MX2007001935A - Detoxifizima con actividad para transformar la aflatoxina y el gen que codifica la misma. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona con una detoxifizima con actividad para transformar la aflatoxina y el gen que codifica la misma. Primeramente, los inventores aislaron y purificaron una nueva proteina, llamada aflatoxina-detoxifizima (ADTZ), la cual tiene la actividad para transformar la aflatoxina. Los cebadores especifican el gen ADTZ se obtienen a traves de la purificacion y secuenciacion. El gen que codifica el ADTZ se clona del total del ARN del Armillariella tabescens. La proteina recombinante se expresa y purifica a traves de varios sistemas de expresion usando metodos de ingenieria genetica. La mencionada detoxifizima con actividad para transformar la AFB1, reduciendo los efectos mutagenicos de la AFB1. Tiene un gran potencial para la manufactura de alimento o comida, y en el desarrollo de medicamentos anta-tumores.

Description

DETOXIFIZIMA CON ACTIVIDAD PARA TRANSFORMAR LA AFLATOXINA Y EL GEN QUE CODIFICA LA MISMA Campo Técnico La presente invención se relaciona con una detoxifizima con actividad para transformar la aflatoxina y el gen que codifica la misma.

Antecedentes Las aflatoxinas, un grupo de micotoxinas, que incluye Aflatoxina B1 (AFB1), Aflatoxina M1 (AFM1), Aflatoxina G1 (G1 ), etc., son producidas por varias especies de aspergilos. Las aflatoxinas son tóxicas y carcinogénico para animales y humanos. Las aflatoxinas se presentan ampliamente en granos, alimento y comida, y los efectos dañinos en los humanos son: (1) envenenamiento directo por consumo de aflatoxina sin tratar en alimentos contaminados; (2) envenenamiento indirecto por consumo de aves, leche, etc. de aflatoxinas no tratadas en el alimento de los animales: (3) desechos y eliminación de cultivos o nueces contaminadas con aflatoxinas.

Debido a estos efectos dañinos, la desintoxicación de aflatoxinas ha sido estudiada por años. Algunos métodos de transformación de aflatoxinas ya existe, por ejemplo: (1 ) el método de Armonización: usado para alimento húmedo, sin embargo, debido a la cantidad de amoniaco residual se prohibió en el procesamiento de alimentos por la FDA; la aplicación en alimento para animales es limitada. (2) el método NaOH (para aceite vegetal): debido a la alta inversión en equipo, consumo de petróleo, y el costo, este método ya no se usa. (3) Método de absorción de tierra blanca: ya no se usa debido al alto costo laboral, contaminación, etc. (4) Método de extracción (para polvo de cacahuate, semillas de algodón, etc.): no se usa mucho debido al alto costo asociado con la extracción y recuperación del solvente. (5) Método de calor (286°C): el costo de calentamiento y pérdida de sabor y nutrientes lo hacen poco práctico. (6) Método biológico: se usan bacterias o bacterias inmovilizadas para disolver las aflatoxinas. Las bacterias pueden destruir los nutrientes de la comida, y los productos y sus toxicidades no son bien entendidas. De esta manera, la aplicación es limitada a solo algunos tipos de alimento y aceite de cacahuate. (7) Método ultravioleta: se usa una fuerte oxidación ultravioleta para destruir las aflatoxinas, no es consistente y consume mucha energía. (8) Método de ultra- filtración: no es práctico debido al alto costo del equipo y los requerimientos técnicos rigurosos. (9) Método de enzimas: clon de hígado de citocromo oxidasa P450 en E.coli fue usado para transformar las aflatoxinas (Brown DW, etc. Proc. Nati. Acad. Se. USA. 1996).

En resumen, los métodos físicos y químicos para transformar las aflatoxinas muchas veces requieren condiciones duras, pero resultan en valores bajos para los granos, alimentos y comidas tratados. Estos métodos a menudo no son eficientes y económicos, por lo que son difíciles de aplicar a gran escala. El método de la enzima P450 no promueve el metabolismo de las aflatoxinas, pero puede conducir a una alta toxicidad de AFB1 en humanos. Debido a las especificaciones y alta eficacia de las enzimas, la investigación se ha enfocada en las enzimas que pueden transformar de forma directa las aflatoxinas.

Resumen de la invención - La presente invención se dirige a una detoxifizima que pueda transformar las aflatoxinas y el gen codificado de la enzima.

Esta enzima con AFBi con actividad transformadora puede ser preparada de la purificación de enzimas ordinarias producidas por células selectas. La proteína transformante AFB, se puede producir por medio de técnicas de ADN recombinante. Esta nueva proteína activa se llama Aflatoxina-detoxifizima (ADTZ).

Los cebadores específicos al gen ADTZ se pueden obtener de la purificación y secuenciación. El gen codificado de ADTZ puede ser clonado del ARN de Armillaríella tabescens. El gen es nuevo que no ha sido reportando anteriormente. La proteina recombinante se puede expresar y purificar de diferentes sistemas de expresión, el sistema expresión Pichia pastoris, por ejemplo, usa métodos de ingeniería genética. El hongo, Armillariella tabescens, viene de la Colección del Centro de Cultivo Microbiológica General (CGMCC por sus siglas en inglés).

La purificación de ADTZ: rompe primeramente la célula del hongo, luego se obtiene la proteína cruda por medio del método de precipitación (NH4)2SO4. La secuencia de aminoácidos péptidos ADTZ-N terminal se puede obtener de un análisis de espectrometría de masa del punto del objetivo.

La purificación de ADTZ: al principio precipitamos las proteínas por medio del método de precipitado de amonio-sulfato. Después, recibimos la diana objetivo del extremo corto del péptido del orden de los aminoácidos.

Esta invención se relaciona con la extracción total de ARN del Armillariella tabescens. Por medio de PCR y SMART RACE los cebadores derivados de la secuencia de de aminoácidos péptidos ADTZ-N terminal, se puede obtener el gen codificado ADTZ, cuya longitud es de aproximadamente 2.3 kb. La secuencia contiene un completo marco abierto de lectura 3' y 5' de regiones no-traducidas. E¡ ADTZ codifica ADNc conteniendo 2088 pares base. El ADTZ el péptido que contiene 695 aminoácidos, peso molecular: 73-77kDa (SDS-PAGE), pl: 5.3-6.8 (isoeléctrica enfocada a electroforesis). Los aminoácidos y las secuencias de ADN son representadas en la Lista de Secuencias (SEQ ID No. 1 y SEQ ID No. 2). La proteína reivindicada se debe entender que incluye la producción molecular por eliminación, sustitución, modificación, adición, etc.

Esta invención proporciona el portador de expresión recombinante, el cual comprende dicho gen, y el transformante obtenido por una célula hospedadora transformada con el mencionado portador de expresión recombinante. La invención, además, produce un método de preparación de la mencionada detoxifizíma, que comprende: el cultivo de dicho transformante y la recuperación de la expresada detoxifízima.

Esta invención se relaciona con un par de cebadores para amplificar el gen codificado de ADTZ péptido maduro del ADNc de Armillariella tabescenes. El ADN puede ser clonado a vectores de expresión tipo de integración eucariótica, tales como el pHIL-S1. La expresión plásmida pHIL-S1-ADTZ puede ser asi construido de la transformación de la expresión de vector recombinante en Pichia pastoris GS115. Esta expresión de vector recombinante usa AOX como promotor. Los experimentos en el tiempo de cultivación e inducción, llevan más del 25% de expresión ADTZ en el total de la proteína en estado soluble.

La invención se relaciona a los sistemas de expresión eucariótíca, incluyendo vectores endocíticos (tales como PA0815, PPIC3K, PPICZ, PHWO10, PGAPZ), o vectores de excreción (tales como PPIC9K, PPICZa, PGAPZa, u otros vectores comerciales). Las manchas de expresiones eucariótícas, Pichia pastoris KM71 , MC100-3, SMD1168, SMD1165, SMD1163 se pueden usar como células hospedadoras.

La invención se relaciona con sistemas de expresión procarióticas. Los diferentes vectores se pueden usar, tales como pET, pUCH33, o vectores comerciales similares. Para las manchas de expresiones procarióticas se puede usar como células hospedadoras: E.coli BL21 , E.co// JM109.

La replicación de los vectores de expresión se pueden lograr siguiendo el manual de Sambrook (Sambroo, et al. 2002, Clonación molecular, Cold Spring Laboratory Press. USA). La preparación y transformación de E.coli DH5a se puede lograr usando el protocolo de cloruro de calcio. El cultivo celular puede prepararse usando ampicilina (100 µg/ml) en un medio LB, y el plásmido extraído usando un método alcalino.

Esta ¡nvención se relaciona con las condiciones óptimas para purificar el ADTZ recombinante. La expresión del cultivo se puede precipitar, primeramente, con (NH )2S0 . La enzima cruda resultante puede además purificarse por cromatografía de interacción hidrófoba y cromatografía de afinidad metal-quelato para dar ADTZ recombinante, cuya pureza es superior al 95%.

La invención proporciona el uso de la mencionada detoxifizima con actividad transformante de la aflatoxina para la manufactura de alimento y comida. El ADTZ puede ser usado como aditivo de desintoxicación para alimento, y el ADTZ inmovilizado se puede usar en la desintoxicación del aceite de cacahuate. La invención proporciona el uso de la mencionada detoxifizima con actividad transformante de la aflatoxina para la preparación de un medicamento para prevenir o tratar cáncer o tumores. El ADTZ se puede usar en la prevención y el tratamiento de tumores inducidos por aflatoxinas.

La invención se relaciona con los métodos de separación y secuenciación del gen ADTZ en la primera vez. El gen que codifica el ADTX puede ser clonado por Armillariella tabescenes a vector de expresión para formar el transformante recombinante. La proteína recombínante ADTZ se puede expresar usando este transformante. El ADTZ recombinante tiene actividad similar al transformar AFBi como el ADTZ natural del análisis de actividad. El ADTZ recombinante reduce significativamente los efectos mutagénicos del AFB, . Esto tiene un gran potencial en las industrias alimentarias y farmacéuticas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Fig. 1 muestra el PAGE del ADTZ purificado. M: peso estándar de proteína molecular; 1 y 2: BSA , 3: enzima cruda de la precipitación de sulfato de amonio. 5 4 ADTZ purificado.

La Fig. 2 muestra el TLC del ADTZ purificado en la transformación de AFBL 1 : estándar analítico AFBi; 2 y 3: solución buffer PBS, 4: AFBi tratado con ADTZ desactivado, 5: AFB! tratado con ADTZ purificado, 6: estándar analítico AFBi. IO La Fig. 3 muestra la electroforesis del ARN total de Armillariella tabescens.

La Fig. 4 muestra la electroforesis del producto RT-PCR. M: marcador de ADN. E1 : producto RT-PCR. I 5 La Fig. 5 muestra la incisión de la enzima del vector recombinante pTE1. M: marcador de ADN. 1 : pTE1/Hindlll + EcoRI, 2: pTE1/EcoRI, 3: pTE1/Hindlll.

La Fig. 6 muestra la electroforesis del producto 3'RACE. M: marcador de ADN. 0 E2: producto 3'RACE.

La Fig. 7 muestra la incisión de la enzima del vector recombinante pTE2. M: marcador de ADN. 1 : pTE2/Hindlll + EcoRI, 2: pTE2/EcoRI, 3: pTE2/Hindlll. 5 La Fig. 8 muestra la electroforesis del producto 5'RACE. M: marcador de ADN. E3: producto 5'RACE.

La Fig. 9 muestra la incisión de la enzima del vector recombínante pTE3. M: marcador de ADN. 1 : pTE3/Hindlll + EcoRI, 2: pTE3/EcoRI, 3: pTE3/Hindlll. 0 La Fig. 10 muestra la electroforesis de extremo a extremo del producto PCR. marcador de ADN. ADTZ': producto PCR.

La Fig. 11 muestra la incisión de la enzima del plásmido recombinante pSA. M: marcador de ADN. 1 : pSA/HindIII + EcoRI, 2: pSA/EcoRI, 3: pSA/HindIII.

La Fig. 12 muestra la expresión de los productos SDS-PAGE. 1. cultivo celular de control negativo, 2: peso estándar de proteína molecular, 3: BSA, 4: cultivo celular recombinante a las 24 hrs., 5: cultivo celular recombinante a las 48 hrs., 6: cultivo celular recombinante a las 72 hrs., 7: cultivo celular recombinante a las 96 hrs.

La Fig. 13 muestra el TLC del ADTZ recombinante purificado en transformación de AFBi. 1 : estándar analítico de AFBL 2: AFBi tratado con ADTZ recombinante purificado, 3: AFBi tratado con ADTZ recombínante desactivado, 4: solución buffer.

La Fig. 14 es un diagrama esquemático de la construcción del ADTZ recombinante y la recombinación homogénea en Pichia pastoris.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION Ejemplo 1 Preparación y purificación del ADTZ 5 1.1 Cultivo celular 1.1.1 Cepa : Armillariella tabescenes. 1.1.2. Las células arriba mencionadas fueron incubadas en un medio (extracto líquido de papa 1 I., glucosa 20 g., KH2PO4 3.0 g., MgSO4-7H2O 1.5 g., i o y trazas de vitamina, pH6.6) por 25 días. Primero, por medio de tres clases de incubación: 6 días, 4 días y 4 días, luego la cuarta clase: 11 días, temperatura de 24-28°C; posteriormente se recolectaron las células. 1.2. Extracción de ADTZ 15 Las células frescas se congelaron en nitrógeno líquido, y se rompieron en pequeños pedazos. Se agregó fosfato buffer (1 :1 W/V), seguido de homogenización en un baño de hielo, sonicación ultrasónica para manchar las células, y centrifugación a 11000-12000 g para remover el precipitado. El precipitado se recolecta de una precipitación saturada fraccional (NH4)2SO4 , y 0 suspendida en fosfato buffer (0.2 mol/L, pH 6.0). Las proteínas se cuantifican usando el método Bradford, se prueba la actividad enzimática usando el kit de prueba AFBj ELISA. De esta manera, la solución de enzima ADTZ se produce. 1.3. Purificación de ADTZ 5 1.3.1. Muestra de la preparación de enzima La muestra fue preparada por medio de los siguientes pasos, tales como la diálisis de desalinización de la solución de enzima cruda en fosfato buffer (40 volúmenes, 0.02 mol/l., pH 6.0), y concentración por diálisis en PEG-20000 y filtración en micro membrana (0.45 µm). Las proteínas se cuantificaron usando el 30 método Bradford. 1.3.2. Purificación de la enzima ADTZ por cromatografía líquida de proteína rápida (FPLC por sus siglas en inglés) Las columnas y eluentes para cromatografía de intercambio de ion y cromatografía de enfoque isoelectro fueron preparadas siguiendo los procedimientos de la literatura (Métodos y principios de cromatografía de intercambio de ion. Pharmacia Co. Edited, Pharmacia Co., 1984, pp.29-31 ; Cromatoenfoque con Polybuffer™ y PBE™, 6th. Experimental. Pharmacia Co. Edited, Pharmacia Co., 1984, pp.11-24). Todas las separaciones cromatográficas se realizaron con sistemas FPLC (Pharmacia Biotech Co., Estados Unidos). Detalles a continuación: 1.3.2.1 Cromatografía de intercambio de anión (1 ) Reactivo -pH 6.0, 0.2 mol/L fosfato buffer. -A: pH 6.0, 0.2 mol/L, fosfato buffer. -B: pH 6.0, 0.2 mol/L, fosfato buffer + 1 N NaCI . (2) Preparación de columnas Se lavó el DEAE-Sephadex (50ml) con 2 volúmenes de fosfato buffer, y se mantuvo a temperatura ambiente por 20 min. La solución buffer se removió usando una micro-bomba, el proceso se repitió 5 veces. El gel espeso se vertió en una columna (20 x 30 cm.) de vidrio y se empaca a una tasa de flujo de 0.6 ml/min.

La columna fue lavada con buffer A para equilibrar hasta que la línea base se estabilizó alrededor del 0. La muestra de enzima se cargó a una pre-columna y luego a la columna DEAE-Sephadex. El eluente gradiente NaCI: 2 horas por el buffer A, 5 horas por el buffer B y A del 0-80%, 2 horas por el buffer B al 100%. taza de flujo: 0.6 ml/min., inspeccionado en UV O.D. 280 nm. Los efluentes se recolectaron usando un recolector de fracción. Luego la concentración dializada PEG-20000, y desalinización, las diferentes fracciones de proteína se cuantificaron usando el método Bradford, se probó su actividad al transformar AFBi . La separación se repitió, solo las fracciones activas se recolectaron. 1.3.2.2. Cromatografía de electroenfoque 5 (1 ) Reactivo -Eluente: Polybuffer™ 74 (Pharmacia Co., Estados Unidos, 250ml/botella). 100 ml diluidos a 1000 ml con agua, almacenados a 4°C. -Solución buffer inicial : pH 7.4, imidazol-HCI buffer (0.025 mol/L). (2) Columna i o -Mono-p™ PBE 94, 5 x 20 cm., columna pre-empacada (Pharmacia Co., U. S.) La solución de enzima activa de una cromatografía de intercambio de anión (6 ml., 3 mg./ml.) se equilibró usando Polybuffer 74 -6.5 ml. La columna Mono-p se equilibró con la solución buffer inicial por 2 horas, luego se cambió a Polybuffer 15 74. La solución de enzima (2 ml.) se cargó a la columna, y se lavó con Polybuffer 74 por 10 horas a 0.2 ml/ min., inspeccionado en UV O.D. 280 nm. Los efluentes se recolectaron usando un recolector, 2 ml/ tubo (10 min./tubo). Las proteínas recolectadas se cuantificaron usando el método Bradford, se probó su actividad al transformar AFBÍ . 20 La columna fue lavada con 0.1 N HCl hasta AU -0, y lavada de nuevo con 1 N NaCI, y equilibrada con la buffer inicial por una noche. El proceso se repitió, y se recolectaron las fracciones activas. 25 1.3.2.3. Prueba de la actividad usando ELISA La AFB, fue tratada con las fracciones de proteina recolectadas, los restos de AFBÍ se miden usando el método ELISA. Las fracciones de proteina se calientan a 100°C por 10 min. para solución de proteína inactiva como control. Las fracciones que pueden disminuir el nivel de AFB, son fracciones activas. Como '30 se detalla a continuación: (1) Preparación de muestra -Mezcla de análisis de enzimas inactivas: AFB, (200 µl, 2.5 ng/ml en metanol) + solución de enzima inactiva (200 µl, 1.2 mg/ml). -Mezcla de (análisis?) de enzimas activas: AFB1 (200 µl, 2.5 ng/ml en metanol) + solución de enzima activa (200 µl, 1.2 mg/ml). -Mezcla de control: AFB1 (200 µl, 2.5 ng/ml en metanol) + solución buffer (200 µl). Preparación de las soluciones de enzimas desactivadas: calentadas a 100°C por 10 min.

Las mezclas de análisis se mezclaron perfectamente y reaccionaron por 30 min. a 30°C. Después de la centrifugación a 3000g por 5 min., el precipitado se removió. Las mezcla de análisis se sometieron a prueba usando kits de prueba ELISA (AgraQuant™ Prueba Total de Aflatoxina 4/40, ROMER, Estados Unidos). El resto de AFB1 se calcula en base a la calibración de la curva. Las diferentes fracciones de las separaciones cromatográficas se analizaron por su actividad para transformar AFB1 t y las fracciones que pueden reducir los niveles de AFBi , son activas. El resultado de los restos de AFBi es: grupo de prueba con enzima activa: 1.230 ± 0.508 ng/ml, grupo de prueba con enzima desactivada: 2.436 ± 0.326 ng/ml, grupo de control: 2.508 ± 0.203 ng/ml.

PAGE de la fracción de enzima activa muestra que una sola banda bajo condiciones no reductivas, como se muestra en la Fig. 1. Peso molecular de la proteína es 73-76 kDa analizado por SDS PAGE. pl de proteina es 5.3 -6.8 analizado por electroforesis de enfoque isoeléctrico.

Ejemplo 2 Medición de la actividad del ADTZ purificado 2.1. Análisis de la actividad de ADTZ transformando AFBi Para medir la actividad del ADTZ purificado, la capa delgada de la cromatografía se usó para analizar los restos de AFB1 después del tratamiento con ADTZ. Los detalles a continuación: 2.1.1. Mezcla de enzima ADTZ La solución AFBt (1 µl, 0.5 µg/µl metanol) (Alexis Biochemical's Inc., Suiza) en un tubo 1.5 ml. se evaporo bajo gas de nitrógeno. La solución de enzima (300 µl, 0.1 mg/ml), MgSO (0.5 µl) y PEG 200 (10 µl) se agregaron al tubo y se mezclaron perfectamente. La mezcla reacciona en un baño de agua por 1 hora a 30°C, y luego se agrega AFBt 0.5 µl por hora hasta que el total de AFB? sea 2 µg. Después de esto, la mezcla reacciona por otras 2 horas. 2.1.2. Control de mezclas. Control 1 : la solución AFBi 1 µl en un tubo centrifugo de 5 ml. se evapora bajo gas de nitrógeno. La solución de enzima desactivada 300 µl, se desactiva a 100°C por 5 min., MgSO4 0.5 µl y PEG 200 10 µl se añaden al tubo y se mezclan perfectamente. Control 2: solución AFBi 1 µl en un tubo centrífugo de 5 ml. se evapora bajo gas de nitrógeno. Solución buffer PBS 300 µl (0.1 M, pH 6.6), MgSO40.5 µl y PEG 200 10 µl se agregan al tubo y se mezclan a la perfección. Las dos mezclas de control se dejan reaccionar de las misma manera que la mezcla de enzima.

La mezcla de enzima y las mezclas de control se extraen con 2 volúmenes CHCI3 dos veces. El extracto de CHCI3 se evapora bajo gas de nitrógeno a 45°C. Las mezclas crudas se disuelven de nuevo en metanol 1ml. para obtener la muestra de enzima y dos muestras de control para TLC. 2.1.3. Medición de TLC Las placas de TLC (10 x 10 cm., ?, Whatman, Estados Unidos) se activaron frescas a 100°C por 2 hrs. Las muestras fueron salpicadas en las placas a 1 cm., y a 1 cm. del borde de izquierda a derecha, 1°: AFB, (10 µl, 25 µg/ml en CHCI3), I 2 2°, 3°: control 2 (10 µl), 4°: control 1(10 µl), 5°: mezcla de enzima (10 µl), 6°: AFBÍ (10 µl, 25 µg/ml en CHCI3). La placa se desarrolló en éter anhídrido, se visualizó con luz UV (? 365 nm), y se fotografió (el resultado se muestra en la Fig. 2). Casi no existe cambio en los estándares de AFB1 (eri la primera y sexta mancha), la mezcla de control de enzima desactivada (4°) y los controles buffer PBS (2° y 3°), pero hay un cambio significativo por la mezcla de ADTZ activo (producto Rf= 0.95). El producto siguiendo el tratamiento de ADTZ es mucho menos polar que el AFBL indicando la actividad transformadora de AFBL del ADTZ purificado. 2.2. La bioactividad del ADTZ en la transformación de AFBi Los análisis de mutación inversa de los microorganismos (análisis Ames) fueron conducidos como se describe a continuación: 2.2.1. Análisis de cepas bacteriales La cepa Histidina Auxotrofa Salmonella Typhimurium TA98 se almacena a -85°C. La identificación del Genotipo y la determinación de la cantidad de mutación inversa espontánea se llevan a cabo antes del análisis para asegurar que la cepa cumpla los requisitos del experimento. 2.2.2. Preparación del hígado Sg (a) Inducción en ratas SD: las ratas SD son puestas en cuarentena por una semana para asegurar que estén sanas. Se administra a las ratas una suspensión de aceite de maíz bifenil policlorinado por vía estomacal (500 mg/Kg.). En el quinto día, luego de 12 horas de ayuno, los animales son decapitados. (b) Preparación de higado S9 : los hígados se recolectaron, pesaron y perfundieron in situ con KCl (0.15 M) estéril helado, se homogenizaron en un homogenizador. Seguido de una centrifugación a 9000 g por 30 min., el sobrante líquido fue recolectado, analizado y almacenado a -85°C. 2.2.3. Preparación de la mezcla Sg La siguientes soluciones: A, B y C se mezclaron con Sg, y se almacenaron a 4°C (para usarse en 4 hrs.) A: (0.2 M, coenzima II, esterilizada por filtración) 0.2 ml. B: (0.2 M, glucosa 6-fosfato, esterilizada por filtración) 0.25 ml C: (0.4 M MgCI2 20 ml + 1.65 M KCl, 20 ml + 0.2 mol/L fosfato buffer, pH 7.4, 500 ml + agua destilada, 313 ml, mezclada y esterilizada por filtración) 8.55 ml. S9: 1.00ml. 10 2.2.4. Preparación del análisis de las mezclas En una muestra de prueba de 30 ml, conc. de ADTZ fue 0.2mg/ml, AFBi 0.2µg/ml, pH=6.0. La mezcla reaccionó a 28°C por 120 min., luego se extrajo con CHCI3 en el mismo volumen tres veces. Los extractos de CHCI3 reunidos se I5 evaporaron bajo presión reducida a 40°C. La extracción cruda se disolvió en 6.75 ml de DMSO (3.75 ml y 3 ml) como mezcla de enzima de prueba. De la misma forma, el ADTZ desactivado (pretratado con CHCI3) se usó para desactivar la mezcla de enzima de control, y la solución buffer fue usada para amortiguar la mezcla de control. Todas las muestras se mantuvieron a -15°C. 20 2.2.5. Análisis de mutación inversa (análisis Ames) Las mezclas de prueba en DMSO, mezcla de S9 y cultivo celular de Salmonella Typhimurium TA98 se añaden a un medio agaroso suave de estrato alto, se mezclan a la perfección, y se vierten en un medio selectivo Vogel mínimo 5 definido a 40°C. Las placas se incuban por 72 hrs. a 37°C, y se calculan las colonias mutantes en cada placa.

Cada muestra fue analizada con un control positivo y negativo, y se repitieron una vez. El resultado de cada muestra se obtuvo del valor de la media 3o de seis grupos de dos pruebas. Los datos se reportaron en el número de colonias mutantes, la tasa de mutación (MR = número de colonias mutantes en la muestra/ número de colonias mutantes en control negativo) y la razón de inhibición (={1 -(número de colonias mutantes en la muestra - número de colonias mutantes en control negativo) / (muestra de control del número de colonias mutantes en AFBi - número de colonias mutantes en control negativo)} x 100%). 2.2.6. Criterio de evaluación de los datos Las muestras de prueba se consideran positivas en Ames cuando: a) los controles de solvente están en rangos normales; b) las muestras de prueba son positivas en tres diferentes conc. (MR > 2). 2.2.7. Resultados El número de colonias mutantes en mezclas de prueba de enzima activa y muestras de control DMSO son muy similares (MR > 2). El número de controles buffer y de mezclas de enzima desactivada son considerablemente más altos que las muestras de control DMSO. De hecho, en números son muy cercanas a los controles positivos (controles AFBi) (MR > 2). Los datos indican la actividad de ADTZ en la inhibición de la mutación causada por AFBi. Los datos se muestran en la siguiente tabla.

Descripción: los análisis de mutación usan hígado de rata Sg y cepa de prueba de Salmonella Typhimurium TA 98. El control positivo de AFß^ 0.8µg /50µl DMSO/ placa. Las mezcla de análisis de enzima usan la misma cantidad de AFB, y DMSO. Las placas se incubaron por 28 hrs., y se calcularon los números de colonias mutantes. Los datos arriba mostrados son de 4 placas + SD.

Ejemplo 3 Secuenciación del péptido ADTZ Muestras: se recolectaron las fracciones activas del ejemplo 1 ó la 5 fracción activa además purificada por PAGE. La secuenciación del péptido ADTZ-N terminal se conduce en un espectrómetro de masa Micromass Q-TOF II. Las secuencias son las siguientes: M1 : EAWEGFTALVDK M2: NKLLQDANGELENLYVR i o La invención se relaciona con otras secuencia de péptidos además de la arriba listada, siempre y cuando se detecten del MALDI-MS-TOF u otros métodos químicos en el péptido ADTZ.

Ejemplo 4 15 Extracción del ARN total de Armillariella tabescenes El cultivo bacterial de Armillariella tabescenes se coloca en una placa de Petri en hielo. Luego, los tejidos se congelan por inmersión en nitrógeno líquido, y se muelen hasta hacer polvo. El polvo (100 mg) se transfiere a un tubo de 1.5 ml de 0 centrifugado y se agrega Trizol (1 ml). La mezcla se agita vigorosamente y se incuba por 5 min. a temperatura ambiente. Se agrega cloroformo (200 µl) a la mezcla, se agita vigorosamente por 2 min., y se coloca en un baño de hielo por 5 min. El homogenato se centrifuga a 12000 g por 15 min. a 2-8°C. El sobrante líquido, que contiene ARN, se transfiere cuidadosamente a otro tubo de 5 centrifugado de 1.5 ml. Se agrega isopropanol (500 µl) enfriado, y la mezcla se coloca en un baño de hielo por 20 min. La mezcla se centrifuga a 12000 g por 10 min. a 2-8°C, posteriormente el sobrante líquido se remueve y los granulos? de ARN se lavan en etanol (1 ml) al 75%. La muestra se centrifuga a 7500 g por 5 min. a 2-8 °C. El etano se remueve y el ARN se seca por 5-10 min. a 30 temperatura ambiente.

El ARN se disuelve por completo en agua esterilizada DEPC (50 ul), y se prueba por medio de análisis de UV y electroforesis (1.1 % gel de agarosa/ EB 100 V, 20 min.) antes de ser almacenado a -80°C. El resultado se muestra en la Fig. 3. De la eléctroforesis, 28s ARNr y 18s ARNs son claramente visibles. La razón fue de alrededor 2:1; esto indica que el total de ARN no se degrada.

Ejemplo 5 Diseño de cebadores de gen ADTZ La invención se relaciona con dos pares de cebadores (P1 , P2 y G1 , G2) diseñados de acuerdo con la secuencia de péptido ADTZ. Los productos de secuencia de genes ADTZ parciales se obtienen del RT-PCR usando el kit QIAGEN OneStep RT-PCR. Los productos RT-PCR son clonados de TA. El plásmido recombinante forma el clon TA identificado por las incisiones de enzima Hindlll y EcoRI seguido por electroforesis (1.5% gel de agarosa). El gen parcial ADTZ ADNc E1 se obtiene de la secuenciación del plásmido recombinante. Los detalles a continuación: Par de cebador 1 Par de cebador 2 P1 : 5'-TGGGARGGNTTYACNGC-3' G1 : 5'-CARGAYGCNAAYGGNGA-3' P1: 5'-TCNCCRTTNGCRTCYTG-3' G2: 5'-GCNGTRAANCCYTCCCA-3' La invención se relaciona con los pares cebadores específicos ADTZ que no limitan a los pares de arriba, pero también cualquier otro designado de la secuencia de péptido ADTZ 5.1. RT-PCR 5.1.1. Molde del ARN total (del Ejemplo 4) se desnaturaliza a 75°C por 5 min., luego se enfria en un baño de hielo. 5.1.2. Preparación de la mezcla maestra (sistema 80µl) 42 µl agua libre de ARNasa 16 µl 5?QIAGEN One-Step RT-PCR Buffer 3.2 µl Mezcla dNTP (10mM) 3.2 al mezcla de enzima QIAGEN Qne-Step RT-PCR 64.4µl Mezclado perfectamente por medio de pipeta hacia arriba y hacia abajo de la mezcla maestra algunas veces. 5.1.3. Los componentes agregados en el orden listado un tubo de centrifugado estéril (unidad: µl) 5.1.4. Ciclos PCR • Transcripción inversa: 50°C, 30 min. • Paso de activación inicial PCR: 50 °C, 15 min. • Cíelos de 3 pasos • 15 ciclos: 94 °C, 40 sec 65 °C 1 min. (-1 °C/ciclo) 72 °C 1 min. • 25 ciclos: 94 °C 40 sec 50 °C 1 min. 72 °C 1 min. • Extensión final: 70 °C 10 min. 5.1.5. Luego de los ciclos PCR, la muestra 5 µl se toma por electroforesis. 5.2. Extracción del producto RT-PCR 5.2.1. Se preparan solución buffer electroforética TAE y gel de agarosa al 0.8%. 5.2.2. Producto 50µl RT-PCR y 10x buffer cargado? se mezclaron y se cargaron. 5.2.3. Electroforesis a 100V por 20 min. 5.2.4. Se observan las bandas con luz UV después de la electroforesis. Las bandas interesantes se extraen del gel y se transfieren a un tubo estéril de centrifugado de 1.5 ml. 5.2.5. Se agrega 800 µl Buffer NT1 5.2.6. La suspensión NucleoTrap se remueve vigorosamente hasta tener una mezcla homogénea. Se agregan 10 µl al tubo de centrifugado. 5.2.7. El tubo de centrifugado se sumerge en un baño de agua a 50°C por 6 min., se agita cada 2 min. 5.2.8. Se centrífuga a 10000 g por 30 seg. a temperatura ambiente, el sobrante liquido se remueve. 5.2.9. Se agrega 500µl Buffer NT2 y la mezcla se agita. Se centrifuga a 10000 g por 30 seg. a temperatura ambiente, el sobrante líquido se remueve. El proceso se repite una vez. 5.2.10. Se agrega 500µl Buffer NT3 la mezcla se agita. Se centrifuga a 10000 g por 30 seg. a temperatura ambiente, el sobrante líquido se remueve. El proceso se repite una vez. 5.2.11. Se centrifuga a 10000 g por 30 seg. a temperatura ambiente, el sobrante líquido se remueve. El residuo se seca con aire por 10-25 min. 5.2.12. El precipitado se sumerge en 30 µl ITE buffer (pH 8.0). A este fragmento se le llama E1. La electroforesis de este producto RT-PCR se muestra en la Fig. 4. Una nueva banda nombrada E1 se observa de la reacción de primer par de cebador P1 y P2 (- 800 bp) 5.3. Clones TA y secuenciación ?<> 5.3.1. Ligar por ADN ligasa Los siguientes componentes se agregaron a un tubo de centrifugado de 1.5 ml. 1 µl portador pUCm-T 3 µl fragmento E1 (producto RT-PCR) 1 µl 10?buffer 1 µl T4 ADN ligasa 4 µl agua esterilizada, volumen total 10 µl Se mezclan a la perfección por medio de pipeta hacia arriba y abajo unas cuantas veces, se incuban en un baño de agua a 22°C por al menos 4 hrs. 5.3.2. Preparación de células competentes E.coli DH5a usando el método CaCI2 El monoclon DH5a se incuba en 2 ml de medio LB, se agita a 37°C por una noche. Se transfieren 50 µl de la colonia a 5 ml de medio LB. se agita a 37°C por 1.5- 2 hrs. El cultivo luego se enfría a 0°C manteniendo el tubo en hielo por 30 min. El cultivo se transfiere a un tubo estéril de centrifugado, y se centrifuga a 5000 rpm por 5 min. El medio se decanta de los granulos de célula. Los granulos se sumergen de nuevo en 1.5 ml de solución helada de CaCI2 , y el tubo se mantuvo en hielo por 10 min. Las células se recuperan por medio de centrifugación a 5000 rpm por 5 min., y el medio se decanta. Los granulos se sumergen de nuevo en 200 µl de solución helada de CaCI2 y se mantiene a 4°C. 5.3.3. Transformación de células competentes de DH5a Se transfieren 200 µl de la suspensión de células competentes a un tubo de centrifugado conteniendo un ligador de ADN (10 µl). El contenido se mezcla agitando suavemente y se almacenan en hielo por 30 min. Después de 90 seg. en un baño de agua a 42°C, el contenido se almacena en hielo por 3-5 min. Se agrega medio LB (800 µl) y la mezcla se incuba a 37°C por 40-60 min.

Las células competentes transformadas se esparcen en un medio agaroso que contiene Amp y IPTG/X-gal (200 µl /90-mm placa) y se ¡ncuba a 37°C por 12-16 hrs. 5.3.4. Extracción alcalina del plásmido de ADN Las células competentes transformadas se transfieren a 2 ml de medio LB que contiene ampicilina. El cultivo se agita vigorosamente a 37°C por una noche. El cultivo (1.5 ml) se transfiere a un tubo de micro-centrifugado, y se centrifuga a 12000 rpm por 2 min.; el sobrante líquido se remueve. Los granulos se lavan con 400 µl de solución STE. El contenido se mezcla removiendo vigorosamente, y se centrifuga a 12000 rpm. El sobrante líquido se remueve. Los granulos se agregan a una solución fría I, se agitan vigorosamente, luego se agrega un solución II recién preparada, se mezcla bien y se almacena en hielo por 3 min. Se agrega la solución II, se mezcla bien, y se almacena en hielo por 5 mín.

La mezcla se centrifuga a 12000 rpm por 5 min., y el sobrante líquido se transfiere a otro tubo. El mismo volumen de fenol cloroformo se agrega al sobrante líquido. La mezcla se centrifuga de nuevo; y el sobrante líquido se transfiere a un tercer tubo. Se agrega etanol anhídrido (2 volúmenes) enfriado al tercer tubo. Después de mezclar el tubo se mantiene a temperatura ambiente por 40-60 min. El contenido se centrifuga a 12000 rpm por 10 min.; el sobrante líquido se remueve. Los granulos se lavan con etanol (200 µl) al 70%. La mezcla se centrifuga de nuevo a 12000 rpm por 1 min.; el sobrante líquido se remueve. Los granulos se secan al aire por 5-10 min., luego se sumergen en ADNasa libre de buffer TE ARNasa, y se incuban a 30°C por 1 hr, y se almacenan a -20°C. 5.3.5. Identificación del plásmido recombinante pTE1 por incisiones enzimáticas. Incisiones enzimáticas Hindlll y EcoRI de clones TA (unidad: µl) Después de la reacción de incisión enzimática a 37°C por 4 hrs., la mezclas se analizaron por electroforesis agarosa al 1.5%. Los resultados de la incisión enzimática de vector recombinante pTE1 se muestran en la Fig. 5. Dos incisiones enzimáticas Hind lll + EcoRI (muestra 1) y la incisión enzimática sencilla Hindlll (muestra 3) muestran la misma banda a 400 bp con más intensidad en la muestra 1. La incisión sencilla EcoRI (muestra 2) muestra una 5 segmentación lineal. Estos resultados indican que hay un sitio? de segmentación Hindlll en el fragmento E1. 5.3.6. Secuenciación del plásmido de ADN recombinante El plásmido de ADN recombinante se purifica por precipitación con PEG (Sambrook, et al. 1989, Clonación molecular, Cold Spring Harbor Laboratory i o Press, Estados Unidos). La secuencia de ADN del fragmento E1 se detepnina en un secuenciador de ADN ABI377 usando cebadores de secuenciación T7 y SP6. La secuencia determinada contiene P1 , P2 y segmentación Hindlll (aagctt).

Ejemplo 6 15 Secuencia total de ADNc del gen ADTZ Los cebadores se designaron del fragmento E1 del gen ADTZ como se determina en el ejemplo 5: 0 S1 : 5'-TAGGCGAAGTGTCGTCGTCAATGGAA-3' S3 : 5'-GAAGTTATCGGCTTTCCAGTCAGAGGGT-3' Usando S1 y S3 como cebadores, el 3'RACE y 5'RACE se condujeron usando el kit SMART™ RACE de amplificación de ADNc (COLONTECH 5 Laboratories, Inc. Cat. No. K181 1-2). Los productos RACE se recuperaron del rascado del gel, y el TA clonado usando el método de rutina. Los fragmentos de plásmido de ADN recombinante se secuenciaron siguiendo la incisión de enzima Hindlll y EcoRI y se analizaron por medio de electroforesis agarosa al 1.5%: de esta manera se obtuvieron los fragmentos E2 y E3. Los vectores de secuencia 0 se removieron usando el software Vecscreen. E1 , E2 y E3 se ensamblaron usando el software DNAMAN software (Lynnon BioSoft). La secuencia completa de ADNc del gen ADTZ se obtiene del análisis del marco de lectura abierta usando ORF Finder (NCBI). Los detalles a continuación: Cebador S1 : 5'-TAGGCGAAGTGTCGTCGTCAATGGAA-3' 5 Cebador S3: 5'-GAAGTTATCGGCTTTCCAGTCAGAGGGT-3' 6.1. 3'RACE 6.1.1. Preparación de 3'RACE-Ready ADNc 6.1.1.1. Molde de ARN total (del Ejemplo 4) se desnaturalizó a 75°C por 5 i o min., posteriormente se enfría en un baño de hielo. 6.1.1.2. Los siguientes reactivos se agregaron a un tubo de centrifugado de 0.5 ml: 1 µl de molde de ARN total desnaturalizado, 1 µl 3'-CDS cebador A, y 3 µl de agua esterilizada libre de ARNasa para hace un volumen total de 5 µl. 6.1.1.3. Se mezcla a la perfección por medio de pipeta hacia arriba y 15 abajo unas veces, seguido del paso de centrifugación corta. 6.1.1.4. Incubación a 70°C por 2 min. 6.1.1.5. La muestra se almacena en hielo por 2 min. Luego de una centrifugación corta, se agregan los siguientes reactivos. 2 µl 5?First-Strand Buffer 0 1 µl DTT (20mM) 1 µl Mezcla dNTP (10mM) 1 µl Transcriptasa inversa PowerScript 10 µl volumen total 6.1.1.6. Se mezclan a la perfección por medio de pipeta hacia arriba y 5 abajo unas veces, seguido del paso de centrifugación corta. 6.1.1.7. Incubación a 42°C por 1.5 hrs. 6.1.1.8. Dilución con 100 µl Tricine-EDTA. 6.1.1.9. Incubación a 72°C por 7 min. 6.1.1.10. Almacenamiento a -20°C 30 6.1.2. 3' RACE PCR 6.1.2.1. Preparación de la mezcla maestra (sistema 100µl) 69 µl Agua grado PCR 10 µl 10* Buffer Advantage 2 PCR 2 µl Mezcla dNTP (10mM) 2 ul 50* Mezcla polimerasa Advantaqe 2 83 µl Los ingredientes se mezclan a la perfección por medio de pipeta hacia arriba y abajo unas veces, seguido del paso de centrifugación corta. 6.1.2.2. Los componentes se agregan a un tubo estéril de centrifugado de 0.5 ml en orden listado (unidad: µl) 6.1.2.3. Ciclos PCR •5 ciclos: 94°C 5 sec 72 °C 3 min. •5 ciclos: 94°C 5 sec 70 °C 10 sec 72 °C 3 min. •35 ciclos: 94°C 5 sec 68 °C 10 sec 72 °C 3 min. 6.1.2.4. Después de los ciclos PCR, se usan 5 µl de la muestra para electroforesis, el resultado se muestra en la Fig. 6. Se obtiene una sola banda del 3'RACE (-800 bp), y se le nombra E2. 6.1.3. El clon TA del producto RACE, la preparación de células competentes de E.coli DH5a (método CaCI2) y el plásmido de ADN de la extracción alcalina se conduce como se describe en el Ejemplo 5. 6.1.4. Identificación del plásmído recombinante pTE2 por incisión enzimátíca. Incisiones enzimáticas Hindlll y EcoRI de los clones TA (unidad: µl) Después de las reacciones enzimáticas a 37°C por 4 hrs., las mezclas se I O analizaron por electroforesis agarosa al 1.5%, lo resultados se muestran en la Fig. 7. Dos incisiones enzimáticas Hindlll + EcoRI (muestra 1) muestran dos bandas a 600 bp y 300-400 bp, mientras la incisión enzimática sencilla Hindlll (muestra 3) muestra solo una banda a 300-400 bp, la EcoRI (muestra 2) muestra una segmentación lineal. Estos resultados indican que existe segmentación en el 15 sitio Hindlll en el fragmento E2, que está cerca a un extremo del fragmento. 6.1.5. Secuenciación El plásmido de ADN recombinante se purifica por precipitación con PEG (Sambrook, et al. 1989, Clonación molecular, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Estados Unidos). La secuencia de ADN del fragmento E2 se determina en 0 un secuenciador de ADN ABI377 usando cebadores de secuenciación T7 y SP6. La secuencia E2 contiene una segmentación en el sitio Hindlll (aagctt) cerca de 3'. 6.2. 5' RACE 5 6.2.1. Preparación del ADNX 5'RACE-Ready 6.2.1 .1. Molde de ARN total se desnaturalizó a 75°C por 5 min., posteriormente se enfria en un baño de hielo. 6.2.1.2. Los siguientes reactivos se agregaron a un tubo de centrifugado de 0.5 ml: 1 ul de molde de ARN total desnaturalizado. 1 ul 5'-CDS cebador A, 1 µl de oligonucleotoide SMART II A y 2 µl de agua esterilizada libre de ARNasa para hace un volumen total de 5 µl. 6.2.1.3. Se mezcla a la perfección por medio de pipeta hacía arriba y abajo unas veces, seguido del paso de centrifugación corta. 6.2.1.4. Incubación a 70°C por 2 min. 6.2.1.5. La muestra se almacena en hielo por 2 min. Luego de una centrifugación corta, se agregan los siguientes reactivos. 2 µl 5?First-Strand Buffer 1 µl DTT (20mM) 1 µl Mezcla dNTP (10mM) 1 ul Transcriptasa inverse PowerScript 10 µl volumen total 6.2.1.6. Los ingredientes se mezclan a la perfección por medio de pipeta hacía arriba y abajo unas veces, seguido del paso de centrifugación corta. 6.2.1 .7. Incubación a 42°C por 1.5 hrs. 6.2.1.8. Dilución con 100 µl Tricine-EDTA 6.2.1.9. Incubación a 72°C por 7 min. 6.2.1.10. Almacenamiento a -20°C. 6.2.2. 5' RACE PCR 6.2.2.1. Preparación de la mezcla maestro (sistema 110 µl) 75.9 µl Agua de grado PCR- 11 µl 10 x Buffer Advantage 2 PCR 2.2 µl Mezcla dNTP (lOmM) 2.2 ul 5Q? Mezcla polimerasa Advantaqe 2 91.3 µl Los ingredientes se mezclan a la perfección por medio de pipeta hacia arriba y abajo unas veces, seguido del paso de centrifugación corta. 6.2.2.2. Los componentes en el orden arriba listado se vierten en un tubo estéril de centrifugado de 0.5 ml (unidad: µl) Componente ¡ 1 6.2.2.3. Ciclos PCR: 94°C 1 min. • 5 ciclos: 94°C 30 sec 72°C 4 min. •5 ciclos: 94°C 30 sec 70°C 4 min. •25 ciclos: 94°C 30 sec 68°C 4 min. 72°C 10 min. 6.2.2.4. Después de los ciclos PCR, la muestra de 5 µl se usa para electroforesis. Los resultados se muestran en la Fig. 8. Se obtiene una sola banda de 5'RACE (-1400-1800 bp), y se le nombra E3. 6.2.3. El clon TA del producto 5' RACE, la preparación de células competentes E.coli DH5a (método CaCI2) y la extracción alcalina de plásmido de ADN se conducen como se describe en el Ejemplo 5. 6.2.4. Identificación del plásmido recombinante pTE3 por incisión enzimática. Incisiones enzimáticas Hindlll y EcoRI de los clones TA (unidad: µl) Después de las reacciones enzimáticas a 37°C por 4 hrs., se analizaron las mezclas por electroforesis agarosa al 1.5%, los resultados se muestran en la Fig. 9. Dos incisiones enzimáticas Hindlll + EcoRI (muestra 1) muestran dos bandas a 1400 bp y 300-400 bp, mientras la incisión enzimática sencilla Hindlll (muestra 3) muestra solo una banda a 1400-1000 bp. Estos resultados indican que existe segmentación en el sitio Hindlll en el fragmento E3. 6.2.5. Secuenciación El plásmido de ADN recombinante se purifica por precipitación con PEG (Sambrook, et al. 1989, Clonación molecular, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Estados Unidos). La secuencia de ADN del fragmento E3 se determina en un secuenciador de ADN ABI377 usando cebadores de secuenciación T7 y SP6. La secuencia E3 contiene una segmentación en el sitio Hindlll, una cerca de 3' y la otra cerca de 5'. 6.3. Ensamblaje de la secuencia de fragmentos de ADNc de ADTZ Las secuencias de vectores se removieron usando software Vecscreen. E1 , E2 y E3 se ensamblaron usando software DNAMAN. La secuencia completa de ADNc del gen ADTZ se obtiene del análisis del marco de lectura abierto usando ORF Finder (NCBI), el cual contiene el marco de lectura abierto completo con la cola 3' poli(A), y las regiones sin traducción 5' y 3'. Los resultados se muestran en la Lista de Secuencia como SEQ ID No.2.

Se usaron BLAST y BLASTX (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) para buscar la similaridad de secuencia en la secuencia de ADNc de ADTZ y se calculó la secuencia de proteína. La investigación identifica el ADNc de ADTZ como una secuencia nueva. La secuencia de péptido maduro ADTZ calculado del ADNc de ADTZ se identificó como un nuevo péptido de la investigación en GENEBANK.

La invención se relaciona no sólo con el método descrito en este ejemplo, si no también con el clon de la secuencia en ADNc de Armillariella tabescens en el banco de datos usando la sonda designada de la secuencia de péptido ADTZ. :s Ejemplo 7 Síntesis del gen ADNc codificado péptido maduro de ADTZ De acuerdo con los extremos de las secuencias ADNc 3' y 5', un par de cebadores se diseñaron para obtener la secuencia del marco de lectura abierto.

P3: 5'-GTCGAATTCATGGCCACCACAACTGTC-3' P4: 3'-GTAACTCTCTGCTAACACTCCTAGGGAC-5' La segmentación de sitios de enzima EcoR1 (GAATTC) y BamHl (GGATCC) se incorporaron a los cebadores. La amplificación de PCR se lleva a cabo, y el producto PCR se raspa de la agarosa. Los detalles a continuación: 7.1. Preparación de la mezcla maestra (sistema 100µl) 69 µl Agua de grado PCR 10 µl 10? Buffer Advantage 2 PCR 2 µl Mezcla dNTP (10?nM) 2 ul 5Q? Mezcla polimerasa Advantaqe 2 83 µl Los ingredientes se mezclan a la perfección por medio de pipeta hacia arriba y abajo unas veces, seguido del paso de centrifugación corta. 7.2. Los componentes en el orden arriba listado se vierten en un tubo estéril de centrifugado de 0.5 ml (unidad: µl) 7.3. Ciclos PCR. 94°C 1 min. • 5. ciclos: 94°C 30 sec 72°C 4 min. • 5 ciclos: 94°C 30 sec 72°C 4 min. • 35 ciclos: 94°C 30 sec 68°C 4 min. 72°C 10 min. 7.4. Después de los ciclos PCR, la muestra de 5 µl se usa para electroforesis; los resultados se muestran en la Fig. 10. Se obtiene una sola banda del PCR (-1800 bp), y se le nombra fragmento ADTZ. 7.5. Recuperación del producto PCR El producto PCR se raspa del gel. De esta manera, se obtuvo el ADNc codificando el péptido maduro ADTZ. El fragmento se nombró "ADTZ".

Ejemplo 8 Construcción de la expresión de plásmido de ADTZ recombinante El ADTZ del Ejemplo 7 se clona a pHIL-S1 para construir la expresión del vector pHIL-S1 -ADTZ siguiendo el procedimiento estándar (Sambrook, et al. 1989, Clonación molecular, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Estados Unidos). El producto se analizó por incisiones enzimáticas y secuencias. Los detalles a continuación: Como se muestra en la Fig. 14, la construcción del plásmido híbrido conteniendo el gen ADTZ es de la siguiente manera: El plásmido pHIL-S1 y el fragmento ADTZ se segmenta por medio de dos incisiones enzimáticas EcoRI + Baml. Las mezclas se somete a electroforesis agarosa al 0.8%, y se extrae del gel. El plásmido recombinanle pHIL-S1-A07Z se construye del vector pHIL-S1 y el gen ADTZ por enzima ligasa T4 ADN.

Las células competentes E.coli DH5a se preparan usando el método CaCI2, y se transforman. Las células transformadas se seleccionan, y se obtiene plásmido de ADN de la extracción alcalina. El plásmido de ADN recombinante se purifica por precipitación con PEG (Sambrook, et al. 1989, Clonación molecular, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Estados Unidos). La secuencia de ADN se determina en un secuenciador de ADN ABI377 usando cebadores de secuenciación T7 y SP6.

La incisión de enzima del plásmido recombinante pHIL-S1 -ADTZ (pSA) se muestra en la Fig. 1 1. Dos incisiones de enzima BamHl y EcRI (muestra 1 ) muestra una sola banda (-2000 bp), la incisión de enzima sencilla Hindlll (muestra 2) muestra tres bandas (-1400 bp, 600 bp y 500 bp), la incisión de enzima sencilla Sacl muestra segmentación lineal (indicando no segmentación en el sitio Sacl en el fragmento insertado).

Ejemplo 9 Expresión del gen ADTZ recombinante El plásmido recombinante pHIL-S1 -ADTZ y la expresión del vector pHIL-S1 se segmentan por medio de Sacl. Las mezclas se someten a electroforesis agarosa al 0.8%; el µlásmido recombinante linealizado pHIL-S1-AD7"Z y el vector pHIL-S1 se extraen del gel. Los transformantes Mut+ se seleccionan siguiendo la transformación esferoplasto del P/c/7/a pastoris GS1 15 (kit manual de expresión Pichia, Invitorgen Inc. Estados Unidos). Se usa metanol como la única fuente de carbón para la expresión inducida de P c/7/a pastoris GS1 15. El SDS-PAGE de la mezcla de incubación muestra claramente la banda de proteína siguiendo la expresión inducida, mientras que la muestra de control sin gen ADTZ no muestra la banda de proteína; los resultados se muestran en la Fig. 12. Los detalles a continuación: Recombinación homogénea del plásmido recombinante en Pichia pastorís 9.1. Linealizacíón de plásmidos. El plásmido recombínante pHIL-S1 -ADTZ (pSA) y la expresión del vector pHIL-S1 se segmentan por medio de Sacl. Este último se usa como control en el siguiente experimento. Incisión enzimática pSA (120 µl): 12ml Buffer L+ 8ml Sacl+ 100ml pSA. Incisión enzimática pHIL-S1 (120 µl): 12ml Buffer L+ 8ml Sacl+ 100ml pHIL- S1.

Las mezclas se someten a electroforesis agarosa al 0.8%; el plásmido recombinante linealizado pSA y el vector pHIL-S1 se extraen del gel. 9.2. Incubación de Pichia pastoris para transformación de esferoplasto 9.2.1. 10 ml inoculados de YPD (medio de extracto de levadura dextrosa peptona) con una solo colonia de P/c/7 a pastoris GS115. Se dejan crecer una noche a 30°C en un incubador de agitación (250-300 rpm). 9.2.2. 200 ml de YPD inoculado con 5, 10 y 20 µl del cultivo mencionado. Estas muestras se incuban por una noche a 30°C en un incubador de agitación (250-300 rpm). 9.2.3. Los tres cultivos se analizan por OD6oo- Aquellos con OD6oo = 0.2-0.3 se seleccionan, y se hacen granulos por medio de centrifugación a 1500 x g por 5 min.; el sobrante líquido se descarta. Las células se usan para transformación de esferoplasto. 9.3. Preparación de esferoplastos de P/'c/7/'a pastoris GS115 9.3.1. Los granulos de célula se sumergen de nuevo en 20 ml de agua estéril, y se transfieren a dos tubos de centrifugado de 10 ml. 9.3.2. Las células se hacen granulos por medio de centrifugación a 1500 x g por 5 min.; el sobrante líquido se descarta, 9.3.3. Los granulos de célula se lavan con SED recién preparado, seguido de una centrifugación a 1500 x g por 5 min.; el sobrante líquido se descarta. 9.3.4. Los granulos de célula se lavan en una solución de 1M Sorbitol, seguido de una centrifugación a 1500 x g por 5 min.; el sobrante líquido se descarta. 9.3.5. Los granulos de célula se sumergen de nuevo en 10 ml de SCE. 9.3.6. Se derrite Zimoliasa en un tubo y se mezcla agitando rápidamente el tubo. 9.3.7. Se agregan 7.5 µl de Zimoliasa y se incuban por 30 min. a 30°C. 9.3.8. Las células se hacen granulos por centrifugación a 1500 x g por 5 min.; el sobrante líquido se descarta. 9.3.9. La mezcla de transformación se lava con una solución de 1M Sorbitol, se mezcla agitando rápidamente el tubo para dispersar el precipitado.

Las células se hacen granulos por centrifugación a 750 x g por 5 min. a temperatura ambiente; el sobrante líquido se descarta. 9.3.10. Los granulos de célula se lavan con 10 ml de una solución de CaS, seguido de una centrifugación a 750 x g por 5 min.; el sobrante líquido se descarta. 9.3.11. Los granulos de célula se sumergen de nuevo en 0.6 ml de una solución CaS. Los esferoplastos se deben usar en los siguientes 30 min. 9.4. Transformación de esferoplastos de Pichia pastoris GS115 9.4.1. Se transfieren 100 µl de Alícuotas de cada esferoplasto de Pichia pastoris GS1 15 a tres tubos estériles de centrifugado A, B y C. 9.4.2. El tubo A (no ADN) control negativo, el tubo B (se agrega 30 µl de vector linealizado pHIL-S1 ), el tubo C (se agrega 30 µl de plásmido recombinante pSA, incubado por 10 min. a temperatura ambiente). Se preparan 3 ml de PEG/CaT al mismo tiempo. 9.4.3. Se agregan alícuotas de 1 ml de cada PEG/CaT al tubo A, B y C, se mezclan suavemente y se incuban por 10 min. a temperatura ambiente. 9.4.4. Las células se hacen granulos por medio de centrifugación a 750 x g por 5 mín.; el sobrante líquido se descarta. 9.4.5. Los granulos de células se sumergen de nuevo en 150 µl de SOS, se incuban por 20 min. a temperatura ambiente. 9.4.6. Se agregan alícuotas de 850 µl de una solución de 1M Sorbitol a cada uno de los tubos. 9.4.7. Las transformaciones completas se emplacan en placas de incubación sólidas RD usando una espátula estéril (200µl/placa). Las placas se incuban a 28-30°C. Los transformantes aparecen entre 4-6 días. 9.5. Selección de transformantes Mut+ 9.5.1. Usando un mondadientes estéril, los transformantes His+ se (patched) en ambas placas MM y MD, las sepas GS115/His+Muts Albúmina y GS115/His+ Mut+ ß-gal también se (patched) en la placas como controles. 9.5.2. Las placas se incuban a 28-30°C por 2 dias. 9.5.3. Después de dos días, las placas se marcan. Las cepas Mut+ crecen normalmente en ambas placas, mientras que la Muts crece normalmente solo en la placa MD, pero poco o casi nada en la placa MM. 9.6. Expresión inducida de las cepas recombinantes 9.6.1. Se inocula una sola colonia de His+Mut+ transformante en 25 ml de BMG en un frasco graduado de 250 ml. Se deja crecer en un incubador de agitado (250-300 rpm) a 28-30°C hasta que el cultivo alcance OD60o = 2-6 (-16-18 h). 9.6.2. Las células se cultivan por centrifugación a 1500-3000 x g por 5 min. a temperatura ambiente. El sobrante líquido se decanta y los granulos de célula se sumergen de nuevo en BMM a OD6oo e 1.0 (-100-200ml BMM). El cultivo se coloca en un frasco graduado de 1 litro y se regresa al incubador para seguir con el crecimiento a 250-300 rpm a 28-30°C. 9.6.3. Se agrega metanol al 100% a una concentración final de 0.5% para mantener la expresión inducida. 9.6.4. Después de 96 hrs., la expresión del cultivo se centrifuga por 2-3 min., el sobrante líquido se transfiere a un tubo aparte y se almacena a -80°C para purificar la expresión del producto.

Se analiza el sobrante líquido del cultivo luego de 96 hrs. de inducción. La cantidad total de proteína es de 0.23 mg/ml. El peso molecular del producto de proteína es consistente con el valor pronosticado de 76.95 kDa por BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html).

Ejemplo 10 Purificación de ADTZ recombinante El cultivo de expresión recombinante se precipita con una saturación al 70% de (NH4)2SO , produciendo enzimas crudas como precipitado. La enzima cruda se disuelve en igual volumen de PBS, y se centrifuga. El sobrante líquido se carga en una columna de Fenil Sefarosa hidrofóbica; el producto activo se recolecta de la elución gradiente. El producto se somete a diálisis de desalinización y se concentra después de la equilibración con PBS. La solución concentrada de enzima cruda se purifica por cromatografía de afinidad metal quelato usando una columna Quelato Sefarosa. El punto activo se eluce usando un pH gradiente pH7.5-6.0 y se recolecta la fracción. Los detalles a continuación: 10.1. Enzima cruda de la precipitación (NH4)2SO Se agrega polvo de (NH )2SO al cultivo de expresión recombinante hasta una saturación del 40%, seguido de centrifugación a 10000 g por 20 minutos a 4°C.

Al sobrante líquido se le agrega más NH4)2SO4 hasta una saturación del 70 %.

La enzima cruda se obtiene de la centrifugación a 10000 g por 20 min. a 4°C. 10.2. Cromatografía de interacción hidrofóbica La enzima cruda ADTZ se disuelve en igual volumen de 0.02 M PBS (pH 6.0), y se centrifuga a 4000 g por 10 min. a 4°C. El sobrante líquido se carga una columna Fenil Sefarosa (Pharmacia Biotech. Inc., Estados Unidos) que ha sido lavada a fondo usando 0.02 M PBS + 30% de saturación de NH4)2S04 , elución gradiente pH 6.0 con A (0.02M PBS + 10% de saturación de (NH4)2SO4 , pH 6.0 ) y B (0.02 M PBS, pH 6.0) dando un producto activo. El producto se somete a diálisis de desalinización y se concentra luego de la equilibración con la solución F 0.02 M PBS + 5 M NaCI, pH 7.5) a un 1 mg/ml. 10.3. Cromatografía de afinidad metal quelato Se satura la quelato sefarosa (Pharmacia Biotech. Inc., Estados Unidos) con .2 M CuCI2, y después se equilibra con agua y solución F (0.02 M PBS + 5 M NaCI , pH 7.5). Las fracciones reunidas de la cromatografía de interacción hidrofóbica se cargaron y se purificaron con gradiente pH no-lineal usando buffer G (0.02 M PBS + 0.5 M NaCI, pH 7.5-6.0, gradiente no-lineal incrementado por 0.5 pH unidad). El punto del producto se recolecta y se analiza usando SDS-PAGE. Conclusión: se obtienen 58 mg de ADTZ recombinante purificado de un litro de cultivo de expresión, la pureza es mayor al 95%.

Ejemplo 1 1 Análisis de actividad de ADTZ recombinante La actividad de ADTZ recombinante se analiza siguiendo los siguientes protocolos del Ejemplo 2.1. Análisis de mezclas: (1 ) mezcla de enzima: solución 1 µl AFBi (0.5 µg/µl in MeOH. evaporado bajo nitrógeno) + solución de enzima ADTZ recombinante (0.1 mg/ml, 300 µl) + 0.5 µl MgS04 + 10 µl PEG200; (2) mezcla de enzima desactivada: 1 µl de solución AFB, (0.5 µg/µl en MeOH, evaporado bajo nitrógeno) + solución de enzima ADTZ recombinante (0.1 mg/ml, 300 µl, precalentado a 100°C por 5 min.) + 0.5 µl MgS04 + 10 µl PEG200; (3) mezcla de control" 1 µl de solución AFB i (0 5 µg/µl in MeOH, evaporado bajo nitrógeno) + 300 µl de buffer PBS + 0.5 µl MgS04 + 10 µl PEG200. Las mezclas para el análisis se mezclan a la perfección, se hacen reaccionar por 1 hr. A 30°C, se agrega AFBÍ (0.5 µl x 2) cada hora (total AFB1 : 2 µg). Después de la adición, las reacciones siguen por otras 6 horas. Luego de la reacción se muestra el nuevo producto TLC (como en el Ejemplo 1) con Rf -1 (= 0.93) para ADTZ recombinante, muy similar al ADTZ natural señalando actividad de ADTZ recombinante en la transformación de AFBi. El resultado se muestra en la Fig. 13.

Ejemplo 12 Bíoactividad de ADTZ recombinante en desintoxícación de AFBi La bioactividad de ADTZ recombinante se analizó siguiendo los protocolos en el Ejemplo 2.2., donde el ADTZ recombinante se usa en lugar del ADTZ natural. El número de colonias mutantes de la muestra de ADTZ es muy similar a la del control negativo (DMSO muestra de control) (MR < 2). El número de colonias mutantes de la muestra buffer de control y la muestra de ADTZ recombinante desactivado son significativamente más altos que en la muestra de control negativo (MR > 2), y son muy cercanos al control positivo (muestra de control AFBi). Los resultados se muestran en el siguiente cuadro.

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Lo que se reclama es: 5 1. Una detoxifizima con actividad para transformar la aflatoxina, caracterizado porque su punto isoeléctrico es 5.3-6.8, y su peso molecular es 73-77 kilodaltcns, y su secuencia de aminoácidos se presente en la Lista de Secuencia.
2. 2. Un gen caracterizado por que codifica una secuencia de ácido nucleósido i o para una detoxifízima con actividad para transformar la aflatoxina, de acuerdo a la reivindicación 1.
3. 3. El gen de acuerdo a la reivindicación 2, caracterizado además por que comprende, una secuencia de ácido nucleósido presente en la Lista de 15 Secuencia.
4. 4. Un portador de expresión recombinante caracterizado porque comprende un gen, de acuerdo a la reivindicación 3. 0
5. 5. Un transformante obtenido de una célula hospedadora transformada por un portador de expresión recombinante, de acuerdo a la reivindicación 4.
6. 6. Un método de preparación de una detoxifizima, de acuerdo a la reivindicación 1 , caracterizado porque comprende: 5 -cultivo de un transformante, de acuerdo a la reivindicación 5, y la separación, purificación y recuperación de la detoxifizima expresada con actividad para transformar la aflatoxina.
7. 7. El uso de una detoxifizima con actividad para transformar la aflatoxina, de acuerdo a la reivindicación 1 , para la manufactura de alimento y comida.
8. 8. El uso de una detoxifizima con actividad para transformar la aflatoxina, de acuerdo a la reivindicación 1 , para la preparación de medicamentos para prevenir o tratar tumor o cáncer.