JP2008509684A - アフラトキシンを転化する活性を有する解毒酵素、及びこの酵素をコーディングする遺伝子 - Google Patents
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Abstract
【選択図】 図1
Description
ADTZ短鎖N末端のアミノ酸配列の獲得:目的ピークに対して質量スペクトル解析を行って、短鎖ペプチドN末端のアミノ酸配列を得る。
本発明において、発明者は、初めてこのタンパク質をコーディングする遺伝子を分離、偏析した。また、発明者はこの遺伝子を一種の発現ベクターに組み込んで、一種の形質転換体を生成し、更に、この形質転換体に基づいて、ADTZタンパク質の製造を成功的に実現することができた。活性鑑定実験によれば、組換えADTZが天然ADTZと類似なアフラトキシンを転化する生物活性を有することが証明される。組換えADTZのAFB1解毒生物活性に対する鑑定実験によれば、組換えADTZが、AFB1の異常(aberration)作用を低下させ、AFB1が引き起こす突然変異を抑制する生物活性作用を有することが証明される。本発明は、これからの飼料加工、食品加工及び抗癌薬の開発において、優れた基礎を築いた。
(I)菌体の発酵培養:
1)菌種:Armillariella tabescens
2)前記菌種を液体培地(馬鈴薯抽出液1L、グルコース20.0g、KH2PO4 3.0g、MgSO4・7H2O 1.5g、微量のビタミン、pH6.6)で合計25日培養して、一級〜三級をそれぞれ6日、4日、4日培養し、四級は11日培養し、培養温度を24〜28℃として、菌体を収集した。
新鮮な菌体を液体窒素凍結した後に小さい塊に打って、1:1(W/V)の比例でリン酸塩緩衝液を加えて、氷浴の中でホモジネートし、超音波で細胞を滅裂した後に、11000〜12000g遠心力で遠心分離法により沈殿物を除去し、それから20〜80%飽和の硫酸アンモニウムで分別沈殿し、最後に沈殿物を取り出す。pH6.0,0.02mol/Lのリン酸緩衝液で溶解懸濁して、ブラッドフォードタンパク質分析(Bradford法)し、また、AFB1 ELISAキットでタンパク質の成分の酵素活性を検査して、アフラトキシン解毒酵素(ADTZ)を含む酵素液を得る。
(1)酵素サンプルの準備:
粗酵素液を40倍体積のリン酸緩衝液(pH6.0,0.02mol/L)で透析脱塩し、ポリエチレン・グリコール−20000で透析濃縮して、また、0.45μmマイクロフィルムで濾過してから、ブラッドフォードタンパク質分析する(Bradford法)。
文献(Ion Exchange Chromatography principles and methods,Pharmacia Co.編,Pharmacia Co.,1984,pp.29〜31;及びChromatofocusing with PolybufferTM and PBETM,6.Experimental,Pharmacia Co.編,Pharmacia Co.,1984,pp.11〜24)記載の方法によって、イオン交換クロマトグラムと、等電点電気泳動法クロマトグラフィーカラム填料と、緩衝液とを選んで、操作請求に従って、イオン交換クロマトグラム及びフォーカスクロマトグラムを、すべてFPLC System(Pharmacia Biotech Co.,米国)により行う。詳細は以下の通りである。
1)試薬:
pH6.0,0.2mol/Lリン酸塩貯蔵緩衝液
A液:pH6.0,0.02mol/Lのリン酸緩衝液
B液:pH6.0,0.02mol/L+1N NaClのリン酸緩衝液
DEAE-Sephadex 50mLを、2倍の体積のリン酸塩緩衝液と十分に攪拌洗浄した後に、20分間静置し、そして小型真空ポンプで上清を引出して、相同な操作をして洗浄を繰り返し、また、相同の条件で5回繰り返して洗浄した後に、0.6mL/分の流速で規格が20×30cmであるカラムに充填する。
1)試薬:
溶出液:PolybufferTM 74(Pharmacia Co.製),250mL包装。100mLを取って純水を添加して1000mLまで薄め、4℃の条件に保存して予備用とする。
最初緩衝液:pH7.4,0.025mol/Lのイミダゾール−HCL緩衝液
2)カラム:
Mono-pTM PBE94,5×20cm予め装填カラム(Pharmacia Co.製)。
収集した各成分について別々にAFB1を取り扱い、ELISA法によって処理をしたサンプルの中のAFB1の量を検査し、100℃の条件で10分間沸騰した同じ成分を対照するが、AFB1を減少させることができる成分が活性の成分である。詳細は以下の通りである。
不活性化酵素液群:AFB1 200ul(濃度2.5ng/mLメタノール)+不活性化酵素液200ul(1.2mg/mL)
活性酵素液群:AFB1 200ul(濃度2.5ng/mLメタノール)+活性酵素液200ul(1.2mg/mL)
質量制御群:AFB1 200ul(濃度2.5ng/mLメタノール)+緩衝液200ul(1.2mg/mL)
不活性化酵素液の調製:成分を100℃で10分間煮沸させる。
得られたタンパク質は、SDS−PAGE電気泳動によって分析した結果、分子量が約73〜76kDaであり、等電点電気泳動によって分析した結果、等電点(pI)が約5.3〜6.8である。
(I)ADTZでAFB1を転化する活性の鑑定:
中国予防医学科学院の標準処点(食品衛生国家標準集,中国予防医学科学院標準処編,北京,中国標準的出版社,1998年版,pp.410〜415)及び▲ジェー▼永信(薄層クロマトグラフの食品分析への応用,▲ジェー▼永信,陸氷真編集,北京大学出版社,1991年版,pp.118〜123)が報告した方法に従って、薄層クロマトグラフ法により、ADTZで処理したAFB1に対して検査・測定を行って、純化したADTZ活性を鑑定する。具体的な方法は次の通りである。
1.5mLの遠心管一つを取って、1μLのAFB1溶液(AFB1メタノール溶液:0.5μg/μL,アフラトキシンB1,Alexis Biochemicals Inc.,スイス)を添加して、窒素ガスを蒸着する。別々にADTZ酵素の液体(タンパク質の含有量:0.1mg/mL)300μL、MgSO4 0.5μL、PEG200 10μLを添加して、十分に混ぜる。30℃の水浴の中で1時間反応させて、試験管の内のAFB1総量が2μgになるように、以降毎時間ずつ各容器へ0.5μLのAFB1溶液を添加する。添加を完了した後、更に2時間反応させる。
1.5mLの遠心管一つを取って対照群1と表記し、1μLのAFB1溶液を添加してから、窒素ガスを蒸着する。別々に、300μLの酵素溶液(前もって100℃水浴で5分間非活性化する)、MgSO4 0.5μL、PEG200 10μLを添加した後、十分に混ぜる。1.5mLの別の遠心管を取って対照群2と表記し、1μLのAFB1溶液を添加してから、窒素ガスを蒸着する。別々に、3300μLのPBS緩衝液(0.1M,pH6.6)、MgSO4 0.5μL、PEG200 10μLを添加して十分に混ぜる。後続操作は実験群と同じである。
新しく活性化(100℃,2時間)したプレハブシリカゲルの薄層板(10×10cm,60Å,Whatman,USA)を取って、薄層板の上でサンプルをポイントして、ポイントをへりから1cm離れ、ポイントの間隔を1cmとする。左から右に:第1ポイントは10μL,25μg/mLのAFB1クロロホルム溶液であり;第2、3ポイントはそれぞれ10μLの対照群2であり;第4ポイントは10μL,2号の対照群1であり;第5ポイントは10μLの実験群であり;第6ポイントは10μL 25μg/mLのAFB1クロロホルム溶液である。
観察:波長が365nmである紫外線の下で蛍光を観察して、写真を撮る。結果は図2に示す通りである。
結果によると、AFB1の標準品(1、6)と酵素の非活性化対照(4)とPBS緩衝液対照(2、3)について、エーテルが展開する時すべてただ微小な移動のみが発生したが、ADTZ処理を行った後のAFB1産物のRf値は1に近づいている(=0.95)。これで、解毒処理をした後のAFB1が、その極性が著しく減少して、AFB1と明らかに異なり、純化して得たADTZがAFB1を転化する活性を有することを説明する。
エームス・ネズミチフス菌バイオアッセイ試験(Ames実験)は中華人民共和国衛生部薬政局の公布する方法(中華人民共和国の衛生部薬政局が編集、新薬(西洋式薬)の臨床研究指導集(薬学、薬理学、毒理学),1993年7月)に従って行う。具体的な方法は次の通りである。
ヒスチジンの栄養欠陥型のネズミのチフスサルモネラ菌株TA98(衛生部薬品生物製品検定所から引用)であり、−85℃(零下85℃)の低温の冷蔵庫で保存して、テストの前で採用の菌の株に対して遺伝子型鑑定及び自発回変数の測定を行って、生物学の鑑定は合格で、実験要求に符合する。
(i)SDラット誘導:SDラットを一周間検疫して病気がないことを確定して、ポリ塩化ビフェニルでトウモロコシ油を混濁し、腹腔注射(500mg/kg体重)して、5日後の死刑を決め、死刑に処する前に12時間断食する。
(ii)S9成分の調製:上述のように誘導したSDラットに対して首を切って血を落ち、また、無菌の条件で肝臓を取って、重さを量り、肝臓を冷たい0.15mol/L(以下同じ)KClにより洗浄する。1g肝臓に3mLの割合で添加してホモジナイザーで均質化してから、各組織の均質化時間を一致させる。均質液を0℃で、9000g遠心力で20分間遠心して、上清液を取る。無菌を証明した後に−85℃の冷蔵庫に貯蔵して備え付けておく。
下記A、B、C液とS9成分を混合して、4℃の条件で保存して4時間以内に使う。
A液:(0.2mol/L,補酵素II,濾過滅菌)0.2mL
B液:(0.2mol/L,グルコース6−リン酸,濾過滅菌)0.25mL
C液:8.55mL
C液組成(0.4mol/L MgCl2 20mL,1.65mol/L KCl 20mL,0.2mol/Lリン酸緩衝液(pH7.4)500mL,蒸留水315mL,混ぜた後に濾過滅菌する)。
S9成分:1.00mL
30mLの反応体系において、ADTZ濃度が0.2mg/mLで、AFB1の濃度が0.2mg/mLで、pH値が6.0であるが、28℃の下で120分間反応して、体系を10倍拡大する。反応後に、同等体積のクロロホルムでアフラトキシンB1副産物と未反応の残留物を3回抽出して、有機相を合併し、更に、40℃で減圧してクロロホルムを揮発乾燥する。また、3.75と3mLのDMSOで抽出物(活性酵素処理反応群)を洗浄し、活性ADTZの代わりに予めクロロホルムで非活性化させたADTZによって、同等の条件下にアフラトキシンB1(非活性化する酵素処理対照群)を処理する;活性ADTZ酵素液の代わりに緩衝液により、同等の条件下にアフラトキシンB1(緩衝液処理対照群)を処理する。以上のサンプルを全部−15℃の条件で保存する。
サンプルのDMSO溶液と一夜培養した菌液及びS9を上層寒天培養基の中に添加して均一に混ぜる。また、40℃の条件で下層Vogel選択培地に倒れて置き、凝固した後に37℃のインキュベーターで72時間培養して、培養皿毎に現れる復帰突然変異コロニーの数を算出する。
群毎にテストする時、各群の抽出液及び陰陽性対照を全部3つの平皿に設けて、1回繰り返す。各群の抽出液の結果は、2回6群の平均値である。実験結果は、復帰コロニーの数、突然変異率(MR=サンプル復帰コロニーの数/陰性対照復帰コロニーの数)、及び抑制率(%)[={1−(被験サンプル復帰コロニーの数−陰性対照群復帰コロニーの数)/(AFB1対照群復帰コロニーの数−陰性対照群復帰コロニーの数)}−100%]によって表示される。
溶剤対照群が正常な範囲内であれば、受検物は3個濃度以上に陽性用量反応があり、最大の増加値は溶剤対照値の2倍(即ちMR≧2)であって、致突然変異陽性と考えられる。
活性ADTZ処理反応群の細菌復帰突然変異コロニーの数は、陰性対照群(DMSO対照群)に近づいている(MR値が全部2より小さい)。緩衝液処理対照群と不活性化ADTZ処理対照群の細菌復帰突然変異コロニーの数は、陰性対照群(MR値が全部2より大きい)より顕著に高い、陽性対照(アフラトキシンB1対照)の細菌復帰突然変異コロニーの数に比べて顕著な相違がない。これは活性ADTZ処理反応群の被試験物が誘発遺伝子突然変異作用を有しないことを表明している。ADTZはAFB1の突然変異を抑制する生物活性作用を有することを表す。結果は次の表の通りである。
実施例1で純化して得られた活性成分のピークの先を収集して、或いは活性成分をPAGE電気泳動して、目的バンドを収集し、Q−TOF2(電子スプレー−4極竿飛行時間−タンデム質量スペクトル解析)機器(イギリスMicromass社,軍事医学科学院器具テスト分析センターから提供)を採用してADTZ短鎖ペプチドのN末端のアミノ酸配列を測定する。得られたアミノ酸配列は次の通りである。
M1:EAWEGFTALVDK
M2:NKLLQDANGELENLYVR
酵素を生成する菌の菌体の組織をプレクーリングしたモルタルの中に入れて、サンプルが粉末状になるように液体の窒素を添加して研磨する。また、100mg程度のサンプルを取って1.5mLの遠心管の中に移して、1mLのTrizolを添加し、振動して均一に混ぜて、室温に5分間置く。また、200mLクロロホルムを添加して、2分間振動して均一に混ぜて、氷浴に5分間置いて、2〜8℃の条件で、12000×gで15分間遠心してから、上清を別の11.5mLの遠心管に転移する。プレクーリングした500mLのイソプロピルアルコールを添加して、氷浴に20分間置いて、2〜8℃の条件で、12000×gで10分間遠心する。更に、上清を捨てて、プレクーリングした1mLの75%アルコールを添加して、沈殿及び遠心管壁を洗浄する。2〜8℃の条件で、7500×gで5分間遠心して、上清を捨てて、空気で5〜10分間乾燥させてから、50μLのDEPC無菌水を完全溶解するように添加する。紫外分光光度法と電気泳動の検査(1.1% Agarose/EB、100V、20分)を行って、サンプルは−80℃で保存する。結果は図3に示すように、電気泳動の検査の結果から28s rRNAと18s sRNAの二つの特徴バンドがはっきりして、光度比は2:1に近づいていることにより、総RNAが分解しなかったことを説明する。
実施例3で得たADTZ短鎖ペプチドアミノ酸配列から二つのプライマー(P1、P2とG1、G2)を設計する。ADTZ遺伝子部分の配列の産物を得るように、QIAGEN OneStep RT-PCR Kit(QIAGEN Inc.,米国)手帳を参照してRT−PCRを行う。ゴムを切ってRT−PCR産物を回収して、そして通常の方法によってTAクローンを行う。HindIIIとEcoRIでTAクローンの組換えプラスミドを酵素切断して鑑定して、1.5%アガロースゲル電気泳動で酵素切断結果を検査する。組換えプラスミドに対して配列解析を行って、ADTZ遺伝子のcDNAフラグメントE1を得る。具体的な方法は次の通りである。
P1:5’−TGGGARGGNTTYACNGC−3’
P2:5’−TCNCCRTTNGCRTCYTG−3’
プライマー対2:
G1:5’−CARGAYGCNAAYGGNGA−3’
G2:5’−GCNGTRAANCCYTCCCA−3’
1)テンプレートの総RNA(実施例4から獲得する)を75℃で5分間変性させて、迅速に氷の中に挿入して冷却する。
吸い込んで均一に混ぜて、短時間遠心する。
・逆転写(Reverse transcription):50℃,30分
・Initial PCR activation step:50℃,15分
・3ステップサイクル(3-step cycling)
・15サイクル:94℃,40秒
65℃,1分(−1℃/サイクル)
72℃,1分
・25サイクル:94℃,40秒
50℃,1分
72℃,1分
・Final extension:70℃,10分
1)TAE電気泳動緩衝液を調合して、また、0.8%アガロースゲルを調合する。
2)50μLのRT−PCRの産物と10×loading bufferを割合によって混合して、サンプルを加える。
3)100V,20分間の電気泳動。
4)電気泳動が終わった後に、紫外灯を用いてバンドの位置を観察して、目的帯を切って、新しい滅菌した1.5mLの遠心管へ転移する。
5)800μLのバッファーNT1を添加する。
6)NucleoTrap Suspensionを渦巻振動して、小珠が完全に浮遊させた後に、10μLを取って遠心管に加入する。
7)遠心管を50℃水浴に6分間置いて、その間に2分毎に短い時間渦巻振動する。
8)室温下で、10000×gで、30秒遠心して、上清を捨てる。
9)500μLのバッファーNT2を加入して、短時間渦巻振動し、室温の条件で、一0000×gで、30秒間遠心して、上清を捨てる。次に、このステップを1回繰り返す。
10)500μLのバッファーNT3を加入して、短時間渦巻振動し、室温の条件で、10000×gで、30秒間遠心して、上清を捨てる。次に、このステップを一回繰り返す。
11)再度10000×gで、30秒間遠心して、上清を捨て、空気の条件で10〜15分乾燥する。
12)30μLのTEバッファー(pH8.0)を加入して、沈殿物を再び懸濁する。回収のフラグメントを“E1”と命名する。RT−PCR産物の電気泳動検査を行う。結果は図4に示すように、プライマー対P1とP2の反応の結果から1つのバンドを獲得したことを明示しており、条帯位置はおよそ800bp程度であり、これをE1フラグメントと命名する。
(1)連結:
1.5mLの新しい滅菌した遠心管に下記の成分を加入する。
1μL pUCm−Tベクター
3μL E1フラグメント(RT−PCR回収産物)
1μL 10×バッファー
1μL T4 DNAリガーゼ
4mLの無菌水を添加して総体積を10mLに補充する。
吸い込んで均一に混ぜて、短時間遠心して、22℃水浴で4時間以上置く。
DH5αモノクローンを選び取って2mLのLB液体培地の中に添加し、37℃の条件で振動して一夜培養する。活性化した新鮮なDH5α菌液の中から50μLを取って5mLのLB液体培地の中に接種して、37℃の条件で振動して1.5〜2時間培養する。また、氷浴に30分置いて、菌液を無菌遠心管の中に転移して、5000rpmで5分遠心して、上清を捨てる。1.5mL氷浴した無菌CaCl2を遠心管に添加して、菌体を浮遊して、氷浴に10分置いて、5000rpmで5分遠心して、上清を捨てる。200μLの氷浴した無菌CaCl2を遠心管に添加して、菌体を浮遊して、4℃の条件で保存しておく。
200μLのコンピテント細胞を取って、10μLの連結物を含む遠心管に添加して、均一に混ぜる。氷浴に30分置き、42℃の水浴に90秒置いて、直ちに氷浴に3〜5分置く。800μL LB液体培地に添加して、37℃で40〜60分培養し;90mm平板毎に200μLの量で、形質転換されたコンピテント細胞をAmpとIPTG/X−galを含むLB固体培地に塗布し、37℃で12〜16時間振動培養する。
形質転換した単菌落を選び取って、2mLのアンピシリンを含むLB液体培地の中に接種して、37℃で激しく振動して一夜培養する。1.5mL菌液を取って微量遠心管に添加して、12000rpmで2分遠心して、上清を捨てる。400μLのSTE溶液を取って菌体を洗浄して、渦巻き振動して均一に混ぜて、12000rpmで2分遠心して、上清を捨てる。沈殿した菌体に100μLのプレクーリングした溶液Iを添加して、激しく振動して均一に混ぜる。200μLの新鮮に調合した溶液IIを添加して、直ちに急速に転倒させて混ぜて、氷浴に3分置く。150μLのプレクーリングした溶液IIIを添加して、転倒させて混ぜることを繰り返して、氷浴に5分間置く。12000rpmで5分間遠心して、上清は別の管の中へ移す。同等体積のフェノールを添加して、転倒して均一に混ぜる。12000rpmで5分遠心する。気をつけて上清を吸収して別の管の中へ転移する。2倍体積のプレクーリングした無水アルコールを添加して、転倒にて均一に混ぜて、室温で静かに40〜60分置く。12000rpmで10分遠心させて、上清を捨てる。200μLの70%アルコールを添加して、沈殿物を洗浄して、12000rpmで1分間遠心させて、上清を捨てる。キャップを開けて、空気の中で5〜10分乾燥して、30μLのデオキシリボヌクレアーゼを含まないリボヌクレアーゼのTEを添加し、溶解沈殿し、37℃で1時間培養する。−20℃の条件で貯蔵する。
HindIIIとEcoRI酵素でTAクローンのリコンを酵素切断鑑定して、次の通り表す(単位:mL)。
組換えプラスミドPEG純化法(Sambrookら,1989,Molecular cloning,Cold Spring Harbor Laboratory Press,USA)によって、プラスミドDNAを抽出する。T7とSP6をシークエンシングプライマーとして、ABI377 DNA Sequencer DNA自動配列計(上海博雅公司から提供)で、表裏方向で測定を行って、E1フラグメントの核酸配列を得る。測定結果:配列はプライマーP1とプライマーP2の配列を含み、その中の位置にHindIII酵素認識部位(aagctt)が現れる。
実施例5で獲得したADTZ遺伝子の部分の配列E1フラグメントによって、プライマーを設計する。
S1(5’−TAGGCGAAGTGTCGTCGTCAATGGAA−3’)
S3(5’−GAAGTTATCGGCTTTCCAGTCAGAGGGT−3’)
プライマーS1:5’−TAGGCGAAGTGTCGTCGTCAATGGAA−3’
プライマーS3:5’−GAAGTTATCGGCTTTCCAGTCAGAGGGT−3’
(1)3’RACE-Ready cDNAの調製:
1)テンプレートの総RNAを75℃で5分間変性して、迅速に氷の中に挿入して冷却する。
2)0.5mLの滅菌遠心管の中に下記の試薬を添加する。
1μL 変性したテンプレートの総RNA
1μL 3’−CDSプライマーA
3μLのリボヌクレアーゼを含まない無菌水を添加して体積を5mLまで補充する。
3)吸い込んで均一に混ぜて、そして短い時間で遠心させて混合液が管底に位置するようにする。
4)70℃で、温浴で2分置く。
5)氷浴で2分置いて、少し遠心させて下記の試薬を添加する。
6)試薬をそっと吸い込んで均一に混ぜて、少し遠心させる。
7)インキュベーターの中で、42℃で1.5時間温浴する。
8)100mLのTricine−EDTAバッファーで産物を希釈する。
9)72℃で7分間培養する。
10)サンプルは−20℃で貯蔵する。
1)マスターミックス(Master Mix)(総体系100μL)の準備:
吸い込んで均一に混ぜて、短い時間で遠心する。
・5サイクル:94℃,5秒
72℃,3分
・5サイクル:94℃,5秒
70℃,10秒
72℃,3分
・35サイクル:94℃,5秒
68℃,10秒
72℃,3分
HindIIIとEcoRI酵素でTAクローンのリコンを酵素切断鑑定して、次の通り表す(単位:mL)。
組換えプラスミドPEG純化法(Sambrookら,1989,Molecular cloning,Cold Spring Harbor Laboratory Press,USA)によって、プラスミドDNAを抽出し、T7とSP6をシークエンシングプライマーとして、ABI377 DNA Sequencer DNA自動配列計(上海博雅公司から提供)で、表裏方向で測定を行って、2つのフラグメントの核酸配列を得る。得られたE2配列は、3’に偏る位置に一つのAAGCTTのHindIII酵素認識部位がある。
(1)5’RACE-Ready cDNAの調製:
1)テンプレートの総RNAを取って、75℃で5分間変性させて、迅速に氷の中に挿入して冷却する。
2)0.5mLの滅菌遠心管の中に下記の試薬を添加する。
1μL 変性したテンプレートの総RNA
1μL 5’−CDSプライマーA
1μL SMART IIA Oligonucleotide
2μLのリボヌクレアーゼを含まない無菌水を添加して体積を5mLまで補充する。
2)吸い込んで均一に混ぜて、そして短時間遠心して混合液が管底に位置するようにする。
3)70℃で、温浴で2分置く。
4)氷浴で2分置いて、少し遠心させて下記の試薬を添加する。
5)試薬をそっと抽出して均一に混ぜて、少し遠心させる。
6)インキュベーターの中で、42℃で1.5時間温浴する。
7)100mLのTricine−EDTAバッファーで産物を希釈する。
8)72℃で、7分間培養する。
9)サンプルは−20℃で貯蔵する。
1)マスターミックス(Master Mix)(総体系110μL)の準備:
吸い込んで均一に混ぜて、短い時間で遠心する。
・94℃,1分
・5サイクル:94℃,30秒
72℃,4分
・5サイクル:94℃,30秒
70℃,4分
・25サイクル:94℃,30秒
68℃,4分
・72℃,10分
HindIIIとEcoRI酵素でTAクローンのリコンを酵素切断鑑定して、次の通り表す(単位:mL)。
組換えプラスミドPEG純化法(Sambrookら,1989,Molecular cloning,Cold Spring Harbor Laboratory Press,USA)によって、プラスミドDNAを取り出す。T7とSP6をシークエンシングプライマーとして、ABI377 DNA Sequencer DNA自動配列計(上海博雅公司から提供)で、表裏方向で測定を行って、E3フラグメントの核酸配列を得る。得られたE3フラグメントに、5’に偏る位置に一つのHindIII酵素認識部位が存在し、3’の端部に一つのHindIII酵素認識部位が存在する。
NCBIのVecscreenプログラムによりベクター配列を認識して取り除いた後、DNAMANプログラムでE1、E2、E3を繋ぎ合わせ、得られた配列を、NCBIのORF Finderプログラムによってオープン・リーディング・フレーム分析を行い、長さが2.3kbで、完璧なオープン・リーディング・フレームがあり、また3’末端のポリ(A)尾部及び5’末端と3’末端の非翻訳領域を含む配列を得た。その結果は配列表の配列番号2に示す。ADTZヌクレオチド配列と推定されたアミノ酸配列に対して、インターネットによって、例えばプログラムBLASTとBLASTX(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)、BLASTA配列との類似性を調べて、ADTZが新たな遺伝子であり、更に、これによって推算されたコーディングADTZの成熟ペプチドのアミノ酸配列と同じ配列がGENEBANKにないので、新しいアミノ酸配列であることが分かる。
実施例6で得られたコーディングADTZ全長cDNA配列の両端配列を分析し、開始コドンから終止コドンまでのADTZオープン・リーディング・フレームを得られ、更にプライマーに制限酵素認識部位EcoRI(GAATTC)とBamHI(GGATCC)をそれぞれ添加するように、プライマー一対を設計する。
P3:5’−GTCGAATTCATGGCCACCACAACTGTC−3’
P4:3’−GTAACTCTCTGCTAACACTCCTAGGGAC−5’
吸い込んで均一に混合した後、短時間の遠心分離を施す。
・94℃,1分
・5サイクル:94℃,30秒
72℃,4分
・5サイクル:94℃,30秒
70℃,4分
・35サイクル:94℃,30秒
68℃,4分
・72℃,10分
PCR生成物を回収する常法に従って、コーディングADTZ成熟ペプチドのcDNAを得た。このフラグメントをADTZ’と命名する。
遺伝子クローンは常法(Sambrookら,2001,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,USA)で行って、実施例7で得られたADTZ’をpHIL−S1にクローンして、発現プラスミドpHIL−S1−ADTZを組み立てた。クローンした後の標的遺伝子は酵素で切って、配列解析をする。詳しくは、操作は以下の通りである。
組換えプラスミドpHIL−S1−ADTZとプラスミドpHIL−S1をSacI酵素で切り、得られた生成物について0.8%のアガロースゲルで電気泳動を行った後、ゲルを切って、得られたリニアー組換えプラスミドpHIL−S1−ADTZとプラスミドpHIL−S1を回収した。Pichia Expression Kit(Invitrogen Inc.,米国)に記載するプロトプラスト法に従って、Pichia Pastoris GS115を形質転換して、Mut+形質転換体を篩分けた。メタノールを単一炭素源として、組換え菌に対して誘導性発現(Pichia Expression Kitに従って操作する)を行う場合、培養液をSDS−PAGE電気泳動で分析することにより、形質転換体が誘導性発現された後、培養液の上清に著しい標的タンパクバードが検出された。しかし、標的遺伝子を含まない空プラスミドを対照菌に形質転換したのち、同様な条件下で96時間誘導すると、上清に標的タンパクバードが検出されなかった。その結果、図12に示すように、形質転換体がメタノールで誘導性発現された後、培養液の上清に著しい標的タンパクバードが検出されたが、標的遺伝子を含まない空プラスミドを形質転換した陰性対照菌に対して、同様な条件下で誘導すると、上清に標的タンパクバードが検出されなかった。
詳しくは以下の通りである。
(1)リニアープラスミド:
組換えプラスミドpSAとプラスミドpHIL−S1をSacI酵素で切りながら、リニアープラスミドpHIL−S1を後述の実験の対照(control)とした。
酵素pSAで切る(総体系120):12mLバッファーL+8mL SacI+100mL pSA
酵素pHIL−S1で切る(総体系120):12mLバッファーL+8mL SacI+100mL pHIL−S1
酵素で切ったサンプルについて0.8%のアガロースゲルで電気泳動を行って、ゲルを切って、得られたリニアー組換えプラスミドpSAとプラスミドpHIL−S1を回収した。
1)平板から一つのGS115単一クローンを取って、10mLのYPD中に接種した後、150mLの三角フラスコで、30℃下、250〜300rpmで振動して、一晩培養した。
2)昨日培養した10mLのYPD菌液からそれぞれ5、10、20μLを取り出して、200mLのYPD中に接種した後、500mLの三角フラスコで、30℃下、250〜300rpmで振動して、一晩培養した。
3)三つの三角フラスコに菌液のOD600を検査して、OD600=0.2〜0.3の菌液を取って、遠心管に移行し、室温下1500×gで5分遠心して、上清を捨てて、細胞を収集しプロトプラスト形質転換に用いた。
1)収集した培養の細胞を200mLの無菌水に懸濁して、10mLの遠心管二つに移行した。
2)室温下、1500×gで5分遠心して、上清を捨てた。
3)調製したばかりのSED 10mLで沈殿を洗った後、室温下、1500×gで5分遠心して、上清を捨てた。
4)1Mソルビトール液10mLで沈殿を洗った後、室温下、1500×gで5分遠心して、上清を捨てた。
5)SCE 10mLで沈殿を懸濁した。
6)Zymolyase一管を取って、氷結した後管壁を軽く打って、溶液を均一に混合した。
7)Zymolyase 7.5μLを取って管に加えて、30℃の温度で30分育てた。
8)室温下、750×gで10分遠心し、菌体を収集して、上清を捨てた。
9)1Mソルビトール液10mLでプロトプラストを洗った後、沈殿を分散するように管壁を軽く打って、室温下、750×gで10分遠心し、菌体を収集して、上清を捨てた。
10)10mLのCaSで菌体を洗った後、室温下、750×gで10分遠心し、菌体を収集して、上清を捨てた。
11)沈殿を0.6mLのCaSに懸濁して、このプロトプラストは必ず30分以内に使わなければならない。
1)それぞれ100μLのPichia Pastorisプロトプラストを取って、A、B、C三つの15mL無菌遠心管に添加した。
2)A管にDNAを加えずに陰性対照とし、B管に線状化した本来のプラスミドpHIL−S1 30μLを加えて、C管に線状化した組換えプラスミドpSA 30μLを加えて、室温で10分育て、この間に新鮮なPEG/CaT 3mLを調製して備える。
3)各管に調製したばかりのPEG/CaTを1mLそれぞれ添加して、軽く振動し均一に混ぜて,室温で10分育てた。
4)室温下、750×gで10分遠心し、上清を捨てて、乾燥まで置いた。
5)沈殿を150μLのSOSに懸濁して、室温で20分育てた。
6)各管に1Mソルビトール液を10mLそれぞれ添加して、プレートの塗装を準備した。
7)RD固体培地をプレートごと200μL塗布して、28〜30℃で反転置いて培養し、4〜6日後、形質転換体が出現した。
1)無菌楊枝でHis+形質転換体を取って、プレートMMとMDに一対一に菌を点在させながら、GS115/His+MutsAlbumin分とGS115/His+Mut+β−galとも点在させて、対照とした。
2)28〜30℃で反転置いて二日培養した。
3)二日後、プレートMMとMDを対照して、いずれのプレートにも良く成長したのがMut+で、プレートMDに良く成長したが、プレートMMに少し成長した、或いは成長しなかったのがMutsである。
1)His+Mut+形質転換体の一つの単一クローンを取って、25mLのBMGに接種して、250mLの三角フラスコで、28〜30℃下、250〜300rpmでOD600=2〜6(約16〜18時間)まで振動しながら培養した。
2)1500〜3000×gで5分遠心して、細胞を収集して、上清を捨てた後、細胞をBMMにOD600=1.0(約100〜200mL BMMを要する)まで懸濁して、1Lの三角フラスコで、28〜30℃下、250〜300rpmで振動し、引き続き培養した。
3)24時間毎に100%メタノールを添加し、最終の濃度を0.5%とし、誘導性発現を維持した。
4)誘導性発現を96時間続けた。培養液を2〜3分遠心して、上清を取って−80℃で保存して、発現生成物の純化に用いる。
96時間で誘導培養した上清中に総タンパク質量は0.23mg/mLであった。標的タンパクの分子量はBioEditソフトウェア(http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html)で予測した理論値76.95kDaと一致した。
誘導発現の発酵液が70%の飽和(NH4)2SO4で沈殿して、沈殿から粗酵素サンプルを得た。粗酵素サンプルは同じ体積のPBSで溶解し、遠心した後、上清を取って疎水クロマトグラフPhenyl sepharoseカラムに通導し、連続的な勾配の溶出液により溶出し、標的ピークを収集した。透析脱塩し、PBS溶液で平衡化した後、濃縮した。濃縮した酵素液が金属キレート親和クロマトグラフChelating Sepharoseカラムに通導し、pH7.5〜6.0の非連続的な勾配の溶出液により溶出し、標的ピークを収集した。具体的には次の通りである。
40%の飽和度になるまで組換え発現発酵液に(NH4)2SO4粉末を加え、4℃下、10000gで20分間遠心し、更に上清に(NH4)2SO4粉末を添加し70%の飽和度になされ、4℃下、10000gで20分間遠心して、粗酵素サンプルを得た。
組換えADTZの活性の鑑定は実施例2の方法Iに従って行った。反応系:(1)活性化酵素群:1μLのAFB1溶液(AFB1メタノール溶液:0.5μg/μL、窒素ガスで揮発した)+組換え発現ADTZ酵素液(タンパク質の含有量:0.1mg/mL)300μL+0.5μL MgSO4+10μL PEG200;(2)不活性化酵素群:1μLのAFB1溶液(AFB1メタノール溶液:0.5μg/μL、窒素ガスで揮発した)+不活性化した組換え発現ADTZ酵素液(タンパク質の含有量:0.1mg/mL、予め100℃で5分間水浴した)300μL+0.5μL MgSO4+10μL PEG200;(3)緩衝液対照群:1μLのAFB1溶液(AFB1メタノール溶液:0.5μg/μL、窒素ガスで揮発した)+PBS緩衝液(0.1M,pH:6.6)300μL+0.5μL MgSO4+10μL PEG200;反応系を均一に混合して、30℃で1時間水浴した後、管内のAFB1総量が2μgになるまで、1時間毎にAFB1を0.5μLそれぞれ添加した。その後、引き続き6時間反応させた。反応が済んだ後、実施例2の方法Iに従って点板展開し検査した。
組換えADTZの活性の鑑定は実施例2の方法IIに従って行った。天然ADTZの代わりに組換え発現ADTZを用いた以外、他の群が同様な設計と操作で、試験を受けたサンプルを調製した。その結果、活性組換えADTZで処理した群の細菌復帰突然変異コロニーの数は陰性対照群(DMSO対照群)と近似していた(いずれのMR値も2未満)。緩衝液処理対照群と不活性化組換えADTZ処理群は、細菌復帰突然変異コロニーの数が陰性対照群(いずれのMR値も2以上)より著しく高いが、陽性対照群(アフラトキシンB1対照)と著しい差がなかった。組換えADTZはAFB1に引き起された突然変異を抑制する生物活性作用を有することが分かった。結果を下表に示す。
Claims (8)
- アフラトキシンを転化する活性を有する解毒酵素であって、等電点が5.3〜6.8、分子量が73〜77キロダルトンであり、配列表に示すようなアミノ酸配列を有することを特徴とする解毒酵素。
- アフラトキシンを転化する活性を有する請求項1に記載の解毒酵素をコーディングすることを特徴とする遺伝子。
- 配列表に示すようなヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項2に記載の遺伝子。
- 請求項3に記載の遺伝子を含むことを特徴とする組換え発現ベクター。
- 請求項4に記載の組換え発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換することにより得られることを特徴とする形質転換体。
- 請求項5に記載の形質転換体を培養する工程と、発現されたアフラトキシンを転化する活性を有する解毒酵素を回収する工程と、を含む請求項1に記載の解毒酵素の調製方法。
- 飼料及び食品中のアフラトキシンの脱毒品の製造に請求項1に記載のアフラトキシンを転化する活性を有する解毒酵素を用いることを特徴とする使用方法。
- アフラトキシンによる癌を予防及び治療する薬物の製造に請求項1に記載のアフラトキシンを転化する活性を有する解毒酵素を用いることを特徴とする使用方法。
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