TWI224674B

TWI224674B - Immunoassay using insoluble magnetic support particles

Info

Publication number: TWI224674B
Application number: TW091110336A
Authority: TW
Inventors: Masaaki Sakurai; Naoki Takanashi; Masanori Oka; Minoru Hirata
Original assignee: Srl Inc
Priority date: 2001-05-18
Filing date: 2002-05-17
Publication date: 2004-12-01
Also published as: US6964872B2; ATE331953T1; CN1491359A; EP1400808B1; JPWO2002095407A1; CN1258091C; EP1400808A4; KR20040010589A; DK1400808T3; EP1400808A1; CA2435535A1; DE60212840D1; US20040058387A1; JP3863493B2; DE60212840T2; WO2002095407A1; ES2268015T3

Description

1224674 五、發明說明（1) [發明說明] 【技術領域】本發明係有關將生體試樣等流體中之抗原性物質利用磁性粒子進行免疫學測定之方法。【技術背景】近年來’於醫院、檢驗中心等，由於人手不足、經費削減或多量檢體需處理，而策劃將臨床檢查等諸檢查自動化及/或縮短測定時間。適用於該等自動化之方法中以利用不溶性磁性載體粒子，將抗原性物質定性或定量之方法廣受注目。利用該等不溶性磁性載體粒子之目的之一為可將在分析上無法避開之B/F利用磁場作用簡便地進行分離。於利用不溶性磁體載體粒子之免疫化學領域，可使用擔載與欲測定磁體載體之抗原或抗體相同抗原或抗體之不溶性磁性粒子（敏感化不溶性磁性粒子）來進行。於該領域所公知者有如揭示於日本特開平〇 6 — i 6 〇 3 8 7號公報、特開平0 7-72 1 55號公報之於測定生體試樣等流體（被檢試樣）中之抗原性物質時’將預先於該抗原性物質擔載特異結合之抗體或其片斷不溶性磁性粒子與該被檢試樣混合，經由測定與該不溶性磁性粒子結合之該抗原性物質之程度以檢出或定量上述抗原性物質者。但是’於測定時使用預先在不溶性磁性粒子擔載抗體等時，由於不能避開該敏感化不溶性磁性粒子安定性之問題，所以仍有試藥使用期限、調製困難等問題存在。又，

313660.ptd 第8頁 1224674 五、發明說明（3) 中之抗原性物質吸附或結合於不溶性磁性载體粒子，使將該已吸附之抗原性物質與特異反應之標籤化抗體進行反應’可選擇性測疋不溶性磁性載體粒子上之抗原性物質。本發明中從確保定量性容易度之點而言，生體試樣之濃度及不溶性載體粒子懸濁液之緩衝液濃度等，係以生體試樣中之抗原性物質以其存在量之比例吸附於不溶性載體粒子上’依據測定項目特性之條件加以選擇較雄。亦即，本發明提供 & [1 ]使用不溶性載體粒子之免疫測定法，其特徵為： (i)使用抗原及/或抗體實質上為未吸附狀態之不溶性磁性載體粒子、 (i i )被檢試樣中之抗原性物質係吸附或結合於該不溶性磁性載體粒子上、 (i i i)為與該抗原性物質進行特異性反應之標籤化抗體，且與該不溶性磁性載體粒子固相化之抗原性物質進行之特異性反應，使與以天然狀態存在於液相中之抗原性物質實質上不起反應之抗體與經由上述（1丨）之處理所獲得之該不溶性磁性載體粒子進行反應、（i v )以與該抗原性物質反應之標籤化抗體之標識作為指標進行測定 … [2 ]上述[1 ]所揭示之免疫測定法，其特徵為將被檢試樣中之抗原性物質吸附或結合於不溶性磁性載體粒子後，該被檢試樣不經由洗淨除去而是與對抗原性物質有特異性反應之抗體進行反應。 [3 ]上述[1 ]或[2 ]所揭示之免疫測定法，其特徵為使

3l3660.ptd 五、發明說明（4) :ίι 5 t ΐ與吸附或結合有被檢試樣中抗原性物質性磁性哉骑/粒子進行反應後，在磁場之作用下將該該抗原姓铷二子與未反應之標籤化抗體分離，接著， ^。、反應之標籤化抗體之標識作為指標進行 [4] 上述[1]至特# A μμ π 任何一項所揭示之免疫測定法，特徵為上述抗體係為單株抗體者。 [5] 上述[1]至/ 特徵為上述抗體一項所揭示之免疫測定法， i机篮係為多株抗體者。 [6] 上述[1]至[5]任何一 _ 特徵為上诫夕、、办項所揭不之免疫測定法，質上為不溶性之：粒：性載體粒子係於水性液體介質物質相組成之微粒子者：且為由有機高分子物質相與 [7] 上述[1]至[6]任何一特徵為上述之不、玄松路μ I項所揭不之免疫測定法， JLJ ^ 4 性載體粒子係由有機古八不物

成之薄膜相與由磁性物質所成之芯相所=二：J 特徵為上^述之[1 ]至[7 ]任何一項所揭示之免疫測定法，特徵為上述之不溶性磁性役捌疋沄微米範圍之乳膠粒子，粒徑在〇·〇ι [9] 上述[1]至[7]任何一質所成之核者特徵為上述之不溶性磁性_、 #、之免疫測定法，米範圍之乳膠粒子，且具= = 徑，" [10] 上述[1]至[9]任何一項所：：：成之核者。特徵為該免疫測定法係磁性粒子免疫測定法改粒子用臨床檢查用自動機第11頁之不不溶以與測其其其中實磁性其質所〇其至20 〇其 L 6微，其器， 1224674 子'發明說明⑸ 從檢體試樣之分注至取得測定結果均可自動化進行者。 [11 ]上述[1 ]至[1 〇 ]任何一項所揭示之免疫測定法’ 其特徵為被檢試樣中之抗原性物質係HbA 1C者。本發明之其他目的、特徵、優秀性及其具有之觀點經由下述之揭示，業者應可明白。然而，包括下述之揭示及具體實施例等之本說明書係呈現本發明之理想樣態，只是用於說明而表示者，此點應加以理解。在本說明書所揭示之本發明之意圖及範圍内作種種變化及/或改變（或修飾）由下述之揭示及本說明書其他部分之知識，業者應可容易地瞭解。本說明書所引用之所有專利文獻及參考文獻為以說明為目的加以引用者，該等為本說明書之一部分，其内谷在此亦加以解釋。【實施發明之最佳形態】於本發明’標戚化抗體’尤其是標藏化單株抗體與液相中之抗原性物質實質上不進行反應，而可與吸附·固相化於不溶性磁性載體之抗原性物質進行選擇性之反應。因此，只要根據本發明之理想樣態，於上述免疫測定法中，將被檢試樣中之抗原性物質吸附於不溶性載體後，該被檢試樣可不經由洗淨除去，而使上述抗原性物質與單株抗體進行反應。亦即，於本發明更理想之具體例中所使用之單株抗體可由與吸附於不溶性載體粒子之抗原進行反應或是經由選擇與液相中未吸附之抗原性物質實質上不反應者，而可實質地去除未吸附成分所引起之妨礙作用。

313660.ptd 第12頁 1224674 五、發明說明（6) (抗原性物質）可經由本發明之免疫測定法測定之抗原性物質為可吸附（或者結合）於不溶性磁性載體，且該抗原性物質對應之多株抗體或單株抗體至少有一種為可作成或購得者，其餘龙無特別之限制，從吸附於不溶性磁性載體之容易性觀點而言，以生體試樣中含有1〇〇微克/毫升以上（尤其是1毫克 /毫升以上）或（總蛋白質重量）1 %以上之物質較理想。又’從上述多株抗體或單株抗體作成之容易性觀點而言，以上述抗原性物質為分子量1 〇，0 0 0以上之物質（蛋白質等）較理想。可經由本發明免疫測定法測定之「抗原性物質」，只要是該抗原性物質對應之多株抗體或單株抗體至少有一種町作成或購得者即可。「抗原性物質」可列舉例如蛋白質、多肽、基因工學所產生之重組蛋白質等種種物質，於該免疫測定領域為公知之物質或亦可為新穎之物質。代表性之抗原性物質可列舉HbAlc。 (對抗原性物質為特異性之抗體）於本發明中，「與抗原性物質進行特異性反應之抗體」可使用多株抗體及/或單株抗體之任何一種，亦可為天然型（intact)分子及該等之片斷及衍生物，亦可包含稱為F(ab’ ）2、Fab’及Fab之抗體片斷。製造單株抗體之理想方法之例除了可列舉雜交法（hy br i doma ) (G. Koh 1 er and C.Milstein， Nature， 256， ρρ·495-497(1975)); Brodeur et a 1. , Monoclonal Antibody Production

313660.ptd 第13頁 1224674 五、發明說明（7)

Techniques and Applications， ρρ·51-63,Marcel Dekker， Inc·，New York( 1 987 )之外，關於抗體可列舉以下之文獻：J.J.:Langone et al·，（ed·)，” Methods In Enzymology"，Vo 1 121( Immunochemical Techniques，

Part 1 : Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies), Academic Press, New Yor k ( 1 9 8 6 )或此處所引用之文獻（該等中之記載作為參照亦包含於本說明書之揭示中）。較好單株抗體可經由Koehler & Milstein(Nature， 256，495-497，1975)等所報告之細胞融合法獲得。該方法本身為常法，不需另外加以敘述，該方法必需有效率地選別可產生目的單株抗體之雜交細胞。從大量檢體可容易處理而言’大都係將規定之抗原於9 6洞盤固相化，使其與雜交細胞之培養上清液進行反應，再與酵素標識抗老鼠免疫球蛋白進行反應之所謂EL I SA法（酵素免疫測定法）進行選別。此時’由於抗原固相化，抗原以固相化之狀態與抗體進行反應之測定系組合時以該選別法較理想，於用 E L I S A法選別所得雜交細胞產生之單株抗體中，如放射性免疫測疋法（R I A )，可看到於抗原與抗體在液相中進行反應之測定系有不進行反應之抗體存在。該等現象本身在該領域中為公知或是周知，於本發明之免疫測定法中經由使用該等單株抗體，不會受到液相中抗原性物質之阻礙，可與固相化於不溶性載體粒子之抗原性物質進行特異性反應。

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五、發明說明（8) 代表性之單株抗體可列舉揭示於日本專利第26 77753 號者。尤其疋代表性之單株抗體可列舉日本專利第 2677753號所揭示之抗HbAlc單株抗體。抗體通學使用IgG，亦可使用胃蛋白化酵素或二硫蘇糖醇、巯美r萨蝥木凡酶等4 h，, P , , p k璁基乙醇等逛原劑，亦可使用 (b )2 Fab等低分子化之物。又，不僅ΐβ，亦可使用IgM或將其與ϊ G 又不僅1SG， g b進仃相同處理使低分之不同單株抗體2種類以上組斷。亦可將認識抗原決定基從1&刀于化之片合使用。 (抗體之標籤化）本發明之抗體可用遍& > i 作為標識可列舉酵c將其標籤化。分子類、輔酵素、酵素前M 4 Μ基質、酵素抑制劑、補缺螢光物質、色素物質、4=^、阿樸酵素（aP〇enjyme)、物質、磁氣物質、金屬板2先化合物、發光物質、發色等。酵素可列舉脫氫酶、卞店例如膠體金等、放射性物質例如催化胺基、羧基、甲其’、酶、氧化酶等氧化還原酶，移酶，例如將酯鍵、糠脊二醯基、磷酸基等之轉移之轉酶，裂解酶、異構酶U =鍵、肽鍵等水解之水解複合使用而利用於檢定。酶等。酵素為亦可將多種酵素

又’亦可利用酵素之循$ 西洋山葵過氧化酶等過氧化^ 等半乳糖苷酶，馬來酸_ •脫酶、葡糖氧化酶、葡糖凝粉酶。代表性之酵素標識可列舉，大腸菌泠-D-半乳糖苷酶氫酶、葡糖-6-磷酸·脫氫、乙醯膽鹼酯酶、過氧化氫

1224674 五、發明說明（9) ---- 酶、牛小腸鹼性磷酸酶、大腸菌鹼性磷 ^ ^ _ W醪酶孳驗性碟酸酶等。使用鹼性磷酸酶時可使用4-甲基傘形# y , I $基璘酸酿等傘形酮衍生物、硝苯基磷酸酯等磷酸化笨酚^ ^ ^ 之酵素循環系、蟲榮光素衍生物、4=物、利= 基質，而由所產生…、發光等測；丁烧衍生：！ <。亦可利用蟲榮光素、蟲螢光酶系進行。使用過氧化氫_ 時，由於斑過氧化氫反應產生氧，該氧可用電極等檢測。+ 、/' 2女 j 電極可使用玻璃電極、使用難溶性鹽膜之離子電極、液膜型高分子膜電極等。酵素標識亦可以生物素標識體物素蛋白（鏈絲抗生物素蛋白）替代。摔 ^ ^ %識可使用複數個不同種類之標識。此時，複數之測定可連鱗+ 4 a成 ^ , 4 %躓或非連續，同時或各自進行。本發明中’於信號之形成亦可將4〜羥苯基乙酸、1 2_ 苯二胺、四甲基聯苯胺等與西洋山葵.過氧化酶、傘形基半乳糖脊、確苯基半乳糖脊等與点-D〜半乳糖苷酶、葡糖 -6-填酸.脫氫酶等酵素試藥組合使用，亦可使用將二酚、羥基對苯醌、羥基蒽醌等醌醇化合物、硫辛酸、谷耽甘狀等硫醇化合物、盼衍生物、二茂鐵衍生物等以酵等作用形成者。螢光物質或化學發光化合物可列舉螢光素異硫氰酸酯，例如若丹明異硫氰酸酯、四甲基若丹明異碎氰酸酯等若丹明衍生物、丹醯氣、丹醯氟、^光素明、 (fluoresc amine)，例如藻青蛋白 '藻紅蛋白等藻膽色素蛋白、吖啶鐺鹽、蟲螢光素、蟲螢光素酶、雌馬素等魯'米諾、咪唑、草酸酯，例如銪（Eu) '轼（Tb)、釤（Sm)等稀^

1224674 五、發明說明（ίο) 類螯合化合物、7 -胺基-4 -甲基香豆素等香豆素衍生物等。抗體與標識之結合可以使用吸附等物理方法或利用縮合劑等，於所使用已活性化之物等及/或於其間以化學鍵導入間隔基分子之化學方法，更可利用相互之化學結合反應之方法等來進行。標識之進行可利用硫醇基與馬來酸酐縮亞胺基之反應、吡啶基二硫化基與硫醇基之反應、胺基與醛基之反應等來進行、公知之方法或於該領域之業者可容易完成之方法，此外亦可從將該等方法加以修飾之方法中適當選擇使用。縮合劑可列舉甲醛、戊二醛、己撐二異氰酸酯、己撐二異硫氰酸酯、Ν，Ν’ -聚甲撐雙碘乙醯胺、 Ν，Ν’ _乙撐雙馬來酸酐縮亞胺、乙二醇雙琥珀醯亞胺基琥 ί白酸酯、雙重氮聯苯胺、1-乙基-3- (3 -二甲胺基丙基）碳化二亞胺、琥珀醯亞胺基3 - ( 2 -吡啶基二硫基）丙酸酯 (SPDP)、Ν-琥珀醯亞胺基4-(Ν -馬來酸酐縮亞胺基甲基）環己烷-1-羧酸酯（SMCC)、Ν-磺基琥珀醯亞胺基4-(Ν -馬來酸酐縮亞胺基甲基）環已烷-卜羧酸酯、Ν -琥珀醯亞胺基（4-碘化乙醯基）胺基苯酸酯、Ν-琥珀醯亞胺基4-(1-馬來酸酐縮亞胺基苯基）丁酸酯、Ν-(ε -馬來酸酐縮亞胺基己醯氧基）琥珀醯亞胺（EMCS)、亞胺四氫噻吩、S -乙醯基Μ基琥珀酸酐、曱基-3-（ 4’ -二硫吡啶基）-戊酮亞胺酯、甲基 - 4-魏基丁醯基亞胺酯、甲基-3-巯基丙醯基亞胺酯、Ν-琥珀醯亞胺基-S-乙醯基巯基乙酸酯等。 (不溶性磁性載體粒子）

313660.ptd 第17頁 1224674 五、發明說明（11) 本發明所使用之不溶性磁性載體粒麟外哲由奋傲、『丁权好為於水性液體厂質中實質上不，谷性之微粒子，且係由古八相與磁性物質相組成之微粒子。代表性 =刀子物質 ^ < 不溶性磁性齑Μ 粒子為由有機高分子物質組成之薄膜相及由磁性物質缸之芯相所成之微粒子。該不溶性磁性載體粒子氧化王鐵丨以爪）、三氧化二鐵（1^〇3)'各種鐵酸鹽、鐵、錳、鎳、鈷 '鉻等金屬，鈷、鎳、錳等合金組成之微粒子或於内部含有該等磁性粒子之乳膠、明膠、核糖核蛋白體等。較理想可列舉如以乳膠薄膜包圍該磁性物質之核構成之乳膠粒子。本來，乳膠為橡膠樹受傷時所滲出之乳液’本發明之乳膠為於水性液中懸濁有不連續微粒子之懸濁液或乳濁液。本發明所使用之不溶性磁性載體粒子以使用該磁性粒子之核表面用有機物等進行表面處理之微粒子較理想，但是並不只限於該等微粒子。如此之乳膠粒子進行定量之免疫測定時，粒子大小之均一性、表面狀態之控制、内部構造之選擇等通常係要求高度標準，該等試藥適合性良好之乳膠粒子可從市售品中選擇使用。構成上述粒子所使用之有機高分子物質可列舉例如以往技術（特公昭58 — 1 1 575號公報等）之有機高分子物質之微粒子，但是並不只限於該等粒子。該有機高分子物質可列舉聚苯乙烯、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈、聚甲基丙烯酸甲酯、聚己内醯胺、聚乙烯對苯二甲酸酯等疏水性聚合物、聚丙烯醯胺、聚甲基丙烯醯胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚（2 -羥乙基丙烯酸酯）、聚（2 -羥乙基甲基丙

313660.ptd 第18頁 1224674 五、發明說明（12) 烯酸酯）、聚（2,3-二羥丙基丙烯酸酯）、聚（2,3_二羥丙基甲基丙烯酸酯）、聚乙二醇甲基丙烯酸酯等經交聯之親水" 性聚合物或各個單體約2-4種之共聚物等。乳膠之材質並無特別之限制，較好使用聚苯乙烯乳膠等笨乙烯系乳貝膠、丙烯酸系乳膠等。使用表面疏水性強之乳膠（例如聚笨乙烯乳膠）在蛋白質或肽之順利吸附上較理想。又，必要時亦可使用種種改性乳膠（例如魏酸改性乳膠）等。本發明中，上述不溶性載體以使用聚苯乙烯乳膠等乳膠特別理想。乳膠粒子以使用不用乳化劑之乳化聚合所獲得之聚苯乙烯粒子特別理想。該等乳膠由於表面負電荷間之相斥，即使沒有乳化劑亦可安定地存在。市售不溶性磁性載體粒子之代表例可由貝利達斯（Veritas)公司製造之迪那畢 Μ - 279 環氧（Dynabeads M-270 Epoxy)，迪那畢M-270 胺 (Dynabeads M-270 Amine)，迪那畢 M-270 羧酸（Dynabeads Μ-270 Carboxyl ic acid)，迪那畢Μ-270甲苯磺醯活性化 (Dynabeads Μ-270 Tosylactivated)，迪那畢Μ-450 環氧 (Dynabeads Μ-450 Epoxy)，迪那畢M-450甲苯續酿活性化 (Dynabeads M-450 Tosylactivated)，JSR公司之姻慕德一馬格（IMMUTEX-MAG)，藤倉化成（股）公司製造之SMG-11 等、弁格（Bangs)公司購得。不溶性磁性載體粒子以使用粒徑為0 · 〇 1微米至2 0微米之粒子，又以具有粒徑在0 · 1微米至6微米範圍内之不溶性磁性粒子較理想。於不溶性磁性粒子上吸附或結合抗原性 7物質之方法以經由將被檢體中之抗原性物質以物理性吸

313660.ptd 第19頁 1224674 五、發明說明（13) 附或結合或是以化學性結合來進行。又以物理性之吸附或結合較理想。為了將被檢試樣中之抗原性物質吸附於乳谬粒子，對於將乳膠粒子懸濁之緩衝液，基本上可使用與以EL丨s A等於盤上將抗原固相化時相同之技術。乳膠粒子亦有容易產生自然凝集之粒子，該等場合由安定性之點而言，以懸濁於弱驗性甘胺酸緩衝液或硼酸緩衝液較理想。乳膠濃度以使用0.05至1重之懸濁液較理想。 (抗原_抗體反應）

於本發明中，將被檢試樣中之抗原性物質固相化後使該抗原性物質與特異性反應之標籤化抗體進行反應，將由乳膠等組成之不溶性磁性載體上之抗原性物質標籤化。此時所使用之水溶液，為了防止該抗體吸附於由乳膠等所成之不溶性載體上，以使用含有約〇·1至0.3%之Tween(Tw een) 20等界面活性劑較理想。進行本發明反應之容器並無特別之限制，可使用一般試管（試驗管，例如聚苯乙烯製）狀容器。若考慮到多數檢體同時處理之容易點，可使用具有複數洞（穴）之ELISA用盤（例如 96 洞 ELISA 用盤（NUNc — IMMUNO PLATE))等。如後

述’從容易以光學方法測定之點而言，以使用實質上為透明之容器來進行反應較理想。又，如後述使用自動分析機時’通常在該分析機中之反應槽中進行反應。 (測定）測定不溶性磁性載體粒子標識程度之方法並無特別之

313660.ptd 第20頁 1224674 五發明說明（14) ___ 限制。例如於進行標識之定性或半定量測定之試樣濁度程度比較，可經由目視判定上述不溶知子之標識程度。定量測定該標識時，栽體粒測定較理想。間使性而&以光學法可不溶性磁性載體粒子標識之光學測定於本發明，試樣檢體之測定處理可使用自檢體处ϊ至測疋分析結果為止均自動化之機器，刀/ 粒子之臨床檢查用自動機器進行。該等性器可列舉拜耳公司：阿德比亞（商品名自、動機阿奇特德（商品名）、IMX(商品名）、貝克 f么司· ^,,., ：, ,, 蚤巴斯（商品名）等。該等機器廣泛利用於免疫（利用抗原抗體反應）測定系，只要是此類免疫（利可不受限制地使用。料機器之特徵為二地作夕項目之測定，測定感應度高、可廣範心時間内測定’由於從分注至結果出來均； Π等優：以測定精度高…於使用專用反應器而ί; 機哭測定試樣中之抗原時，以往之臨床檢查用自動 ^係用抗體敏感化磁性粒子，該順序為（a) 一將磁性粒子與試樣中之抗原反應後（2)洗淨、（b)二二標ί ^ H與對、於抗原為第二抗體(使用酵素、螢光物質等丁、作為標記）進行反應後（4)洗淨、（c)三次反應為（5)與

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對於標記之基質進杆及施 m A Ca， u r= ^ 應、（6 )測定。但是，根據本發明則為U) —次反應為（1)將疋根微个 (b)二次反應為（2)與對於 ^ ^與试樣中之抗原反應总光物質篝，辦你炎極、、原為第一抗體（使用酵素、榮應為進行反應後（3)洗淨、（c)三次反 Λ 基質進行反應、⑷測定’其中可減少冼净之认數，而大幅度改善粒子之減少。 :光：：測乳膠粒子凝集之方法，其條件為使用較多之粒子。本方法用於檢測粒子所結合之物質之量，亦可用 $ 2往之方法）10倍以上量之粒子量及標記標識抗體量來測定。只要根據本發明即可回避有關製作法之困難性、使用濃題點，經由只使用單一抗體，製造批量間之差異，可安定地可活用該優點。例如可排除抗質安定、信賴性高之試藥。於本發明，作為試藥之不原等敏感化之粒子，所以可大量間差異之問題，又，由於磁以抗原性物質之吸附或結合性以往方法所使用抗體複合體度之不安定性等製造上之問可改善物質之安定性、亦無製造。只使用單株抗體，而體批量間之差異，可提供品溶性載體粒子由於不是使抗幅度改善試藥組套中粒子批性體在核表面形成乳膠，所優越。本發明中可使用之不溶性磁性載體粒子之測定用機号可列舉富士雷必歐公司、魯蜜巴斯（ALP-AMPPD);貝克曼公司、阿克斯（ALP-LumigenPPD)、貝克曼公司、魯蜜瓦德 (ALP-LumigenPPD);日本DPC公司、衣母來滋

1224674 五、發明說明（16) (ALP-AMPPD)、拜耳公司、ACS(吖啶鐵酯）；歐索公司、必德斯Eci (HRP-魯米諾）；精密公司、HiMICO ;大那埔得公司、阿奇特德（吖啶鎗酯）；羅氏公司：匹可魯蜜（釕複合體）；東索公司、AIA-6 0 0 1 1 (ALP-4MUP)等，可列舉使用酵素之化學發光、使用釕複合體之電氣化學發光、使用吖啶鎗酯之化學發光等者。 (血紅蛋白A 1 c之測定例）充分顯示本發明免疫測定法特徵之一之實施樣態，以下述之血紅蛋白Alc(HbAlc)之測定例加以陳述，但是本發明之免疫測定法並不只限於血紅蛋白A 1 c之測定。上述之「血紅蛋白Ale」為血紅素（Hb)召鍵鏈N末端之胺基酸殘基纈胺酸之α —胺基與葡萄糖以非酵素性結合，成為糖化血紅蛋白者，該企紅蛋白Ale之血中量反映糖尿病較長期之血糖控制狀態。所以，測定該HbA1 c可知道丘糠之控制狀態，在臨床上具有極大之意義（例如參照日本臨床，48，增刊號，315-322(1990))。血紅蛋白為由2個α鏈及2個石鏈形成之雜四聚物，血紅蛋白Ale之特徵為將2個冷鏈中之1個ν末端之《胺基葡糖化’因此於金紅蛋白A1 c，其特徵之反應部位只有1個地方。換言之’從血紅蛋白A 1 c與特異性單株抗體之反應性而言，血紅蛋白Ale具有一價抗原之機能。根據本發明之免疫測定法，有關血紅蛋白A 1 c之測定例如可將被檢試樣（例如於全血中加入精製水，使溶血者）吸附於不溶性磁性載體粒子（乳膠包覆磁性粒子），經由與

313660.ptd 第23頁 1224674 五、發明說明（Π) 才示戚化抗血紅蛋白A 1 c单株抗體之反應，可將乳膠膜上之血紅蛋白A1 c選擇性標籤化，測定該選擇性標籤化標識之程度，可定量血紅蛋白Ale。例如，以HPLC等測定之血紅蛋白A1 c %值為既知之標準試樣，以本發明之免疫測定法同時定量，作成標準曲線，以該標準曲線為基準，可求得未知之試樣血紅蛋白Ale之區分％值。 (抗HbAlc單株抗體）抗HbAlc單株抗體對於吸附或固相化之111^1(2進行實質上之反應’只要是與固相化之HbAO實質上未進行反應（較理想為實質上未與液相中之HbAlc及HbAO進行反應）之抗 HbA 1 c單株抗體即可使用，並無特別之限制。若將糖化肽作為免疫原製作單株抗體，則可獲得該等單株抗體。對於 HbAlc及HbAO之反應性，可經如日本專利第2677753號所揭示之方法測定。本發明中，抗HbAlc單株抗體以HbAlc與日本專利第 26 77753號所揭示之免疫平板閱讀器之刻度顯示l 〇以上 (尤其在2 · 0以上）之反應性者較理想，又，HbAO以顯示在 0.1以下（尤其是在〇·〇5以下）之反應性者較理想。本發明中，抗HbAlc單株抗體以未改性之HbAlc或 HbAO、特別是已改性之HbAO等在液相中即使為1〇微克/毫升（尤其是20微克/毫升）亦未顯示反應性，另一方面，已改性之HbAlc在液相中即使為1微克/毫升（尤其是0.5微克/ 亳升）以下亦顯示反應性者較理想。接著，對於本發明中測定HbA 1 c時理想之一實施樣態 IHII Irani 313660.ptd 第24頁 ip4674 五、發明說明（18) 加以陳述。於本發明，在各試管通常採取溶血液約1至20微升（尤其是2至5微升）作為被檢試樣。實際上所使用之溶血液可由將被檢試樣（例如於全血5 0微升加入純水1毫升者）用約5 至10倍之甘胺酸緩衝液等稀釋使用。接著，於各試管加入磁性乳膠粒子懸濁液（例如〇 · 1 2 微米磁性粒子包覆乳膠，〇· 2%濃度）約1〇〇至300微升（尤其是150至20 0微升），於37 °C放置約1至30分鐘（尤其是3至 1 0分鐘），將試樣中之HbA1 c吸附於乳膠中。此時所使用之磁性乳膠粒子懸濁液以將磁性乳膠粒子原液用甘胺酸緩衝液等稀釋使用較理想。接著，在吸附於乳膠之HbAlc中加入約1 00至300微升 (尤其是50至200微升）含有用適當標識標籤化之抗111^1<3單株抗體（例如源自老鼠腹水之單株抗體）之溶液，於3 7它放置（保溫）2至30分鐘（尤其是3至1〇分鐘）使HbAlc與標籤化單株抗體反應。此時所使用單株抗體溶液之濃度例如以製作抗HbAlc單株抗體之稀釋系列，尋求最適當之濃度較理想。稀釋所使用之緩衝液可列舉例如〇 · 〇 5至〇.丨M甘胺酸緩衝液（GBS;以甘胺酸緩衝化之生理食鹽 buffered saline) ; pH 值為 8.2 至 8·5，含有〇15M氣化鈉）等。此時所使用之緩衝液可加有界面活性劑（Tween 2〇)約〇·1至0·5%(尤其是0·2至〇.3%)，從防止單株抗體在乳膠表面之物理性吸附之點而言較理想。於該領域’使用乳膠粒子作為不溶性磁性載體粒子

時，該乳膠試樣（擔載有抗原、彳^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ 同等品質之乳膠，而在在防止產二ϋ膠)欲作成經常 .彦^生非特異性凝章赤ίΤΓ :奶《V 同時能以安定狀態保存者並不容易。子共f婕集次/儿澱之中本發明’由於不溶性磁性載體(乳膠等) Τ机原或抗體實質上不舍齡戍 ^ ; 1攸士办个會敏感化’所以該不溶性磁性葡髀敏！化磁性乳膝以原狀使用。又，抗體未必精製抑，由於試藥單純而可確保高度之保存安定 Ϊ:n製ί業者為！利之方法。如上所述，根據本發，；試藥之製造單純、容易，可提供使用保存安定性高之試藥之方法。廿文疋、適用本發明之免疫測定法，於各個方法之條件、操作法，業者除了兼顧通常之技術之外，只要構築與本發明該對象物質或具有與該等同等活性之物質相關之測定系即可詳細之此種一般技術方法可參照總論、出版之書[例如入江寬編，「放射性免疫測定法」，講談社，昭和49 年發行；入江寬編，「放射性免疫測定法（續集）」，講谈社’昭和5 4年發行；石川榮治等編，「酵素免疫測定法」醫學書院，昭和5 3年發行；石川榮治等編，「酵素免疫測定法」（第2版），醫學書院，昭和5 7年發行；石川榮治等編’ 「酵素免疫測定法」（第3版），醫學書院，昭和 62 年發行；Η· V· Vunakis et al，（ed，），"（酵素學方法 Methods in Enzymology)"，Vol.70(免疫化學技術 Immunochemical Techn i ques), Part A)，Academic

Press，New York( 1 980 ) ； J. J. Langone e t al.(ed)，1’（酵

1224674 五、發明說明（20) 素學方法）n，Vol.73(免疫學技術），Part B)，Academic Press, New York(1981) ; J. J. Langone et al.(ed)，1’ 酵素學方法n，Vol.74(免疫化學技術，Part C)，Academic Press, New York(1981) ; J.J.Langone et al.(ed)，n酵素學方法"，Vol. 84(免疫化學技術，Part D : Selected Immunoassays)，Academic Press, New York(1982)； J.J.Langone et al.(ed)，” 酵素學方法"，Vol.92(免疫化學技術，P a r t E : Μ o ri o c 1 ο n a 1 A n t i b o d i e s a n d G e n e r a 1 Immunoassay Methods)，Academic Press, New York(1983); J.J.Langone et al.(ed)，” 酵素學方法11， Vol.l21(免疫化學技術，Part I : Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies) ， Academic Press， New York(1986) ; J.J.Langone et al.(ed)，1'酵素學方法n， Vol. 178(Antibodies, Antigens， and Molecular Mimicry)，Academic Press， New York( 1 989 ) ·， M.Wilchek et al，（ed·)，"酵素學方法”，

Vo 1 · 184(Ανidin-Biotin Technology)，Academic Press, New York( 1990); J.J.Langone et al.(ed)，"酵素學方法 "，Vol. 203(Molecular Design and Modeling ·· Concepts and Application， Part B : Antibodies and Antigens， Nucleic Acid, Polysaccharides， and Drugs)，

Academic Press，New York(1991)或該等所引用之文獻 (該等中之某些揭示作為參照，亦包含於本說明書之揭示中）。

313660.ptd 第27頁 1224674 五、發明說明（22) 9.59E-03，0·25%之水稀釋液中之粒子數為312e + 〇8、表面積（m2)為9· 59E-04，〇· 02 5 %之水稀釋液中之粒子數為 3.12E + 07、表面積（m2)為 9.59E-05。於1 0 0微升之磁性乳膠粒子水稀釋液中加入溶血液5微升’於室溫放置5分鐘，使抗原性物質吸附。接著，添加 5 0微升生物素化抗Hb A1 c單株抗體〇 · 〇 7亳克/毫升。將混合液於室溫放置5分鐘後用ALP用緩衝液（1 % BSA，50mM咪唑，150mM氣化鈉，ImM氯化鎂，〇.lmM氣化鋅，〇〇5% Tween2 0，pH 7· 6)洗淨1次。接著添加抗生物素蛋白 (avidin) - ALP( * 5000 ; DAKO D- 3 6 5 ) 1 0 0 微升。將混合液於室溫放置5分鐘後，由於使用生物素一抗生物素蛋白系’所以以ALP用緩衝液洗淨4次。添加AMPPD(Lumigen PPD，和光純藥公司製造）ι〇〇微升後移至白色盤上，測定 10分鐘後之發光量。結果如第1圖所示。由該結果推定溶血液中之蛋白量為約微克，於磁性粒子濃度為2.5%表面積為9.6E-03 m2之蛋白量少，推定係在反應中會引起凝集’而進入該内部者變成不能測定之故。因此，於使用1微米粒子時以約9.6E-03 m2較妥當。實施例2 田抗體量與信號之關係於0· 025 %磁性乳膠粒子水稀釋液1 〇〇微升（不溶性磁性載體粒子係使用與實施例1相同之粒子）中添加溶血液5 微升（以與實施例1相同之方法調製），於室溫放置5分鐘後添加生物素化抗HbAlc單株抗體（以與實施例1相同之方法

1224674 五、發明說明（23) 調製）0.048毫克/毫升（50微升，2·4微克）、0.0048毫克/ 毫升（50微升，0.24微克）或0.00048毫克/毫升（50微升， 0· 024微克）。將混合液於室溫放置5分鐘後用ALP用緩衝、液 (1 % BSA，50mM咪嗤，150mM氣化鈉，ImM氯化鎮，氯化辞，0· 05% Tween20，pH 7· 6)洗淨1次。接著，添知與實施例1相同之抗生物素蛋白一A L P1 0 0微升。將混合_ 於室溫放置5分鐘後，由於使用生物素一抗生物素蛋白系，以ALP用緩衝液洗淨4次。添加與實施例1相同之 1 0 0微升後移至白色盤上，測定1 0分鐘後之發光量。結果如第2圖所示。該結果可判定抗HbAlc單株抗趙f 以約0. 2 5微克即足夠。實施例3 以直接標識之抗體測定以將測定簡略化、提昇再現性為目的，將抗HbA 1 e單株抗體直接以ALP標識之。 (1)將鹼性磷酸酶（ALP :天然酵母）用螢光素異硫氰酸酉旨 (FITC;德泰公司製造）標識之。首先將10毫克/毫升之 ALP( 100微升）添加至0.1M碳酸氳鈉緩衝液（400微升）中，接著添加將4毫克之FITC溶解於二甲基甲醯胺（DMF，1毫升）所獲得之FITC溶液10微升（對ALP為10倍量之FITC)。將混合物於室溫授拌1 0分鐘後以PD- 1 0 (法瑪西亞公司製造）回收之。使用0·1Μ之填酸二氫鈉緩衝液、pH為7.5溶出。可回收1. 7毫升之FITC標識ALP液。使以上所獲得之FITC標識ALP(ALP-FITC)馬來酸酐輪

1224674 五、發明說明（24) 亞胺化。首先將上述回收之alp — FIt用旋液分離器3〇(微孔膜（Minipole)濃縮成為5 00微升。接著，添加將ε 一馬來酸針縮亞胺乙醯氧基）琥珀醯亞胺（EMCS，6毫克）溶解於 DMF(1亳升）所獲得之EMCS溶液1〇微升（對ALP-FITC為20倍量之EMCS)。將混合物於室溫攪拌3 〇分鐘後使用pD _丨〇 (法瑪西亞么司製ie)進行回收。使用含有5mM乙撐二胺四乙酸 (EDTA)之0·1Μ磷酸二氫鈉緩衝液、ρΙ^6·3溶出。可回收 1· 7毫升之馬來酸酐縮亞胺化ALp_FITC液。另一方面’將抗HbA 1 c單株抗體（使用與實施例1相同之抗體）SH化。將19· 1毫克/毫升之抗HbAlc單株抗體（52· 4 微升）添加於0·1Μ之磷酸二氫鈉緩衝液、pH為7·5(450微升）中，再添加將S -乙醯基酼基琥珀酸酐（AMSA，6毫克）溶解於DMF(1亳升）所獲得之AMSA溶液1〇微升（對於抗體為5〇倍量之AMSA)。將混合物於室溫攪拌3〇分鐘後加入含有 50mM乙撐二胺四乙酸之iM Tris緩衝液' pH為7.0(20微升）及1M鹽酸羥基胺液、pH為7· 0(20微升）。將混合物於室溫授拌15分鐘後以pD-i〇(法瑪西亞公司製造）進行回收。使用含有5mM乙撐二胺四乙酸之〇·1Μ磷酸二氫鈉緩衝液、pH 為6· 3溶出。可回收丨· 7毫升之SH化抗體（SH化IgG)液。接著，將上述所調製之馬來酸酐縮亞胺化ALP-FITC與 SH化IgG全量混合。混合比推定為Alp : IgG= l 5 :丨（莫^ 比）。於室溫進行反應2小時後用旋液分離器（微孔膜）濃縮成為500微升，用凝膠過濾（使用載體：超羅斯（Super〇se) 1 2 ;法瑪西亞公司製造），獲得ALp標識抗jjbAlc單株抗

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第31頁 1224674 五、發明說明（25) 體。 (2 )於與實施例1相同之磁性乳膠粒子Q · Q 2 5 % 1 Q Q微升中添加與實施例1相同之》谷血液5微升，於室溫放置5分後添加ALP標識抗HbAlc早株抗體。係添加igG 5微克/毫升50微升作為抗體。又’抗體係使用以PBS-Tween稀釋者與加入 BSA之緩衝液稀釋者用於比較。將混合液於室溫放置$分鐘後用PBS-Tween洗淨4次。添加與實施例1相同之amppdioo 微升後移至白色盤上’測定1 5分鐘後之發光量。結果如第 3圖所示。 u 添加抗體時若與蛋白質共存，則看到背景值下降。由背景值下降可期待再現性之提升。經由抗生物素蛋白一 ALP亦確認信號上昇。第4圖為研究與血紅蛋白Alc(HbAlc) 測疋用試藥「Lapidia Auto HbAlc」（富士雷必歐公司販賣、SRL公司製造）之膠凝集法相關性之結果。確認具有良好之相關性。實施例4 不同之不溶性磁性載體粒子之比較

使用與實施例3相同之操作及試藥。比較實施例丨至3 所使用之藤倉化成（股）公司製造的粒子與貝利達斯公司製造，粒子。使測定時所使用磁性粒子之總表面積為相同下進灯測疋。貝利達斯公司製造的粒子粒徑為2 · 8微米，粒，濃度為4.0E + 09粒子/毫升，計算上之面積為2·46Ε_η，每個刀析之表面積為9· 59E_〇5m2/粒子（作成^必需為工微升），將貝利達斯公司製造之粒子用水稀釋i 〇〇倍，取丨〇 Q

第32頁 1224674 五、發明說明（26) 微升使用。將各磁性粒子100微升（表面積為9. 59E-11 m2)添加於溶血液5微升後於室溫放置5分鐘。接著，於混合物中添加 ALP標識抗HbAlc單株抗體。抗體係添加5微升/毫升50微升 IgG。將混合物於室溫放置5分鐘後用PBS-Tween洗淨4次，添加與實施例1相同之AMPPD1 00微升後移至白色盤，測定 1 5分鐘後之發光量。結果如第5圖所示。校準器係使用血紅蛋白

Alc(HbAlc)測定用試藥「Lapidia Auto HbAlc」（富士雷必歐公司販賣、SRL公司製造）。【產業上利用之可能性】根據本發明理，可簡便且迅可使多數檢體同測定法理想地適自動化、可大量身，對於試藥之 (將乳膠與抗原同之品質。又，術。一般，乳膠試藥價袼一半以粒子之步驟之費性磁性載體上之藥用不溶性磁性速地測定被檢試樣中時並列處理變為極容用於已全自動化之臨處理。又，根據本發製造亦有優點。亦即 ‘抗體結合）之製造未必需有防止在保存時診斷藥價袼中原材料上者為生物材料及將用。對於此，根據本抗原或抗體實質上不載體（乳膠等）可以原不需進之抗原易。除床檢查明，不，一般必可容產生凝乳膠之生物材發明，經敏感狀使用行煩雜性物質此之外機器，僅是測磁性乳易地製集或沉成本低料包覆於乳膠化，市，不需之前處，所以，該等使測定定法本膠試藥造出相澱之技，占有於乳膠等不溶售之試繫i告新

1224674 五、發明說明（27) 的「乳膠試藥」。除此之外，本發明中即使是抗體亦不一定要用精製品，其必要量亦可大幅度減少，測定試藥之製造亦變容易，在保存安定性方面亦極有利。本發明除了上述之說明及實施例所揭示者之外亦可實行乃明確之事。以上述之示範為借鏡，本發明可作各種之改變及變形，該等亦在本件所請之申請專利範圍之範圍内。

313660.ptd 第34頁 1224674 圖式簡單說明【圖表之簡單說明】第1圖為使用包含將HbA 1 c吸附於磁性乳膠粒子步驟之標識抗H b A1 c單株抗體測定H b A1 c時，不溶性磁性載體粒子之粒子表面積與所得信號之關係圖。第2圖為使用包含將H b A 1 c吸附於磁性乳膠粒子步驟之標識抗H b A 1 c早株抗體，測定H b A1 c時’存在於系中之抗體量與信號之關係圖。第3圖為使用包含將HbA 1 c吸附於磁性乳膠粒子步驟之標識抗HbA lc單株抗體，測定HbAlc時，使用作為標識可直接檢測之物時之結果。第4圖為使用包含將H b A1 c吸附於磁性乳膠粒子步驟之標識抗HbAlc單株抗體之HbAlc測定法與乳膠凝集法之關係圖。第5圖為使用包含將HbA 1 c吸附於磁性乳膠粒子步驟之標識抗HbAlc單株抗體之HbAlc測定法中，使用不同之不溶性磁性載體粒子對於測定之影響。

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Claims

1224674 ΙΜ^11Ι0336_ 五年 η ^ ¥) H?

公告本六 1. 、申請專利範圍一種使用不溶性載體粒子 \ ⑴使用抗原及/或抗體㈡：：丨，徵為：溶性磁性载體粒子、、貝上為未吸附狀態之不 (1 Ο被檢試樣中之抗原性物不溶性磁性載體粒子上、係及附或九合於該 (=i)為與該抗原性物f進行磁性載體粒子固相化之抗原= 性磁性载4粒能；；以不吸附或結合於該不溶 =i,·;原性物質實質上不起反應之抗體與經一 $ (11)之處理所獲得之該不溶性磁性載體粒子進仃μ、（1 v)以與該原性物質反應之標籤化抗體之_ 識作為指標進行測定。紙骽之‘ 如:明專利範圍第1項之免疫測定法，係將被檢試樣中之抗原I4生物貝吸附或結合於不溶性磁性載體粒子後，該被檢試樣不經由洗淨除去而是與對抗原性物質特異性反應之抗體進行反應者。 3 如申請專利範圍第1項之免疫測定法，係使該標籤化抗體與吸附或結合有被檢試樣中之抗原性物質之不溶性磁性載體粒子進行反應後，在磁場之作用下將該不溶性磁性載體粒子與未反應之標籤化抗體分離，接著以與該抗原性物質反應之標籤化抗體之標識作為指標進行測定者。 4 ·如申請專利範圍第1項至第3項任何一項之免疫測定

313660修正版.ptc 第36頁 1224674 _案號91110336 %年0月9曰修正_ 六、申請專利範圍法，其中，該抗體係單株抗體者。 5. 如申請專利範圍第1項至第3項任何一項之免疫測定法，其中，該抗體係多株抗體者。 6. 如申請專利範圍第1項至第3項任何一項之免疫測定法，其中，該不溶性磁性載體粒子係於水性液體介質中實質上為不溶性之微粒子，且為由有機高分子物質相與磁性物質相組成之微粒子者。 7. 如申請專利範圍第6項之免疫測定法，其中，該不溶性磁性載體粒子係由有機高分子物質而成之薄膜相與由磁性物質而成之芯相所組成之微粒子者。 8. 如申請專利範圍第1項至第3項任何一項之免疫測定法，其中，該不溶性磁性載體粒子係平均粒徑在0. 0 1 至2 0微米範圍之乳膠粒子，且具有由磁性物質所成之核者。 9. 如申請專利範圍第8項之免疫測定法，其中，該不溶性磁性載體粒子係平均粒徑在0. 1至6^1米範圍之乳膠粒子，且具有由磁性物質所成之核者。 1 0 .如申請專利範圍第1項至第3項任何一項之免疫測定法，其中，該免疫測定法係於磁性粒用臨床檢查用自動機器中，從檢體試樣之分注至取得測定結果均可自動化進行者。 1 1.如申請專利範圍第1項至第3項任何一項之免疫測定法，其中，被檢試樣中之抗原性物質係HbA 1 c者。

313660修正版.ptc 第37頁