は、その表面または内部に、核酸や抗原等の目的物質を特異的に固定可能な粒子である。磁性体粒子７０を液体層３１中で分散させることにより、液体層３１中に含まれる目的物質が粒子７０に選択的に固定される。

磁性体粒子への目的物質の固定方法は特に限定されず、物理吸着、化学吸着等の各種公知の固定化メカニズムが適用可能である。例えば、ファンデルワールス力、水素結合、疎水相互作用、イオン間相互作用、π−πスタッキング等の種々の分子間力により、粒子の表面あるいは内部に目的物質が固定される。

磁性体粒子の粒径は１ｍｍ以下が好ましく、０．１μｍ〜５００μｍがより好ましい。粒子の形状は、粒径が揃った球形が望ましいが、粒子操作が可能である限りにおいて、不規則な形状で、ある程度の粒径分布を持っていてもよい。粒子の構成成分は単一物質でもよく、複数の成分からなるものでもよい。

磁性体粒子は、磁性体のみからなるものでもよいが、磁性体の表面に目的物質を特異的に固定するためのコーティングが施されたものが好ましく用いられる。磁性体としては、鉄、コバルト、ニッケル、ならびにそれらの化合物、酸化物、および合金等が挙げられる。具体的には、マグネタイト（Ｆｅ_３Ｏ_４）、ヘマタイト（Ｆｅ_２Ｏ_３、またはαＦｅ_２Ｏ_３）、マグヘマイト（γＦｅ_２Ｏ_３）、チタノマグネタイト（ｘＦｅ_２ＴｉＯ_４・（１−ｘ）Ｆｅ_３Ｏ_４、イルメノヘマタイト（ｘＦｅＴｉＯ_３・（１−ｘ）Ｆｅ_２Ｏ_３、ピロタイト（Ｆｅ_１−ｘＳ（ｘ＝０〜０．１３）‥Ｆｅ_７Ｓ_８（ｘ〜０．１３））、グレイガイト（Ｆｅ_３Ｓ_４）、ゲータイト（αＦｅＯＯＨ）、酸化クロム（ＣｒＯ_２）、パーマロイ、アルコニ磁石、ステンレス、サマリウム磁石、ネオジム磁石、バリウム磁石が挙げられる。

磁性体粒子に選択的に固定される目的物質としては、例えば核酸、タンパク質、糖、脂質、抗体、受容体、抗原、リガンド等の生体由来物質や細胞自身が挙げられる。目的物質が生体由来物質である場合は、分子認識等により、粒子の内部あるいは粒子表面に目的物質が固定されてもよい。例えば、目的物質が核酸である場合は、磁性体粒子７０として、表面にシリカコーティングが施された磁性体粒子等が好ましく用いられる。目的物質が、抗体(例えば、標識抗体)、受容体、抗原およびリガンド等である場合、粒子表面のアミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、アピジン、ピオチン、ジゴキシゲニン、プロテインＡ、プロテインＧ等により、目的物質を粒子表面に選択的に固定できる。特定の目的物質を選択的に固定可能な磁性体粒子として、例えば、ライフテクノロジーズから販売されているＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）や、東洋紡から販売されているＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（登録商標）等の市販品を用いることもできる。

図１Ｂに示すように、容器１０の外壁面に磁石９を近付けると、目的物質が固定された磁性体粒子は、磁場の作用により、磁石９近傍の容器内壁面に集められる。図１Ｃに示すように、磁石９を、外壁面に沿って容器１０の長手方向に移動させると、磁場の変化に追随して、磁性体粒子７０も容器の長手方向に沿って移動し、ゲル状媒体層２１、液体層３５、ゲル状媒体層２２、液体層３２へと順に移動する。粒子７０の周囲に液滴として物理的に付着している液体の大半は、粒子が、ゲル状媒体の内部に進入する際に、粒子表面から脱離する。ゲル状媒体層２１，２２内への粒子の進入および移動により、ゲル状媒体が穿孔されるが、ゲルの復元力による自己修復作用により、ゲル状媒体の孔は直ちに塞がれる。そのため、粒子による貫通孔を介したゲル状媒体への液体の流入は、ほとんど生じない。

液体層３５内および液体層３１内で磁性体粒子７０を分散させ、磁性体粒子を液体層内の液体と接触させることにより、磁性体粒子への目的物質の固定、磁性体粒子表面に付着している夾雑物を除去するための洗浄操作、磁性体粒子に固定されている目的物質の反応、磁性体粒子に固定されている目的物質の液体中への溶出等の操作が行われる。例えば、磁性体粒子に選択的に固定される物質が抗原である場合、第一の媒体層である液体層３１内に含まれる抗原が、プロテインＧやプロテインＡ等の抗原を選択的に固定化可能な分子でコーティングされた磁性体粒子７０の表面に固定され、液体層３５内で磁性体粒子を分散させることにより、粒子表面に付着した夾雑物を除去するための洗浄が行われ、第二の媒体層である液体層３２内で磁性体粒子を分散させることにより、粒子表面に固定された抗原と液体層３２内の抗体との抗原抗体反応や、液体層３２内への目的物質の遊離溶出等を行うことができる。

［液体中での粒子の分散方法］
本発明の一形態は、液体層中に磁性体粒子を分散させるための粒子操作方法に関する。本発明の粒子操作では、容器の内壁面に沿った移動（周方向移動）と、容器の径方向を横断する移動（径方向移動）とが繰り返し行われる。容器の内壁面に沿った周方向の移動は、例えば容器を回転（容器の長手方向の軸を中心とする自転）させる方法や、容器の周方向に沿って磁石を移動させる方法等により実施できる。

図２Ａ〜Ｄは、容器１０の長手方向に直交する面（図１のIIA-IIB）における断面図であり、管の長手方向を水平に配置した状態で容器を回転させることにより、本発明の粒子操作を実施した際の粒子の移動の様子を概念的に表している。これらの図において、紙面の下方向が鉛直下方である。容器１０内に液体３５が封入されており、液体中に磁性体粒子７０が含まれている。図２Ａは、容器の長手方向を水平に保持して静置した状態を表しており、磁性体粒子７０は、重力により、容器１０の鉛直下方の内壁面上に堆積した状態である。

容器１０を回転させると、壁面内壁面近傍の液体の壁面摩擦や、容器内壁面と磁性体粒子との摩擦力等の作用により、容器の内壁面近傍に存在する磁性体粒子は容器内壁面近傍を周方向に沿って移動する。図２Ｂでは、重力の作用により、一部の粒子は容器の鉛直下方の内壁面上に堆積した状態を維持している。容器の回転速度を大きくすると、容器の鉛直下方に堆積していた粒子は、容器の内壁面との摩擦力等により、順次、容器の周方向に沿って移動する。容器の回転を継続すると、図２Ｃに示すように、粒子が容器の内壁面の全周にわたって帯状に分散した状態で、容器の内壁面に沿って周方向を移動する。

このように、磁性体粒子が周方向に沿って移動している状態で、容器の回転を減速または停止すると、粒子を周方向へ移動させる外力（容器の内壁面と液体や粒子との摩擦力等）が弱められる。そのため、粒子は重力によって、鉛直下方へと移動する。この際、図２Ｄに示すように、粒子は、鉛直下方に向けて容器１０の径方向を横断するように液体層３５内を移動する。なお、「径方向に移動」とは、必ずしも円の中心を通るように移動する必要はなく、円弧の弦に沿った移動のように、容器内壁面よりも内側を移動するものも含まれる。回転を完全に停止した場合、図２Ａに示すように、容器内の径方向に移動した粒子は、容器の内壁面上に堆積する。

容器１０の回転を再開（あるいは増速）すると、再び、図２Ｃに示すように、粒子は周方向移動し、容器の内壁面に沿った帯状の霧となり、液体中に分散される。回転を停止または減速すると、再び、図２Ｄに示すように、粒子が径方向に移動する。

周方向の運動は、液体層の厚みや容量の制限を受けることなく連続的に行い得るため、管の長手方向に沿った往復運動に比べて、粒子を効率的に帯状に分散させることができる。ただし、粒子の周方向の移動のみでは、図２Ｃに示すように、粒子の分散は、液体層の内壁面近傍にとどまる。本発明の粒子操作では、周方向の移動後に、径方向への移動が実施されることにより、液体層３５の全体を利用して粒子が分散される。また、径方向への移動の際に液体から受ける抗力が大きいため、凝集塊を形成していた粒子の凝集が解消され易くなる。さらに、周方向の移動と径方向の移動とが繰り返し行われるため、粒子の全体を径方向移動に供して分散させることができ、液体中での粒子の分散効率が格段に向上する。

このように、液体中での磁性体粒子の分散効率が高められることにより、粒子を液体との接触機会が増大する。そのため、本発明の粒子操作を適用することにより、目的物質の収率向上、純度向上、検査精度向上等が期待できる。例えば、液体試料中の目的物質を粒子表面に固定する際に、上記の粒子操作を適用すれば、粒子表面に固定される目的物質の量が増大し、分離・抽出操作における収率の向上や、検査における定量性の向上が期待できる。

目的物質が固定された磁性体粒子を洗浄する際に上記の粒子操作を適用すれば、洗浄液と粒子との接触機会が増大するため、粒子表面に付着した夾雑物が効率的に除去され、目的物質の純度や、検査精度が高められる。また、目的物質が固定された粒子と液体中の物質との反応の際に、上記の粒子操作を適用すれば、反応効率が高められる。目的物質が固定された粒子を液体中に溶出する際に上記の粒子操作を適用すれば、目的物質の収率を向上できる。

図２Ａ〜Ｄでは、容器１０の回転速度の変化、あるいは回転と停止を繰り返すことにより、粒子の周方向移動と径方向の移動とを繰り返し実施する例を説明したが、粒子操作の方法はこれに限定されない。例えば、容器を一方向に回転させ容器の内壁面に沿って粒子を周方向に運動させた状態から、容器の回転方向を逆転すれば、容器内壁面近傍の液体の流れに変化が生じ、内壁面近傍に存在していた粒子が、容器の中心部付近や対面の内壁面に向かって移動するため、径方向の移動を実施できる。すなわち、所定時間容器を回転させた後に回転方向を逆転し、回転を所定時間継続した後、再度回転方向を逆転することを繰り返すことにより、周方向の移動と径方向の移動を繰り返し実施することができる。

上記のように、容器の回転速度や回転方向を変化させることにより、粒子の周方向移動と径方向移動とを繰り返し、液体中に粒子を分散させることができる。この方法は、容器の回転以外の操作を必要としないため、粒子操作の自動化を容易になし得るとの利点も有する。粒子操作の自動化は、液体と粒子が装填された容器を長手方向が水平となるように保持するための容器保持部と、容器を回転可能に構成された回転機構とを備える装置を用いて行うことができる。回転機構は、容器保持部を回転させるように構成されていてもよい。

容器の回転以外の外力により、粒子を周方向に移動させてもよい。このような外力としては、磁力、重力、指向性を有するように位相が調整された超音波、容器を自公転運動させることによる遠心力挙げられる。磁力を利用する場合、図３Ａに示すように容器の外壁に接してあるいは容器の外壁に近接させて磁石を配置し容器を回転（自転）させる方法や、図３Ｂに示すように容器の外壁に沿ってあるいは容器の外壁に近接させながら磁石を周方向に移動させる方法（すなわち、容器の長手方向の軸を中心とする公転）等が挙げられる。図３Ｃに示すように磁石９を中心として容器１０を公転させることによっても、容器の周方向に沿った磁場の変化を実現できる。

永久磁石に代えて、電磁石を用いて磁場操作を行うこともできる。例えば、図３Ｄに示すように、容器１０の外周に複数の電磁石９１〜９８を配置し、各電磁石の電流量を変化させることにより、容器の周方向に沿って磁場を変化させることができる。例えば、電磁石９１のみに通電した状態から、電磁石９１への通電の遮断と略同時に電磁石９２に通電し、隣接する電磁石に順次通電を行えばよい。また、電磁石９１の通電量を減少させながら電磁石９２の通電量を増加させ、隣接する電磁石への通電量を連続的に変化させる方法により、周方向に沿って磁場を変化させてもよい。電磁石に通電される電流は交流でもよい。例えば、図３Ｄに示すように、容器の外周に沿って８個の電磁石が等間隔で配置されている場合、隣接する電磁石に通電する交流電流の位相をπ／４ずつ遅らせることにより、容器１０の周方向に沿って連続的に磁場を変化させることができる。

このように、磁場の変化により磁性体粒子の操作を行う場合、容器の配置方向は限定されず、容器の長手方向が、水平方向、鉛直方向、斜め方向のいずれでもよい。容器の長手方向を水平方向あるいは斜め方向に配置した状態で磁場を変化させる場合は、磁力に加えて重力を利用して粒子操作を行うことができ、粒子の分散効率が高められる場合がある。

磁場の変化により磁性体粒子を周方向に移動させた状態で、周方向に沿った磁場の変化を減速あるいは停止することにより、磁性体粒子を周方向へ移動させる外力が弱められ、磁性体粒子は磁石に引きつけられるように、容器の液体層内を移動する。そのため、図２Ｃおよび図２Ｄに示す場合と同様に、粒子を径方向に移動させることができる。

また、磁場の変化により磁性体粒子を周方向に移動させた状態で、容器の外壁面側からの磁場の強度を変化させることによっても、磁性体粒子を径方向に移動させることができる。例えば、容器の外壁から所定距離を隔てて磁石を配置した状態で容器を回転させると、磁場の影響よりも容器の内壁面での摩擦等の影響が大きく働くため、磁性体粒子は容器内壁面に沿って帯状に沿った状態で周方向を移動する。磁石を容器に近づけると、磁性体粒子が受ける磁場の強度が増大するため、磁性体粒子は磁石に引きつけられるように、容器の液体層内を移動する。

磁場の変化により粒子操作を行う場合、周方向の移動と径方向の移動とを、一連の動作で行うこともできる。例えば、図４に示す形態では、容器を回転させた状態で、容器の外壁面側からの磁場の大きさを連続的に変化させることにより、周方向移動ステップと径方向移動ステップとが繰り返し行われる。図４Ａ１，Ｂ１，Ｃ１は、容器断面における磁性体粒子の移動の様子を表す模式図であり、図４Ａ２，Ｂ２，Ｃ２は、それぞれの状態における容器正面からの観察写真である。

図４Ａ１では、磁石９が容器１０の外壁面から距離ｄ_１の位置に存在する状態で容器１０が回転しており、容器内に印加される磁場が小さいため、磁性体粒子は容器の内壁面に沿った帯状に分散し、周方向に移動している。容器を回転させた状態で、磁石９を容器１０に近づけると、容器内に印加される磁場が大きくなり、図４Ｂ１に示すように、磁性体粒子は磁石９に引きつけられるように、容器の液体層内を移動する。図４Ｂ２の写真からもわかるように、磁性体粒子は霧状となって移動し、液体層内で分散される。さらに磁石９を容器１０に近づけると、図４Ｃ１に示すように、磁性体粒子は容器の内壁面近傍に集められる。磁石９を容器１０から遠ざけると、図４Ａ１に示すように、磁性体粒子は再び容器内壁面の内壁面に沿った帯状に分散する。

このように、容器の回転を継続して周方向に沿った磁場を変化させながら、容器と磁石の距離を変化させることにより、容器外壁面側からの磁場の大きさが連続的に変化するため、磁性体粒子の周方向移動と径方向移動とが繰り返し行われる。また、容器１０と永久磁石９との距離を変化させる代わりに、容器外壁面近傍に電磁石を配置し、電磁石への通電のオン・オフや、電流量の変化により、容器外壁面側からの磁場の大きさを変化させてもよい。

［デバイスの構成］
上記の粒子操作が適用されるデバイスの例として、図１では、管状容器内にゲル状媒体層と液体層とが交互に重層されたデバイスを示したが、粒子操作が行われるデバイスは、管状容器内に液体と磁性体粒子が含まれていれば、その構成は特に限定されない。

＜容器＞
本発明では、管状容器１０内に装填された液体中で、粒子操作が行われる。容器内で磁性体粒子を移動可能であり、液体を保持できるものであれば、その材質は特に限定されない。容器外からの磁場操作により容器内の磁性体粒子を移動させるためには、プラスチック等の透磁性材料が好ましく、例えば、ポリプロピレンやポリエチレン等のポリオレフィン、テトラフルオロエチレン等のフッ素系樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリカーボネート、環状ポリオレフィン等の樹脂材料が挙げられる。これらの素材の他、セラミック、ガラス、シリコーン、非磁性金属等も用いられ得る。容器内壁面の撥水性を高めるために、フッ素系樹脂やシリコーン等によるコーティングが行われてもよい。

容器の形状としては、例えば内径１〜２ｍｍ程度、長さ５０ｍｍ〜２００ｍｍ程度の直管状構造体（キャピラリー）が挙げられる。管の内径や長さは、処理すべき物質の量、磁性体粒子の量等に応じて適切なものを選択すればよい。容器は管状である限り、その形状は特に限定されない。磁性体粒子の周方向の移動を円滑に行うためには、容器の断面形状は円形であることが好ましいが、楕円形、多角形等でもよい。また、容器は必ずしも直管状である必要はなく、管の長手方向に沿ってみた場合に、径の大きい部分や、径の小さい部分が存在していてもよい。

粒子操作中あるいは操作後に、吸光度、蛍光、化学発光、生物発光、屈折率変化等の光学的測定が行われる場合や、光照射が行われる場合は、光透過性を有する容器が好ましく用いられる。また、容器が光透過性であれば、容器内の粒子操作の状況を目視確認できることからも好ましい。一方、液体や磁性体粒子等を遮光する必要がある場合は、光透過性を有していない遮光性の容器が好ましく用いられる。使用目的等によって、光透過部分と遮光部分とを有する容器を採用することもできる。

本発明の粒子操作方法は、ピペット等により液流を発生させる必要がないため、密閉系で実施できる。容器内に液体および磁性体粒子を密封装填すれば、外部からのコンタミネーションを防止できる。そのため、ＲＮＡ等の分解しやすい目的物質を磁性体粒子に固定して操作する場合や、空気中の酸素等と反応しやすい液体を用いる場合等に、特に有用である。容器を密閉系とする場合、容器の開口部を熱融着する方法や、適宜の封止手段を用いて封止することができる。操作後の粒子や目的物質を溶出後の液体を容器外に取り出す必要がある場合は、樹脂栓等を用いて、取り外し可能に開口部を封止することが好ましい。また、図１に示すデバイスのように、液体に接してゲル層等を配置することによって、液体を密封装填してもよい。

＜液体＞
容器内に装填される液体は、磁性体粒子表面に固定された目的物質の、抽出、精製、反応、分離、検出、分析等の化学操作の場を提供する。液体の種類は特に限定されないが、液体層間がゲル状媒体層で隔てられている場合は、ゲル状媒体を溶解しないものが好ましい。そのため、液体としては、水溶液や、水と有機溶媒の混合溶液等の水系液体が好ましく用いられる。液体は、これら化学操作のための単なる媒体として機能し得る他に、化学操作に直接関与するか、あるいは当該操作に関与する化合物を成分として含んでいてもよい。液体に含まれる物質としては、磁性体粒子に固定された反応性物質と反応する物質、当該反応によって磁性体粒子の表面に固定された物質と更に反応する物質、反応試薬、蛍光物質、各種の緩衝剤、界面活性剤、塩類、およびその他の各種補助剤、並びに、アルコール等の有機溶剤等を例示することができる。水系液体は、水、水溶液、水懸濁液等の任意の態様で提供され得る。

液体試料中に含まれる目的物質を磁性体粒子の表面に固定する場合、液体中には、磁性体粒子の表面に固定されるべき目的物質の他に、多種多様な夾雑物が含まれている場合がある。液体試料中には、例えば、動植物組織、体液、排泄物等の生体試料、細胞、原虫、真菌、細菌、ウィルス等の核酸包含体等が含まれていてもよい。体液には血液、髄液、唾液、乳等が含まれ、排泄物には糞便、尿、汗等が含まれる。細胞には血液中の白血球、血小板や、口腔細胞等の粘膜細胞の剥離細胞、唾液中白血球等が含まれる。

核酸、抗原、抗体等の目的物質を含む液体試料は、例えば、細胞懸濁液、ホモジネート、細胞溶解液との混合液等の態様で調製してもよい。血液等の生体由来試料中に含まれる目的物質を粒子表面に固定する場合、液体試料は、血液等の生体由来試料と、そこから目的物質を抽出するための細胞溶解液（核酸抽出液）との混合物である。細胞溶解液は、カオトロピック物質や界面活性剤等の細胞を溶解可能な成分を含む。

＜ゲル状媒体＞
液体層間がゲル状媒体で隔てられている場合、ゲル状媒体は、粒子操作前においてゲル状、若しくはペースト状であればよい。ゲル状媒体は、隣接する液体層の液体に不溶性または難溶性であり、化学的に不活性な物質であることが好ましい。ゲル状媒体の材料や組成等は、特に限定されない。例えば、ＷＯ２０１２／０８６２４３号に記載されているように、非水溶性または難水溶性の液体物質を加熱し、加熱された当該液体物質にゲル化剤を添加し、ゲル化剤を完全に溶解させた後、ゾル・ゲル転移温度以下に冷却することで、物理ゲルが形成される。

ゲル状媒体として化学ゲルを用いることもできる。化学ゲルとしては、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、（メタ）アクリル系ポリマー等の炭化水素系ゲル；ポリシロキサン、ＰＤＭＳ、シリコーンハイドロゲル等のシリコーン系ゲル；ＰＴＦＥ、ＰＦＡ、ＦＥＰ、ＥＴＦＥ、ＰＣＴＦＥ等のフッ素系ゲル；およびこれらを主成分とするゲル状、あるいはペースト状の混合物等を使用できる。上記炭化水素系ゲルの具体例としては、ポリエチレンを主成分としたプラスチベース（登録商標）等が挙げられる。

化学ゲルは、化学反応によって複数のポリマー鎖が共有結合を介して架橋されたものであり、架橋構造が維持されている限り、ゲル状態を保持できる。そのため、磁性体粒子がゲル状媒体を通過した後もゲル状態が保持される。化学ゲル媒体中を粒子が通過する際は、一時的にゲルが穿孔されるが、ゲルの復元力によって、穿孔は直ちに修復される。そのため、ゲル由来の成分が磁性体粒子の表面に付着して、夾雑物としてゲル外へ持ち出されることが、ほとんどない。したがって、ゲル状媒体として化学ゲルを用いることにより、粒子操作による目的物質の精製や検出の精度を高めることができる。また、化学ゲルを用いる場合、容器内でのゲル化を行う必要がないため、容器内へのゲルの装填操作を容易に行い得る。化学ゲルは安定性が高いため、ゲルを装填後のデバイスの運搬時や保管時の振動等の物理的作用や、高温環境に暴露された際の加熱によっても、ゾル化を生じ難い。そのため、液体層およびゲル状媒体層が予め容器内に装填された状態のデバイスとして提供される場合も、デバイスの運搬・保管時の安定性が高められる。

上記化学ゲルの中でも、シリコーンゲルが好適に用いられる。シリコーンゲルを構成するポリマーとしては、架橋型オルガノポリシロキサン、アルキル変性部分架橋型オルガノポリシロキサン、シリコーン分岐型アルキル変性部分架橋型オルガノポリシロキサン等の架橋型オルガノポリシロキサンが挙げられる。オルガノポリシロキサンとしては、ジメチコン、ビニルジメチコン、メチルトリメチコン、メチルビニルシロキサン、ラウリルジメチコン、あるいはこれらの共重合体等が用いられる。ポリマーの分子構造は特に限定されず、直鎖、分枝状直鎖、環状、または網状であってもよい。シリコーンゲルは、上記の架橋型オルガノポリシロキサンのポリマー（またはオリゴマー）を油剤に膨潤させることにより得られる。油剤としては、上記ポリマーを膨潤させ、かつ水系液体と混和しないものが好適に用いられる。このような油剤としては、シクロペンタシロキサン、シクロメチコン、ジメチコン、ジメチコノール、メチルトリメチコン、フェニルトリメチコーン、シクロペンタシロキサン、ジフェニルシロキシフェニルトリメチコン、ミネラルオイル、イソドデカン、ネオペンタン酸イソドデシル、トリオクタノイン、スクワラン等が挙げられる。例えば、架橋型オルガノポリシロキサンのポリマーを微粒子化したものを、油剤と混合することにより、ゲル状あるいはペースト状のシリコーンゲルが得られる。

架橋型オルガノポリシロキサンを油剤に膨潤させたシリコーンゲルは、架橋構造を有する化学ゲルでありながら、粘稠性を有している。そのため、シリコーンゲルは、磁性体粒子や磁性固体を容易に通過させることができる上に、ゲルが一時的に穿孔されても直ちに修復されることから、磁性体粒子を用いた操作において、液体層間を隔てるためのゲル状媒体として適している。

容器内へのゲル状媒体および液体の装填は、適宜の方法により行い得る。管状の容器が用いられる場合、装填に先立って容器の一端の開口が封止され、他端の開口部からゲル状媒体および液体が順次装填されることが好ましい。

容器内に装填されるゲル状媒体および液体の容量は、操作対象となる磁性体粒子の量や、操作の種類等に応じて適宜に設定され得る。容器内に複数のゲル状媒体層や液体層が設けられる場合、各層の容量は同一でも異なっていてもよい。各層の厚みも適宜に設定され得る。操作性等を考慮した場合、層厚みは、例えば、２ｍｍ〜２０ｍｍ程度が好ましい。

［粒子操作の例］
上記のように、磁性体粒子を用いた操作では、液体中での磁性体粒子を分散と、他の液体中への磁性体粒子の移動とを繰り返し行うことにより、目的物質の分離、精製、反応、検出等が行われる。例えばＥＬＩＳＡ（Enzyme-linked immuno-sorbent assay）を行う場合、第一次抗体が固定された磁性体粒子を用い、被検抗原（被検物質）を含む第一液体中で、磁性体粒子に固定された第一次抗体と被検抗原との反応が行われる。これにより、液体中の被検抗原は、選択的に磁性体粒子表面に固定される。第二液体中で磁性体粒子の洗浄が行われた後、第三液体中で酵素標識第二次抗体と磁性体粒子表面に固定された被検抗原との抗原抗体反応が行われる。これにより、第二次抗体は、磁性体粒子表面に第一次抗体および被検抗体を介して、磁性体粒子表面に固定される。第四液体中で磁性体粒子の洗浄が行われた後、第五液体中で粒子表面に固定された第二次抗体に結合している酵素と発色物質との問で発色反応を一定時間行わせる。この発色反応を、分光光度計による吸光度測定によりモニターすることにより定量的な評価が行える。なお、定性評価であれば、目視により発色反応を確認してもよい。

第五液体中で発色反応を一定時間行った後、磁性体粒子を第五液体から第六液体に移動させてもよい。磁性体粒子を第五液体の外部へ移動させることにより、発色反応を停止させることができる。そのため、水酸化ナトリウム等の反応停止試薬を新たに加えて発色反応を停止させることなく定量評価が可能となるため、第五液体が密封瘋癲されている場合でも、定量的な測定が可能となる。

上記のように、ＥＬＩＳＡを行う場合は、反応と洗浄とを繰り返すために、磁性体粒子を順次移動させ、各液体中で、磁性体粒子の分散が行われる。これらの各液体中での粒子の分散を本発明の方法により行うことができる。分散後の粒子を別の液体へ移動させる手段としては、容器に磁石を近付けることにより容器内壁面に粒子を集合させた状態で容器中の液体を除去し、別の液体を注入する方法が挙げられる。また、図１に示すように、管状容器内にゲル状媒体層と液体層とが交互に重層されたデバイスを用いる場合は、容器の外壁面に磁石を近付けて容器内壁面に粒子を集めた状態で、磁石を外壁面に沿って容器の長手方向に移動させることにより、粒子はゲル状媒体層を通過して別の液体層中に移動する。

図５は、粒子操作の自動化を実施可能な粒子操作用装置の一形態を表す構成概念図である。装置１００は、支持板１３３に回転可能に取り付けられた容器保持部１８１を備える。容器保持部１８１は、液体層１３４，１３５，１３６とゲル状媒体層１２４，１２５とが交互に装填された管状容器１１０を保持可能に構成されている。容器の保持方法は特に限定されないが、着脱可能に容器が保持されていることが好ましい。

容器保持部１８１はモータ等の適宜の駆動手段と連結されており、制御部１０５からの信号に基づいて、回転方向や回転速度を変化させることができる。容器保持部１８１の回転により、容器１１０は、長手方向を軸として回転（自転）する。容器保持部に保持された容器１１０の回転の開始・停止、回転速度の大小の変化、回転方向の逆転等を繰り返すことにより、液体層１３５内の磁性体粒子７０は、周方向の移動と径方向の移動を繰り返し、液体内に分散される。

装置１００は、さらに磁場印加部１９０を備える。磁場印加部は、印加する磁場を変化可能に構成されている。図５に示す形態において、磁場印加部１９０は、支持板１３３に固定されたガイドバー１９３と、ガイドバー上にスライド可能に取り付けられた磁場制御機構１９５とを備える。磁場制御機構１９５には永久磁石１９１が取り付けられている。磁場制御機構１９５は、ステッピングモータ等の適宜の駆動手段を備え、制御部１０５からの信号に基づいて、容器１０の長手方向と平行に設けられたガイドバー１９３上をスライドし、その位置を変化させることができる。そのため、磁石１９１は容器の長手方向に沿って移動可能であり、容器の長手方向に沿って磁場を変化可能である。また、磁場制御機構１９５に取り付けられた磁石１９１は、制御部１０５からの信号に基づいて、容器１１０との距離を変化可能である。これにより、容器の外壁面側からの磁場の大きさを変化させることができる。

容器保持部１８１の回転により液体層３５内での粒子の分散が行われる際、磁石１９１と容器１１０との距離を大きくしておけば、液体層１３５に印加される磁場の影響が小さいため、磁性体粒子７０の周方向移動をスムーズに行うことができる。また、液体層内で粒子の分散が行われる際に、磁場制御機構１９５に取り付けられた磁石１９１を図の上下方向に移動させることにより、容器１１０の外壁面側からの磁場の大きさを連続的に変化させ、図４に示したのと同様の機序により、磁性体粒子を分散させることもできる。

液体中での磁性体粒子の分散を所定時間実施した後、容器保持部１８１の回転を停止させ、磁石１９１を容器１１０に近づけると、磁性体粒子７０は、磁石１９１に引き寄せられ、容器内壁面に集められる。この状態で、磁場制御機構１９５をガイドバー１９３に沿って移動させることにより、磁石１９１に引き寄せられた磁性体粒子７０は、液体層１３５からゲル状媒体層１２５を通過して液体層１３６へと移動する。

磁性体粒子を液体層１３６へ移動後、磁石１９１を容器１１０から遠ざけることにより、容器内壁面に集められていた磁性体粒子７０は、磁石による拘束が解かれ、液体層１３６内で分散可能となる。この状態で、再び容器保持部１８１を回転させ、その回転速度や回転方向を制御することにより、液体層１３６内で磁性体粒子を分散させることができる。

このように、本発明の粒子操作方向を適用すれば、液体中での粒子の分散と液体層間の粒子の移動とを容易に自動化できる。なお、図５では、永久磁石１９１を用いる例について説明したが、永久磁石に代えて電磁石を用いれば、印加磁場の制御をさらに容易かつ正確に行うことができる。

図５に示す実施形態では、容器保持部１８１を回転させることにより、容器１１０を自転させる例について説明したが、容器１１０の周方向に沿った磁場の変化により、磁性体粒子の周方向移動を行う場合、粒子操作用装置は、ガイドバーが容器１１０の周りを回転（公転）することにより、容器の周りを磁石が回転するように構成されていてもよい。また、容器の自転と磁石の好転の両方を行い得るように装置が構成されていてもよい。

磁性体粒子を用いた操作として、ＥＬＩＳＡの例について説明したが、本発明は、磁性体粒子を用いた各種の化学操作に適用可能である。例えば、シリカコーティングが施された磁性体粒子を用いて核酸の分離・抽出を行う場合、核酸を含む試料中で磁性体粒子を分散させ、磁性体粒子の表面に核酸を固定した後、磁性体粒子を洗浄液中へ移動させる。洗浄液中で磁性体粒子を分散させ表面に付着した夾雑タンパク質等を除去した後、磁性体粒子を核酸溶出液中へ移動させる。磁性体粒子を核酸溶出液中へ移動させる。核酸抽出液中で磁性体粒子を分散させることにより、粒子表面に固定されていた核酸を溶出液中に回収することができる。

核酸の抽出を行うために用いられる細胞溶解液（核酸抽出液）としては、カオトロピック物質、ＥＤＴＡ等のキレート剤、トリス塩酸等を含有する緩衝液が挙げられる。また、細胞溶解液には、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００等の界面活性剤を含めることもできる。カオトロピック物質としては、グアニジン塩酸塩、グアニジンイソチアン酸塩、ヨウ化カリウム、尿素等が挙げられる。細胞溶解液は、上記の他に、プロテアーゼＫ等のタンパク質分解酵素や各種の緩衝剤、塩類、およびその他の各種補助剤、並びに、アルコール等の有機溶剤等を含んでいてもよい。

界面活性剤やカオトロピック塩等を含む細胞溶解液を用いて生体由来試料中の細胞を溶解させた場合、液体中には、目的物質である核酸の他に、多種多様な夾雑物が含まれているため、磁性体粒子同士が凝集しやすくなる。このように夾雑タンパク質等によって磁性体粒子が凝集している場合は、容器外部からの磁場の印加により、磁性体粒子の径方向の移動を行うことが、磁性体粒子を液体中に効率的に分散する上で有効である。

洗浄液としては、核酸が粒子表面に固定された状態を保持したまま、試料中に含まれる核酸以外の成分（例えばタンパク質、糖質等）や、核酸抽出等の処理に用いられた試薬等を洗浄液中に遊離させ得るものであればよい。洗浄液としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸アンモニウム等の高塩濃度水溶液、エタノール、イソプロパノール等のアルコール水溶液等が挙げられる。

核酸溶出液としては、水または低濃度の塩を含む緩衝液を用いることができる。具体的には、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、蒸留水等を用いることができ、ｐＨ７〜９に調整された５〜２０ｍＭトリス緩衝液を用いることが一般的である。核酸が固定された磁性体粒子を溶出液中で分散させることにより、核酸溶出液中に核酸を遊離溶出させることができる。回収された核酸は、必要に応じて濃縮や乾固等の操作を行った後、分析や反応等に供することができる。

１０，１１０ 容器
７０ 磁性体粒子
９ 磁石
９１〜９８ 電磁石
１３０ 液体層
３１，３２，３５，１３４，１３５，１３６ 液体（層）
２１，２２，１２４，１２５ ゲル状媒体（層）
１００ 粒子操作用装置
１０５ 制御部
１８１ 容器保持部（回転機構）
１９０ 磁場印加部
１９５ 磁場制御機構

Claims (6)

1. 液体中で磁性体粒子を分散させるための粒子操作方法であって、
   管状容器内に液体が装填され、液体中に、特定の物質を選択的に固定し得る磁性体粒子が含まれており、
   前記容器を回転させた状態で、前記容器の外壁面側からの磁場の大きさを連続的に変化させることにより、
   前記液体中で、容器の周方向に沿った磁場の変化により容器の内壁面に沿った周方向に磁性体粒子が移動する周方向移動と、容器の外壁面側からの磁場の変化により容器の径方向を横断するように磁性体粒子が移動する径方向移動とが、一連の動作として繰り返し行われることにより、前記液体中で前記磁性体粒子が分散することを特徴とする、粒子操作方法。
2. 前記液体は、前記容器内に密封装填されている、請求項１に記載の粒子操作方法。
3. 前記粒子が選択的に固定し得る物質が、核酸、タンパク質、糖、脂質、抗体、受容体、抗原、リガンドおよび細胞からなる群から選択される１以上である、請求項１または２に記載の粒子操作方法。
4. 前記周方向移動において、磁性体粒子が、容器の内壁面に沿った帯状に分散する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の粒子操作方法。
5. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の粒子操作方法により磁性体粒子を液体中で分散させる前または後の少なくともいずれかに、
   前記容器の長手方向に沿って磁場操作を行うことにより、前記液体中と他の媒体との間で前記磁性体粒子を移動させるステップ、をさらに有する、磁性体粒子の操作方法。
6. 前記他の媒体は液体であり、
   前記他の媒体と、粒子の分散が行われる液体とが、ゲル状媒体により隔てられている、請求項５に記載の磁性体粒子の操作方法。