BR112016030971B1

BR112016030971B1 - Processo para produzir um produto de óleo e processo para produzir um produto de óleo a partir do óleo da planta

Info

Publication number: BR112016030971B1
Application number: BR112016030971-5A
Authority: BR
Inventors: Thomas Vanhercke; James Robertson Petrie; Anna El Tahchy; Surinder Pal Singh; Kyle Reynolds; Qing Liu; Benjamin Aldo Leita
Original assignee: Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation
Priority date: 2014-07-07
Filing date: 2015-07-07
Publication date: 2022-09-27
Also published as: MX2020004734A; US20220364014A1; US11814600B2; EP4303288A2; RU2017102934A3; EP2966157C0; CN106852158A; RU2021103505A; RU2017102934A; AU2015286221A1; MY178434A; PH12019502112A1; CL2019000616A1; WO2016004473A1; AU2022218528A1; US10472587B2; US20200080022A1; JP2021121200A; EP4303288A3; RU2743384C2

Abstract

PROCESSO PARA PRODUZIR UM PRODUTO DE ÓLEO, CÉLULA EUCARIÓTICA RECOMBINANTE, PROCESSO PARA A OBTENÇÃO DESTA CÉLULA, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA PLANTA, PROCESSO PARA PRODUZIR UM PRODUTO INDUSTRIAL, PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE LIPÍDEOS EXTRAÍDOS, PROCESSO PARA PRODUZIR SEMENTE, LIPÍDEOS RECUPERADOS OU EXTRAÍDOS, PROCESSO PARA PRODUZIR COMBUSTÍVEL, PROCESSO PARA PRODUZIR UM INGREDIENTE ALIMENTAR, ALIMENTOS, COSMÉTICOS OU PRODUTOS QUÍMICOS E PROCESSO PARA A ALIMENTAÇÃO DE UM ANIMAL. A presente invenção refere-se a métodos de produção de produtos para a indústria de lipídeos de plantas, em particular das partes vegetativas das plantas. Em particular, a presente invenção proporciona produtos de óleo tais como biodiesel e diesel sintético e processos para a produção destes, assim como plantas que têm um aumento do nível de um ou mais lipídeos não polares, tais como triglicerídeos e um aumento do conteúdo total de lipídeos não polares. Em uma modalidade particular, a presente invenção refere-se a combinações de modificações em duas ou mais das enzimas manipuladoras de lipídeos, proteínas do corpo oleoso, enzimas catabólicas lipídicas reduzidas e/ou fatores de transcrição que regulam a biossíntese lipídica para aumentar o nível de um ou mais lipídeos não polares e/ou o teor total de lipídeos não (...).

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[1] A presente invenção se refere a métodos de produção de produtos para a indústria de lipídeos de plantas, em particular das partes vegetativas das plantas. Em particular, a presente invenção fornece derivados de óleo tais como biodiesel e diesel sintético e processos para a produção destes, assim como plantas que têm um aumento do nível de um ou mais lipídeos não polares, tais como triacilgliceróis e um aumento do teor de lipídeos totais não polares. Em uma modalidade particular, a presente invenção refere-se a combinações de modificações em duas ou mais das enzimas manipuladoras de lipídeos, proteínas do corpo oleoso, enzimas catabólicas lipídicas reduzidas e/ou fatores de transcrição que regulam a biossíntese lipídica para aumentar o nível de um ou mais lipídeos não polares e/ou o teor de lipídeos totais não polares e/ou o teor de ácidos graxos monoinsaturados em plantas ou qualquer parte da mesma. Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um processo para a extração de lipídeos. Em uma outra modalidade, o lipídeo é convertido em um ou mais produtos de hidrocarbonetos em partes vegetativas colhidas para produzir ésteres de alquil dos ácidos graxos, que são adequados para utilização como combustível de biodiesel renovável.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[2] A maior parte da energia do mundo, particularmente para o transporte, é fornecida pelos combustíveis derivados do óleo, que têm uma fonte finita. Fontes alternativas que sejam renováveis são necessárias, tais como a partir de óleos biologicamente produzidos.

Biossíntese de triacilglicerol

[3] Os triacilgliceróis (TAG) constituem a forma principal de lipídeos em sementes e consistem em três cadeias de acil esterificadas a uma cadeia principal de glicerol. Os ácidos graxos são sintetizados no plastídeo como intermediários de proteína carreadora acil-acil (ACP) onde podem sofrer uma primeira dessaturação catalisada. Esta reação é catalisada pela estearoil-ACP dessaturase e produz ácido oleico (C18: 1A9). Subsequentemente, as cadeias de acil são transportadas para o citosol e retículo endoplasmático (RE) como tioésteres de acil-coenzima (CoA). Antes de entrar na via principal de biossíntese de TAG, também conhecida como via de Kennedy ou glicerol-3-fosfato (G3P), as cadeias de acil são tipicamente integradas em fosfolipídeos da membrana ER onde podem sofrer uma dessaturação adicional. Duas enzimas chave na produção de ácidos graxos poli-insaturados são as FAD2 e FAD3 dessaturases ligadas a membranas que produzem ácido linoleico (C18: 2A9,12) e aácido linolênico (C18: 3A9,12'15), respectivamente.

[4] A biossíntese de TAG através da via de Kennedy consiste em uma série de acilações subsequentes, cada uma usando ésteres de acil-CoA como dador de acil. A primeira etapa de acilação ocorre tipicamente na posição sn1da cadeia principal de G3P e é catalisada por glicerol-3-fosfato aciltransferase (sn1-GPAT). O produto, ácido lisofosfatídico sn1(sn1-LPA) serve como um substrato para ácido lisofosfatídico aciltransferase (LPAAT) que acopla uma segunda cadeia de acil na posição sn2para formar o ácido fosfatídico. O PA é ainda desfosforilado em diacilglicerol (DAG) por ácido fosfatídico fosfatase (PAP), fornecendo assim o substrato para a etapa de acilação final. Finalmente, uma terceira cadeia de acil é esterificada para a posição sn3de DAG, em uma reação catalisada pela diacilglicerol aciltransferase (DGAT) para formar TAG que se acumula nos corpos oleosos. Uma segunda reação enzimática, fosfatidil glicerol aciltransferase (PDAT), também resulta na conversão de DAG para TAG. Esta reação não está relacionada com DGAT e utiliza os fosfolipídeos como doadores de acil.

[5] Para maximizar os rendimentos para a produção comercial de lipídeos, existe uma necessidade de meios adicionais para aumentar os níveis de lipídeos, particularmente lipídeos não polares, tais como DAGs e TAGs, em organismos transgênicos ou partes dos mesmos, tais como plantas, sementes, folhas, algas e fungos. As tentativas de aumentar a produção de lipídeos neutros em plantas centraram- se principalmente nas etapas enzimáticas críticas individuais envolvidas na biossíntese de ácidos graxos ou montagem de TAG. Essas estratégias, no entanto, resultaram em aumentos modestos no teor de óleo de sementes ou folhas. O trabalho de engenharia metabólica recente na levedura oleaginosa Yarrowia lipolytica tem demonstrado que uma abordagem combinada de aumentar a produção de glicerol-3-fosfato e prevenir a quebra de TAG através de P-oxidação resultou em aumentos cumulativos no teor de lipídeos totais (Dulermo et al., 2011).

[6] Os lipídeos das plantas, tais como triacilgliceróis de semente de óleo (TAGs) têm muitos usos, por exemplo, usos culinários (encurtamento, textura, sabor), usos industriais (em sabões, velas, perfumes, cosméticos, adequados como agentes de secagem, isolantes, lubrificantes) e fornecem valor nutricional. Há também um interesse crescente no uso de lipídeos de plantas para a produção de biocombustível.

[7] Para maximizar os rendimentos para a produção comercial de lipídeos, existe uma necessidade de meios adicionais para aumentar os níveis de lipídeos, particularmente lipídeos não polares, tais como DAGs e TAGs, em organismos transgênicos ou partes dos mesmos, tais como plantas, sementes, folhas, algas e fungos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[8] Os presentes inventores identificaram um processo para produzir um produto de óleo de partes vegetativas da planta.

[9] Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece um processo para produzir um produto de óleo, o processo compreendendo as etapas de (i) tratar, em um reator, uma composição que compreende (a) partes vegetativas da planta cujo peso seco é de pelo menos 2g e que tenham um teor de lipídeos totais não polares de pelo menos 5% em peso em uma base de peso seco, (b) um solvente que compreende água, um álcool ou ambos e (c) opcionalmente, um catalisador, em que o tratamento compreende o aquecimento da composição a uma temperatura entre cerca de 50oC e cerca de 450oC e a uma pressão entre 5 e 350 bar durante entre 1 e 120 minutos em um ambiente oxidativo, redutivo ou inerte, (ii) recuperar o produto de óleo a partir do reator a um rendimento de pelo menos 35% em peso em relação ao peso seco das partes vegetativas da planta, produzindo desse modo o produto de óleo.

[10] Em uma modalidade, as partes vegetativas da planta têm um peso seco de pelo menos 1 kg.

[11] Em uma modalidade, as partes vegetativas da planta têm um teor de lipídeos totais não polares de pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, entre 10% e 75%, entre 20% e 75% ou, de preferência entre 30% e 75% em uma base de peso seco.

[12] Em uma modalidade, a composição possui uma concentração de sólidos entre 5% e 90%, de preferência entre 15% e 50% (peso seco/peso).

[13] Qualquer catalisador adequado pode ser utilizado. Em uma modalidade, o catalisador é uma base, um ácido ou um catalisador de metal precioso. Por exemplo, em uma modalidade o catalisador compreende NaOH ou KOH, ou ambos, de preferência a uma concentração de 0,1 M a 2M.

[14] Em uma modalidade, o tempo de tratamento é entre 1 e 60 minutos, de preferência entre 10 e 60 minutos, de preferência entre 15 e 30 minutos. Em uma modalidade onde a pressão é menor do que 50bar, o tempo de reação pode ser de até 24 horas ou mesmo 7 dias. Em uma modalidade preferida, a temperatura está entre 275oC e 360oC, a pressão situa-se entre 100 e 200 bar, e a reação ocorre em 10-60mins.

[15] Em uma modalidade, se o solvente for água, o processo produz um rendimento do produto de óleo entre um mínimo de 36%, 37%, 38%, 39% ou 40% e um máximo de 55% ou 60% em peso em relação ao peso seco das partes vegetativas da planta. Nesta modalidade, o produto de óleo compreende pelo menos duas vezes, preferencialmente pelo menos 3 vezes mais compostos de hidrocarbonetos do que os ésteres de acil graxo. De um modo preferido, o produto compreende 35% de óleo, mais preferivelmente 40% de compostos de hidrocarboneto em C13C22.

[16] Em uma outra modalidade, se o solvente compreende um álcool, preferivelmente metanol, o processo produz um rendimento do produto de óleo entre um mínimo de 36%, 37%, 38%, 39% ou 40% e um máximo de 65% ou 70% em peso em relação ao peso seco das partes vegetativas da planta. Nesta modalidade, o produto de óleo compreende, pelo menos, 1,5 vezes, de preferência pelo menos 2 vezes, mais ésteres de acil graxos do que os compostos de hidrocarbonetos. De um modo preferido, o produto compreende 40% de óleo, mais preferivelmente 50% de ésteres metílicos de ácidos graxos.

[17] Em uma outra modalidade, se o solvente compreende cerca de 80% de água, o produto de óleo compreende cerca de 30% de compostos de hidrocarboneto em C13-C22, de preferência cerca de 35%, mais preferencialmente cerca de 40% de compostos de hidrocarboneto em C13-C22.

[18] Em uma outra modalidade, se o solvente compreende cerca de 50% de metanol, o produto de óleo compreende cerca de 50% de ésteres metílicos de ácidos graxos (FAME),

[19] Em uma outra modalidade, o produto óleo recuperado tem um teor em água menor do que cerca de 15%, em peso, de preferência menor do que 5% em peso.

[20] Em ainda outra modalidade, o rendimento do produto de óleo é pelo menos 2% maior, em peso, de um modo preferido, pelo menos, 4% maior, em peso, em relação a um processo correspondente usando partes vegetativas da planta correspondentes cujo teor de lipídeos não polares é inferior a 2% em uma base de peso seco.

[21] Em uma modalidade, as partes vegetativas da planta na etapa (i) (a) foram fisicamente processadas por um ou mais de secagem, corte, fragmentação, moagem, laminação, prensagem, esmagamento ou trituração. Em algumas modalidades, as partes vegetativas da planta não foram secas até um teor de umidade inferior a 10% antes da preparação da composição. Por exemplo, as partes vegetativas da planta têm um teor de pelo menos 20% ou pelo menos 30% de umidade, ou as partes vegetativas da planta retêm pelo menos 50% do teor de água que tinham no momento em que foram colhidas.

[22] Em uma modalidade, o processo compreende ainda um ou mais dos seguintes: (i) hidrodesoxigenação do produto de óleo recuperado, (ii) tratamento do produto de óleo recuperado com hidrogênio para reduzir os níveis de cetonas ou açúcares no produto de óleo, (iii) produção de gás de síntese a partir do produto de óleo recuperado, e (iv) fracionamento do produto de óleo recuperado para produzir um ou mais de óleo combustível, óleo diesel, querosene ou gasolina. Por exemplo, a etapa de fracionamento é por destilação fracionada.

[23] Em uma modalidade, as partes vegetativas da planta compreendem folhas, caules ou ambos.

[24] Em uma modalidade, as partes vegetativas da planta compreendem uma combinação de polinucleótidos exógenos e/ou modificações genéticas, tal como aqui definido.

[25] Os presentes inventores também demonstraram aumentos significativos do teor de lipídeos de organismos, em particular nas partes vegetativas e sementes de plantas, por manipulação da biossíntese de ácidos graxos, de lipídeos e de montagem vias embalagens de lipídeos e catabolismo de lipídeos reduzidos. Várias combinações de genes e redução da expressão de genes foram utilizadas para alcançar aumentos substanciais no teor de óleo, o que é de grande importância para a produção de biocombustíveis e outros produtos industriais derivados de óleo.

[26] Em um segundo aspecto, a presente invenção fornece uma célula eucariótica recombinante compreendendo a) primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na célula, b) um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um polinucleotídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares e qualquer um ou dois ou todos os três de c) uma primeira modificação genética que infrarregula a produção endógena e/ou a atividade de um polinucleotídeo envolvido no catabolismo de triacilgliceróis (TAG) na célula, quando comparado com uma célula correspondente sem a modificação genética, d) um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo que aumenta a exportação de ácidos graxos para fora dos plastídeos da célula quando comparado com uma célula correspondente sem o quarto polinucleotídeo exógeno, e e) um quarto polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na célula, em que o polinucleotídeo é operativamente ligado a um promotor capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo na célula.

[27] Em uma modalidade, a célula compreende a), b) e c), e opcionalmente d) ou e).

[28] Em uma modalidade, a célula compreende a), b) e d), e opcionalmente, c) ou e).

[29] Em uma modalidade, a célula compreende a), b) e e), e, opcionalmente, c) ou d).

[30] Em uma modalidade, a célula compreende ainda um ou mais ou todos de a) um quinto polinucleótido exógeno que codifica um polipeptídeo de revestimento de corpos oleosos (OBC), de preferência, proteína associada às gotas lipídicas (LDAP), b) uma segunda modificação genética que infrarregula a produção e/ou a atividade de um polipeptídeo envolvido na importação de ácidos graxos em plastídeos da célula quando comparado com uma célula correspondente sem a segunda modificação genética endógena, e c) uma terceira modificação genética que infrarregula a produção endógena e/ou a atividade de um polipeptídeo envolvido na produção de diacilglicerol (DAG) no plastídeo quando comparado a uma célula correspondente sem a terceira modificação genética.

[31] Em uma modalidade, a células eucariótica recombinante compreende a) primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na célula, b) um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um polinucleotídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares e c) uma primeira modificação genética que infrarregula a produção endógena e/ou a atividade de um polinucleotídeo envolvido no catabolismo de triacilgliceróis (TAG) na célula, quando comparado com uma célula correspondente sem a modificação genética, em que cada um polinucleotídeo exógeno está operativamente ligado a um promotor que é capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo na célula, e ainda, opcionalmente, a célula compreende um ou mais ou todos de d) um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo de revestimento de corpos oleosos (OBC), de preferência um LDAP, e) um quarto polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo que aumenta a exportação de ácidos graxos para fora dos plastídeos da célula quando comparado com uma célula correspondente sem o quarto polinucleotídeo exógeno, f) uma segunda modificação genética que infrarregula a produção e/ou a atividade de um polipeptídeo envolvido na importação de ácidos graxos em plastídeos da célula quando comparado com uma célula correspondente sem a segunda modificação genética endógena, e g) uma terceira modificação genética que infrarregula a produção endógena e/ou a atividade de um polipeptídeo envolvido na produção de diacilglicerol (DAG) no plastídeo quando comparado a uma célula correspondente sem a terceira modificação genética.

[32] Em uma modalidade, a célula é uma célula vegetal de ou em uma parte vegetativa de uma planta e um ou mais ou todos os promotores são expressos a um nível superior na parte vegetativa em relação à semente da planta.

[33] Em uma modalidade preferida, a presença de c), d) ou e), em conjunto com o primeiro e o segundo polinucleotídeos exógeno aumenta o teor de lipídeos não polares totais da célula, preferencialmente uma célula na parte vegetativa da planta, tais como uma folha ou caule, em relação a uma célula correspondente, que compreende o primeiro e o segundo polinucleotídeos exógenos, mas não tem cada c), d) e e). Mais preferivelmente, o aumento é sinérgico. Mais preferencialmente, pelo menos, o promotor que dirige a expressão do primeiro polinucleotídeo exógeno é um promotor que não é um promotor constitutivo.

[34] Em uma modalidade, o polipeptídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares é DGAT ou PDAT e o polipeptídeo envolvido no catabolismo de TAG na célula é uma SDP1 lipase.

[35] Em uma modalidade, o polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na célula é um polipeptídeo WRI1 e o polipeptídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares é DGAT ou PDAT.

[36] Em uma modalidade, o polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na célula é um polipeptídeo WRI1, um polipeptídeo LEC2, um polipeptídeo LEC1 ou um polipeptídeo semelhante a LEC-1 e o polipeptídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares é DGAT.

[37] Em uma modalidade, o polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na célula é um polipeptídeo WRI1, um polipeptídeo LEC2, um polipeptídeo LEC1 ou um polipeptídeo semelhante a LEC-1 e o polipeptídeo envolvido no catabolismo de triacilgliceróis (TAG) na célula é uma SDP1 lipase.

[38] Em uma modalidade, o polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na célula é um polipeptídeo WRI1, um polipeptídeo LEC2, um polipeptídeo LEC1 ou um polipeptídeo semelhante a LEC-1, na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares é DGAT ou PDAT e o polipeptídeo envolvido no catabolismo de triacilgliceróis (TAG) na célula é uma SDP1 lipase.

[39] Em uma modalidade, quando presentes, os dois fatores de transcrição são WRI1 e LEC2 ou WRI1 e LEC1.

[40] Nas modalidades acima, é preferido que a célula esteja em uma parte vegetativa de uma planta que está crescendo no solo ou que foi cultivada em solo e que a parte da planta tenha sido subsequentemente colhida, e em que a célula compreenda pelo menos 8% de TAG em uma base de peso (% peso seco) tal como, por exemplo, entre 8% e 75% ou entre 8% e 30%. Mais preferivelmente, o teor de TAG é de pelo menos 10%, tal como, por exemplo, entre 10% e 75% ou entre 10% e 30%. De preferência, estes níveis de TAG estão presentes nas partes vegetativas antes ou durante a floração da planta ou antes da fase de semeadura do desenvolvimento da planta. Nestas modalidades, é preferido que a razão do teor de TAG nas folhas para o teor de TAG nos caules da planta esteja entre 1:1 e 10:1 e/ou a razão seja aumentada em relação a uma célula correspondente compreendendo o primeiro e o segundo polinucleótidos exógenos e sem a primeira modificação genética.

[41] Nas modalidades acima, a célula compreende, preferencialmente, um polinucleotídeo exógeno que codifica uma DGAT e uma modificação genética que infrarinfrarregula a produção de uma SDP1 lipase endógena. Mais preferencialmente, a célula não compreende um polinucleotídeo exógeno que codifica PDAT e/ou é uma célula que não seja uma célula Nicotiana benthamiana e / ou o WRI1 é um WRI1 outro que não seja Arabidopsis thaliana WRI1 (SEQ ID NOs: 21 ou 22). Mais preferencialmente, pelo menos um dos polinucleotídeos exógenos na célula é expresso a partir de um promotor que não é um promotor constitutivo, tal como, por exemplo, um promotor que é expresso, preferencialmente, em tecidos verdes ou caules da planta ou que é suprarregulado após o início da floração ou durante a senescência.

[42] Em um segundo aspecto, a presente invenção fornece uma célula eucariótica recombinante compreendendo a) primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na célula, b) um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um polinucleotídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares e c) um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo de revestimento de corpos oleosos (OBC), de preferência um polipeptídeo associado a gotícula de lipídeo (LDAP), em que cada polinucleótido exógeno está operativamente ligado a um promotor que é capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo na célula e em que a célula eucariótica recombinante tem um nível aumentado de um ou mais lipídeos não polares e/ou um aumento da quantidade do polipeptídeo OBC, em relação a uma célula correspondente que compreende um terceiro polinucleotídeo exógeno cuja sequência nucleotídica é o complemento da sequência forneceda como SEQ ID NO:176.

[43] Em uma modalidade, a célula do aspecto acima compreende ainda um ou mais ou todos de d) uma primeira modificação genética que infrarregula a produção endógena e/ou a atividade de um polinucleotídeo envolvido no catabolismo de triacilgliceróis(TAG) na célula, quando comparado com uma célula correspondente sem a modificação genética, e) um quarto polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo que aumenta a exportação de ácidos graxos para fora dos plastídeos da célula quando comparado com uma célula correspondente sem o quarto polinucleotídeo exógeno, f) uma segunda modificação genética que infrarregula a produção e/ou a atividade de um polipeptídeo envolvido na importação de ácidos graxos em plastídeos da célula quando comparado com uma célula correspondente sem a segunda modificação genética endógena, e g) uma terceira modificação genética que infrarregula a produção endógena e/ou a atividade de um polipeptídeo envolvido na produção de diacilglicerol (DAG) no plastídeo quando comparado a uma célula correspondente sem a terceira modificação genética.

[44] Em uma modalidade, o polipeptídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares é DGAT ou PDAT e o polipeptídeo OBC é uma oleosina. Alternativamente, o polipeptídeo OBC é um LDAP.

[45] Em uma modalidade, o polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na célula é um polipeptídeo WRI1 e o polipeptídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares é DGAT ou PDAT.

[46] Em uma modalidade, o polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na célula é um polipeptídeo WRI1, um polipeptídeo LEC2, um polipeptídeo LEC1 ou um polipeptídeo semelhante a LEC-1 e o polipeptídeo OBC é uma oleosina. Alternativamente, o polipeptídeo OBC é um LDAP.

[47] Em uma modalidade, o polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na célula é um polipeptídeo WRI1, um polipeptídeo LEC2, um polipeptídeo LEC1 ou um polipeptídeo semelhante a LEC-1 e o polipeptídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares é DGAT ou PDAT e o polipeptídeo OBC é uma oleosina. Alternativamente, o polipeptídeo OBC é um LDAP.

[48] Em uma modalidade, a célula compreende dois polinucleotídeos exógenos que codificam dois polipeptídeos de fator de transcrição diferentes que aumentam a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na célula, tais como WRI1 e LEC2 ou WRI1 e LEC1.

[49] Em uma modalidade preferida, a presença do terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica o polipeptídeo OBC, de preferência um LDAP, em conjunto com o primeiro e o segundo polinucleotídeos exógenos aumenta o teor de lipídeos totais não polares da célula vegetal, de preferência uma célula na parte vegetativa da planta, tal como uma folha ou caule, em relação a uma célula vegetal correspondente que compreende o primeiro e o segundo polinucleotídeos exógenos, mas sem o terceiro polinucleotídeo exógeno. Mais preferivelmente, o aumento é sinérgico. Mais preferencialmente, pelo menos, o promotor que dirige a expressão do primeiro polinucleotídeo exógeno é um promotor que não é um promotor constitutivo.

[50] Em um quarto aspecto, a presente invenção fornece uma célula eucariótica recombinante compreendendo plastídeos e um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na célula, e um ou mais ou todos de; a) um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo que aumenta a exportação de ácidos graxos para fora dos plastídeos da célula quando comparado com uma célula correspondente sem o quarto polinucleotídeo exógeno, b) uma primeira modificação genética que infrarregula a produção e/ou a atividade de um polipeptídeo envolvido na importação de ácidos graxos em plastídeos da célula quando comparado com uma célula correspondente sem a primeira modificação genética endógena, e c) uma segunda modificação genética que infrarregula a produção endógena e/ou a atividade de um polipeptídeo envolvido na produção de diacilglicerol (DAG) no plastídeo quando comparado a uma célula correspondente sem a segunda modificação genética. em que o polinucleotídeo é operativamente ligado a um promotor capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo na célula.

[51] Em uma modalidade, a célula, preferivelmente uma célula vegetal, compreende a) e, opcionalmente, b) ou c).

[52] Em uma modalidade, a célula do aspecto acima compreende ainda um ou mais ou todos de d) um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica um polinucleotídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares, e) uma terceira modificação genética que infrarregula a produção endógena e/ou a atividade de um polinucleotídeo envolvido no catabolismo de triacilgliceróis(TAG) na célula, quando comparado com uma célula correspondente sem a modificação genética, e f) um quarto polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo de revestimento de corpos oleosos (OBC), de preferência um LDAP.

[53] Em uma modalidade preferida, a célula, preferivelmente uma célula vegetal, compreende o primeiro, o segundo e o terceiro polinucleotídeos exógenos e, opcionalmente, a terceira modificação genética ou o quarto polinucleotídeo exógeno.

[54] Em uma modalidade preferida, a presença do segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo que aumenta a exportação de ácidos graxos para fora dos plastídeos da célula, que é preferencialmente acil graxo tioesterase, tal como um polipeptídeo FATA, em conjunto com o primeiro e, se presente,os terceiros polinucleotídeos exógenos aumentam o teor de lipídeos totais não polares da célula vegetal, de preferência uma célula na parte vegetativa da planta, tal como uma folha ou caule, em relação a uma célula vegetal correspondente que compreende o primeiro e, se presente, o terceiro polinucleótidos exógenos, mas não tem o segundo polinucleotídeo exógeno. Mais preferivelmente, o aumento fornecido pelo segundo polinucleotídeo exógeno é sinérgico. Mais preferencialmente, pelo menos, o promotor que dirige a expressão do primeiro polinucleotídeo exógeno é um promotor que não é um promotor constitutivo.

[55] Em uma modalidade, o polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na célula é um polipeptídeo WRI1, um polipeptídeo LEC2, um polipeptídeo LEC1 ou um polipeptídeo semelhante a LEC1, de preferência um fator de transcrição que não seja Arabidopsis thaliana WRI1 (SEQ ID NOs: 21 ou 22), e o polipeptídeo que aumenta a exportação de ácidos graxos para fora de plastídeos da célula é ácido graxo tioesterase, preferencialmente um polipeptídeo FATA ou FATB, mais preferivelmente um polipeptídeo FATA ou ácido graxo tioesterase diferente de ácido graxo de cadeia média tioesterase. A presença de uma tioesterase diferente de uma cadeia média tioesterase é indicada pela percentagem de ácidos graxos C12:0 e/ou C14:0 com o teor de ácidos graxos totais da célula sendo aproximadamente o mesmo em relação a uma célula correspondente sem o polinucleotídeo exógeno codificando a tioesterase. Preferivelmente, a célula compreende um polinucleotídeo exógeno que codifica uma DGAT e uma modificação genética que infrarregula a produção de uma SDP1 lipase endógena. Em uma modalidade, a diminuição da produção de uma SDP1 lipase atua sinergisticamente com o fator de transcrição e de ácido graxo tioesterase para aumentar o teor de lipídeos não polares totais na célula. Mais preferencialmente, a célula não compreende um polinucleotídeo exógeno que codifica PDAT e/ou é uma célula que não é uma célula Nicotiana benthamiana. Mais preferencialmente, pelo menos um dos polinucleotídeos exógenos na célula é expresso a partir de um promotor que não é um promotor constitutivo, tal como, por exemplo, um promotor que é expresso, preferencialmente, em tecidos verdes ou caules da planta ou que é suprarregulado durante a senescência.

[56] Em uma modalidade, o polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na célula é um polipeptídeo WRI1, um polipeptídeo LEC2, um polipeptídeo LEC1 ou um polipeptídeo semelhante a LEC1 e o polipeptídeo envolvido na importação de ácidos graxos em plastídeos da célula é um polipeptídeo TGD.

[57] Em uma modalidade, o polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na célula é um polipeptídeo WRI1, um polipeptídeo LEC2, um polipeptídeo LEC1 ou um polipeptídeo semelhante a LEC1 e o polipeptídeo envolvido na produção de diacilglicerol (DAG) é um GPAT plastidial.

[58] Em uma modalidade, o polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na célula é um polipeptídeo WRI1, um polipeptídeo LEC2, um polipeptídeo LEC1 ou um polipeptídeo semelhante a LEC1 e o polipeptídeo que aumenta a exportação de ácido graxos para fora dos plastídeos da célula é ácido graxo tioesterase, preferivelmente um polipeptídeo FATA ou FATB e o polipeptídeo envolvido na importação de ácidos graxos para os plastídeos da célula é um polipeptídeo TGD.

[59] Em uma modalidade, o polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na célula é um polipeptídeo WRI1, um polipeptídeo LEC2, um polipeptídeo LEC1 ou um polipeptídeo semelhante a LEC1 o polipeptídeo que aumenta a exportação de ácidos graxos para fora dos plastídeos da célula é ácido graxo tioesterase, de preferência um polipeptídeo FATA ou FATB e o polipeptídeo envolvido na produção de diacilglicerol (DAG) é um GPAT plastidial.

[60] Em uma modalidade, o polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na célula é um polipeptídeo WRI1, um polipeptídeo LEC2, um polipeptídeo LEC1 ou um polipeptídeo semelhante a LEC1, o polipeptídeo envolvido na importação de ácidos graxos para plastídeos da célula um polipeptídeo TGD e o polipeptídeo envolvido em produção de diacilglicerol (DAG) é um GPAT plastidial.

[61] Em uma modalidade, a célula compreende dois polinucleotídeos exógenos que codificam dois polipeptídeos de fator de transcrição diferentes que aumentam a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na célula, tais como WRI1 e LEC2 ou WRI1 e LEC1.

[62] Em modalidades do segundo, do terceiro e do quarto aspectos, em que a célula compreende um polinucleotídeo exógeno que codifica ácido graxo tioesterase, tais como, por exemplo, um polipeptídeo FATA ou FATB, a tioesterase é preferivelmente um polipeptídeo FATA ou ácido graxo tioesterase diferente de ácido graxo de cadeia média tioesterase.

[63] Em um quinto aspecto, a presente invenção fornece uma célula eucariótica recombinante compreendendo a) primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na célula, preferivelmente um fator de transcrição WRI, b) um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares, que é um LPAAT com atividade preferencial para ácidos graxos com um comprimento de cadeia média (C8 a C14)e c) um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo que aumenta a exportação de ácidos graxos de C8 a C14 a partir de plastídeos da célula quando comparados com uma célula correspondente sem o terceiro polinucleotídeo exógeno, em que o polinucleotídeo é operativamente ligado a um promotor capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo na célula.

[64] Em uma modalidade, o terceiro polinucleotídeo exógeno codifica para uma tioesterase, de preferência uma FATB tioesterase com atividade preferencial para ácidos graxos com um comprimento de cadeia média (C8 a C14).

[65] Em uma modalidade preferida, a presença do terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo que aumenta a exportação de ácidos graxos de C8 a C14 para fora de plastídeos da célula, juntamente com o primeiro e o segundo polinucleotídeos exógenos aumenta o teor de MCFA total da célula, preferencialmente uma célula na parte vegetativa da planta, tais como uma folha, raiz ou caule, em relação a uma célula vegetal correspondente que compreende o primeiro e o segundo polinucleotídeo exógenos, mas que não tem o terceiro polinucleotídeo exógeno. Mais preferivelmente, o aumento fornecido pelo terceiro polinucleotídeo exógeno é sinérgico. Mais preferencialmente, pelo menos, o promotor que dirige a expressão do primeiro polinucleotídeo exógeno é um promotor que não é um promotor constitutivo.

[66] Em uma modalidade, o polinucleotídeo exógeno que codifica para a FATB tioesterase com atividade preferencial para ácidos graxos com um comprimento de cadeia média (C8 a C14) compreende os aminoácidos cuja sequência é apresentada como qualquer uma de SEQ ID NOs: 193-199, ou um fragmento biologicamente ativo de qualquer um destes, ou um polipeptídeo cuja sequência de aminoácidos é pelo menos 30% idêntica a qualquer uma ou mais de SEQ ID NOs: 193 a 199. Mais de preferência, o polinucleotídeo exógeno que codifica a FATB tioesterase com atividade preferencial para ácidos graxos com um comprimento de cadeia média (C8 a C14) compreende os aminoácidos cuja sequência é apresentada como SEQ ID NOs: 193-199 ou um fragmento biologicamente ativo de qualquer um destes, ou de um polipeptídeo cuja sequência de aminoácidos é pelo menos 30% idêntica a qualquer um ou ambos de SEQ ID NOs: 193 a 199.

[67] Em uma modalidade do quinto aspecto, o fator de transcrição não é Arabidopsis thaliana WRI1 (SEQ ID NOs: 21 ou 22).

[68] Em uma modalidade do quinto aspecto, o polinucleotídeo exógeno que codifica LPAAT compreende os aminoácidos cuja sequência é apresentada como SEQ ID NO: 200, ou um fragmento biologicamente ativo dos mesmos ou um polipeptídeo cuja sequência de aminoácidos é pelo menos 30% idêntica a estes.

[69] Em uma modalidade do quinto aspecto, a célula compreende ainda um ou mais ou todos de; d) um quarto polinucleotídeo exógeno que codifica ainda um polinucleotídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares, e) uma primeira modificação genética que infrarregula a produção endógena e/ou a atividade de um polinucleotídeo envolvido no catabolismo de triacilgliceróis (TAG) na célula, quando comparado com uma célula correspondente sem a primeira modificação genética, f) um quinto polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo de revestimento de corpos oleosos (OBC), de preferência um LDAP. g) uma segunda modificação genética que infrarregula a produção e/ou a atividade de um polipeptídeo envolvido na importação de ácidos graxos em plastídeos da célula quando comparado com uma célula correspondente sem a segunda modificação genética endógena, e h) uma terceira modificação genética que infrarregula a produção endógena e/ou a atividade de um polipeptídeo envolvido na produção de diacilglicerol (DAG) no plastídeo quando comparado a uma célula correspondente sem a terceira modificação genética. em que o polinucleotídeo é operativamente ligado a um promotor capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo na célula.

[70] Em uma modalidade do quinto aspecto, a célula é uma célula vegetal de ou em uma parte vegetativa de uma planta e um ou mais ou todos os promotores são expressos a um nível superior na parte vegetativa em relação à semente da planta.

[71] Em uma modalidade do quinto aspecto, o ácido graxo com um comprimento de cadeia média é pelo menos o ácido mirístico. Em uma modalidade preferida, a célula compreende um teor de ácido mirístico de pelo menos cerca de 8%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 11%, pelo menos cerca de 12%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, entre 8% e 25%, entre 8% e 20%, entre 10% e 25%, entre 11% e 25%, entre cerca de 15% e 25%, entre cerca de 20% e 25%, (p/p de peso seco).

[72] Nas modalidades do terceiro, do quarto e do quinto aspectos, é preferido que a célula esteja em uma parte vegetativa de uma planta que está crescendo no solo ou que foi cultivada em solo e que a parte da planta tenha sido subsequentemente colhida, e em que a célula compreenda pelo menos 8% de TAG em uma base de peso (% peso seco) tal como, por exemplo, entre 8% e 75% ou entre 8% e 30%. Mais preferivelmente, o teor de TAG é de pelo menos 10%, tal como, por exemplo, entre 10% e 75% ou entre 10% e 30%. De preferência, estes níveis de TAG estão presentes nas partes vegetativas antes ou durante a floração da planta ou antes da fase de semeadura do desenvolvimento da planta. Nestas modalidades, é preferido que a razão do teor de TAG nas folhas para o teor de TAG nos caules da planta esteja entre 1:1 e 10:1 e/ou a razão seja aumentada em relação a uma célula correspondente compreendendo o primeiro e o segundo polinucleótidos exógenos e sem a primeira modificação genética.

[73] Nas modalidades do segundo, do terceiro, do quarto e do quinto aspectos, a célula compreende, preferencialmente, um polinucleotídeo exógeno que codifica uma DGAT e uma modificação genética que infrarregula a produção de uma SDP1 lipase endógena. Em uma modalidade, a célula não compreende um polinucleotídeo exógeno que codifica PDAT e/ou é uma célula que não seja uma célula Nicotiana benthamiana e/ou é uma célula que não seja uma célula Brassica napus. Mais preferencialmente, pelo menos um dos polinucleotídeos exógenos na célula é expresso a partir de um promotor que não é um promotor constitutivo, tal como, por exemplo, um promotor que é expresso, preferencialmente, em tecidos verdes ou caules da planta ou que é suprarregulado durante a senescência.

[74] Em uma modalidade, uma célula da invenção (incluindo a do segundo, do terceiro, do quarto e do quinto aspectos) tem uma ou mais, ou todas as seguintes características (se aplicável); i) a célula tem um aumento da síntese de ácidos graxos totais em relação a uma célula correspondente sem o primeiro polinucleotídeo exógeno, ou uma diminuição do catabolismo dos ácidos graxos totais em relação a uma célula correspondente sem o primeiro polinucleotídeo exógeno, ou ambos, de tal modo que tem um aumento do nível de ácidos graxos totais em relação a uma célula correspondente sem o primeiro polinucleotídeo exógeno, ii) a célula tem uma maior expressão e/ou atividade de uma acil graxo aciltransferase, que catalisa a síntese de TAG, DAG ou MAG, de preferência, TAG, em relação a uma célula correspondente tendo o primeiro polinucleotídeo exógeno e sem o polinucleotídeo exógeno que codifica um polinucleotídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares, iii) a célula tem uma produção reduzida de ácido lisofosfatídico (LPA) a partir de acil-ACP e G3P nos seus plastídeos em relação a uma célula correspondente tendo o primeiro polinucleotídeo exógeno e sem a modificação genética que infrarregula a produção endógena e/ou a atividade de um polipeptídeo envolvido na produção de diacilglicerol (DAG) no plastídeo na célula, iv) a célula tem uma razão alterada de ácidos graxos C16:3 e C18:3 em seu teor de ácidos graxos totais e/ou o seu teor de galactolipídeo em relação a uma célula correspondente sem o(s) polinucleotídeo(s) exógeno(s) e/ou a(s) modificação(ões) genética(s), de um modo preferido uma razão reduzida, v) a célula está em uma parte vegetativa de uma planta e compreende um teor de lipídeos totais não polares de pelo menos cerca de 8%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 11%, pelo menos cerca de 12%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, entre 8% e 75%, entre 10% e 75%, entre 11% e 75%, entre cerca de 15% e 75%, entre cerca de 20% e 75%, entre cerca de 30% e 75%, entre cerca de 40% e 75%, entre cerca de 50% e 75%, entre cerca de 60% e 75% ou entre cerca de 25% e 50% (p/p em peso seco), vi) a célula está em uma parte vegetativa de uma planta e compreende um teor de TAG de pelo menos cerca de 8%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 11%, pelo menos cerca de 12%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, entre 8% e 75%, entre 10% e 75%, entre 11% e 75%, entre cerca de 15% e 75%, entre cerca de 20% e 75%, entre cerca de 30% e 75%, entre cerca de 40% e 75%, entre cerca de 50% e 75%, entre cerca de 60% e 75%, ou entre cerca de 25% e 50% (p/p em peso seco), vii) o(s) polipeptídeo(s) de fator de transcrição é selecionado a partir do grupo que consiste de um enrugado (WRI1), frondosa cotilédone 1 (LEC1), LEC1-like, Frondoso Cotilédone 2 (LEC2), Baby boom (BBM), FUS3, ABI3, ABI4, ABI5, Dof4 e Dof11, ou o grupo que consiste em MYB73, bZIP53, AGL15, MYB115, MYB118, TANMEI, WUS, GFR2a1, GFR2a2 e PHR1, viii) o ácido oleico compreende, pelo menos, 20% (% em mol), pelo menos, 22% (% em mol), pelo menos, 30% (% em mol), pelo menos, 40% (% em mol), pelo menos, 50% (% em mol), ou pelo menos, 60% (% em mol), de um modo preferido cerca de 65% (% em mol) ou entre 20% e cerca de 65% do teor de ácidos graxos totais na célula, ix) lipídeo não polar na célula compreende um ácido graxo que compreende um grupo hidroxil, um grupo epóxi, um grupo ciclopropano, uma ligação dupla de carbono-carbono, uma ligação tripla de carbono-carbono, ligações duplas conjugadas, uma cadeia ramificada, tal como uma cadeia ramificada metilada ou hidroxilada, ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos, ou qualquer de dois, três, quatro, cinco ou seis dos grupos acima mencionados, de ligações ou cadeias ramificadas, x) lipídeo não polar na célula compreende um ou mais ácidos graxos poli-insaturados selecionados entre ácido eicosadienóico (EDA), ácido araquidônico (ARA), ácido estearidônico (SDA), ácido eicosatrienóico (ETE), ácido eicosatetraenóico (ETA), ácido eicosapentaenóico (EPA), ácido docosapentaenóico (DPA), ácido docosa-hexaenóico (DHA) ou uma combinação de dois deles, xi) a célula está em uma planta ou parte dela, de preferência uma parte vegetativa da planta, ou a célula é uma célula algácea tal como uma diatomácea (bacilariophyta), algas verdes (clorófitas), algas azul-esverdeadas (cianófitas), algas castanho-douradas (crisófitos), haptofitos, algas marrons ou algas heterokontophyta, ou a célula é de ou é um organismo apropriado para a fermentação tal como um fungo, xii) um ou mais ou todos os promotores são selecionados de um promotor diferente de um promotor constitutivo, de preferência, um promotor específico do tecido, tal como promotor específico de uma folha e/ou caule, um promotor regulado pelo desenvolvimento, tal como um promotor específico de senescência, tal como um promotor SAG12, um promotor indutível ou um promotor regulado pelo ritmo circadiano, de preferência, em que pelo menos um dos promotores operativamente ligados a um polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo de fator de transcrição é um promotor que não seja um promotor constitutivo, xiii) a célula compreende um teor de ácidos graxos totais que compreende os ácidos graxos de cadeia média, de preferência C12:0, C14:0 ou ambos, a um nível de pelo menos 5% do teor de ácidos graxos totais e, opcionalmente, um polinucleotídeo exógeno que codifica um LPAAT que tem atividade preferencial para ácidos graxos com um comprimento de cadeia média (C8 a C14), preferencialmente C12:0 ou C14:0, xiv) a célula compreende um teor de ácidos graxos totais, cujo nível de ácido oleico e/ou ácido palmítico é aumentado em pelo menos 2% em relação a uma célula correspondente sem o(s) polinucleotídeo(s) exógeno(s) e/ou a(s) modificação(ões) genética(s) e/ou cujo nível de aácido linolênico (ALA) é reduzido em pelo menos 2% em relação a uma célula correspondente sem o(s) polinucleotídeo(s) exógeno(s) e/ou a(s) modificação(ões) genética(s), xv) o lipídeo não polar na célula compreende um nível modificado de esteróis totais, de preferência esteróis livres (não esterificados), ésteres de esterol, glicosídeos de esterol, em relação ao lipídeo não polar de uma célula correspondente sem o(s) polinucleotídeo(s) exógeno(s) e/ou a(s) modificação(ões) genética(s), xvi) lipídeo não polar na célula compreende ceras e/ou ésteres de cera, xvii) a célula é um membro de uma população ou a coleta de pelo menos cerca de 1000 destas células, de preferência em uma parte da vegetativa da planta ou em uma semente, xviii) a célula compreende um polinucleotídeo exógeno que codifica um supressor de silenciamento, em que o polinucleotídeo exógeno está operativamente ligado a um promotor que é capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo na célula, xix) o nível de um ou mais lipídeos não polares e/ou o teor de lipídeos totais não polares da célula é pelo menos 2% maior em uma base de peso do que em uma célula correspondente que compreende polinucleotídeos exógenos que codificam um Arabidposis thaliana WRI1 (SEQ ID NO: 21) e um Arabidopsis thaliana DGAT1 (SEQ ID NO: 1), e xx) um teor de ácidos graxos totais poli-insaturado (PUFA), que é reduzido em relação ao teor de PUFA total de uma célula correspondente sem o(s) polinucleotídeo(s) exógeno(s) e/ou a(s) modificação(ões) genética(s).

[75] As seguintes modalidades aplicáveis à célula da invenção (incluindo o segundo, o terceiro, o quarto e o quinto aspectos), bem como os métodos de produção de células e os métodos de utilização das células. Nestas modalidades, onde a célula está em uma parte vegetativa de uma planta, é preferível que a planta esteja crescendo no solo ou tenha sido cultivada no solo.

[76] Em uma modalidade, o polipeptídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares é uma acil graxo aciltransferase, que está envolvida na biossíntese de TAG, DAG ou monoacilglicerol (MAG) na célula, de preferência de TAG na célula, tal como DGAT, PDAT, LPAAT, GPAT ou MGAT, de preferência DGAT, PDAT,

[77] Em uma modalidade o polipeptídeo envolvido no catabolismo de triacilgliceróis (TAG) na célula é uma SDP1 lipase, um polipeptídeo Cgi 58, uma acil-CoA oxidase, tal como ACX1 ou ACX2, ou um polipeptídeo envolvido na e-oxidação de ácidos graxos na célula tal como um transportador de cassete de ligação ATP peroxisomal PXA1, de preferência uma SDP1 lipase,

[78] Em uma modalidade o polipeptídeo de revestimento de corpos oleosos (OBC) é oleosina, tal como uma polioleosina ou uma caleosina, ou uma proteína associada a gotículas lipídicas (LDAP).

[79] Em uma modalidade, o polipeptídeo que aumenta a exportação de ácidos graxos para fora de plastídeos da célula é ácido graxo C16 ou C18 tioesterase, tal como um polipeptídeo FATA ou um polipeptídeo FATB, um transportador de ácido graxo, tal como um polipeptídeo ABCA9 ou acil-CoA de cadeia longa sintetase (LACS),

[80] Em uma modalidade, a polipeptídeo envolvido na importação de ácidos graxos em plastídeos da célula é um transportador de ácidos graxos, ou subunidade do mesmo, de preferência um polipeptídeo TGD tal como, por exemplo, um polipeptídeo TGD1, um polipeptídeo TGD2, um polipeptídeo TGD3, ou um polipeptídeo TGD4.

[81] Em uma modalidade o polipeptídeo envolvido na produção de diacilglicerol (DAG) no plastídeo é um GPAT plastidial, uma LPAAT plastidial ou um PAP plastidial.

[82] Em uma modalidade, a célula é a partir de ou em uma planta 16:3, ou em uma parte vegetativa ou semente da mesma, e que compreende uma ou mais ou todas as seguintes características; a) um polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo que aumenta a exportação de ácidos graxos para fora dos plastídeos da célula quando comparado com uma célula correspondente sem o quarto polinucleotídeo exógeno, b) uma primeira modificação genética que infrarregula a produção e/ou a atividade de um polipeptídeo envolvido na importação de ácidos graxos em plastídeos da célula quando comparado com uma célula correspondente sem a primeira modificação genética endógena, e c) uma segunda modificação genética que infrarregula a produção endógena e/ou a atividade de um polipeptídeo envolvido na produção de diacilglicerol (DAG) no plastídeo quando comparado a uma célula correspondente sem a segunda modificação genética. em que o polinucleotídeo exógeno é operativamente ligado a um promotor capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo na célula.

[83] Em uma modalidade alternativa, a célula é de ou em uma planta 18:3 ou em uma parte vegetativa ou semente da mesma.

[84] Em uma modalidade a célula é de uma folha, caule, ou raiz de planta, antes da panta florescer, e a célula compreende um teor de lipídeos totais não polar de, pelo menos, cerca de 8%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 11%, entre 8% e 15% ou entre 9% e 12% (p/p em peso seco). Em uma modalidade, o teor de lipídeos totais não polares da célula é pelo menos 3%, mais preferencialmente pelo menos 5% maior, do que o teor de lipídeos não polares totais em uma célula correspondente transformada com genes que codificam um WRI1 e uma DGAT, mas que não tem outros polinucleotídeos exógenos e modificações genéticas, como aqui descrito para o segundo, o terceiro, o quarto e o quinto aspectos. Mais preferivelmente, este grau de aumento está em uma célula em um caule ou raiz da planta.

[85] Em uma modalidade, a adição de um ou mais dos polinucleotídeos exógenos ou modificações genéticas, de preferência o polinucleotídeo exógeno que codifica uma OBC ou uma acil graxo tioesterase ou a modificação genética que infrarregula a produção endógena e/ou a atividade de um polipeptídeo envolvido no catabolismo de triacilgliceróis (TAG) na célula, mais preferencialmente o polinucleotídeo exógeno que codifica uma FATA tioesterase ou um LDAP ou que diminui a expressão de uma lipase TAG endógena, tal como uma SDP1 TAG lipase na célula, resulta em um aumento sinérgico no teor de lipídeos totais não polar da célula quando adicionado ao par de transgenes WRI1 e DGAT, particularmente antes da planta florescer e ainda mais particularmente nos caules e/ou raízes da planta. Por exemplo, ver Exemplos 8, 11 e 15. Em uma modalidade preferida, o aumento no teor de TAG da célula em um caule ou uma raiz da planta é pelo menos 2 vezes, mais preferencialmente pelo menos 3 vezes, em relação a uma célula correspondente transformada com genes que codificam WRI1 e DGAT1, mas sem a FATA tioesterase, o LDAP e a modificação genética que infrarregula a produção e/ou atividade endógena de um polipeptídeo envolvido no catabolismo de triacilgliceróis (TAG) na célula. Mais preferencialmente, pelo menos, o promotor que dirige a expressão do primeiro polinucleotídeo exógeno é um promotor que não é um promotor constitutivo.

[86] A modificação genética pode ser qualquer mudança para uma célula de ocorrência natural que alcance o efeito desejado. Métodos de modificar geneticamente células que são bem conhecidas na técnica. Em uma modalidade, cada uma das uma ou mais ou todas as modificações genéticas é uma mutação de um gene endógeno que inativa parcialmente ou completamente o gene, de preferência uma mutação introduzida, tal como uma mutação pontual, uma inserção ou uma deleção (ou uma combinação de um ou mais destes). A mutação pontual pode ser um códon de parada prematura, uma mutação no sítio de junção, uma mutação de deslocamento de estrutura ou uma mutação de substituição de aminoácidos que reduz a atividade do gene ou do polipeptídeo codificado. A deleção pode ser de um ou mais nucleotídeos dentro de um éxon transcrito ou promotor do gene, ou estender-se através ou em mais de um éxon, ou estender-se à deleção do gene completo. De preferência, a deleção é introduzida pela utilização de tecnologias ZF, TALEN ou CRISPR. Em uma modalidade, uma ou mais ou todas as modificações genéticas é um polinucleotídeo exógeno que codifica uma molécula de RNA que inibe a expressão do gene endógeno, em que o polinucleotídeo exógeno está operativamente ligado a um promotor que é capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo na célula. Exemplos de polinucleotídeos exógenos que reduzem a expressão de um gene endógeno são selecionados do grupo consistindo em um polinucleotídeo antissenso, um polinucleotídeo de sentido, um microRNA, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que liga a enzima endógena, uma molécula de RNA de cadeia dupla e uma molécula de RNA processado derivada da mesma. Em uma modalidade, a célula compreende modificações genéticas que são uma mutação introduzida em um gene endógeno e um polinucleotídeo exógeno que codifica uma molécula de RNA que reduz a expressão de outro gene endógeno.

[87] Em uma modalidade, o polinucleotídeo exógeno que codifica WRI1 compreende um ou mais dos seguintes: 1) nucleotídeos que codificam um polipeptídeo compreendendo aminoácidos cuja sequência é apresentada como qualquer das SEQ ID NO: 21 a 75 ou 205 a 210, ou um fragmento biologicamente ativo dos mesmos ou um polipeptídeo cuja sequência de aminoácidos é pelo menos 30% idêntica a qualquer uma ou mais das SEQ ID NOs: 21 a 75 ou 205 a 210, ii)nucleotídeo cuja sequência é pelo menos 30% idêntica a i), e 111) nucleotídeos que hibridizam com i) e/ou ii) sob condições rigorosas. De preferência, o polipeptídeo WRI1 é um polipeptídeo WRI1 diferente de Arabidopsis thaliana WRI1 (SEQ ID NOs:21 ou 22). Mais preferencialmente, o polipeptídeo WRI1 compreende aminoácidos cuja sequência é apresentada como SEQ ID NO: 208, ou um fragmento biologicamente ativo do mesmo, ou um polipeptídeo cuja sequência de aminoácidos é pelo menos 30% idêntica àquela.

[88] Em uma modalidade do segundo, terceiro, quarto ou quinto aspectos, a célula recombinante é uma célula de um tubérculo de batata (Solanum tuberosum), uma célula de uma beterraba ou folha de beterraba sacarina (Beta vulgaris), uma célula de um caule ou uma folha de cana de açúcar (Saccharum sp.) ou sorgo (Sorghum bicolor), uma célula de endosperma de uma planta monocotiledônea, em que a célula tem um teor de ácidos graxos totais aumentado em relação a uma célula de endosperma de tipo selvagem correspondente tal como, por exemplo, uma célula de grão de trigo (Triticum aestivum, grão de arroz (Oryza sp.) ou uma semente de milho (Zea mays), uma célula de uma semente de Brassica sp. tendo um teor de ácidos graxos totais aumentado, tal como, por exemplo, uma semente de canola, ou uma célula de uma semente de leguminosa com um teor aumentado de ácidos graxos totais, tal como, por exemplo, uma semente de soja (Glycine max).

[89] Em um sexto aspecto, a presente invenção fornece um organismo não humano, ou uma parte do mesmo, compreendendo ou consistindo em uma ou mais células da invenção.

[90] Em uma modalidade, a parte do organismo não humano é uma semente, fruta ou uma parte vegetativa de uma planta, tal como uma parte aérea da planta ou uma parte verde, tal como uma folha ou caule.

[91] Em uma outra modalidade, o organismo não humano é um organismo fototrófico, tal como, por exemplo, uma planta ou uma alga, ou um organismo adequado para fermentação tal como, por exemplo, um fungo.

[92] Em um sétimo aspecto, a presente invenção fornece uma planta transgênica, ou parte da mesma, de preferência uma parte vegetativa da planta, compreendendo a) um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na planta, b) um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um polinucleotídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares e qualquer um ou dois ou todos os três de c) uma modificação genética que infrarregula a produção endógena e/ou a atividade de um polinucleotídeo envolvido no catabolismo de triacilgliceróis(TAG) na planta, quando comparado com uma planta correspondente sem a modificação genética, d) um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo que aumenta a exportação de ácidos graxos para fora dos plastídeos da célula quando comparado com uma célula correspondente sem o quarto polinucleotídeo exógeno, e e) um quarto polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na planta, em que o polinucleotídeo exógeno é operativamente ligado a um promotor capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo na planta.

[93] Em uma modalidade, a planta ou parte da mesma, compreende a), b) e c), e eventualmente d) ou e).

[94] Em uma modalidade, a planta ou parte da mesma compreende a), b) e d), e opcionalmente c) ou e).

[95] Em uma modalidade, a planta ou parte da mesma, compreende a), b) e e), e opcionalmente c) ou d).

[96] Em uma modalidade preferida, a presença de c), d) ou e), em conjunto com a) e b) aumenta o teor de lipídeos totais não polares da planta ou parte da mesma, de preferência uma parte vegetativa da planta, tal como uma folha, uma raiz, ou um caule, em relação a uma planta ou parte correspondente, que compreende a) e b), mas que não tem cada um de c), d) e e). Mais preferivelmente, o aumento é sinérgico. Mais preferencialmente, pelo menos, o promotor que dirige a expressão do primeiro polinucleotídeo exógeno é um promotor que não é um promotor constitutivo.

[97] Em uma modalidade, a planta, ou parte da mesma, compreende ainda um ou mais ou todos os a) um quinto polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo de revestimento de corpos oleosos (OBC), de preferência um LDAP, b) uma segunda modificação genética que infrarregula a produção e/ou a atividade de um polipeptídeo envolvido na importação de ácidos graxos em plastídeos da planta quando comparado com uma planta correspondente sem a segunda modificação genética endógena, e c) uma terceira modificação genética que infrarregula a produção endógena e/ou a atividade de um polipeptídeo envolvido na produção de diacilglicerol (DAG) no plastídeo quando comparado a uma planta correspondente sem a terceira modificação genética.

[98] Em uma modalidade, a planta transgênica, ou parte da mesma, compreende a) um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na planta, expressos preferencialmente a partir de um promotor diferente de um promotor constitutivo, b) um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um polinucleotídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares e c) uma modificação genética que infrarregula a produção endógena e/ou a atividade de um polinucleotídeo envolvido no catabolismo de triacilgliceróis(TAG) na planta, quando comparado com uma planta correspondente sem a modificação genética, em que cada polinucleotídeo exógeno está operativamente ligado a um promotor que é capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo na célula, e, opcionalmente, a planta, ou parte da mesma compreende um ou mais ou todos de d) um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo de revestimento de corpos oleosos (OBC), de preferência um LDAP, e) um quarto polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo que aumenta a exportação de ácidos graxos para fora dos plastídeos da planta quando comparado com uma célula correspondente sem o quarto polinucleotídeo exógeno, f) uma segunda modificação genética que infrarregula a produção e/ou a atividade de um polipeptídeo envolvido na importação de ácidos graxos em plastídeos da planta quando comparado com uma planta correspondente sem a segunda modificação genética endógena, e g) uma terceira modificação genética que infrarregula a produção endógena e/ou a atividade de um polipeptídeo envolvido na produção de diacilglicerol (DAG) no plastídeo quando comparado a uma planta correspondente sem a terceira modificação genética.

[99] Em uma modalidade, a parte é uma parte vegetativa e um ou mais ou todos os promotores são expressos a um nível superior na parte vegetativa em relação à semente da planta.

[100] Em uma modalidade, o polipeptídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares é DGAT ou PDAT e o polipeptídeo envolvido no catabolismo de TAG na planta é uma SDP1 lipase.

[101] Em uma modalidade, o polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na planta é um polipeptídeo WRI1 e o polipeptídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares é DGAT ou PDAT.

[102] Em uma modalidade, o polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na planta é um polipeptídeo WRI1, um polipeptídeo LEC2, um polipeptídeo LEC1 ou um polipeptídeo semelhante a LEC-1 e o polipeptídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares é DGAT.

[103] Em uma modalidade, o polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na planta é um polipeptídeo WRI1, um polipeptídeo LEC2, um polipeptídeo LEC1 ou um polipeptídeo semelhante a LEC-1 e o polipeptídeo envolvido no catabolismo de triacilgliceróis (TAG) na planta é uma SDP1 lipase.

[104] Em uma modalidade, o polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na planta é um polipeptídeo WRI1, um polipeptídeo LEC2, um polipeptídeo LEC1 ou um polipeptídeo semelhante a LEC-1, na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares é DGAT ou PDAT e o polipeptídeo envolvido no catabolismo de triacilgliceróis (TAG) na planta é uma SDP1 lipase.

[105] Em uma modalidade, quando presentes, os dois fatores de transcrição são WRI1 e LEC2 ou WRI1 e LEC1.

[106]Nas modalidades acima, é preferível que a planta esteja crescendo em solo ou seja cultivada em solo e a sua parte seja subsequentemente colhida. De um modo preferido, uma parte vegetativa da planta compreende, pelo menos, 8% de TAG em uma base de peso (% de peso seco) tal como, por exemplo, entre 8% e 75% ou entre 8% e 30%. Mais preferivelmente, o teor de TAG é de pelo menos 10%, tal como, por exemplo, entre 10% e 75% ou entre 10% e 30%. De preferência, estes níveis de TAG estão presentes nas partes vegetativas antes ou durante a floração da planta ou antes da fase de semeadura do desenvolvimento da planta. Nestas modalidades, é preferido que a razão do teor de TAG nas folhas para o teor de TAG nos caules da planta esteja entre 1:1 e 10:1 e/ou a razão seja aumentada em relação a uma célula correspondente compreendendo o primeiro e o segundo polinucleótidos exógenos e sem a primeira modificação genética.

[107]Nas modalidades acima, o teor de lipídeos totais não polares da planta ou parte da mesma é preferencialmente pelo menos 3%, mais preferencialmente pelo menos 5% maior do que o teor de lipídeos totais não polares em uma planta correspondente ou parte da mesma transformada com genes que codificam um WRI1 e uma DGAT, mas sem os outros polinucleotídeos exógenos e modificações genéticas, tais como aqui descrito. Mais preferivelmente, este grau de aumento está nos tecidos do caule ou da raiz da planta.

[108]Nas modalidades acima, a adição de um ou mais dos polinucleotídeos exógenos ou modificações genéticas, de preferência o polinucleotídeo exógeno que codifica uma OBC ou uma acil graxo tioesterase ou a modificação genética que infrarregula a produção endógena e/ou a atividade de um polipeptídeo envolvido no catabolismo de triacilgliceróis (TAG) na célula, mais preferencialmente o polinucleotídeo exógeno que codifica uma FATA tioesterase ou um LDAP ou que diminui a expressão de uma lipase TAG endógena, tal como uma SDP1 TAG lipase na célula, resulta em um aumento sinérgico no teor de lipídeos totais não polares da célula quando adicionado ao par de transgenes WRI1 e DGAT, particularmente antes da planta florescer e ainda mais particularmente nos caules e/ou raízes da planta. Por exemplo, ver Exemplos 8, 11 e 15. Em uma modalidade preferida, o aumento no teor de TAG dos tecidos da folha, do caule ou da raiz, ou de todos os três, é pelo menos 2 vezes, mais preferencialmente pelo menos 3 vezes, em relação a uma parte correspondente transformada com genes que codificam WRI1 e DGAT1, mas sem o polinucleotídeo exógeno que codifica a OBC ou a ácido graxo tioesterase e a modificação genética que infrarregula a produção e/ou a atividade endógena de um polipeptídeo envolvido no catabolismo de triacilgliceróis (TAG) na célula.

[109]Nas modalidades acima, a célula compreende, preferencialmente, um polinucleotídeo exógeno que codifica uma DGAT e uma primeira modificação genética que infrarregula a produção de uma SDP1 lipase endógena. Mais de preferência, a planta ou parte da mesma não compreende um polinucleotídeo exógeno que codifica PDAT e/ou é uma planta ou parte da mesma que não seja de Nicotiana benthamiana e/ou Brassica napuse/ou o WRI1 é um WRI1 diferente de Arabidopsis thaliana WRI1 (SEQ ID NOs: 21 ou 22). Em uma modalidade, a planta é diferente de cana de açúcar-de-açúcar. Mais preferencialmente, pelo menos um dos polinucleotídeos exógenos na planta é expresso a partir de um promotor que não é um promotor constitutivo, tal como, por exemplo, um promotor que é expresso, preferencialmente, em tecidos verdes ou caules da planta ou que é suprarregulado após o início da floração ou durante a senescência. De um modo preferido, pelo menos, o primeiro polinucleotídeo exógeno (que codifica um fator de transcrição) é expresso a partir de um tal promotor.

[110] Em um oitavo aspecto, a presente invenção fornece uma planta transgênica, ou parte da mesma, de preferência uma parte vegetativa da planta, compreendendo a) um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na planta, b) um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um polinucleotídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares e c) um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo de revestimento de corpos oleosos (OBC), de preferência um LDAP, em que cada polinucleotídeo exógeno está operativamente ligado a um promotor que é capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo na planta e em que a planta tem um nível aumentado de um ou mais lipídeos não polares e/ou um aumento da quantidade do polipeptídeo OBC, em relação a uma célula correspondente que compreende um terceiro polinucleotídeo exógeno cuja sequência nucleotídica é o complemento da sequência proporcionada como SEQ ID NO:176.

[111] Em uma modalidade preferida, a presença do terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica o polipeptídeo OBC, em conjunto com o primeiro e o segundo polinucleotídeos exógenos, aumenta o teor de lipídeos totais não polares da planta ou de parte da mesma, de preferência uma parte vegetativa da planta, tal como uma folha, raiz ou caule, em relação a uma parte da planta correspondente que compreende o primeiro e o segundo polinucleotídeos exógenos, mas sem o terceiro polinucleotídeo exógeno. Mais preferivelmente, o aumento é sinérgico. Mais preferencialmente, pelo menos, o promotor que dirige a expressão do primeiro polinucleotídeo exógeno é um promotor que não é um promotor constitutivo.

[112] Em uma modalidade do oitavo aspecto, a planta, ou parte da mesma, compreende ainda um ou mais ou todos de d) uma primeira modificação genética que infrarregula a produção endógena e/ou a atividade de um polinucleotídeo envolvido no catabolismo de triacilgliceróis (TAG) na planta, quando comparado com uma célula correspondente sem a primeira modificação genética, e) um quarto polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo que aumenta a exportação de ácidos graxos para fora dos plastídeos da planta quando comparado com uma célula correspondente sem o quarto polinucleotídeo exógeno, f) uma segunda modificação genética que infrarregula a produção e/ou a atividade de um polipeptídeo envolvido na importação de ácidos graxos em plastídeos da planta quando comparado com uma planta correspondente sem a segunda modificação genética endógena, e g) uma terceira modificação genética que infrarregula a produção endógena e/ou a atividade de um polipeptídeo envolvido na produção de diacilglicerol (DAG) no plastídeo quando comparado a uma planta correspondente sem a terceira modificação genética.

[113] Em uma modalidade, o polipeptídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares é DGAT ou PDAT e o polipeptídeo OBC é uma oleosina. Alternativamente, o polipeptídeo OBC é um LDAP.

[114] Em uma modalidade, o polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na planta é um polipeptídeo WRI1 e o polipeptídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares é DGAT ou PDAT.

[115] Em uma modalidade, o polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na planta é um polipeptídeo WRI1, um polipeptídeo LEC2, um polipeptídeo LEC1 ou um polipeptídeo semelhante a LEC-1 e o polipeptídeo OBC é uma oleosina. Alternativamente, o polipeptídeo OBC é um LDAP.

[116] Em uma modalidade, o polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na planta é um polipeptídeo WRI1, um polipeptídeo LEC2, um polipeptídeo LEC1 ou um polipeptídeo semelhante a LEC-1 e o polipeptídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares é DGAT ou PDAT e o polipeptídeo OBC é uma oleosina. Alternativamente, o polipeptídeo OBC é um LDAP.

[117] Em uma modalidade, a célula compreende dois polinucleotídeos exógenos que codificam dois polipeptídeos de fator de transcrição diferentes que aumentam a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na planta, tais como WRI1 e LEC2 ou WRI1 e LEC1.

[118] Em um nono aspecto, a presente invenção fornece uma planta transgênica ou parte da mesma, de preferência uma parte de planta vegetativa, compreendendo um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos de ácidos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na planta e um ou mais ou todos de; a) um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo que aumenta a exportação de ácidos graxos para fora dos plastídeos da planta quando comparado com uma célula correspondente sem o quarto polinucleotídeo exógeno, b) uma primeira modificação genética que infrarregula a produção e/ou a atividade de um polipeptídeo envolvido na importação de ácidos graxos em plastídeos da planta quando comparado com uma célula correspondente sem a primeira modificação genética endógena, e c) uma segunda modificação genética que infrarregula a produção endógena e/ou a atividade de um polipeptídeo envolvido na produção de diacilglicerol (DAG) no plastídeo quando comparado a uma planta correspondente sem a segunda modificação genética. em que o polinucleotídeo exógeno é operativamente ligado a um promotor capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo na planta.

[119] Em uma modalidade, a planta ou parte da mesma, de preferência uma parte de planta vegetativa da planta, compreende a) e opcionalmente b) ou c).

[120] Em uma modalidade do nono aspecto, a planta, ou parte da mesma, compreende ainda um ou mais ou todos de d) um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica um polinucleotídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares, e) uma terceira modificação genética que infrarregula a produção endógena e/ou a atividade de um polinucleotídeo envolvido no catabolismo de triacilgliceróis (TAG) na planta, quando comparado com uma célula correspondente sem a modificação genética, e f) um quarto polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo de revestimento de corpos oleosos (OBC), de preferência um LDAP.

[121] Em uma modalidade preferida, a planta ou parte da mesma, preferivelmente uma parte vegetativa da planta, compreende o primeiro, o segundo e o terceiro polinucleotídeos exógenos e, opcionalmente, a terceira modificação genética ou o quarto polinucleotídeo exógeno.

[122] Em uma modalidade preferida, a presença do segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo que aumenta a exportação de ácidos graxos para fora dos plastídeos da célula, que é preferencialmente acil graxo tioesterase, tal como um polipeptídeo FATA, em conjunto com o primeiro e, se presente,os terceiros polinucleotídeos exógenos aumentam o teor de lipídeos totais não polares da parte da planta, de preferência uma parte vegetativa da planta, tal como uma folha, raiz ou caule, em relação a uma parte da planta correspondente que compreende o primeiro e, se presente, o terceiro polinucleótidos exógenos, mas não tem o segundo polinucleotídeo exógeno. Mais preferivelmente, o aumento fornecido pelo segundo polinucleotídeo exógeno é sinérgico. Mais preferencialmente, pelo menos, o promotor que dirige a expressão do primeiro polinucleotídeo exógeno é um promotor que não é um promotor constitutivo.

[123] Em uma modalidade, o polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na planta é um polipeptídeo WRI1, um polipeptídeo LEC2, um polipeptídeo LEC1 ou um polipeptídeo semelhante a LEC1 e o polipeptídeo envolvido na importação de ácidos graxos em plastídeos da célula é um polipeptídeo TGD.

[124] Em uma modalidade, o polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na planta é um polipeptídeo WRI1, um polipeptídeo LEC2, um polipeptídeo LEC1 ou um polipeptídeo semelhante a LEC1 e o polipeptídeo envolvido na produção de diacilglicerol (DAG) é um GPAT plastidial.

[125] Em uma modalidade, o polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na célula é um polipeptídeo WRI1, um polipeptídeo LEC2, um polipeptídeo LEC1 ou um polipeptídeo semelhante a LEC1 e o polipeptídeo que aumenta a exportação de ácido graxos para fora dos plastídeos da planta é ácido graxo tioesterase, preferivelmente um polipeptídeo FATA ou FATB e o polipeptídeo envolvido na importação de ácidos graxos para os plastídeos da planta é um polipeptídeo TGD.

[126] Em uma modalidade, o polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na planta é um polipeptídeo WRI1, um polipeptídeo LEC2, um polipeptídeo LEC1 ou um polipeptídeo semelhante a LEC1 o polipeptídeo que aumenta a exportação de ácidos graxos para fora dos plastídeos da planta é ácido graxo tioesterase, de preferência um polipeptídeo FATA ou FATB e o polipeptídeo envolvido na produção de diacilglicerol (DAG) é um GPAT plastidial.

[127] Em uma modalidade, o polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na planta é um polipeptídeo WRI1, um polipeptídeo LEC2, um polipeptídeo LEC1 ou um polipeptídeo semelhante a LEC1, e o polipeotídeo envolvido na importação de ácidos graxos em plastídeos da planta é o polipeptídeo TGD e o polipeptídeo envolvido na produção de diacilglicerol (DAG) é um GPAT platidial.

[128] Em uma modalidade, a planta compreende dois polinucleotídeos exógenos que codificam dois polipeptídeos de fator de transcrição diferentes que aumentam a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na célula, tais como WRI1 e LEC2 ou WRI1 e LEC1.

[129] Em modalidades do sétimo, oitavo e nono aspectos, em que a planta compreende um polinucleotídeo exógeno que codifica a ácido graxo tioesterase, tais como, por exemplo, um polipeptídeo FATA ou FATB, a tioesterase é preferivelmente um polipeptídeo FATA ou ácido graxo tioesterase diferente de ácido graxo de cadeia média tioesterase.

[130] Em um nono aspecto, a presente invenção fornece uma planta transgênica, ou parte da mesma, de preferência uma parte vegetativa, compreendendo a) primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na planta, preferivelmente um fator de transcrição WRI, b) um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares, que é um LPAAT com atividade preferencial para ácidos graxos com um comprimento de cadeia média (C8 a C14)e c) um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo que aumenta a exportação de ácidos graxos de C8 a C14 para fora dos plastídeos da planta quando comparados com uma célula correspondente sem o terceiro polinucleotídeo exógeno, em que o polinucleotídeo exógeno é operativamente ligado a um promotor capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo na planta.

[131] Em uma modalidade preferida, a presença do terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo que aumenta a exportação de ácidos graxos de C8 a C14 para fora de plastídeos da célula, juntamente com o primeiro e o segundo polinucleotídeos exógenos aumenta o teor de MCFA total da parte da planta, preferencialmente uma parte vegetativa da planta, tais como uma folha, raiz ou caule, em relação a uma parte da planta correspondente que compreende o primeiro e o segundo polinucleotídeo exógenos, mas que não tem o terceiro polinucleotídeo exógeno. Mais preferivelmente, o aumento fornecido pelo terceiro polinucleotídeo exógeno é sinérgico. Mais preferencialmente, pelo menos, o promotor que dirige a expressão do primeiro polinucleotídeo exógeno é um promotor que não é um promotor constitutivo.

[132] Em uma modalidade do décimo aspecto, a planta transgênica, ou parte da mesma, compreende ainda um ou mais ou todos de d) um quarto polinucleotídeo exógeno que codifica ainda um polinucleotídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares, e) uma primeira modificação genética que infrarregula a produção endógena e/ou a atividade de um polinucleotídeo envolvido no catabolismo de triacilgliceróis (TAG) na planta, quando comparado com uma célula correspondente sem a primeira modificação genética, f) um quinto polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo de revestimento de corpos oleosos (OBC), de preferência um LDAP. g) uma segunda modificação genética que infrarregula a produção e/ou a atividade de um polipeptídeo envolvido na importação de ácidos graxos em plastídeos da planta quando comparado com uma planta correspondente sem a segunda modificação genética endógena, e h) uma terceira modificação genética que infrarregula a produção endógena e/ou a atividade de um polipeptídeo envolvido na produção de diacilglicerol (DAG) no plastídeo quando comparado a uma planta correspondente sem a terceira modificação genética. em que o polinucleotídeo exógeno é operativamente ligado a um promotor capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo na planta.

[133] Em uma forma de realização do décimo aspecto, o fator de transcrição não é Arabidopsis thaliana WRI1 (SEQ ID NOs: 21 ou 22) e/ou a planta não é N. benthamiana.

[134] Em uma modalidade do décimo aspecto, o polinucleotídeo exógeno que codifica LPAAT compreende os aminoácidos cuja sequência é apresentada como SEQ ID NO: 200, ou um fragmento biologicamente ativo dos mesmos ou um LPAAT polipeptídeo cuja sequência de aminoácidos é pelo menos 30% idêntica a estes.

[135] Em uma modalidade do décimo aspecto, um ou mais ou todos os promotores são expressos a um nível superior na parte vegetativa em relação à semente da planta, de preferência incluindo pelo menos o promotor que expressa o primeiro polinucleotídeo exógeno.

[136] Em uma modalidade do décimo aspecto, o ácido graxo com um comprimento de cadeia média é pelo menos o ácido mirístico (C14:0). Em uma modalidade preferida, a parte da planta compreende um teor de ácido mirístico de pelo menos cerca de 8%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 11%, pelo menos cerca de 12%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, entre 8% e 25%, entre 8% e 20%, entre 10% e 25%, entre 11% e 25%, entre cerca de 15% e 25%, entre cerca de 20% e 25%, (p/p de peso seco).

[137]Nas modalidades do sexto, sétimo, oitavo, nono e décimo aspectos, é preferível que a planta esteja crescendo em solo ou tenha sido cultivada em solo e a parte da planta, de preferência a parte vegetativa da planta, seja subsequentemente colhida, e em que a parte da planta compreende pelo menos 8% de TAG em uma base de peso (% de peso seco), tal como por exemplo entre 8% e 75% ou entre 8% e 30%. Mais preferivelmente, o teor de TAG é de pelo menos 10%, tal como, por exemplo, entre 10% e 75% ou entre 10% e 30%. De preferência, estes níveis de TAG estão presentes nas partes vegetativas antes ou durante a floração da planta ou antes da fase de semeadura do desenvolvimento da planta. Nestas modalidades, é preferido que a razão do teor de TAG nas folhas para o teor de TAG nos caules da planta esteja entre 1:1 e 10:1 e/ou a razão seja aumentada em relação a uma célula correspondente compreendendo o primeiro e o segundo polinucleótidos exógenos e sem a primeira modificação genética.

[138]Nas modalidades do sexto, sétimo, oitavo, nono e décimo aspectos, a planta ou parte da mesma, preferencialmente compreende um polinucleotídeo exógeno que codifica uma DGAT e uma modificação genética que infrarregula a produção de uma lipase SDP1 endógena. Em uma modalidade preferida, a planta ou parte da mesma não compreende um polinucleotídeo exógeno que codifica PDAT e/ou é uma planta diferente da planta Nicotiana benthamiana. Mais preferencialmente, pelo menos um dos polinucleotídeos exógenos na planta é expresso a partir de um promotor que não é um promotor constitutivo, tal como, por exemplo, um promotor que é expresso, preferencialmente, em tecidos verdes ou caules da planta ou que é suprarregulado durante a senescência.

[139] Em um décimo primeiro aspecto, a presente invenção fornece uma planta compreendendo uma parte vegetativa, ou a parte vegetativa da mesma, em que a parte vegetativa tem um teor de lipídeos totais não polares de pelo menos cerca de 18%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, entre 18% e 75%, entre cerca de 20% e 75%, entre cerca de 30% e 75%, entre cerca de 40% e 75%, entre cerca de 50% e 75%, entre cerca de 60% e 75%, ou entre cerca de 25% e 50% (p/p de peso seco), em que o lipídeo não polar compreende pelo menos 90% de triacilgliceróis (TAG).

[140] Em modalidades preferidas, a parte vegetativa da planta é caracterizada por características como descritas no sétimo, oitavo, nono e décimo aspectos. A planta é de preferência uma planta 18:3.

[141] Em uma modalidade dos aspectos acima, a célula vegetal ou parte de planta tem sido tratada de modo que já não possa ser propagada ou dar origem a uma planta viva, isto é, está morta. Por exemplo, a célula vegetal ou parte da planta foi seca e/ou triturada.

[142] Em um décimo segundo aspecto, a presente invenção fornece uma planta compreendendo uma parte vegetativa, ou a parte vegetativa da mesma, em que a parte vegetativa tem um teor de TAG de pelo menos cerca de 18%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, entre 18% e 75%, entre cerca de 20% e 75%, entre cerca de 30% e 75%, entre cerca de 40% e 75%, entre cerca de 50% e 75%, entre cerca de 60% e 75%, ou entre cerca de 25% e 50% (p/p de peso seco), em que o lipídeo não polar compreende pelo menos 90% de triacilgliceróis (TAG). A planta é de preferência uma planta 18:3.

[143] Em um décimo terceiro aspecto, a presente invenção fornece uma planta compreendendo uma parte vegetativa, ou a parte vegetativa da mesma, em que a parte vegetativa tem um teor de lipídeos totais não polares é de pelo menos 8%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 11%, pelo menos cerca de 12%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, entre 8% e 75%, entre 10% e 75%, entre 11% e 75%, entre cerca de 15% e 75%, entre cerca de 20% e 75%, entre cerca de 30% e 75%, entre cerca de 40% e 75%, entre cerca de 50% e 75%, entre cerca de 60% e 75%, ou entre cerca de 25% e 50% (p/p de peso seco), em que o lipídeo não polar compreende, pelo menos, 90% de triacilgliceróis (TAG), e em que a planta é uma planta 16:3 ou parte vegetativa da mesma.

[144] Em um décimo quarto aspecto, a presente invenção fornece uma planta compreendendo uma parte vegetativa, ou a parte vegetativa da mesma, em que a parte vegetativa tem um teor de TAG de pelo menos 8%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 11%, pelo menos cerca de 12%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, entre 8% e 75%, entre 10% e 75%, entre 11% e 75%, entre cerca de 15% e 75%, entre cerca de 20% e 75%, entre cerca de 30% e 75%, entre cerca de 40% e 75%, entre cerca de 50% e 75%, entre cerca de 60% e 75%, ou entre cerca de 25% e 50% (p/p de peso seco), em que o lipídeo não polar compreende, pelo menos, 90% de triacilgliceróis (TAG), e em que a planta é uma planta 16:3 ou parte vegetativa da mesma.

[145] Em uma modalidade, a célula da invenção (incluindo o segundo, terceiro, quarto e quinto aspectos) é uma célula das seguintes espécies ou gêneros,ou a planta ou parte da mesma da invenção (incluindo o sexta, sétimo, oitavo, nono, décimo, décimo primeiro, décimo segundo, décimo terceiro e décimo quarto aspectos) é Acrocomia aculeata (palmeira macaúba), Arabidopsis thaliana, Aracinis hypogaea (amendoi), Astrocaryum murumuru (murumuru), Astrocaryum vulgare (tucumã), Attalea geraensis (Indaiá-rateiro), Attalea humilis (Óleo de palma americano), Attalea oleifera (andaiá), Attalea phalerata (uricuri), Attalea speciosa (babaçu), Avena sativa (aveias), Beta vulgaris (beterraba sacarina), Brassica sp. tais como, por exemplo, Brassica carinata, Brassica juncea, Brassica napobrassica, Brassica napus (canola), Camelina sativa (falso linho), Cannabis sativa (cânhamo), Carthamus tinctorius (cártamo), Caryocar brasiliense (pequi), Cocos nucifera (Cêco), Crambe abyssinica (Abyssinian kale), Cucumis melão (melão), Elaeis guineensis (Palmeira africana de açúcar), Glycine max (soja), Gossypium hirsutum (algodão), Helianthus sp. tais como Helianthus annuus (girassol), Hordeum vulgare (cevada), Jatropha curcas (nóz física), Joannesia princeps (indaguaçu), Lemna sp. (lentilha), tais como Lemna aequinoctialis, Lemna disperma, Lemna ecuadoriensis, Lemna gibba (lentilha de água inchada), Lemna japonica, Lemna minor, Lemna minuta, Lemna obscura, Lemna paucicostata, Lemna perpusilla, Lemna tenera, Lemna trisulca, Lemna turionifera, Lemna valdiviana, Lemna yungensis, Licania rigida (oiticica), Linum usitatissimum (linho), Lupinus angustifolius (tremoço), Mauritia flexuosa (palmeira buritu), Maximiliana maripa (palmeira inajá), Miscanthus sp. tais comoMiscanthus x giganteus e Miscanthus sinensis, Nicotiana sp. (tabaco), tais como Nicotiana tabacum ou Nicotiana benthamiana, Oenocarpus bacaba (bacaba-do-azeite), Oenocarpus bataua (patauã), Oenocarpus distichus (bacaba-de-leque), Oryza sp. (arroz) tais como Oryza sativa e Oryza glaberrima, Panicum virgatum (painço amarelo), Paraqueiba paraensis (mari), Persea amencana de açúcar (abacate), Pongamia pinnata (Faia indiana), Populus trichocarpa, Ricinus communis (castor), Saccharum sp. (cana de açúcar-de-ácucar), Sesamum indicum (sésamo), Solanum tuberosum (batata), Sorghum sp. tais como Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, Theobroma grandiforum (cupuaçu), Trifolium sp., Trithrinax brasiliensis (Palmeira de algulha brasileira), Triticum sp. (trigo), tais como Triticum aestivum e Zea mays (milho).

[146] Em um décimo quinto aspecto, a presente invenção fornece uma planta de batata, ou parte da mesma, de um modo preferido um tubérculo que tem um diâmetro de, pelo menos, 2 centímetros, e tem um teor de TAG de pelo menos 0,5% em uma base de peso seco e/ou um teor de ácidos graxos totais de pelo menos 1%, de preferência pelo menos 1,5% ou, pelo menos, 2,0%, em uma base de peso seco. O tubérculo de batata tem preferencialmente um nível aumentado de ácidos graxos monoinsaturados (MUFA) e/ou um nível mais baixo de ácidos graxos poli-insaturados (PUFA) tanto no teor de ácidos graxos totais, como na fração de TAG do teor de ácidos graxos totais, tal como um nível aumentado de ácido oleico e um nível reduzido de ALA, quando comparado com um tubérculo de batata correspondente sem as modificações genéticas e/ou o(s) polinucleotídeo(s) exógeno(s). De preferência, o nível de ALA no teor de ácidos graxos totais do tubérculo é reduzido para menos de 10% e/ou o nível de ácido oleico no teor de ácidos graxos totais é aumentado para pelo menos 5%, de preferência pelo menos 10% ou mais de preferência pelo menos 15%, quando comparado com um tubérculo de batata correspondente sem as modificações genéticas e/ou polinucleotídeo(s) exógeno(s). Além disso, em uma modalidade, o nível de ácido palmítico no teor de ácidos graxos totais do tubérculo é aumentado e/ou os níveis de ácido esteárico (18:0) diminuem no teor de ácidos graxos totais do tubérculo, quando comparado com um tubérculo de batata correspondente sem as modificações genéticas e/ou polinucleotídeo(s) exógeno(s). Em uma modalidade, o teor de amido do tubérculo está entre cerca de 90% e 100% em uma base de peso em relação a um tubérculo de tipo selvagem quando são cultivados nas mesmas condições.

[147] Em uma modalidade, a planta da batata, ou parte da mesma de um modo preferido um tubérculo, da invenção compreende a) primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na tubérculo, e b) um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um polinucleotídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares, em que o polinucleotídeo exógeno está operativamente ligado a um promotor capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo no tubérculo durante o crescimento da planta de batata.

[148] Em uma modalidade preferida, o tubérculo de batata compreende ainda um ou mais ou todos de c) um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo de revestimento de corpos oleosos (OBC), de preferência um LDAP, d) uma primeira modificação genética que infrarregula a produção endógena e/ou a atividade de um polinucleotídeo envolvido no catabolismo de triacilgliceróis (TAG) no tubérculo, quando comparado com um tubérculo correspondente sem a modificação genética, por exemplo onde o polipeptídeo é SDP1, e) um quarto polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo que aumenta a exportação de ácidos graxos para fora dos plastídeos do tubérculo quando comparado com um tubérculo correspondente sem o quarto polinucleotídeo exógeno, f) uma segunda modificação genética que infrarregula a produção e/ou a atividade de um polipeptídeo envolvido na importação de ácidos graxos em plastídeos do tubérculo quando comparado com um tubérculo correspondente sem a segunda modificação genética endógena, e g) uma terceira modificação genética que infrarregula a produção endógena e/ou a atividade de um polipeptídeo envolvido na produção de diacilglicerol (DAG) no plastídeo quando comparado a um tubérculo correspondente sem a terceira modificação genética.

[149] Em outras modalidades, as modificações genéticas adicionais no tubérculo são como definidas no contexto de uma célula ou planta da invenção.

[150] Em um décimo sexto aspecto, a presente invenção proporciona uma planta de sorgo ou cana de açúcar, ou parte da mesma de preferência um caule ou uma folha, que tem um teor de ácidos graxos totais de, pelo menos, 6% ou, pelo menos, 8% com base no peso seco e/ou um teor de TAG no caule de pelo menos 2% ou pelo menos 3% em uma base de peso seco e/ou tem um aumento no teor de TAG de pelo menos 50 vezes no caule e/ou, pelo menos, 100 vezes na folha em uma base de peso. Em modalidades, a planta de sorgo ou cana de açúcar, ou parte da mesma de preferência, um caule ou uma folha, é caracterizada por características tais como definidas no contexto de uma célula ou planta ou parte da mesma da invenção.

[151] Em um décimo sétimo aspecto, a presente invenção fornece uma planta de sorgo ou de cana de açúcar ou parte da mesma preferencialmente um caule ou folha, que compreende a) um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na planta ou parte da mesma, e b) um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares, em que cada polinucleotídeo exógeno está operativamente ligado a um promotor que é capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo na planta ou parte da mesma durante o crescimento da planta.

[152] De preferência, o promotor que dirige a expressão de pelo menos o primeiro polinucleotídeo exógeno é um promotor que não seja um promotor de ubiquitina de arroz (Rubi3). Mais preferencialmente, o promotor não é um promotor de ubiquitina, ou qualquer outro promotor constitutivo. De preferência, o primeiro e o segundo polinucleotídeos exógenos e seus respectivos promotores estão ligados em um constructo genético que está integrado no genoma da planta.

[153] Em uma modalidade, o teor de açúcar do caule da cana de açúcar está entre cerca de 70% e 100% em uma base de peso em relação a um caule de cana de açúcar de tipo selvagem quando são cultivados nas mesmas condições. Alternativamente, o teor de açúcar está entre 50% e 70%.

[154] Em uma modalidade, a planta de sorgo ou de cana de açúcar, ou parte da mesma preferencialmente um caule ou folha, da invenção compreende a) um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos no(s) caule(s) da planta(s), e b) um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um polinucleotídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares, em que pelo menos um dos polinucleotídeos exógenos, de preferência pelo menos o primeiro polinucleotídeo exógeno, está operativamente ligado a um promotor que é expresso preferencialmente no(s) caule(s) em relação às folhas durante o crescimento da planta.

[155] Em uma modalidade, a planta de sorgo ou cana de açúcar. ou parte da mesma, da invenção compreende ainda um ou mais ou todos de c) um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo de revestimento de corpos oleosos (OBC), de preferência um LDAP, d) uma primeira modificação genética que infrarregula a produção endógena e/ou a atividade de um polinucleotídeo envolvido no catabolismo de triacilgliceróis (TAG) na planta, ou parte da mesma, quando comparado com uma célula correspondente sem a primeira modificação genética, e) um quarto polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo que aumenta a exportação de ácidos graxos para fora dos plastídeos da planta, ou parte da mesma, quando comparado com uma célula correspondente sem o quarto polinucleotídeo exógeno, f) uma segunda modificação genética que infrarregula a produção e/ou a atividade de um polipeptídeo envolvido na importação de ácidos graxos em plastídeos da planta, ou parte da mesma, quando comparado com uma planta correspondente sem a segunda modificação genética endógena, e g) uma terceira modificação genética que infrarregula a produção endógena e/ou a atividade de um polipeptídeo envolvido na produção de diacilglicerol (DAG) nos plastídeos da planta, ou parte da mesma, quando comparado a uma planta correspondente sem a terceira modificação genética.

[156]A planta de sorgo ou de cana de açúcar ou, parte da mesma, da invenção tem preferencialmente um nível aumentado de ácidos graxos monoinsaturados (MUFA) e/ou um nível mais baixo de ácidos graxos poli-insaturados (PUFA) tanto no teor de ácidos graxos totais quanto na fração deTAG do teor de ácidos graxos, tal como um nível aumentado de ácido oleico e um nível reduzido de ALA, quando comparado com uma planta ou parte correspondente sem as modificações genéticas e/ou polinucleotídeo(s) exógeno(s).

[157] De preferência, o nível de ALA no teor de ácidos graxos totais é de menos de 10% e/ou o nível de ácido oleico no teor de ácidos graxos totais é de pelo menos 5%, de preferência pelo menos 10% ou mais de preferência pelo menos 15%, quando comparado com uma planta ou parte da mesma correspondente sem as modificações genéticas e/ou polinucleotídeo(s) exógeno(s).

[158] Em modalidades adicionais, modificações genéticas adicionais na planta de sorgo ou cana de açúcar, ou parte da mesma, são como definidas no contexto de uma célula ou planta da invenção.

[159] Em uma décimo oitavo aspecto, a presente invenção fornece uma planta monocotiledônea transgênica ou parte da mesma de preferência uma folha, um grão, um caule, uma raiz ou um endosperma, que tem um teor de ácidos graxos totais ou um teor de TAG que é aumentado pelo menos 5 vezes em uma base de peso quando comparado com uma planta não monocotiledôneatransgênica correspondente, ou parte da mesma. Alternativamente, a invenção fornece uma planta monocotiledônea transgênica cujo endosperma tem um teor de TAG que é pelo menos 2,0%, de preferência pelo menos 3%, mais preferencialmente pelo menos 4% ou pelo menos 5%, em peso, ou parte da planta, de preferência uma folha, um caule, uma raiz, um grão ou um endosperma. Em uma modalidade, o endosperma tem um teor de TAG de pelo menos 2% que é aumentado pelo menos 5 vezes em relação a um endosperma não transgênico correspondente. De preferência, a planta é inteiramente macho e fêmea fértil, o seu pólen é essencialmente 100% viável, e o seu grão tem uma taxa de germinação que está entre 70% e 100% em relação ao grão correspondente de tipo selvagem. Em uma modalidade, a planta transgênica é uma planta descendente de pelo menos duas gerações derivadas de uma planta de trigo transgênica inicial, e é preferencialmente homozigótica para os transgenes. Em modalidades, a planta monocotiledônea, ou parte da mesma preferencialmente uma folha, um caule, um grão ou um endosperma, é ainda caracterizada por uma ou mais características como definidas no contexto de uma célula ou planta da invenção.

[160] Em um décimo nono aspecto, a presente invenção fornece uma planta monocotiledônea, ou parte da mesma preferencialmente uma folha, um grão, um caule ou um endosperma, que compreende a) um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na planta ou parte da mesma, e b) um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um polinucleotídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares, em que o polinucleotídeo exógeno está operativamente ligado a um promotor capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo na planta ou parte da mesma durante o crescimento da planta.

[161] De preferência, o promotor que dirige a expressão de pelo menos o primeiro polinucleotídeo exógeno é um promotor que não seja um promotor constitutivo.

[162] Em uma modalidade, o teor de amido do grão de uma planta monocotiledônea da invenção está entre cerca de 70% e 100% em uma base de peso em relação a um grão de tipo selvagem quando as plantas a partir das quais são obtidas são cultivadas sob as mesmas condições. As plantas monocotiledôneas preferidas nos dois aspectos anteriores são trigo, arroz, sorgo e milho (maís).

[163] Em uma modalidade, a planta monocotiledônea, ou parte da mesma, de preferência uma folha, um grão ou um endosperma, da invenção compreende a) um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos da planta, e b) um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um polinucleotídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares, em que pelo menos um dos polinucleotídeos exógenos, de preferência pelo menos o primeiro polinucleotídeo exógeno, está operativamente ligado a um promotor que é expresso a um nível maior no endosperma em relação às folhas durante o crescimento da planta.

[164] Em uma modalidade preferida, a planta monocotiledônea, ou parte da mesma, compreende ainda um ou mais ou todos de c) um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo de revestimento de corpos oleosos (OBC), de preferência um LDAP, d) uma primeira modificação genética que infrarregula a produção endógena e/ou a atividade de um polinucleotídeo envolvido no catabolismo de triacilgliceróis (TAG) na planta, ou parte da mesma, quando comparado com uma célula correspondente sem a primeira modificação genética, e) um quarto polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo que aumenta a exportação de ácidos graxos para fora dos plastídeos da planta, ou parte da mesma, quando comparado com uma célula correspondente sem o quarto polinucleotídeo exógeno, f) uma segunda modificação genética que infrarregula a produção e/ou a atividade de um polipeptídeo envolvido na importação de ácidos graxos em plastídeos da planta, ou parte da mesma, quando comparado com uma planta correspondente sem a segunda modificação genética endógena, e g) uma terceira modificação genética que infrarregula a produção endógena e/ou a atividade de um polipeptídeo envolvido na produção de diacilglicerol (DAG) nos plastídeos da planta, ou parte da mesma, quando comparado a uma planta correspondente sem a terceira modificação genética.

[165] Em uma modalidade, a planta monocotiledônea compreende as características a), b), uma ou ambas d) e e), e opcionalmente um de c), f) e g).

[166]A planta monocotiledônea ou, parte da mesma, preferencialmente uma folha, um caule, ou um endosperma da invenção, tem preferencialmente um nível aumentado de ácidos graxos monoinsaturados (MUFA) e/ou um nível mais baixo de ácidos graxos poli-insaturados (PUFA) tanto no teor de ácidos graxos totais quanto na fração deTAG do teor de ácidos graxos, tal como um nível aumentado de ácido oleico e um nível reduzido de LA (18:2), quando comparado com uma planta ou parte correspondente sem as modificações genéticas e/ou polinucleotídeo(s) exógeno(s).

[167] De preferência, o nível de ácido linoleico (LA, 18:2) no teor de ácidos graxos totais do grão ou do endosperma é reduzido em pelo menos 5% e/ou o nível de ácido oleico no teor de ácidos graxos totais é aumentado pelo menos 5% em relação a uma planta correspondente de tipo selvagem ou parte da mesma, de preferência pelo menos 10% ou mais preferencialmente pelo menos 15%, quando comparado com uma planta ou parte correspondente sem as modificações genéticas e/ou polinucleotídeo(s) exógeno(s).

[168]As seguintes modalidades aplicam-se a cada uma das plantas e partes das mesmas do décima quinto, décimo sexto, décimo sétimo, décimo oitavo e décimo nono aspectos.

[169] Em uma modalidade, o polipeptídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares é DGAT ou PDAT e o polipeptídeo OBC é uma oleosina. Alternativamente, o polipeptídeo OBC é um LDAP.

[170] Em uma modalidade, o polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na planta, ou parte da mesma, é um polipeptídeo WRI1 e o polipeptídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares é DGAT ou PDAT.

[171] Em uma modalidade, o polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na planta, ou parte da mesma, é um polipeptídeo WRI1, um polipeptídeo LEC2, um polipeptídeo LEC1 ou um polipeptídeo semelhante a LEC-1 e o polipeptídeo OBC é uma oleosina. Alternativamente, o polipeptídeo OBC é um LDAP.

[172] Em uma modalidade, o polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na planta, ou parte da mesma, é um polipeptídeo WRI1, um polipeptídeo LEC2, um polipeptídeo LEC1 ou um polipeptídeo semelhante a LEC-1 e o polipeptídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares é DGAT ou PDAT e o polipeptídeo OBC é uma oleosina. Alternativamente, o polipeptídeo OBC é um LDAP.

[173] Em uma modalidade, a planta, ou parte da mesma, compreende dois polinucleotídeos exógenos que codificam dois polipeptídeos de fator de transcrição diferentes que aumentam a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na célula, tais como WRI1 e LEC2 ou WRI1 e LEC1.

[174] Em cada uma das modalidades das células, plantas e partes da mesma da invenção (incluindo o segundo, terceiro, quarto, quinto, sexto, sétimo, oitavo, nono, décimo, décimo primeiro, décimo segundo, décimo terceiro, décimo quarto, décimo quinto, décimo sexto, décimo sétimo, décimo oitavo e décimo nono aspectos), prefere-se que o polipeptídeo do fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou ácidos graxos na célula seja um polipeptídeo WRI1, um polipeptídeo LEC2, um polipeptídeo LEC1 ou um polipeptídeo semelhante a LEC1, polipeptídeo, o polipéptido envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares é DGAT ou PDAT e o polipeptídeo envolvido no catabolismo de triacilgliceróis (TAG) na célula é uma SDP1 lipase.

[175] Em cada uma das modalidades das células, plantas e partes da mesma da invenção (incluindo o segundo, terceiro, quinto, sexto, sétimo, oitavo, décimo, décimo primeiro, décimo segundo, décimo terceiro, décimo quarto, décimo quinto, décimo sexto, décimo sétimo, décimo oitavo e décimo nono aspectos, mas excluindo o quinto e o décimo aspectos), prefere-se que o polipeptídeo do fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou ácidos graxos na célula seja um polipeptídeo WRI1, um polipeptídeo LEC2, um polipeptídeo LEC1 ou um polipeptídeo semelhante a LEC1, polipeptídeo, o polipéptido envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares é DGAT ou PDAT e o polipeptídeo que aumenta a exportação de ácidos graxos para fora dos plastídeos da célula é uma ácido graxo tioesterase, de preferência um polipeptídeo FATA ou FATB, mais preferencialmente um polipeptídeo FATA ou uma ácido graxo tioesterase diferente de uma ácido graxo de cadeia média tioesterase.

[176] Em cada uma das modalidades acima das células, plantas e partes da mesma da invenção (incluindo o segundo, terceiro, quarto, quinto, sexto, sétimo, oitavo, nono, décimo, décimo primeiro, décimo segundo, décimo terceiro, décimo quarto, décimo quinto, décimo sexto, décimo sétimo, décimo oitavo e décimo nono aspectos), prefere-se que o polipeptídeo do fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou ácidos graxos na planta, ou parte da mesma, seja uma combinação de pelo menos dois polipeptídeos, de preferência um polipeptídeo WRI1 e um polipeptídeo LEC2. Mais preferencialmente, os referidos pelo menos dois polipeptídeos de fator de transcrição são expressos a partir de diferentes promotores. Mais preferencialmente, os polinucleotídeos exógenos que codificam os referidos pelo menos dois polipeptídeo estão ligados em um único constructo genético integrado na célula ou no genoma da planta.

[177] Em cada uma das modalidades acima, quando a planta é uma planta dicotiledônea, o referido fator de transcrição pode ser um fator de transcrição de planta monocotiledônea. Por outro lado, quando a planta é uma planta monocotiledônea, o referido fator de transcrição pode ser um fator de transcrição de planta dicotiledônea. O referido fator de transcrição é de preferência um fator de transcrição diferente de A. thaliana WRI1 (SEQ ID NOs: 21 ou 22).

[178] Em cada uma das modalidades acima, é preferido que a planta seja uma planta descendente transgênica, pelo menos, duas gerações derivadas a partir de uma planta transgênica inicial, e é de preferência homozigótica para os transgenes.

[179] Em modalidades adicionais, modificações genéticas adicionais na planta, ou parte da mesma, são como definidas no contexto de uma célula da invenção.

[180] Em uma modalidade, uma planta, ou parte da mesma, da invenção (incluindo o sexto, sétimo, oitavo, nono, décimo, décimo primeiro, décimo segundo, décimo terceiro, décimo quarto, décimo quinto, décimo sexto, sétimo, décimo oitavo e décimo nono aspectos) tem uma ou mais ou todas as seguintes características (quando aplicável); i) a planta compreende uma parte, preferencialmente uma parte vegetativa, que tem um aumento da síntese de ácidos graxos totais em relação a uma parte correspondente sem o primeiro polinucleotídeo exógeno, ou uma diminuição do catabolismo dos ácidos graxos totais em relação a uma parte correspondente sem o primeiro polinucleotídeo exógeno, ou ambos, de tal modo que tem um aumento do nível de ácidos graxos totais em relação a uma parte correspondente sem o primeiro polinucleotídeo exógeno, ii) a planta, compreende uma parte, de preferência uma parte vegetativa, que tem uma maior expressão e/ou atividade de uma aciltransferase de acil graxo, que catalisa a síntese de TAG, DAG ou MAG, de preferência, TAG, em relação a uma parte correspondente tendo o primeiro polinucleotídeo exógeno e sem o polinucleotídeo exógeno que codifica um polinucleotídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares, iii) a planta compreende uma parte, preferivelmente uma parte vegetativa, que tem uma produção reduzida de ácido lisofosfatídico (LPA) a partir de acil-ACP e G3P nos seus plastídeos em relação a uma parte correspondente tendo o primeiro polinucleotídeo exógeno e sem a modificação genética que infrarregula a produção endógena e/ou a atividade de um polipeptídeo envolvido na produção de diacilglicerol (DAG) no plastídeo na parte da planta, iv) A planta compreende uma parte, preferivelmente uma parte vegetativa, que tem uma razão alterada de ácidos graxos C16:3 para C18:3 no seu teor de ácidos graxos totais e/ou o seu teor de galactolipídeos em relação a uma parte correspondente sem o(s) polinucleotídeo(s) exógeno e/ou modificação(ões) genética(s), preferencialmente uma razão reduzida, v) uma parte vegetativa da planta compreende um teor de lipídeos não polares totais de pelo menos cerca de 8%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 11%, pelo menos cerca de 12%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, entre 8% e 75%, entre 10% e 75%, entre 11% e 75%, entre cerca de 15% e 75%, entre cerca de 20% e 75%, entre cerca de 30% e 75%, entre cerca de 40% e 75%, entre cerca de 50% e 75%, entre cerca de 60% e 75% ou entre cerca de 25% e 50% (p/p em peso seco), antes da floração, vi) uma parte vegetativa da planta e compreende um teor de TAG de pelo menos cerca de 8%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 11%, pelo menos cerca de 12%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, entre 8% e 75%, entre 10% e 75%, entre 11% e 75%, entre cerca de 15% e 75%, entre cerca de 20% e 75%, entre cerca de 30% e 75%, entre cerca de 40% e 75%, entre cerca de 50% e 75%, entre cerca de 60% e 75%, ou entre cerca de 25% e 50% (p/p em peso seco), preferivelmente antes da floração, vii) o(s) polipeptídeo(s) de fator de transcrição é selecionado do grupo que consiste em WRI1, LEC1, semelhante a LEC1, LEC2, BBM, FUS3, ABI3, ABI4, ABI5, Dof4 e Dof11, de preferência WRI1, LEC1 ou LEC2, ou o grupo que consiste em MYB73, bZIP53, AGL15, MYB115, MYB118, TANMEI, WUS, GFR2a1, GFR2a2 e PHR1, viii) o ácido oleico compreende, pelo menos, 20% (% em mol), pelo menos, 22% (% em mol), pelo menos, 30% (% em mol), pelo menos, 40% (% em mol), pelo menos, 50% (% em mol), ou pelo menos, 60% (% em mol), de um modo preferido cerca de 65% (% em mol) ou entre 20% e cerca de 65% do teor de ácidos graxos totais na planta, ou parte da mesma, ix) lipídeo não polar na planta, ou parte da mesma, preferivelmente uma parte vegetativa, compreende um ácido graxo que compreende um grupo hidroxil, um grupo epóxi, um grupo ciclopropano, uma ligação dupla de carbono-carbono, uma ligação tripla de carbono-carbono, ligações duplas conjugadas, uma cadeia ramificada, tal como uma cadeia ramificada metilada ou hidroxilada, ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos, ou qualquer de dois, três, quatro, cinco ou seis dos grupos acima mencionados, ligações ou cadeias ramificadas, x) lipídeo não polar na planta, ou parte da mesma, preferivelmente uma parte vegetativa, compreende um ou mais ácidos graxos poli-insaturados selecionados de ácido eicosadienoico (EDA), ácido araquidônico (ARA), ácido estearidônico (SDA), ácido eicosatrienóico (ETE), ácido eicosatetraenóico (ETA), ácido eicosapentaenóico (EPA), ácido docosapentaenóico (DPA), ácido docosa-hexaenóico (DHA) ou uma combinação de dois deles, xi) a parte é uma parte vegetativa da planta, tal como uma folha ou um caule, ou parte da mesma, xii) um ou mais ou todos os promotores são selecionados de um promotor diferente de um promotor constitutivo, de preferência, um promotor específico do tecido, tal como promotor específico de uma folha e/ou caule, um promotor regulado pelo desenvolvimento, tal como um promotor específico de senescência, tal como um promotor SAG12, um promotor indutível ou um promotor regulado pelo ritmo circadiano, de preferência, em que pelo menos um dos promotores operativamente ligados a um polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo de fator de transcrição é um promotor que não seja um promotor constitutivo, xiii) a planta, ou parte da mesma, preferivelmente, uma parte vegetativa, compreende um teor de ácidos graxos totais que compreende os ácidos graxos de cadeia média, de preferência C12:0, C14:0 ou ambos, a um nível de pelo menos 5% do teor de ácidos graxos totais e, opcionalmente, um polinucleotídeo exógeno que codifica um LPAAT que tem atividade preferencial para ácidos graxos com um comprimento de cadeia média (C8 a C14), preferencialmente C12:0 ou C14:0, xiv) a planta, ou parte da mesma, preferivelmente uma parte vegetativa, compreende um teor de ácidos graxos totais, cujo nível de ácido oleico e/ou ácido palmítico é aumentado em pelo menos 2% em relação a uma planta, ou parte da mesma correspondente sem o(s) polinucleotídeo(s) exógeno(s) e/ou a(s) modificação(ões) genética(s) e/ou cujo nível de aácido linolênico (ALA) é reduzido em pelo menos 2% em relação a uma planta, ou parte da mesma correspondente sem o(s) polinucleotídeo(s) exógeno(s) e/ou a(s) modificação(ões) genética(s), xv) o lipídeo não polar na planta, ou parte da mesma, preferivelmente uma parte vegetativa, compreende um nível modificado de esteróis totais, de preferência esteróis livres (não esterificados), ésteres de esterol, glicosídeos de esterol, em relação ao lipídeo não polar de uma planta, ou parte da mesma correspondente sem o(s) polinucleotídeo(s) exógeno(s) e/ou a(s) modificação(ões) genética(s), xvi) lipídeo não polar na planta, ou parte do mesmo, compreende ceras e/ou ésteres de cera, xvii) a planta, ou parte da mesma, de preferência uma parte vegetativa, é um membro de uma população ou conjunto de pelo menos cerca de 1000 plantas, ou partes das mesmas, xviii) a planta compreende um polinucleotídeo exógeno que codifica um supressor de silenciamento, em que o polinucleotídeo exógeno está operativamente ligado a um promotor que é capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo na planta, xix) o nível de um ou mais lipídeos não polares e/ou o teor de lipídeos não polares totais da planta, ou parte da mesma, é pelo menos 2% maior em uma base de peso do que em uma célula correspondente que compreende polinucleotídeos exógenos que codificam um Arabidposis thaliana WRI1 (SEQ ID NO: 21) e um Arabidopsis thaliana DGAT1 (SEQ ID NO: 1), e xx) um teor de ácidos graxos totais poli-insaturados (PUFA), que é reduzido em relação ao teor de PUFA total de uma célula correspondente sem o(s) polinucleotídeo(s) exógeno(s) e/ou a(s) modificação(ões) genética(s). xxi) a parte da plata é um tubérculo de batata (Solanum tuberosum), uma beterraba sacarina (Beta vulgaris), um caule de cana de açúcar (Saccharum sp.) ou sorgo (Sorghum bicolor), uma semente de plantas monocotiledôneas com um teor aumentado de ácidos graxos totais no seu endosperma tal como, por exemplo, um grão de trigo (Triticum aestivum) ou semente de milho (Zea mays), uma folha de Nicotiana ou uma semente de leguminosa com um teor de ácidos graxos totais aumentado tal como, por exemplo, uma semente de Brassica sp. ou uma semente de soja (Glycine max), xxii) Se a parte da planta é uma semente, a semente germina a uma taxa substancialmente a mesma que para um correspondente de sementes de tipo selvagem ou quando semeadas em solo produz uma planta cujas sementes germinam a uma taxa substancialmente igual ao do correspondente para sementes do tipo selvageme xxiii) a planta é uma planta de algas, como diatomáceas (bacilariófitas), algas verdes (clorófitas), algas azul- esverdeadas (cianófitas), algas castanho-douradas (crisófitas), haptófitas, algas marrons ou algas heterocontas.

[181]Nas modalidades acima referidas, uma parte da planta preferida é um pedaço de folha que tem uma área de superfície de pelo menos 1 centímetro2 ou uma pedaço do caule com um comprimento de pelo menos um centímetro.

[182] Em uma modalidade dos aspectos acima, a planta ou parte da planta tem sido tratada de modo que já não possa ser propagada ou dar origem a uma planta viva, isto é, está morta. Por exemplo, a planta ou parte da planta foi seca e/ou triturada.

[183]Nas modalidades acima, é preferido que o teor de lipídeos não polares totais da parte da planta é preferencialmente pelo menos 3%, mais preferencialmente pelo menos 5% maior do que o teor de lipídeos não polares totais em uma parte da planta correspondente transformada com genes que codificam um WRI1 e uma DGAT, mas sem os outros polinucleotídeos exógenos e modificações genéticas, tais como aqui descrito. Mais preferivelmente, este grau de aumento está um caule ou raiz da planta.

[184] Em uma modalidade, a adição de um ou mais dos polinucleotídeos exógenos ou modificações genéticas, de preferência o polinucleotídeo exógeno que codifica uma OBC ou uma acil graxo tioesterase ou a modificação genética que infrarregula a produção endógena e/ou a atividade de um polipeptídeo envolvido no catabolismo de triacilgliceróis (TAG) na planta, mais preferencialmente o polinucleotídeo exógeno que codifica uma FATA tioesterase ou um LDAP ou que diminui a expressão de uma lipase TAG endógena, tal como uma SDP1 TAG lipase na planta, resulta em um aumento sinérgico no teor de lipídeos não polares totais da parte da planta quando adicionado ao par de transgenes WRI1 e DGAT, particularmente antes da planta florescer e ainda mais particularmente nos caules e/ou raízes da planta. Por exemplo, ver Exemplos 8, 11 e 15. Em uma modalidade preferida, o aumento no teor de TAG do caule ou da raiz da planta é pelo menos 2 vezes, mais preferencialmente pelo menos 3 vezes, em relação a uma parte correspondente transformada com genes que codificam WRI1 e DGAT1, mas não têm a FATA tioesterase, o LDAP e a modificação genética que infrarregula a produção e/ou atividade endógena de um polipeptídeo envolvido no catabolismo de triacilgliceróis (TAG) na planta. Mais preferencialmente, pelo menos, o promotor que dirige a expressão do primeiro polinucleotídeo exógeno é um promotor que não é um promotor constitutivo.

[185]Nas modalidades do sexto, sétimo, oitavo, décimo, décimo primeiro, décimo segundo, décimo terceiro, décimo quarto, décimo sexto, décimo oitavo e décimo nono, é preferível que a planta ou a parte da mesma é fenotipicamente normal, pelo fato de não ser significativamente reduzida na sua capacidade de crescer e reproduzir quando comparada com uma planta não modificada ou parte da mesma. De preferência, a biomassa, a taxa de crescimento, a taxa de germinação, o tamanho do órgão de armazenamento, o tamanho da semente e/ou o número de sementes viáveis produzidas não é inferior a 90% do de uma planta correspondente de tipo selvagem quando cultivadas em condições idênticas. Em uma modalidade, a planta é fértil macho e fêmea na mesma extensão que uma planta correspondente de tipo selvagem e o seu pólen (se produzido) é tão viável quanto o pólen da planta de tipo selvagem correspondente, de preferência, aproximadamente 100% viável. Em uma modalidade, a planta produz semente que tem uma taxa de germinação de pelo menos 90% em relação à taxa de germinação de sementes correspondentes de uma planta de tipo selvagem, onde a espécie de planta produz semente. Em uma modalidade, a planta da invenção tem uma altura de planta que é pelo menos 90% em relação à altura da planta de tipo selvagem correspondente cultivada sob as mesmas condições. Prevê-se uma combinação de cada uma dessas características. Em uma modalidade alternativa, a planta da invenção tem uma altura de planta que está entre 60% e 90% em relação à altura da planta de tipo selvagem correspondente cultivada nas mesmas condições. Em uma modalidade, a planta ou parte da mesma da invenção, de preferência uma folha de planta, não apresenta necrose aumentada, isto é, a extensão da necrose, se presente, é a mesma que a exibida por uma planta correspondente de tipo selvagem ou parte da mesma cultivada nas mesmas condições e na mesma fase de desenvolvimento de planta. Esta característica aplica-se em particular à planta ou parte da mesma compreendendo um polinucleotídeo exógeno que codifica um ácido graxo tioesterase, tal como uma FATB tioesterase.

[186]As seguintes modalidades aplicam-se à planta, ou parta da mesma, da invenção (incluindo osexto, sétimo, oitavo, nono, décimo, décimo primeiro, décimo segundo, décimo terceiro, décimo quarto, décimo sexto, décimo oitavo e décimo nono), bem como um método de produção da planta ou parte da mesma ou um método de utilização da mesma. Em uma modalidade, o polipeptídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares é uma acil graxo aciltransferase, que está envolvida na biossíntese de TAG, DAG ou monoacilglicerol (MAG) na planta ou parte da mesma, de preferência TAG na planta ou parte da mesma, tal como DGAT, PDAT, LPAAT, GPAT ou MGAT, de preferência, DGAT ou PDAT.

[187] Em uma outra modalidade o polipeptídeo envolvido no catabolismo de triacilgliceróis (TAG) na planta é uma SDP1 lipase, um polipeptídeo Cgi 58, uma acil-CoA oxidase, tal como ACX1 ou ACX2, ou um polipeptídeo envolvido na e-oxidação de ácidos graxos na célula tal como um transportador de cassete de ligação ATP peroxisomal PXA1, de preferência uma SDP1 lipase,

[188] Em uma modalidade o polipeptídeo de revestimento de corpos oleosos (OBC) é oleosina, tal como uma polioleosina ou uma caleosina, ou uma proteína associada a gotículas lipídicas (LDAP).

[189] Em uma modalidade, o polipeptídeo que aumenta a exportação de ácidos graxos para fora de plastídeos da planta é ácido graxo C16 ou C18 tioesterase, tal como um polipeptídeo FATA ou um polipeptídeo FATB, um transportador de ácido graxo, tal como um polipeptídeo ABCA9 ou acil-CoA de cadeia longa sintetase (LACS),

[190] Em uma modalidade, a polipeptídeo envolvido na importação de ácidos graxos em plastídeos da planta é um transportador de ácidos graxos, ou subunidade do mesmo, de preferência um polipeptídeo TGD tal como, por exemplo, um polipeptídeo TGD1, um polipeptídeo TGD2, um polipeptídeo TGD3, ou um polipeptídeo TGD4.

[191] Em uma modalidade o polipeptídeo envolvido na produção de diacilglicerol (DAG) no plastídeo é um GPAT plastidial, uma LPAAT plastidial ou um PAP plastidial.

[192] Em uma modalidade, aplanta, ou parte da mesma, da invenção é uma planta 16:3, ou parte da mesma, e que compreende uma ou mais ou todas as seguintes características; a) um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo que aumenta a exportação de ácidos graxos para fora dos plastídeos da planta quando comparado com uma planta correspondente sem o quarto polinucleotídeo exógeno, b) uma primeira modificação genética que infrarregula a produção e/ou a atividade de um polipeptídeo envolvido na importação de ácidos graxos em plastídeos da planta quando comparado com uma célula correspondente sem a primeira modificação genética endógena, e c) uma segunda modificação genética que infrarregula a produção endógena e/ou a atividade de um polipeptídeo envolvido na produção de diacilglicerol (DAG) no plastídeo quando comparado a uma planta correspondente sem a segunda modificação genética. em que o polinucleotídeo exógeno está operavelmente ligado a um promotor capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo na planta, ou parte da mesma.

[193] Em uma modalidade alternativa, a planta, ou parte da mesma, da invenção é uma planta 18:3 ou parte da mesma.

[194] Em uma modalidade, antes da planta florescer,uma parte vegetativa da planta compreende um teor de lipídeos não polares totais de pelo menos cerca de 8%, pelo menos cerca de 10%, cerca de 11%, entre 8% e 15%, ou entre 9% e 12% (p/p de peso seco).

[195] Em uma modalidade, uma ou mais ou todas as modificações genéticas é uma mutação de um gene endógeno que inativa parcialmente ou completamente o gene, tal como uma mutação pontual, uma inserção ou uma deleção (ou uma combinação de um ou mais destes), de preferência uma mutação introduzida. A mutação pontual pode ser um códon de parada prematura, uma mutação no sítio de junção, uma mutação de deslocamento de estrutura ou uma mutação de substituição de aminoácidos que reduz a atividade do gene ou do polipeptídeo codificado. A deleção pode ser de um ou mais nucleotídeos dentro de um éxon transcrito ou promotor do gene, ou estender-se através ou em mais de um éxon, ou estender-se à deleção do gene completo. De preferência, a deleção é introduzida pela utilização de tecnologias ZF, TALEN ou CRISPR. Em uma modalidade alternativa, uma ou mais ou todas as modificações genéticas é um polinucleotídeo exógeno que codifica uma molécula de RNA que inibe a expressão do gene endógeno, em que o polinucleotídeo exógeno está operativamente ligado a um promotor que é capaz de direcionar a expressão do polinucleotídeo na planta ou em parte da mesma.

[196] Em uma modalidade, o polinucleotídeo exógeno que codifica WRI1 compreende um ou mais dos seguintes: 1) nucleotídeos que codificam um polipeptídeo compreendendo aminoácidos cuja sequência é apresentada como qualquer das SEQ ID NO: 21 a 75 ou 205 a 210, ou um fragmento biologicamente ativo dos mesmos ou um polipeptídeo cuja sequência de aminoácidos é pelo menos 30% idêntica a qualquer uma ou mais das SEQ ID NOs: 21 a 75 ou 205 a 210, ii)nucleotídeo cuja sequência é pelo menos 30% idêntica a i), e 111) nucleotídeos que hibridizam com i) e/ou ii) sob condições rigorosas. De preferência, o polipeptídeo WRI1 é um polipeptídeo WRI1 diferente de Arabidopsis thaliana WRI1 (SEQ ID NOs:21 ou 22). Mais preferencialmente, o polipeptídeo WRI1 compreende aminoácidos cuja sequência é apresentada como SEQ ID NO: 208, ou um fragmento biologicamente ativo do mesmo, ou um polipeptídeo cuja sequência de aminoácidos é pelo menos 30% idêntica àquela.

[197] Em uma modalidade, o teor de lipídeos não polares, ou um ou mais lipídeos não polares, e/ou o nível do ácido oleico ou um PUFA na planta ou parte da mesma é determinável por análise usando cromatografia gasosa de ésteres metílicos de ácidos graxos obtidos da planta ou da parte vegetativa da mesma.

[198] Em uma outra modalidade, em que a parte da planta é uma folha e o teor de lipídeos não polares totais da folha é determinável por análise usando Ressonância Magnética Nuclear (NMR).

[199] Em uma modalidade, a planta, ou parte da mesma, é um membro de uma população ou coleção de pelo menos cerca de 1000 dessas plantas ou partes.

[200] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma população de pelo menos cerca de 1000 plantas, sendo cada uma, uma planta da invenção, crescendo em um campo.

[201] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma coleção de pelo menos cerca de 1000 partes vegetativas da planta, sendo cada uma, uma parte vegetativa da planta da invenção, em que as partes vegetativas da planta foram colhidas a partir de plantas que crescem em um campo.

[202] Em uma modalidade da célula, do organismo não humano, da planta ou parte da mesma da invenção, o polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou ácidos graxos na célula é um fator de transcrição WRI1, o polipeptídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares é uma DGAT, tais como uma DGAT1 ou uma DGAT2, ou PDAT, e o polipeptídeo envolvido no catabolismo de triacilglicerídeos (TAG) na célula é uma lipase SDP1. Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo de revestimento de corpo oleoso (OBC) é uma oleosina, o polipeptídeo que aumenta a exportação de ácidos graxos para fora dos plastídeos da célula é uma ácido graxo tioesterase, tal como uma FATA ou FATB tioesterase, o polipeptídeo envolvido na importação de ácidos graxos em plastídeos da célula é um polipeptídeo TGD, de preferência um polipeptídeo TGD1, e o polipeptídeo envolvido na produção de diacilglicerol (DAG) no plastídeo é um GPAT plastidial. Em uma modalidade mais preferida, a célula está em uma parte vegetativa da planta e o teor de TAG da parte vegetativa da planta antes da floração da planta é de pelo menos 8% (% em peso seco).

[203] Em uma modalidade, a planta, a parte vegetativa da planta, o organismo não humano ou parte do mesmo, a semente ou o tubérculo de batata compreende um primeiro polinucleotídeo exógeno codificando um WRI1, um segundo polinucleotídeo exógeno codificando DGAT ou PDAT, de preferência uma DGAT1, um terceiro polinucleotídeo exógeno codificando um RNA que reduz a expressão de um gene codificando um polipeptídeo SDP1 e um quarto polinucleotídeo exógeno codificando uma oleosina. Em modalidades preferidas, a parte vegetativa da planta, o organismo não humano ou parte do mesmo, a semente ou o tubérculo de batata tem uma ou mais ou todas as seguintes características: i) um teor de lipídeos totais de pelo menos 8%, pelo menos 10%, pelo menos 12%, pelo menos 14%, ou pelo menos 15,5% (% em peso), ii) pelo menos 3 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 7 vezes, pelo menos 8 vezes ou pelo menos de 10 vezes, com um teor de lipídeos totais mais elevado na parte vegetativa da planta ou no organismo não humano em relação a uma parte vegetativa da planta ou organismo não humano que não possui os polinucleotídeos exógenos, iii) um teor total de TAG de pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 6,5% ou pelo menos 7% (% em peso de peso seco ou peso de semente), iv) teor de TAG total de pelo menos 40 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 60 vezes ou pelo menos 70 vezes, pelo menos 100 vezes, ou pelo menos 120 vezes superior em relação a uma parte vegetativa da planta correspondente ou organismo não humano sem polinucleotídeos exógenos, v) ácido oleico compreende pelo menos 15%, pelo menos 19% ou pelo menos 22% (% em peso de peso seco ou peso de semente) dos ácidos graxos em TAG, vi) um nível de pelo menos 10 vezes, pelo menos 15 vezes ou pelo menos 17 vezes maior de ácido oleico em TAG em relação a uma parte vegetativa da planta correspondente ou a um organismo não humano sem os polinucleotídeos exógenos, vii) o ácido palmítico compreende pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30% ou pelo menos 33% (% em peso) dos ácidos graxos em TAG, viii) pelo menos um nível 1,5 vezes maior de ácido palmítico em TAG em relação a uma parte vegetativa da planta correspondente ou organismo não humano sem os polinucleotídeos exógenos, ix) ácido linoleico compreende pelo menos 22%, pelo menos 25%, pelo menos 30% ou pelo menos 34% (% em peso) dos ácidos graxos em TAG, x) a-ácido linolênico compreende menos de 20%, menos de 15%, menos de 11% ou menos de 8% (% em peso) dos ácidos graxos em TAG, xi) pelo menos um nível de 5 vezes, ou pelo menos 8 vezes mais baixo de a-ácido linolênico em TAG em relação a uma parte vegetativa da planta correspondente ou a um organismo não humano sem os polinucleotídeos exógenos, e xii) para um tubérculo de batata, um teor de TAG de pelo menos 0,5% em uma base de peso seco e/ou um teor de ácido graxo total de pelo menos 1%, de preferência pelo menos 1,5% ou, pelo menos, 2,0%, em uma base de peso seco.

[204] Também é fornecida uma semente de, ou obtida a partir, de uma planta da invenção.

[205] Em um outro aspecto, a invenção fornece um caule de planta transgênica, ou parte de um caule de pelo menos 1 g de peso seco, cujo teor de TAG é pelo menos 5% em peso (peso seco), preferencialmente pelo menos 6%, mais preferencialmente pelo menos 7%. Em uma modalidade, a parte do tronco ou tronco da planta transgênica é de, ou de preferência, colhida a partir de uma planta dicotiledônea. Alternativa, a parte do tronco ou caule da planta transgênica é de, ou de preferência colhida a partir de uma planta monocotiledônea. Em uma modalidade, a parte do tronco ou tronco da planta é de ou a partir de uma planta diferente de cana de açúcar. Em modalidades, a parte do caule ou caule da planta é ainda caracterizado por uma ou mais características como definidas no contexto de uma célula ou planta da invenção.

[206] Em um outro aspecto, a invenção proporciona uma célula vegetal compreendendo a) um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica PDAT, b) uma primeira modificação genética que infrarregula a produção e/ou a atividade de um polipeptídeo envolvido na importação de ácidos graxos em plastídeos da célula, preferivelmente um polipeptídeo TGD, quando comparado com uma célula correspondente sem a primeira modificação genética endógena, e c) uma primeira modificação genética que infrarregula a produção endógena e/ou a atividade de um polinucleotídeo envolvido no catabolismo de triacilgliceróis (TAG) na célula, preferivelmente um polipeptídeo SDP1, quando comparado com uma célula correspondente sem a modificação genética, d) um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo que aumenta a exportação de ácidos graxos para fora dos plastídeos da célula, preferivelmente uma ácido graxo tiosterase, quando comparado com uma célula correspondente sem o quarto polinucleotídeo exógeno, e) uma terceira modificação genética que infrarregula a produção endógena e/ou a atividade de um polipeptídeo envolvido na produção de diacilglicerol (DAG) no plastídeo quando comparado a uma célula correspondente sem a terceira modificação genética. em que o polinucleotídeo é operativamente ligado a um promotor capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo na célula. Em uma modalidade preferida, a presença na célula da primeira, segunda ou terceira modificação genética ou do segundo polinucleotídeo exógeno aumenta sinergicamente o teor de lipídeos não polares totais da célula quando comparada com uma célula correspondente tendo PDAT, mas sem a modificação genética adicional ou o polinucleotídeo exógeno. Mais preferencialmente, pelo menos um dos polinucleotídeos exógenos é expresso a partir de um promotor diferente de um promotor constitutivo.

[207] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um processo para obter uma célula eucariótica recombinante da invenção, o processo compreendendo as etapas de: i) introduzir em uma célula eucariótica pelo menos um polinucleotídeo exógeno e/ou pelo menos uma modificação genética, tal como aqui definido para produzir uma célula eucariótica compreendendo um conjunto de polinucleotídeo exógenos e/ou modificações genéticas, tal como aqui definido, ii) expressar o(s) polinucleotídeo(s) exógeno(s) na célula ou uma célula descendente da mesma, iii) analisar o teor de lipídeos da célula ou da célula descendente, e iv) selecionar uma célula da invenção.

[208] Em uma modalidade, o um ou mais polinucleotídeos exógenos são integrados de forma estável no genoma da célula ou na célula descendente.

[209] O processo compreende ainda a etapa de regenerar uma planta transgênica a partir da célula ou da célula descendente compreendendo um ou mais polinucleotídeos exógenos.

[210] Em uma outra modalidade, a etapa de regeneração de uma planta transgênica é realizado antes da etapa de expressar um ou mais polinucleotídeos exógenos na célula ou em uma célula descendente da mesma e/ou antes da etapa de analisar o teor de lipídeos da célula ou da célula descendente e/ou antes da etapa de selecionar a célula ou célula descendente tendo um nível aumentado de um ou mais lipídeos não polares.

[211] Em uma outra modalidade, o processo compreende ainda uma etapa de obtenção de uma semente ou planta descendente a partir da planta transgênica, em que a semente ou planta descendente compreende um ou mais polinucleotídeos exógenos.

[212] Em ainda uma outra modalidade, a célula selecionada ou planta regenerada a partir daí, ou uma parte vegetativa da planta ou semente da planta regenerada, tem uma ou mais das características, tal como aqui definido.

[213] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método de produção de uma planta que integrou no seu genoma um conjunto de polinucleotídeos exógenos e/ou modificações genéticas, tal como aqui definido, o método compreendendo as etapas de i) cruzar duas plantas progenitoras, em que uma planta compreende, pelo menos, um de polinucleotídeos exógenos e/ou pelo menos uma das modificações genéticas, tal como definido aqui, e a outra planta compreende, pelo menos, um de polinucleotídeos exógenos e/ou pelo menos uma das modificações genéticas, tais como definido aqui, e em que entre eles as duas plantas progenitoras compreendem um conjunto de polinucleotídeos exógenos e/ou modificações genéticas, tal como definido aqui, ii) pesquisar uma ou mais plantas descendentes do cruzamento para a presença ou ausência de um conjunto de polinucleotídeos exógenos e/ou modificações genéticas, tal como definido aquie iii) selecionar uma planta descendente que compreende o conjunto de polinucleotídeos exógenos e/ou modificações genéticas, tal como definido aqui, desse modo produzindo a planta.

[214] É também fornecida uma célula transgênica ou uma planta transgênica obtida usando o processo da invenção, ou uma parte da mesma, obtida a partir daí, que compreende o conjunto de polinucleotídeos exógenos e/ou modificações genéticas, tal como definido aqui.

[215] Também é fornecido o uso de um conjunto de polinucleotídeos exógenos e/ou modificações genéticas, tal como aqui definido para produzir uma célula transgênica, um organismo não humano transgênico ou uma parte do mesmo ou uma semente tendo uma capacidade aumentada para produzir um ou mais lipídeos não polares em relação a uma célula correspondente, um organismo não humano ou parte do mesmo ou uma semente que não tem o conjunto de polinucleotídeos exógenos e/ou modificações genéticas, em que cada polinucleotídeo exógeno está operativamente ligado a um promotor que é capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo exógeno na célula transgênica, no organismo transgênico não humano ou parte do mesmo ou semente.

[216] De preferência, pelo menos um dos promotores operativamente ligado a um polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo do fator de transcrição é um promotor diferente de um promotor constitutivo.

[217] Em uma modalidade, a célula transgênica, organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente compreende uma ou mais das características, tal como aqui definido.

[218] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um processo para a produção de um produto industrial, compreendendo o processo as etapas de: i) obter uma célula eucariótica recombinante da invenção, um organismo transgênico não humano ou uma parte do mesmo da presente invenção, uma planta transgênica ou parte da mesma, da invenção, uma semente da invenção, ou uma célula transgênica ou planta transgênica ou parte da mesma da presente invenção, e ii) converter pelo menos parte do lipídeo na célula, no organismo não humano ou parte do mesmo, na planta ou parte da mesma, ou na semente ao produto industrial por aplicação de meios térmicos, químicos ou enzimáticos, ou qualquer combinação destes, ao lipídeo in situ no organismo não humano ou parte do mesmo, e iii) recuperar o produto industrial, produzindo desse modo o produto industrial.

[219] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um processo para a produção de um produto industrial, compreendendo o processo as etapas de: i) obter uma célula eucariótica recombinante da invenção, um organismo transgênico não humano ou uma parte do mesmo da presente invenção, uma planta transgênica ou parte da mesma, da invenção, uma semente da invenção, ou uma célula transgênica ou planta transgênica ou parte da mesma da presente invenção, e ii) processar fisicamente a célula, organismo não humano ou parte do mesmo, planta ou parte da mesma ou semente da etapa i), iii) converter simultaneamente ou subsequentemente pelo menos parte do lipídeo na célula, no organismo não humano ou parte do mesmo, na planta ou parte da mesma, ou na semente ao produto industrial por aplicação de meios térmicos, químicos, ou enzimáticos ou qualquer combinação dos mesmos, para o lipídeo na célula processada, organismo não humano ou parte do mesmo, planta ou parte da mesma, ou semente, e iv) recuperar o produto industrial, produzindo desse modo o produto industrial.

[220] Em uma modalidade, um dos dois aspectos acima, a parte da planta é uma parte vegetativa da planta.

[221] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um processo para a produção de um produto industrial, compreendendo o processo as etapas de: i) obter uma parte vegetativa da planta tendo um teor de lipídeos não polares totais de pelo menos cerca de 18%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, entre 18% e 75%, entre cerca de 20% e 75%, entre cerca de 30% e 75%, entre cerca de 40% e 75%, entre cerca de 50% e 75%, entre cerca de 60% e 75%, ou entre cerca de 25% e 50% (p/p de peso seco), ii) converter pelo menos parte do lipídeo na parte vegetativa da planta ao produto industrial por aplicação de meios térmicos, químicos ou enzimáticos, ou qualquer combinação destes, ao lipídeo in situ na parte vegetativa da planta e iii) recuperar o produto industrial, produzindo desse modo o produto industrial.

[222] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um processo para a produção de um produto industrial, compreendendo o processo as etapas de: i) obter uma parte vegetativa da planta tendo um teor de lipídeos não polares totais de pelo menos cerca de 18%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, entre 18% e 75%, entre cerca de 20% e 75%, entre cerca de 30% e 75%, entre cerca de 40% e 75%, entre cerca de 50% e 75%, entre cerca de 60% e 75%, ou entre cerca de 25% e 50% (p/p de peso seco), ii) processar fisicamente a parte vegetativa da planta da etapa i), ii) converter, simultaneamente ou subsequentemente pelo menos parte do lipídeo na parte vegetativa da planta ao produto industrial por aplicação de meios térmicos, químicos ou enzimáticos, ou qualquer combinação destes, ao lipídeo na parte vegetativa da planta processada, e iv) recuperar o produto industrial, produzindo desse modo o produto industrial.

[223] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um processo para a produção de um produto industrial, compreendendo o processo as etapas de: i) obter uma parte vegetativa da planta tendo um teor de lipídeos não polares totais de pelo menos cerca de 11%, pelo menos cerca de 12%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, entre 8% e 75%, entre 10% e 75%, entre 11% e 75%, entre cerca de 15% e 75%, entre cerca de 20% e 75%, entre cerca de 30% e 75%, entre cerca de 40% e 75%, entre cerca de 50% e 75%, entre cerca de 60% e 75% ou entre cerca de 25% e 50% (p/p em peso seco), em que a planta é uma planta 16:3 ou uma parte vegetativa da mesma, ii) converter pelo menos parte do lipídeo na parte vegetativa da planta ao produto industrial por aplicação de meios térmicos, químicos ou enzimáticos, ou qualquer combinação destes, ao lipídeo in situ na parte vegetativa da planta e iii) recuperar o produto industrial, produzindo desse modo o produto industrial.

[224] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um processo para a produção de um produto industrial, compreendendo o processo as etapas de: i) obter uma parte vegetativa da planta tendo um teor de lipídeos não polares totais de pelo menos cerca de 11%, pelo menos cerca de 12%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, entre 8% e 75%, entre 10% e 75%, entre 11% e 75%, entre cerca de 15% e 75%, entre cerca de 20% e 75%, entre cerca de 30% e 75%, entre cerca de 40% e 75%, entre cerca de 50% e 75%, entre cerca de 60% e 75% ou entre cerca de 25% e 50% (p/p em peso seco), em que a planta é uma planta 16:3 ou uma parte vegetativa da mesma, ii) processar fisicamente a parte vegetativa da planta da etapa i), iii) converter, simultaneamente ou subsequentemente pelo menos parte do lipídeo na parte vegetativa da planta ao produto industrial por aplicação de meios térmicos, químicos ou enzimáticos, ou qualquer combinação destes, ao lipídeo na parte vegetativa da planta processada, e iv) recuperar o produto industrial, produzindo desse modo o produto industrial.

[225] Em uma modalidade, a etapa de processar fisicamente a célula, o organismo não humano ou uma parte do mesmo, uma planta ou parte dela, ou uma semente compreende um ou mais de laminação, prensagem, esmagamento ou trituração da célula, organismo não humano ou parte do mesmo, planta ou parte da mesma, ou semente.

[226] Em uma modalidade, o processo compreende as etapas de: (a) extrair pelo menos algum do teor de lipídeo não polar da célula, do organismo não humano ou parte do mesmo, da planta ou parte da mesma, ou das sementes como lipídeo não polar, e (b) recuperar o lipídeo não polar extraído, em que as etapas (a) e (b) são realizados antes da etapa de conversão de, pelo menos, parte do lipídeo na célula, no organismo não humano ou na parte do mesmo, na planta ou parte da mesma, ou nas sementes para o produto industrial.

[227] Em uma modalidade, o lipídeo não polar extraído compreende triacilgliceróis, em que os triacilgliceróis compreendem pelo menos 90%, de preferência pelo menos 95%, do lipídeo extraído.

[228] Em uma modalidade, o produto industrial é um produto de hidrocarboneto, tais como ésteres de ácidos graxos, ésteres metílicos de um modo preferido de ácidos graxos e/ou ésteres etílicos de ácidos graxos, um alcano, tal como o metano, etano ou um alcano de cadeia mais longa, uma mistura de alcanos de cadeia mais longa, um alceno, um biocombustível, monóxido de carbono e/ou de gás hidrogênio, um bio álcool, tais como etanol, propanol, ou butanol, bio carvão, ou uma combinação de monóxido de carbono, hidrogênio e bio carvão. Em uma modalidade preferida, o teor de ácidos graxos totais da parte vegetativas da planta compreende pelo menos 5% de C12:0, C14:0 ou a soma de C12:0 e C14:0 é pelo menos 5% do teor de ácido graxo total e o produto industrial produzido a partir do lipídeo na parte vegetativa da planta é um componente de um combustível de aviação.

[229] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um processo para a produção de um lipídeo extraído, compreendendo o processo as etapas de: i) obter uma célula eucariótica recombinante da invenção, um organismo transgênico não humano ou uma parte do mesmo da presente invenção, uma planta transgênica ou parte da mesma, da invenção, uma semente da invenção, ou uma célula transgênica ou planta transgênica ou parte da mesma da presente invenção, ii) extrair lipídeo da célula, um organismo não humano ou parte do mesmo, uma planta ou parte da mesma, ou semente, e iii) recuperar o lipídeo extraído, produzindo, assim, o lípido extraído.

[230] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um processo para a produção de um lipídeo extraído, compreendendo o processo as etapas de: i) obter uma parte vegetativa da planta tendo um teor de lipídeos não polares totais de pelo menos cerca de 18%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, entre 18% e 75%, entre cerca de 20% e 75%, entre cerca de 30% e 75%, entre cerca de 40% e 75%, entre cerca de 50% e 75%, entre cerca de 60% e 75%, ou entre cerca de 25% e 50% (p/p de peso seco), ii) extrair lipídeo da parte vegetativa da planta, e iii) recuperar o lipídeo extraído, produzindo, assim, o lípido extraído.

[231] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um processo para a produção de um lipídeo extraído, compreendendo o processo as etapas de: i) obter uma parte vegetativa da planta tendo um teor de lipídeos não polares totais de pelo menos cerca de 11%, pelo menos cerca de 12%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, entre 8% e 75%, entre 10% e 75%, entre 11% e 75%, entre cerca de 15% e 75%, entre cerca de 20% e 75%, entre cerca de 30% e 75%, entre cerca de 40% e 75%, entre cerca de 50% e 75%, entre cerca de 60% e 75% ou entre cerca de 25% e 50% (p/p em peso seco), em que a planta é uma planta 16:3 ou uma parte vegetativa da mesma, ii) extrair lipídeo da parte vegetativa da planta, e iii) recuperar o lipídeo extraído, produzindo, assim, o lípido extraído.

[232] Em uma modalidade, um processo de extração compreende um ou mais de secagem, laminação, prensagem, esmagamento ou trituração da célula, organismo não humano ou parte do mesmo, planta ou parte da mesma, ou semente, e/ou purificação do lipídeo ou óleo de semente extraído.

[233] Em uma modalidade, o processo utiliza um solvente orgânico no processo de extração para extrair o óleo.

[234] Em uma outra modalidade, o processo compreende recuperar o lipídeo ou óleo extraído colhendo-a em um recipiente e/ou um ou mais de desengorduramento, desodorização, descoloração, secagem, fracionamento do lipídeo ou óleo extraído, remoção de pelo menos algumas ceras e/ou ésteres de cera do lipídeo ou óleo extraído ou análise da composição do ácido graxo do lipídeo ou óleo extraído.

[235] Em uma modalidade, o volume do lipídeo ou óleo extraído é de pelo menos 1 litro.

[236] Em uma modalidade, aplicam-se uma ou mais ou todas as seguintes características: (i) o lipídeo ou óleo extraído compreende triacilgliceróis, em que os triacilgliceróis compreendem pelo menos 90%, de preferência pelo menos 95% ou pelo menos 96%, do lipídeo ou óleo extraído, (ii) o lipídeo ou óleo extraído compreende esteróis livres, ésteres de esteroil, esteroil-glicosídeos, ceras ou ésteres de cera, ou qualquer combinação destes, e (iii) o teor de esterol total e/ou composição no lipídeo ou óleo extraído é significativamente diferente do teor de esterol e/ou composição no lipídeo ou óleo extraído produzido a partir de uma célula correspondente, organismo não humano ou parte do mesmo, planta ou parte da mesma ou semente.

[237] Em uma modalidade, o processo compreende ainda a conversão do lipídeo ou óleo extraído para um produto industrial.

[238] Em uma modalidade, o produto industrial é um produto de hidrocarboneto, tais como ésteres de ácidos graxos, ésteres metílicos de um modo preferido de ácidos graxos e/ou ésteres etílicos de ácidos graxos, um alcano, tal como o metano, etano ou um alcano de cadeia mais longa, uma mistura de alcanos de cadeia mais longa, um alceno, um biocombustível, monóxido de carbono e/ou de gás hidrogênio, um bio álcool, tais como etanol, propanol, ou butanol, bio carvão, ou uma combinação de monóxido de carbono, hidrogênio e bio carvão. Em uma modalidade preferida, o teor de ácidos graxos totais da parte vegetativas da planta compreende pelo menos 5% de C12:0, C14:0 ou a soma de C12:0 e C14:0 é pelo menos 5% do teor de ácido graxo total e o produto industrial produzido a partir do lipídeo na parte vegetativa da planta é um componente de um combustível de aviação.

[239] Em uma outra modalidade, a parte da planta é uma parte aérea da planta ou uma parte verde da planta, de preferência uma parte vegetativa da planta, como uma folha ou caule da planta. Em uma modalidade alternativa, a parte da planta é um tubérculo ou beterraba, tal como um tubérculo de batata (Solanum tuberosum) ou beterraba sacarina.

[240] Em ainda uma outra modalidade, o processo compreende ainda uma etapa de colheita da célula, organismo não humano ou parte do mesmo, planta ou parte da mesma, tal como um tubérculo ou beterraba, ou semente, de preferência com uma colheitadeira mecânica, ou por um processo compreendendo filtração, centrifugação, sedimentação, flutuação ou floculação de organismos de algas ou fungos.

[241] Em uma outra modalidade, o nível de um lipídeo na célula, organismo não humano ou parte do mesmo, planta ou parte da mesma ou semente e/ou a lipídeo extraído ou óleo é determinável pela análise por meio de cromatografia em fase gasosa dos ésteres metílicos preparados a partir de lipídeos extraídos ou óleo.

[242] Em ainda outra modalidade, o processo compreende ainda a colheita da parte de uma planta.

[243] Em uma modalidade, a parte da planta é uma parte vegetativa da planta que compreende um um teor de lipídeos não polares totais de pelo menos cerca de 18%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, entre 18% e 75%, entre cerca de 20% e 75%, entre cerca de 30% e 75%, entre cerca de 40% e 75%, entre cerca de 50% e 75%, entre cerca de 60% e 75%, ou entre cerca de 25% e 50% (p/p de peso seco).

[244] Em ainda uma outra modalidade, a parte da planta é uma parte vegetativa da planta que compreende um teor de TAG total de pelo menos cerca de 18%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, entre 18% e 75%, entre cerca de 20% e 75%, entre cerca de 30% e 75%, entre cerca de 40% e 75%, entre cerca de 50% e 75%, entre cerca de 60% e 75%, ou entre cerca de 25% e 50% (p/p de peso seco).

[245] Em uma outra modalidade, a parte da planta é uma parte vegetativa da planta que compreende um teor de lipídeos não polares totais de pelo menos cerca de 11%, pelo menos cerca de 12%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, entre 8% e 75%, entre 10% e 75%, entre 11% e 75%, entre cerca de 15% e 75%, entre cerca de 20% e 75%, entre cerca de 30% e 75%, entre cerca de 40% e 75%, entre cerca de 50% e 75%, entre cerca de 60% e 75% ou entre cerca de 25% e 50% (p/p em peso seco), em que a parte vegetativa da planta é de uma planta 16:3.

[246] Em ainda uma outra modalidade, a parte da planta é uma parte vegetativa da planta que compreende um teor de TAG total de pelo menos cerca de 11%, pelo menos cerca de 12%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, entre 8% e 75%, entre 10% e 75%, entre 11% e 75%, entre cerca de 15% e 75%, entre cerca de 20% e 75%, entre cerca de 30% e 75%, entre cerca de 40% e 75%, entre cerca de 50% e 75%, entre cerca de 60% e 75% ou entre cerca de 25% e 50% (p/p em peso seco), em que a parte vegetativa da planta é de uma planta 16:3.

[247] É também fornecido um processo para a produção de sementes, o processo compreendendo: i) cultivar uma planta da invenção, e ii) a colheita da semente da planta.

[248] Em uma modalidade, o processo acima compreende o cultivo de uma população de pelo menos cerca de 1000 plantas, cada uma sendo uma planta da presente invenção e a colheita da semente da população de plantas.

[249] Em ainda um outro aspecto, a presente invenção fornece um processo de fermentação, o processo compreendendo as etapas de: i) fornecer um recipiente contendo uma composição líquida compreendendo uma célula eucariótica recombinante da invenção, ou o organismo não humano transgênico da invenção, em que o organismo celular ou não humano é adequado para a fermentação e os constituintes necessários para a biossíntese de fermentação e ácidos graxos, e ii) fornecer condições que contribuam para a fermentação da composição líquida contida no referido recipiente.

[250] É também fornecido lipídeo recuperado ou extraído obtido a partir de uma célula eucariótica recombinante da invenção, de um organismo não humano transgênico ou de uma parte do mesmo da invenção, de uma planta transgênica ou de parte da mesma da invenção, de uma semente da invenção, ou de uma célula transgênica ou planta transgênica ou parte da mesma da invenção, ou podem ser obtidas pelo processo da invenção.

[251] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um produto industrial produzido pelo processo da invenção, que é um produto de hidrocarboneto, tais como ésteres de ácidos graxos, ésteres metílicos de um modo preferido de ácidos graxos e/ou ésteres etílicos de ácidos graxos, um alcano, tal como o metano, etano ou um alcano de cadeia mais longa, uma mistura de alcanos de cadeia mais longa, um alceno, um biocombustível, monóxido de carbono e/ou de gás hidrogênio, um bio álcool, tais como etanol, propanol, ou butanol, bio carvão, ou uma combinação de monóxido de carbono, hidrogênio e bio carvão.

[252] Também é fornecida a utilização de uma célula eucariótica recombinante da invenção, um organismo não humanos transgênico ou uma parte do mesmo da invenção, uma planta transgênica ou parte da mesma da invenção, uma semente da invenção, ou uma célula transgênica ou planta transgênica ou parte da mesma da invenção, ou o lipídeo recuperado ou extraído da invenção para a fabricação de um produto industrial.

[253] Exemplos de produtos industriais da invenção, incluem, mas não estão limitados a produto de hidrocarboneto, tais como ésteres de ácidos graxos, ésteres metílicos de um modo preferido de ácidos graxos e/ou ésteres etílicos de ácidos graxos, um alcano, tal como o metano, etano ou um alcano de cadeia mais longa, uma mistura de alcanos de cadeia mais longa, um alceno, um biocombustível, monóxido de carbono e/ou de gás hidrogênio, um bio álcool, tais como etanol, propanol, ou butanol, bio carvão, ou uma combinação de monóxido de carbono, hidrogênio e bio carvão.

[254] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um processo para a produção de combustível, o processo compreendendo: i) fazer reagir o lipídeo da invenção com um álcool, opcionalmente, na presença de um catalisador, para produzir ésteres de alquil, e ii) opcionalmente, misturar os ésteres alquílicos com combustível à base de óleo.

[255] Em uma modalidade do processo acima, os ésteres de alquil são ésteres de metil.

[256] Em ainda um outro aspecto, a presente invenção fornece um processo para a produção de combustível de diesel sintético, o processo compreendendo: i) converter o lipídeo em uma célula eucariótica recombinante da invenção, um organismo não humano transgênico ou uma parte do mesmo da invenção, uma planta transgênica ou parte da mesma da invenção, uma semente da invenção, ou uma célula transgênica ou planta transgênica ou parte da mesma da invenção a um bio-óleo por um processo que compreende pirólise ou processamento hidrotérmico ou a um gás de síntese por gaseificação, e ii) converter o bio-óleo para o combustível diesel sintético por um processo compreendendo fracionamento, de preferência, selecionando compostos de hidrocarbonetos que se condensam entre cerca de 150oC até cerca de 200oC ou entre cerca de 200oC até cerca de 300oC, ou a conversão de gás de síntese a um biocombustível usando um catalisador de metal ou um catalisador microbiano.

[257] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um processo para a produção de um biocombustível, o processo compreendendo a conversão do lipídeo em uma célula eucariótica recombinante da invenção, um organismo não humano transgênico ou uma parte do mesmo da invenção, uma planta transgênica ou parte da mesma da invenção, uma semente da invenção ou uma célula transgênica ou planta transgênica ou parte da mesma da invenção para bio-óleo por pirólise, um bioálcool por fermentação ou um biogás por gaseificação ou digestão anaeróbica.

[258] Em uma modalidade do processo acima, a parte é uma parte vegetativa da planta.

[259] É também fornecido um processo para a produção de um alimento para animais, o processo compreendendo a mistura de uma célula eucariótica recombinante da invenção, de um organismo não humano transgênico ou uma parte do mesmo da invenção, de uma planta transgênica ou parte da mesma da invenção, uma semente da invenção ou uma célula transgênica ou planta transgênica ou parte da mesma da invenção, ou que pode ser obtida pelo processo da invenção, ou um extrato ou porção da mesma, com pelo menos um outro ingrediente alimentar.

[260] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece alimentos para animais, cosméticos ou produtos químicos compreendendo uma célula eucariótica recombinante da invenção, um organismo não humano transgênico ou uma parte do mesmo da invenção, uma planta transgênica ou parte da mesma da invenção, uma semente da invenção, ou uma célula transgênica ou planta transgênica ou parte da mesma da invenção, ou que podem ser obtidas pelo processo da invenção, ou um extrato ou porção da mesma.

[261] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um processo para a alimentação animal, o processo compreendendo fornecer ao animal a planta transgênica ou parte da mesma da invenção, uma semente da invenção, ou planta transgênica ou parte da mesma da invenção, ou o lipídeo recuperado ou extraído da invenção.

[262] Qualquer forma de realização aqui deve ser tomada para aplicarmutatis mutandis a qualquer outra modalidade a menos que especificamente indicado em contrário.

[263]A presente invenção não deve ser limitada ao âmbito das modalidades específicas aqui descritas, que se destinam apenas a exemplificação. Os produtos, composições e métodos funcionalmente equivalentes estão claramente dentro do âmbito da invenção, tal como aqui descrito.

[264]Ao longo de todo o presente relatório descritivo, a não ser que seja especificado especificamente o contrário ou o contexto exija o contrário, a referência a uma única etapa, composição de matéria, grupo de etapas ou grupo de composições de matéria deve ser considerada por englobar uma e uma pluralidade (ou seja, uma ou mais) etapas, composições de matéria, grupos de etapas ou grupo de composições de matéria.

[265]A invenção é descrita a seguir por meio dos seguintes Exemplos não limitativos e com referência às figuras anexas. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS ANEXOS

[266] Figura 1. Uma representação da síntese lipídica em células eucarióticas, mostrando a exportação de alguns dos ácidos graxos sintetizados nos plastídeos ao retículo endoplasmático (ER) através da membrana de plastídeos associados (PLAM) e a importação de alguns dos ácidos graxos para o plastídeo do ER para a síntese de galactolipídeos eucarióticos. Abreviações: Acetil-CoA e Malonil-CoA: acetil-coenzima A e malonil- coenzima A; ACCase: Acetil-CoA carboxilase; FAS: Complexo de ácido graxo sintase; 16:0-ACP, 18:0-ACP e 18:1-ACP: C16:0-proteína carreadora de acil (ACP), C18:0-proteína carreadora de acil, C18:1-proteína carreadora de acil; KAS II: Cetoacil-ACP sintase II (EC 2.3.1.41); PLPAAT: LPAAT plastidial; PGPAT: GPAT plastidial; PAP: PA fosforilase (EC 3.1.3.4); G3P: glicerol-3-fosfato; LPA: ácido lisofosfatídico; PA: ácido fosfatídico; DAG: diacilglicerol; TAG: triacilglicerol; Acil-CoA e Acil-PC: acil-coenzima A e acil- fosfatidilcolina; PC: fosfatidilcolina; GPAT: glicerol-3-fosfato aciltransferase; LPAAT: ácido lisofosfatídico aciltransferase (EC 2.3.1.51); LPCAT: Acil-CoA: lisofosfatidilcolina aciltransferase; ou sinônimos 1-acilglicerofosfocolina O-aciltransferase; acil-CoA:1-acil-sn-glicero-3- fosfocolina O-aciltransferase (EC 2.3.1.23); CPT: CDP-colina:diacilglicerol colinafosfotransferase; ou sinônimos 1-alquil-2- acetilglicerol colinafosfotransferase; alquilacilglicerol colinafosfotransferase; colinafosfotransferase; fosforilcolina-glicerídeo transferase (EC 2.7.8.2); PDCT: fosfatidilcolina:diacilglicerol colinafosfotransferase; PLC: fosfolipase C (CE 3.1.4.3); PLD: fosfolipase D; colina fosfatase; lecitinase D; lipofosfodiesterase II (EC 3.1.4.4); PDAT: fosfolipídeo: diacilglicerol aciltransferase; ou sinônimo fosfolipídeo:1,2-diacil-sn-glicerol O- aciltransferase (EC 2.3.1.158); FAD2: ácido graxo Δ12-dessaturase; FAD3, ácido graxo Δ15-dessaturase; UDP-Gal: Uridina difosfato galactose; MGDS: monogalactosildiacilglicerol sintase; MGDG: monogalactosildiacilglicerol; DGDG: digalactosildiacilglicerol FAD6, 7, 8: ácido graxo plastidial Δ12-dessaturase, plastidial o3-dessaturase, plastidial o3-dessaturase induzida a uma temperatura baixa, respectivamente.

[267] Figura 2. Mapa genético esquemático do constructo para aumentar o teor de óleo de sementes em plantas dicotiledôneas. Abreviações: PRO Pissa-Vicilin, promotor de vicilina Pisum sativum e 5' UTR; TMV líder, 5'UTR do vírus do mosaico do tabaco; Arath-DGAT1, região de codificaçã de proteína codificando DGAT1 de A. thaliana; TER Glyma-Lectin, região de 3’ terminador/ poliadenilação de um gene de lectina G. max; PRO Phavu-Phaseolin, promotor de um gene da proteína de faseolinaPhaseolus vulgaris; Arath-WRI1, região de codificação de proteína codificando A. thaliana WRI1; TER Agrtu-NOS, região de 3’ terminador/poliadenilação de um gene Nos Agrobacterium tumefaciens; PRO Phavu-PHA, promotor de um gene da proteína de faseolina Phaseolus vulgaris; Sesina- Oleosina, região de codificação de proteína codificando gene de oleosina de Sesame indicum; TER Phavu-PHA, região de 3’terminador/ poliadenilação de um gene de faseolina Phaseolus vulgaris.

[268] Figura 3. Diagrama esquemático do vetor pOIL122. Abreviações: TER Agrtu-Nos, terminador de Agrobacterium tumefaciens nopaline sintase; NPTII, região de codificação da proteína de neomicina fosfotransferase; PRO CaMV35S-Ex2, promotor do 35S do vírus do mosaico da couve-flor com região de potencialização dobrada; Arath-DGAT1, região de codificação da proteína de Arabidopsis thaliana DGAT1 aciltransferase; PRO Arath-Rubisco SSU, promotor da subunidade pequena de A. thaliana Rubisco; Arath-FATA2, região de codificação de proteína de A. thaliana FATA2 tiosterase; Arath-WRI, região de codificação da proteína do fator de transcrição de A. thaliana WRI1 TER Glyma-Lectin, terminador de lectina Glicina max; promotor de enTCUP2, promotor constitutivo de Nicotiana tabacum críptica; attB1 e attB2, sítio de recombinação de entrada; fragmento NB SDP1, região de SDP1 Nicotiana benthamiana direcionada para silenciar hpRNAi; terminador OCS, terminador de A. tumefaciens octopina sintase. As características da cadeia principal fora da região T-DNA são derivadas de pORE04 (Coutu et al., 2007).

[269] Figura 4. Perfis de éster metílico de ácido graxo total (FAME) (% em peso) que ilustram o efeito da base de óleo elevado mediado por WRI1 + DGAT1 na produção de MCFA na folha de Nicotiana benthamiana (n=4). A maior produção de MCFA foi observada após a adição de Arath-WRI1.

[270] Figura 5. Perfis FAME totais da folha (% em peso) elucidando o efeito de WRI1 sobre a acumulação de MCFA (n = 4). A adição de Arath-WRI1 aumentou significativamente a produção do ácido graxo relevante (C12:0, C14:0 ou C16:0) em relação à adição anterior apenas de Cocnu-LPAAT.

[271] Figura 6. Níveis de TFA (% em peso), níveis de TAG, níveis de MCFA (C16:0 e C14:0,% de ácidos graxos totais) em TFA e MCFA em TAG (% de teor total de ácidos graxos em TAG) em células vegetaiss após expressão de combinações de três DGATs de óleo de palma com FATB, LPAAT e WRI1. Os números 1 10 são como listado no texto (Exemplo 9).

[272] Figura 7. Níveis de TAG (% em peso seco de folha) no tecido da folha de N. benthamiana, infiltrado com genes que codificam diferentes polipeptídeo WRI1 seja com (barras de mão direita) seja sem (barras de mão esquerda) co- expressão de DGAT1 (n = 3). Todas as amostras foram infiltradas com o constructo P19 também.

[273] Figura 8. Representação esquemática do constructo em gancho de N. benthamiana SDP1. Os segmentos genéticos são mostrados como descrito no Exemplo 11. Abreviações são como para a Figura 3. Os sítios attB representam locais de recombinação a partir do vetor pHELLSGATE12.

[274] Figura 9. Teor de TAG em amostras de folhas verdes de plantas de tabaco transformadas com o T-DNA de pOIL51, linhagens # 61 e # 69, colhidas antes da floração. As amostras de controle (progenitoras) foram de plantas transformadas com o T-DNA de pJP3502.

[275] Figura 10. Níveis de TAG (% em peso seco) nos tecidos radiculares e de caule de tipo selvagem (wt) e nas plantas transgênicas N. tabacum contendo apenas o T-DNA de pJP3502 ou adicionalmente com o T-DNA de pOIL051.

[276] Figura 11. Níveis de TAG (% em peso seco) nos tecidos radiculares e de caule de tipo selvagem (wt) e nas plantas transgênicas N. tabacum contendo apenas o T-DNA de pJP3502 ou adicionalmente com o T-DNA de pOIL049.

[277] Figura 12. Teor de TAG em amostras de folhas de plantas de tabaco transformadas em fase de crescimento de semente, transformadas com o T-DNA de pOIL049, linhagens # 23c e # 32b. As amostras de controle (progenitoras) foram de plantas transformadas com o T-DNA de pJP3502. A linhagens superior mostra uma percentagem de 18:2 no TAG e a linhagens inferior mostra a percentagem de 18:3 (ALA) no teor de ácido graxo.

[278] Figura 13. A. O teor de amido em tecido de folhas de plantas de tipo selvagem (WT) e plantas transgênicas contendo o T-DNA de pJP3502 (controle HO) ou os T-DNA de ambos pJP3502 e pOIL051 (pOIL51.61 e pOIL51.69) ou pJP3502 e POIL049 (pOIL49.32b). Os dados representam resultados combinados de pelo menos três plantas individuais. B. Correlação entre o teor de amido e TAG em tecido de folhas de plantas de tipo selvagem (WT) e plantas transgênicas contendo o T-DNA de pJP3502 (controle HO) ou os T-DNA de ambos pJP3502 e pOIL051 (pOIL51.61 e pOIL51.69) ou pJP3502 e POIL049 (pOIL49.32b). Os dados representam resultados combinados de pelo menos três plantas individuais.

[279] Figura 14. Representação esquemática do vetor binário pTV55. Abreviações: PRO, promotor; TER, região de 3’ temrinação/poliadenilação; Arath, A. thaliana; Linus, Linum usitatissimum; Nicta, Nicotiana tabacum; Glyma, G. max; Cnl1, conlinina 1 de linho; Cnl2, Conlinina 2 del inho; MAR Nicat- RB7, matriz do RB7 do tabaco, ou como na Figura 3. Abreviações dos genes MGAT2, DGAT1, GPAT4, WRI1 como no texto.

[280] Figura 15. Teor de óleo (%) de sementes de C. sativa T2 sementes transformadas com pTV55, pTV56 e pTV57 como determinado por NMR. Cada ponto de dados representa o teor médio de óleo de três lotes independentes de 50 mg de semente para cada linhagens transgênica. As sementes de controle negativo eram sementes de tipo selvagem (não transformadas) de C. sativa, cultivadas sob as mesmas condições na estufa. N indica o número de acontecimentos transgênicos independentes para cada constructo.

[281] Figura 16. Árvore filogenética de polipeptídos LDAP (Exemplo 15).

[282] Figura 17. Representação esquemática do constructo genético pJP3506 incluindo a região T-DNA entre as margens esquerda e direita. As abreviações são como para a Figura 3 e: Sesina-Oleosina, região de codificação de proteína de Sesame indicum oleosina.

[283] Figura 18. Variações de rendimento e de valor calorífico para a produção de bio-óleo por HTP de material vegetativo da planta de tabaco de tipo selvagem e transgênica, de alto teor de óleo como matéria-prima. LEGENDA PARA A LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: 1 polipeptídeo Arabidopsis thaliana DGAT1 (CAB44774.1) SEQ ID NO:2 polipeptídeo Arabidopsis thaliana DGAT2 (NP_566952.1) SEQ ID NO:3 polipeptídeo Ricinus communis DGAT2 (AAY16324.1) SEQ ID NO:4 polipeptídeo Vernicia fordii DGAT2 (ABC94474.1) SEQ ID NO:5 polipeptídeo Mortierella ramanniana DGAT2 (AAK84179.1) SEQ ID NO:6 polipeptídeo Homo sapiens DGAT2 (Q96PD7.2) SEQ ID NO:7 polipeptídeo Homo sapiens DGAT2 (Q58HT5.1) SEQ ID NO:8 polipeptídeo Bos taurus DGAT2 (Q70VZ8.1) SEQ ID NO:9 polipeptídeo Mus musculus DGAT2 (AAK84175.1) SEQ ID NO:10 YFP tripeptídeo - motivo de sequência conservada de DGAT2 e ou MGAT1/2 SEQ ID NO:11 HPHG tetrapeptídeo - motivo de sequência conservada de DGAT2 e/ou MGAT1/2 SEQ ID NO: 12 EPHS tetrapeptídeo - motivo de sequência de planta conservada de DGAT2 SEQ ID NO:13 RXGFX(K/R)XAXXXGXXX(L/V)VPXXXFG(E/Q) — motivo de sequência conservada longa de DGAT2 que é parte do domínio de fosfolipídeo de glicerol putativo SEQ ID NO:14 FLXLXXXN -motivo de sequência convservada de camundongo DGAT2 e MGAT1/2 que é um suposto domínio de ligação de lipídeo neutro putativo SEQ ID NO:15 domínio de plsC aciltrasnferase (PF01553) de GPAT SEQ ID NO:16 domínio superfamília de hidrolase semelhante a HAD (PF12710) de GPAT SEQ ID NO:17 domínio de fosfatase fosforina (PF00702). GPAT4-8 contêm uma região N-terminal homóloga a este domínio SEQ ID NO:18 Sequência de aminoácidos GPAT conservada GDLVICPEGTTCREP SEQ ID NO:19 Sequência de aminoácidos GPAT/fosfatase conservada (Motivo I) SEQ ID NO:20 Sequência de aminoácidos GPAT/fosfatase conservada (Motivo III) SEQ ID NO:21 polipeptídeo Arabidopsis thaliana WRI1 (A8MS57) SEQ ID NO:22 polipeptídeo Arabidopsis thaliana WRI1 (Q6X5Y6) SEQ ID NO:23 polipeptídeo Arabidopsis lyrata subsp. lyrata WRI1 (XP_002876251.1) SEQ ID NO:24 polipeptídeo Brassica napus WRI1 (ABD16282.1) SEQ ID NO:25 polipeptídeo Brassica napus WRI1 (ADO16346.1) SEQ ID NO: 26 polipeptídeo Glycine max WRI1 (XP_003530370.1) SEQ ID NO:27 polipeptídeo Jatropha curcas WRI1 (AEO22131.1) SEQ ID NO:28 polipeptídeo Ricinus communis WRI1 (XP_002525305.1) SEQ ID NO:29 polipeptídeo Populus trichocarpa WRI1 (XP_002316459.1) SEQ ID NO: 30 polipeptídeo Vitis vinifera WRI1 (CBI29147.3) SEQ ID NO:31 polipeptídeo Brachypodium distachyon WRI1 (XP_003578997.1) SEQ ID NO:32 polipeptídeo Hordeum vulgare subsp. vulgare WRI1 (BAJ86627.1) SEQ ID NO:33 polipeptídeo Oryza sativa WRI1 (EAY79792.1) SEQ ID NO:34 polipeptídeo Sorghum bicolor WRI1 (XP_002450194.1) SEQ ID NO:35 polipeptídeo Zea mays WRI1 (ACG32367.1) SEQ ID NO:36 polipeptídeo Brachypodium distachyon WRI1 (XP_003561189.1) SEQ ID NO:37 polipeptídeo Brachypodium sylvaticum WRI1 (ABL85061.1) SEQ ID NO:38 polipeptídeoOryza sativa WRI1 (BAD68417.1) SEQ ID NO:39 polipeptídeo Sorghum bicolor WRI1 (XP_002437819.1) SEQ ID NO: 40 polipeptídeo Sorghum bicolor WRI1 (XP_002441444.1) SEQ ID NO:41 polipeptídeo Glycine max WRI1 (XP_003530686.1) SEQ ID NO:42 polipeptídeo Glycine max WRI1 (XP_003553203.1) SEQ ID NO:43 polipeptídeo Populus trichocarpa WRI1 (XP_002315794.1) SEQ ID NO:44 polipeptídeo Vitis vinifera WRI1 (XP_002270149.1) SEQ ID NO:45 polipeptídeo Glycine max WRI1 (XP_003533548.1) SEQ ID NO:46 polipeptídeo Glycine max WRI1(XP_003551723.1) SEQ ID NO:47 polipeptídeo Medicago truncatula WRI1 (XP_003621117.1) SEQ ID NO:48 polipeptídeo Populus trichocarpa WRI1 (XP_002323836.1) SEQ ID NO:49 polipeptídeo Ricinus communis WRI1 (XP_002517474.1) SEQ ID NO:50 polipeptídeo Vitis vinifera WRI1 (CAN79925.1) SEQ ID NO:51 polipeptídeo Brachypodium distachyon WRI1 (XP_003572236.1) SEQ ID NO:52 polipeptídeo Oryza sativa WRI1 (BAD10030.1) SEQ ID NO:53 polipetídeo Sorghum bicolor WRI1 (XP_002444429.1) SEQ ID NO:54 polipeptídeo Zea mays WRI1 (NP_001170359.1) SEQ ID NO:55 polipeptídeo Arabidopsis lyrata subsp. lyrata WRI1 (XP_002889265.1) SEQ ID NO:56 polipeptídeo Arabidopsis thaliana WRI1 (AAF68121.1) SEQ ID NO:57 polipeptídeo Arabidopsis thaliana WRI1 (NP_178088.2) SEQ ID NO:58 polipeptídeo Arabidopsis lyrata subsp. lyrata WRI1 (XP_002890145.1) SEQ ID NO:59 polipeptídeo Thellungiella halophila WRI1 (BAJ33872.1) SEQ ID NO:60 polipeptídeo Arabidopsis thaliana WRI1 (NP_563990.1) SEQ ID NO:61 polipeptídeo Glycine max WRI1 (XP_003530350.1) SEQ ID NO:62 polipeptídeo Brachypodium distachyon WRI1 (XP_003578142.1) SEQ ID NO:63 polipeptídeo Oryza sativa WRI1 (EAZ09147.1) SEQ ID NO:64 polipeptídeo Sorghum bicolor WRI1 (XP_002460236.1) SEQ ID NO:65 polipeptídeo Zea mays WRI1 (NP_001146338.1) SEQ ID NO:66 polipeptídeo Glycine max WRI1 (XP_003519167.1) SEQ ID NO:67 polipeptídeo Glycine max WRI1 (XP_003550676.1) SEQ ID NO:68 polipeptídeo Medicago truncatula WRI1 (XP_003610261.1) SEQ ID NO:69 polipeptídeo Glycine max WRI1 (XP_003524030.1) SEQ ID NO:70 polipeptídeo Glycine max WRI1 (XP_003525949.1) SEQ ID NO:71 polipeptídeo Populus trichocarpa WRI1 (XP_002325111.1) SEQ ID NO:72 polipeptídeo Vitis vinifera WRI1 (CBI36586.3) SEQ ID NO:73 polipeptídeo Vitis vinifera WRI1 (XP_002273046.2) SEQ ID NO:74 polipeptídeo Populus trichocarpa WRI1 (XP_002303866.1) SEQ ID NO:75 polipeptídeo Vitis vinifera WRI1 (CBI25261.3) SEQ ID NO:76 Sorbi-WRL1 SEQ ID NO: 77 Lupan-WRL1 SEQ ID NO:78 Ricco-WRL1 SEQ ID NO:79 polipeptídeo Lupin angustifolius WRI1 SEQ ID NO:80 polipeptídeo Aspergillus fumigatus DGAT1 (XP_755172.1) SEQ ID NO:81 polipeptídeo Ricinus communis DGAT1 (AAR11479.1) SEQ ID NO:82 polipeptídeo Vernicia fordii DGAT1 (ABC94472.1) SEQ ID NO:83 polipeptídeo Vernonia galamensis DGAT1 (ABV21945.1) SEQ ID NO:84 polipeptídeo Vernonia galamensis DGAT1 (ABV21946.1) SEQ ID NO: 85 polipeptídeo alatus Euonymus DGAT1 (AAV31083.1) SEQ ID NO:86 polipeptídeo Caenorhabditis elegans DGAT1 (AAF82410.1) SEQ ID NO:87 polipeptídeo Rattus norvegicus DGAT1 (NP_445889.1) SEQ ID NO:88 polipeptídeo Homo sapiens DGAT1 (NP_036211.2) SEQ ID NO:89 motivo WRI1 (R G V T/S R H R W T G R) SEQ ID NO:90 motivo WRI1 (F/Y E A H L W D K) SEQ ID NO:91 motivo WRI1 (D L A A L K Y W G) SEQ ID NO:92 motivo WRI1 (S X G F S/A R G X) SEQ ID NO:93 motivo WRI1 (H H H/Q N G R/K W E A R I G R/K V) SEQ ID NO:94 motivo WRI1 (Q E E A A A X Y D) SEQ ID NO:95 polipeptídeo Brassica napus oleosina (CAA57545.1) SEQ ID NO:96 polipeptídeo Brassica napus oleosina S1-1 (ACG69504.1) SEQ ID NO:97 polipeptídeo Brassica napus oleosina S2-1 (ACG69503.1) SEQ ID NO:98 polipeptídeo Brassica napus oleosina S3- 1(ACG69513.1) SEQ ID NO:99 polipeptídeo Brassica napus oleosina S4-1 (ACG69507.1) SEQ ID NO:100 polipeptídeo Brassica napus oleosina S5-1 (ACG69511.1) SEQ ID NO:101 polipeptídeo Arachis hypogaea oleosina 1 (AAZ20276.1) SEQ ID NO:102 polipeptídeo Arachis hypogaea oleosina 2 (AAU21500.1) SEQ ID NO:103 polipeptídeo Arachis hypogaea oleosina 3 (AAU21501.1) SEQ ID NO:104 polipeptídeo Arachis hypogaea oleosina 5 (ABC96763.1) SEQ ID NO:105 polipeptídeo Ricinus communis oleosina 1 (EEF40948.1) SEQ ID NO:106 polipeptídeo Ricinus communis oleosina 2 (EEF51616.1) SEQ ID NO:107 polipeptídeo da isoforma a de Glycine max oleosina (P29530.2) SEQ ID NO:108 polipeptídeo da isoforma b de Glycine max oleosina (P29531.1) SEQ ID NO:109 polipeptídeo da isoforma de Linum usitatissimum oleosina de baixo peso molecular (ABB01622.1) SEQ ID NO:110 sequência de aminoácido de polipeptídeo da isoforma de Linum usitatissimum oleosina de elevado peso molecular (ABB01624.1) SEQ ID NO:111 polipeptídeo Helianthus annuus oleosina (CAA44224.1) SEQ ID NO:112 polipeptídeo Zea mays oleosina (NP_001105338.1) SEQ ID NO:113 polipeptídeo Brassica napus esteroleosina (ABM30178.1) SEQ ID NO:114 polipeptídeo Brassica napus esteroleosina SLO1-1 (ACG69522.1) SEQ ID NO:115 polipeptídeo Brassica napus esteroleosina SLO2-1 (ACG69525.1) SEQ ID NO:116 polipeptídeo Sesamum indicum esteroleosina (AAL13315.1) SEQ ID NO:117 polipeptídeo Zea mays esteroleosina (NP_001152614.1) SEQ ID NO:118 polipeptídeo Brassica napus caleosina CLO- 1 (ACG69529.1) SEQ ID NO:119 polipeptídeo Brassica napus caleosina CLO- 3 (ACG69527.1) SEQ ID NO:120 polipeptídeo Sesamum indicum caleosina (AAF13743.1) SEQ ID NO:121 polipeptídeo Zea mays caleosina (NP_001151906.1) SEQ ID NO:122 sequência de pJP3502 TDNA (inserida no genoma) SEQ ID NO:123 sequência do vetor pJP3507 SEQ ID NO:124 sequência do ligante SEQ ID NO:125 Sequência parcial de Nicotiana benthamiana CGI-58 selecionada para silenciar hpRNAi (pTV46) SEQ ID NO:126 Sequência parcial de N. tabacum AGPase selecionada para silenciar hpRNAi (pTV35) SEQ ID NO:127 motivo GXSXG lipase SEQ ID NO:128 motivo HX(4)D aciltransferase SEQ ID NO:129 provável motivo de ligação lipídica VX(3)HGF SEQ ID NO:130 polinucleotídeo Arabidopsis thaliana CGi58 (NM_118548.1) SEQ ID NO:131 polinucleotídeo Brachypodium distachyon CGi58 (XM_003578402.1) SEQ ID NO:132 polinucleotídeo Glycine max CGi58 (XM_003523590.1) SEQ ID NO:133 polinucleotídeo Zea mays CGi58 (NM_001155541.1) SEQ ID NO:134 polinucleotídeo Sorghum bicolor CGi58 (XM_002460493.1) SEQ ID NO:135 polinucleotídeo Ricinus communis CGi58 (XM_002510439.1) SEQ ID NO:136 polinucleotídeo Medicago truncatula CGi58 (XM_003603685.1) SEQ ID NO:137 polinucleotídeo Arabidopsis thaliana LEC2 (NM_102595.2) SEQ ID NO:138 polinucleotídeo Medicago truncatula LEC2 (X60387.1) SEQ ID NO:139 polinucleotídeo Brassica napus LEC2 (HM370539.1) SEQ ID NO:140 polinucleotídeo Arabidopsis thaliana BBM (NM_121749.2) SEQ ID NO: 141 polinucleotídeo Medicago truncatula BBM (AY899909.1) SEQ ID NO:142 polinucleotídeo Arabidopsis thaliana LEC2 (NP_564304.1) SEQ ID NO:143 polinucleotídeo Medicago truncatula LEC2 (CAA42938.1) SEQ ID NO:144 polinucleotídeo Brassica napus LEC2 (ADO16343.1) SEQ ID NO:145 polinucleotídeo Arabidopsis thaliana BBM (NP_197245.2) SEQ ID NO:146 polinucleotídeo Medicago truncatula BBM (AAW82334.1) SEQ ID NO:147 Promotor indutível Aspergilus niger alcA SEQ ID NO:148 AlcR indutor que ativa o promotor AlcA na presença de etanol SEQ ID NO:149 Arabidopsis thaliana LEC1; (AAC39488) SEQ ID NO:150 Arabidopsis lyrata LEC1 (XP_002862657) SEQ ID NO:151 Brassica napus LEC1 (ADF81045) SEQ ID NO:152 Ricinus communis LEC1 (XP_002522740) SEQ ID NO:153 Glycine max LEC1 (XP_006582823) SEQ ID NO:154 Medicago truncatula LEC1 (AFK49653) SEQ ID NO:155 Zea mays LEC1 (AAK95562) SEQ ID NO:156 Arachis hypogaea LEC1 (ADC33213) SEQ ID NO:157 Arabidopsis thaliana semelhante a LEC1 (AAN15924) SEQ ID NO:158 Brassica napus semelhante a LEC1 (AHI94922) SEQ ID NO:159 Phaseolus coccineus semelhante a LEC1 (AAN01148) SEQ ID NO:160 Arabidopsis thaliana FUS3 (AAC35247) SEQ ID NO:161 Brassica napus FUS3 SEQ ID NO:162 Medicago truncatula FUS3 SEQ ID NO:163 sequência cDNa de Arabidopsis thaliana SDP1, N.° de Acessão. NM_120486, 3275nt SEQ ID NO:164 Brassica napus SDP1 cDNA; N.° de Acessão GN078290 SEQ ID NO:165 Brachypodium distachyon SDP1 cDNA, 2670nt SEQ ID NO:166 Populus trichocarpa SDP1 cDNA, 3884nt SEQ ID NO:167 Medicago truncatula SDP1 cDNA; XM_003591377; 2490nt SEQ ID NO:168 Glycine max SDP1 cDNA XM_003521103; 2783nt SEQ ID NO:169 Sorghum bicolor SDP1 cDNA XM_002458486; 2724nt SEQ ID NO:170 Zea mays SDP1 cDNA, NM_001175206; 2985nt SEQ ID NO:171 Physcomitrella patens SDP1 cDNA, XM_001758117; 1998nt SEQ ID NO:172 Hordeum vulgare SDP1 cDNA, AK372092; 3439nt SEQ ID NO:173 Nicotiana benthamiana SDP1 cDNA, Nbv5tr6404201 SEQ ID NO:174 região cDNA de Nicotiana benthamiana SDP1 direcionada para silenciar hpRNAi SEQ ID NO:175 Promotor de gene Arabidopsis thaliana SDP1, 1.5kb SEQ ID NO:176Sequência nucleotídica do complemento do gene pSSU-Oleosina no T-DNA de pJP3502. Em ordem (sequências complementares): TerminadorGlycine max Lectina 348nt, 3 'exon 255nt, UBQ10 intron 304nt, 5' exon 213nt, promotor SSU 1751nt SEQ ID NO:177 cDNA GPAT plastidial Arabidopsis thaliana, NM_179407 SEQ ID NO:178 polipeptídeo GPAT plastidial Arabidopsis thaliana, NM_179407 SEQ ID NO:179 cDNA GPAT plastidial Populus trichocarpa, XP_006368351 SEQ ID NO:180 cDNA GPAT plastidial Jatropha curcas, ACR61638 SEQ ID NO:181 cDNA GPAT plastidialRicinus communis, XP_002518993 SEQ ID NO:182 cDNA GPAT plastidial Helianthus annuus, ADV16382 SEQ ID NO:183 cDNA GPAT plastidial Medicago truncatula, XP 003612801 SEQ ID NO:184 cDNA GPAT plastidial Glycine max, XP_003516958 SEQ ID NO:185 cDNA GPAT plastidial Carthamus tinctorius, CAHG3PACTR SEQ ID NO:186 cDNA GPAT plastidial Solanum tuberosum, XP_006352898 SEQ ID NO:187 cDNA GPAT plastidial Oryza sativa, Japonica, NM_001072027 SEQ ID NO:188 cDNA GPAT plastidial Sorghum bicolor, XM_002467381 SEQ ID NO:189 cDNA GPAT plastidial Zea mays, NM_001158637 SEQ ID NO:190 cDNA GPAT plastidial Hordeum vulgare, AK371419 SEQ ID NO:191 cDNA GPAT plastidial Physcomitrella patens, XM_001771247 SEQ ID NO:192 cDNA GPAT plastidial Chlamydomonas reinhardtii, XM_001694925 SEQ ID NO:193 Cinnamomum camphora 14:0-ACP tiosterase (Cinca-TE), cloroplástico, 382aa, (N.° de Acessão Q39473.1) SEQ ID NO:194 Cocos nucifera acil-ACP tioesterase FatB1 (Cocnu-TE1; 417aa, N.° de Acessão. AEM72519.1 SEQ ID NO:195 Cocos nucifera acil-ACP tioesterase FatB2 (Cocnu-TE2; 423aa, N.° de Acessão. AEM72520.1) SEQ ID NO:196 Cocos nucifera acil-ACP tioesterase FatB3 (Cocnu-TE3; 414aa, N.° de Acessão AEM72521.1) SEQ ID NO:197 Cuphea lanceolata acil-(ACP) tioesterase tipe B (Cupla-TE, 419aa, N.° de Acessão CAB60830.1) SEQ ID NO:198 Cuphea viscosissima FatB1 (Cupvi-TE; 419aa, N.° de Acessão. AEM72522.1) SEQ ID NO:199 Umbellularia californica 12:0-ACP tiioesterase (proteína carreadora de lauroil-acil tioesterase) (Umbca-TE, 382aa; N.° de Acessão Q41635.1) SEQ ID NO:200 Cocos nucifera LPAAT (Cocnu-LPAAT, 308aa, N.° de Acessão. Q42670.1) SEQ ID NO:201 LPAAT1 plastidial Arabidopsis thaliana (Arath-PLPAAT; 356aa, N.° de Acessão. AEE85783.1) SEQ ID NO:202 Arabidopsis thaliana FATA1 SEQ ID NO:203 Arabidopsis thaliana FATA2 SEQ ID NO:204 Arabidopsis thaliana FATB SEQ ID NO:205 Arabidopsis thaliana WRI3 SEQ ID NO:206 Arabidopsis thaliana WRI4 SEQ ID NO:207 Avena sativa WRI1 SEQ ID NO:208 Sorghum bicolor WRI1 SEQ ID NO:209 Zea mays WRI1 SEQ ID NO:210 Triadica sebifera WRI1 SEQ ID NO:211 Sequência do promotor S. tuberosum da Patatina B33 SEQ ID NOs 212 a 215 e 245 to 254 Iniciadores de oligonucleotídeo SEQ ID NO:216 região do promotor Z. mays SEE1 (1970nt de N.° de Acessão AJ494982) SEQ ID NO:217 sequência do promotor A. littoralis AlSAP, N.° de Acessão DQ885219 SEQ ID NO:218 sequência do promotor A. rhizogenes ArRolC, N.° de Acessão. DQ160187 SEQ ID NO:219 HpRNAi contendo um fragmento de 732 pb de GPAT plastidial N. benthamiana SEQ ID NO:220 Elaeis guineensis (óleo de palma) DGAT1 SEQ ID NO:221 G. max MYB73, N.° de Acessão. ABH02868 SEQ ID NO:222 A. thaliana bZIP53, N.° de Acessão. AAM14360 SEQ ID NO:223 A. thaliana AGL15, N.° de Acessão NP_196883 SEQ ID NO:224 A. thaliana MYB118, N.° de Acessão. AAS58517 SEQ ID NO:225 A. thaliana MYB115, N.° de Acessão. AAS10103 SEQ ID NO:226 A. thaliana TANMEI, N.° de Acessão. BAE44475 SEQ ID NO:227 A. thaliana WUS, N.° de Acessão. NP_565429 SEQ ID NO:228 B. napus GFR2a1, N.° de Acessão. AFB74090 SEQ ID NO:229 B. napus GFR2a2, N.° de Acessão. AFB74089 SEQ ID NO:230 A. thaliana PHR1, N.° de Acessão. AAN72198 SEQ ID NO:231 fragmento de N. benthamiana TGD1 SEQ ID NO:232 Aminoácido de batata SDP1 SEQ ID NO:233 Sequência nucleotídica de batata SDP1 SEQ ID NO:234 Subunidade pequena de batata AGPase SEQ ID NO:235 Sequência nucleotídica da subunidade pequena de batata AGPase: SEQ ID NO:236 sequência nucleotídica Sapium sebiferum LDAP-1 SEQ ID NO:237 sequencia de aminoácido Sapium sebiferum LDAP-1 SEQ ID NO:238 sequência nucleotídica Sapium sebiferum LDAP-2 SEQ ID NO:239 sequência de aminoácido Sapium sebiferum LDAP-2 SEQ ID NO:240 sequência nucleotídica Sapium sebiferum LDAP-3 SEQ ID NO:241 sequência de aminoácido Sapium sebiferum LDAP-3 SEQ ID NO:242 S. bicolor SDP1 (N.° de Acessão XM_002463620) SEQ ID NO:243 sequência nucleotídica T. aestivum SDP1 (N.° de Acessão AK334547) SEQ ID NO:244 fragemento de S. bicolor SDP1 hpRNAi

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Técnicas Gerais

[284]A menos que especificamente definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados devem ser considerados como tendo o mesmo significado compreendido normalmente por um versado comum na técnica (por exemplo, em cultura celular, genética molecular, biologia vegetal, biologia celular, química de ácidos graxos e lipídeos, produção de biocombustível e bioquímica).

[285]A menos que indicado de outra forma, a proteína recombinante, a cultura celular e as técnicas imunológicas utilizadas na presente invenção são os procedimentos padrão, bem conhecidos dos versados na técnica. Tais técnicas são descritas e explicadas em toda a literatura em fontes tais como, J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley e Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 e 2, IRL Press (1991), D.M. Glover e B.D. Hames (editores), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 e 1996), F.M. Ausubel et al. (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, incluindo todas as atualizações até o momento), Ed Harlow e David Lane (editores) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), e J.E. Coligan et al. (editores) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (incluindo todas as atualizações até o momento).

Definições selecionadas

[286] O termo "organismo não humanotransgênico" refere- se, por exemplo, a uma planta inteira, alga, animal não humano ou a um organismo adequado para fermentação, tal como uma levedura ou fungo, compreendendo um ou mais polinucleotídeos exógenos (transgene) ou polipeptídeos. Em uma modalidade, o organismo transgêniconão humano não é um animal ou parte do mesmo. Em uma modalidade, o organismo transgênico não humano é um organismo fototrófico (por exemplo, uma planta ou alga) capaz de obter energia a partir da luz solar para sintetizar compostos orgânicos para nutrição.

[287] O termo "exógeno", no contexto de um polinucleotídeo ou polipeptídeo refere-se ao polinucleotídeo ou polipeptídeo, quando presente em uma célula que não compreende naturalmente do polinucleotídeo ou polipeptídeo. Tal célula é referida aqui como uma "célula recombinante" ou uma "célula transgênica". Em uma modalidade, o polinucleotídeo exógeno ou polipeptídeo é de um gênero diferente para a célula compreendendo o polinucleotídeo exógeno ou polipeptídeo. Em uma modalidade, o polinucleotídeo exógeno ou polipeptídeo é de uma espécie diferente. Em uma modalidade, o polinucleotídeo exógeno ou polipeptídeo é expresso em uma célula vegetal ou planta hospedeira e o polinucleotídeo exógeno ou polipeptídeo é de uma espécie ou gênero diferente. O polinucleotídeo ou polipeptídeo exógeno pode ser de ocorrência não natural, tal como, por exemplo, uma molécula de DNA sintético que tenha sido produzida por métodos de DNA recombinante. A molécula de DNA pode, muitas vezes de preferência, incluir uma região codificante de proteína que tenha sido otimizada para códon para expressão na célula, produzindo desse modo um polipeptídeo que tem a mesma sequência de aminoácidos que um polipeptídeo de ocorrência natural, embora a sequência nucleotídica da região de codificação de proteína não ocorra naturalmente. O polinucleotídeo exógeno pode codificar, ou o polipeptídeo exógeno pode ser: uma diacilglicerol aciltransferase (DGAT) tal como uma DGAT1 ou uma DGAT2, um fator de transcrição Wrinkled 1 (WRI1), um OBC, tal como uma oleosina ou de preferência um LDAP, uma ácido graxo tioesterase, tal como um polipeptídeo FATA ou FATB ou um polipeptídeo supressor de silenciamento

[288] Tal como aqui utilizado, o termo "lipídeo extraído" refere-se a uma composição extraída de um organismo transgênico ou parte do mesmo que compreende pelo menos 60% (p/p) de lipídeo.

[289] Tal como aqui utilizado, o termo "lipídeo não polar" refere-se a ácidos graxos e derivados dos mesmos que são solúveis em solventes orgânicos, mas insolúveis em água. Os ácidos graxos podem ser ácidos graxos livres e/ou em uma forma esterificada. Exemplos de formas esterificadas incluem, mas não estão limitados a, triacilglicerol (TAG), diacrilglicerol (DAG), monoacilglicerol (MAG). Os lipidos não polares também incluem esteróis, ésteres de esteróis e ésteres de cera. Os lipídeos não polares são também conhecidos como "lipídeos neutros". O lipídeo não polar é tipicamente um líquido à temperatura ambiente. De preferência, o lípido não polar predominantemente (> 50%) compreende ácidos graxos com pelo menos 16 carbonos de comprimento. Mais preferencialmente, pelo menos 50% dos ácidos graxos totais no lipídeo não polar são ácidos graxos C18, por exemplo, ácido oleico. De preferência, pelo menos 5% dos ácidos graxos totais nos lipídeos não polares são ácidos graxos C12 ou C14, ou ambos. Em uma modalidade, pelo menos 50%, mais preferencialmente pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, mais preferencialmente pelo menos 93%, mais preferencialmente pelo menos 94%, mais preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 96%, mais preferencialmente pelo menos 97%, mais preferencialmente pelo menos 98%, mais preferencialmente pelo menos 99% dos ácidos graxos em lipídeos não polares da invenção podem ser encontrados como TAG. O lipídeo não polar pode ser adicionalmente purificado ou tratado, por exemplo por hidrólise com uma base forte para liberar ácido graxo livre, ou por fracionamento, destilação ou semelhantes. O lipídeo não polar pode estar presente ou ser obtido a partir de partes de plantas, tais como sementes, folhas, tubérculos, beterrabas ou frutos, a partir de células recombinantes ou de organismos não humanos, tais como levedura. O lipídeo não polar da invenção pode fazer parte de "óleo de semente" se for obtido a partir de sementes.

[290]As concentrações de esterol livre e esterificado (por exemplo, sitosterol, campesterol, estigmasterol, brassicasterol, Δ5-avenasterol, sitostanol, campestanol, e colesterol) no lipídeo extraído pode ser tal como descrito em Phillips et al. (2002). Os esteróis em óleos vegetais estão presentes como álcoois livres, ésteres com ácidos graxos (esteróis esterificados), glicosídeos e glicosídeos acilados de esteróis. As concentrações de esterol em óleos vegetais naturais (óleos de semente) variam até um máximo de cerca de 1100mg/100g. O óleo de palma hidrogenado tem uma das concentrações mais baixas de óleos vegetais naturais a cerca de 60mg/100g. Os óleos de semente recuperados ou extraídos da invenção têm preferencialmente entre cerca de 100 e cerca de 1000 mg de esterol total/100 g de óleo. Para utilização como comida ou alimentos para animais, é preferível que os esteróis estejam presentes principalmente sob a forma de formas livres ou esterificadas em vez de formas glicosiladas. Nos óleos de semente da presente invenção, de preferência pelo menos 50% dos esteróis nos óleos estão presentes como esteróis esterificados, exceto para o óleo de semente de soja que tem cerca de 25% dos esteróis esterificados. O óleo de semente de canola e o óleo de colza da invenção têm preferencialmente entre cerca de 500 e cerca de 800 mg de esterol total/100 g, sendo o sitosterol o esterol principal e o campesterol o próximo mais abundante. O óleo de semente de milho da invenção tem de preferência entre cerca de 600 e cerca de 800 mg de esterol total/100 g, sendo o sitosterol o esterol principal. O óleo de semente de soja da invenção tem preferencialmente entre cerca de 150 e cerca de 350 mg de esterol total/100 g, sendo o sitosterol o esterol principal e o estigmasterol o próximo mais abundante e com mais esterol livre do que esterol esterificado. O óleo de semente de algodão da invenção tem preferencialmente entre cerca de 200 e cerca de 350 mg de esterol total/100 g, sendo o sitosterol o esterol principal. O óleo de coco e o óleo de palma da invenção têm preferencialmente entre cerca de 50 e cerca de 100 mg de esterol total/100 g, sendo o sitosterol o esterol principal. O óleo de semente de cártamo da invenção tem de preferência entre cerca de 150 e cerca de 250 mg de esterol total/100 g, sendo o sitosterol o esterol principal. O óleo de semente de amendoim da invenção tem preferencialmente entre cerca de 100 e cerca de 200 mg de esterol total/100 g, sendo o sitosterol o esterol principal. O óleo de semente de gergelim da invenção tem preferencialmente entre cerca de 400 e cerca de 600 mg de esterol total/100 g, sendo o sitosterol o esterol principal. O óleo de semente de girassol da invenção tem preferencialmente entre cerca de 200 e 400 mg de esterol total/100 g, sendo o sitosterol o esterol principal. Os óleos obtidos a partir de partes egetativas de plantas de acordo com a invenção têm preferencialmente menos de 200 mg de esterol total/100 g, mais preferencialmente menos de 100 mg de esterol total/100 g e mais preferencialmente menos de 50 mg de esteróis totais/100 g, sendo a maior parte dos esteróis livres sendo esteróis livres.

[291] Tal como aqui utilizado, o termo "óleo de semente" refere-se a uma composição obtida a partir da semente/grão de uma planta que compreende pelo menos 60% (p/p) de lipídeo, ou pode ser obtida da semente/grão se o óleo de semente ainda está presente na semente/grão. Isto é, óleo de semente da invenção inclui óleo de semente que está presente na semente/grão ou porção do mesmo, bem como o óleo de semente que foi extraído da semente/grão. O óleo de semente é de preferência óleo de semente extraído. O óleo de semente é tipicamente um líquido à temperatura ambiente. Preferencialmente, o teor total de ácidos graxos (TFA) no óleo de semente predominantemente (> 50%) compreende ácidos graxos com pelo menos 16 carbonos de comprimento. Mais preferencialmente, pelo menos 50% dos ácidos graxos totais no óleo de semente são ácidos graxos C18, por exemplo, ácido oleico. Os ácidos graxos estão tipicamente em uma forma esterificada tal como, por exemplo, TAG, DAG, acil-CoA ou fosfolipídeo. Os ácidos graxos podem ser ácidos graxos livres e/ou em uma forma esterificada. Em uma modalidade, pelo menos 50%, mais preferencialmente pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, mais preferencialmente pelo menos 93%, mais preferencialmente pelo menos 94%, mais preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 96%, mais preferencialmente pelo menos 97%, mais preferencialmente pelo menos 98%, mais preferencialmente pelo menos 99% dos ácidos graxos no óleo de semente da invenção podem ser encontrados como TAG. Em uma modalidade, o óleo de semente da invenção é óleo "substancialmente purificado" ou "purificado" que foi separado de um ou mais outros lipídeos, ácidos nucleicos, polipeptídeos ou outras moléculas contaminantes com as quais está associado na semente ou em um extrato de produto bruto. É preferível que o óleo de semente substancialmente purificado seja pelo menos 60% livre, mais preferencialmente pelo menos 75% livre e, mais preferencialmente, pelo menos 90% livre de outros componentes com os quais está associado na semente ou extrato. O óleo de semente da invenção pode ainda compreender moléculas de ácido não graxo tais como, mas não se limitando a, esteróis. Em uma modalidade, o óleo de semente é óleo de canola (Brassica sp. tais como Brassica carinata, Brassica juncea, Brassica napobrassica, Brassica napus) óleo de mostarda (Brassica juncea), outro óleo Brassica (e.g., por exemplo Brassica napobrassica, Brassica camelina), óleo de girassol (Helianthus sp. tais como Helianthus annuus), óleo de linhagensça (Linum usitatissimum), óleo de soja (Glycine max), óleo de cártamo (Carthamus tinctorius), óleo de milho (Zea mays), óleo de tabaco (Nicotiana sp. tais como Nicotiana tabacum ou Nicotiana benthamiana), óleo de amendoim (Arachis hypogaea), óleo de palma (Elaeis guineensis), óleo de semente de algodão (Gossypium hirsutum), óleo de coco (Cocos nucifera), óleo de abacate (Persea americana), azeite (Olea europaea), óleo de caju (Anacardium occidentale), óleo de macadâmia (Macadamia intergrifolia), óleo de amêndoa (Prunus amygdalus), óleo de semente de aveia (Avena sativa), óleo de arroz (Oryza sp. tais como Oryza sativa e Oryza glaberrima), óleo de semente de Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), ou óleo de semente de Acrocomia aculeata (palmeira macaúba), Aracinis hypogaea (amendoim), Astrocaryum murumuru (murumuru), Astrocaryum vulgare (tucumã), Attalea geraensis (Indaiá-rateiro), Attalea humilis (óleo de palma americana), Attalea oleifera (andaiá), Attalea phalerata (uricuri), Attalea speciosa (babaçu), Beta vulgaris (beterreba), Camelina sativa (linho falso), Caryocar brasiliense (pequi), Crambe abyssinica (Couve Abissínia), Cucumis melo (melão), Hordeum vulgare (cevada), Jatropha curcas (nóz física), Joannesia princeps (árvore de nóz de arara), Licania rigida (oiticica), Lupinus angustifolius (tremoço), Mauritia flexuosa (palmeira de buriti), Maximiliana maripa (palmeira de inajá), Miscanthus sp. tais como Miscanthus x giganteus e Miscanthus sinensis, Oenocarpus bacaba (bacaba-do-azeite), Oenocarpus bataua (patauã), Oenocarpus distichus (bacaba-de- leque), Panicum virgatum (painço amarelo), Paraqueiba paraensis (mari), Persea amencana (abacate), Pongamia pinnata (faia indiana), Populus trichocarpa, Ricinus communis (castor), Saccharum sp. (cana de açúcar), Sesamum indicum (sésamo), Solanum tuberosum (batata), Sorghum sp. tais como Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, Theobroma grandiforum (cupuaçu), Trifolium sp., Trithrinax brasiliensis (Palmeira de agulha brasileira e Triticum sp. (trigo), tais como Triticum aestivum. O óleo de semente pode ser extraído da semente/grão por qualquer método conhecido na técnica. Isto tipicamente envolve a extração com solventes não polares, tais como éter dietílico, éter de óleo, clorofórmio/metanol ou misturas de butanol, geralmente associados com o primeiro esmagamento das sementes. Os lipídeos associados com o amido no grão podem ser extraídos com butanol saturado com água. O óleo de semente pode ser "desagregado" por métodos conhecidos na técnica para remover polissacarídeos ou tratados de outras formas para remover contaminantes ou melhorar a pureza, a estabilidade ou a cor. Os TAGs e outros ésteres no óleo de semente podem ser hidrolisados para liberar ácidos graxos livres, ou o óleo de semente hidrogenado, tratado quimicamente ou enzimaticamente como é conhecido na técnica.

[292] Tal como aqui utilizado, o termo "ácido graxo" refere-se a um ácido carboxílico com uma cauda alifática com pelo menos 8 átomos de carbono de comprimento, seja saturado ou não saturado. Os ácidos graxos preferidos têm uma cadeia ligada carbono-carbono de pelo menos 12 carbonos de comprimento. A maioria dos ácidos graxos de ocorrência tem um número par de átomos de carbono porque a sua biossíntese envolve acetato que tem dois átomos de carbono. Os ácidos graxos podem estar no estado livre (não esterificado) ou em uma forma esterificada, tal como parte de uma ligação TAG, DAG, MAG, acil-CoA (tio-éster), ligada a acil-ACP ou outra forma ligada covalentemente. Quando covalentemente ligado em uma forma esterificada, o ácido graxo é aqui referido como um grupo "acil". O ácido graxo pode ser esterificado como um fosfolipídeo, tal como uma fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol ou difosfatidilglicerol. Os ácidos graxos saturados não contêm quaisquer ligações duplas ou outros grupos funcionais ao longo da cadeia. O termo "saturado" refere-se a hidrogênio, em que todos os carbonos (com exceção do grupo ácido carboxílico [-COOH]) contêm tantos hidrogênios quanto possível. Em outras palavras, a extremidade omega (w) contém 3 hidrogênios (CH3-) e cada carbono dentro da cadeia contém 2 hidrogênios (-CH2-). Os ácidos graxos insaturados são de forma semelhante aos ácidos graxos saturados, com a exceção de que um ou mais grupos funcionais alqueno existem ao longo da cadeia, com cada alqueno substituindo uma parte "-CH2-CH2" ligada individualmente da cadeia com uma porção duplamente ligada " -CH = CH- " (isto é, um carbono ligado duplamente a outro carbono). Os dois átmos de carbono seguintes na cadeia que estão ligados a qualquer lado da ligação dupla podem ocorrer em uma configuração cis ou trans.

[293] Como aqui utilizado, os termos "ácido graxo monoinsaturado" ou "MUFA" referem-se a um ácido graxo que compreende pelo menos 12 átomos de carbono na sua cadeia de carbono e apenas um grupo alqueno (ligação dupla carbono- carbono), que pode estar em uma forma esterificada ou não esterificada (livre). Tal como aqui utilizado, os termos "ácido graxo poli-insaturado" ou "PUFA" referem-se a um ácido graxo que compreende pelo menos 12 átomos de carbono na sua cadeia de carbono e pelo menos dois grupos alqueno (ligações duplas carbono-carbono) esterificados ou não esterificados.

[294] Como aqui utilizado, um ácido graxo com um "comprimento de cadeia médio", também referido como "MCFA", compreende uma cadeia acil de 8 a 14 carbonos. A cadeia acil pode ser modificada (por exemplo, pode compreender uma ou mais ligações duplas, um grupo hidroxil, um grupo expóxi, etc) ou não modificada (saturada). Estes termos incluem pelo menos uma ou mais ou todos de ácido caprílico (C8:0), ácido cáprico (C10:0), ácido láurico (C12:0), e ácido mirístico (C14:0).

[295] "Monoacilglicerídeo" ou "MAG" é glicerídeo em que o glicerol é esterificado com um ácido graxo. Tal como aqui utilizado, o MAG compreende um grupo hidroxil em um grupo em um posição sn-1/3 (também aqui referido como sn-1 MAG ou 1- MAG ou 1/3-MAG) ou posição sn-2 (também referido aqui como 2- MAG) e, por conseguinte, MAG não inclui moléculas fosforiladas, tais como PA ou PC. MAG é, portanto, um componente de lipídeos neutros em uma célula.

[296] "Diacilglicerídeo" ou "DAG" é glicerídeo em que o glicerol é esterificado com dois ácidos graxos que podem ser iguais ou, de preferência, diferentes. Tal como aqui utilizado, o DAG compreende um grupo hidroxil em uma posição sn-1,3 ou uma posição sn-2, e portanto DAG não inclui moléculas fosforiladas, tais como PA ou PC. DAG é, portanto, um componente de lipídeos neutros em uma célula. Na via de Kennedy da síntese de DAG (Figura 1), o precursorsn-glicerol- 3-fosfato (G3P) é esterificado com dois grupos acil, cada um proveniente de um éster de coenzima A de ácido graxo, em uma primeira reação catalisada por uma glicerol-3-fosfato aciltransferase (GPAT) na posição sn-1 para formar LysoPA, seguido de uma segunda acilação na posição sn-2 catalisado por uma aciltransferase de ácido lisofosfatídico (LPAAT) para formar ácido fosfatídico (PA). Este intermediário é então desfosforilado por PAP para formar DAG. O DAG pode também ser formado a partir de TAG por remoção de um grupo acil por uma lipase, ou de PC essencialmente por remoção de um grupo principal de colina por qualquer das enzimas PDCT, PLC ou PLD (Figura 1).

[297] "Triacilglicerídeos" ou "TAG" é glicerídeo em que o glicerol é esterificado com três ácidos graxos que podem ser os mesmos (por exemplo, como em tri-oleína) ou, mais comumente, diferentes. Na via de Kennedy da síntese de TAG, DAG é formado como descrito acima, e então um terceiro grupo acil é esterificado ao esqueleto de glicerol pela atividade de DGAT. As vias alternativas para a formação de TAG incluem um catalisado pela enzima PDAT (Figura 1) e a via MGAT aqui descrito.

[298] Tal como aqui utilizado, o termo "tipo selvagem" ou suas variações refere-se a uma parte vegetativa da planta, a uma célula, a uma semente ou a um organismo não humano ou parte da mesma, tal como um tubérculo ou beterraba, que não foi geneticamente modificado, um polinucleotídeo(s) exógeno(s), de acordo com esta invenção.

[299] O termo "correspondente" refere-se a uma parte vegetativa da planta, a uma célula, a uma semente ou a um organismo não humano ou parte do mesmo (tal como um tubérculo ou beterraba) que tem o mesmo ou semelhante histórico genético de uma parte vegetativa da planta, uma célula, uma semente ou organismo não humano ou parte do mesmo, mas que não tenha sido modificado como aqui descrito (por exemplo, uma parte vegetativa da planta, uma célula, uma semente ou um organismo não humano ou uma parte do mesmo que não possua o(s) polinucleotídeo(s) exógeno(s) e/ou não tem a(s) modificação(ões) genética(s). Em uma modalidade preferida, a parte vegetativa correspondente, a célula eucariótica, a semente ou o organismo não humano ou parte do mesmo está no mesmo estágio de desenvolvimento que a parte vegetativa da planta, célula eucariótica, semente ou organismo não humano ou parte do mesmo da invenção. Por exemplo, se o organismo não humano é uma planta florescendo, então, de preferência, a planta correspondente também está florescendo. Pode utilizar-se uma parte vegetativa da planta correspondente, uma célula eucariótica, uma semente ou um organismo não humano ou uma parte do mesmo, como controle para comparar os níveis de expressão de ácido nucleico ou proteína, ou a extensão e natureza da modificação de traços, por exemplo produção e/ou teor de lipídeos não polares, com a parte vegetativa da planta, célula eucariótica, semente ou organismo não humano ou parte da mesma da invenção que é modificada como aqui descrito. Uma pessoas versada na técnica é prontamente capaz de determinar uma parte vegetativa da planta "correspondente" apropriada, célula eucariótica, semente ou organismo não humano ou parte do mesmo, tecido, órgão ou organismo para tal comparação.

[300] Tal como aqui utilizado, "em comparação com" ou "em relação a" refere-se a comparação de níveis de um lipídeo não polar, teor de lipídeos não polares totais, teor de ácidos graxos ou outro parâmetro da parte vegetativa da planta, célula eucariótica, um organismo humano ou parte do mesmo (tal como um tubérculo ou beterraba) que expressa um ou mais polinucleotídeos exógenos ou polipeptídeos exógenos com uma parte vegetativa da planta, célula eucariótica, semente, organismo não humano ou parte do mesmo sem um ou mais polinucleotídeos ou polipeptídeos exógenos.

[301] Tal como aqui utilizado, "capacidade potencializada para produzir lipídeo não polar" é um termo relativo que se refere à quantidade de lipídeos não polares totais que é produzido por uma parte vegetativa da planta, célula eucariótica, semente ou organismo não humano ou parte do mesmo (tal como um tubérculo ou beterraba) da invenção sendo aumentada em relação a uma parte vegetativa da planta correspondente, célula eucariótica, semente ou organismo não humano ou parte do mesmo. Em uma modalidade, o teor de ácido graxo TAG e/ou poli-insaturado, ou o teor de ácido oleico no teor de ácidos graxos totais do lipídeo não polar é aumentado, ou o teor de ácido linolênico no teor de ácidos graxos totais dos lipídeos não polares é reduzido, por exemplo em pelo menos 2% em termos absolutos.

[302] Tal como aqui utilizado, os termos "sinergismo", "sinérgico", "atuando sinergicamente" e relacionados são, cada um, um termo comparativo que significa que o efeito de uma combinação de elementos presentes em uma célula, planta ou parte da mesma da invenção, por exemplo uma combinação de elementos A e B, é maior do que a soma dos efeitos dos elementos separadamente em células, plantas ou partes das mesmas correspondentes, por exemplo a soma do efeito de A e o efeito de B. Quando mais de dois elementos estão presentes na célula, planta ou parte da mesma, por exemplo, elementos A, B e C, significa que o efeito da combinação de todos os elementos é maior do que a soma dos efeitos dos efeitos individuais dos elementos. Em uma modalidade preferida, significa que o efeito da combinação de elementos A, B e C é maior do que a soma do efeito dos elementos A e B combinados e o efeito do elemento C. Nesse caso, pode-se dizer que o elemento C atua sinergicamente com os elementos A e B Como seria entendido, os efeitos são medidos em células, plantas ou partes das mesmas correspondentes, por exemplo cultivadas nas mesmas condições e no mesmo estágio de desenvolvimento biológico.

[303] Tal como aqui utilizado, "germinar a uma taxa substancialmente a mesma que para uma planta de tipo selvagem correspondente" refere-se a semente de uma planta da invenção que é relativamente capaz de germinar quando comparada com a semente de uma planta de tipo selvagem sem o polinucleotídeo(s) exógeno(s) definido(s). A germinação pode ser medida in vitro ono meio de cultura de tecidos ou no solo como ocorre no campo. Em uma modalidade, o número de sementes que germinam, por exemplo quando cultivadas em condições de estufa ótimas para a espécie vegetal, é pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 90%, quando comparado com a semente correspondente de tipo selvagem. Em uma outra modalidade, as sementes que germinam, por exemplo quando cultivadas sob condições ótimas de estufa para as espécies de plantas, produzem mudas que crescem a uma taxa que, em média, é pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 90%, quando comparadas a plantas de tipo selvagem correspondentes. Isto é referido como "vigor de mudas". Em uma modalidade, a taxa de crescimento inicial de raízes e crescimento de brotos de mudas da invenção é essencialmente a mesma em comparação com uma planta de semente de tipo selvagem correspondente cultivada sob as mesmas condições. Em uma modalidade, a biomassa foliar (peso seco) das plantas da invenção é pelo menos 80%, de preferência pelo menos 90%, da biomassa foliar em relação a uma planta correspondente de tipo selvagem cultivada nas mesmas condições, preferencialmente no campo. Em uma modalidade, a altura das plantas da invenção é pelo menos 70%, de preferência pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 90%, da altura da planta em relação a uma planta correspondente de tipo selvagem cultivada nas mesmas condições, de preferência no campo e preferencialmente na maturidade.

[304] Tal como aqui utilizado, o termo "um polinucleotídeo exógeno que infrarregula a produção e/ou atividade de um polipeptídeo endógeno" ou suas variações, refere-se a um polinucleotídeo que codifica uma molécula de RNA (por exemplo, codificando um amiRNA ou hpRNAi) que infrarregula a produção e/ou atividade, ou infrarregula a produção e/ou atividade por si só (por exemplo, é um amiRNA ou hpRNA que pode ser administrado diretamente a, por exemplo, uma célula) de um polipeptídeo endógeno, por exemplo, SDP1 TAG lipase, GPAT plastidial, LPAAT plastidial, polipeptídeo TGD, AGPase, ou ácidos graxos delta-12 desturase (FAD2), ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos. Tipicamente, a molécula de RNA diminui a expressão de um gene endógeno que codifica o polipeptídeo.

[305] Tal como aqui utilizado, o termo "em uma base de peso" refere-se ao peso de uma substância (por exemplo, TAG, DAG, ácido graxo) como uma percentagem do peso da composição que compreende a substância (por exemplo, semente, folha). Por exemplo, se uma semente transgênica tem 25 μg ácidos graxos totais por 120 μg de peso de semente; a percentagem de ácido graxo total em uma base de peso é de 20,8%.

[306] Tal como aqui utilizado, o termo "em uma base relativa" refere-se a um parâmetro tal como a quantidade de uma substância em uma composição que compreende a substância, em comparação com o parâmetro correspondente para uma composição, em percentagem. Por exemplo, uma redução de 3 unidades a 2 unidades é uma redução de 33% em uma base relativa.

[307] Tal como aqui utilizado, os plastídeos são organelas em plantas, incluindo algas, que são o local de fabricação de compostos à base de carbono a partir da fotossíntese, incluindo açúcares, amido e ácidos graxos. Plastídeos incluem cloroplastos que contêm clorofila e realizam fotossíntese, etioplastos que são os predecessores de cloroplastos, bem como plastídeos especializados, tais como cromoplastos que são plastídeos coloridos para síntese e armazenamento de pigmentos, gerontoplastos que controlam o desmantelamento do aparelho fotossintético durante a senescência, amilófitos para a síntese e armazenagem de amido, eleioplastos para armazenamento de lipídeos e proteinoplastos para armazenamento e modificação de proteínas.

[308] Tal como aqui utilizado, o termo "biocombustível" refere-se a qualquer tipo de combustível, tal como se utiliza normalmente para máquinas de energia, tais como automóveis, aviões, barcos, caminhões ou motores movidos a óleo, cuja energia é derivada da fixação biológica de carbono. Os biocombustíveis incluem combustíveis derivados de conversão de biomassa, bem como biomassa sólida, combustíveis líquidos e biogás. Exemplos de biocombustíveis incluem bioalcoois, biodiesel, diesel sintético, óleo vegetal, bioéteres, biogás, gás de síntese, biocombustíveis sólidos, combustível derivado de algas, biohidrogênio, biometanol, 2,5-dimetilfurano (DMF), éter biodimetílico (bioDME), Fischer-Tropsch Diesel, biohidrogênio diesel, álcoois mistos e diesel de madeira.

[309] Tal como aqui utilizado, o termo "bioálcool" refere-se a álcoois produzidos biologicamente, por exemplo, etanol, propanol e butanol. Os bioálcoois são produzidos pela ação de micro-organismos e/ou enzimas através da fermentação de açúcares, hemicelulose ou celulose.

[310] Tal como aqui utilizado, o termo "biodiesel" refere-se a uma composição compreendendo ésteres de metil ou de etil de ácidos graxos derivados de lipídeos por transesterificação, sendo que os lipídeos provenientes de células vivas não combustíveis fósseis.

[311] Tal como aqui utilizado, o termo "diesel sintético" refere-se a uma forma de combustível diesel que é derivado de matéria-prima renovável em vez da matéria-prima fóssil utilizada na maioria dos combustíveis para motores diesel.

[312] Como aqui utilizado, o termo "óleo vegetal" inclui um óleo vegetal puro (ou óleo vegetal retilíneo) ou um óleo vegetal residual (por produto de outras indústrias), incluindo o óleo produzido quer em uma parte vegetativa da planta ou na semente.

[313] Tal como aqui utilizado, o termo "biogás" refere-se a metano ou uma mistura inflamável de metano e outros gases produzidos por digestão anaeróbica de material orgânico por anaeróbios.

[314] Tal como aqui utilizado, o termo "gás de síntese" refere-se a uma mistura de gás que contém quantidades variáveis de monóxido de carbono e hidrogênio e possivelmente outros hidrocarbonetos, produzidos por combustão parcial de biomassa. O gás de síntese pode ser convertido em metanol na presença de um catalisador (normalmente à base de cobre), com subsequente desidratação do metanol na presença de um catalisador diferente (por exemplo, sílica-alumina).

[315] Tal como aqui utilizado, o termo "Fischer-Tropsch" refere-se a um conjunto de reações químicas que convertem uma mistura de monóxido de carbono e hidrogênio em hidrocarbonetos líquidos. O gás de síntese pode primeiro ser condicionado usando, por exemplo, uma mudança de gás de água para atingir a razão H2/CO. A conversão ocorre na presença de um catalisador, normalmente ferro ou cobalto. A temperatura, pressão e catalisador determinam se é produzido um sincrude leve ou pesado. Por exemplo, a 330°C principalmente gasolina e olefinas são produzidas, enquanto que a 180° a 250°C principalmente diesel e ceras são produzidos. Os líquidos produzidos a partir de gás de síntese, que compreendem várias frações de hidrocarboneto, são hidrocarbonetos de cadeia linear muito depurados (sem enxofre).

[316] Tal como aqui utilizado, o termo "biocarvão" refere-se a carvão feito a partir de biomassa, por exemplo, por pirólise de biomassa.

[317] Como aqui utilizado, o termo "matéria-prima" refere-se a um material, por exemplo, biomassa ou um seu produto de conversão (por exemplo, gás de síntese) quando utilizado para produzir um produto, por exemplo, um biocombustível, tal como biodiesel ou um diesel sintético.

[318] Tal como aqui utilizado, o termo "produto industrial" refere-se a um produto de hidrocarboneto que é predominantemente feito de carbono e hidrogênio, tais como ésteres de metil e/ou etil de ácidos graxo ou alcanos, tais como metano, misturas de alcanos de cadeia mais longa que são tipicamente líquidos a temperaturas ambiente, um biocombustível, monóxido de carbono e/ou hidrogênio, ou um bioálcool, tal como etanol, propanol ou butanol, ou biocarvão O termo "produto industrial" destina-se a incluir produtos intermediários que podem ser convertidos para outros produtos industriais, por exemplo, o gás de síntese é considerado um produto industrial que pode ser utilizado para sintetizar um produto de hidrocarboneto que é também considerado um produto industrial. O termo produto industrial, tal como aqui utilizado inclui ambas as formas puras dos compostos acima, ou mais vulgarmente uma mistura de vários compostos e componentes, por exemplo o produto de hidrocarboneto pode conter um intervalo de comprimentos de cadeia de carbono, como bem entendido na técnica.

[319] Tal como aqui utilizado, "descendência" significa as gerações imediatas e todas subsequentes de prole produzidas a partir de um progenitor, por exemplo uma segunda, terceira ou posterior geração.

[320]Ao longo deste relatório descritivo, a palavra "compreende", ou variações como "compreendem" ou "compreendendo" serão entendidas como implicando na inclusão de um elemento citado, número inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, integrais ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de números inteiros.

[321] O termo "e/ou", por exemplo, "X e/ou Y" deve ser entendido como significando "X e Y" ou "X ou Y" e deve ser tomado para fornecer apoio explícito para ambos os significados ou para qualquer um dos significados.

[322] Tal como aqui utilizado, o termo, salvo indicação em contrário, refere-se a +/- 10%, mais preferencialmente +/5%, mais preferencialmente +/- 2%, mais preferencialmente +/1%, ainda mais preferencialmente + / - 0,5% do valor designado.

Produção de lipídos não polares e triacilgliceróis

[323] A presente invenção baseia-se na descoberta de que o teor de lipídeos não polares em células eucarióticas recombinantes pode ser aumentado por uma combinação de modificações selecionadas daquelas aqui designadas como: (A). Impulsionar (B). Retirar, (C). Proteger, (D). Empacotamento, (E). Exportação plastidial, (F). Importação plastidial e (G). Via procariótica. Como aqui descrito, as células sem plastídeos podem compreender várias combinações de A-D, enquanto que as células com plastídeos, tais como células vegetaiss e algas, podem compreender várias combinações de A-G.

[324] Células recombinantes, animais não humanos transgênicos ou uma parte dos mesmos e plantas transgênicas ou partes das mesmas, da invenção, portanto, têm uma série de combinações de polinucleotídeos exógenos e/ou modificações genéticas, cada uma das quais fornece uma das modificações. Estes polinucleótidos exógenos e/ou modificações genéticas incluem: (A) Um polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo do fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na célula, animal não humano transgênico ou parte do mesmo, ou planta transgênica ou parte da mesma, fornecendo a modificação "Impulsionar" (B) um polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeo não polares na célula, animal não humano transgênico ou parte do mesmo, ou planta transgênica ou parte da mesma fornecendo a modificação "Retirar", (C) uma modificação genética que infrarregula a produção e/ou a atividade endógena de um polipeptídeo envolvido no catabolismo de triacilgliceróis (TAG) na célula, animal não humano transgênico ou parte do mesmo, ou planta transgênica ou parte da mesma quando comparado com uma célula correspondente, animal não humano transgânico ou parte do mesmo ou planta transgênica ou parte da mesma sem a modificação genética, fornecendo a modificação "Proteger", (D) um polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo de revestimento de corpo oleoso (OBC), proporcionando a modificação "Empacotamento", (E) um polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo que aumenta a exportação de ácidos graxos para fora dos plastídeos da célula, animal transgênico ou parte do mesmo, ou planta transgênica ou parte do mesmo, quando comparado com uma célula correspondente, animal não humano transgênico ou parte do mesmo, ou planta transgênica ou parte do mesmo sem o polinucleotídeo exógeno, fornecendo a modificação "Exportação Plastidial" (F) uma modificação genética que infrarregula a produção e/ou a atividade endógena de um polipeptídeo envolvido na importação de ácidos graxos nos plastídeos da célula, animal não humano transgênico ou parte do mesmo, ou planta transgênica ou parte da mesma quando comparado com uma célula correspondente, animal não humano transgênico ou parte do mesmo ou planta transgênica ou parte da mesma sem a modificação genética, fornecendo a modificação "Importação Plastidial", e G) uma modificação genética que infrarregula a produção e/ou a atividade endógena de um polipeptídeo envolvido na produção de diacilglicerol (DAG) no plastídeo da célula, animal não humano transgênico ou parte do mesmo, ou planta transgênica ou parte da mesma quando comparado com uma célula correspondente, animal não humano transgânico ou parte do mesmo ou planta transgênica ou parte da mesma sem a modificação genética, fornecendo a modificação "Via procariótica",

[325]As combinações preferidas (também aqui referidos como conjuntos) de polinucleotídeos exógenos e/ou modificações genéticas da invenção são; 1) A, B e, opcionalmente, um de C, D, E, F ou G; 2) A, C e, opcionalmente, um de D, E, F ou G; 3) A, D e, opcionalmente, um de E, F ou G; 4) A, E e, opcionalmente, F ou G; 5) A, F e, opcionalmente, G; 6) A e G; 7) A, B, C e, opcionalmente, um de D, E, F ou G; 8) A, B, D e, opcionalmente, um de E, F ou G; 9) A, B, E e, opcionalmente, F ou G; 10) A, B, F e, opcionalmente G; 11) A, B, C, D e, opcionalmente, um de E, F ou G; 12) A, B, E e, opcionalmente, F ou G; 13) A, B, C, F e, opcionalmente G; 14) A, B, D, E e, opcionalmente F ou G; 15) A, B, D, F e, opcionalmente G; 16) A, B, E, F e, opcionalmente, G; 17) A, C, D e, opcionalmente, um de E, F ou G; 18) A, C, E e, opcionalmente, F ou G; 19) A, C, F e, opcionalmente, G; 20) A, C, D, E e, opcionalmente, F ou G; 21) A, C, D, F e, opcionalmente, G; 22) A, C, E, F e, opcionalmente uma quinta modificação G; 23) A, D, E e, opcionalmente F ou G; 24) A, D, F e, opcionalmente, G; 25) A, D, E, F e, opcionalmente, G; 26) A, E, F e, opcionalmente, G; 27) Seis de A, B, C, D, E, F e G omitindo um de A, B, C, D, E, F ou G, e 28) Qualquer um de 1-26 acima onde existem dois ou mais polinucleotídeos exógenos codificando dois ou mais polipeptídeos de fator de transcrição diferentes que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos de ácidos glicolíticos e/ou ácidos graxos na célula, por exemplo um polinucleotídeo exógeno codificando WRI1 e outro polinucleotídeo exógeno que codifica LEC2.

[326] Em cada uma das combinações preferidas acima podem existir pelo menos dois polinucleotídeos exógenos que codificam pelo menos dois polipeptídeos de fator de transcrição diferentes que aumentam a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na célula, animal não humano transgênico ou parte do mesmo ou planta transgênica ou parte da mesma.

[327] Estas modificações são descritas a seguir: A. A modificação "Impulsionar" é caracterizada por um aumento da síntese de ácidos graxos totais nos plastídeos da célula eucariótica. Em uma modalidade, isto ocorre pelo aumento da expressão e/ou atividade de um fator de transcrição que regula a síntese de ácidos graxos nos plastídeos. Em uma modalidade, isto pode ser conseguido expressando em uma célula transgênica um polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo do fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou ácidos graxos na célula. Em uma modalidade, a síntese aumentada de ácidos graxos não é causada pela provisão à célula de uma ACCase alterada cuja atividade é menos inibida pelos ácidos graxos, em relação à ACCase endógena na célula. Em uma modalidade, a célula compreende um polinucleotídeo exógeno que codifica o fator de transcrição, de preferência sob o controle de um promotor diferente de um promotor constitutivo. O fator de transcrição pode ser selecionado do grupo que consiste em WRI1, LEC1, tipo LEC1, LEC2, BBM, FUS3, ABI3, ABI4, ABI5, Dof4, Dof11 ou do grupo consistindo em MYB73, bZIP53, AGL15, MYB115, MYB118, TANMEI, WUS, GFR2a1, GFR2a2 e PHR1, e é preferivelmente WRI1, LEC1 ou LEC2. Em uma outra modalidade, o aumento da síntese de ácidos graxos totais é relativo a uma célula de tipo selvagem correspondente. Em uma modalidade existem dois ou mais polinucleotídeos exógenos codificando dois ou mais polipeptídeos do fator de transcrição diferentes. B. A modificação "Retirar" é caracterizada por aumento da expressão e/ou atividade na célula de uma ácido graxo aciltransferase, que catalisa a síntese de TAG, DAG ou MAG na célula, tal como uma DGAT, PDAT, LPAAT, GPAT MGAT ou, de preferência, uma DGAT ou PDAT. Em uma modalidade, isto pode ser conseguido expressando em uma célula transgênica um polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares. Em uma modalidade, a aciltransferase é uma aciltransferase ligada à membrana que utiliza um substrato acil-CoA como doador de acil no caso de DGAT, LPAAT, GPAT ou MGAT, ou um grupo acil de PC como dador de acil no caso de PDAT. A modificação de Retirar pode ser relativa a uma célula de tipo selvagem correspondente ou, de preferência, relativamente a uma célula correspondente que tenha a modificação Impulsionar. Em uma modalidade, a célula compreende um polinucleotídeo exógeno que codifica a ácido graxo aciltransferase. C. A modificação "Proteger" caracteriza-se por uma redução no catabolismo de triacilgliceróis (TAG) na célula. Em uma modalidade, isto pode ser conseguido por meio de uma modificação genética na célula que infrarregula a produção e/ou a atividade de um polipeptídeo envolvido no catabolismo de triacilgliceróis (TAG) na célula endógena quando comparada a uma célula correspondente sem a modificação genética. Na modalidade, a célula tem uma expressão e/ou atividade reduzida de uma TAG lipase endógena na célula, de preferência uma SDP1 lipase, um polipeptídeo Cgi58, uma acil-CoA oxidase, tais como ACX1 ou ACX2, ou um polipeptídeo envolvido na β- oxidação de ácidos graxos na célula, tal como um transportador de cassete de ligação ATP peroxisomal PXA1. Isto pode ocorrer por expressão na célula de um polinucleotídeo exógeno que codifica uma molécula de RNA que reduz a expressão de, por exemplo, um gene endógeno que codifica a TAG lipase, tal como a SDP1 lipase, acil-CoA oxidase oou o polipeptídeo envolvido na e-oxidação de ácidos graxos na célula, ou por uma mutação em um gene endógeno que codifica, por exemplo, a TAG lipase, acul-CoA oxidase ou polipeptídeo envolvido na e-oxidação de ácidos graxos. Em uma modalidade, a expressão e/ou atividade reduzida é relativa a uma célula de tipo selvagem correspondente, ou é relativa a uma célula correspondente que tem a modificação Impulsionar. D. A modificação "Empacotamento" é caracterizada por uma expressão aumentada e/ou acumulação de um polipeptídeo de revestimento de corpo oleoso (OBC). Em uma modalidade, isto pode ser conseguido expressando em uma célula transgênica um polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo de revestimento de corpo oleoso (OBC). O polipeptídeo OBC pode ser uma oleosina, tal como, por exemplo, uma polioleosina, uma caoleosina ou uma esteroleosina, ou preferivelmente LDAP. Em uma modalidade, o nível de oleosina que é acumulado na célula eucariótica é pelo menos 2 vezes superior em relação à célula correspondente compreendendo o gene de oleosina a partir do T-DNA de pJP3502. Em uma modalidade, a expressão aumentada ou acumulação do polipeptídeo OBC não é causada apenas pela modificação Impulsionar. Em uma modalidade, a expressão e/ou atividade reduzida é relativa a uma célula de tipo selvagem correspondente, ou, preferivelmente é relativa a uma célula correspondente que tem a modificação Impulsionar. E. A modificação "Exportação plastidial" é caracterizada por um aumento da taxa de exportação de ácidos graxos totais para fora dos plastídeos da célula eucariótica. Em uma modalidade, isto pode ser conseguido expressando em uma célula transgênica um polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo que aumenta a exportação de ácidos graxos para fora dos plastídeos da célula quando comparada com uma célula correspondente sem o polinucleotídeo exógeno. Em uma modalidade, isto ocorre pelo aumento da expressão e/ou atividade de uma ácido graxo tioesterase (TE), um polipeptídeo transportador de ácido graxo, tal como um polipeptídeo ABCA9, ou uma acil-CoA de cadeia longa sintetase (LACS). Em uma modalidade, a célula compreende um polinucleotídeo exógeno que codifica a TE, polipeptídeo transportador de ácido graxo ou LACS. A TE pode ser um polipeptídeo FATB ou preferencialmente um polipeptídeo FATA. Em uma modalidade, a TE é preferencialmente uma TE com especificidade para MCFA. Em uma modalidade, a modificação de Exportação plastidial é relativa a uma célula correspondente de tipo selvagem ou, de preferência, relativa a uma célula correspondente que tem a modificação de Impulsionar. F. A modificação "Importação plastidial" é caracterizada por uma taxa reduzida de importação de ácidos graxos nos plastídeos da célula a partir do exterior dos plastídeos. Em uma modalidade, isto pode ser conseguido por meio de uma modificação genética na célula que infrarregula a produção e/ou atividade de um polipeptídeo envolvido na importação de ácidos graxos nos plastídeos da célula, quando comparado com uma célula correspondente sem a modificação genética endógena. Por exemplo, isto pode ocorrer por expressão na célula de um polinucleotídeo exógeno que codifica uma molécula de RNA que reduz a expressão de um gene endógeno que codifica um polipeptídeo transportador, tal como um polipeptídeo TGD, por exemplo, um polipeptídeo TGD1, TGD2, TGD3 ou TGD4, ou por uma mutação em um gene endógeno que codifica o polipeptídeo TGD. Em uma modalidade, a taxa reduzida de importação é relativa a uma célula correspondente de tipo selvagem ou relativa a uma célula correspondente que tem a modificação Importação. G. A modificação "Via procariótica" é caracterizada por uma quantidade de DAG ou taxa de produção de DAG reduzida nos plastídeos da célula. Em uma modalidade, isto pode ser conseguido por meio de uma modificação genética na célula que infrarregula a produção e/ou a atividade de um polipeptídeo envolvido na produção de diacilgliceróis (DAG) no plastídeo quando comparada a uma célula correspondente sem a modificação genética. Em uma modalidade, a quantidade ou taxa de produção de DAG reduzida ocorre por uma produção reduzida de LPA a partir de acil-ACP e G3P nos plastídeos. A quantidade ou taxa de produção de DAG reduzida pode ocorrer por expressão na célula de um polinucleotídeo exógeno que codifica uma molécula de RNA que reduz a expressão de um gene endógeno que codifica GPAT plastidial, LPAAT plastidial ou PAP plastidial, preferencialmente GPAT plastidial, ou por uma mutação em um gene endógeno que codifica o polipeptídeo plastidial. Em uma modalidade, a quantidade ou taxa de produção de DAG reduzida é relativa a uma célula de tipo selvagem correspondente ou, de preferência, relativa a uma célula correspondente que tem a modificação Impulsionar.

[328]A modificação Impulsionar é essencial para a invenção, e a modificação Retirar é preferida. As modificações Proteger e Empacotamento podem ser complementares, ou seja, uma das duas pode ser suficiente. A célula pode compreender uma, duas ou todas as três modificações de Exportação Plastidial, Importação plastidial e Via procariótica. Em uma modalidade, pelo menos um dos polinucleotídeos exógenos na célula, de preferência pelo menos o polinucleotídeo exógeno que codifica o fator de transcrição que regula a síntese de ácidos graxos nos plastídeos, é expresso sob o controle de (H) um promotor diferente de um promotor constitutivo, tal como, por exemplo, um promotor relacionado com o desenvolvimento, um promotor que seja preferencialmente ativo em células fotossintéticas, um promotor específico de tecido, um promotor que tenha sido modificado por redução do seu nível de expressão em relação a um promotor nativo correspondente ou seja preferencialmente uma senescência. Mais preferencialmente, pelo menos o polinucleotídeo exógeno que codifica o fator de transcrição que regula a síntese de ácidos graxos nos plastídeos é expresso sob o controle de um promotor diferente de um promotor constitutivo e o polinucleotídeo exógeno que codifica uma molécula de RNA que infrarregula a produção endógena e/ou atividade de um polipeptídeo envolvido no catabolismo de triacilgliceróis é também expressa sob o controle de um promotor diferente de um promotor constitutivo, cujos promotores podem ser iguais ou diferentes.

[329]As plantas produzem alguns, mas não todos, dos seus lipídeos de membrana, tais como MGDG em plastídeos pela chamada via procariótica (Figura 1). Nas plantas, existe também uma via eucariótica para a síntese de galactolipídeos e glicerolipídeos que sintetiza FA primeiramente no plastídeo e depois monta a FA nos glicerolipídeos no ER. O MGDG sintetizado pela via eucariótica contém ácido graxo C18:3 (ALA) esterificado na posição sn-2 de MGDG. A cadeia principal de DAG incluindo ALA para a síntese de MGDG por esta via é montada no ER e depois importada para o plastídeo. Em contraste, o MGDG sintetizado pela via procariótica contém ácido graxo C16:3 esterificado na posição sn-2 de MGDG. A razão da contribuição da via procariótica em relação à via eucariótica na produção de MGDG (16:3) vs MGDG (18:3) é uma característica distinta e específica de diferentes espécies de plantas (Mongrand et al. 1998). Esta composição distinta de ácidos graxos do MGDG permite que todas as plantas superiores (angiospermas) sejam classificadas como plantas 16:3 ou 18:3. espécies 16:3, exemplificadas por Arabidopsis e Brassica napus, geralmente têm ambas as vias procarióticas e eucarióticas da síntese de MGDG operando, enquanto que as espécies 18:3 exemplificadas por Nicotiana tabacum, Pisum sativum e Glycine max geralmente tem apenas (ou quase inteiramente) a via eucariótica da síntese de MGDG, fornecendo pouca ou nenhuma acumulação de ácidos graxos C16:3 nos tecidos vegetativos. Tal como aqui utilizado, uma "planta 16:3" ou "espécie 16:3" é uma que tem mais de 2% de ácido graxo C16:3 no teor de ácidos graxos totais dos seus tecidos fotossintéticos. Tal como aqui utilizado, uma "planta 18:3" ou "espécie 18:3" é uma que tem menos de 2% de ácido graxo C16:3 no teor de ácidos graxos totais dos seus tecidos fotossintéticos. Tal como aqui descrito, uma planta pode ser convertida de ser uma planta 16:3 para uma planta 183 por modificações genéticas adequadas. A razão de fluxo entre as vias procariotas e eucariotas não é conservada em diferentes espécies ou tecidos de plantas. Em espécies 16:3 até 40% de fluxo em folhas ocorre através da via procariótica (Browse et al., 1986), enquanto que em espécies 18:3, tais como ervilha e soja, cerca de 90% dos FAs que são sintetizados no plastídeo são exportados do plastídeo para o ER para fornecer a fonte de FA para a via eucariótica (Ohlrogge e Browse, 1995, Somerville et al., 2000).

[330] Deste modo, diferentes quantidades de ácidos graxos 18:3 e 16:3 são encontradas dentro dos glicolipídeos de diferentes espécies de plantas. Isto é utilizado para distinguir entre plantas 18:3 cujos ácidos graxos com 3 ligações duplas são quase completamente ácidos graxos C18 e as plantas 16:3 que contêm ambos ácidos graxos C16e C18com três ligações duplas. Em cloroplastos de plantas 18:3, as atividades enzimáticas que catalisam a conversão de fosfatidato em diacilglicerol e diacilglicerol em monogalactosil diacilglicerol (MGD) são significativamente menos ativas do que em cloroplastos 16:3. Nas folhas de plantas 18:3, os cloroplastos sintetizam estearoil-ACP2 no estroma, introduzem a primeira ligação dupla na cadeia hidrocarbonada saturada e depois hidrolizam o tioéster por tioesterases (Figura 1). O oleato liberado é exportado através de envelopes de cloroplasto em membranas da parte eucariótica da célula, provavelmente o retículo endoplasmático, onde é incorporado no PC. Os grupos oleoil ligados a PC são desaturados nestas membranas e subsequentemente voltam para o cloroplasto. Os grupos acil ligados a MGD são substratos para a introdução da terceira ligação dupla para produzir MGD com dois resíduos linolenoil. Este galactolipídeo é característico de plantas 18:3. tais como Asteraceae e Fabaceae, por exemplo Em células fotossinteticamente ativas de plantas 16:3 que são representadas, por exemplo, por membros de Apiaceae e Brassicaceae, duas vias operam em paralelo para proporcionar tilacoides com MGD.

[331] Em uma modalidade, a parte vegetativa da planta, célula eucariótica, semente ou organismo não humano transgênico ou parte do mesmo (tal como um tubérculo ou beterraba) da invenção produz níveis mais elevados de lipídeos não polares, tais como TAG ou ácido graxo total (TFA),preferencialmente ambos, do que uma parte vegetativa da planta correspondente, uma célula eucariótica, uma semente ou um organismo não humano ou uma parte do mesmo que não possui as modificações genéticas ou polinucleotídeos exógenos. Em um exemplo, as plantas da invenção produzem sementes, folhas ou têm porções de folhas de pelo menos 1cm2 em área de superfície, caules e/ou tubérculos com um teor aumentado de lipídeos não polares, tal como TAG ou teor de TFA, de preferência ambos, quando comparados com sementes correspondentes, folhas, porções de folhas de pelo menos 1cm2 em superíficie de área, caules ou tubérculos.

[332] Em uma outra modalidade, a parte vegetativa da planta, organismo não humano transgênico ou parte do mesmo (tal como um tubérculo ou beterraba), de preferência uma planta, tubérculo, beterraba ou semente, produz TAGs que são enriquecidos para um ou mais ácidos graxos particulares. Um vasto espectro de ácidos graxos pode ser incorporado em TAGs, incluindo ácidos graxos saturados e insaturados e ácidos graxos de cadeia curta e de cadeia longa. Alguns exemplos não limitativos de ácidos graxos que podem ser incorporados em TAGs e que podem ser aumentados em nível incluem: ácidos graxos cáprico (10:0), láurico (12:0), mirístico (14:0), palmítico (16:0), palmitoleico (16:0), esteárico (18:0), oleico (18:1), vacênico (18:1), linoleico (18:2), eleosteárico (18:3), y-linolênico (18:3), a-linolênico (18:3®3), estearidônico (18:4o3), araquídico (20:0), eicosadienoico (20:2), dihomo-y-linoleico (20:3), eicosatrienoico (20:3), araquidônico (20:4), eicosatetraenoico (20:4), eicosapentaenoico (20:5o3), beênico (22:0), docosapentaenoico (22:5o), docosahexaenoico (22:6o3), lignocérico (24:0), nervônico (24:1), cerótico (26:0), e montânico (28:0). Em uma modalidade da presente invenção, a parte vegetal da planta, a célula eucariótica, a semente ou o organismo transgênico ou partes dos mesmos (tal como um tubérculo ou beterraba) é enriquecida para TAGs compreendendo ácido oleico e/ou é reduzida em ácido linolênico (ALA), de preferência pelo menos 2% ou pelo menos 5% em uma base absoluta.

[333] De preferência, a parte vegetativa da planta, célula eucariótica, semente transgênica ou organismo não humano ou parte do mesmo da presente invenção são transformadas com um ou mais DNAs quiméricos (polinucleotídeos exógenos). No caso de múltiplos DNAs quiméricos, estes são preferencialmente ligados covalentemente em uma molécula de DNA tal como, por exemplo, uma única molécula de T-DNA, e preferencialmente integrados em um único locus no genoma da célula hospedeira. Alternativamente, os DNAs quiméricos estão em duas ou mais moléculas de DNA que podem estar não ligadas no genoma do hospedeiro, ou a(s) molécula(s) de DNA(s) não está integrada no genoma do hospedeiro, tal como ocorre em experiências de expressão transiente. A planta, parte vegetativa da planta, célula eucariótica, semente ou organismo não humano transgênico ou parte do mesmo é preferencialmente homozigótica para uma molécula de DNA inserida no seu genoma. Fatores de Transcrição

[334]Vários fatores de transcrição estão envolvidos em células eucarióticas na síntese de ácidos graxos e lipídeos que incorporam os ácidos graxos, tal como TAG, e, portanto, podem ser manipulados para a modificação Impulsionar. Um fator de transcrição preferido é WRI1. Tal como aqui utilizado, o termo "Wrinkled 1" ou "WRI1" ou "WRL1" refere-se a um fator de transcrição da classe AP2/ERWEBP que regula a expressão de várias enzimas envolvidas na glicólise e de novo biossíntese de ácidos graxos. WRI1 tem dois domínios de ligação ao DNA específicos de plantas (AP2/EREB). WRI1 pelo menos em Arabidopsis também regula a quebra de sacarose via glicólise, regulando deste modo o fornecimento de precursores para a biossíntese de ácidos graxo. Em outras palavras, ele controla o fluxo de carbono da fotossíntese para os lipídeos de armazenamento. Mutanteswri1 em pelo menos Arabidopsis têm um fenótipo de semente enrugado, devido a um defeito na incorporação de sacarose e glicose em TAGs.

[335] Exemplos de genes que são transcritos por WRI1 incluem, mas não estão limitados a, um ou mais, preferencialmente todos os genes que codificam piruvato quinase (At5g52920, At3g22960), subunidade E1alfa de piruvato desidrogenase (PDH) (At1g01090), acetil-CoA carboxilase ACCase), subunidade BCCP2 (At5g15530), enoil-ACP redutase (At2g05990; EAR), fosfoglicerato mutase (At1g22170), fructoquinase citosólica e fosfoglicerato-mutase citosólica, sacarose sintase (SuSy) (ver, por exemplo, Liu et al. 2010b; Baud et al., 2007; Ruuska et al., 2002).

[336]WRI1 contém o domínio conservado AP2 (cd00018). AP2 é um domínio de ligação a DNA encontrado em reguladores de transcrição em plantas, tais como APETALA2 e EREBP (proteína de ligação a elementos sensíveis ao etileno). Em EREBPs o domínio liga-se especificamente à caixa de 11bp GCC do elemento de resposta ao etileno (ERE), um elemento promotor essencial para a capacidade de resposta ao etileno. EREBUs e o fator de ligação C-repeat CBF1, que está envolvido na resposta ao stress, contêm uma única cópia do domínio AP2. Proteínas semelhantes a APETALA2, que desempenham um papel no desenvolvimento da planta contêm duas cópias.

[337] Outros motivos de sequências que podem ser encontrados em WRI1 e seus homólogos funcionais incluem: 1. R G V T/S R H R W T G R (SEQ ID NO:89). 2. F/Y E A H L W D K (SEQ ID NO:90). 3. D L A A L K Y W G (SEQ ID NO:91). 4. S X G F S/A R G X (SEQ ID NO:92). 5. H H H/Q N G R/K W E A R I G R/K V (SEQ ID NO:93). 6. Q E E A A A X Y D (SEQ ID NO:94).

[338] Tal como aqui utilizado, o termo "Wrinkled 1" ou "WRI1" inclui também proteínas "semelhantes a Wrinkled 1" ou "semelhantes a WRI1". Exemplos de proteínas WRI1 incluem Nos de acesso: Q6X5Y6, (Arabidopsis thaliana; SEQ ID NO:22), XP_002876251.1 (Arabidopsis lyrata subsp. Lyrata; SEQ ID NO:23), ABD16282.1 (Brassica napus; SEQ ID NO:24), ADO16346.1 (Brassica napus; SEQ ID NO:25), XP_003530370.1 (Glycine max; SEQ ID NO:26), AEO22131.1 (Jatropha curcas; SEQ ID NO:27), XP_002525305.1 (Ricinus communis; SEQ ID NO:28), XP_002316459.1 (Populus trichocarpa; SEQ ID NO:29), CBI29147.3 (Vitis vinifera; SEQ ID NO:30), XP_003578997.1 (Brachypodium distachyon; SEQ ID NO:31), BAJ86627.1 (Hordeum vulgare subsp. vulgare; SEQ ID NO:32), EAY79792.1 (Oryza sativa; SEQ ID NO:33), XP_002450194.1 (Sorghum bicolor; SEQ ID NO:34), ACG32367.1 (Zea mays; SEQ ID NO:35), XP_003561189.1 (Brachypodium distachyon; SEQ ID NO:36), ABL85061.1 (Brachypodium sylvaticum; SEQ ID NO:37), BAD68417.1 (Oryza sativa; SEQ ID NO:38), XP_002437819.1 (Sorghum bicolor; SEQ ID NO:39), XP_002441444.1 (Sorghum bicolor; SEQ ID NO:40), XP_003530686.1 (Glycine max; SEQ ID NO:41), XP_003553203.1 (Glycine max; SEQ ID NO:42), XP_002315794.1 (Populus trichocarpa; SEQ ID NO:43), XP_002270149.1 (Vitis vinifera; SEQ ID NO:44), XP_003533548.1 (Glycine max; SEQ ID NO:45), XP_003551723.1 (Glycine max; SEQ ID NO:46), XP_003621117.1 (Medicago truncatula; SEQ ID NO:47), XP_002323836.1 (Populus trichocarpa; SEQ ID NO:48), XP_002517474.1 (Ricinus communis; SEQ ID NO:49), CAN79925.1 (Vitis vinifera; SEQ ID NO:50), XP_003572236.1 (Brachypodium distachyon; SEQ ID NO:51), BAD10030.1 (Oryza sativa; SEQ ID NO:52), XP_002444429.1 (Sorghum bicolor; SEQ ID NO:53), NP_001170359.1 (Zea mays; SEQ ID NO:54), XP_002889265.1 (Arabidopsis lyrata subsp. lyrata; SEQ ID NO:55), AAF68121.1 (Arabidopsis thaliana; SEQ ID NO:56), NP_178088.2 (Arabidopsis thaliana; SEQ ID NO:57), XP_002890145.1 (Arabidopsis lyrata subsp. lyrata; SEQ ID NO:58), BAJ33872.1 (Thellungiella halophila; SEQ ID NO:59), NP_563990.1 (Arabidopsis thaliana; SEQ ID NO:60), XP_003530350.1 (Glycine max; SEQ ID NO:61), XP_003578142.1 (Brachypodium distachyon; SEQ ID NO:62), EAZ09147.1 (Oryza sativa; SEQ ID NO:63), XP_002460236.1 (Sorghum bicolor; SEQ ID NO:64), NP_001146338.1 (Zea mays; SEQ ID NO:65), XP_003519167.1 (Glycine max; SEQ ID NO:66), XP_003550676.1 (Glycine max; SEQ ID NO:67), XP_003610261.1 (Medicago truncatula; SEQ ID NO:68), XP_003524030.1 (Glycine max; SEQ ID NO:69), XP_003525949.1 (Glycine max; SEQ ID NO:70), XP_002325111.1 (Populus trichocarpa; SEQ ID NO:71), CBI36586.3 (Vitis vinifera; SEQ ID NO:72), XP_002273046.2 (Vitis vinifera; SEQ ID NO:73), XP_002303866.1 (Populus trichocarpa; SEQ ID NO:74), e CBI25261.3 (Vitis vinifera; SEQ ID NO:75). Outros exemplos incluem Sorbi-WRL1 (SEQ ID NO:76), Lupan-WRL1 (SEQ ID NO:77), Ricco-WRL1 (SEQ ID NO:78) e Lupin angustifolius WRI1 (SEQ ID NO:79). Um WRI1 preferido é um WRI1 de milho ou um WRI1 de sorgo.

[339]Mais recentemente, um subconjunto de fatores de transcrição semelhante a WRI1 foram reclassificados como fatores de transcrição WRI2, WRI3 ou WRI4, que são caracterizados por expressão preferencial em caules e/ou raízes de plantas em vez de desenvolver sementes (To et al., 2012). Apesar da sua reclassificação, estes são incluídos na definição de "WRI1" aqui. Os fatores de transcrição semelhante a WRI1 preferidos são aqueles que podem complementar a função de uma mutação de wri1 em uma planta, particularmente a função no desenvolvimento de sementes da planta, tais como um mutante A. thaliana wri1. A função de um polipeptídeo semelhante a WRI1 pode também ser ensaiada nos ensaios de transiente N. benthamiana tal como aqui descrito.

[340] Tal como aqui utilizado, um polipeptídeo "LEAFY COTYLEDON" ou "LEC" significa um fator de transcrição que é um fator de transcrição LEC1, semelhante a LEC1, LEC2, ABI3 ou FUS3 que exibe um amplo controle sobre a maturação das sementes e a síntese de ácidos graxos. LEC2, FUS3 e ABI3 são polipeptídeos relacionados que contêm, cada um, um domínio de ligação ao DNA B3 de 120 aminoácidos (Yamasaki et al., 2004), que é apenas encontrado em proteínas de plantas. Podem distinguir-se por análise filogenética para determinar a relação na sequência de aminoácidos com os membros dos polipeptídeos A. thaliana tendo os Nos de Acesso como segue: LEC2, N.° de Acessão AAL12004.1; FUS3 (também conhecido como FUSCA3), N.° de Acessão AAC35247. LEC1 pertence a uma classe diferente de polipeptídeos e é homólogo de um HAP3 polipeptídeo da classe de fator de ligação CBF (Lee et al., 2003). Os genes LEC1, LEC2 e FUS3 são necessários na embriogênese precoce para manter o destino das células embrionárias e especificar a identidade do cotilédone e, posteriormente, na iniciação e manutenção da maturação embrionária (Santos-Mendoza et al. 2008). Eles também induzem a expressão de genes que codificam proteínas de armazenamento de sementes por ligação a motivos RY presentes nos promotores e genes de oleosina. Podem também ser distinguidos pelos seus padrões de expressão no desenvolvimento de sementes ou pela sua capacidade de complementar a mutação correspondente em A. thaliana.

[341] Tal como aqui utilizado, o termo "Cotilédone foliar 1" ou "LEC1" refere-se a um fator de transcrição do tipo NF- YB que participa no desenvolvimento zigótico e na embriogênese somática. O gene endógeno é expresso especificamente nas sementes, tanto no embrião quanto no endosperma. LEC1 ativa o gene que codifica WRI1 assim como uma grande classe de genes de síntese de ácidos graxos. A expressão etópica de LEC2 também provoca uma rápida ativação dos genes que respondem à auxina e pode causar a formação de embriões somáticos. Exemplos de polipeptídeos LEC1 incluem proteínas de Arabidopsis thaliana (AAC39488, SEQ ID NO:149), Medicago truncatula (AFK49653, SEQ ID NO:154) e Brassica napus (ADF81045, SEQ ID NO:151), A. lyrata (XP_002862657, SEQ ID NO:150), R. communis (XP_002522740, SEQ ID NO:152), G. max (XP_006582823, SEQ ID NO:153), A. hypogaea (ADC33213, SEQ ID NO:156), Z. mays (AAK95562, SEQ ID NO:155).

[342] Semelhantes a LEC1 (L1L) estão intimamente relacionados com LEC1, mas têm um padrão diferente de expressão gênica, sendo expressos anteriormente durante a embriogênese (Kwong et al., 2003). Exemplos de polipeptídeos semelhantes a LEC1 incluem proteínas de Arabidopsis thaliana (AAN15924, SEQ ID NO:157), Brassica napus (AHI94922, SEQ ID NO:158), e Phaseolus coccineus semelhantes a LEC1 (AAN01148, SEQ ID NO: 159).

[343] Tal como aqui utilizado, o termo "Cotilédone foliar 2" ou "LEC2" refere-se a um fator de transcrição de domínio B3 que participa no desenvolvimento zigótico e na embriogênese somática e que ativa a expressão de um gene que codifica WRI1. Sua expressão ectópica facilita a embriogênese dos tecidos vegetativos (Alemanno et al., 2008). Exemplos de polipeptídeos LEC2 incluem proteínas de Arabidopsis thaliana (No. de acesso NP_564304.1, SEQ ID NO:142), Medicago truncatula (N.° de Acessão. CAA42938.1, SEQ ID NO:143) e Brassica napus (N.° de Acessão ADO16343.1, SEQ ID NO:144).

[344] Em uma modalidade, um polinucleotídeo exógeno da presente invenção que codifica um LEC2 compreende um ou mais dos seguintes: 1) nucleotídeos que codificam um polipeptídeo compreendendo aminoácidos cuja sequência é apresentada como qualquer das SEQ ID NOs: 142 a 144, ou um fragmento biologicamente ativo dos mesmos ou um polipeptídeo cuja sequência de aminoácidos é pelo menos 30% idêntica a qualquer uma ou mais das SEQ ID NOs: 142 a 144, ii)nucleotídeo cuja sequência é pelo menos 30% idêntica a i), e 111) um polinucleotídeo que hibridiza com um ou ambos de i) ou ii) sob condições rigorosas.

[345] Tal como aqui utilizado, o termo "FUS3" refere-se a um fator de transcrição do domínio B3 que participa no desenvolvimento zigótico e na embriogênese somática e é detectado principalmente no tecido protodérmico do embrião (Gazzarrini et al. 2004). Exemplos de polipeptídeos FUS3 incluem proteínas de Arabidopsis thaliana (AAC35247, SEQ ID NO:160), Brassica napus (XP_006293066.1, SEQ ID NO:161) e Medicago truncatula (XP_003624470, SEQ ID NO:162). A sobre- expressão de qualquer de LEC1, L1L, LEC2, FUS3 e ABI3 a partir de um polinucleotídeo exógeno é de preferência controlada por um promotor regulado pelo desenvolvimento, tal como um promotor específico da senescência, um promotor indutível ou um promotor que foi projetado para fornecer um nível reduzido de expressão em relação a um promotor nativo, particularmente em plantas que não sejam Arabidopsis thaliana e B. napus cv. Westar, a fim de evitar anomalias de desenvolvimento no desenvolvimento de plantas que são comumente associadas com sobre-expressão destes fatores de transcrição (Mu et al. 2008).

[346] Tal como aqui utilizado, o termo "BABY BOOM "ou "BBM" refere-se um fator de transcrição AP2/FER que induz a regeneração em condições de cultura que normalmente não suportam a regeneração em plantas do tipo selvagem. A expressão ectópica de genes de Brassica napus BBM (BnBBM) em B. napus e Arabidopsis induz a embriogênese somática espontânea e organogênese a partir de mudas cultivadas em meio basal isento de hormônio (Boutilier et al., 2002). No tabaco, a expressão ectópica de BBM é suficiente para induzir a regeneração adventícia de brotos e raízes no meio basal, mas a citocinina exógena é necessária para a formação de embriões somáticos (SE) (Srinivasan et al., 2007). Exemplos de polipeptídeos de BBM incluem proteínas de Arabidopsis thaliana (N.° de Acessão NP_197245.2, SEQ ID NO:145), milho (US 7579529), Sorghum bicolor (N.° de Acessão XP_002458927) e Medicago truncatula (N.° de Acessão AAW82334.1, SEQ ID NO:146).

[347] Em uma modalidade, um polinucleotídeo exógeno da invenção que codifica um BBM compreende, a menos que especificado em contrário, um ou mais dos seguintes: i) nucleotídeos que codificam um polipeptídeo compreendendo aminoácidos cuja sequência é apresentada como qualquer das SEQ ID NOs: 145 ou 146, ou um fragmento biologicamente ativo dos mesmos ou um polipeptídeo cuja sequência de aminoácidos é pelo menos 30% idêntica a uma ou ambas de SEQ ID NOs: 145 ou 146, ii)nucleotídeo cuja sequência é pelo menos 30% idêntica a i), e iii) um polinucleotídeo que hibridiza com um ou ambos de i) ou ii) sob condições rigorosas.

[348] Um polipeptídeo ABI3 (A. thaliana N.° de Acessão NP_189108) está relacionado com a proteína VP1 do milho, é expresso em níveis baixos nos tecidos vegetativos e afeta o desenvolvimento dos plastídeos. Um polipeptídeo ABI4 (A. thaliana Acesso NP_181551) pertence a uma família de fatores de transcrição que contêm um domínio AP2 específico da planta (Finkelstein et al., 1998) e atua a jusante de ABI3. ABI5 (A. thaliana N.° de Acessão NP_565840) é um fator de transcrição da família bZIP que afeta a sensibilidade de ABA e controla a expressão de alguns genes LEA em sementes. Ele se liga a um elemento ABA-responsivo.

[349] Cada um dos seguintes fatores de transcrição foi selecionado com base no fato de terem funcionado na embriogênese em plantas. Os números de acesso são mostrados na Tabela 10. Os homólogos de cada um podem ser facilmente identificados em muitas outras espécies vegetais e testados como descrito no Exemplo 10.

[350]MYB73 é um fator de transcrição que foi identificado na soja, envolvido em respostas de estresse.

[351] BZIP53 é um fator de transcrição na família da proteína bZIP, identificada em Arabidopsis.

[352]AGL15 (semelhante a Agamous 15) é um fator de transcrição de caixa MADS que é nativamente expresso durante a embriogênese. A AGL15 também é expressa nativamente em primórdios de folha, brotos de meristemas apicais e jovens botões florais, sugerindo que AGL15 também pode ter uma função durante o desenvolvimento pós-germinativo. A AGL15 tem um papel na embriogênese e no catabolismo do ácido giberélico. Tem como alvo os fatores de transcrição de domínio B3 que são reguladores chave da embriogênese.

[353]MYB115 e MYB118 são fatores de transcrição na família MYB de Arabidopsis envolvidos na embriogênese.

[354] TANMEI também conhecido como EMB2757 codifica uma proteína de repetição WD necessária para o desenvolvimento embrionário em Arabidopsis.

[355]WUS, também conhecido como Wuschel, é um gene homeobox que controla o pool de células-tronco em embriões. É expresso no centro de organização de células-tronco de meristemas e é necessário para manter as células-tronco em um estado indiferenciado. O fator de transcrição liga-se a um motivo central de elemento de TAAT.

[356] GFR2a1 e GFR2a2 são fatores de transcrição, pelo menos, da soja. Acil graxo aciltransferases

[357] Tal como aqui utilizado, o termo "acil graxo aciltransferase" refere-se a uma proteína que é capaz de transferir um grupo acil de acil-CoA, PC ou acil-ACP, preferencialmente acil-CoA ou PC, sobre um substrato para formar TAG, DAG ou MAG. Estes aciltransferases incluem DGAT, PDAT, MGAT, GPAT e LPAAT.

[358] Tal como aqui utilizado, o termo "diacilglicerol aciltransferase" (DGAT) refere-se a uma proteína que transfere um grupo acil graxo de acil-CoA para um DAG substrato para a produção de TAG. Assim, o termo "atividade de diacilglicerol aciltransferase" refere-se à transferência de um grupo acil de acil-CoA para DAG para produzir TAG. Uma DGAT pode ter também a função MGAT, mas funciona predominantemente como DGAT, isto é, tem maior atividade catalítica como DGAT do que como MGAT quando a atividade enzimática é expressa em unidades de nmols produto/min/mg de proteína (ver por exemplo, Yen Et al., (2005). A atividade de DGAT pode ser limitante da taxa na síntese de TAG em sementes (Ichihara et al., 1988). A DGAT utiliza um substrato de acil-CoA como doador de acil e transfere-o para a posiçãosn-3 de DAG para TAG. As funções enzimáticas no seu estado nativo no retículo endoplasmático (ER) da célula.

[359] Existem três tipos conhecidos de DGAT, referidas como DGAT1, e DGAT2 DGAT3, respectivamente. Os polipeptídeo DGAT1 são proteínas de membrana que tipicamente têm 10 domínios transmembranares, os polipeptídeo DGAT2 são também proteínas de membrana, mas tipicamente têm 2 domínios transmembranares, enquanto que os polipeptídeos DGAT3 tipicamente não têm nenhuma e acredita-se que sejam solúveis no citoplasma, não integrados nas membranas. Os polipeptídeo DGAT1 da planta têm tipicamente cerca de 510-550 resíduos de aminoácidos enquanto que os polipeptídeos DGAT2 têm tipicamente cerca de 310-330 resíduos. DGAT1 é a principal enzima responsável pela produção de TAG a partir de DAG na maioria das sementes de plantas em desenvolvimento, enquanto que DGAT2s de espécies vegetais, como tungue (Vernicia fordii) e mamona (Ricinus communis)que produzem altas quantidades de ácidos graxos incomuns parecem ter um papel importante no acúmulo de ácidos graxos incomuns em TAG. A sobre-expressão de AtDGAT1 em folhas de tabaco resultou em um teor de TAG aumentado 6-7 vezes (Bouvier-Nave et al., 2000).

[360] Exemplos de polipeptídeos DGAT1 incluem proteínas DGAT1 de Aspergillus fumigatus (XP_755172.1; SEQ ID NO:80), Arabidopsis thaliana (CAB44774.1; SEQ ID NO:1), Ricinus communis (AAR11479.1; SEQ ID NO:81), Vernicia fordii (ABC94472.1; SEQ ID NO:82), Vernonia galamensis (ABV21945.1 and ABV21946.1; SEQ ID NO:83 and SEQ ID NO:84, respectively), Euonymus alatus (AAV31083.1; SEQ ID NO:85), Caenorhabditis elegans (AAF82410.1; SEQ ID NO:86), Rattus norvegicus (NP_445889.1; SEQ ID NO:87), Homo sapiens (NP_036211.2; SEQ ID NO:88), bem como variantes e/ou mutantes dos mesmos. Exemplos de polipeptídeos DGAT2 incluem proteínas codificadas por genes DGAT2 de Arabidopsis thaliana (NP_566952.1; SEQ ID NO:2), Ricinus communis (AAY16324.1; SEQ ID NO:3), Vernicia fordii (ABC94474.1; SEQ ID NO:4), Mortierella ramanniana (AAK84179.1; SEQ ID NO:5), Homo sapiens (Q96PD7.2; SEQ ID NO:6) (Q58HT5.1; SEQ ID NO:7), Bos taurus (Q70VZ8.1; SEQ ID NO:8), Mus musculus (AAK84175.1; SEQ ID NO:9), bem como variantes e/ou mutantes dos mesmos. As sequências de aminoácidos de DGAT1 e DGAT2 mostram pouca homologia. A expressão em folhas de uma DGAT2 exógena foi duas vezes mais eficaz que uma DGAT1 no aumento do teor de óleo (TAG). Além disso, A. thaliana DGAT2 teve uma maior preferência por linoleoil-CoA e linolenoil-CoA como doadores de acil em relação a oleoil-CoA, em comparação com DGAT1. Esta preferência de substrato pode ser utilizada para distinguir as duas classes de DGAT em adição às suas sequências de aminoácidos.

[361] Exemplos de polipeptídeos DGAT3 incluem proteínas codificadas por genes DGAT3 de amendoim (Arachis hypogaea, Saha, et al., 2006), bem como variantes e/ou mutantes dos mesmos. Um DGAT tem pouca ou nenhuma atividade de MGAT detectável, por exemplo, inferior a 300 pmol/min/mg de proteína, preferencialmente inferior a 200 pmol/min/mg de proteína, mais preferencialmente inferior a 100 pmol/min/mg de proteína.

[362] Em uma modalidade, um polinucleotídeo exógeno da presente invenção que codifica um DGAT1 compreende um ou mais dos seguintes: 1) nucleotídeos que codificam um polipeptídeo compreendendo aminoácidos cuja sequência é apresentada como qualquer das SEQ ID NOs: 1 ou 80 a 88, ou um fragmento biologicamente ativo dos mesmos ou um polipeptídeo cuja sequência de aminoácidos é pelo menos 30% idêntica a qualquer uma ou mais das SEQ ID NOs: 1 ou 80 a 88, ii)nucleotídeo cuja sequência é pelo menos 30% idêntica a i), e iii) um polinucleotídeo que hibridiza com um ou ambos de i) ou ii) sob condições rigorosas.

[363] Em uma modalidade, um polinucleotídeo exógeno da presente invenção que codifica um DGAT2 compreende um ou mais dos seguintes: 1) nucleotídeos que codificam um polipeptídeo compreendendo aminoácidos cuja sequência é apresentada como qualquer das SEQ ID NOs: 2 a 9, ou um fragmento biologicamente ativo dos mesmos ou um polipeptídeo cuja sequência de aminoácidos é pelo menos 30% idêntica a qualquer uma ou mais das SEQ ID NOs: 2 a 9, ii)nucleotídeo cuja sequência é pelo menos 30% idêntica a i), e 111) um polinucleotídeo que hibridiza com um ou ambos de i) ou ii) sob condições rigorosas.

[364] Tal como aqui utilizado, o termo "fosfolipídeo:diacilglicerol aciltransferase" (PDAT, EC 2.3.1.158) ou o seu sinônimo "fosfolipídeo:1,2-diacil-sn- glicerol O-aciltransferase” significa uma aciltransferase que transfere um grupo acil de um fosfolipídeo, tipicamente PC, para a posição sn-3 de DAG para formar TAG. Esta reação não está relacionada com DGAT e utiliza os fosfolipídeos como doadores de acil. Existem várias formas de PDAT em células vegetais, incluindo PDAT1, PDAT2 ou PDAT3 (Ghosal et al., 2007).

[365] Tal como aqui utilizado, o termo "monoacilglicerol aciltransferase" ou "MGAT" refere-se a uma proteína que transfere um grupo acil graxo de acil-CoA para um substrato MAG, por exemplo sn-2 MAG, para produzir DAG. Assim, o termo "atividade de monoacilglicerol aciltransferase" refere-se a, pelo menos, a transferência de um grupo acil de acil-CoA para produzir MAG DAG. O termo "MGAT" tal como aqui utilizado inclui enzimas que atuam sobre sn-1/3 MAG e/ou substratos sn- 2 MAG para formar sn-1,3 DAG e/ou sn-1,2/2,3-DAG, respectivamente. Em uma modalidade preferida, o MGAT tem uma preferência pelo substrato sn-2 MAG em relação a sn-1 MAG, ou, substancialmente, use apenas sn-2 MAG como substrato. Tal como aqui utilizado, MGAT não inclui enzimas que transferem um grupo acil preferencialmente para LysoPA em relação a MAG, tais enzimas são conhecidas como LPAATs. Isto é, uma MGAT preferencialmente utiliza substratos de monoacil não fosforilados, embora também possam ter baixa atividade catalítica em LysoPA. Uma MGAT preferida não tem atividade detectável na acilação de LysoPA. Uma MGAT pode ter também a função DGAT, mas funciona predominantemente como MGAT, isto é, tem maior atividade catalítica como MGAT do que como DGAT quando a atividade enzimática é expressa em unidades de nmols produto/min/mg de proteína (ver por exemplo, Yen Et al., 2002). Existem três classes conhecidas de MGAT, referidas como MGAT1, MGAT2 e MGAT3, respectivamente. Exemplos de polipeptídeo MGAT1, MGAT2 e MGAT3 estão descritos em WO2013/096993.

[366] Tal como aqui utilizado, uma "via MGAT" refere-se a uma via anabólica, diferente da via Kennedy para a formação de TAG, na qual DAG é formado pela acilação de sn-1 MAG ou preferivelmente sn-2 MAG, catalisado por MGAT. DAG podem ser posteriormente utilizado para formar TAG ou outros lipídeos. O WO2012/000026 demonstrou em primeiro lugar que o tecido da folha das plantas pode sintetizar MAG a partir de G-3-P de modo que o MAG seja acessível a uma MGAT exógena expressa no tecido da folha, em segundo lugar MGAT de várias fontes pode funcionar em tecidos vegetais com outros fatores vegetais envolvidos na síntese de lipídeos e em terceiro lugar o DAG produzido pela atividade MGAT exógena é acessível a uma DGAT de planta, ou uma DGAT exógena, para produzir TAG. A atividade de MGAT e DGAT pode ser ensaiada pela introdução de construções que codificam as enzimas (ou enzimas candidatas) em filamento Saccharomyces cerevisiae H1246 e demonstram acumulação de TAG.

[367]Alguns dos motivos que mostraram ser importantes para a atividade catalítica em algumas DGAT2s também são conservados em MGAT aciltransferases De particular interesse, é um domínio de ligação de lipídeos neutro putativo com a sequência de consenso FLXLXXXN (SEQ ID NO: 14) em que cada X representa independentemente qualquer aminoácido que não seja prolina, N é qualquer aminoácido não polar, localizado dentro da região transmembranar N-terminal seguido por um domínio glicerol aciltransferase/fosfolipídeo putativo. O motivo FLXLXXXN (SEQ ID NO: 14) encontra-se na DGAT2 de camundongo (aminoácidos 81-88) e MGAT1/2, mas não em DGAT2s de levedura ou de planta. É importante para a atividade da DGAT2 de camundongo. Outros motivos de sequência de DGAT2 e/ou MGAT1/2 incluem: 1. Um tripeptídeo YFP altamente conservado (SEQ ID NO:10) na maioria dos polipeptídeos DGAT2 e também em MGAT1 e MGAT2, por exemplo, presentes como aminoácidos 139-141 em DGAT2 de camundongo. A mutação deste motivo dentro da DGAT2 de levedura com substituições não conservativas tornou a enzima não funcional. 2. Tetrapeptídeos HPHG (SEQ ID NO:11), altamente conservados em MGATs bem como em sequências de DGAT2 de animais e fungos, por exemplo, presentes como aminoácidos 161-164 em DGAT2 de camundongo e importantes para a atividade catalítica pelo menos em DGAT2 de leveduras e camundongos. As aciltransferases DGAT2 de planta têm uma sequência conservada EPHS (SEQ ID NO: 12) em vez disso, pelo que podem ser toleradas alterações conservativas no primeiro e quarto aminoácidos. 3. Um motivo mais conservado que faz parte do domínio putativo de fosfolipídeo de glicerol. Um exemplo disto é o motivo RXGFX(K/R)XAXXXGXXX(L/V)VPXXXFG(E/Q) (SEQ ID NO:13),que está presente como aminoácidos 304-327 em DGAT2 de camundongo. Este motivo é menos conservado na sequência de aminoácidos do que os outros, como seria de esperar do seu comprimento, mas os homólogos podem ser reconhecidos por procura de motivos. O espaçamento pode variar entre os aminoácidos mais conservados, i.e., pode haver aminoácidos X adicionais dentro do motivo, ou menos aminoácidos X comparados com a sequência acima.

[368] Um componente importante na síntese de glicerolipídeos a partir de ácidos graxos esterificados em ACP ou CoA é a enzima sn-glicerol-3-fosfato aciltransferase (GPAT), que é outro dos polipeptídeos envolvidos na biossíntese de lipídeos não polares. Esta enzima está envolvida em diferentes vias metabólicas e funções fisiológicas. Ela catalisa a seguinte reação: G3P + acil graxo-ACP or -CoA -> LPA + ACP ou CoA livre. A reação catalisada por GPAT ocorre em três compartimentos subcelulares distintos da planta: plastídeo, retículo endoplasmático (ER) e mitocôndrias. Essas reações são catalisadas por três tipos diferentes de enzimas GPAT, uma forma solúvel localizada em estroma plastidial que usa acil- ACP como seu acil substrato natural (PGPAT na Figura 1) e duas formas ligadas à membrana localizadas no ER e mitocôndrias que usam Acil-CoA e acil-ACP como dadores de acil naturais, respectivamente (Chen et al., 2011).

[369] tal como aqui utilizado, o termo "glicerol-3- fosfato aciltransferase" (GPAT, EC 2.3.1.15) e o seu sinênimo "glicerol-3-fosfato O-aciltransferase" referem-se a uma proteína que acila glicerol-3-fosfato (G-3-P) para formar LysoPA e/ou MAG, formando este último produto se a GPAT tiver também atividade de fosfatase em LysoPA. O grupo acil que é transferido é de acil-CoA se a GPAT é uma GPAT de tipo ER (uma “acil-CoA:sn-glicerol-3-fosfato 1-O-aciltransferase” também referida como "GPAT microsomal") ou de acil-ACP se a GPAT é uma GPAT de tipo plastidial (PGPAT). Assim, o termo "atividade de glicerol-3-fosfato aciltransferase" refere-se à acilação de G-3-P para formar LysoPA e/ou MAG. O termo "GPAT" abrange enzimas que acilam G-3-P para formar sn-1 LPA e/ou sn-2 LPA, preferivelmente sn-2 LPA. De preferência, a GPAT que pode ser sobre-expressa na modificação Impulsionar é uma GPAT ligada à membrana que funciona no ER da célula, mais preferencialmente uma GPAT9, e a GPAT plastidial que é infrarregulada na modificação Via procariótica é uma GPAT solúvel ("GPAT plastidial").Em uma modalidade preferida, a GPAT tem atividade de fosfatase. Em uma modalidade mais preferida, a GPAT é uma sn-2 GPAT com atividade fosfatase que produz sn-2 MAG.

[370] Tal como aqui utilizado, o termo "sn-1 glicerol-3- fosfato aciltransferase" (sn-1 GPAT) refere-se a uma proteína que acila sn-glicerol-3-fosfato (G-3-P) para preferencialmente formar 1-acil-sn-glicerol-3-fosfato (sn-1 LPA). Assim, o termo "atividade de sn-1 glicerol-3-fosfato aciltransferase" refere-se à acilação desn-glicerol-3-fosfato para formar 1-acil-sn-glicerol-3-fosfato (sn-1 LPA).

[371] Tal como aqui utilizado, o termo "sn-2 glicerol-3- fosfato aciltransferase" (sn-2 GPAT) refere-se a proteína que acila sn-glicerol-3-fosfato (G-3-P) para preferencialmente formar 2-acil-sn-glicerol-3-fosfato (sn-2 LPA). Assim, o termo "atividade desn-2 glicerol-3-fosfato aciltransferase" refere-se a acilação de sn-glicerol-3-fosfato para formar 2- acil-sn-glicerol-3-fosfato (sn-2 LPA).

[372]A família GPAT é grande e todos os membros conhecidos contêm dois domínios conservados, um domínio de aciltransferase de plsC (PF01553; SEQ ID NO: 15) e um domínio de superfamília de hidrolase tipo HAD (PF12710; SEQ ID NO: 16) e suas variantes. Além disso, pelo menos em Arabidopsis thaliana, nas subclasses GPAT4-GPAT8, todas contêm uma região N-terminal homóloga a um domínio de fosfatase de fosfoserina (PF00702; SEQ ID NO:17) e GPATs que produzem MAG como um produto podem ser identificadas pela presença de tal região homóloga. Algumas GPAT expressas endogenamente em tecido de folhas compreendem a sequência de aminoácidos conservada GDLVICPEGTTCREP (SEQ ID NO:18). GPAT4 e GPAT6 contêm ambos resíduos conservados que são conhecidos como sendo críticos para a atividade da fosfatase, aminoácidos especificamente conservados no Motivo I (DXDX [T/V] [L/V], SEQ ID NO: 19) e no Motivo III (K- [G/S] [D/S] XXX [D/N]; SEQ ID NO:20) localizado no N-terminal (Yang et al. 2010).

[373] Homólogos de Arabidopsis GPAT4 (N.° de Acessão. NP_171667.1) e GPAT6 (NP_181346.1) incluem AAF02784.1 (Arabidopsis thaliana), AAL32544.1 (Arabidopsis thaliana), (Oryza sativa), ABK25381.1 (Picea sitchensis), (Zea Mays), BAF00762.1 (Arabidopsis thaliana), (Oryza sativa), EAY84189.1 (Oryza sativa), (Oryza sativa), EAZ21484.1 (Oryza sativa), (Oryza sativa), EEC76137.1 (Oryza sativa), (Oryza sativa), EFJ08963.1 (Selaginella moellendorffii), EFJ11200.1 (Selaginella moellendorffii), NP_001044839.1 (Oryza sativa), NP_001045668.1 (Oryza sativa), NP_001147442.1 (Zea mays), NP_001149307.1 (Zea mays), NP_001168351.1 (Zea mays), AFH02724.1 (Brassica napus) NP_191950.2 (Arabidopsis thaliana), XP_001765001.1 (Physcomitrella patens), XP_001769671.1 (Physcomitrella patens), (Vitis vinifera), XP_002275348.1 (Vitis vinifera), XP_002276032.1 (Vitis vinifera), XP_002279091.1 (Vitis vinifera), XP_002309124.1 (Populus trichocarpa), XP_002309276.1 (Populus trichocarpa), XP_002322752.1 (Populus trichocarpa), XP_002323563.1 (Populus trichocarpa), XP_002439887.1 (Sorghum bicolor), XP_002458786.1 (Sorghum bicolor), XP_002463916.1 (Sorghum bicolor), XP_002464630.1 (Sorghum bicolor), XP_002511873.1 (Ricinus communis), XP_002517438.1 (Ricinus communis), XP_002520171.1 (Ricinus communis), ACT32032.1 (Vernicia fordii), NP_001051189.1 (Oryza sativa), AFH02725.1 (Brassica napus), XP_002320138.1 (Populus trichocarpa), XP_002451377.1 (Sorghum bicolor), XP_002531350.1 (Ricinus communis) e XP_002889361.1 (Arabidopsis lyrata).

[374]As GPATs plastidiais solúveis (PGPAT, também conhecidas como ATS1 in Arabidopsis thaliana) foram purificadas e genes codificando-os clonados a partir de várias espécies de plantas, tais como ervilha(Pisum sativum, Número de Acessão: P30706.1), espinafre (Spinacia oleracea, Número de Acessão: Q43869.1), abóbora (Cucurbita moschate, Número de Acessão: P10349.1), pepino (Cucumis sativus, Número de Acessão: Q39639.1) e Arabidopsis thaliana (Número de Acessão: Q43307.2). A GPAT plastidial solúvel é o primeiro passo comprometido para o que é conhecido como a via procariótica da síntese de glicerolipídeos e é operativa apenas no plastídeo (Figura 1). A chamada via procariótica está localizada exclusivamente em plastídeos de plantas e monta DAG para a síntese de galactolipídeos (MGDG e DGMG) que contêm ácidos graxos C16: 3 esterificados na posição sn-2 da cadeia principal do glicerol.

[375] Os motivos e/ou resíduos conservados podem ser utilizados como um diagnóstico baseado em sequências para a identificação de enzimas GPAT. Alternativamente, um ensaio baseado em função mais rigoroso poderia ser utilizado. Tal ensaio envolve, por exemplo, a alimentação de glicerol-3- fosfato marcado em células ou microssomas e a quantificação dos níveis de produtos marcados por cromatografia em camada fina ou por uma técnica semelhante. A atividade de GPAT resulta na produção de LPA marcado enquanto que a atividade de GPAT/fosfatase resulta na produção de MAG marcado.

[376] Tal como aqui utilizado, o termo "ácido lisofosfatídico aciltransferase" (LPAAT, EC 2.3.1.51) e os seus sinônimos "1-acil-glicerol-3-fosfato aciltransferase”, “acil-CoA:1-acil-sn-glicerol-3-fosfato 2-O-aciltransferase” e “1-acilglicerol-3-fosfato O-aciltransferase” referem-se a uma proteína que acila o ácido lisofosfatídico (LPA) para formar ácido fosfatídico (PA). O grupo acil que é transferido é de acil-CoA se o LPAAT for uma LPAAT de tipo ER ou de acil-ACP se o LPAAT for uma LPAAT de tipo plastidial (PLPAAT). Assim, o termo "atividade de ácido lisofosfatídico aciltransferase" refere-se à acilação de LPA para formar PA. Polipeptídeos de revestimento de corpo oleoso

[377]As sementes de plantas e pólen acumulam TAG em estruturas subcelulares chamadas corpos oleosos que geralmente variam de 0,5-2,5 μm em diâmetro. Tal como aqui utilizado, "gotas lipídicas", também referidas como "corpos oleosos", são orgânulos celulares ricos em lipídeos para armazenamento ou troca de lipídeos neutros incluindo predominantemente TAG. Gotículas lipídicas podem variar muito em tamanho de cerca de 20 nm a 100 μm. Estes orgânulos têm um núcleo TAG rodeado por uma monocamada de fosfolipídeos contendo várias proteínas incorporadas que estão envolvidas no metabolismo e armazenamento lipídico, bem como o tráfico de lipídeos para outras membranas, incluindo oleosinas se os corpos oleosos são de sementes de plantas ou tecidos de flores (Jolivet et al., 2004). Eles consistem geralmente em 0,5-3,5% de proteína enquanto que o restante é o lipídeo. Eles são os menos densos dos orgânulos na maioria das células e podem, portanto, ser facilmente isolados por centrifugação de flotação. As oleosinas representam a mais abundante (pelo menos 80%) da proteína na membrana de corpos oleosos a partir de sementes.

[378] Tal como aqui utilizado, o termo "Oleosina" refere- se a uma proteína presente na membrana anfipática de corpos oleosos dos tecidos de armazenagem de sementes (ver, por exemplo, Huang, 1996;. Lin et al, 2005; Capuano et al., 2007; Lui et al., 2009; Shimada e Hara-Nishimura, 2010) e variantes produzidas artificialmente (ver por exemplo WO2011/053169 e WO2011/127118).

[379] Oleosinas são de baixa Mr (15-26,000), correspondendo a cerca de 140-230 resíduos de aminoácidos, o que lhes permite tornar-se fortemente empacotados na superfície de corpos oleosos. Dentro de cada espécie de sementes, existem geralmente duas ou mais oleosinas de diferentes Mr. Cada molécula de oleosina contém um domínio N-terminal variável, relativamente hidrofílico, (por exemplo, cerca de 48 resíduos de aminoácidos), um domínio central totalmente hidrofóbico (por exemplo, de cerca de 70 a 80 resíduos de aminoácidos) que é particularmente rico em aminoácidos alifáticos, tais como alanina, glicina, leucina, isoleucina e valina, e um domínio anfipático α-helicoidal de cerca de 30-40 resíduos de aminoácidos no ou perto do C- terminal. O domínio hidrofóbico central contém tipicamente um motivo de nó de prolina de cerca de 12 resíduos no seu centro. Geralmente, o trecho central de resíduos hidrofóbicos é inserida no núcleo do lipídeo e o C-terminal anfifático e/ou N-terminal anfifático está localizado na superfície dos corpos oleosos, com resíduos carregados positivamente embebidos em uma monocamada de fosfolipídeos e os resíduos carregados negativamente expostos ao exterior.

[380] Tal como aqui utilizado, o termo "oleosina" engloba polioleosinas que têm múltiplos polipeptídeos de oleosina fundidos em conjunto de uma forma cabeça a cauda como um único polipeptídeo (WO2007/045019), por exemplo peptídeo de oleosina 2x, 4x ou 6x e caleosinas que ligam cálcio e que são um componente proteico menor das proteínas que cobrem os corpos oleosos em sementes (Froissard et al., 2009), e esteroleosinas que ligam esteróis (WO2011 / 053169). No entanto, geralmente uma grande proporção (pelo menos 80%) das oleosinas de corpos oleosos não serão caleosinas e/ou esteroleosinas. O termo "oleosina" abrange também polipeptídeos de oleosina que foram modificados artificialmente, tais oleosinas que têm um ou mais resíduos de aminoácidos das oleosinas nativas substituídas artificialmente com resíduos de cisteína, como descrito em WO2011/053169. Tipicamente, 4-8 resíduos são substituídos artificialmente, de um modo preferido 6 resíduos, mas tantos quanto entre 2 e 14 resíduos podem ser substituídos. De um modo preferido, ambos os domínios anfipáticos N-terminal e C- terminal compreendem substituições de cisteína. A modificação aumenta a capacidade de reticulação das oleosinas e aumenta a estabilidade térmica e/ou a estabilidade das proteínas contra a degradação por proteases.

[381] Um número substancial de sequências de proteínas da oleosina, e sequências de nucleotídeos que codificam para os mesmos, são conhecidos a partir de um grande número de diferentes espécies de plantas. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, oleosinas de Arabidposis, canola, milho, arroz, amendoim, mamona, soja, linho, uva, repolho, algodão, girassol, sorgo e cevada. Exemplos de oleosinas (com os seus Nos de Acesso) incluem Brassica napus oleosina (CAA57545 .1; SEQ ID NO:95), Brassica napus oleosina S1-1 (ACG69504.1; SEQ ID NO:96), Brassica napus oleosina S2-1 (ACG69503.1; SEQ ID NO:97), Brassica napus oleosina S3-1 (ACG69513.1; SEQ ID NO:98), Brassica napus oleosina S4-1 (ACG69507.1; SEQ ID NO:99), Brassica napus oleosina S5-1 (ACG69511.1; SEQ ID NO:100), Arachis hypogaea oleosina 1 (AAZ20276.1; SEQ ID NO:101), Arachis hypogaea oleosina 2 (AAU21500.1; SEQ ID NO:102), Arachis hypogaea oleosina 3 (AAU21501.1; SEQ ID NO:103), Arachis hypogaea oleosina 5 (ABC96763.1; SEQ ID NO:104), Ricinus communis oleosina 1 (EEF40948.1; SEQ ID NO:105), Ricinus communis oleosina 2 (EEF51616.1; SEQ ID NO:106), Glycine max oleosina isoforma a (P29530.2; SEQ ID NO:107), Glycine max oleosina isoforma b (P29531.1; SEQ ID NO:108), Linum usitatissimum oleosina de baixo peso molecular (ABB01622.1; SEQ ID NO:109), Linum usitatissimum oleosina com elevado peso molecular (ABB01624.1; SEQ ID NO:11 0), Helianthus annuus oleosina (CAA44224.1; SEQ ID NO:111), Zea mays oleosina (NP_001105338.1; SEQ ID NO:112), Brassica napus esteroleosina (ABM30178.1; SEQ ID NO:113), Brassica napus esteroleosina SLO1-1 (ACG69522.1; SEQ ID NO:114), Brassica napus esteroleosina SLO2-1 (ACG69525.1; SEQ ID NO:115), Sesamum indicum esteroleosina (AAL13315.1; SEQ ID NO:116), Zea mays esteroleosina (NP_001152614.1; SEQ ID NO:117), Brassica napus caleosina CLO-1 (ACG69529.1; SEQ ID NO:118), Brassica napus caleosina CLO-3 (ACG69527.1; SEQ ID NO:119), Sesamum indicum caleosina (AAF13743.1; SEQ ID NO:120), Zea mays caleosina (NP_001151906.1; SEQ ID NO:121), Glycine max caleosina (AAB71227). Outros polipeptídeos de encapsulação lipídica que são funcionalmente equivalentes são plastoglobulinas e polipeptídeos MLDP (WO2011/127118).

[382] Em uma modalidade, um polinucleotídeo exógeno da invenção que codifica uma oleosina compreende, a menos que especificado em contrário, um ou mais dos seguintes: 1) nucleotídeos que codificam um polipeptídeo compreendendo aminoácidos cuja sequência é apresentada como qualquer das SEQ ID NOs: 95 a 112, ou um fragmento biologicamente ativo dos mesmos ou um polipeptídeo cuja sequência de aminoácidos é pelo menos 30% idêntica a qualquer uma ou mais das SEQ ID NOs: 95 a 112, ii)nucleotídeo cuja sequência é pelo menos 30% idêntica a i), e 111) um polinucleotídeo que hibridiza com um ou ambos de i) ou ii) sob condições rigorosas.

[383] Em uma modalidade, um polinucleotídeo exógeno da invenção que codifica uma esteroleosina compreende, a menos que especificado em contrário, um ou mais dos seguintes: 1) nucleotídeos que codificam um polipeptídeo compreendendo aminoácidos cuja sequência é apresentada como qualquer das SEQ ID NOs: 113 a 117, ou um fragmento biologicamente ativo dos mesmos ou um polipeptídeo cuja sequência de aminoácidos é pelo menos 30% idêntica a qualquer uma ou mais das SEQ ID NOs: 113 a 117, ii)nucleotídeo cuja sequência é pelo menos 30% idêntica a i), e 111) um polinucleotídeo que hibridiza com um ou ambos de i) ou ii) sob condições rigorosas.

[384] Tal como aqui utilizado, uma "proteína associada a gotículas de lipídeos" ou "LDAP" significa um polipeptídeo que está associado a gotículas de lipídeos em plantas em tecidos ou órgãos diferentes de sementes, anteras e pólen, tais como tecidos de frutos incluindo pericarpo e mesocarpo. Os LDAP podem estar associadas a corpos oleosos em sementes, anteras ou pólen, bem como nos tecidos ou órgãos que não sejam sementes, anteras e pólen. Elas são distintas de oleosinas que são polipeptídeos associados com a superfície de gotículas lipídicas em tecidos de sementes, anteras e pólen. LDAPs, tal como aqui utilizadas, incluem polipeptídeos LDAP que são produzidos naturalmente em tecidos vegetais, bem como variantes de sequência de aminoácidos que são produzidos artificialmente. A função de tais variantes pode ser testada tal como exemplificado no Exemplo 15.

[385] Horn et al. (2013) identificaram dois genes LDAP que são expressos no pericarpo do abacate. Os polipeptídeos LDAP1 e LDAP2 de abacate codificados eram 62% idênticos na sequência de aminoácidos e tinham homologia com o polipeptídeo codificado por Arabidopsis At3g05500 e uma proteína tipo SRPP da árvore da borracha. Gidda et al. (2013) identificaram três genes LDAP que foram expressos em mesocarpo de óleo de palma (Elaeis guineensis), mas não em grãos e concluiu que os genes LDAP eram específicos de plantas e conservados entre todas as espécies de plantas. Os polipeptídeos LDAP podem conter domínios adicionais (Gidda et al., (2013). Os genes que codificam LDAPs são geralmente suprarregulados em tecidos não semente com lipídeos abundantes e podem ser identificados por esse meio, mas pensa-se que são expressos em todas as células que não produzem óleo, incluindo para armazenamento transitório. Horn et al. (2013) mostra uma árvore filogenética de proteínas do tipo SRPP nas plantas. Os polipeptídeos LDAP exemplificativos são descritos no Exemplo 15 do presente documento. Homólogos de LDAPs em outras espécies de plantas podem ser prontamente identificados por aqueles versados na técnica.

[386] Em uma modalidade, um polinucleotídeo exógeno da invenção que codifica LDAP compreende, a menos que especificado em contrário, um ou mais dos seguintes: i) nucleotídeos que codificam um polipeptídeo compreendendo aminoácidos cuja sequência é apresentada como qualquer uma das SEQ ID NOs: 237, 239 ou 241 ou um fragmento biologicamente ativo de qualquer um destes, ou de um polipeptídeo cuja sequência de aminoácidos é pelo menos 30% idêntica a qualquer um ou ambos de SEQ ID NOs: 237, 239 ou 241, ii) nucleotídeo cuja sequência é pelo menos 30% idêntica a i), e iii) um polinucleotídeo que hibridiza com um ou ambos de i) ou ii) sob condições rigorosas.

[387] Tal como aqui utilizado, o termo "polipeptídeo envolvido na biossíntese de amido" refere-se a qualquer polipeptídeo, cuja infrarregulação em uma célula abaixo dos níveis normais (tipo selvagem) resulta em uma redução no nível de síntese de amido e em uma diminuição nos níveis de amido. Um exemplo de um tal polipeptídeo é a AGPase.

[388] Tal como aqui utilizado, o termo "ADP-glicose fosforilase" ou "AGPase" refere-se a uma enzima que regula a biossíntese de amido, catalisando a conversão de glicose-1- fosfato e ATP a ADP-glucose que serve como bloco de construção para polímeros de amido. A forma ativa da enzima AGPase consiste em 2 subunidades grandes e 2 subunidades pequenas.

[389]A enzima ADPase em plantas existe primariamente como um tetrâmero que consiste em 2 subunidades grandes e 2 subunidades pequenas. Embora estas subunidades sejam diferentes em seus papéis catalíticos e reguladores dependendo da espécie (Kuhn et al., 2009), em plantas, a subunidade pequena geralmente exibe atividade catalítica. O peso molecular da subunidade pequena é de aproximadamente 50 a 55 kDa. O peso molecular da subunidade grande é de aproximadamente 55 a 60 kDa. A enzima vegetal é fortemente ativada pelo 3-fosfoglicerato (PGA), um produto de fixação de dióxido de carbono; na ausência de PGA, a enzima exibe apenas cerca de 3% da sua atividade. A AGPase de planta também é fortemente inibida pelo fosfato inorgânico (Pi). Em contraste, a AGPase bacteriana e de algas existe como homotetrâmeros de 50 kDa A enzima algácea, como sua contraparte vegetal, é ativada pela PGA e inibida por Pi, enquanto a enzima bacteriana é ativada pela frutose-1, 6- bifosfato (FBP) e inibida por AMP e Pi. TAG Lipases e Beta-Oxidação

[390] Tal como aqui utilizado, o termo "polipeptídeo envolvido na degradação de lipídeos e/ou que reduz o teor de lipídeos" refere-se a qualquer polipeptídeo que catabolise lipídeo, cuja infrarregulação em uma célula abaixo dos níveis normais (tipo selvagem) resulta em um aumento da concentração do nível de óleo, tal como ácidos graxos e/ou TAGs, na célula, de preferência uma célula de uma parte vegetativa, tubérculo, beterraba ou uma semente de uma planta. Exemplos de tais polipeptídeos incluem, mas não estão limitados a lipases, ou uma lipase, tal como um polipeptídeo CGi58 (identificador de Gene Comparativo semelhante a 58), uma SUGAR-DEPENDENT1 triacilglicerol lipase (SDP1) (ver, por exemplo, Kelly et al., 2011) e uma lipase descrita no documento WO 2009/027335.

[391] Tal como aqui utilizado, o termo "TAG lipase" (EC.3.1.1.3) refere-se a uma proteína que hidrolisa TAG em um ou mais ácidos graxos e qualquer um de DAG, MAG ou glicerol. Assim, o termo "atividade de TAG lipase" refere-se à hidrólise do TAG em glicerol e ácidos graxos.

[392] Tal como aqui utilizado, o termo "CGi58" refere-se a uma ácido lisofosfatídico acil-transferase dependente de acil-CoA solúvel codificada pelo gene At4g24160 em Arabidopsis thaliana e seus homólogos em outras plantas e "Ict1p" em levedura e seus homólogos. O gene da planta tal como o do locus do gene Arabidopsis At4g24160 é expresso como duas transcrições alternativas: uma isoforma de comprimento completo mais longo (At4g24160.1) e uma isoforma menor (At4g24160.2) faltando uma porção da extremidade 3 '(ver James et al., 2010; Ghosh et al., 2009; US 201000221400). Ambos os mRNAs codificam para uma proteína que é homóloga à proteína CGI-58 humana e outros membros ortólogos desta α/β família de hidrolase (ABHD). Em uma modalidade, a proteína CGI58 (At4g24160) contém três motivos que são conservados entre as espécies de plantas: um motivo de GXSXG lipase (SEQ ID NO:127), um motivo de HX (4) D aciltransferase (SEQ ID NO:128) e VX (3) HGF, um provável motivo de ligação de lipídeos (SEQ ID NO:129). A proteína CGI-58 humana tem atividade de ácido lisofosfatídico aciltransferase (LPAAT), mas não atividade de lipase. Em contraste, as proteínas de plantas e de leveduras possuem um motivo de sequência de GXSXG lipase canônica, que está ausente de proteínas vertebradas (seres humanos, camundongos e peixe-zebra) e têm atividade de lipase e fosfolipase (Ghosh et al. 2009). Embora as proteínas CGI58 de plantas e leveduras parecessem possuir quantidades detectáveis de atividade de lipase e fosfolipase A de TAG em adição à atividade de LPAAT, a proteína humana não.

[393]A interrupção do gene CGI-58 homólogo nos resultados de Arabidopsis thaliana na acumulação de gotículas lipídicas neutras em folhas maduras. A espectroscopia de massa de gotículas lipídicas cgi-58 mutantes de perda de função mostraram que contêm triacilgliceróis com ácidos graxos específicos de folhas comuns. Folhas de plantas cgi- 58 maduras exibem um aumento marcado dos níveis absolutos de triacilglicerol, mais do que 10 vezes mais alto do que em plantas de tipo selvagem. Níveis de lipídeos nas sementes de plantas cgi-58 com perde de função permaneceram Inalteradas e, ao contrário das mutações na e-oxidação, as sementes de cgi-58 germinaram e cresceram normalmente, não necessitando de resgate com sacarose (James et al., 2010).

[394] Exemplos de nucleotídeos que codificam polipeptídeos CGi58 incluem aqueles de Arabidopsis thaliana (NM_118548.1 codificando NP_194147.2; SEQ ID NO:130), Brachypodium distachyon (XP_003578450.1; SEQ ID NO:131), Glycine max (XM_003523590.1 codificando XP_003523638.1; SEQ ID NO:132), Zea mays (NM_001155541.1 codificando NP_001149013.1; SEQ ID NO:133), Sorghum bicolor (XM_002460493.1 codificando XP_002460538.1; SEQ ID NO:134), Ricinus communis (XM_002510439.1 codificando XP_002510485.1; SEQ ID NO:135), Medicago truncatula (XM_003603685.1 codificando XP_003603733.1; SEQ ID NO:136),e Oryza sativa (codificando EAZ09782.1).

[395] Em uma modalidade, uma modificação genética da invenção infrarregula a produção endógena de CGi58, em que CGi58 é codificada por um ou mais dos seguintes: i) nucleotídeos compreendendo uma sequência apresentada como qualquer uma das SEQ ID NOs: 130 a 136, ii) os nucleotídeos compreendendo uma sequência que é pelo menos 30% idêntica a qualquer uma ou mais das SEQ ID NOs: 130 a 136, e iii) um polinucleotídeo que hibridiza com um ou ambos de i) ou ii) sob condições rigorosas.

[396] Outras lipases que têm atividade de lipase no TAG incluem SUGAR-DEPENDENT1 triacilglicerol lipase (SDP1, ver, por exemplo, Eastmond et al., 2006; Kelly et al., 2011) e polipeptídeos semelhantes a SDP1 encontrados em espécies de plantas bem como levedura (polipeptídeos TGL4) e células animais, que estão envolvidos na quebra do TAG de armazenamento. Os polipeptídeos SDP1 e tipo SDP1 parecem ser responsáveis por iniciar a quebra do TAG em sementes após a germinação (Eastmond et al., 2006). As plantas que são mutantes em SDP1, na ausência de WRI1 e DGAT1 exógenos, exibem níveis aumentados de PUFA no seu TAG. Tal como aqui utilizado, "polipeptídeos" SDP1 incluem polipeptídeos SDP1, polipeptídeos semelhantes a SDP1 e seus homólogos de espécies de plantas. Polipeptídeos SDP1 e semelhantes a SDP1 em plantas são de 800-910 resíduos de aminoácidos de comprimento e têm um domínio de acil-hidrolase tipo patatina que pode associar-se com superfícies de corpo oleoso e hidrolisar TAG de preferência para DAG ou MAG. Acredita-se que SDP1 tenha uma preferência por hidrolisar o grupo acil na posição sn-2 de TAG. Arabidopsis contém pelo menos três genes que codificam as SDP1 lipases, nomeadamente SDP1 (N.° de Acessão NP_196024, sequência nucleotídica SEQ ID NO: 163 e homólogos de outras espécies), SDP1L (N.° de Acessão NM_202720 e homólogos em outras espécies, Kelly et al., 2011) e ATGLL (At1g33270) (Eastmond et al, 2006). De particular interesse para a redução da atividade do gene são os genes SDP1 que são expressos em tecidos vegetativos em plantas, tais como em folhas, caules e raízes. Os níveis de lipídeos não polares nas partes vegetativas das plantas podem portanto ser aumentados por redução da atividade dos polipeptídeos SDP1 nas partes da planta, por exemplo, seja por mutação de um gene endógeno que codifica um polipeptídeo SDP1 ou pela introdução de um gene exógeno que codifica uma molécula de RNA de silenciamento que reduz a expressão de um gene endógeno SDP1. Tal redução é particularmente benéfica em tubérculos, tais como beterraba e batata, e nas plantas de "alta sacarose", tais como cana e beterraba sacarina.

[397] Os genes que codificam os homólogos de SDP1 (incluindo os homólogos do tipo SDP1) em uma espécie de planta de escolha podem ser facilmente identificados por homologia a sequências de gene SDP1 conhecidas. As sequências de nucleotídeos ou de aminoácidos SDP1 conhecidas incluem Nos de Acesso: em Brassica napus, GN078290 (SEQ ID NO:164), GN078281, GN078283; Capsella rubella, XP_006287072; Theobroma cacao, XP_007028574.1; Populus trichocarpa, XP_002308909 (SEQ ID NO:166); Prunus persica, XP_007203312; Prunus mume, XP_008240737; Malus domestica, XP_008373034; Ricinus communis, XP_002530081; Medicago truncatula, XP_003591425 (SEQ ID NO:167); Solanum lycopersicum, XP_004249208; Phaseolus vulgaris, XP_007162133; Glycine max, XP_003554141 (SEQ ID NO:168); Solanum tuberosum, XP_006351284; Glycine max, XP_003521151; Cicer arietinum, XP_004493431; Cucumis sativus, XP_004142709; Cucumis melo, XP_008457586; Jatropha curcas, KDP26217; Vitis vinifera, CBI30074; Oryza sativa, Japonica Group BAB61223; Oryza sativa, Indica Group EAY75912; Oryza sativa, Japonica Group NP_001044325; Sorghum bicolor, XP_002458531 (SEQ ID NO:169); Brachypodium distachyon, XP_003567139 (SEQ ID NO:165); Zea mays, AFW85009; Hordeum vulgare, BAK03290 (SEQ ID NO:172); Aegilops tauschii, EMT32802; Sorghum bicolor, XP_002463665; Zea mays, NP_001168677 (SEQ ID NO:170); Hordeum vulgare, BAK01155; Aegilops tauschii, EMT02623; Triticum urartu, EMS67257; Physcomitrella patens, XP_001758169 (SEQ ID NO:171). As sequências SDP1 preferidas para utilização em constructos genéticos para inibição da expressão dos genes endógenos são a partir de cDNAs correspondentes aos genes que são expressos mais altamente nas células, nas partes vegetativas da planta ou nas sementes, qualquer uma quer esteja para ser modificada. As sequências de nucleotídeos que são altamente conservadas entre os cDNAs correspondentes a todos os genes SDP1 em uma espécie de planta são preferidos se se deseja reduzir a atividade de todos os membros de uma família de genes naquela espécie.

[398] Em uma modalidade, uma modificação genética da invenção infrarregula a produção endógena de SDP1, em que SDP1 é codificado por um ou mais dos seguintes: i) nucleotídeos cuja sequência é apresentada como qualquer uma de SEQ ID NOs: 163 a 174, ii) os nucleotídeos cuja sequência é pelo menos 30% idêntica a qualquer uma ou mais das sequências apresentadas como SEQ ID NOs: 163 a 174, e iii) uma sequência de nuleotídeos que hibridiza com um ou ambos de i) ou ii) sob condições rigorosas.

[399] Tal como ilustrado nos Exemplos, a redução da expressão e/ou atividade da SDP1 TAG lipase em folhas de plantas aumentou bastante o teor de TAG, tanto em termos da quantidade de TAG acumulado como da temporização anterior de acumulação durante o desenvolvimento da planta, no contexto de coexpressão do fator de transcrição WRI1 e uma acil graxo aciltransferase. Em particular, o aumento foi observado em plantas antes da floração, e foi de cerca de 70% em uma base de peso (% de peso seco) no início da senescência. O aumento foi relativo aos níveis de TAG observados em folhas de plantas correspondentes transformadas com polinucleotídeos exógenos codificando WRI1 e acil graxo aciltransferase, mas sem a modificação que reduziu a expressão e/ou atividade de SDP1.

[400] Reduzir a expressão de outros genes de catabolismo TAG em partes de plantas também pode aumentar o conteúdo de TAG, como os genes ACX codificando acl-CoA oxidases, tais como os genes Acx1 (At4g16760 e homólogos em outras espécies vegetais) ou Acx2 (At5g65110 e homólogos em outras espécies vegetais). Outro polipeptídeo envolvido no catabolismo de lipídeos é PXA1 que é um transportador de cassete de ligação a ATP peroxisomal que é necessário para a importação de ácidos graxos para a e-oxidação (Zolman et al. 2001). Exportação de ácidos graxos a partir de plastídeos

[401] Tal como aqui utilizado, o termo "polipeptídeo que aumenta a exportação de ácidos graxos a partir de plastídeos da célula" refere-se a qualquer polipeptídeo que auxilia em ácidos graxos sendo transferidos de dentro do plastídeos (em células que têm plastídeos, tais como uma célula de uma parte vegetativa, tubérculos, beterraba ou de uma semente de uma planta) para fora do plastídeo, que pode ser qualquer outra parte da célula tal como, por exemplo, o retículo endoplasmático (ER). Exemplos de tais polipeptídeos incluem, mas não estão limitados a, uma ácido graxo tioesterase C16 ou C18, tal como um polipeptídeo FATA ou um polipeptídeo FATB, uma ácido graxo tioesterase C8 a C14 (que é também um polipeptídeo FATB), um transportador de ácido graxo, tal como um polipeptídeo ABCA9 ou uma acil-CoA de cadeia longa sintetase (LACS).

[402] Tal como aqui utilizado, o termo "ácido graxo tioesterase" ou "FAT" refere-se a uma enzima que catalisa a hidrólise da ligação tioéster entre uma porção acil e uma proteína carreadora de acil (ACP) em acil-ACP e a liberação de um ácido graxo livre. Tais enzimas funcionam, normalmente nos plastídeos de um organismo que são ácidos graxos de novo de sintetização. Tal como aqui utilizado, o termo "ácido graxo C16 ou C18 tioesterase" refere-se a uma enzima que catalisa a hidrólise da ligação tioéster entre uma porção acil C16 e/ou C18 e ACP em acil-ACP e à liberação de ácidos graxos C16 ou C18 livres no plastídeo. O ácido graxo livre é então re-esterificado para CoA no envelope de plastídeo à medida que é transportado para fora do plastídeo. A especificidade de substrato da enzima ácido graxo tioesterase (FAT) no plastídeo está envolvida na determinação do espectro de comprimento de cadeia e grau de saturação dos ácidos graxos exportados a partir do plastídeo. As enzimas FAT podem ser classificadas em duas classes com base na sua especificidade de substrato e sequências nucleotídicas, FATA e FATB (EC 3.1.2.14) (Jones et al., 1995). Os polipeptídeos FATA preferem o oleoil-ACP como substrato, enquanto que os polipeptídeos FATB apresentam uma atividade mais elevada em relação aos acil-ACP saturados de diferentes comprimentos de cadeia, tal como a atuação sobre palmitoil-ACP para produzir ácido palmítico livre. Exemplos de polipeptídeos FATA úteis para a invenção incluem, mas não estão limitados a, aqueles de Arabidopsis thaliana (NP_189147), Arachis hypogaea (GU324446), Helianthus annuus (AAL79361), Carthamus tinctorius (AAA33020), Morus notabilis (XP_010104178.1), Brassica napus (CDX77369.1), Ricinus communis (XP_002532744.1) e Camelina sativa (AFQ60946.1). Exemplos de polipeptídeos FATB úteis para a invenção incluem, mas não estão limitados a, aqueles de Zea mays (AIL28766), Brassica napus (ABH11710), Helianthus annuus (AAX19387), Arabidopsis thaliana (AEE28300), Umbellularia californica (AAC49001), Arachis hypogaea (AFR54500), Ricinus communis (EEF47013) e Brachypodium sylvaticum (ABL85052.1).

[403] Uma subclasse de polipeptídeos FATB são ácidos graxos tioesterases que têm atividade de hidrólise em uma porção acil saturada C8-C14 ligada por uma ligação tioéster a ACP. Tais enzimas são também referidas como ácido graxo de cadeia média tioesterases (MCFA) ou enzimas MC-FAT. Tais enzimas podem também ter atividade de tioesterase em C16-ACP, de fato podem ter uma atividade de tioesterase superior em um substrato acil-C16 C16 do que em um substrato MCFA-ACP, no entanto, são aqui consideradas como uma tioesterase de MCFA se produzem pelo menos 0,5% de MCFA no teor de ácidos graxos totais quando expresso exogenamente em uma célula vegetal. Exemplos de MCFA tioesterases são dados no Exemplo 9 aqui.

[404] Tal como aqui utilizado, o termo "transportador de ácido graxo" refere-se a um polipeptídeo presente na membrana do plastídeo que está envolvida na transferência ativa de ácidos graxos de um plastídeo para fora do plastídeo. Exemplos de polipeptídeos de ABCA9 (transportador ABC A, membro da família 9) úteis para a invenção incluem, mas não estão limitados a, aqueles de Arabidopsis thaliana (Q9FLT5), Capsella rubella (XP_006279962.1), Arabis alpine (KFK27923.1), Camelina sativa (XP_010457652.1), Brassica napus (CDY23040.1) e Brassica rapa (XP_009136512.1).

[405] Tal como aqui utilizado, o termo "acil-CoA sintetase" ou "ACS" (EC 6.2.1.3) significa um polipeptídeo que é um membro de uma família de ligases que catalisa a formação de acil-CoA graxo por um processo de dois passos que prossegue através de um intermediário adenilado, usando um ácido graxo não esterificado, CoA e ATP como substratos para produzir um éster de acil-CoA, AMP e pirofosfato como produtos. Tal como aqui utilizado, o termo "acil-CoA de cadeia longa sintetase" (LACS) é um ACS que tem atividade sobre pelo menos um substrato de ácido graxo C18 livre embora possa ter uma atividade mais ampla em qualquer um dos ácidos graxos C14-C20 livres. As enzimas LACS plastidiais endógenas estão localizadas na membrana externa do plastídeo e funcionam com a ácido graxo tioesterase para a exportação de ácidos graxos a partir do plastídeo (Schnurr et al. 2002). Em Arabidopsis, existem pelo menos nove genes LACS identificados (Shockey et al., 2002). Os polipeptídeos LACS preferidos são da subclasse LACS9, que em Arabidopsis é o maior LACS plastidial. Exemplos de polipeptídeos LACS úteis para a invenção incluem, mas não estão limitados a, aqueles de Arabidopsis thaliana (Q9CAP8), Camelina sativa (XP_010416710.1), Capsella rubella (XP_006301059.1), Brassica napus (CDX79212.1), Brassica rapa (XP_009104618.1), Gossypium raimondii (XP_012450538.1) e Vitis Vinifera (XP_002285853.1). Os homólogos dos polipeptídeos acima mencionados em outras espécies podem ser prontamente identificados por aqueles versados na técnica. Polipeptídeos envolvidos na produção de diacilglicerol (DAG) em plastídeos

[406] Os níveis de lipídeos não polares, por exemplo, partes vegetativas da planta, pode também ser aumentado através da redução da atividade de polipeptídeos envolvidos na produção de diacilglicerol (DAG) no plastídeo nas partes da planta, por exemplo por qualquer mutação de um gene endógeno codificante, tal um polipeptídeo ou a introdução de um gene exógeno codificante em uma molécula de RNA de silenciamento que reduz a expressão de um gene alvo envolvido na produção de diacilglicerol (DAG) no plastídeo.

[407] Tal como aqui utilizado, o termo "polipeptídeo envolvido na produção de diacilglicerol (DAG) no plastídeo" refere-se a qualquer polipeptídeo no plastídeo (em células que têm plastídeos, tais como uma célula de uma parte vegetativa, tubérculo, beterraba ou de uma semente de uma planta) que está diretamente envolvida na síntese de diacilglicerol. Exemplos de tais polipeptídeos incluem, mas não estão limitados a, GPAT plastidial, LPAAT plastidial ou PAP plastidial.

[408] GPATs são descritas em outras partes do presente documento. Exemplos de polipeptídeos GPAT plastidiais que podem ser alvo de infrarregulação na invenção incluem, mas não estão limitados a, aqueles de Arabidopsis thaliana (BAA00575), Capsella rubella (XP_006306544.1), Camelina sativa (010499766.1), Brassica napus (CDY43010.1), Brassica rapa (XP_009145198.1), Helianthus annuus (ADV16382.1) e Citrus unshiu (BAB79529.1). Homólogos em outras espécies de plantas podem ser prontamente identificados por aqueles versados na técnica.

[409] LPAATs são descritas em outras partes do presente documento. Como o especialista na especialidade irá apreciar, LPAATs plastidiais a serem alvo de infrarregulação para a redução da síntese de DAG no plastídeo não são LPAATs endógenas que funcionam fora do plastídeo, tal como aquelas no ER, por exemplo como aqui descrito como sendo úteis para produzir TAG compreendendo ácidos graxos de comprimento de cadeia média. Exemplos de polipéptidos LPAAT plastidiais que podem ser alvo de infrarregulação na invenção incluem, mas não estão limitados a, aqueles de Brassica napus (ABQ42862), Brassica rapa (XP_009137939.1), Arabidopsis thaliana (NP_194787.2), Camelina sativa (XP_010432969.1), Glycine max (XP_006592638.1) e Solanum tuberosum (XP_006343651.1). Os homólogos em outras espécies de polipeptídeos acima mencionados podem ser prontamente identificados por aqueles versados na técnica.

[410] Tal como aqui utilizado, o termo "ácido fosfatídico fosfatase" (PAP) (EC 3.1.3.4) refere-se a uma proteína que hidrolisa o grupo fosfato em 3-sn-fosfatidato para produzir 1,2-diacil-sn-glicerol (DAG) e fosfato. Exemplos de polipeptídeos PAP plastidiais que podem ser alvo de infrarregulação na invenção incluem, mas não estão limitados a, aqueles de Arabidopsis thaliana (Q6NLA5), Capsella rubella (XP_006288605.1), Camelina sativa (XP_010452170.1), Brassica napus (CDY10405.1), Brassica rapa (XP_009122733.1), Glycine max (XP_003542504.1) e Solanum tuberosum (XP_006361792.1). Os homólogos em outras espécies de polipeptídeos acima mencionados podem ser prontamente identificados por aqueles versados na técnica. Importação de ácidos graxos em plastídeos

[411] Os níveis de lipídeos não polares nas partes vegetativas das plantas podem, portanto, ser aumentados por redução da atividade dos polipeptídeos TGD nas partes da planta, por exemplo, seja por mutação de um gene endógeno que codifica um polipeptídeo TGD ou pela introdução de um gene exógeno que codifica uma molécula de RNA de silenciamento que reduz a expressão de um gene endógeno TGD. Tal como aqui utilizado, um "polipeptídeo trigalactosildiacilglicerol (TGD)" é aquele que está envolvido no ER para o tráfico de lipídeos de cloroplasto (Xu et al., 2010) e envolvido na formação de um complexo de proteína que tem a função permease para lipídeos. Quatro de tais polipeptídeos são conhecidos por formarem ou estarem associados a uma TGD permease, nomeadamente TGD-1 (N.° de Acessão At1g19800 e homólogos de outras espécies), TGD-2 (N.° de Acessão At2g20320 e homólogos de outras espécies), TGD-3 (N.° de Acessão NM-105215 e homólogos em outras espécies) e TGD-4 (At3g06960 e homólogos em outras espécies) (US 20120237949). Pensa-se que os polipeptídeos TGD-1, -2 e -3 são componentes de um transportador de cassete de ligação a ATP (ABC) associado com a membrana de envelope interna do cloroplasto. Os polipeptídeos TGD-2 e TGD-4 ligam-se a ácido fosfatídico enquanto que o polipeptídeo TGD-3 funciona como uma ATPase no estroma do cloroplasto. Tal como aqui utilizado, um "gene TGD endógeno" é um gene que codifica um polipeptídeo TGD em uma planta. Mutações no gene TGD-1 em A. thaliana causou acúmulo de triacilgliceróis, oligogalactolipídeos e ácido fosfatídico (PA) (Xu et al., (2005). Mutações em genes TGD ou genes SDP1, ou mesmo em qualquer gene desejado em uma planta, podem ser introduzidos de uma forma específica de sítio por meio de uma nuclease de dedo de zinco artificial (ZFN), efetor TAL (TALEN) ou tecnologias CRISPR (usando uma nuclease de tipo Cas9) como é conhecido na técnica. Os genes exógenos preferidos que codificam RNA de silenciamento são aqueles que codificam uma molécula de RNA de cadeia dupla, tal como um RNA em gancho ou um precursor de microRNA artificial. Enzimas modificadoras de ácidos graxos

[412] Tal como aqui utilizado, o termo "FAD2" refere-se a uma desturase de ácido graxo delta-12 ligada à membrana que dessatura o ácido oleico (C18:1Δ9) para produzir ácido linoleico (C18:2A9,12).

[413] Tal como aqui utilizado, o termo "epoxigenase" ou "ácido graxo epoxigenase" refere-se a uma enzima que introduz um grupo epóxi em um ácido graxo resultando na produção de um ácido graxo epóxi. Na modalidade preferida, o grupo epóxi é introduzido no 12o carbono em uma cadeia de ácido graxo, caso em que a epoxigenase é uma Δ12-epoxigenase, especialmente de uma cadeia de ácido graxo C16 ou C18. A epoxigenase pode ser uma Δ9-epoxigenase, a Δ15 epoxigenase, ou atuam em uma posição diferente na cadeia acil como é conhecido na técnica. A epoxigenase pode ser da classe P450. As epoxigenases preferidas são da classe mono-oxigenase como descrito em WO98/46762. Numerosas epoxigenases ou presumidas epoxigenases foram clonadas e são conhecidas na técnica. Outros exemplos de expoxigenases incluem proteínas compreendendo uma sequência de aminoácidos fornecida em SEQ ID NO: 21 de WO 2009/129582, polipeptídeos codificados por genes de Crepis paleastina (CAA76156, Lee et al., 1998), Stokesia laevis (AAR23815) (tipo mono-oxigenase), Euphorbia lagascae (AAL62063) (P450 type), CYP2J2 humano (ácido araquidônico epoxigenase, U37143); CYPIA1 humano (ácido araquidônico epoxigenase, K03191), bem como variantes e/ou mutantes dos mesmos.

[414] Tal como aqui utilizado, o termo "hidroxilase" ou "ácido graxo hidroxilase" refere-se a uma enzima que introduz um grupo hidroxil em um ácido graxo resultando na produção de um ácido graxo hidroxilado. Em uma modalidade preferida, o grupo hidroxil é introduzido no 2°, 12° e/ou 17° carbono em uma cadeia de ácido graxo C18. De preferência, o grupo hidroxil é introduzido no 12o carbono, caso em que a hidroxilase é uma Δ12-hidroxilase. Em uma modalidade preferida, o grupo hidroxil é introduzido no 15o carbono em uma cadeia de ácido graxo C16. Hidroxilases também podem ter atividade da enzima como um ácido graxo dessaturase. Exemplos de genes que codificam Δ12-hydroxilases incluem aqueles de Ricinus communis (AAC9010, van de Loo 1995); Physaria lindheimeri, (ABQ01458, Dauk et al., 2007); Lesquerella fendleri, (AAC32755, Broun et al., 1998); Daucus carota, (AAK30206); ácido graxo hidroxilases que hidroxilam o terminal de ácidos graxos, por exemplo: A, thaliana CYP86A1 (P48422, ácido graxo o-hdroxilase); Vicia sativa CYP94A1 (P98188, ácido graxo o-hidroxilase); camundongo CYP2E1 (X62595, ácido láurico o-1 hidroxilase); rati CYP4A1 (M57718, ácido graxo o-hidroxilase), bem como variantes e/ou mutantes dos mesmos.

[415] Tal como aqui utilizado, o termo "conjugase" ou "ácido graxo conjugase" refere-se a uma enzima capaz de formar uma ligação conjugada na cadeia acil de um ácido graxo. Exemplos de conjugases incluem aquelas codificadas pelos genes de Calendula officinalis (AF343064, Qiu et al., 2001); Vernicia fordii (AAN87574, Dyer et al., 2002); Punica granatum (AY178446, Iwabuchi et al., 2003) and Trichosanthes kirilowii (AY178444, Iwabuchi et al., 2003); bem como as variantes e/ou mutantes dos mesmos.

[416] Tal como aqui utilizado, o termo "acetilenase" ou "ácido graxo acetilenase" refere-se a uma enzima que introduz uma ligação tripla em um ácido graxo resultando na produção de um ácido graxo acetilênico. Em uma modalidade preferida, a ligação tripla é introduzida no 2°, 6°, 12° e/ou 17° carbono em uma cadeia de ácido graxo C18. Exemplos de acetilenases incluem aqueles de Helianthus annuus (AA038032, ABC59684), bem como variantes e/ou mutantes dos mesmos.

[417] Exemplos de tais genes modificadores de ácidos graxos incluem proteínas de acordo com os seguintes Números de Acesso que são agrupadas por função putativa e homólogos de outras espécies: Δ12-acetilenases ABC00769, CAA76158, AAO38036, AAO38032; Δ12 conjugases AAG42259, AAG42260, AAN87574; Δ12-dessaturases P46313, ABS18716, AAS57577, AAL61825, AAF04093, AAF04094; Δ12 epoxigenases XP_001840127, CAA76156, AAR23815; Δ12-hidroxilases ACF37070, AAC32755, ABQ01458, AAC49010; e Δ12 P450 enzimas, tais como AF406732.

Supressores de silenciamento

[418] Em uma modalidade, uma célula recombinante/transgênica da invenção pode compreender um supressor de silenciamento.

[419] Tal como aqui utilizado, um "supressor de silenciamento" aumenta a expressão do transgene em uma célula da invenção. Por exemplo, a presença de supressores de silenciamento resulta em níveis mais elevados de um polipeptídeo(s) produzido um polinucleotídeo(s) exógeno(s) em uma célula da invenção, quando comparada a uma célula correspondente sem o supressor de silenciamento. Em uma modalidade, o supressor de silenciamento liga preferencialmente uma molécula de dsRNA que tem 21 pares de bases de comprimento em relação a uma molécula de dsRNA de um comprimento diferente. Esta é uma característica de pelo menos o tipo p19 de supressor de silenciamento, ou seja, para p19 e seus ortólogos funcionais. Em uma outra modalidade, o supressor de silenciamento liga-se preferencialmente a uma molécula de RNA de cadeia dupla que tem extremidades 5' sobrepostas em relação a uma molécula de RNA de cadeia dupla correspondente tendo extremidades cegas. Esta é uma característica do tipo V2 de supressor de silenciamento, ou seja, para V2 e seus ortólogos funcionais. Em uma modalidade, a molécula de dsRNA, ou um produto do mesmo de RNA processado, compreende pelo menos 19 nucleotídeos consecutivos, preferencialmente cujo comprimento é de 19 a 24 nucleotídeos com 19 a 24 pares de bases consecutivos no caso de uma molécula de RNA em gancho de cadeia dupla ou produto de RNA processado, mais preferencialmente consistindo em 20, 21, 22, 23 ou 24 nucleotídeos de comprimento, e de preferência compreendendo um nucleotídeo metilado, que é pelo menos 95% idêntico ao complemento da região do RNA alvo e em que a região do RNA alvo é i) dentro de uma região 5' não traduzida do RNA alvo, ii) dentro de uma metade 5' do RNA alvo, iii) dentro de uma estrutura de leitura aberta de codificação de proteína do RNA alvo, iv ) dentro de uma metade 3' do RNA alvo, ou v) dentro de uma região 3' não traduzida do RNA alvo.

[420]Mais detalhes sobre os supressores de silenciamento são bem conhecidos na técnica e descritos em WO 2013/096992 e WO 2013/096993.

Polinucleotídeos

[421] Os termos "polinucleotídeo" e "ácido nucleico" são utilizados permutavelmente. Eles se referem a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos ou análogos dos mesmos. Um polinucleotídeo da invenção pode ser de origem genômica, cDNA, semissintética ou sintética, de cadeia dupla ou de cadeia simples e em virtude da sua origem ou manipulação: (1) não está associado com a totalidade ou uma porção de um polinucleotídeo com o qual está associado na natureza, (2) está ligado a um polinucleotídeo diferente daquele ao qual está ligado na natureza, ou (3) não ocorre na natureza. Os seguintes são exemplos de polinucleotídeos não limitativos: regiões codificantes ou não codificantes de um gene ou fragmento de gene, éxons, íntrons, RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência (tRNA), RNA ribossomal (rRNA),ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, DNA quimérico de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico e iniciadores. Para uso in vitro, um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como por conjugação com um componente de marcação.

[422] Tal como aqui utilizado, um "polinucleotídeo isolado" refere-se a um polinucleotídeo que foi separado das sequências polinucleotídicas com as quais está associado ou ligado no seu estado nativo, ou um polinucleotídeo que não ocorre naturalmente.

[423] Tal como aqui utilizado, o termo "gene" deve ser tomado no seu contexto mais amplo e inclui as sequências de desoxirribonucleotídeos compreendendo a região transcrita e, se traduzida, a região codificante de proteína, de um gene estrutural e incluindo sequências localizadas adjacentes à região de codificação em ambas as extremidades 5' e 3' para uma distância de pelo menos cerca de 2 kb em qualquer das extremidades e que estão envolvidas na expressão do gene. A este respeito, o gene inclui sinais de controle, tais como promotores, potencializadores, sinais de terminação e/ou de poliadenilação que estão naturalmente associados a um dado gene, ou sinais de controle heterólogos, caso em que o gene é referido como um "gene quimérico". As sequências que estão localizadas em 5' da região codificante da proteína e que estão presentes no mRNA são referidas como sequências não traduzidas em 5'. As sequências que estão localizadas a 3' ou a jusante da região codificante da proteína e que estão presentes no mRNA são referidas como sequências 3' não traduzidas. O termo "gene" engloba ambas as formas de cDNA e genômicas de um gene. Uma forma genômica ou clone de um gene contém a região de codificação que pode ser interrompida com sequências não codificantes denominadas "íntrons", "regiões intervenientes" ou "sequências intervenientes". Íntrons são segmentos de um gene que são transcritos em RNA nuclear (nRNA). Íntrons podem conter elementos reguladores, tais como potenciadores. Os íntrons são removidos ou "cortados" do transcrito nuclear ou primário; íntrons são, portanto, ausentes na transcrição de mRNA. Um gene que contém pelo menos um íntron pode estar sujeito à junção variável, resultando em mRNAs alternativos a partir de um único gene transcrito e, portanto, em variantes de polipeptídeo. Um gene no seu estado nativo, ou um gene quimérico pode não ter íntrons. O mRNA funciona durante a tradução para especificar a sequência ou ordem dos aminoácidos em um polipeptídeo nascente. O termo "gene" inclui uma molécula sintética ou de fusão que codifica a totalidade ou parte das proteínas da invenção aqui descrita e uma sequência de nucleotídeos complementar a qualquer um dos acima.

[424] Tal como aqui utilizado, "DNA quimérico" refere-se a qualquer molécula de DNA que não seja naturalmente encontrada na natureza; também aqui referido como um "constructo de DNA" ou "constructo genético". Tipicamente, um DNA quimérico compreende sequências reguladoras e transcritas ou de codificação de proteínas que não são encontradas naturalmente em conjunto na natureza. Por exemplo, uma molécula de DNA quimérico pode compreender sequências regulatórias e sequências em código que sejam derivadas de diferentes fontes, ou sequências regulatórias e sequências em código que sejam derivadas da mesma fonte, mas dispostas de uma maneira diferente daquela encontrada na natureza. A estrutura de leitura aberta pode ou não estar ligada aos seus elementos reguladores naturais a montante e a jusante. A estrutura de leitura aberta pode ser incorporada, por exemplo, no genoma da planta, em uma localização não natural, ou em um replicon ou vetor onde não se encontra naturalmente, tal como um plasmídeo bacteriano ou um vetor viral. O termo "DNA quimérico" não está limitado a moléculas de DNA que são replicáveis em um hospedeiro, mas incluem DNA capaz de ser ligado a um replicon por, por exemplo, sequências de adaptador específico.

[425] Um "transgene" é um gene que foi introduzido no genoma por um procedimento de transformação. O termo inclui um gene em uma célula descendente, planta, semente, organismo não humano ou uma parte do mesmo que estava se introduzindo no genoma de uma célula progenitora do mesmo. Tais células descendentes etc podem ser, pelo menos, uma 3a ou 4a geração descendente da célula descendente que era a célula primária transformada, ou da planta transgênica descendente (aqui referida como uma planta T0). A descendência pode ser produzida por reprodução sexual ou vegetativamente tais como, por exemplo, a partir de tubérculos de batata ou socas em cana de açúcar. O termo "geneticamente modificado", "modificação genética" e suas variações, é um termo genérico que inclui a introdução de um gene em uma célula por transformação ou transdução, mutação de um gene em uma célula e alteração ou modulação genética da regulação de um gene em uma célula, ou a descendência de qualquer célula modificada, tal como descrito acima.

[426] Uma "região genômica", tal como aqui utilizado refere-se a uma posição dentro do genoma onde um transgene, ou um grupo de transgenes (também aqui referido como um aglomerado), foi inserido em uma célula, ou antecessora da mesma. Tais regiões compreendem nucleotídeos únicos que foram incorporados pela intervenção do homem, tais como por meio de métodos aqui descritos.

[427] Um "polinucleotídeo recombinante" da invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico que tenha sido construída ou modificado por métodos recombinantes artificiais. O polinucleotídeo recombinante pode estar presente em uma célula em uma quantidade alterada ou expressa a uma taxa alterada (por exemplo, no caso de mRNA) em relação ao seu estado nativo. Em uma modalidade, o polinucleotídeo é introduzido em uma célula que não compreende naturalmente o polinucleotídeo. Tipicamente, um DNA exógeno é usado como um modelo para a transcrição de mRNA, que é então traduzido para uma sequência contínua de resíduos de aminoácidos que codificam para um polipeptídeo da invenção dentro da célula transformada. Em uma outra modalidade, o polinucleotídeo é endógeno à célula e a sua expressão é alterada por meios recombinantes, por exemplo, uma sequência de controle exógena é introduzida a montante de um gene endógeno de interesse para permitir que a célula transformada expresse o polipeptídeo codificado pelo gene, ou uma deleção é criada em um gene de interesse pelos métodos ZFN, Talen ou CRISPR.

[428] Um polinucleotídeo recombinante da invenção inclui polinucleotídeos que não foram separados de outros componentes do sistema de expressão à base de célula ou livre de células, em que está presente, e polinucleotídeos produzidos em tais sistemas à base de células ou livre de células que são, subsequentemente purificados a partir de pelo menos alguns dos outros componentes. O polinucleotídeo pode ser um trecho contíguo de nucleotídeos ou compreender duas ou mais extensões de nucleotídeos contíguos a partir de diferentes fontes (que ocorrem naturalmente e/ou sintéticas) unidas para formar um único polinucleotídeo. Tipicamente, esses polinucleotídeos quiméricos compreendem pelo menos uma estrutura de leitura aberta que codifica um polipeptídeo da presente invenção operacionalmente ligada a um promotor adequado para dirigir a transcrição da estrutura de leitura aberta em uma célula de interesse.

[429]No que diz respeito aos polinucleótidos definidos, faz-se observar que a% de identidade de valores mais elevada do que as fornecidas acima irá abranger modalidades preferidas. Assim, quando aplicável, à luz das percentagens de identidade de% mínima, é preferido que o polinucleotídeo compreenda uma sequência de polinucleotídeos que seja pelo menos 60%, mais preferencialmente pelo menos 65%, mais preferencialmente pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, mais preferencialmente pelo menos 93%, mais preferencialmente pelo menos 94%, mais preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 96%, mais preferencialmente pelo menos 97%, mais preferencialmente pelo menos 98%, mais preferencialmente pelo menos 99%, mais preferencialmente pelo menos 99,1%, mais preferencialmente pelo menos 99,2%, mais preferencialmente pelo menos 99,3%, mais preferencialmente pelo menos 99,4%, mais preferencialmente pelo menos 99,5%, mais preferencialmente pelo menos 99,6%, mais preferencialmente pelo menos 99,7%, mais preferencialmente pelo menos 99,8%, e ainda mais preferencialmente pelo menos 99,9% idêntica à SEQ ID NO. nominada relevante.

[430] Um polinucleotídeo da, ou útil para a presente invenção pode hibridizar seletivamente, sob condições rigorosas, com um polinucleotídeo aqui definido. Tal como aqui usado, as condições rigorosas são aquelas que: (1) empregam durante a hibridização um agente desnaturante, tal como formamida, por exemplo, formamida a 50% (v/v) com albumina de soro bovino a 0,1% (p/v), Ficoll a 0,1%, polivinilpirrolidona a 0,1%, tampão fosfato de sódio 50 mM PH 6,5 com 750 mM de NaCl, 75 mM de citrato de sódio a 42oC; ou (2) empregam 50% de formamida, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sódio 0,075 M), fosfato de sódio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sódio a 0,1%, 5 x solução de Denhardt, DNA de esperma de salmão sonicado (50 g/ml) 0,1% de SDS e 10% de sulfato de dextrano a 42oC em 0,2 x SSC e 0,1% de SDS e/ou (3) empregam baixa força iônica e temperatura elevada para lavagem, por exemplo, NaCl 0,015 M/citrato de sódio 0,0015 M/0,1% de SDS a 50oC.

[431] Os polinucleotídeos da invenção podem possuir, quando comparados com moléculas que ocorrem naturalmente, uma ou mais mutações que são deleções, inserções ou substituições de resíduos nucleotídicos. Os polinucleotídeos que possuem mutações em relação a uma sequência de referência podem ser quer de origem natural (isto é, isolados a partir de uma fonte natural) ou sintéticos (por exemplo, através da realização de mutagênese dirigida ao sítio ou embaralhamento de DNA no ácido nucleico tal como descrito acima).

Polinucleotídeos para reduzir a expressão de genes Interferência de RNA

[432]A interferência de RNA (RNAi) é particularmente útil para reduzir especificamente a expressão de um gene, o que resulta na redução da produção de uma proteína particular se o gene codifica uma proteína. Embora não desejando estar limitado pela teoria, Waterhouse et al. (1998) forneceram um modelo para o mecanismo pelo qual dsRNA (RNA duplex) pode ser utilizado para reduzir a produção de proteína. Esta tecnologia baseia-se na presença de moléculas de dsRNA que contenham uma sequência que é essencialmente idêntica ao mRNA do gene de interesse ou a parte do mesmo. Convenientemente, o dsRNA pode ser produzido a partir de um único promotor em um vetor hospedeiro ou célula recombinante, onde as sequências de sentido e antissenso estão flanqueadas por uma sequência não relacionada que permite que as sequências de sentido e antissenso hibridizem, para formar a molécula de dsRNA com a sequência não relacionada formando uma estrutura em alça.. A concepção e a produção de moléculas de dsRNA adequadas está bem dentro da capacidade de um versado na técnica, particularmente considerando Waterhouse et al. (1998), Smith et al. (2000), WO 99/32619, WO 99/53050, WO 99/49029, e WO 01/34815.

[433] Em um exemplo, introduz-se um DNA que dirige a síntese de um produto(s) de RNA de cadeia dupla pelo menos parcialmente com homologia com o gene alvo a ser inativado tal como, por exemplo, um gene de SDP1, TGD, plastidial GPAT, plastidial LPAAT, plastidial PAP, AGPase. Por conseguinte, o DNA compreende ambas as sequências de sentido e antissenso que, quando transcritas para RNA, podem hibridizar para formar a região de RNA de cadeia dupla. Em uma modalidade da invenção, as sequências de sentido e antissenso são separadas por uma região espaçadora que compreende um íntron que, quando transcrito para RNA, é cortado. Verificou-se que esta disposição resulta em uma maior eficiência de silenciamento de genes (Smith et al. 2000). A região de cadeia dupla pode compreender uma ou duas moléculas de RNA, transcritas a partir de qualquer de uma ou duas regiões de DNA. Pensa-se que a presença da molécula de cadeia dupla desencadeia uma resposta a partir de um sistema endógeno que destrói tanto o RNA de cadeia dupla como também o transcrito de RNA homólogo a partir do gene alvo, reduzindo ou eliminando eficazmente a atividade do gene alvo.

[434] O comprimento das sequências de sentido e antissenso que hibridizam deve ser, cada uma, de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos, de preferência pelo menos 50 nucleotídeos contíguos, mais preferivelmente pelo menos 100 ou pelo menos 200 nucleotídeos contíguos. Geralmente, uma sequência de nucleotídeos 100-1000 que corresponde a uma região do mRNA do gene alvo é usada. Pode ser usada a sequência de comprimento completo correspondente à totalidade do transcrito do gene. O grau de identidade da sequência de sentido para o trasncrito alvo (e, portanto, também a identidade da sequência antissenso para o complemento do transcrito alvo) deve ser de pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou 95 a 100%. A molécula de RNA pode, naturalmente, compreender sequências não relacionadas, que podem funcionar para estabilizar a molécula. A molécula de RNA pode ser expressa sob o controle de um promotor de RNA polimerase II ou RNA-polimerase III. Exemplos destes últimos incluem promotores de tRNA ou snRNA.

[435]As moléculas de RNA de interferência pequenas ("siRNA") preferidas compreendem uma sequência de nucleotídeos que é idêntica a cerca de 19 a 25 nucleotídeos contíguos do mRNA alvo. De preferência, a sequência de siRNA começa com o dinucleotídeo AA, compreende um teor de GC de cerca de 30 a 70% (preferencialmente, 30 a 60%, mais preferencialmente 40 a 60% e mais preferencialmente cerca de 45% a 55%) e não têm uma elevada percentagem de identidade com qualquer sequência de nucleotídeos diferente do alvo no genoma do organismo em que deve ser introduzida, por exemplo, como determinado por pesquisa BLAST padrão. microRNA

[436] Os microRNAs (miRNAs abreviados) são geralmente moléculas de RNA não codificantes de 19 a 25 nucleotídeos (normalmente cerca de 20 a 24 nucleotídeos nas plantas) que são derivadas de precursores maiores que formam estruturas imperfeitas em haste-alça. miRNAs ligam a sequências complementares nos transcritos de RNA mensageiro alvo (mRNAs), normalmente resultando em repressão translacional ou degradação de alvo e silenciamento de genes. Os miRNAs artificiais (amiRNAs) podem ser concebidos com base em miRNAs naturais para reduzir a expressão de qualquer gene de interesse, como é bem conhecido na técnica.

[437] Em células vegetaiss, acredita-se que as moléculas precursoras de miRNA sejam largamente processadas no núcleo. O pri-miRNA (contendo uma ou mais regiões locais de cadeia dupla ou "em gancho" assim como a cauda de 5 '"cap" habitual e a cauda poliadenilada de um mRNA) é processado para uma molécula precursora de miRNA mais curta que também inclui um estrutura em haste-alça ou de dobra para trás e é denominado o "pre-miRNA". Em plantas, os pre-miRNAs são clivados por diferentes enzimas do tipo DICER (DCL), produzindo miRNA:miRNA * duplexes. Antes do transporte para fora do núcleo, estes duplexes são metilados.

[438]No citoplasma, a cadeia de miRNA do miRNA:miRNA duplex é incorporada seletivamente em um complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) ativo para reconhecimento de alvo. Os complexos RISC contêm um subconjunto particular de proteínas Argonaute que exercem repressão genética específica de sequência ( ver, por exemplo, Millar e Waterhouse, 2005, Pasquinelli et al., 2005; Almeida and Allshire, 2005).

Cossupressão

[439] Os genes podem suprimir a expressão de genes endógenos relacionados e/ou transgenes já presentes no genoma, um fenômeno denominado dependente de homologia Silenciamento de genes A maioria dos casos de silenciamento de genes dependente de homologia caem em duas classes - aqueles que funcionam no nível de transcrição do transgene, e aqueles que operam pós-transcricionalmente.

[440] O silenciamento de genes dependente de homologia pós-transcricional (isto é, a cossupressão) descreve a perda de expressão de um transgene e de genes endógenos ou virais relacionados em plantas transgênicas. A cossupressão muitas vezes, mas nem sempre, ocorre quando os transcritos do transgene são abundantes, e acredita-se que geralmente é desencadeada ao nível do processamento, localização e/ou degradação do mRNA. Modelos Severa1 existem para explicar como a cossupressão funciona (ver em Taylor, 1997).

[441] Cossupressão envolve a introdução de uma cópia extra de um gene ou um fragmento do mesmo em uma planta na orientação de sentido em relação a um promotor para a sua expressão. O tamanho do fragmento de sentido, sua correspondência às regiões de gene alvo e seu grau de identidade de sequência com o gene alvo podem ser determinados pelos versados na técnica. Em alguns casos, a cópia adicional da sequência do gene interfere com a expressão do gene alvo do planta. É feita referência a WO 97/20936 e EP 0465572 para métodos de aplicação de abordagens de cossupressão.

Polinucleotídeos antissenso

[442] O termo "polinucleotídeo antissenso" deve ser tomado para significar uma molécula de DNA ou RNA que é complementar a pelo menos uma porção de uma molécula de mRNA específica codificando um polipeptídeo endógeno e capaz de interferir com um evento pós-transcricional, tal como a tradução de mRNA A utilização de métodos antissenso é bem conhecida na técnica (ver, por exemplo, G. Hartmann e S. Endres, Manual of Antisense Methodology, Kluwer (1999)). A utilização de técnicas antissenso em plantas foi revista por Bourque (1995) e Senior (1998). Bourque (1995) lista um grande número de exemplos de como sequências antissenso têm sido utilizadas em sistemas de plantas como um método de inativação do gene. Bourque afirma também que a obtenção de 100% de inibição de qualquer atividade enzimática pode não ser necessária, já que a inibição parcial mais do que provavelmente irá resultar na alteração mensurável no sistema. Senior (1998) afirma que os métodos antissenso são agora uma técnica muito bem estabelecida para manipular a expressão do gene.

[443] Em uma modalidade, o polinucleotídeo antissenso hibridiza sob condições fisiológicas, isto é, o polinucleotídeo antissenso (que é total ou parcialmente de cadeia simples) é pelo menos capaz de formar um polinucleotídeo de cadeia dupla com mRNA codificando um polipeptídeo endógeno, por exemplo, SDP1, TGD, GPAT plastidial, LPAAT plastidial, PAP plastidial ou mRNA AGPase em condições normais em uma célula.

[444]As moléculas antissenso podem incluir sequências que correspondam aos genes estruturais ou para sequências que exercem controle sobre a expressão do gene ou evento de junção. Por exemplo, a sequência antissenso pode corresponder à região de codificação do gene endógeno alvo, ou a região 5' não traduzida (UTR) ou a 3'-UTR ou a combinação destes. Pode ser complementar em parte às sequências de íntron, que podem ser aplicadas durante ou após a transcrição, preferivelmente apenas para sequências de éxons do gene alvo. Tendo em conta a divergência geralmente maior das UTRs, o direcionamento destas regiões fornece uma maior especificidade da inibição do gene.

[445] O comprimento da sequência antissenso devem ter pelo menos 19 nucleotídeos contíguos, de preferência pelo menos 50 nucleotídeos, e mais de preferência pelo menos 100, 200, 500 ou 1000 nucleotídeos. Pode ser usada a sequência de comprimento completo correspondente à totalidade do transcrito do gene. O comprimento é de um modo muito preferido de 100 a 2000 nucleotídeos. O grau de identidade da sequência antissenso para a transcrição direcionada deve ser pelo menos 90% e mais preferencialmente 95 a 100%. A molécula de RNA antissenso pode, naturalmente, compreender sequências não relacionadas, que podem funcionar para estabilizar a molécula.

Vetores recombinantes

[446] Uma modalidade da presente invenção inclui um vetor recombinante, que compreende pelo menos um polinucleotídeo aqui definido e é capaz de transportar o polinucleotídeo em uma célula hospedeira. Os vetores recombinantes incluem vetores expressão. Os vetores recombinantes contêm sequências de polinucleotídeos heterólogos, isto é, sequências de polinucleotídeos que não são encontrados naturalmente adjacente a um polinucleotídeo aqui definido, que de um modo preferido, são derivados de uma espécie diferente. O vetor pode ser RNA ou DNA, e tipicamente é um vetor viral, derivado de um vírus, ou um plasmídeo. Os vetores plasmídicos incluem tipicamente sequências de ácido nucleico adicionais que fornecem uma fácil seleção, amplificação e transformação da cassete de expressão em células procarióticas, por exemplo, vetores rivados de pUC, vetores rivados de pGEM ou vetores binários contendo uma ou mais regiões de T-DNA. As sequências adicionais de ácido nucleico incluem origens de replicação para fornecer a replicação autônoma do vetor, genes marcadores selecionáveis, de preferência codificando a resistência a antibióticos ou herbicidas, sítios de clonagem múltiplos únicos fornecendo sítios múltiplos para inserir sequências de ácido nucleico ou genes codificados no constructo de ácido nucleico, e sequências que aumentam a transformação de células procarióticas e eucarióticas (especialmente de plantas).

[447] "Operativamente ligado", tal como aqui utilizado, refere-se a uma relação funcional entre dois ou mais segmentos de ácidos nucleicos (por exemplo, DNA). Tipicamente, ele refere-se à relação funcional de um elemento regulador da transcrição (promotor) para uma sequência transcrita. Por exemplo, um promotor está operativamente ligado a uma sequência codificante de um polinucleotídeo aqui definido, se estimula ou modula a transcrição da sequência codificante em uma célula apropriada. Geralmente, os elementos reguladores da transcrição do promotor que são operativamente ligados a uma sequência transcrita são fisicamente contíguos à sequência transcrita, isto é, são de atividade cis. Entretanto, alguns elementos reguladores da transcrição, tais como pontenciadores, não precisam ser fisicamente contíguos ou localizados em estreita proximidade com as sequências codificantes cuja transcrição elas aumentam.

[448] Quando existem múltiplos promotores presentes, cada promotor pode ser independentemente o mesmo ou diferente.

[449] Os vetores recombinantes podem também conter uma ou mais sequências peptídicas de sinal para permitir que um polipeptídeo expresso aqui definido seja retido no retículo endoplasmático (ER) na célula ou seja transferido para um plastídeo e/ou conter sequências de fusão que conduzam à expressão de moléculas de ácido nucleico como proteínas de fusão. Exemplos de segmentos de sinal adequados incluem qualquer segmento de sinal capaz de dirigir a secreção ou localização de um polipeptídeo como aqui definido.

[450] Para facilitar a identificação de transformantes, o vetor recombinante compreende, desejavelmente, um gene marcador selecionável ou detectável. Por "gene marcador" entende-se um gene que confere um fenótipo distinto a células que expressam o gene marcador e assim, permite que tais células transformadas sejam distinguidas de células que não têm o marcador. Um gene marcador selecionável confere uma característica para a qual se pode "selecionar" com base na resistência a um agente seletivo (por exemplo, um herbicida, um antibiótico). Um gene marcador detectável (ou gene repórter) confere uma característica que se pode identificar através de observação ou teste, isto é, por "rastreio" (por exemplo, β-glucuronidase, luciferase, GFP ou outra atividade enzimática não presente em células não transformadas). Os exemplos de marcadores selecionáveis para a seleção de transformantes vegetais incluem, mas não se limitam a, um gene hyg que codifica a resistência à higromicina B; um gene de neomicina fosfotransferase (nptII) que confere resistência à canamicina, paromomicina; um gene de glutationa-S- transferase de fígado de rato que confere resistência a herbicidas derivados de glutationa como por exemplo, descrito em EP 256223; um gene de glutamina sintetase que confere, por sobre-expressão, resistência a inibidores de glutamina sintetase, tais como fosfinotricina como, por exemplo, descrito em WO 87/05327; um gene de acetiltransferase de Streptomyces viridochromogenes que confere resistência ao agente seletivo fosfinotricina como por exemplo, descrito em EP 275957; um gene que codifica uma 5-enolshikimate-3-fosfato sintase (EPSPS) que confere tolerância a N- fosfonometilglicina como por exemplo, descrito por Hinchee et al. (1988); um gene de barra que confere resistência contra bialafos como por exemplo, descrito em WO91 / 02071; um gene de nitrilase tal como bxn de Klebsiella ozaenae que confere resistência ao bromoxinil (Stalker et al., 1988); um gene da dihidrofolato redutase (DHFR) que confere resistência ao metotrexato (Thillet et al., 1988); um gene de acetolactato sintase mutante (ALS) que confere resistência a imidazolinona, sulfonilureia ou outros produtos químicos inibidores de ALS (EP 154, 204); um gene de antranilato sintase mutado que confere resistência a 5-metil triptofano; ou um gene de dalapon-dehalogenase que confere resistência ao herbicida.

[451] De um modo preferido, o vetor recombinante é estavelmente incorporado no genoma da célula, tais como a célula vegetal. Assim, o vetor recombinante pode compreender elementos apropriados que permitem que o vetor seja incorporado no genoma, ou em um cromossoma da célula.

Vetores de Expressão

[452] Tal como aqui utilizado, um "vetor expressão" é um vetor DNA que é capaz de transformar uma célula hospedeira e de efetuar a expressão de um ou mais polinucleotídeos especificadas. Os vetores expressão da presente invenção contêm sequências reguladoras, tais como sequências de controle da transcrição, sequências de controle da tradução, origens de replicação e outras sequências reguladoras que são compatíveis com a célula hospedeira e que controlam a expressão de polinucleotídeos da presente invenção. Em particular, os vetores expressão da presente invenção incluem sequências de controle da transcrição. As sequências de controle de transcrição são sequências que controlam a iniciação, alongamento e terminação da transcrição. As sequências de controle da transcrição particularmente importantes são aquelas que controlam a iniciação da transcrição, tais como as sequências promotoras, intensificadoras, operadoras e repressoras. A escolha das sequências reguladoras usadas depende do organismo alvo, tal como uma planta e/ou órgão ou tecido alvo de interesse. Tais sequências reguladoras podem ser obtidas a partir de qualquer organismo eucariota, tal como plantas ou vírus de plantas, ou podem ser quimicamente sintetizadas. Uma série de vetores adequada para a transfecção estável de células vegetais ou para o estabelecimento de plantas transgênicas foi descrita em, por exemplo, Pouwels et al., vetores Clonagem: A Laboratory Manual, 1985, supp. 1987, Weissbach e Weissbach, Methods para Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989, e Gelvin et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990. Tipicamente, os vetores expressão de plantas incluem, por exemplo, um ou mais genes de plantas clonados sob o controle transcricional de 5'e 3', sequências de regulação e um marcador de seleção dominante. Tais vetores expressão de plantas também podem conter uma região reguladora de promotor (por exemplo, uma região reguladora que controla a expressão indutível ou constitutiva, ambientalmente ou regulada pelo desenvolvimento, ou expressão específica de células ou tecidos), um sítio de início de iniciação de transcrição, um sítio de ligação de ribossoma, um sítio de terminação da transcrição e/ou um sinal de poliadenilação.

[453] Uma série de promotores constitutivos que são ativos nas células vegetais foram descritos. Os promotores adequados para a expressão constitutiva em plantas incluem, mas não estão limitados a, o promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV), o vírus do mosaico Figwort (FMV) 35S, o promotor indutível leve da subunidade pequena (SSU) 1,5-bis- fosfato carboxilase, o promotor de triosefosfato isomerase citosólico de arroz, o promotor adenina fosforibosiltransferase de Arabidopsis, o promotor do gene da actina do arroz 1, os promotores da manopina sintase e da octopina sintase, o promotor Adh, o promotor da sacarose sintase, o promotor do complexo do gene R e o promotor α/β do gene da proteína de ligação à clorofila. Estes promotores têm sido utilizados para criar vetores DNA que têm sido expressos em plantas, ver por exemplo, WO 84/02913. Todos estes promotores foram utilizados para criar vários tipos de vetores DNA recombinante expressíveis em plantas.

[454] Para efeitos de expressão em tecidos de origem da planta, tais como a folha, a semente, a raiz ou o caule, é preferido que os promotores utilizados na presente invenção tenham expressão relativamente elevada nestes tecidos específicos. Para este fim, pode-se escolher entre um certo número de promotores para genes com expressão específica de tecido ou célula, ou potencializada. Exemplos de tais promotores relatados na literatura incluem, o promotor de glutamina sintetase GS2 de cloroplasto de ervilha, o promotor de frutose-1,6-bifosfatase de cloroplasto de trigo, o promotor fotossintético ST-LS1 nuclear de batata, o promotor de serina/treonina cinase e o promotor de quinase de glucoamilase (CHS) de Arabidopsis thaliana. Também foram relatados como ativos nos tecidos fotossintéticamente ativos o promotor de ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase do lariço oriental (Larix laricina)o promotor do gene Cab, Cab6, do pinheiro, o promotor do gene Cab-1 do trigo, o promotor do gene Cab-1 do espinafre, o promotor do gene Cab 1R do arroz, o promotor piruvato, ortofosfato dikinase (PPDK) de Zea mays,O promotor para o gene Lhcb1*2 do tabaco, o promotor symporter Arabidopsis thaliana Suc2 sacarose-H30, e o promotor para os genes da proteína de membrana de tilacoide de espinafre (PsaD, PsaF, PsaE, PC, FNR, AtpC, AtpD, Cab, RbcS). Outros promotores para as proteínas de ligação à clorofilaα/β podem também ser utilizados na presente invenção, tais como os promotores para o gene LhcB e o gene PsbP da mostarda branca (Sinapis alba).

[455] Uma variedade de promotores de genes de plantas que são regulados em resposta a sinais ambientais, hormonais, químicos e/ou de desenvolvimento, também podem ser utilizados para a expressão de genes de proteína de ligação de RNA em células vegetaiss, incluindo promotores regulados por (1) calor (2) luz (por exemplo, promotor RbcS-3A de ervilha, promotor RbcS de milho), (3) hormônios, tais como ácido abscísico, (4) ferimento (por exemplo, WunI), ou (5) produtos químicos, tais como jasmonato de metil, ácido salicílico, hormônios esteroides, álcool, Safeners (WO 97/06269), ou pode também ser vantajoso empregar (6) promotores específicos de órgãos.

[456] Tal como aqui utilizado, o termo "promotor específico de órgão de armazenagem de plantas" refere-se a um promotor que preferencialmente, quando comparado com outros tecidos vegetais, dirige a transcrição de genes em um órgão de armazenamento de uma planta. Para efeitos de expressão em tecidos de lavagem da planta, tais como o tubérculo da planta de batata, o fruto de tomate, ou a semente de soja, canola, algodão, Zea mays, trigo, arroz e cevada, é preferível que os promotores utilizados na presente invenção tenham expressão relativamente elevada nestes tecidos específicos. O promotor para ^-conglicinina ou outros promotores específicos da semente, tais como os promotores de napina, zeina, linina e faseolina, podem ser utilizados. Podem também ser utilizados promotores específicos de raiz. Um exemplo de um tal promotor é o promotor para o gene da quitinase ácida. A expressão em tecido de raiz também pode ser conseguida através da utilização de subdomínios de raiz específicos do promotor CaMV 35S que foram identificados.

[457] Em uma modalidade particularmente preferida, o promotor dirige a expressão em tecidos e órgãos em que a biossíntese de lipídeos acontece. Tais promotores podem atuar no desenvolvimento da semente, no momento apropriado para modificar a composição lipídica em sementes. Os promotores preferidos para a expressão específica de sementes incluem: 1) promotores de genes que codificam enzimas envolvidas na biossíntese de lipídeos e acumulação em sementes, tais como dessaturases e alongases, 2) promotores de genes que codificam proteínas de armazenamento da semente, e 3) promotores de genes que codificam enzimas envolvidas na biossíntese e acumulação de carboidratos em sementes. Os promotores específicos da semente que são adequados são, o promotor do gene da napina da colza oleaginosa (US 5 608 152), o promotor USP Vicia faba (Baumlein et al., 1991), o promotor de Arabidopsis oleosina (WO 98/45461), o promotor de Phaseolus vulgaris faseolina (US 5,504,200), o promotor de Brassica Bce4 (WO 91/13980), ou o promotor de legumina B4 (Baumlein et al., 1992), e os promotores que conduzem à expressão específica de sementes em monocotiledêneas, tais como milho, cevada, trigo, centeio, arroz e semelhantes. Promotores notáveis que são adequados são o promotor do gene lpt2 ou Ipt1 da cevada (WO 95/15389 e WO 95/23230), ou os promotores descritos em WO 99/16890 (promotores do gene da hordeína cevada, o gene glutelina de arroz, o gene orizina do arroz, o gene prolamina do arroz, o gene gliadina do trigo, o gene glutelina do trigo, o gene zeína do milho, o gene glutelina da aveia, o gene Kasirina do sorgo, o gene secalina do centeio). Outros promotores incluem os descritos por Broun et al. (1998), Potenza et al. (2004), US 20070192902 e US 20030159173. Em uma modalidade, o promotor específico da semente é preferencialmente expresso em partes definidas da semente, tais como o cotilédone(s) ou o endosperma. Exemplos de promotores específicos de cotilédones, incluem, mas não estão limitados a, o promotor FP1 (Ellerstrom et al., 1996), p promotor legumina da ervilha (Perrin et al., 2000), e o promotor de fito-hemaglutinina do feijão (Perrin et al., 2000). Exemplos de promotores específicos de endosperma incluem, mas não estão limitados a, o promotor de zeína-1 de milho (Chikwamba et al., 2003), o promotor de glutelina-1 de arroz (Yang et al., 2003), o promotor D-hordeína de cevada (Horvath et al., 2000) e promotores de glutenina HMW de trigo (Alvarez et al., 2000). Em uma outra modalidade, o promotor específico de sementes não é expresso, ou só é expresso a um nível baixo, no embrião e/ou depois da germinação de sementes.

[458] Em uma outra modalidade, o promotor específico do órgão de armazenamento de plantas é um promotor específico de frutos. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, promotores de poligalacturonase de tomate, E8 e Pds, assim como o promotor de ACC oxidase de maçã (para revisão, ver Potenza et al., 2004). Em uma modalidade preferida, o promotor dirige preferencialmente a expressão nas partes comestíveis do fruto, por exemplo a medula do fruto, em relação à pele do fruto ou às sementes dentro do fruto.

[459] Em uma modalidade, o promotor indutível é o sistema deAspergillus nidulans. Exemplos de sistemas de expressão indutíveis que podem ser utilizados em vez do sistema de Aspergillus nidulans alc são descritos em uma revisão por Padidam (2003) e Corrado e Karali (2009). Em uma outra modalidade, o promotor indutível é um promotor indutível de proteção, tal como, por exemplo, o promotor de milho ln2-1 ou ln2-2 (Hershey and Stoner, 1991), o promotor indutível de proteção é o promotor de GST-27 de milho (Jepson et al., 1994), ou o promotor de GH2 / 4 de soja (Ulmasov et al., 1995).

[460] Em outra modalidade, o promotor indutível é um promotor indutível por senescência, tal como, por exemplo, o promotor indutível por senescência SAG (gene associado a senescência) 12 e SAG 13 de Arabidopsis (Gan, 1995; Gan and Amasino, 1995) e LSC54 de Brassica napus (Buchanan-Wollaston, 1994). Tais promotores mostram uma expressão aumentada em torno do início da senescência dos tecidos das plantas, em particular das folhas.

[461] Para a expressão em tecido vegetativo podem ser utilizados promotores específicos de folhas, tais como os promotores de ribulose bifosfato carboxilase (RBCS). Por exemplo, a RBCS1 de tomate, e os genes RBCS2, RBCS3A são expressos em folhas e mudas cultivadas à luz (Meier et al., 1997). Os promotores de ribulose bisfosfato carboxilase expressos quase exclusivamente em células de mesofilo em lâminas foliares e em bainhas foliares em níveis elevados, descritos por Matsuoka et al. (1994), podem ser utilizados. Outro promotor específico de folha é o promotor do gene da proteína de ligação da clorofila a/b de colheita leve (ver, Shiina et al., 1997). O promotor de gene relacionado a Arabidopsis thaliana myb (Atmyb5) descrito por Li et al. (1996), é específico de folha. O promotor Atmyb5 é expresso no desenvolvimento de tricomas foliares, estipulações e células epidérmicas nas margens de folhas jovens de roseta e caulina e em sementes imaturas. Um promotor de folha identificado no milho por Busk et al. (1997), também pode ser usado.

[462] Em alguns casos, por exemplo quando LEC2 ou BBM é expresso de forma recombinante, pode ser desejável que o transgene não seja expresso em níveis elevados. Um exemplo de um promotor que pode ser utilizado nestas circunstâncias é um promotor de napina A truncado que retém o padrão de expressão específico da semente, mas com um nível de expressão reduzido (Tan et al. 2011).

[463] A sequência líder não traduzida em 5' pode ser derivada do promotor selecionado para expressar a sequência genética heteróloga do polinucleotídeo da presente invenção, ou pode ser heteróloga em relação à região codificante da enzima a ser produzida e pode ser especificamente modificada se desejado de modo a aumentar a tradução de mRNA. Para uma revisão de otimização de expressão de transgenes, ver Koziel et al. (1996). As regiões não traduzidas em 5' podem também ser obtidas a partir de RNAs virais vegetais (vírus do mosaico do tabaco, vírus do tabaco etch, vírus do mosaico anão do milho, vírus do mosaico da alfafa, entre outros) a partir de genes eucarióticos adequados (genes de clorofila a/b de trigo e milho clorofila), ou a partir de uma sequência genética sintética. A presente invenção não se limita a construções em que a região não traduzida é derivada da sequência 5' não traduzida que acompanha a sequência promotora. A sequência líder também pode ser derivada de um promotor ou sequência de codificação não relacionado. As sequências líderes úteis no contexto da presente invenção compreendem o líder de Hsp70 de milho (US 5.362.865 e US 5.859.347) e o elemento TMV de omega.

[464]A terminação da transcrição é realizada por sequência de DNA não traduzida 3' operativamente ligada no vetor expressão para o polinucleotídeo de interesse. A região 3' não traduzida de uma molécula de DNA recombinante contém um sinal de poliadenilação que funciona em plantas para provocar a adição de nucleotídeos de adenilato à extremidade 3' do RNA. A região 3' não traduzida pode ser obtida a partir de vários genes que são expressos em células vegetais. A região 3' não traduzida da nopalina sintase, a região não traduzida 3' do gene Rubisco da subunidade pequena da ervilha, a região 3' não traduzida do gene da proteína de armazenamento da semente 7S da soja são comummente utilizadas nesta capacidade. As regiões 3' transcritas, não traduzidas contendo o sinal de poliadenilação de genes de plasmídeo indutores de tumores (Ti) de Agrobacterium são também adequadas.

[465]As tecnologias de DNA recombinante podem ser utilizadas para melhorar a expressão de um polinucleotídeo transformado manipulando, por exemplo, a eficiência com que os transcritos resultantes são traduzidos por otimização de códons de acordo com a espécie de célula hospedeira ou a deleção de sequências que desestabilizam transcritos e a eficiência de modificações pós-tradução.

Ácidos nucleicos de transferência

[466] Os ácidos nucleicos de transferência podem ser utilizados para administrar um polinucleotídeo exógeno a uma célula e compreendem uma, de preferência duas, sequências de fronteira e um ou mais polinucleotídeos de interesse. O ácido nucleico de transferência pode ou não pode codificar um marcador de seleção. De preferência, o ácido nucleico de transferência faz parte de um vetor binário em uma bactéria, onde o vetor binário compreende ainda elementos que permitem a replicação do vetor na bactéria, seleção, ou manutenção de células bacterianas que contêm o vetor binário. Após transferência para uma célula eucariótica, o componente de ácido nucleico de transferência do vetor binário é capaz de integração no genoma da célula eucariótica ou, para experiências de expressão transitória, meramente de expressão na célula.

[467] Tal como aqui utilizado, o termo "ácido nucleico extracromossômico de transferência" refere-se a uma molécula de ácido nucleico que é capaz de ser transferida a partir de uma bactéria tal como Agrobacterium sp., para uma célula eucariótica, como uma célula de folha da planta. Um ácido nucleico extracromossômico de transferência é um elemento genético que é bem conhecido como um elemento capaz de ser transferido, com a subsequente integração de uma sequência de nucleotídeo contida dentro das suas fronteiras no genoma da célula receptora. A este respeito, um ácido nucleico de transferência está flanqueado, tipicamente, por duas sequências de "fronteira", embora em alguns casos, uma única fronteira em uma das extremidades pode ser usada e a uma segunda extremidade do ácido nucleico transferido é gerado aleatoriamente no processo de transferência. Um polinucleotídeo de interesse está tipicamente posicionado entre a sequência semelhante a uma fronteira esquerda e a sequência semelhante a uma fronteira direita de um ácido nucleico de transferência. O polinucleotídeo contido dentro do ácido nucleico de transferência pode estar operativamente ligado a uma variedade de diferentes elementos reguladores do promotor e do terminador que facilitam a sua expressão, isto é, a transcrição e/ou a tradução do polinucleotídeo. DNAs de transferência (T-DNAs) de Agrobacterium sp. tais como Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes, e suas variantes/mutantes artificiais são provavelmente os exemplos melhor caracterizados de ácidos nucleicos de transferência. Outro exemplo é o P-DNA ( "DNA de planta"), que compreende sequências semelhantes à fronteira de T-DNA de plantas.

[468] Tal como aqui utilizado, "T-DNA" refere-se a um T- DNA de um plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens ou de um plasmídeo Ri Agrobacterium rhizogenes, ou variantes da mesma que funcionam para transferência de DNA para células vegetaiss. O T-DNA pode compreender um T-DNA inteiro incluindo as sequências de fronteira direita e esquerda, mas necessita apenas compreender as sequências mínimas requeridas em cis para transferência, isto é a sequência de fronteira de T-DNA direita. Os T-DNAs da invenção têm inserido neles, em qualquer lugar entre as sequências de fronteira direita e esquerda (se presentes), o polinucleotídeo de interesse. As sequências que codificam fatores necessários em trans para a transferência do T-DNA para uma célula vegetal, tais como genes vir, podem ser inseridas no T-DNA, ou podem estar presentes no mesmo replicon como o T-DNA, ou de preferência estão em trans em um replicon noAgrobacterium hospedeiro compatível. Tais sistemas de "vetor binário" são bem conhecidos na técnica. Tal como aqui utilizado, "P-DNA" refere-se a um ácido nucleico isolado de transferência a partir de um genoma de planta, ou variantes/mutantes artificias dos mesmos, e compreende em cada extremidade, ou em apenas uma extremidade, uma sequência de T-DNA semelhante à fronteira.

[469] Tal como aqui utilizado, uma sequência de "fronteira" de um ácido nucleico de transferência pode ser isolada a partir de um organismo selecionado, tal como uma planta ou bactéria, ou ser uma variante/mutante artificial da mesma. A sequência de fronteira promove e facilita a transferência do polinucleotídeo ao qual está associada e pode facilitar a sua integração no genoma da célula receptora. Em uma modalidade, uma sequência de fronteira tem entre 10-80 pb de comprimento. As sequências de fronteira de T-DNA de Agrobacterium sp. são bem conhecidas na técnica e incluem os descritos em Lacroix et al. (2008).

[470] Embora tradicionalmente apenas Agrobacterium sp. tenham sido utilizados para transferir genes para células vegetaiss, há agora um grande número de sistemas que foram identificados/desenvolvidos que atuam de um modo semelhante a Agrobacterium sp. Várias espéciesAgrobacterium foram recentemente geneticamente modificadas para serem competentes para a transferência de genes (Chung et al., 2006; Broothaerts et al., 2005). Esses incluem Rhizobium sp. NGR234, Sinorhizobium meliloti e Mezorhizobium loti.

[471]A transferência direta de plasmídeos de expressão eucarióticos de bactérias para hospedeiros eucarióticos foi conseguida, primeiramente, várias décadas atrás pela fusão de células de mamíferos e protoplastos de plasmídeos Escherichia coli (Schaffner, 1980). Desde então, o número de bactérias capazes de distribuir genes em células de mamíferos tem aumentado constantemente (Weiss, 2003), tendo sido ser descoberto por quatro grupos independentemente (Sizemore et al. 1995; Courvalin et al., 1995; Powell et al., 1996; Darji et al., 1997).

[472] Tal como aqui utilizados, os termos "transfecção", "transformação" e variações dos mesmos são geralmente utilizados permutavelmente. As células "transfectadas" ou "transformadas" podem ter sido manipuladas para introduzir o(s) polinucleotídeo(s) de interesse, ou podem ser células descendentes delas derivadas.

Células recombinantes

[473]A invenção também proporciona uma célula recombinante, por exemplo, uma célula vegetal ou uma célula fúngica recombinante, que é uma célula hospedeira transformada com um ou mais polinucleotídeos ou vetores aqui definidos, ou uma combinação dos mesmos. As células adequadas da invenção incluem qualquer célula que pode ser transformada com um polinucleotídeo ou vetor recombinante da invenção, que codifica um RNA, ou polipeptídeo de enzima aqui descrito. A célula é uma célula que é, assim, capaz de ser utilizada para a produção de lipídeos. A célula recombinante pode ser uma célula em cultura, uma célula in vitro, ou em um organismo tal como, por exemplo, uma planta, ou um órgão, tal como, por exemplo, uma semente ou uma folha. De preferência, a célula é de uma planta, mais preferivelmente, na semente de uma planta. Em uma modalidade, a célula recombinante é uma célula não humana.

[474]As células nas quais o(s) polinucleotídeo(s) são introduzidas podem ser ou células não transformadas ou células que já estão transformadas com pelo menos um ácido nucleico do hospedeiro. Tais ácidos nucleicos podem ser relacionados com a síntese de lipídeos, ou não relacionados. As células hospedeiras da presente invenção podem ser ou endogenamente (isto é, naturalmente) capazes de produzir o(s) polipeptídeo(s) aqui definido(s), caso em que a célula recombinante dele derivada tem uma maior capacidade de produzir o(s) polipeptídeo(s), ou podem ser capazes de produzir o(s) referido(s) polipeptídeo(s), apenas depois de terem sido transformadas com pelo menos um polinucleotídeo da invenção. Em uma modalidade, uma célula recombinante da invenção tem uma melhor capacidade de produzir lipídeo não polar, tal como TAG.

[475]As células hospedeiras da presente invenção podem ser qualquer célula capaz de produzir pelo menos uma proteína aqui descrita, e incluem fungos (incluindo levedura), animais, tais como artrópodes, e células vegetaiss, tais como células de algas. Em uma modalidade preferida, a célula vegetal é uma célula de sementes, em especial, uma célula em um cotilédone ou endosperma de uma semente. As células hospedeiras podem ser de um organismo adequado para um processo de fermentação, tais como, por exemplo, Yarrowia lipolytica ou outras leveduras. Em uma modalidade, a célula é uma célula animal. A célula animal pode ser de qualquer tipo de animal, tais como, por exemplo, uma célula de animal não humano, uma célula de vertebrado não humano, uma célula de mamífero não humano, ou células de animais aquáticos, tais como peixes ou crustáceos, invertebrados, insetos, etc. Exemplos de células de algas úteis como células hospedeiras da presente invenção incluem, por exemplo, Chlamydomonas sp. (por exemplo, Chlamydomonas reinhardtii), Dunaliella sp., Haematococcus sp., Chlorella sp., Thraustochytrium sp., Schizochytrium sp., e Volvox sp.

Plantas Transgênicas

[476]A invenção também proporciona uma planta compreendendo um ou mais polinucleotídeos ou polipeptídeos exógenos e uma ou mais modificações genéticas da invenção, uma célula da invenção, um vetor da invenção, ou uma combinação dos mesmos. O termo "planta" quando usado como substantivo refere-se a plantas inteiras, enquanto o termo "parte do mesma" refere-se a órgãos de plantas (por exemplo, folhas, caules, raízes, flores, frutos), células isoladas (por exemplo, pólen), partes de sementes, tais como um embrião, endosperma, scutellum ou tecido de planta tais como tecido vascular, células vegetais e descendentes da mesma. Tal como aqui utilizado, as partes das plantas compreendem células vegetais.

[477] Tal como aqui utilizados, os termos "em uma planta" e "na planta", no contexto de uma modificação da planta significa que a modificação ocorreu em, pelo menos, uma parte da planta, incluindo, sempre que a modificação ocorreu em toda a planta, e não exclui que a alteração ocorre em apenas uma ou mais, mas não todas as partes da planta. Por exemplo, diz-se que um promotor específico do tecido é expresso "em uma planta", embora possa ser expresso apenas em certas partes da planta. Analogamente, "um polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes biossintéticos glicolíticos e/ou de ácidos graxos na planta "significa que o aumento da expressão ocorre em pelo menos uma parte da planta.

[478] Tal como aqui utilizado, o termo "planta" é utilizado no mesmo sentido mais amplo, incluindo qualquer organismo no Reino Plantae. Também inclui algas castanhas e vermelhas, bem como algas verdes. Inclui, mas não está limitado a, qualquer espécie de planta, erva, cultura ou cereal de florescência (por exemplo, oleaginosas, milho, soja), forragem ou de forragem, planta de fruta ou vegetal, planta de erva, planta lenhosa ou árvore. Ele não se destina a limitar uma planta a qualquer estrutura particular. Também se refere a uma planta unicelular (por exemplo, microalga). O termo "parte do mesmo", em referência a uma planta refere- se a uma célula vegetal e a descendência da mesma, uma pluralidade de células vegetais, de uma estrutura que está presente em qualquer fase de desenvolvimento de uma planta, ou em um tecido de planta. Essas estruturas incluem, mas não estão limitados a, folhas, caules, flores, frutos, nozes, sementes, raízes, casca de sementes, embriões. O termo "tecido vegetal" inclui tecidos diferenciados e não diferenciados de plantas incluindo os presentes nas folhas, caules, flores, frutos, nozes, raízes, sementes, por exemplo, tecido embrionário, endosperma, tecido dérmico (por exemplo, epiderme, periderme), tecido vascular (por exemplo, xilema, floema), ou tecido triturado (compreendendo as células parênquimas, colênquimas, e/ou esclerênquimas), bem como em células de cultura (por exemplo, células isoladas, os protoplastos, calos, embriões, etc). O tecido vegetal na planta, em cultura de órgãos, cultura de tecidos ou cultura de células.

[479] Tal como aqui utilizado, o termo "tecido vegetativo" ou "parte vegetativa de planta" é qualquer tecido, órgão ou parte de uma planta que não sejam órgãos para a reprodução sexual de plantas. Os órgãos para a reprodução sexual de plantas são especificamente sementes tendo órgãos, flores, pólen, frutos e sementes. Os tecidos e partes vegetativas incluem, pelo menos, folhas de plantas, caules (incluindo cavilhas e perfilhos, mas excluindo as cabeças), tubérculos e raízes, mas excluindo flores, pólen, sementes incluindo a casca de sementes, embriões e endospermas, frutos incluindo tecidos mesocarpo, vagens e cabeças de semente. Em uma modalidade, a parte vegetativa da planta é uma parte aérea da planta. Em uma outra modalidade, a parte vegetativa da planta é uma parte vegetativa verde, tal como uma folha ou caule.

[480] Uma "planta transgênica" ou variações da mesma refere-se a umaplanta que contém um transgene não encontrado em uma planta de tipo selvagem da mesma espécie, variedade ou cultivar. As plantas transgênicas, tais como definidas no contexto da presente invenção incluem plantas e suas descentes que foram geneticamente modificadas usando técnicas recombinantes, para causar a produção de pelo menos um polipeptídeo aqui definido na planta desejada ou parte da mesma. Partes das plantas transgênicas têm um significado correspondente.

[481] Os termos "semente" e "grão" são aqui utilizados permutavelmente. "Grão" refere-se a grãos maduros, tais como grãos colhidos ou grãos que ainda estão em uma planta, mas prontos para a colheita, mas também pode se referir ao grão após imbibição ou germinação, de acordo com o contexto. O grão maduro geralmente tem um teor de menos do que cerca de 18% de umidade. Em uma modalidade preferida, o teor de umidade do grão é a um nível que é geralmente considerado como seguro para o armazenamento, de preferência entre 5% e 15%, entre 6% e 8%, entre 8% e 10%, ou entre 10% e 15%. "Semente em desenvolvimento", tal como aqui utilizado refere- se a uma semente antes da maturidade, tipicamente encontrada nas estruturas reprodutivas da planta após fertilização ou antese, mas também pode se referir a tais sementes antes da maturidade, que são isoladas a partir de uma planta. O grão maduro geralmente tem um teor de menos do que cerca de 12%.

[482] Tal como aqui utilizado, o termo "órgão de armazenamento da planta" refere-se a uma parte de uma planta especializada para armazenar energia sob a forma de, por exemplo, proteínas, carboidratos, lipídeos. Exemplos de órgãos de armazenamento de plantas são sementes, frutos, raízes tuberosas e tubérculos. Um órgão de armazenamento da planta preferida da invenção é a semente.

[483] Tal como aqui utilizado, o termo "fenotipicamente normal" refere-se a uma planta geneticamente modificada ou parte da mesma, por exemplo, uma planta transgênica, ou um órgão de armazenamento, tal como uma semente, tubérculo, ou os frutos da presente invenção não tendo uma capacidade significativamente reduzida para crescer e reproduzir quando comparado com uma planta não modificada ou parte da mesma. De preferência, a biomassa, taxa de crescimento, taxa de germinação, tamanho do órgão de armazenamento, tamanho da semente e/ou o número de sementes viáveis produzidas não é inferior a 90% da de uma planta que não tem as referidas modificações genéticas ou polinucleotídeos exógenos quando cultivadas em condições idênticas. Este termo não abrange características da planta que podem ser diferentes da planta de tipo selvagem, mas que não afetam a utilidade da planta para fins comerciais, tal como, por exemplo, um fenótipo de bailarina de folhas de mudas. Em uma modalidade, a planta geneticamente modificada ou parte da mesma que é fenotipicamente normal compreende um polinucleotídeo recombinante que codifica um supressor de silenciamento operativamente ligado a um promotor específico para um órgão de armazenamento da planta e tem uma capacidade de crescer ou reproduzir que é essencialmente a mesma como uma planta correspondente ou parte da mesma não compreendendo o referido polinucleotídeo.

[484] Tal como aqui utilizado, o termo "começo da floração" ou "início da floração" no que diz respeito a uma planta refere-se ao tempo que a primeira flor na planta abre, ou o tempo de início da antese.

[485] Tal como aqui utilizado, o termo "conjunto de sementes" com respeito a uma planta de suporte de sementes refere-se ao momento em que a primeira semente da planta atinge a maturidade. Isto é tipicamente observável pela cor da semente ou pelo seu teor de umidade, bem conhecido na técnica.

[486] Tal como aqui utilizado, o termo "senescência" no que diz respeito a uma planta inteira refere-se à fase final de desenvolvimento da planta que se segue à conclusão de crescimento, geralmente após a planta atingir a biomassa ou altura aérea máxima. A senescência começa quando a biomassa vegetal aérea atinge o seu máximo e começa a diminuir em quantidade e, geralmente, termina com a morte da maior parte dos tecidos vegetais. É nessa fase que a planta mobiliza e recicla componentes celulares de folhas e outras partes que se acumulam durante o crescimento para outras partes para completar seu desenvolvimento reprodutivo. A senescência é um processo complexo, que envolve a expressão regulada nova ou aumentada de genes de alguns genes. Muitas vezes, algumas partes da planta estão senescendo enquanto outras partes da mesma planta continuam a crescer. Portanto, com relação a uma folha da planta ou outro órgão verde, o termo "senescência", tal como aqui utilizado refere-se ao tempo em que a quantidade de clorofila na folha ou órgão começa a diminuir. A senescência está associada tipicamente com dessecação da folha ou de órgãos, principalmente na última fase da senescência. A senescência é geralmente observável pela mudança na cor da folha do verde para o amarelo e, eventualmente, marrom quando totalmente desidratada. Acredita-se que a senescência celular subjaz à senescência de plantas e órgãos.

[487]As plantas fornecidas ou contempladas para utilização na prática da presente invenção incluem tanto monocotiledôneas como dicotiledôneas. Em modalidades preferidas, as plantas da presente invenção são plantas de cultura (por exemplo, cereais e leguminosas, milho, trigo, batata, arroz, sorgo, painço, cevada, mandioca) ou leguminosas, como soja, feijão ou ervilha. As plantas podem ser cultivadas para a produção de comestíveis raízes, tubérculos, caules, folhas, flores ou frutos. As plantas podem ser plantas hortícolas cujas partes vegetativas são utilizados como alimento. As plantas da presente invenção podem ser: Acrocomia aculeata (palmeira macaúba), Arabidopsis thaliana, Aracinis hypogaea (amendoim), Astrocaryum murumuru (murumuru), Astrocaryum vulgare (tucumã), Attalea geraensis (Indaiá-rateiro), Attalea humilis (Palma de óleo americana), Attalea oleifera (andaiá), Attalea phalerata (uricuri), Attalea speciosa (babaçu), Avena sativa (aveia), Beta vulgaris (beterraba), Brassica sp. tais como Brassica carinata, Brassica juncea, Brassica napobrassica, Brassica napus (canola), Camelina sativa (linho falso), Cannabis sativa (cânhamo), Carthamus tinctorius (cártamo), Caryocar brasiliense (pequi), Cocos nucifera (coco), Crambe abyssinica (Couve abissiniana), Cucumis melo (melão), Elaeis guineensis (Palmeira africana), Glycine max (soja), Gossypium hirsutum (algodão), Helianthus sp. tais como Helianthus annuus (girassol), Hordeum vulgare (cevada), Jatropha curcas (nóz física), Joannesia princeps (árvore de nós de arar), Lemna sp. (lentilha) tais como Lemna aequinoctialis, Lemna disperma, Lemna ecuadoriensis, Lemna gibba (lentilha de água inchada), Lemna japonica, Lemna minor, Lemna minuta, Lemna obscura, Lemna paucicostata, Lemna perpusilla, Lemna tenera, Lemna trisulca, Lemna turionifera, Lemna valdiviana, Lemna yungensis, Licania rigida (oiticica), Linum usitatissimum (linho), Lupinus angustifolius (tremoço), Mauritia flexuosa (palmeira de buruti), Maximiliana maripa (palmeira de inaja), Miscanthus sp. tais como Miscanthus x giganteus e Miscanthus sinensis, Nicotiana sp. (tabaco) tais como Nicotiana tabacum ou Nicotiana benthamiana, Oenocarpus bacaba (bacaba-do- azeite), Oenocarpus bataua (patauã), Oenocarpus distichus (bacaba-de-leque), Oryza sp. (arroz) tais como Oryza sativa e Oryza glaberrima, Panicum virgatum (painço amarelo), Paraqueiba paraensis (mari), Persea amencana (abacate), Pongamia pinnata (faia indiana), Populus trichocarpa, Ricinus communis (castor), Saccharum sp. (cana-de-açucar), Sesamum indicum (sésamo), Solanum tuberosum (batata), Sorghum sp. tais como Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, Theobroma grandiforum (cupuaçu), Trifolium sp., Trithrinax brasiliensis (Palmeira de agulha brasileira), Triticum sp. (trigo) tais como Triticum aestivum, Zea mays (milho), alfalfa (Medicago sativa), centeio (Secale cerale), batata doce (Lopmoea batatus), madioca (Manihot esculenta), café (Cofea spp.), abacaxi (Anana comosus), árvore de citrinos (Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao), chá (Camellia senensis), banana (Musa spp.), abacate (Persea americana), figo (Ficus casica), goiaba (Psidium guajava), manga (Mangifer indica), oliva (Olea europaea), mamão (Carica papaya), caju (Anacardium occidentale), macadâmia (Macadamia intergrifolia) e amêndoa (Prunus amygdalus).

[488] Outras plantas preferidas incluem gramas C4, tais como, além das mencionadas acima, Andropogon gerardi, Bouteloua curtipendula, B. gracilis, Buchloe dactyloides, Schizachyrium scoparium, Sorghastrum nutans, Sporobolus cryptandrus; gramas C3, tais como Elymus canadensis, os legumes Lespedeza capitata e Petalostemum villosum, o forb Aster azureus; e plantas lenhosas, tais como Quercus ellipsoidalis e Q. macrocarpa. Outras plantas preferidas incluem gramas C3.

[489] Em uma modalidade preferida, a planta é uma angiosperma.

[490] Em uma modalidade, a planta é uma planta de semente oleaginosa, de preferência, uma planta oleaginosa. Tal como aqui utilizado, uma "planta de sementes oleaginosas" é uma espécie de planta usada na produção comercial de lipídeos a partir das sementes da planta. A planta de sementes oleaginosas pode ser, por exemplo, colza (por exemplo, canola), milho, girassol, açafroa, soja, sorgo, linho (linhagensça) ou de beterraba. Além disso, a planta de sementes oleaginosas pode ser outras Brassicas, algodão, amendoim, papoula, rutabaga, mostarda, mamona, gergelim, cártamo, Jatropha curcas ou plantas produtoras de nozes. A planta pode produzir altos níveis de lipídeos em seu fruto como o azeite, óleo de palma ou de coco. Plantas hortícolas às quais a presente invenção pode ser aplicada são alface, endívia, ou vegetais Brassicas incluindo repolho, brócolis ou couve-flor. A presente invenção pode ser aplicada em tabaco, cucurbitáceas, cenoura, morango, tomate ou pimenta.

[491] Em uma modalidade preferida, a planta transgênica é homozigótica para cada gene que foi introduzido (transgene), de modo que a sua descendência não se segrega para o fenótipo desejado. A planta transgênica pode também ser heterozigótica para o(s) transgene(s) introduzidos, de preferência uniformemente heterozigóticos para o transgene, como, por exemplo, na descendência de F1 que foram cultivados a partir de sementes híbridas. Tais plantas podem fornecer vantagens, tais como o vigor híbrido, bem conhecidos na técnica. Transformação de plantas

[492]As plantas transgênicas podem ser produzidas usando técnicas conhecidas na técnica, tais como as geralmente descritas em Slater et al., Plant Biotechnology - The Genetic Manipulation of Plants, Oxford University Press (2003), e Christou and Klee, Handbook of Plant Biotechnology, John Wiley e Sons (2004).

[493] Tal como aqui utilizados, os termos "transformação estável", "estavelmente transformada" e variações dos mesmos referem-se à integração do polinucleotídeo no genoma da célula de tal modo que são transferidos para células descendentes durante a divisão celular sem a necessidade de selecionar positivamente sua presença. Os transformantes estáveis, ou seus descendentes, podem ser identificados por quaisquer meios conhecidos na técnica, tais como Southern blot em DNA cromossômico, ou hibridização in situ hybridization de DNA genômico, permitindo sua seleção.

[494]A transferência mediada por Agrobacteriumé um sistema amplamente aplicável para introduzir genes em células vegetais porque o DNA pode ser introduzido em células em tecidos de plantas inteiras, órgãos de plantas ou explantes em cultura de tecidos, quer para expressão transitória, quer para integração estável do DNA no genoma da célula vegetal. Por exemplo, métodos de imersão floral (in planta) podem ser usados. O uso de vetores integração de planta mediada por Agrobacteriumpara introduzir DNA em células vegetais é bem conhecido na técnica. A região do DNA a ser transferido é definido pelas sequências de fronteira, e o DNA interveniente (T-DNA) é geralmente inserido no genoma da planta. É o método de escolha devido à natureza fácil e definida da transferência de genes.

[495]Métodos de aceleração que podem ser utilizados incluem, por exemplo, bombardeamento com microprojéteis e outros semelhantes. Um exemplo de um método para a entrega de moléculas de ácido nucleico transformador de células vegetais é o bombardeamento de microprojéteis. Este método foi revisto por Yang et al., Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, Oxford Press, Oxford, Inglaterra (1994). Partículas não biológicas (microprojéteis) que podem ser revestidos com ácidos nucleicos e distribuídos em células, por exemplo, de embriões imaturos, por uma força propulsora. Exemplos de partículas incluem os composto de tungstênio, ouro, platina, e outros semelhantes.

[496] Em um outro método, plastídeos podem ser transformados de forma estável. Métodos divulgados para a transformação de plastídeos em plantas superiores incluem a distribuição por pistola de partículas de DNA contendo um marcador selecionável e direcionamento do DNA para o genoma de plastídeos através de recombinação homóloga (US 5 451 513, US 5 545 818, US 5 877 402, US 5 932 479 e WO 99/05265). Outros métodos de transformação de células também podem ser usados e incluem, mas não estão limitados à introdução de DNA em plantas por transferência direta de DNA para pólen, por injeção direta de DNA em órgãos reprodutores de uma planta, ou por injeção direta de DNA para dentro das células de embriões imaturos seguida de reidratação de embriões a dessecados.

[497]A regeneração, o desenvolvimento e o cultivo de plantas a partir de transformantes de protoplasto de uma única planta ou de vários explantes transformados é bem conhecido na técnica (Weissbach et al. In: Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, San Diego, Calif., (1988)). Este processo de regeneração e crescimento tipicamente inclui as etapas de seleção de células transformadas, cultivando aquelas células individualizadas através dos estágios habituais de desenvolvimento embrionário através da fase de muda enraizada. Embriões transgênicos e sementes são regenerados de forma semelhante. Os brotos transgênicos enraizados resultantes são depois plantados em um meio de crescimento de plantas adequado tal como o solo.

[498] O desenvolvimento ou a regeneração de plantas contendo o gene estranho, exógeno é bem conhecido na técnica. De preferência, as plantas regeneradas são autopolinizadas para fornecer plantas transgênicas homozigóticas. Caso contrário, o pólen obtido das plantas regeneradas é cruzado para plantas cultivadas em sementes de linhagens agronomicamente importantes. Inversamente, o pólen das plantas destas linhagens importantes é usado para polinizar plantas regeneradas. Uma planta transgênica da presente invenção contendo um polinucleotídeo desejado é cultivada usando métodos bem conhecidos de um versado na técnica.

[499] Para confirmar a presença dos transgenes nas células e plantas transgênicas, uma reação em cadeia da polimerase (PCR) ou análise de Southern blot pode ser efetuada usando métodos conhecidos dos versados na técnica. Os produtos de expressão dos transgenes podem ser detectados em qualquer uma de uma variedade de modos, dependendo da natureza do produto, e incluem hibridação Northern blot, Western blot e ensaio enzimático. Uma vez que as plantas transgênicas tenham sido obtidas, elas podem ser cultivadas para produzir tecidos ou partes de plantas que possuem o fenótipo desejado. O tecido vegetal ou as partes da planta podem ser colhidos e/ou a semente coletada. A semente pode servir como fonte para o crescimento de plantas adicionais com tecidos ou partes possuindo as características desejadas. De preferência, as partes vegetativas da planta são colhidas em um momento em que o rendimento de lipídeos não polares está no seu nível mais elevado. Em uma modalidade, as partes vegetativas são colhidas no momento da floração, ou após a floração ter iniciado. Preferencialmente, as partes da planta são colhidas aproximadamente no momento em que começa a senescência, habitualmente indicada por amarelecimento e secagem das folhas.

[500]As plantas trasngênicas formadas usando Agrobacterium ou outros métodos de transformação tipicamente contêm um único locus genético em um cromossoma. Tais plantas transgênicas podem ser referidas como sendo hemizigóticas para o(s) gene(s) adicionado(s). Mais preferida é uma planta transgênica que é homozigótica para o(s) gene(s) adicionado(s), isto é, uma planta transêénica que contém dois genes adicionados, um gene no mesmo locus em cada cromossoma do par de cromossomas. Uma planta transgênica homozigótica pode ser obtida por autofertilização de uma planta transgênica hemizigótica, germinando algumas das sementes produzidas e analisando as plantas resultantes para o gene de interesse.

[501] Também deve ser entendido que duas plantas transgênicas diferentes que contêm dois genes exógenos ou loci segregando independentemente ou também podem ser cruzados (acoplados) para produzir descendência que contêm ambos os conjuntos de genes ou loci. A autofecundação da descendente F1 adequada pode produzir plantas que são homozigotos para os dois genes exógenos adicionados. O retrocruzamento em uma planta progenitora e o cruzamento com uma planta não transgênica são contemplados também, assim como a propagação vegetativa. Da mesma forma, uma planta transgênica pode ser cruzada com uma segunda planta que compreende uma modificação genética, tal como um gene mutante e descendente contendo tanto o transgene quanto a modificação genética identificados. Descrições de outros métodos de criação de animais que são normalmente utilizados para diferentes traços e culturas podem ser encontradas em Fehr, Em: Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison Wis. (1987).

TILLING

[502] Em uma modalidade, TILLING (Genomas IN de Lesões Locais Induzidas por Ddirecionamento) podem ser utilizados para produzir plantas nas quais os genes endógenos compreendem uma mutação, por exemplo, genes que codificam um polipeptídeo SDP1 ou TGD, GPAT plastidial, LPAAT plastidial, fosfatase fosfatídica (PAP) ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos. Em uma primeira etapa, induzem-se mutações introduzidas tais como novas alterações de pares de bases simples em uma população de plantas tratando sementes (ou pólen) com um agente mutagênico químico e depois fazendo avançar plantas para uma geração em que as mutações serão herdadas de forma estável. O DNA é extraído, e as sementes são armazenadas de todos os membros da população para criar um recurso que pode ser acessado repetidamente ao longo do tempo. Para um ensaio de TILLING, métodos heteroduplex usando endonucleases específicas podem ser usados para detectar polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs). Alternativamente, a Sequenciação de Próxima Geração de DNA a partir de pools de plantas mutagenizadas pode ser utilizada para identificar mutantes no gene de escolha. Tipicamente, uma frequência de mutação de um mutante por 1000 plantas na população mutagenizada é alcançado. usando esta abordagem, podem ser rastreados muitos milhares de plantas para identificar qualquer indivíduo com uma única alteração de base bem como pequenas inserções ou deleções (1-30 pb) em qualquer gene ou região específica do genoma. TILLING é ainda descrito em Slade e Knauf (2005), e Henikoff et al. 2004).

[503]Além de permitir a eficiente detecção de mutações, a tecnologia TILLING de elevado rendimento é ideal para a detecção de polimorfismos naturais. Por conseguinte, a interrogação de um DNA homólogo desconhecido por heteroduplexação para uma sequência conhecida revela o número e a posição dos locais polimórficos. Ambas as alterações de nucleotídeos e pequenas inserções e deleções são identificados, incluindo, pelo menos, alguns números repetidos de polimorfismos. Isto tem sido chamado de Ecotilling (Comai et al., 2004). Edição de genoma usando nucleases de sítio específico

[504]A edição de genoma utiliza nucleases engenheiradas, tais como endonucleases de DNA guiadas por RNA ou nucleases compostas de domínios de ligação de DNA específicos de sequência fundidas a um módulo de clivagem de DNA não específico. Estas nucleases engenheiradas permitem modificações genéticas eficientes e precisas, induzindo pausas de cadeia dupla de DNA direcionadas que estimulam os mecanismos endógenos de reparação de DNA celular da célula para reparar a quebra induzida. Tais mecanismos incluem, por exemplo, junção de extremidades não homólogas propensas a erros (NHEJ) e reparação dirigida por homologia (HDR).

[505]Na presença de plasmídeo doador com braços de homologia prolongados, o HDR pode conduzir à introdução de transgenes únicos ou múltiplos para corrigir ou substituir genes existentes. Na ausência de plasmídeo doador, o reparo mediado por NHEJ produz pequenas mutações de inserção ou deleção do alvo que causam a ruptura do gene.

[506]As nucleases de engenharia úteis nos métodos da presente invenção incluem nucleases de dedo de zinco (ZFN), nucleases efetoras de tipo ativador de transcrição (TAL) (TALEN) e nucleases do tipo CRISPR/Cas9.

[507] Tipicamente, os genes codificados por nuclease são administrados em células por DNA plasmídico, vetores virais ou mRNA transcritos in vitro.

[508] Uma nuclease de dedo de zinco (ZFN) compreende um domínio de ligação a DNA e um domínio de clivagem de DNA, em que o domínio de ligação de DNA é compreendido de pelo menos um dedo de zinco e está operativamente ligado a um domínio de clivagem de DNA. O domínio de ligação de DNA de dedo de zinco está na extremidade N-terminal da proteína e o domínio de clivagem de DNA situa-se no C-terminal da referida proteína.

[509] Uma ZFN deve ter, pelo menos, um dedo de zinco. Em uma modalidade preferida, uma ZFN teria pelo menos três dedos de zinco, a fim de ter uma especificidade suficiente para ser útil para a recombinação genética direcionada em uma célula ou organismo hospedeiro. Tipicamente, uma ZFN com mais de três dedos de zinco teria uma especificidade progressivamente maior com cada dedo de zinco adicional.

[510] O domínio de dedo de zinco pode ser derivado a partir de qualquer classe ou tipo de dedo de zinco. Em uma modalidade particular, o domínio de dedo de zinco compreende os tipos de dedo de zinco cis2His2 que é muito geralmente representada, por exemplo, através da transcrição TFIIIA de dedo de zinco ou fatores de Sp1. Em uma modalidade preferida, o domínio de dedo de zinco compreende três tipos de dedos de zinco Cis2His2. O reconhecimento de DNA e/ou a especificidade de ligação de uma ZFN podem ser alterados de modo a realizar a recombinação genética direcionada em qualquer local escolhido no DNA celular. Tal modificação pode ser realizada usando técnicas de biologia molecular e/ou de síntese química conhecidas. (Ver, por exemplo, Bibikova et al., 2002).

[511] O domínio de clivagem de DNA de ZFN é derivado de uma classe de domínios de clivagem de DNA não específicos, por exemplo, o domínio de clivagem de DNA de uma enzima de restrição de Tipo II tal como FokI (Kim et al., 1996). Outras endonucleases úteis podem incluir, por exemplo, HhaI, HindIII, Nod, BbvCI, EcoRI, BglI, e AlwI.

[512] Uma nuclease efetora de tipo ativador de transcrição (TAL) (TALEN) compreende um domínio de ligação de DNA efetor de TAL e um domínio de endonuclease.

[513] Os efetores de TAL são proteínas de bactérias patogênicas de plantas que são injetadas pelo patógeno na célula vegetal, onde viajam para o núcleo e funcionam como fatores de transcrição para ativar genes de plantas específicos. A sequência de aminoácidos primária de um efetor de TAL determina a sequência de nucleotídeos para a qual se liga. Deste modo, os sítios alvo podem ser previstos para os efetores de TAL, e os efetores de TAL podem ser manipulados e gerados com o objetivo de se ligar a sequências de nucleotídeos particulares.

[514]As sequências de ácido nucleico que codificam o efetor de TAL estão fundidas com sequências que codificam uma nuclease ou uma porção de uma nuclease, tipicamente um domínio de clivagem não específico de uma endonuclease de restrição de tipo II, tal como FokI (Kim et al., 1996). Outras endonucleases úteis podem incluir, por exemplo, HhaI, HindIII, Nod, BbvCI, EcoRI, BglI, e AlwI. O fato de algumas endonucleases (por exemplo, FokI) funcionarem apenas como dímeros podem ser aproveitados para melhorar a especificidade alvo do efetor de TAL. Por exemplo, em alguns casos, cada monômero FokI pode ser fundido a uma sequência efetora de TAL que reconhece uma sequência alvo de DNA diferente e apenas quando os dois sítios de reconhecimento estão próximos, os monômeros inativos se juntam para criar uma enzima funcional. Ao exigir a ligação do DNA para ativar a nuclease, pode-se criar uma enzima de restrição altamente de sítio específico.

[515] Uma TALEN de sequência específica pode reconhecer uma sequência particular dentro de uma sequência de nucleotídeos alvo pré-selecionada presente em uma célula. Assim, em algumas modalidades, uma sequência de nucleotídeos alvo pode ser digitalizada por sítios de reconhecimento da nuclease e uma nuclease específica pode ser selecionada com base na sequência alvo. Em outros casos, uma TALEN pode ser manipulada para atingir uma sequência celular particular. Edição de genoma usando endonucleases de DNA guiadas por RNA programáveis

[516] Diferente das nucleases de sítio específico descritas acima, o sistema agregado regulatório de repetições palindrômicas curtas interecaladas (CRISPR)/Cas fornece uma alternativa às ZFN e TALENs para induzir alterações genéticas alvo, por clivagem de DNA guiada por RNA.

[517] Os sistemas CRISPR dependem de CRISPR de RNA (crRNA) e no transativação de RNA quimérico (tracrRNA) para a clivagem específica da sequência de DNA. Existem três tipos de sistemas CRISPR/Cas: em sistemas de tipo II, Cas9 serve como uma endonuclease de DNA guiada por RNA que cliva o DNA através do reconhecimento alvo de CRRNA-tracrRNA. As bases de CRISPR de RNA pareiam-se com tracrRNA para formar uma estrutura de dois RNA que guia a endonuclease Cas9 para sítios de DNA complementares para clivagem.

[518] O sistema CRISPR pode ser portátil para plantar células por codistribuição de plasmídeos que expressam a Cas endonuclease e os componentes de crRNA necessários. A endonuclease Cas pode ser convertida em uma nickase para fornecer controle adicional sobre o mecanismo de reparação do DNA (Cong et al., 2013).

[519] Os CRISPRs são tipicamente sequências curtas parcialmente palindrômicas de 24-40 pb contendo repetições internas e terminais invertidas de até 11 pb. Embora tenham sido detectados elementos isolados, eles são geralmente dispostos em agrupamentos (até cerca de 20 ou mais por genoma) de unidades repetidas espaçadas por sequências únicas de 20 a 58 pb. Os CRISPRs são geralmente homogêneos dentro de um dado genoma, sendo a maior parte deles idênticos. No entanto, há exemplos de heterogeneidade em, por exemplo, the Archaea (Mojica et al., 2000).

Biomassa vegetal

[520] Um aumento no teor total de lipídeos da biomassa vegetal equivale a um maior teor energético, tornando sua utilização como alimento ou forragem ou na produção de biocombustível mais econômica.

[521] Os principais componentes de ocorrência natural de biomassa vegetal são carboidratos (aproximadamente, 75%, em peso seco) e lignina (aproximadamente 25%), o qual pode variar com o tipo de planta. Os carboidratos são principalmente celulose ou fibras de hemicelulose, que conferem força à estrutura da planta, e lignina, que mantém as fibras juntas. A biomassa vegetal tem tipicamente uma densidade de energia baixa como resultado de sua forma física e teor de umidade. Isto também faz com que seja inconveniente e ineficiente para o armazenamento e transporte, sem algum tipo de pré-processamento. Há uma grande variedade de processos disponíveis para convertê-la em uma forma mais conveniente, incluindo: 1) pré-processamento físico (por exemplo, moagem) ou 2) conversão por processos térmicos (por exemplo, combustão, gaseificação, pirólise) ou químicos (por exemplo, digestão anaeróbica, fermentação, compostagem, transesterificação). Deste modo, a biomassa é convertida no que pode ser descrito como um combustível de biomassa.

Combustão

[522]A combustão é o processo pelo qual materiais inflamáveis estão autorizados a queimar na presença de ar ou de oxigênio com liberação de calor. O processo básico é a oxidação. A combustão é o método mais simples, através da qual a biomassa pode ser utilizada para produzir energia, e tem sido usado para fornecer calor. Este calor em si pode ser usado em uma série de maneiras: 1) aquecimento de espaço, 2) aquecimento de água (ou de outro fluido) para aquecimento central ou distrital ou calor de processo, 3) levantamento de vapor para geração de eletricidade ou força motriz. Quando o material combustível inflamável é uma forma de biomassa a oxidação é predominantemente do carbono (C) e hidrogênio (H) na celulose, hemicelulose, lignina, e outras moléculas presentes para formar dióxido de carbono (CO2) e água (H2O). As plantas da presente invenção fornecem um melhor combustível para a combustão por virtude do aumento do teor de lipídeos. Gaseificação

[523]A gaseificação é um processo de oxidação parcial em que uma fonte de carbono, tal como a biomassa vegetal, é dividida em monóxido de carbono (CO) e hidrogênio (H2), além de dióxido de carbono (CO2) e, possivelmente, moléculas de hidrocarboneto, tais como metano (CH4). Se a gaseificação acontecer a uma temperatura relativamente baixa, tal como 700°C a 1000°C, o gás do produto terá um nível relativamente elevado de hidrocarbonetos em comparação com a gaseificação de temperatura elevada. Como resultado, pode ser utilizado diretamente, para ser queimado para geração de calor ou eletricidade através de uma turbina a vapor ou, com depuração de gás adequada, para fazer funcionar um motor de combustão interna para a produção de eletricidade. A câmara de combustão para uma caldeira simples pode ser acoplada próxima do gaseificador, ou o gás produtor pode ser depurado de hidrocarbonetos de cadeia mais longa (alcatrões), transportado, armazenado e queimado remotamente. Um sistema de gaseificação pode ser estreitamente integrado com uma turbina a gás de ciclo combinado para geração de eletricidade (IGCC - ciclo combinado de gaseificação integrada). A maior gaseificação da temperatura (1200°C a 1600°C) leva a poucos hidrocarbonetos no gás produto, e uma maior proporção de CO e H2. Isto é conhecido como gás de síntese (syngas ou biosyngas) uma vez que pode ser utilizado para sintetizar hidrocarbonetos de cadeia mais longa usando técnicas, tais como síntese de Fischer-Tropsch (FT). Se a razão de H2 para CO está correta (2:1), a síntese de FT pode ser utilizada para converter o gás de síntese em biocombustível diesel sintético de alta qualidade que é compatível com os motores a diesel fóssil e diesel convencionais. Pirólise

[524] Tal como aqui utilizado, o termo "pirólise" significa um processo que utiliza o aquecimento lento na ausência de oxigênio para produzir gases, produtos de óleo e carvão animal a partir da biomassa. A pirólise é uma conversão térmica ou termoquímica de materiais à base de lipídeos, particularmente à base de triglicerídeos. Os produtos da pirólise incluem gás, líquido e um carvão animal vendido, com as proporções de cada um dependendo dos parâmetros do processo. As temperaturas mais baixas (cerca de 400°C) tendem a produzir carvão mais sólido (pirólise lenta), enquanto que temperaturas um pouco mais elevadas (cerca de 500°C) produzem uma proporção muito maior de líquido (bio- óleo), desde que o tempo de permanência do vapor seja reduzido a cerca de 1s ou menos. Temperaturas de cerca de 275oC até cerca de 375oC podem ser usadas para produzir o bio-óleo líquido tendo uma maior proporção de hidrocarbonetos de cadeia mais longa. A pirólise térmica direta envolve craqueamento dos lipídeos ou uma combinação de craqueamento térmico e catalítica. A temperaturas de cerca de 400-500oC, o craqueamento ocorre, a produção de hidrocarbonetos de cadeia curta, tais como alcanos, alcenos, alcadienos, aromáticos, olefinas e ácido carboxílico, bem como o monóxido de carbono e dióxido de carbono.

[525] Quatro tipos de catalisadores principais podem ser utilizados, incluindo os catalisadores de metal de transição, catalisadores do tipo de crivo molecular, alumina ativada e carbonato de sódio (Maher et al., 2007). São dados exemplos em US 4.102.938. A alumina (Al2O3) ativada por ácido é um catalisador eficaz (US 5.233.109). Catalisadores de crivo molecular são estruturas porosas, altamente cristalinas que exibem seletividade, de modo que as moléculas de apenas determinados tamanhos podem passar através. Estes incluem catalisadores de zeólitos, tais como o ZSM-5 ou HZSM-5 que são materiais cristalinos que compreendem AlO4 e SiO4 e outros catalisadores de sílica-alumina. A atividade e seletividade destes catalisadores dependem da acidez, do tamanho dos poros e da forma dos poros, e tipicamente operam a 300-500oC. Os catalisadores de metais de transição são descritos, por exemplo, em US 4.992.605. O catalisador de carbonato de sódio foi usado na pirólise de óleos (e Dandik Aksoy, 1998).

[526] Tal como aqui utilizado, "tratamento hidrotérmico", "HTP", também referido como "despolimerização térmica" é uma forma de pirólise que reage a matéria derivada de planta, especificamente o material contendo carbono na matéria de origem vegetal, com hidrogênio para produzir um produto de bio-óleo composto predominantemente por hidrocarbonetos parafínicos, juntamente com outros gases e sólidos. Uma vantagem significativa de HTP é que o material vegetativo da planta não precisa de ser seco antes de formar a composição para a reação de conversão, embora o material vegetativo da planta possa ser previamente seco para auxiliar no transporte ou no armazenamento da biomassa. A biomassa pode ser usada diretamente como colhida a partir do campo. O reator é qualquer vaso que possa suportar a alta temperatura e pressão usadas e é resistente à corrosão. O solvente utilizado no HTP inclui água ou é inteiramente de água, ou pode incluir alguns compostos dehidrocarbonetos na forma de um óleo. Geralmente, o solvente em HTP não tem álcoois adicionados. A reação de conversão pode ocorrer em um ambiente oxidativo, redutor ou inerte. "Oxidativo", tal como aqui utilizado, significa, na presença de ar, "redutor" significa na presença de um agente redutor, tipicamente gás de hidrogênio ou metano, por exemplo 10-15% H2 com o restante do gás sendo N2e "inerte" significa na presença de um gás inerte tal como nitrogênio ou árgon. A reação de conversão é realizada de preferência sob condições redutoras. Os materiais que contêm carbono que são convertidos incluem celulose, hemicelulose, lignina e proteínas, bem como lipídeos. O processo utiliza uma temperatura de conversão de entre 270oC e 400oC e uma pressão de entre 70 e 350 bar, tipicamente 300oC a 350oC e uma pressão entre 100-170bar. Como resultado do processo, os vapores orgânicos, gases de pirólise e carvão vegetal são produzidos. Os vapores orgânicos são condensados para produzir o bio-óleo. A recuperação do bio-óleo pode ser conseguida por arrefecimento do reator e reduzindo a pressão até à pressão atmosférica, o que permite que as fases de bio- óleo (orgânico) e de água se desenvolvam e o bio-óleo seja removido do reator.

[527] O rendimento do bio-óleo recuperado é calculado como uma percentagem do peso seco da biomassa de entrada em uma base de peso seco. Ele é calculado de acordo com a fórmula: peso do bio-óleo x 100/peso seco das partes vegetativas da planta. O peso do bio-óleo não inclui o peso de qualquer água ou sólidos que possam estar presentes em uma mistura de bio-óleo, os quais são facilmente removidos por filtração ou outros métodos conhecidos.

[528] O bio-óleo pode em seguida ser separado em frações por meio de destilação fracionada, com ou sem processos de refinação adicional. Normalmente, as frações que condensam a estas temperaturas são denominadas: cerca de 370oC, óleo combustível; cerca de 300oC, óleo diesel; cerca de 200oC, querosene; cerca de 150oC, gasolina (óleo). Frações mais pesadas podem ser quebradas em frações leves, mais desejáveis, bem conhecidas na técnica. O combustível diesel é tipicamente constituído por compostos de hidrocarbonetos C13-C22.

[529] Tal como é aqui utilizado, "diesel de óleo" (petrodiesel) significa um combustível diesel produzido a partir de combustível fóssil e que cai dentro das especificações descritas pela ASTM D975 nos Estados Unidos e pela EN 590 na Europa. O termo "diesel renovável", tal como aqui utilizado, significa um combustível diesel derivado de biomassa viva recentemente (não combustível fóssil) que satisfaz as normas da ASTM D975 e não são ésteres monoalquílicos. As características típicas do diesel renovável são: número de cetano de 75-90, densidade de energia de cerca de 44 MJ/kg, densidade de cerca de 0,78 g/ml, teor de energia de cerca de 123 K BTU/gal, níveis de enxofre inferiores a 10 ppm, ponto de nebulização abaixo 0oC.

Transesterificação

[530] "Transesterificação", tal como aqui utilizado, é a conversão de lipídeos, principalmente triacilgliceróis, em ésteres metílicos de ácidos graxos ou ésteres de etil por reação com álcoois de cadeia curta, tais como metanol ou etanol, na presença de um catalisador tal como ácido ou alcalino. O metanol é usado mais geralmente devido ao baixo custo e disponibilidade, mas o etanol, propanol ou butanol ou misturas dos álcoois podem também ser utilizados. Os catalisadores podem ser catalisadores homogêneos, catalisadores heterogêneos ou catalisadores enzimáticos. Catalisadores homogêneos incluem sulfato férrico seguido de KOH. Catalisadores heterogêneos incluem CaO, K3PO4e WO3/ ZrO2. Catalisadores enzimáticos incluem Novozyme 435 produzido a partir de Candida antarctica.

[531]A transesterificação pode ser realizada em óleo extraído, ou de preferência diretamente in situ no material vegetativo da planta. As partes vegetativas da planta podem ser secas e moídas antes de serem usadas para preparar a composição para a reação de conversão, mas não há necessidade. A vantagem da conversão direta em ésteres de ácidos graxos, de preferência FAME, é que a conversão pode utilizar temperaturas e pressões mais baixas e ainda fornecer bons rendimentos do produto, por exemplo, compreendendo pelo menos 50% de FAME em peso. O rendimento de bio-óleo recuperado por transesterificação é calculado como para o processo de HTP. Produção de lipídeos não polares

[532]As técnicas que são rotineiramente praticadas na técnica podem ser utilizadas para extrair, processar, purificar e analisar os lipídeos tais como o TAG produzido por células, organismos ou partes do mesmo da presente invenção. Tais técnicas são descritas e explicadas em toda a literatura em fontes tais como, Fereidoon Shahidi, Current Protocols in Food Analytical Chemistry, John Wiley & Sons, Inc. (2001) D1.1.1-D1.1.11, e Perez-Vich et al. (1998). Produção de óleo a partir de partes vegetativas da planta ou sementes

[533] Tipicamente, as sementes de plantas são cozidas, prensadas e/ou extraídas para produzir óleo de semente bruto, que é então desgomado, refinado, branqueado e desodorizado. Geralmente, as técnicas para esmagar sementes são conhecidas na técnica. Por exemplo, as sementes oleaginosas podem ser temperadas por pulverização com água para aumentar o teor de umidade de, por exemplo, 8,5%, e em flocos usando um rolo liso com um ajuste de abertura de 0,23 a 0,27 mm. Dependendo do tipo de semente, a água não pode ser adicionada antes do esmagamento. A aplicação de calor inibe as enzimas, facilita ainda mais a rotura da célula, aglutina as gotículas lipídicas, e aglomera partículas de proteína, os quais facilitam o processo de extração.

[534] Em uma modalidade, a maior parte do óleo de semente é liberado através da passagem por uma prensa de parafuso. Os bolos expelidos da prensa de parafuso são então extraídos com solvente, por exemplo, com hexano, usando uma coluna traçada a quente. Alternativamente, o óleo de semente bruto produzido pela operação de prensagem pode ser passado através de um tanque de sedimentação com um topo de drenagem de fio ranhurado para remover os sólidos que são expressos com o óleo de semente durante a operação de prensagem. O óleo de semente clarificado pode ser passado através de um filtro de placa e moldura para remover quaisquer partículas sólidas finas remanescentes. Se desejado, o óleo de semente recuperado do processo de extração pode ser combinado com o óleo de semente clarificado para produzir um óleo de semente bruto misturado.

[535] Uma vez que o solvente é removido a partir do óleo de semente bruto, as porções pressionadas e extraídas são combinadas e submetidas a procedimentos de processamento lipídico normal (ou seja, degomagem, refinação cáustica, branqueamento e desodorização).

[536]A extração do lipídeo a partir de partes vegetativas da planta da invenção usa métodos análogos aos conhecidos na técnica para a extração de óleo de semente. Uma maneira é a extração física, que muitas vezes não usa extração de solvente. A extração de bagaço pressionado é um tipo comum, como são a prensa de parafuso e métodos de extração de imprensa de ram. A extração mecânica é tipicamente menos eficiente do que a extração com solvente onde um solvente orgânico (por exemplo, hexano) é misturado com pelo menos a biomassa vegetal, de preferência após a biomassa ser seca e moída. O solvente dissolve o lipídeo na biomassa, a qual é então separada da biomassa por ação mecânica (por exemplo, com os processos de prensagem acima). Esta etapa de separação pode também ser realizada por filtração (por exemplo, com uma prensa de filtro ou dispositivo semelhante) ou centrifugação, etc. O solvente orgânico pode então ser separado do lipídeo não polar (por exemplo, por destilação). Esta segunda etapa de separação origina o lipídeo não polar da planta e pode produzir um solvente reutilizável se se empregar a recuperação de vapor convencional. Em uma modalidade, o teor de óleo e/ou proteína da parte da planta ou semente é analisado por espectroscopia de reflectância no infravermelho próximo como descrito em Hom et al. (2007) antes da extração.

[537] Se as partes vegetativas da planta não forem utilizadas imediatamente para extrair o lipídeo, são de preferência processadas para assegurar que o teor de lipídeo seja minimizado tanto quanto possível (ver, por exemplo, Christie, 1993), tal como por secagem das partes vegetativas da planta.

Degomagem

[538]A degomagem é uma etapa inicial na refinação de óleos e seu principal objetivo é a remoção da maioria dos fosfolipídeos do óleo, que pode estar presentes como aproximadamente 1-2% do total de lipídeos extraídos. A adição de ~ 2% de água, tipicamente contendo ácido fosfórico, a 70-80°C ao óleo bruto resulta na separação da maior parte dos fosfolipídeos acompanhados por metais vestigiais e pigmentos. O material insolúvel que é removido é principalmente uma mistura de fosfolipídeos e triacilgliceróis e também é conhecido como lecitina. Adegomagem pode ser realizada por adição de ácido fosfórico concentrado ao óleo de semente bruto para converter fosfatidos não hidratáveis em uma forma hidratável, e para quelar metais menores que estão presentes. A goma é separada do óleo de semente por centrifugação. O óleo de semente pode ser refinado por adição de uma quantidade suficiente de uma solução de hidróxido de sódio para titular todos os ácidos graxos e remover os sabões assim formados.

Refinação alcalina

[539]A refinação alcalina é um dos processos de refinação para o tratamento do óleo bruto, por vezes também referida como neutralização. Ele geralmente segue degomagem e precede o branqueamento. Após degomagem, o óleo de semente pode ser tratado pela adição de uma quantidade suficiente de uma solução alcalina para titular todos os ácidos graxos e ácidos fosfóricos, e remoção dos sabões assim formados. Materiais alcalinos adequados incluem hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, carbonato de sódio, hidróxido de lítio, hidróxido de cálcio, carbonato de cálcio e hidróxido de amônio. Este processo é tipicamente realizado à temperatura ambiente e remove a fração de ácido graxo livre. O sabão é removido por centrifugação ou por extração em um solvente para o sabão, e o óleo neutralizado é lavado com água. Se necessário, qualquer excesso de álcali no óleo pode ser neutralizado com um ácido adequado, tal como ácido clorídrico ou ácido sulfúrico.

Branqueamento

[540] O branqueamento é um processo de refinação no qual os óleos são aquecidos a 90-120°C durante 10-30 minutos na presença de uma terra de branqueamento (0,2-2,0%) e na ausência de oxigênio, operando com nitrogênio ou vapor ou em um vácuo. Esta etapa no processamento de óleo é projetada para remover pigmentos indesejados (carotenoides, clorofila, gossipol etc), e o processo também remove produtos de oxidação, metais vestigiais, compostos de enxofre e vestígios de sabão.

Desodorização

[541]A desodorização é um tratamento de óleos e gorduras a uma temperatura elevada (200-260°C) e à baixa pressão (0,11 mm de Hg). Isto é normalmente conseguido através da introdução de vapor no óleo de semente a uma taxa de cerca de 0,1 ml/minuto/100 ml de óleo de semente. A desodorização pode ser realizada aquecendo o óleo de semente a 260°C sob vácuo e introduzindo lentamente vapor no óleo de semente a uma taxa de cerca de 0,1 ml/minuto/100 ml de óleo de semente. Após cerca de 30 minutos de aspersão, deixa-se resfriar o óleo de sementes sob vácuo. O óleo de semente é normalmente transferido para um recipiente de vidro e lavada com árgon antes de ser armazenado sob refrigeração. Se a quantidade de óleo de semente é limitada, o óleo de semente pode ser colocado sob vácuo, por exemplo, em um reator Parr e aquecido a 260°C durante o mesmo período de tempo que teria sido desodorizado. Este tratamento melhora a cor do óleo de semente e remove a maioria das substâncias voláteis ou compostos odoríferos, incluindo quaisquer ácidos graxos remanescentes livres, monoacilgliceróis e produtos de oxidação.

Desmargarinação

[542]A desmargarinação é um processo às vezes usado na produção comercial de óleos para a separação de óleos e gorduras em sólido (estearina) e líquido (oleína) por frações de cristalização a temperaturas subambientes. Aplicou-se originalmente ao óleo de semente de algodão para produzir um produto isento de sólidos. É tipicamente usado para diminuir o teor de ácido graxo saturado de óleos.

Algas para a produção de lipídeos

[543]As algas podem produzir de 10 a 100 vezes mais massa que as plantas terrestres em um ano e podem ser cultivadas em lagoas abertas (como lagoas e lagos tipo canal) ou em fotobiorreatores. As algas produtoras de óleo mais comuns podem geralmente incluir as diatomáceas (Bacilariófitas), algas verdes (clorófitas), algas azul- esverdeadas (cianófitas), e algas marrom-douradas (crisófitas). Além disso, pode ser utilizado um quinto grupo conhecido como haptófita. Os grupos incluem algas marrons e heterocontos. Os exemplos não limitativos específicos de algas incluem as classes: Chlorophyceae, Eustigmatophyceae, Prymnesiophyceae, Bacillariophyceae. Bacillariophytes capazes de produção de óleo incluem os gêneros Amphipleura, Amphora, Chaetoceros, Cyclotella, Cymbella, Fragilaria, Hantzschia, Navicula, Nitzschia, Phaeodactylum e Thalassiosira. Os exemplos específicos não limitativos de clorofíceas capazes de produção de óleo incluem Ankistrodesmus, Botryococcus, Chlorella, Chlorococcum, Dunaliella, Monoraphidium, Oocystis, Scenedesmus e Tetraselmis. Em um aspecto, os clorófitas podem ser Chlorella ou Dunaliella. Os exemplos específicos não limitativos de cianófitas capazes de produção de óleo incluem Oscillatoria e Synechococcus. Um exemplo específico de crisófitas capazes de produção de óleo inclui Boekelovia. Os exemplos específicos não limitativos de haptófita incluem Isochysis e Pleurochysis.

[544]As algas específicas úteis na presente invenção incluem, por exemplo, Chlamydomonas sp. tais como Chlamydomonas reinhardtii, Dunaliella sp. tais como Dunaliella salina, Dunaliella tertiolecta, D. acidophila, D. Lateralis. D.martima. D. parva, D. polmorpha, D. primolecta, D. pseudosalina, D. quartolecta. D. viridis, Haematococcus sp., Chlorella sp. tais como Chlorella vulgaris, Chlorella sorokiniana ou Chlorella protothecoides, Thraustochytrium sp., Schizochytrium sp., Volvox sp, Nannochloropsis sp., Botryococcus braunii que pode conter mais de 60% em peso de lipídeos, Phaeodactylum tricornutum, Thalassiosira pseudonana, Isochrysis sp., Pavlova sp., Chlorococcum sp, Ellipsoidion sp., Neochloris sp., Scenedesmus sp.

[545]As algas da invenção podem ser colhidas usando microtelas, por centrifugação, por floculação (usando, por exemplo, quitosano, alúmen e cloreto férrico) e por flotação com espuma. A interrupção do fornecimento de dióxido de carbono pode fazer com que as algas floculem por si própria, o que é chamado de "autofloculação". Na flotação com espuma, o cultivador areja a água em uma espuma, e, em seguida, desliza sobre as algas a partir do topo. O ultrassom e outros métodos de colheita estão atualmente em desenvolvimento.

[546] O lipídeo pode ser extraído das algas por esmagamento mecânico. Quando a massa de algas é seca, retém o seu conteúdo lipídico, que pode então ser "pressionado" para fora com uma prensa de óleo. O choque osmótico pode também ser utilizado para liberar componentes celulares tais como lipídeos de algas, e a extração por ultrassom pode acelerar processos de extração. Solventes químicos (por exemplo, hexano, benzeno, éter de óleo) são frequentemente utilizados na extração de lipídeos de algas. A extração enzimática usando enzimas para degradar as paredes celulares também pode ser usada para extrair lipídeos de algas. O supercrítico CO2 também pode ser usado como um solvente. Neste método, o CO2 é liquefeito sob pressão e aquecido até ao ponto que se torna supercrítico (tendo propriedades de um líquido e um gás), permitindo-lhe atuar como um solvente.

[547] Tal como aqui utilizado, um "organismo oleaginoso" é um que acumula, pelo menos, 20% do seu peso seco na forma de triglicerídeos. Tal como aqui utilizado, "levedura" inclui Saccharomyces spp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlbergensis, Candida spp., Kluveromyces spp., Pichia spp., Hansenula spp., Trichoderma spp., Lipomyces starkey, e Yarrowia lipolytica. Leveduras preferidas incluem Yarrowia lipolytica ou outras leveduras oleaginosas e cepas de Saccharomyces spp. Usos de lipídeos de plantas

[548] Os lipídeos produzidos pelos métodos descritos têm uma variedade de usos. Em algumas modalidades, os lipídeos são utilizadas como óleos alimentares. Em outras modalidade, os lipídeos são refinados e utilizados como lubrificantes ou para outros usos industriais, tais como a síntese de plásticos. Em algumas modalidades preferidas, os lipídeos são refinados para produzir o biodiesel. O biodiesel pode ser feito a partir de óleos derivados de plantas, algas e fungos da invenção. Uso de triacilgliceróis de plantas para a produção de biocombustíveis é revisto em Durrett et al. (2008). O combustível resultante é geralmente referido como biodiesel e tem um intervalo de viscosidade dinâmica de 1,9 a 6,0 mm2s-1 (ASTM D6751). O bioálcool pode ser produzido a partir da fermentação de açúcares ou da biomassa que não seja lipídeo deixado após a extração lipídica. Os métodos gerais para a produção de biocombustíveis podem ser encontrados em, por exemplo, Maher e Bressler (2007), Greenwel et al. (2010), Karmakar et al. (2010), Alonso et al. (2010), Liu et al. (2010a). Gong and Jiang (2011), Endalew et al. (2011) and Semwal et al. (2011).

[549]A presente invenção fornece métodos para o aumento do teor de óleo nos tecidos vegetativos. As plantas da presente invenção têm aumentado o conteúdo energético de folhas e/ou talos de tal modo que acima do solo todas as partes de plantas acima do solo podem ser colhidas e usadas para produzir biocombustível. Além disso, o nível de ácido oleico é aumentado de forma significativa, enquanto o ácido linoleico poli-insaturado de ácido graxo alfa (ALA) foi reduzido. As plantas, algas e fungos da presente invenção reduzem assim os custos de produção dos biocombustíveis.

Biodiesel

[550]A produção de biodiesel, ou ésteres de alquil, é bem conhecida. Há três rotas básicas para produção de éster de lipídeos: 1) Transesterificação catalisada por bases do lipídeo com álcool; 2) Esterificação catalisada por ácido direto do lipídeo com metanol; e 3) Conversão do lipídeo em ácidos graxos, e depois em ésteres alquílicos com catálise ácida. Pode ser utilizado qualquer método para a preparação de ésteres alquílicos de ácidos graxos e éteres glicerílicos (nos quais um, dois ou três dos grupos hidroxi em glicerol são eterificados). Por exemplo, os ácidos graxos podem ser preparados, por exemplo, por hidrólise ou saponificação de TAG com catalisadores ácidos ou básicos, respectivamente, ou usando uma enzima, tal como uma lipase ou uma esterase. Ésteres alquílicos de ácidos graxos podem ser preparados por reação de um ácido graxo com um álcool na presença de um catalisador ácido. Ésteres alquílicos de ácidos graxos também podem ser preparados por reação de etiqueta com um álcool na presença de um catalisador ácido ou base. Éteres de glicerol podem ser preparados, por exemplo, por reação de glicerol com um halogeneto de alquil na presença de uma base, ou com uma olefina ou álcool na presença de um catalisador ácido. Os ésteres de alquil pode ser diretamente misturados com combustível para motores diesel, ou lavados com água ou outras soluções aquosas para remover várias impurezas, incluindo os catalisadores, antes da mistura.

Combustível para aviação

[551] Para melhorar o desempenho dos biocombustíveis, desenvolveram-se tecnologias térmicas e catalíticas de quebra de ligação química (craqueamento) que permitem a conversão de bio-óleos em alternativas baseadas em biocombustíveis para o combustível diesel derivado do óleo e outros combustíveis, como o combustível para aviões.

[552]A utilização de uma fonte de ácidos graxos de cadeia média, tais como os produzidos por uma célula eucariótica recombinante da invenção, um organismo não humano transgênico ou uma parte da mesma da invenção, uma planta transgênica ou parte da mesma da invenção, uma semente da invenção, ou uma célula transgênica ou planta transgênica ou parte da mesma da invenção, exclui a necessidade de craqueamento de cadeia de ácidos graxos de alta energia para alcançar as moléculas mais curtas necessárias para combustíveis de jato e outros combustíveis com requisitos de fluxo de baixa temperatura. Este método compreende a clivagem de um ou mais grupos de ácidos graxos de cadeia média a partir dos glicerídeos para formar glicerol e um ou mais ácidos graxos livres. Além disso, o método compreende a separação de um ou mais ácidos graxos de cadeia média a partir do glicerol, e descarboxilação de um ou mais ácidos graxos de cadeia média, para formar um ou mais hidrocarbonetos para a produção do combustível para aviões.

Alimentos para animais

[553]A presente invenção inclui composições que podem ser utilizadas como alimentos. Para fins da presente invenção, "alimentos para animais" incluem qualquer alimento ou preparação para consumo humano ou animal e que sirva para alimentar ou construir tecidos ou fornecer energia e/ou manter, restaurar ou apoiar p estado nutricional adequado ou a função metabólica. Os alimentos da presente invenção incluem composições nutricionais para bebês e/ou crianças pequenas.

[554] Os alimentos da presente invenção compreendem, por exemplo, uma célula da invenção, uma planta da presente invenção, a parte da planta da invenção, as sementes da invenção, um extrato da invenção, o produto de um método da invenção ou uma composição juntamente com um veículo(s) adequado(s). O termo "carreador" é utilizado no seu sentido mais amplo para abranger qualquer componente que pode ou não ter valor nutricional. Como o versado na técnica irá apreciar, o veículo deve ser adequado para utilização (ou usado em uma concentração suficientemente baixa) em um alimento, de tal modo que ele não tem efeito prejudicial no organismo que consome o ingrediente.

[555] O ingrediente da presente invenção compreende um lipídeo produzido diretamente ou indiretamente através da utilização dos métodos, das células ou organismos aqui divulgados. A composição pode estar na forma sólida ou líquida. Além disso, a composição pode incluir macronutrientes comestíveis, vitaminas e/ou minerais em quantidades desejadas para uma utilização particular. As quantidades destes ingredientes variarão dependendo se a composição se destina a utilização com indivíduos normais ou é para ser utilizada com indivíduos que tenham necessidades especializadas, tais como indivíduos que sofrem de distúrbios metabólicos e semelhantes.

[556] Exemplos de carreadores adequados, com valor nutricional incluem, mas não estão limitados a, macronutrientes tais como gorduras comestíveis, carboidratos e proteínas. Exemplos de tais gorduras comestíveis incluem, mas não estão limitados a, óleo de coco, óleo de borragem, óleo fúngico, óleo de corrente escura, óleo de soja e mono- e di-glicerídeos. Exemplos de tais carboidratos incluem, mas não se limitam a, glicose, lactose comestível e amido hidrolisado. Adicionalmente, exemplos de proteínas que podem ser utilizadas na composição nutricional da invenção incluem, mas não estão limitados a, proteínas de soja, soro eletrodialisado, leite desnatado eletrodialisado, soro de leite ou os hidrolisados destas proteínas.

[557] Com relação às vitaminas e minerais, os seguintes podem ser adicionados às composições de alimentos para animais da presente invenção, o cálcio, fósforo, potássio, sódio, cloreto, magnésio, manganês, ferro, cobre, zinco, selênio, iodo e vitaminas A, E, D, C e o complexo B. Outras dessas vitaminas e minerais também podem ser adicionados.

[558] Uma composição de ração da presente invenção pode também ser adicionada ao alimento mesmo quando não é necessária a suplementação da dieta. Por exemplo, a composição pode ser adicionada a alimentos de qualquer tipo, incluindo, mas não se limitando a, margarina, manteiga, queijos, leite, iogurte, chocolate, doces, aperitivos, óleos para saladas, óleos de cozinha, gorduras de cozinha, carnes, peixe e bebidas.

[559]Adicionalmente, o lipídeo produzido de acordo com a presente invenção ou as células hospedeiras transformadas para conter e expressar os genes sujeitos podem também ser utilizados como suplementos alimentares para animais para alterar a composição de um tecido animal ou de ácido graxo de leite a um mais desejável para consumo humano ou animal. Exemplos de tais animais incluem gado, ovelhas, cavalos e semelhantes. Além disso, alimentos da invenção podem ser usados em aquicultura para aumentar os níveis de ácidos graxos de peixes para consumo humano ou animal.

[560] Os alimentos para animais preferidos da invenção são as plantas, sementes e outras partes de plantas, tais como folhas, frutos e caules que podem ser usados diretamente como alimento humano ou animal para seres humanos ou outros animais. Por exemplo, os animais podem pastar diretamente em tais plantas cultivadas no campo, ou serem alimentados com quantidades mais medidas em alimentação controlada. A invenção inclui a utilização de tais plantas e partes de plantas como alimento para aumentar os níveis de ácidos graxos poli-insaturados em seres humanos e outros animais.

[561] Para o consumo por animais não humanos, o alimento pode estar em qualquer forma adequada para, tal como, mas não se limitar a, silagem, feno ou pastagem crescendo em um campo. Em uma modalidade, o alimento para consumo não humano é uma planta leguminosa, ou parte da mesma, que é um membro da família Fabaceae (or Leguminosae) tais como alfalfa, trevo, ervilhas,luzerna, feijões, lentinhas, tremoços, mesquite, alfarrobeira, soja, e amendoins.

Composições

[562]A presente invenção também engloba composições farmacêuticas, particularmente composições, compreendendo um ou mais lipídeos produzidos usando os métodos da invenção.

[563] Uma composição farmacêutica pode compreender um ou mais dos lipídeos, em combinação com um carreador, adjuvante ou veículo farmaceuticamente aceitável, padrão, bem conhecido, não tóxico, tal como solução salina tamponada com fosfato, água, etanol, polióis, óleos vegetais, um agente umectante ou uma emulsão, tal como uma emulsão água/óleo. A composição pode estar em uma forma líquida ou sólida. Por exemplo, a composição pode estar na forma de um comprimido, cápsula, líquido ingerível, em pó, pomada ou creme tópico. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersões e pelo uso de tensoativos. Também pode ser desejável incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, cloreto de sódio e afins. Além de tais diluentes inertes, as composições também podem incluir adjuvantes tais como agentes umectantes, agentes emulsificantes e de suspensão, edulcorantes, flavorizantes, e agentes aromatizantes.

[564] Uma dosagem típica de um ácido graxo particular é de 0,1 mg a 20 g, tomados de uma a cinco vezes por dia (de até 100 g por dia) e é de preferência na intervalo de desde cerca de 10 mg a cerca de 1, 2, 5, ou 10 g por dia (administrado em uma ou várias doses). Como é conhecido na técnica, um mínimo de cerca de 300 mg/dia de ácido graxo, de ácidos graxos poli-insaturados especialmente, é desejável. No entanto, será apreciado que qualquer quantidade de ácido graxo será benéfica ao sujeito.

[565] Possíveis vias de administração das composições farmacêuticas da presente invenção incluem, por exemplo, entérica ou parentérica. Por exemplo, uma preparação líquida pode ser administrada por via oral. Além disso, uma mistura homogênea pode ser completamente dispersa em água, misturado sob condições estéreis com diluentes fisiologicamente aceitáveis, conservantes, tampões ou propulsores para formar um spray ou inalante.

[566] A dosagem da composição a ser administrada ao sujeito pode ser determinada por um versado comum na técnica e depende de vários fatores, tais como peso, idade, saúde geral, histórico passado, estado imunológico, etc., do sujeito.

[567]Além disso, as composições da presente invenção podem ser utilizadas para fins cosméticos. As composições podem ser adicionados a composições cosméticas preexistentes, de tal modo que uma mistura é formada, ou um ácido graxo produzido de acordo com a invenção pode ser utilizado como o único ingrediente "ativo" em uma composição cosmética.

Polipeptídeos

[568] Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são geralmente usados aqui permutavelmente.

[569] Um polipeptídeo ou classe de polipeptídeo pode ser definido pela extensão de identidade (% de identidade) da sua sequência de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos de referência, ou por ter uma maior% de identidade com uma sequência de aminoácidos de referência do que para outra. A% de identidade de um polipeptídeo para uma sequência de aminoácidos de referência é tipicamente determinada por análise GAP (Needleman e Wunsch, 1970; programa GCG) com parâmetros de uma penalidade de criação de gap = 5 e uma penalidade de extensão de gap = 0,3. A sequência de consulta tem pelo menos 100 aminoácidos de comprimento e a análise de GAP alinhagens as duas sequências em uma região de pelo menos 100 aminoácidos. Ainda mais preferencialmente, a sequência de consulta tem pelo menos 250 aminoácidos de comprimento e a análise de GAP alinhagens as duas sequências sobre uma região de pelo menos 250 aminoácidos. Ainda mais preferencialmente, a análise de GAP alinhagens duas sequência ao longo de todo o seu comprimento. O polipeptídeo ou classe de polipéptidos podem ter a mesma atividade enzimática como, ou uma atividade diferente, ou não têm a atividade do polipeptídeo de referência. De preferência, o polipeptídeo tem uma atividade enzimática de pelo menos 10% da atividade do polipeptídeo de referência.

[570] Como aqui utilizado, um "fragmento biologicamente ativo" é uma porção de um polipeptídeo da invenção que mantém uma atividade definida de um polipeptídeo de referência de comprimento completo, por exemplo, atividade de MGAT. Os fragmentos biologicamente ativos como aqui utilizado excluem o polipeptídoe de comprimento completo. Os fragmentos biologicamente ativos podem ser de qualquer porção de tamanho, desde que mantenham a atividade definida. De preferência, o fragmento biologicamente ativo mantém pelo menos 10% da atividade do polipeptídeo de comprimento completo.

[571]No que diz respeito a um polipeptídeo ou uma enzima definida, faz-se observar que a % de identidade de valores mais elevados do que os aqui fornecidos irá abranger modalidades preferidas. Assim, quando aplicável, à luz das percentagens de identidade de% mínima, é preferido que o polipeptídeo/enzima compreenda uma sequência de aminoácidos que seja pelo menos 60%, mais preferencialmente pelo menos 65%, mais preferencialmente pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, mais preferencialmente pelo menos 93%, mais preferencialmente pelo menos 94%, mais preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 96%, mais preferencialmente pelo menos 97%, mais preferencialmente pelo menos 98%, mais preferencialmente pelo menos 99%, mais preferencialmente pelo menos 99,1%, mais preferencialmente pelo menos 99,2%, mais preferencialmente pelo menos 99,3%, mais preferencialmente pelo menos 99,4%, mais preferencialmente pelo menos 99,5%, mais preferencialmente pelo menos 99,6%, mais preferencialmente pelo menos 99,7%, mais preferencialmente pelo menos 99,8%, e ainda mais preferencialmente pelo menos 99,9% idêntica à SEQ ID NO. nominada relevante.

[572] Os mutantes de sequência de aminoácidos dos polipeptídeos aqui definidos podem ser preparados por introdução de alterações de nucleotídeos apropriados em um ácido nucleico aqui definido, ou por síntesein vitro do polipeptídeo desejado. Tais mutantes incluem, por exemplo, deleções, inserções ou substituições de resíduos dentro da sequência de aminoácidos. Uma combinação de deleções, inserções e substituições pode ser feita para chegar ao constructo final, desde que o produto de polipeptídeo final possua as características desejadas.

[573] Os polipeptídeos mutantes (alterados) podem ser preparados usando qualquer técnica conhecida na técnica, por exemplo, usando evolução dirigida ou estratégias de concepção regional (ver abaixo). Os produtos derivados de DNA mutado/alterado podem ser rapidamente rastreados usando as técnicas aqui descritas para determinar se possuem atividade de fator de transcrição, ácido graxo aciltransferase ou atividades de OBC.

[574]Na concepção de mutantes de sequência de aminoácidos, a localização do sítio de mutação e a natureza da mutação dependerão da(s) característica(s) a ser modificada. Os sítios de mutação podem ser modificados individualmente ou em série, por exemplo, (1) substituição primeiro por escolhas de aminoácidos conservadoras e depois com mais seleções de radicais dependendo dos resultados obtidos, (2) eliminando o resíduo alvo, ou (3) inserindo outros resíduos adjacentes ao sítio localizado.

[575]As deleções de sequência de aminoácidos variam geralmente de cerca de 1 a 15 resíduos, mais preferencialmente cerca de 1 a 10 resíduos e tipicamente cerca de 1 a 5 resíduos contíguos.

[576] Os mutantes de substituição de, pelo menos, um resíduo de aminoácido no polipeptídeo removido e um resíduo diferente inserido no seu lugar. Os sítios de maior interesse para mutagênese substitutiva para inativar enzimas incluem sítios identificados como o(s) sítio(s) ativo(s). Outros sítios de interesse são aqueles em que os resíduos particulares obtidos de várias cepas ou espécies são idênticos. Estas posições podem ser importantes para a atividade biológica. Estes locais, especialmente aqueles que estão dentro de uma sequência de pelo menos três outros sítios conservados de forma idêntica, são preferencialmente substituídos de uma forma relativamente conservadora. As substituições conservadoras são mostradas na Tabela 1 sob o título de "substituições exemplificativas". Tabela 1. Substituições exemplificativas.

[577] Em uma modalidade preferida, um polipeptídeo mutante/variante tem apenas, ou não mais do que, um ou dois ou três ou quatro alterações conservadoras de aminoácidos quando comparado a um polipeptídeo que ocorre naturalmente. Detalhes de alterações conservadoras de aminoácidos são apresentadas na Tabela 1. Como o versado na técnica estaria ciente, tais pequenas alterações podem ser razoavelmente previstas para não alterar a atividade do polipeptídeo, quando expressa em uma célula recombinante. Os mutantes com a atividade desejada podem ser modificados usando procedimentos correntes na técnica, tal como efetuando mutagênese aleatória, mutagênese direcionada ou mutagênese de saturação em genes conhecidos de interesse, ou submetendo genes diferentes ao embaralhamento de DNA. EXEMPLOS Exemplo 1. Materiais e Métodos Gerais Expressão de genes em células vegetais em um sistema de expressão transiente

[578] Os genes foram expressos em células vegetais usando um sistema de expressão transiente, essencialmente como descrito por Voinnet et al. (2003) and Wood et al. (2009). Vetores binários contendo a região de codificação a ser expressa por um promotor e35S constitutivo forte contendo uma região potenciadora duplicada foram introduzidos na cepa de Agrobacterium tumefaciens AGL1. Um vetor binário quimérico, 35S:p19, para expressão do supressor de silenciamento viral p19 foi introduzido separadamente em AGL1, como descrito em WO2010/057246. Um vetor binário quimérico, 35S:V2, para expressão do supressor de silenciamento viral V2 foi introduzido separadamente em AGL1. As células recombinantes foram cultivadas até à fase estacionária a 28°C em caldo LB suplementado com 50 mg/L de canamicina e 50 mg/L de rifampicina. As bactérias foram então sedimentadas por centrifugação a 5000 g durante 5 min à temperatura ambiente antes de serem ressuspensas para OD600 = 1,0 em um tampão de infiltração contendo 10 mM MES pH 5.7, 10 mM MgCl2 e 100 uM de acetosiringona. As células foram então incubadas a 28°C com agitação por três horas, após, foi medido o OD600 e foi necessário um volume de cada cultura, incluindo o constructo supressor viral 35S: p19 ou 35S: V2, necessária para atingir uma concentração final de OD600 = 0,125 adicionada a um tubo fresco. O volume final foi feito com o tampão anterior. As folhas foram então infiltradas com a mistura de cultura e as plantas foram tipicamente cultivadas durante mais três a cinco dias após a infiltração antes dos discos das folhas serem recuperados quer para a preparação de lisado celular purificado quer para o isolamento total de lipídeos. Transformação de Brassica napus

[579] Sementes de Brassica napus foram esterilizadas usando cloro gasoso, tal como descrito por Kereszt et al. (2007) e germinadas em meio de cultura de tecidos. Pecíolos cotiledonares com 2-4 mm de talo foram isolados como descrito por Belide et al. (2013) e utilizados como explantes. A. tumefaciens AGL1 (Lazo et al., 1991) culturas contendo o vetor binário foram preparados e pecíolos cotiledonares inoculados com as culturas como descrito por Belide et al. (2013). Pecíolos cotiledonares infectados foram cultivados em meio MS suplementado com 1 mg/L de TDZ + 0,1 mg/L de NAA + 3 mg/L de AgNO3 + 250 mg/L de cefotaxima, 50 mg/L de timentina e 25 mg/L de canamicina e cultivados durante 4 semanas a 24°C, com 16 h/8 h de fotoperíodo de luz/escuro com uma subcultura a cada duas semanas para o mesmo meio. Explantes com calos verdes foram transferidos para disparar o meio de iniciação (MS+1 mg/L de cinetina + 3 mg/L AgNO3 +250 mg/L de cefotaxima + 50 mg/L de timentina + 25 mg/L de canamicina) e cultivados durante mais 2-3 semanas. Pequenos brotos (~1 cm) foram isolados a partir do calo resistente e transferidos para disparar o meio de alongamento (meio MS com 0,1 mg/L de ácido giberélico + 3 mg/L de AgNO3 + 250 mg/L de cefotaxima + 25 mg/L de canamicina) e cultivadas durante mais duas semanas. Brotos saudáveis com uma ou duas folhas, foram selecionados e transferidos para o meio de enraizamento (1/2 MS com 1 mg/L de NAA + 20 mg/L de ADS + 3 mg/L de AgNO3 + 250 mg/L de cefotaxima) e cultivadas durante 2-3 semanas. O DNA foi isolado a partir de folhas pequenas de brotos resistentes usando o kit de isolamento de DNA vegetal (Bioline, Alexandria, NSW, Austrália) como descrito pelo protocolo do fabricante. A presença de sequências de T-DNA foi testada por amplificação de PCR em DNA genômico. Brotos transgênicos com raízes foram transferidos para vasos contendo mistura de crescimento de mudas e cultivados em estufa a 24oC dia/16oC noite (condições padrão). Lisado de folha purificado - ensaios de enzima

[580] Tecidos de folhas de Nicotiana benthamiana previamente infiltrados como descrito acima foram moídos em uma solução tampão contendo 0,1 M de fosfato de potássio (pH 580.1) e 0,33 M de sacarose, usando um homogeneizador de vidro. O homogenato de folha foi centrifugado a 20.000 g durante 45 minutos a 4°C após o qual cada sobrenadante foi coletado. O conteúdo de proteína em cada sobrenadante foi medido de acordo com Bradford (1976) usando um contador multimarcador Wallac1420 e um reagente de corante Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA EUA) Ensaios de aciltransferase usaram 100 μg de proteína de acordo com Cao et al. (2007) com algumas modificações. O meio reacional continha 100 mM de Tris-HCl (pH 7,0), 5 mM de MgCl2, 1 mg/mL de BSA (isento de ácidos graxos), 200 mM de sacarose, 40 mM de oleoil-CoA frio, 16,4 μM sn-2 mono-oleoilglicerol [14C] (55mCi/mmol, American Radiochemicals, Saint Louis, MO EUA) ou 6 μM [14C]glicerol-3-fosfato (G-3-P) sal dissódico] (150 mCi/mmol, American Radiochemicals). Os ensaios foram realizados durante 7,5, 15, ou 30 minutos. Análise de lipídeos Análise do teor de óleo em sementes deArabidposis

[581] Quando o teor de óleo de sementes ou a composição total de ácidos graxos foi determinado em sementes pequenas, tais como sementes de Arabidopsis, ácidos graxos nas sementes foram metilados diretamente sem esmagamento de sementes. As sementes foram secas em um exsicador durante 24 horas e aproximadamente 4 mg de semente foram transferidos para um frasco de vidro de 2 ml contendo uma tampa de rosca revestida com Teflon. 0,05 mg de triheptadecanoina (TAG com três ácidos graxos C17:0) dissolvido em 0,1 ml de tolueno foi adicionado ao frasco como padrão interno. Os ácidos gordos das sementes foram metilados adicionando 0,7 ml de 1N HCl metanólico (Supelco) ao frasco contendo material de semente. O esmagamento das sementes não foi necessário para a metilação completa com sementes pequenas, tais como sementes de Arabidopsis. A mistura foi submetida a vórtice e incubada brevemente a 80°C durante 2 horas. Depois de resfriar as misturas até à temperatura ambiente, adicionou-se 0,3 ml de NaCl a 0,9% (p/p) e 0,1 ml de hexano ao frasco e misturou-se bem durante 10 minutos em um Heidolph Vibramax 110. Os FAME foram recolhidos em um inserto de vidro de 0,3 ml e analisados por GC com um detector de ionização de chama (FID) como descrito abaixo.

[582]A área de pico de FAME individual foi primeiro corrigida com base nas respostas de área de pico de uma quantidade conhecida dos mesmos FAMEs presentes em um padrão comercial GLC-411 (NU-CHEK PREP, INC. EUA). GLC-411 contém quantidades iguais de 31 ácidos graxos (% em peso), que variam desde C8:0 a C22:6. No caso de ácidos graxos que não estavam presentes no padrão, foram tomadas as respostas de área de pico do FAME mais semelhante. Por exemplo, a resposta da área do pico de FAMEs de 16:1d9 foi utilizada para 16:1d7 e a resposta FAME de C22:6 foi utilizada para C22:5. As zonas corrigidas foram usadas para calcular a massa de cada FAME na amostra por comparação com a massa padrão interna. O óleo é armazenado principalmente na forma de TAG e seu peso foi calculado com base no peso de FAME. Os totais de glicerol foram determinados calculando mols de cada FAME e dividindo mols totais de FAMEs por três. O teor de TAG foi calculado como a soma de glicerol e porções de acil graxo usando uma relação:% de óleo em peso = 100x ((41x total mol FAME/3) + (total g FAME- (15x total mol FAME)))/g de sementes, em que 41 e 15 são pesos moleculares de porção de glicerol e grupo metil, respectivamente. Análise do teor de ácido graxo em sementes de Camelina e sementes de canola

[583] Para determinar a composição de ácidos graxos em sementes individuais que eram maiores, tais como sementes de canola e Camelina, a metilação direta de ácidos graxos da semente foi realizada como para sementes de Arabidopsis, exceto com a quebra dos revestimentos de semente. Este método extraiu óleo suficiente da semente para permitir a análise de composição de ácidos graxos. Para determinar a composição de ácidos graxos de lipídeos total extraído de sementes, as sementes foram esmagadas e os lipídeos extraídos com CHCl3/MeOH. As alíquotas do lipídeos extraídas foram metiladas e analisadas por GC. Determinou-se o teor total de lipídeos em pool (teor de óleo de sementes) de sementes de canola por duas extrações de lipídeos usando CHCl3/MeOH a partir de um peso conhecido de sementes dessecadas após esmagamento, seguido por metilação de alíquotas dos lipídeos juntamente com os ácidos graxos 17:0 como padrão interno. No caso de Camelina, o lipídeo a partir de uma quantidade conhecida de sementes foi metilado juntamente com uma quantidade conhecida de 17:0 ácidos graxos como para a análise de óleo de Arabidopsis e FAME foram analisados por GC. Para a quantificação de TAG, o TAG foi fracionado do lipídeo extraído usando TLC e diretamente metilado in silica usando TAG 17:0 como um padrão interno. Estes métodos são descritos mais detalhadamente como se segue.

[584]Após a colheita na maturidade da planta, sementes de Camelina ou canola foram dessecadas armazenando as sementes durante 24 horas à temperatura ambiente em um exsicador contendo sílica gel como exsicante. O teor de umidade das sementes era tipicamente de 6-8%. Os lipídeos totais foram extraídos a partir de pesos conhecidos das sementes dessecadas por esmagamento das sementes usando uma mistura de clorofórmio e metanol (2/1 v/v) em um tubo eppendorf usando um lisador de tecido Reicht (22 frequência/segundos durante 3 minutos) e uma esfera de metal Foi adicionado um volume de 0,1 M de KCl e a mistura foi agitada durante 10 minutos. A fase não polar inferior foi coletada após centrifugação da mistura durante 5 minutos a 3000 rpm. A fase remanescente superior (aquosa) foi lavada com 2 volumes de clorofórmio através da mistura durante 10 minutos. A segunda fase não polar também foi coletada e combinada com o primeira. O solvente foi evaporado a partir dos lipídeos presentes no extrato sob fluxo de nitrogênio e o total de lipídeo seco foi dissolvido em um volume conhecido de clorofórmio.

[585] Para medir a quantidade de lipídeo no material extraído, foi adicionada uma quantidade conhecida de 17:0-TAG como padrão interno e os lipídeos da quantidade conhecida de sementes incubados em HCl metanólico 1 N (Supelco) durante 2 horas a 80oC. O FAME assim feito foi extraído em hexano e analisado por GC. O FAME individual foi quantificado com base na quantidade de TAG-FAME 17:0. Os pesos de FAME individual, após subtração dos pesos dos grupos metilados esterificados de FAME, foram convertidos em mols dividindo-se por pesos moleculares de FAME individual. O total de mols de todos os FAME foi dividido por três para calcular mols de TAG e portanto glicerol. Então, mols de TAG foram convertidos em peso de TAG. Finalmente, a percentagem de teor de óleo em uma base de peso de semente foi calculada usando pesos de sementes, assumindo que todo o lipídeo extraído era TAG ou equivalente a TAG para o propósito de calcular o teor de óleo. Este método foi baseado em Li et al. (2006). Sementes que não sejam de Camelina ou canola, que são de um tamanho semelhante também podem ser analisadas por este método.

[586] O teor de canola e de outros óleos de sementes também foi medido por técnicas de ressonância magnética nuclear (Rossell e Pritchard, 1991) por uma onda pulsada NMS 100 Minispec (Bruker Pty Ltd Scientific Instruments, Alemanha) como descrito no Exemplo 14. O método de NMR mediu simultaneamente o teor de umidade. O teor de óleo de semente também pode ser medido por espectroscopia de reflectância de infravermelho próximo (NIR), tal como usando um monocromador NIRSystems Modelo 5000. O teor de umidade pode também ser medido em uma amostra de um lote de sementes por secagem das sementes na amostra durante 18 horas a cerca de 100oC, de acordo com Li et al. (2006). Análise de lipídeos de ensaios de lisado foliar

[587] Os lipídeos dos ensaios com lisado foram extraídos com clorofórmio:metanol: 0,1 M de KCl (2:1:1) e recuperado. As diferentes classes de lipídeos nas amostras foram separadas em placas de cromatografia em camada fina (TLC) de sílica gel 60 (MERCK, Dermstadt, Alemanha) impregnado com ácido bórico a 10%. O sistema solvente utilizado para fracionar TAG a partir do extrato lipídico foi clorofórmio/acetona (90/10 v/v). As classes individuais de lipídeos foram visualizadas expondo as placas ao vapor de iodo e identificadas por execução de padrões autênticos paralelos na mesma placa de TLC. As placas foram expostas a ecrãs de imagiologia de fósforo durante a noite e analisadas por um fluorimador Fujifilm FLA-5000 antes da contagem de cintilação líquida para quantificação de DPM. Isolamento de lipídeos total e fracionamento de lipídeos de tecidos vegetativos

[588]A composição de ácidos graxos do lipídeo total em folhas e outras amostras de tecido vegetativo foi determinada por metilação direta dos ácidos graxos em amostras liofilizadas. Para a quantificação de lipídeo total, os ácidos graxos em um peso conhecido de amostras liofilizadas, com FFA a 17:0, foram diretamente metilados. Para determinar os níveis de TAG totais em amostras foliares, o TAG foi fracionado por TLC a partir de lipídeos totais extraídos e metilado na presença de padrão interno de TAG 17:0, devido à presença de quantidades substanciais de lipídeos polares nas folhas. Isto foi feito como se segue. Os tecidos incluindo as amostras de folhas foram liofilizados, pesados (peso seco) e os lipídeos totais extraídos como descrito por Bligh e Dyer (1959) ou usando clorofórmio: metanol: KCl 0,1 M (CMK, 2:1:1) como solvente. Os lipídeos totais foram extraídos de amostras de folha de N. benthamiana, depois de liofilização, pela adição de 900 μL de uma mistura de clorofórmio/metanol (2/1 v/v) mistura por 1 cm de diâmetro por amostra de folha. 0,8 μg de DAGE foi adicionado por 0,5 mg de peso da folha seca, como padrão interno, quando a análise por TLC-FID estava sendo executada. As amostras foram homogeneizadas usando um tecido Ultra-Turrax IKA Lyser e após 500 μL 0,1 M KCl foi adicionado. Amostras foram agitadas em vórtex, centrifugadas durante 5 min e a fase inferior foi coletada. A fase superior restante foi extraída uma segunda vez através da adição de 600 μL de clorofórmio, vórtex e centrifugação durante 5 min. A fase inferior foi recuperada e combinada na coleção anterior. Os lipídeos foram secos sob um fluxo de nitrogênio e ressuspensos em 2 μL de clorofórmio por mg em peso seco de folha. Os lipídeo totais de folhas de N. tabacum ou amostras de folhas foram extraídos como acima, com algumas modificações. Se houver discos de 4 ou 6 folhas (cada um aproximadamente 1 cm2 de área de superfícei) foram combinados, foram utilizados 1,6 ml de solvente CMK, enquanto que se se combinassem 3 ou menos discos foliares, utilizava- se 1,2 ml de CMK. Os tecidos de folha liofilizados foram homogeneizados em um tubo eppendorf contendo uma esfera metálica usando um lisador de tecido Reicht (Qiagen) durante 3 minutos a 20 frequência/seg. Separação de lipídeos neutros por TLC e transmetilação

[589] Os volumes conhecidos de extratos foliares totais, tais como, por exemplo, 30 μL foram carregados em uma placa de gel de sílica 60 de TLC (1x20 cm) (Merck KGaA, Alemanha). Os lipídeos neutros foram fracionados nos diferentes tipos e separados dos lipídeos polares através de TLC em um tanque de desenvolvimento equilibrado contendo um sistema de solvente hexano/DEE/ácido acético (70/30/1 v/v/v/). As bandas de TAG foram visualizadas por pulverização primulina, marcadas com UV, raspadas da placa de TLC, transferidas para frascos de GC de 2 mL e secas com N2. 750 μL de 1N de HCl metanolico (Supelco analytical, EUA) foi adicionado a cada frasco juntamente com uma quantidade conhecida de C17:0 TAG como um padrão interno, dependendo da quantidade de TAG em cada amostra. Tipicamente, 30 μg do padrão interno foi adicionado para amostras de baixo TAG enquanto que até 200 μg de padrão interno foi utilizado no caso de amostras com elevado TAG.

[590]As amostras de lipídeo para a análise da composição de ácidos graxos por GC foram transmmetiladas por incubação das misturas a 80°C durante 2 horas na presença do HCl metanólico. Depois de resfriar as amostras até à temperatura ambiente, parou-se a reação adicionando 350 μl H2O. Os ésteres de acil metil graxo (FAME) foram extraídos da mistura adicionando 350 μl de hexano, agitação em vórtex e centrifugação a 1700 rpm durante 5 min. A fase de hexano superior foi coletada e transferida para pequenos frascos de GC com 300 μl de inserções cônicas. Após a evaporação, as amostras foram ressuspensas em 30 μl de hexano. Um μl foi injetado no GC.

[591]A quantidade de ácidos graxos individuais e totais (TFA) presentes nas frações lipídicas foi quantificada por GC determinando a área sob cada pico e calculada por comparação com a área de pico para a quantidade conhecida de padrão interno. O teor de TAG foi calculado como a soma de glicerol e porções de acil graxo na fração de TAG usando uma relação:% de TAG em peso = 100x ((41x total mol FAME/3) + (total g FAME- (15x total mol FAME)))/g em peso seco de folha, em que 41 e 15 são pesos moleculares de porção de glicerol e grupo metil, respectivamente. Cromatografia capilar de gás líquido (GC)

[592] FAME foram analisadas por GC usando uma coluna Agilent Technologies 7890A GC (Palo Alto, Califórnia, EUA), equipada com uma coluna SGE BPX70 (70% de polissilfenileno siloxano de cianopropil) (30 mx 0,25 mm d.i., 0,25 μm de espessura de filme), um FID, um injetor com/sem divisão e um amostrador e injetor Agilent Technologies 7693 Series. O hélio foi utilizado como gás carreador. As amostras foram injetadas no modo de divisão (razão de 50:1) a uma temperatura de forno de 150°C. Após a injeção, a temperatura do forno foi mantida a 150°C durante 1 min, depois aumentada para 210°C a 3°C.min-1 e finalmente para 240°C a 50°C.min-1. Os picos foram quantificados com o software ChemStation da Agilent Technologies (Rev B.04.03 (16), Palo Alto, Califórnia, EUA) com base na resposta da quantidade conhecida do padrão interno GLC-411 (Nucheck) e padrão interno C17:0- Me. Quantificação de TAG via Iatroscan

[593] Um μL de extrato lipídico foi carregado em um Chromarod-SII para TLC-FID IatroscanTM (Mitsubishi Chemical Medience Corporation - Japão). A prateleira Chromarod foi então transferido para um tanque de desenvolvimento equilibrado contendo 70 mL de um hexano/CHCl3/2- propanol/ácido fórmico (85/10.716/0.567/0.0567 v/v/v/v) sistema de solvente. Após 30 min de incubação, a prateleira Chromarod foi seca durante 3 min a 100°C e digitalizado imediatamente em um analisador TLC-FID de Iatroscan MK-6s (Mitsubishi Chemical Medience Corporation - Japão). As áreas de pico do padrão interno de DAGE e TAG foram integradas usando o software de integração SIC-480II (Versão: 7.0-E SIC System instruments Co., LTD - Japão).

[594]A quantificação de TAG aconteceu em duas etapas. Primeiro, o DAGE foi verificado em todas as amostras para corrigir os rendimentos de extração, depois disso as amostras de TAG concentradas foram selecionadas e diluídas. Em seguida, o TAG foi quantificado em amostras diluídas com uma segunda varredura de acordo com a calibração externa usando trilinoleato de gliceril como padrão externo (Sigma-Aldrich). Quantificação da TAG em amostras de folhas por GC

[595]A área de pico de FAME individual foi primeiro corrigida com base nas respostas de área de pico de quantidades conhecidas dos mesmos FAMEs presentes em um padrão comercial GLC-411 (NU-CHEK PREP, INC. EUA). As zonas corrigidas foram usadas para calcular a massa de cada FAME na amostra por comparação com a massa padrão interna. Dado que o óleo está armazenado principalmente na forma de TAG, a quantidade de óleo foi calculada com base na quantidade de FAME em cada amostra. Os totais de mols de glicerol foram determinados calculando o número de mols de FAMEs e dividindo mols totais de FAMEs por três. A quantidade de TAG foi calculada como a soma de glicerol e de porções de acil graxo usando a fórmula:% de óleo em peso = 100x ((41x total mol FAME/3) + (total g FAME- (15x total mol FAME)))/g em peso seco de folha, em que 41 e 15 eram pesos moleculares de porção de glicerol e grupo metil, respectivamente. Exemplo 2.Aumento do teor de lipídeos em partes vegetativas Nicotiana benthamiana

[596] O constructo genético pJP3502 foi utilizado para produzir plantas transformadas de forma estável de Nicotiana benthamiana por protocolo de transformação mediada por Agrobacterium como descrito por Nicotiana tabacum em WO2013/096993. As plantas transgênicas foram selecionadas para resistência à canamicina e cultivadas até a maturidade na estufa. As amostras de folhas foram colhidas no conjunto de sementes e liofilizadas. Determinou-se o teor de ácidos graxos totais (TFA) (% de massa seca) e a composição após a extração de lipídeos totais das amostras por Bligh e Dyer (1959) e o teor e composição da fração de triacilglicerol (TAG). Os dados são mostrados na Tabela 2 e Tabela 3. A amostra de óleo de folha mais elevada foi a da planta transgênica # 16 que tinha um teor de TFA de 33% em peso. Esta amostra continha 22,5% de TAG em peso (peso seco).

[597] Foi observada uma forte correlação entre as alterações na composição dos ácidos graxos e dos teores de TFA ou TAG. O ácido oleico (C18:1n-9) aumentou com o aumento dos teores de TFA e TAG, de modo que era o ácido graxo dominante em folhas com elevado teor de TAG, compreendendo por exemplo 66,8% de TFA e 66,9% de ácidos graxos de TAG nas folhas com o maior teor de TAG. Foram observadas correlações semelhantes para outros ácidos graxos, por exemplo, os níveis de ALA foram reduzidos a 4,9% de TFA e 3,9% de TAG nas folhas com o maior teor de TAG. Foi também observada uma forte correlação entre os níveis de C16:3 e os teores de TFA e TAG com C16:3 diminuindo substancialmente em amostras de TFA e TAG elevadas.

[598] Duas das plantas de alto teor de óleo, # 14 e # 16, também foram analisadas durante a fase de senescência foliar quando as folhas tinham começado a amarelar (Tabela 4 e Tabela 5). Embora houvesse pouca alteração no teor total de ácidos graxos da amostra mais alta (32,9% vs 33%), a quantidade de TAG aumentou para 32,6%. Nestas amostras, o TAG compreendeu quase todos os lipídeos foliares. Tabela 2. Composição de ácidos graxos totais (TFA) e quantidade (% em peso seco) em folhas de plantas de Nicotiana benthamiana estavelmente transformadas com o T-DNA do constructo pJP3502. As amostras também continham 0,1-0,3% de C14:0 e 0,0-0,7% de C20:1

Tabela 3. Composição e quantidade de ácidos graxos totais (% em peso seco) do TAG em folhas de plantas de Nicotiana benthamiana estavelmente transformadas com o T-DNA do constructo pJP3502. As amostras também continham 0,1-0,3% de C14:0 e 0,0-0,7% de C20:1

Tabela 4. Composição de ácidos graxos totais (TFA) em estágio de folha amarela e quantidade (% em peso seco) em folhas de plantas de Nicotiana benthamiana estavelmente transformadas com o T-DNA do constructo pJP3502. As amostras também continham 0,1-0,3% de C14:0 e 0,0-0,7% de C20:1

Tabela 5. Composição e quantidade de ácidos graxos totais (% em peso seco) em estágio de folha amarela do TAG em folhas de plantas de Nicotiana benthamiana estavelmente transformadas com o T-DNA do constructo pJP3502. As amostras também continham 0,1-0,3% de C14:0 e 0,0-0,7% de C20:1

Exemplo 3. Aumento do conteúdo de lipídeos nas partes vegetativas das plantas de Nicotiana tabacum.

[599] O constructo pJP3502 tinha sido anteriormente utilizado para transformar Nicotiana tabacum (WO2013/096993). As sementes obtidas a partir de uma planta T1 homozigótica transformada com o T-DNA de pJP3502 e tendo elevado teor de TFA e TAG foram colhidas e semeadas para estabelecer uma nova geração de plantas descendentes de T2, uniformemente homozigóticas para os transgenes. Os vasos foram dispostos na estufa de modo que as folhas maduras das plantas se sobrepusessem em uma formação típica de copa ("copa"), como aconteceria quando cultivadas em campo, ou estavam expostas ao máximo à luz solar direta ("não copa"). As amostras de folhas foram retiradas de cada planta quando totalmente cultivadas, no estágio de semeadura, e liofilizadas. Determinou-se o teor de ácidos graxos para a fração de TAG (Tabela 6) após extração de lipídeos totais das amostras por Bligh e Dyer (1959). Os níveis de TAG no tecido foliar maduro de plantas sem copa eram tipicamente mais altos do que em plantas com copas, com o maior teor de TAG foliar observado de 20,6% em peso seco de folha. Tabela 6. Teor de TAG (% em peso seco) em tecido foliar maduro de plantas descendentes transgênicas T2 (linhagens 49) transformadas com T-DNA de pJP3502, em comparação com o tipo selvagem (wt).

Exemplo 4.Aumento do teor de óleo em partes vegetativas de plantas monocotiledôneas

[600] Os constructos de DNA quimérico foram concebidos para aumentar o teor de óleo em plantas monocotiledôneas, por exemplo a planta C4 S. bicolor (sorgo), expressando uma combinação de genes que codificam WRI1, Z. mays LEC1 (Número de Acessão AAK95562; SEQ ID NO:155), DGAT e Oleosina nas plantas transgênicas. Vários pares de constructos para a cotransformação biolística foram concebidos e produzidos por clonagem por restrição de ligação enzimática, como se segue.

[601] O constructo genético pOIL136 era um vetor binário contendo três cassetes de expressão de monocotiledõneas, nomeadamente um gene marcador selecionável codificando fosfinotricina acetiltransferase (PAT) para seleção de plantas, uma segunda cassete para expressar DGAT e uma terceira para expressar Oleosina. O pJP136 foi primeiro produzido por amplificação de um promotor do gene de actina de Oryza sativa (McElroy et al., 1990) e inserindo-o como um fragmento cego-ClaI em pORE04 (Coutu et al., 2007) para produzir pOIL094. POIL095 foi então produzido inserindo uma versão do gene da Oleosina Sesamum indicum wque tinha sido codificado otimizado para a expressão de monocotiledôneas em pOIL094 no sítioKpnI. O pOIL093 foi produzido por clonagem de uma versão otimizada do gene Umbelopsis ramanniana DGAT2a (Lardizabal et al., 2008) como um fragmento SmaI-KpnI em um vetor contendo um promotor do gene Zea mays Ubiquitin. O pOIL134 foi então produzido por clonagem da cassete de expressão de NotI DGAT2a de pOIL093 em pOIL095 no sítio NotI. O pOIL141 foi produzido inserindo o gene marcador selecionável codificando para PAT como um fragmento de BamHI- SacI em um vetor contendo o promotor do gene Z. mays Ubiquiti. Finalmente, o pOIL136 foi produzido por clonagem da cassete de expressão de Ubiquitin::PAT de Z. mays como um fragmento cego deAscI em ZraI-AscI de pOIL096. O constructo genético pOIL136 continha, portanto, as seguintes cassetes de expressão: promotor O. sativa Actin::S. indicum Oleosina, promotor Z. mays Ubiquitin::U. ramanniana DGAT2a e promotor Z. mays Ubiquitin::PAT.

[602] Um vetor semelhante pOIL197, contendo NPTII em vez de PAT foi construído por subclonagem da cassete de Z. mays Ubiquitina :: NPTII de pUKN como um fragmento de HindIII-SmaI em AscI (cego) e sítios HindIII de pJP3343. O vetor resultante, pOIL196, foi então digerido com HindIII cego) e AgeI. O fragmento de 3358 pb resultante foi clonado nos sítios ZraI - AgeI de pOIL134, produzindo pOIL197.

[603] Um conjunto de constructos contendo genes que codificam o fator de transcrição Z. mays WRI1 (ZmWRI) ou LEC1 (ZmLEC1) sob o controle de diferentes promotores foram concebidos e produzidos para cotransformação biolítica em combinação com pOIL136 para testar o efeito da resistência do promotor e especificidade celular sobre a função de WRI1 ou LEC1, ou ambos se combinados, quando expressos em tecidos vegetativos de uma planta C4 como o sorgo. Este conjunto separado de constructos não continha um gene marcador selecionável, exceto para pOIL333 que continha NPTII como marcador selecionável. Os diferentes promotores foram testados como se segue. O promotor do gene Z. mays Ubiquitin (pZmUbi) era um promotor monocot constitutivo forte enquanto o promotor CaSV 35S melhorado (e35S) possuindo uma região potenciadora duplicada foi descrito como resultando em níveis de expressão transgênicos mais baixos (revisto em Girijashankar e Swathisree, 2009). Enquanto o promotor do gene de Z. mays fosfoenolpiruvato carboxilase (pZmPEPC) era ativo nas células mesófilas de folhas (Matsuoka e Minami, 1989), o sítio da fotossíntese em espécies de plantas C4, o promotor do gene da subunidade pequena de Z. mays Rubisco (pZmSSU) foi específico para a camada de células de bainha de agrupamento (Nomura et al., 2000; Lebrun et al., 1987), as células onde a fixação de carbono ocorre em plantas C4.

[604]A expressão do gene de Z. mays codificando a protease de cisteína SEE1 (Número de Acessão AJ494982) foi identificada como semelhante àquela do promotor de senescência específica A. thaliana SAG12 durante o desenvolvimento da planta. Por conseguinte, um promotor de 1970bp do gene SEE1 (SEQ ID NO: 216) foi também selecionado para conduzir a expressão dos genes que codificam o fator de transcrição de Z. mays WRI1 e LEC1. Além disso, o promotor do gene que codifica a proteína de dedo de zinco de Aeluropus littoralis AlSAP (Ben Saad et al., 2011; Número de Acessão DQ885219; SEQ ID NO: 217) e o promotor do gene ArRolC responsivo à sacarose de A. rhizogenes (Yokoyama et al., 1994; Número de Acessão DQ160187; SEQ ID NO: 218) também foram selecionados para expressão de expressão de ZmWRI1 no tecido do caule. Portanto, cada um destes promotores foi acompanhado individualmente a montante das regiões de codificação de ZmWRI1 ou ZmLEC1, como se segue.

[605] Um vetor intermediário, pOIL100, foi primeiro produzido clonando a sequência codificante de WRI1 deZ. mays ae uma região de terminação de transcrição/poliadenilação, flanqueada pelos sítios AscI-NcoI, para os mesmos sítios no vetor binário pJP3343. As diferentes versões dos constructos para expressão de WRI1 foram baseadas neste vetor e foram produzidas clonando os vários promotores em pOIL100. O pOIL101 foi produzido por clonagem de um fragmento de XhoI- SalI contendo o promotor e35S com região potenciadora duplicada no sítio XhoI de pOIL100. O pOIL102 foi produzido por clonagem de um fragmento deHindIII-AvrII contendo o promotor do gene de Z. mays Ubiquitin nos sítios HindIII-XbaI de O pOIL100. pOIL103 foi produzido por clonagem de um fragmento de HindIII-NcoI contendo o promotor do gene de Z. mays PEPC nos sítios HindIII-NcoI de pOIL100. O pOIL104 foi produzido por clonagem de fragmento de HindIII-AvrII contendo um promotor do gene de Z. mays SSU nos sítios HindIII-AvrII de pOIL100.

[606] Um fragmento sintético contendo a região do promotor de SEE1 de Z. mays flaqueado por sítios únicos HindIII-XhoI é sintetizado. Este fragmento é clonado a montante da região codificante de proteína WRI1 de Z. mays usando os sítios HindIII-XhoI em pOIL100. O vetor resultante é designado pOIL329. Um fragmento sintético contendo a região do promotor de AlSAP de A. littoralis flanqueado por sítios únicos XhoI-XbaI é sintetizado. Este fragmento é clonado a montante da região codificante de proteína WRI1 de Z. mays usando os sítios XbaI-XhoI em pOIL100. O vetor resultante é designado pOIL330. Um fragmento sintético contendo a região do promotor de A. rhizogenes ArRolC flanqueado por sítios únicos PspOMI-XhoI é sintetizado. Este fragmento é clonado a montante da região de codificação de WRI1 de Z. mays usando os sítios de PspOMI-XhoI em pOIL100. O vetor resultante é designado pOIL335. Finalmente, um vetor binário (pOIL333) contendo a cassete de expressão de SEE1:: ZmLEC1 Z. mays é obtido em três etapas. Primeiro, um vetor expressão de 35S::GUS é construído amplificando a região de codificação de GUS coding region com iniciadores de flanqueamento contendo sítios AvrII e KpnI. O fragmento resultante foi subsequentemente clonado nos sítios SpeI-Kpnde pJP3343. O vetor resultante é designado pTV111. Em seguida, a região do promotor de 35S de pTV111 é substituída pelo promotor de SEE1 de Z. mays. Para este fim, a sequência de SEE1 de Z. mays é amplificada usando iniciadores de flanqueamento contendo sítios únicos HindIII e XhoI. O fragmento resultante é cortado com as respectivas enzimas de restrição e subclonado nos sítios SalI-HindIII de pTV111. O vetor resultante é designado pOIL332. Em seguida, a sequência de codificação de ZmLEC1 é amplificada usando os iniciadores de flanqueamento contendo sítios NotI e EcoR V. Este fragmento resultante é subclonado nos respectivos sítios de pOIL332, originando pOIL333.

[607] O DNA é preparado para a transformação biolística por excisão das cadeias principais do vetor pOIL101, pOIL102, pOIL103, pOIL104, pOIL197, pOIL329, pOIL330, pOIL333 e pOIL335 por digestão de restrição seguida por isolamento em gel. O DNA de pOIL197 é então misturado com DNA de pOIL101, pOIL102, pOIL103, pOIL104, pOIL329, pOIL330, pOIL333 ou pOIL335 e transformado por transformação mediada biolisticamente em explantes de S. bicolor. Alternativamente, os constructos para expressão das mesmas combinações de genes são transformadas separadamente ou cotransformadas por transformação mediada porAgrobacterium(Gurel et al., 2009; Wu et al., 2014).

[608]As plantas transgênicas são regeneradas e selecionadas por resistência aos antibióticos. Quando os dois constructos cotransformam no mesmo evento, observa-se um teor aumentado de óleo nos tecidos de não semente das plantas transgênicas.

[609] Os constructos de DNA quimérico para transformação mediada por Agrobacteriumsão usados para transformar Zea mays (milho) como descrito por Gould et al., (1991). Em resumo, os explantes de ápice do broto são cocultivados com Agrobacteriumtransgênica por tdias antes de serem transferidos para um meio de sal MS contendo Canamicina e carbenicilina. Depois de várias rodadas de subcultura, os brotos e as raízes transformados formam-se espontaneamente e são transplantados para o solo. Os constructos são igualmente usados para transformar Hordeum vulgare (cevada) e Avena sativa (aveia), utilizando métodos de transformação conhecidos para estas espécies. Resumidamente, no caso da cevada, as culturas de Agrobacterium são usadas para transformar células em embriões imaturos de cevada (cv. Golden Promise) de acordo com métodos publicados (Tingay et al., 1997; Bartlett et al., 2008) com algumas modificações naqueles embriões entre 1,5 e 2,5 mm de comprimento são isolados a partir de cariopses imaturas e os eixos embrionários removidos. Os explantes resultantes são cocultivados durante 2-3 dias com a Agrobacterium transgênica e então cultivados no escuro durante 4-6 semanas em meio contendo timentina e higromicina para gerar calos antes de serem transferidos para o meio de transição transição em condições durante duas semanas. Os calos são em seguida, transferidos para o meio de regeneração para permitir a regeneração de brotos e raízes antes da transferência das mudas regeneradas para o solo. As plantas transformadas são obtidas e cultivadas à maturidade naestufa. Exemplo 5. Aumento do teor de óleo em plantas dicotiledôneas

[610] O teor de óleo nas espécies de plantas dicotiledôneas Trifolium repens (trevo), uma leguminosa comumente utilizada como uma espécie de pastagem, foi aumentada por expressar a combinação de genes WRI1, DGAT e Oleosina em partes vegetativas. O constructo pJP3502 foi usado para transformar T. repenspor transformação mediada por Agrobacterium (Larkin et al., 1996). Resumidamente, o constructo genético pJP3502 foi introduzido em A. tumefaciens através de um procedimento de eletroporação padrão. O vetor binário também continha um gene marcador selecionável de 35S:NptII dentro do T-DNA. As células transformadas de Agrobacterium foram cultivadas em meio LB gelificado e suplementado com canamicina (50 mg/L) e rifampicina (25 mg/L) e incubadas a 28°C durante dois dias. Uma única colônia foi utilizada para iniciar uma cultura fresca. Após 48 horas de cultura vigorosa, as célula de Agrobacterium foram usadas para tratar T. repens (cv. Haifa) cotilédones que tinham sido dissecados de sementes embebidas como descrito por Larkin et al. (1996). Após a cocultivo durante três dias os explantes foram expostos a 25 mg/L de canamicina para selecionar os brotos transformados e depois transferidos para meio de enraizamento para formar raízes, antes da transferência para o solo.

[611] Seis plantas transformadas contendo o T-DNA de pJP3502 foram obtidas e transferidas para o solo na estufa. O teor de óleo aumentado foi observado no tecido não semente de algumas das plantas, com uma planta mostrando um aumento maior do que 4 vezes nos níveis de TAG nas folhas. Tais plantas são úteis como alimento para animais, por exemplo, cultivando as plantas em pastagens, fornecendo alimentação com um teor de energia aumentado por unidade de peso (densidade de energia) e resultando em taxas de crescimento aumentadas nos animais.

[612] O constructo pJP3502 também é utilizado para transformar outras plantas leguminosas, tais como alfafa (Medicago sativa) e barril médico (Medicago truncatula) pelo método de Wright et al. (2006) para obtenção de plantas transgênicas que aumentaram o teor de TAG em partes vegetativas. Três transgênicos putativos de plantas M. truncatula foram obtidos. As plantas transgênicas são úteis como espécies de pastagem ou como feno ou silagem como fonte de alimentação para animais tais como, por exemplo, bovinos, ovinos e equinos, fornecendo uma densidade de energia aumentada na alimentação.

[613] Para o aumento do teor de óleo em sementes de leguminosas, sintetizou-se um fragmento de DNA contendo uma combinação de dois genes quiméricos, nomeadamente (a) um primeiro gene quimérico codificando WRI1 e A. thaliana WRI1 expressa do promotor de proteína de armazenamento de faseolina do tipo beta Phaseolus vulgaris e 5' UTR mais (b) um segundo gene quimérico codificando DGAT1 de A. thaliana expressa do promotor de vicilina de a Pisum sativum e 5' UTR. O fragmento de DNA foi inserido em um vetor binário pORE04 contendo um gene quimérico codificando a oleosina para gerar um constructo de T-DNA compreendendo os três genes quiméricos e um gene marcador selecionável (Figura 2) que foi usado para transformar Lupinus angustifolius, umaoutra planta leguminosa, pelo método como descrito por Pigeaire et al. (1997). Resumidamente, explantes de ápice de broto de L. angustifolius são cocultivados com Agrobacterium transgênica antes de serem completamente umedecidos com solução de canamcina (20 mg/ml) e transferido para um meio de regeneração livre de canamicina. Os múltiplos brotos axilares que se desenvolvem a partir dos ápice são estirpados em um meio contendo 50 mg/L canamicina e os brotos sobreviventes transferidos para um meio fresco contendo 50 mg/L canamicina. Os brotos saudáveis são então transferidas para o solo. Os genes no T-DNA são expressos em células de plantas transformadas, aumentando o teor de óleo nos tecidos vegetativos e as sementes. Um promotor específico de semente dirigindo o gene de WRI1 é além disso usado para aumentar o teor de óleo em transgênico de sementes de Lupinus.

[614] O constructo também foi usado para transformar Glycine max tal como descrito por Zhang et al. (1999) para se obter plantas de soja transgênicas, que aumentaram teor de TAG em sementes. As plantas transgênicas foram obtidas como demonstrado por PCR em DNA obtido a partir de amostras de plantas. As plantas foram cultivadas até à maturidade e a semente foi colhida a partir delas. O teor de óleo da semente deverá ser aumentado, tal como determinado por NMR não destrutiva.

[615] Um segundo constructo genético para aumentar o teor de óleo de sementes em tremoço e soja foi construído por sintetização de um inserto de DNA compreendendo três cassetes de expressão de genes, nomeadamente uma primeira tendo um promotor de Glycine max β-conglicinina expressando DGAT2A de Umbelopsis ramanniana, uma segunda tendo um promotr de KTi3 de Glycine max expressando WRI1 de A. thaliana e uma terceira tendo o promotor de Glycine max β-conglicinina expressando MGAT2 de Mus musculus. O fragmento de SbfI-PstI deste inserto foi clonado no vetor binário pORE04 no sítio PstI para produzir pJP3569. Uma versão sem o gene de MGAT2 foi feita por clonagem do menor fragmento de SbfI-SwaI no pORE04 nos sítios EcoRV-PstI para produzir pJP3570. As versões contendo apenas o gene de WRI1 e apenas o gene de DGAT2A foram produzidas de forma semelhante. Estes vetores binários foram usados para transformar Glycine max para gerar sementes transgênicas. O teor de óleo nas sementes a partir dos transformantes primários é analisado por NMR não destrutiva antes de serem semeadas para produzir sementes T2.

[616] Uma versão de pJP3569 adequada para transformação de tremoço é feita por amplificação por PCR das cassetes de expressão de WRI1 e DGAT2A em um único amplicon adaptado com sítios de restrição NotI. O fragmento de NotI é clonado em pJP3416 no sítio PspOMI para produzir pJP3678, um vetor binário contendo o gene marcador selecionável de PAT. Exemplo 6. Experimentos para aumentar o teor de óleo em partes vegetativas de canola

[617] Dois vetores expressão binários foram usados para transformar B. napus (cv. Oscar), a fim de investigar o efeito na acumulação de TAG em sementes e/ou tecidos vegetativos. Em primeiro lugar, o plasmídeo pJP3414 foi construído através da inserção de uma sequência de codificação otimizada por códon da proteína WRI1 de A. thaliana WRI1 no vetor binário 35S-pORE04 que continha uma cassete de expressão de 35S vazia. O T-DNA de pJP3414 contendo, portanto, uma versão otimizada por códon do fator de transcrição de WRI1 de A. thaliana sob o controle do promotor de 35S constitutivo. O tecido foliar de 11 mudas de B. napus T0 transformadas independentemente, transformados com pJP3414 como descrito no Exemplo 1, cada um continha níveis de TAG elevados em comparação com as plantas transformadas com o vetor vazio (pORE04). No entanto, em nenhum caso o nível de TAG excedeu 1%. Os níveis máximos foram detectados na linhagens 31, que continha até 0,58% de TAG em uma base de peso seco. O teor de óleo em sementes T1 transgênicas não foi significativamente elevado em comparação com sementes de tipo selvagem (Oscar) e de controle vetorial vazio. As sementes T1 de três linhagens apresentando os maiores níveis de TAG no tecido foliar foram germinadas em meio MS contendo 3% de sacarose. Não foi observada diferença na germinação após 5 e 8 dias, quando comparado com o controle não transformado (Oscar).

[618] Em uma tentativa de aumentar ainda mais os níveis de TAG em tecidos vegetativos de B. napus, o segundo vetor, pJP3502 (Vanhercke et al., 2014), foi usado para transformar B. napus (cv. Oscar). Os níveis de TAG foram quantificados em folhas de transgênicos amostradas antes da floração. No entanto, o teor de TAG não foi aumentado mais e a composição de ácido graxo não diferiu das plantas de controle não transformadas nesta fase de crescimento.

[619]As observações para B. napus descritas neste Exemplo, fornecendo um teor de TAG inferior a 1% nas folhas, estavam em forte contraste com os relatados nos Exemplos 2 e 3 para espécies de Nicotiana, fornecendo cerca de 20-30% de TAG. Os inventores consideraram estas observações cuidadosamente, buscando uma explicação para a diferença entre as espécies. Foram identificadas várias diferenças entre as espécies. Uma diferença que os inventores conceberam como fornecendo a diferença essencial era que a Brassica napus é uma espécie chamada 16:3 enquanto que a Nicotiana é uma espécie chamada 18:3. Isto se refere à contribuição relativa das chamadas vias procarióticas e eucarióticas para a síntese de lipídeos de plastídeos (Figura 1) e, portanto, os inventores pensaram, a quantidade de DAG que está disponível para a síntese de TAG. Isto levou os inventores a conceberem o modelo de que a modificação da razão da síntese de ácidos graxos através da via eucariótica em relação à via procariótica, por exemplo, diminuindo a acumulação de 16:3 em relação a 18:3, alteraria o nível de TAG que se acumula em células vegetais ou células fotossintéticas, microbianas. Eles esperavam que tal modificação que inclinasse o equilíbrio a favor da via eucariótica fosse vantajosa para os níveis de acumulação de TAG, especialmente nas plantas chamadas 16:3. Em suma, para converter uma célula "16:3" em uma mais semelhante à célula "18:3".

[620] Os inventores levantaram a hipótese de que a presença de C18:1-ACP no plastídeo que inibe ACCase por inibição de retroalimentação poderia ser mais forte em plantas 16:3 devido à síntese e retenção de ácidos graxos no plastídeo pela via procariótica. Em contraste, eles hipotetizaram que as plantas C18:3 são capazes de acumular maiores níveis de TAG nos tecidos vegetativos devido ao aumento da exportação de C18:1 dos plastídeos para fornecimento na via eucariótica. Como se mostra nos Exemplos 2 a 4 aqui, isto foi observado em espécies como a N. tabacum e N. benthamiana que têm razões de lipídeos plastidiais C18:3/C16:3 mais elevadas, tais como B. napus o qual tem baixos níveis de C18:3 em lipídeos plastidiais. Este modelo, os inventores hipotetizaram, explicaria por que a transformação estável dos genes de expressão WRI + DGAT + Oleosina do vctor pJP3502 em ambas N. tabacum e N. benthamiana resultou em altos níveis de acumulação de TAG e mudanças extensas na composição de ácidos graxos. Em contraste, a transformação do mesmo vetor em B. napus resultou em apenas um pequeno aumento na acumulação de TAG e uma pequena alteração na composição de ácido graxo. Este modelo foi examinado, tal como descrito abaixo. Exemplo 7.Modificação de expressão de GPAT plastidial Sobre-expressão de GPAT plastidial em células vegetais

[621] Uma série de experiências foram realizadas para testar a hipótese de que a presença de uma via procariótica 16:3 altamente ativa em uma planta (isto é, uma planta chamada 16:3) proporcionaria níveis de TAG muito mais baixos em tecidos vegetativos após a introdução da combinação de genes em pJP3502, em relação a plantas 18:3. Estas experiências são descritas nos Exemplos seguintes. Inicialmente, os inventores testaram se a acumulação de elevado nível de TAG observada em N. benthamiana transgênica pode ser interrompido por sobre-expressão de uma GPAT plastidial, aumentando o fluxo na via procariótica.

[622] Uma região de codificação para a expressão da GPAT plastidial de Arabidopsis thaliana, ATS1 (Nishida et al., 1993), foi amplificado por RT-PCR a partir do RNA total de A. thaliana e clonado como um fragmento de EcoRI-PstI no vetor expressão binário de pJP3343 sob o controle do promotor de 35S para produzir o vetor expressão constitutivo de pOIL098. O efeito da sobre-expressão de uma GPAT plastidial em uma base de folha de óleo elevado é determinado pela infiltração do vetor quimérico pOIL098 em tecido foliar de óleo elevado. O tecido foliar de óleo elevado é gerado por coinfiltração de vetores expressão binários de WRI1 e DGAT (Exemplo 1) ou por infiltração de pOIL098 em folhas de uma planta Nicotiana transformada de forma estável com o T-DNA de pJP3502 ou outro vetor óleo elevado. Espera-se que o teor de óleo seja reduzido nas manchas de folhas infiltradas coexpressando o gene que codifica ATS1. Isso é determinado através da análise de TFA e TAG como proporções de massa seca da amostra. Isto também é determinado pela observação de incorporação de acetato marcado em ácidos graxos produzidos por microssomas ou lisados de folhas feitos a partir de manchas foliares infiltradas. Acumulação de óleo em um mutante de GPAT plastidial de Arabidopsis thaliana

[623] O ats1 mutante de A. thaliana tem uma mutação disruptiva no gene que codifica GPAT plastidial que reduziu a atividade de GPAT plastidial a um nível de apenas 3,8% da do tipo selvagem (Kunst et al., 1988). Os níveis de acumulação de TAG não semente, pelo menos em folhas, caules e raízes, tanto em ats1 progenitora quando mutante de A. thaliana são testados e comprados. O T-DNA do constructo pJP3502 para sobre-expressão da combinação de genes que codificam WRI1, DGAT e Oleosina é introduzido por transformação em plantas de ambos os genótipos. A combinação de genes no T-DNA de pJP3502 aumenta a síntese de ácidos graxos em ambas as origens vegetais. No entanto, a acumulação de TAG no ATS1 mutante deverá ser significativamente mais elevada em média do que nas plantas transgênicas derivadas a partir do genótipo de tipo selvagem (progenitora) devido à redução na atividade de GPAT plastidial e, portanto, o fluxo reduzido de ácidos graxos para a via procariótica plastidial. A razão entre os ácidos graxos C16:3 e C18:3 é significativamente reduzida nas folhas do ATS1 mutante, tanto transformadas quanto não transformadas. Silenciamento do gene que codifica a GPAT plastidial em células vegetais

[624]Além disso, a modificação genética de uma planta através da introdução de uma mutação em um gene que codifica uma GPAT plastidial, o fluxo de ácidos graxos através da via procariótica 16:3 pode ser reduzido e, assim, aumentar o teor de óleo em partes vegetativas ao silenciar a GPAT plastidial. Isto é demonstrado pela produção de uma cassete transgênica com um promotor constitutivo ou específico de folha expressando RNA em gancho correspondente a uma região do gene que codifica GPAT plastidial das espécies selecionadas. Como um exemplo, uma cassete de expressão de RNAi em gancho é produzida usando o fragmento 581bp SalI-EcoRV da sequência de cDNA de GPAT plastidial de A. thaliana (NM_179407, SEQ ID NO:177). Uma região de qualquer gene codificando uma GPAT plastidial que tenha um elevado grau de identidade de sequência com a sequência de nucleotídeo de NM_179407 também pode ser utilizada para construir um gene para expressão de um RNA em gancho para silenciar um gene de GPAT plastidial endógena. Um constructo de hpRNAi contendo um fragmento de 732 pb (SEQ ID NO:219) da GPAT plastidial de N. benthamiana flanqueada pelo sítios únicos SmaI e KasI foi projetado para uma transformação estável N. tabacum. O fragmento de GPAT plastidial de N. benthamiana sintetizado foi subclonado nos sítios SmaI-KasI de pJP3303, resultando em pOIL113. Espera-se que a redução da retenção de ácido graxo plastidial resulte em um aumento da acumulação de TAG, particularmente quando combinado com um componente de "Impulso", tal como a sobre- expressão de um fator de transcrição, tal como WRI1, ou por um componente de "Impulso", tal como um DGAT ou PDAT e/ou atividade de SDP1 ou TGD reduzida.

[625]A inativação do gene que codifica uma GPAT plastidial ou qualquer gene pode ser conseguida utilizando métodos CRISPR/Cas9. Por exemplo, a inactivação do gene que codifica GPAT plastidial de A. thaliana (N.° de Acessão NM_179407) pode ser realizada por interrupção genética médiada por CRISPR/Cas9/sgRNA e mutagênese subsequente por reparação de DNA de junção de extremidade não homóloga (NHEJ). Antes da clivagem de DNA direcionada, Cas9 estimula a separação da cadeia de DNA e permite que um sgRNA se hibridize com uma sequência específica de 20 nt no gene direcionado. Isto posiciona o DNA alvo no sítio ativo de Cas9 na orientação adequada em relação a um sítio de ligação de PAM (nucleotídeos de guanosina em tandem). Este posicionamento permite que os domínios de nuclease separados de Cas9 separem de forma independente cada cadeia da sequência de DNA alvo em um ponto 3-nt a montante do sítio de PAM. A quebra de cadeia dupla sofre então uma reparação de DNA de NHEJ propensa a erros durante a qual ocorrem deleções ou inserções de alguns nucleotídeos e resultam na inativação do gene de GPAT plastidial. Sequências de SgRNA direcionado o gene de GPAT de A. thaliana são identificadas e selecionadas através da utilização da ferramenta CRISPRP web tool (Xie et al., 2014). A sequência alvo 20nt pode ser qualquer sequência 20nt dentro do gene alvo, incluindo dentro de regiões não codificantes do gene, tal como um promotor ou íntron, desde que seja uma sequência específica dentro do genoma. A sequência pode ser inserida em um vetor binário contendo cassete de expressão de CRISPR/Cas9/sgRNA da planta e marcador de canamicina selecionável (Jiang et al., 2013) e transformado em células de plantas por transformação mediada por Agrobacterium. Plantas T1 transgênicas podem ser rastreadas para mutações no gene da GPAT plastidial por amplificação de PCR e sequenciação de DNA. Exemplo 8. Aumento da expressão de tioesterase em células vegetais

[626]A síntese de ácidos graxosDe novo ocorre nos plastídeos de células eucarióticas onde os ácidos graxos são sintetizados enquanto ligados à proteína carreadora de acil como conjugados de acil-ACP. Após o alongamento da cadeia em grupos acil C16:0 e C18:0 e depois dessaturação em C18:1 enquanto ligado a ACP, os ácidos graxos são clivados da ACP por tioesterases e entram na via eucariótica por exportação dos plastídeos e transporte até à ER onde participam na biogênese lipídica de membrana e de armazenamento. Em cloroplastos, o processo de exportação tem duas etapas: Em primeiro lugar, as cadeias acil são liberadas como ácidos graxos livres pela atividade enzimática de acil-ACP tioesterases (acil graxo tioesterase, FAT), em segundo lugar por reação com CoA para formar ésteres de acil-CoA que é catalisado por acil-CoA sintetases de cadeia longa (LACS). A. thaliana contém 3 acil graxos tioesterasess que podem ser distinguidas com base na sua especificidade de cadeia de acil. FATA1 e FATA2 preferencialmente hidrolisam acil-ACPs insaturados, enquanto as cadeias acil-ACP saturadas são tipicamente clivadas por FATB.

[627] Para explorar o efeito sobre o teor de ácidos graxos totais, o toer de TAG e a composição de ácidos graxos da coexpressão de uma tioesterase e dos genes que codificam os polipeptídeos WRI1 e/ou DGAT,foram feitos genes quiméricos para cada uma das três tiosterases A. thaliana bpor inserção das regiões de codificação no vetor expressão binário pJP3343 para expressão transitória em células foliares de N. benthamiana do promotor de 35S. Regiões de codificação de proteína para a FATA1 de A. thaliana (N.° de Acessão NP_189147.1, SEQ ID NO:202) e FATA2 (N.° de Acessão NP_193041.1, SEQ ID NO:203) tioesterases foram amplificadas a partir de cDNA de silica utilizando iniciadores contendo sítios EcoRI e PstI e subsequentemente clonadas em pJP3343 utilizando os mesmos sítios de restrição. Os vetores expressão resultantes foram designados pOIL079 e pOIL080, respectivamente. A região de codificação de proteína do gene de A. thaliana FATB (N.° de Acessão NP_172327.1, SEQ ID NO: 204) foi amplificada utilizando os iniciadores contendo sítios de flanqueamento NotI e SacI e clonada nos sítios de restrição correspondentes de pJP3343, resultando em pOIL081. Os constructos pOIL079, pOIL080 e pOIL081 estão infiltrados em tecidos foliares de N. benthamiana, quer individualmente quer em combinação com constructos contendo os genes para os fatores de transcrição de WRI1 de A. thaliana (AtWRI1) (pJP3414) e/ou DGAT1 aciltransferase (AtDGAT1) (pJP3352). Para efeitos de comparação, os genes quiméricos que codificam Cocos nucifera FatB1 (CnFATB1) (pJP3630), C. nucifera FatB2 (CnFATB2) (pJP3629) foram introduzidos em tecidos foliares de N. benthamiana, em paralelo com as Arabidopsis tioesterases, para comparar o efeito dos polipeptídeos FatB possuindo especificidade MCFA para as Arabidopsis tioesterases que não têm especificidade MCFA. Todas as infiltrações incluíram um gene quimérico para a expressão do supressor de silenciamento p19, tal como descrito no Exemplo 1. O controlo negativo infiltrou apenas o T-DNA de p19.

[628] Foi observado um efeito sinérgico entre a expressão de tioesterase e a sobre-expressão de WRI1 e/ou DGAT em níveis de TAG em folhas de N. benthamiana. A expressão dos genes da tioesterase sem os genes WRI1 ou DGAT aumentou significativamente os níveis de TAG acima do nível baixo no controle negativo (p19 sozinho). Por exemplo, a expressão da FATB2 tioesterase de coco resultou em um aumento de 8,2 vezes nos níveis de TAG nas folhas em comparação com o controle negativo. A co-expressão do fator de transcrição de WRI1 de A. thaliana com cada uma das tioesterases ainda mais o aumento dos níveis de TAG em comparação com o controle AtWRI1. A co-expressão de cada uma das CnFATB1 e CnFATB2 tioesterases de coco com WRI1 resultou em níveis mais elevados de TAG do que cada uma das três A. thaliana tioesterases com WRI1. Curiosamente, foi observado o inverso quando a A. thaliana DGAT1 aciltransferase foi co-expressa em combinação com uma tioesterase e WRI1. Isto sugere uma melhor adequação na especificidade da cadeia de acil de A. thaliana tioesterases e A. thaliana DGAT1 aciltransferase, resultando em um maior fluxo de cadeias acil a partir de acil-ACP em TAG. As tioesterases não-MCFA também foram consideravelmente mais eficazes na elevação da percentagem de ácido oleico no teor de ácido graxo total nas folhas. A co-expressão de AtWRI1, AtDGAT1 e AtFATA2 resultou no maior nível de TAG nas folhas, proporcionando um nível que foi de 1,6 vezes maior do que quando AtWRI1 e AtDGAT1 foram co-expressas sem a tioesterase. Estas experiências confirmaram o aumento sinérgico na síntese e acumulação de óleo quando ambos WRI1 e DGAT foram co-expressos bem como mostrando o aumento sinérgico adicional obtido adicionando uma tioesterase à combinação.

[629] Três diferentes vetores expressão binário foram construídos de modo a testar o efeito da coexpressão de genes que codificam WRI1, DGAT1 e FATA sobre os níveis de TAG e composição de ácidos graxos em folhas de N. tabacum transformadas de forma estável. O vetor pOIL121 continha um gene SSU::AtWRI1 para a expressão de AtWRI1 a partir do promotor de SSU, um gene 35S::AtDGAT1 para expressão de AtDGAT a partir do promotor de 35S e um gene enTCUP2::AtFATA2 para expressão de AtFATA2 a partir do promotor de enTCUP2 que é um promotor constitutivo. Estes constructos genéticos foram obtidos a partir de pOIL38 primeiro por digestão do DNA com NotI para remover o gene que codifica S. indicum oleosina. A região de codificação de proteína do gene da FATA2 de A. thaliana FATA2 foi amplificada e flanqueada com sítios NotI usando DNA de pOIL80 como molde. Este fragmento foi então inserido no sítio NotI de pOIL38. O pOIL121 serviu então como um vetor progenitora para pOIL122 que continha uma cassete de RNA em gancho adicional enTCUP2::SDP1 para o silenciamento mediado por RNAi do gene endógeno SDP1 nas plantas transgênicas. Para fazer isso, toda a cassete em gancho de SDP1 de N. benthamiana foi isolada de pOIL51 (Exemplo 11) como um fragmento de SfoI-SmaI e clonada no sítio SfoI de pOIL121, produzindo pOIL122 (Figura 3). Um terceiro vetor, pOIL123, contendo os genes SSU::WRI1 e 35S::DGAT1 e o gene de RNA em gancho enTCUP2::SDP1 foi obtido de um modo semelhante por clonagem da cassete de RNA em gancho enTCUP2::SDP1 como um fragmento de SfoI-SmaI no sítio SfoI de pOIL36.

[630] Em resumo, os vetores contendo as combinações de genes: pOIL121: SSU::AtWRI1, 35S::AtDGAT1, enTCUP2::AtFATA2. pOIL122: SSU::AtWRI1, 35S::AtDGAT1, enTCUP2::AtFATA2, enTCUP2::SDP1 em hairpin. pOIL123: SSU::AtWRI1, 35S::AtDGAT1, enTCUP2::SDP1 em hairpin.

[631] Os três constructos foram cada um utilizados para produzir plantas de N. tabacum transformadas (cultivar WI38) por transformação mediada por Agrobacterium. A co-expressão da A. thaliana FATA2 tioesterase ou o silenciamento da lipase endógena SDP1 TAG em combinação com a expressão de AtWRI1 e AtDGAT1 cada resultou em níveis mais elevados de TAG em comparação com a expressão de AtWRI1 AtDGAT1 e na ausência de ambos os genes da tioesterase e o gene silenciador SDP1. Os maiores rendimentos de TAG foram obtidos utilizando pOIL122 pela ação combinada de todos os quatro genes quiméricos.

[632] Percebe-se que N. benthamiana é uma planta 18:3. Os mesmos constructos pOIL079, pOIL080 e pOIL081 são usados para transformar A. thaliana, uma planta 16:3.

[633] Os inventores conceberam o modelo de que o aumento da exportação de ácido graxo plastidial, tal como pelo aumento da atividade da acil graxo tioesterase, reduz a acumulação de acil-ACP nos plastídeos, aumentando assim a biossíntese de ácidos graxos como resultado da inibição de reação reduzida na acetil-CoA carboxilase (ACCase) (Andre et al., 2012; Moreno-Perez et al., 2012). A sobre-expressão de tioesterase aumenta a exportação de cadeias acil dos plastídeos para o ER, proporcionando assim uma ligação eficiente entre as chamadas estratégias de engenharia metabólica "Impulsionar" e "Retirar". Exemplo 9. Produção de ácido graxo de cadeia média nas células vegetativas

[634] Eccleston et al. (1996) estudou a acumulação de ácidos graxos C12:0 e C14:0 em ambas as sementes e folhas de plantas transgênicas de Brassica napus transformadas com um gene constitutivamente expresso que codifica Califórnia Bay Laurel 12:0-ACP tioesterase (Umbellularia californica). Esse estudo relatou que os níveis substanciais de C12:0 acumulado em sementes maduras de B. napus, mas apenas níveis muito baixos de C12:0 foram observados em tecido foliar, apesar de níveis elevados de expressão e atividade de 12:0-ACP tioesterase. Os mesmos resultados foram obtidos quando o gene foi transformado em A. thaliana (Voelker e col., 1992). Este estudo foi estendido pela co-expressão da LPAAT deCocos nucifera e Umbellularia californica tioesterase que resultou em um aumento da acumulação de um total de C12:0, bem como um aumento da fração de trilaurina nas sementes de B. napus (Knutzon et al., (1999). A técnica anterior indicou, portanto, que a síntese de ácidos graxos de cadeia média (MCFA) em células de plantas vegetais foi problemática.

[635] Para testar o efeito da introdução de tioesterases com especificidade para MCFA em combinação com outros genes aqui descritos, os DNAs quiméricos para expressar várias tioesterases diferentes foram sintetizados e introduzidos em células vegetais isoladamente ou em combinações. As regiões de codificação de proteínas para as tioesterases de organismos conhecidas por produzir MCFAs (Jing et al., 2011) foram sintetizadas e inseridas como fragmentos de EcoRI no vetor binário de pJP3343 que continha uma cassete de expressão do promotor de 35S-promotor (Vanhercke et al., 2013). As tioesterases eram: Cinnamomum camphora 14:0-ACP thioesterase (referiada como Cinca-TE) (Yuan et al., 1995; N.° de Acessão Q39473.1; SEQ ID NO: 193), Cocos nucifera acil-ACP tioesterase FatB1 (Cocnu-TE1; N.° de Acessão AEM72519.1 SEQ ID NO: 194), Cocos nucifera acil-ACP tioesterase FatB2 (Cocnu-TE2; N.° de Acessão AEM72520.1; SEQ ID NO: 195), Cocos nucifera acil-ACP tioesterase FatB3 (Cocnu-TE3; N.° de Acessão AEM72521.1; SEQ ID NO: 196), Cuphea lanceolata acil- (ACP) tioesterase tipo B (Cupla-TE) (Topfer et al., 1995; N.° de Acessão CAB60830.1; SEQ ID NO: 197), Cuphea viscosissima FatB1 (Cupvi-TE; N.° de Acessão AEM72522.1; SEQ ID NO: 198) e Umbellularia californica 12: 0- ACP tioesterase (Umbca-TE) (Voelker e col,. 1992; N.° de Acessão Q41635.1; SEQ ID NO: 199). Estas tioesterases estavam todas na classe FATB e tinham especificidade para MCFA. As regiões de codificação de proteínas para C. nucifera LPAAT (Cocnu-LPAAT, tipo MCFA) (Knutzon et al., 1995; N.° de Acessão Q42670.1; SEQ ID NO: 200) e LPAAT1 plastidial de A. thaliana (Arath-PLPAAT; N.° de Acessão AEE85783.1; SEQ ID NO: 201), foram também clonadas. O Coconut-LPAAT tinha anteriormente demonstrado aumentar a incorporação de MCFA na posição sn-2 de TAG em sementes (Knutzon et al., 1995), enquanto a LPAAT plastidial de A. thaliana (Arath-PLPAAT) (Kim et al., 2004) foi utilizado como um LPAAT de controle para determinar o efeito de qualquer especificidade de MCFA que o Cocnu-LPAAT possa ter. A antiga LPAAT usa acil-CoA como um substrato e opera no ER em seu contexto nativo, enquanto que a última PLPAAT usa acil-ACP como substrato e trabalha no plastídeo.

[636] Os genes de tioesterase foram introduzidos nas folhas de Nicotiana benthamiana por infiltração mediada por Agrobacteriumcomo descrito no Exemplo 1 juntamente com o gene para co-expressão do supressor de silenciamento p19 e ou Cocnu-LPAAT ou Arath-PLPAAT para determinar se o MCFA poderia ser produzido em tecido foliar de N. benthamiana. As zonas foliares infiltradas foram colhidas e liofilizadas cinco dias após a infiltração com as misturas de Agrobacterium, depois disso, se determinou o teor de ácidos graxos totais e a composição por GC como descrito no Exemplo 1 (Tabela 7). Para os dados apresentados na Tabela 7, os erros são o desvio padrão de infiltrações em triplicado. As zonas infiltradas das folhas de controle continham apenas vestígios (<0,1%) ou níveis zero de ácidos graxos C12:0 e C14:0 enquanto que C16:0 estava presente em 14,9%±0,6 do TFA nos lipídeos foliares totais Os níveis de C12:0 foram apenas aumentados significativamente pela expressão de Cocnu-TE3 (1.2%±0.1) e Umbca-TE (1.6%±0.1). A expressão de cada uma ds tioesterases testadas resultou na acumulação de C14:0 nas folhas de N. benthamiana, com Cinca-TE dando o nível mais elevado de 11,3%±1,0. Do mesmo modo, a expressão de cada uma das tioesterases com a exceção de Umbca-TE resultou no aumento de níveis de C16: 0. O nível mais elevado de acumulação de C16:0 (35,4%±4.7) foi observado com a expressão de Cocnu-TE1. Observou-se necrose substancial das zonas infiltradas nas folhas quando os genes de FATB foram expressos isoladamente, o que parece estar correlacionado com o nível de produção de MCFA. Os inventores consideraram que a necrose era provavelmente devida a níveis de ácidos graxos livres (FFA) superiores aos ideais, e também devido à acumulação extensiva de MCFA em pools de lipídeos de fosfolipídeos em vez de em TAG. Tabela 7. Composição de ácido graxo foliar total (% de ácido graxo foliar total) de ácidos graxos selecionados em folhas de Nicotiana benthamiana infiltradas com várias tioesterases (TE) e LPAATs. Os resultados são agrupados pelo gene coinfiltrado (genes únicos (diferentes de p19 presente em todas as amostras), Arath-LPAAT + vários TE, Cocnu-LPAAT + vários TE). 'Controle' significa folha de N. benthamianaenquanto que "p19 apenas" contém o gene supressor de silenciamento sozinho. 16:3 é 16:3Δ7,10,13; 18:3 é 18:3Δ9,12,15. As identidades do gene são definidas no texto.

[637]A coinfiltração do gene quimérico para expressar Arath-PLPAAT com as tioesterases tendeu a reduzir a acumulação de C12:0 e C14:0 em comparação com a ausência de LPAAT, enquanto que aumentava ligeiramente a acumulação de C16:0. Em contraste, a co-infiltração dos genes para expressar Cocnu-LPAAT ou Umbca-TE aumentou a acumulação de C12:0 para 3,3%±0,5 enquanto que C14:0 se acumulou para 14,9%±1,6 na amostra de Cinca-TE + Cocnu-LPAAT. Os maiores valores de C16:0 foram observados após coexpressão de Coconut-TEl e Coconut-LPAAT (40,2%±2,8). A adição de uma LPAAT para cada zona inoculada diminuiu o grau de necrose do tecido foliar. Surpreendentemente, foram também produzidos ácidos graxos C8:0 e C10:0 nas células vegetais nos estudos de expressão transitória. A acumulação de C8:0 e C10:0 não foi observada quando a tioesterase foi expressa sozinha. No entanto, quando a expressão de tioesterase foi combinada com a co-expressão de CuphoFatB com CnLPAAT e AtWRI1, verificou- se que C8:0 estava presente em uma concentração de 0,27 ± 0,09% do teor total de ácido graxo nas células vegetais. De forma semelhante, quando CuplaFatB foi co-expressa com CnLPAAT e AtWRI1, verificou-se que C10:0 estava presente a 0,54 ± 0,16% do teor de ácidos graxos totais.

[638] Estes resultados indicaram que as especificidades de acil anteriormente relatadas das tioesterases, observadas a partir da expressão da semente, foram essencialmente mantidas nas folhas de N. benthamiana e que este sistema de expressão era um sistema válido para testar a especificidade de acil. A adição da PLPAAT plastidial de A. thaliana não aumentou a acumulação de MCFA, embora tenha resultado em uma acumulação ligeiramente aumentada de C16:0 nas células de A. thaliana. Em contraste, a LPAAT de C. nucifera aumentou a acumulação de C12:0, C14:0 e C16:0 em folhas de N. benthamiana, nas quais ácidos graxos são encontrados em óleo de C. nucifera (Laureles et al., 2002). Isso indicou que a LPAAT nativa de N. benthamiana ou não foi altamente expressa em tecido foliar ou não tinha elevada atividade em substratos C12:0, C14:0 e C16:0. Produção de ácidos graxos de cadeia média em células vegetativas de plantas que acumulam elevados níveis de TAG

[639] Os inventores obtiveram anteriormente a produção de TAG a 15% em folhas de N. tabacum pela expressão coordenada de genes quiméricos que codificam A. thaliana WRI1, A. thaliana DGAT1 e S. indicum Oleosina (Vanhercke et al., 2014). Para testar se a acumulação de MCFA que foi observada após a expressão de tioesterases em combinação com uma LPAAT também ocorreria ou aumentaria em células vegetais que produzem níveis elevados de TAG (Vanhercke et al. 2013), estes genes foram coexpressos. As mais eficazes combinações de tioesterase/LPAAT C12:0, C14:0 e C16:0 (Cocnu-LPAAT mais Umbca-TE, Cinca-TE e Cocot-TE2 tioesterases, respectivamente) foram infiltradas com e sem as combinações de Arath-WRI1 + DGAT previamente descrito (Vanhercke et al., 2013). Os dados são mostrados na Figura 4.

[640]A acumulação de MCFA relevante (C12:0 para Umbca- TE, C14:0 para Cinca-TE e C16:0 para Cocnu-TE2) foi consistentemente e substancialmente aumentada pela adição de Arath-WRIl às combinações: C12:0 compreendeu 9,5%±0,9 ode ácidos graxos foliares totais nas amostras Umbca-TE + Cocnu- LPAAT + Arath-WRIl, o nível C14:0 foi de 18,5%±2,6 nas amostras de Cinca-TE+Cocnu-LPAAT+Arath-WRIl e o nível de C16:0 foi de 38,3%±3,0 nas amostras de Cocnu-TE2+Cocnu- LPAAT+Arath-WRI1. Verificou-se que as infiltrações de tioesterase mais Arath-WRI1 têm um efeito significativamente maior sobre C12:0 na presença de Umbca-TE, C14: 0 na presença de Cinca-TE e C16: 0 na presença de Cocnu-TE2 em relação à infiltração com tioesterase mais Cocnu-LPAAT na ausência de WRI1 (Figura 5). A adição de Cocnu-LPAAT às misturas de tioesterase mais Arath-WRI1 teve um efeito sobre a composição de ácidos graxos com aumentos relativamente pequenos de C12:0 e C14:0 observados nos conjuntos de Umbca-TE e Cinca-TE e uma pequena diminuição em C16:0 no conjunto Cocnu-TE2. Os níveis máximos observados foram: 8,8%±1.1 de C12:0 em ácidos graxos foliares totais observado nas amostras Umbca-TE + Arath-WRI1 + Cocnu-LPAAT, 14,1%±3,5 de C14:0 nas amostras de Cinca-TE + Arath-WRI1 + Cocnu-LPAAT e 48,6%±3,7 de C16:0 na amostra de Cocnu-TE2 + Arath-WRI1.

[641] Interessantemente, a única tioesterase em que o Arath-WRI1 não aumentou a acumulação de MCFA foi a Cocnu-TE2, embora tenha ainda aumentado significativamente. A adição deste gene sozinho resultou no aumento da acumulação de C16:0 de 16,0%±0,4 a 37,3%±0,6 enquanto que a adição de mais Arath- WRI1 só aumentou para 48,6%±1,7. Isto pode ter sido devido aos intermediários C12:0 e C14:0 serem relativamente transitórios durante a síntese de ácido graxo plastidial em comparação com C16:0.

[642] Outros efeitos que foram observados incluíram o aumento nos níveis de C16:0 e C18:1Δ9 e a diminuição nos níveis de C18:3Δ9,12,15, na presença de Arath-WRI1. A adição a mais de Cinca-TE e Cocnu-TE2 diminuiu os níveis de C18:3Δ9,12,15 ainda mais. Em contraste, o C12:0 adicional produzido após a adição de Arath-WRI1 a Umbca-TE pareceu vir ao custo de C16: 0 em vez de C18:3Δ9,12,15 adicional (Figura 5).

[643] Um subconjunto das amostras também foi analisado por LC-MS para obter uma melhor compreensão da acumulação deMCFA. Galactolipídeos plastidiais de monogalactosil diacilglicerol (MGDG) e digalactosil diacilglicerol (DGDG) continham apenas níveis baixos de C12:0 e C14:0 e níveis reduzidos de C16:0 em relação à infiltração de controle de p19. As principais espécies de MGDG contendo C12:0 nas amostras de Umbca-TE eram de 30:3 indicando que um C18:3 e um C12:0 foram colocalizados no na cadeia principal de monogalactosil. A outra espécie principal de MGDG contendo C12:0 foi de 28:0, indicando que o segundo ácido graxo era C16:0. As principais espécies de MGDG contendo C14:0 nas amostras de Cinca-TE foram 28:0 e 30:0, indicando que uma proporção significativa de C14:0 na MGDG era di-C14:0 ou com C16:0. As espécies MGDG contendo C12:0 e contendo C14:0 não foram detectadas na amostra de controle de p19. Em contraste, as espécies de MGDG contendo C16:0 tendiam a ser reduzidas nas amostras de Coconut-TE2. As principais espécies de MGDG nas amostras de tipo selvagem (34:6 contendo C16:3, 34:6 contendo C18:3 e 36:6 com C18:3) tendiam a ser reduzidas pela expressão dos transgenes. Esta redução foi maior na presença da combinação WRI + DGAT.

[644]Apenas os níveis de vestígios de espécies DGDG contendo C12:0 foram observados nas amostras de Umbca-TE. As principais espécies contendo C14:0 observadas nas amostras de Cinca-TE foram 28:0 e 30:0, ambas ausentes no controle. Estas espécies também foram observadas em níveis elevados nas amostras de Coconut-TE2, mas apenas em níveis vestigais nas amostras de Umbc-TE. As principais espécies de DGDG nas amostras de tipo selvagem (34:3 contendo C16:0, 34:3 contendo C18:3 e 36:6 com C18:3) tendiam a ser reduzidas pela expressão dos transgenes. Esta redução foi maior na presença de WRI.

[645] Do mesmo modo, as espécies de TAG aumentaram consideravelmente em todas as amostras contendo WRI + DGAT como anteriormente descrito (Vanhercke et al., 2013). Descobriu-se que spécies de C12:0 eram dominantes na amostra de Umbca-TE de elevado TAG, C14:0 na amostra de Cinca-TE de TAG elevado e C16:0 na amostra de Cocnu-TE2 de TAG elevada. A análise por LC-MS da fração de TAG mostrou que a 36:0 contendo C12:0 era a espécie de TAG dominante, o dobro do nível de espécies de TAG contendo C18:3, em todas as amostras de Umbca-TE contendo o fator de transcrição de WRI. De modo semelhante, a 42:0 que continha C14:0 era a espécie de TAG dominante nas amostras Cinca-TE co-transformadas com LPAAT, DGAT, WRI ou WRI + DGAT, embora a resposta fosse consideravelmente mais elevada no caso das amostras contendo WRI. Várias espécies de TAG contendo C16:0 eram significativamente elevadas em ambas as amostras de TAG elevado Cinca-TE (por exemplo 44:0 e 50:3) e Cocnu-TE2 (por exemplo, 46:0, 48:0, 50:2 e 50:3). Novamente, os maiores aumentos de C16:0 foram observados na presença de WRI. Transformação estável para a produção de MCFA em tecidos vegetativos.

[646] Fez-se uma série de constructos genéticos em um vetor binário para transformar de forma estável plantas tais como tabaco com combinações de genes para produção de MCFA em tecidos vegetativos, para identificar combinações ideais de genes. Estas constructos incluíram um gene para a expressão de WRI1 sob o controle do promotor de SSU (ver Exemplo 8, pOIL121) ou o promotor de SAG12 específico para a senescência, um gene que codifica uma DGAT de óleo de palma (abaixo), um gene que codifica a LPAAT de coco CocnuLPAAT, ver acima) sob o controle de um promotor de enTCUP e de vários genes que expressam uma variedade de acil graxo tioesterases (FATB) expressas quer a partir de um promotor de 35S ou de um promotor de SAG12. Estas são descritas abaixo Clonagem de um gene que codifica Elaeis guineensis (óleo de palma) DGAT

[647] De forma a testar em primeiro lugar enzimas DGAT diferentes, incluindo enzimas DGAT1, DGAT2 e DGAT3 representativas, foram identificadas sequências candidatas de DGAT de óleo de palma a partir do transcriptoma publicado (Dussert et al. 2013) e códons otimizados para a expressão em Nicotiana tabacum. As regiões de codificação de proteínas foram então clonadas individualmente em vetores expressão binários sob o controle do promotor de 35S para teste em células transientes em ensaios de folhas de N. benthamiana como descrito no Exemplo 1. As combinações de genes testadas foram como se segue: 1 P19 (controle negativo) 2 P19+CnLPAAT+WRI1 3 P19+CnLPAAT+AtWRI1+AtDGAT1 4 P19+CnLPAAT+AtWRI1+EgDGAT1 5 P19+CnLPAAT+AtWRI1+EgDGAT2 6 P19+CnLPAAT+AtWRI1+EgDGAT3 7 P19+CincaFatB 8 P19+CincaFatB+CnLPAAT+WRI1 9 P19+CincaFatB+CnLPAAT+AtWRI1+AtDGAT1 10 P19+CincaFatB+CnLPAAT+AtWRI1+EgDGAT1 11 P19+CincaFatB+CnLPAAT+AtWRI1+EgDGAT2 12 P19+CincaFatB+CnLPAAT+AtWRI1+EgDGAT3

[648] Os resultados para os níveis de TFA e TAG e os níveis de MCFA total nos teores de TFA ou TAG são apresentados na Figura 6. Comparado com AtDGAT1, a expressão de EGDGAT1 levou a uma maior acumulação de ácidos graxos totais e níveis de TAG aumentados. O teor de MCFA total no teor de ácidos graxos totais foi reduzido com a expressão de EgDGAT1 em relação a AtDGAT1, mas os níveis de MCFA presentes no TAG permaneceram aproximadamente iguais (Figura 6).

Preparação de constructos genéticos

[649] Os constructos genéticos para transformação estável (Tabela 8) foram montados através da inserção sequencial de cassetes de genes através da utilização de sítios de enzimas de restrição compatíveis. Os constructos de quatro genes (Tabela 8) continham um gene codificando a DGAT1 do óleo de palma (EgDGAT1) expressa a partir do promotor de 35S, um gene codificando a LPAAT de C. nucifera LPAAT (CnLPAAT) expresso a partir do promotor constitutivo enTCUP2, e um gene codificando AtWRI1 expresso quer a partir do promotor SSU ou do promotor SAG12 em adição a uma de uma série de genes que codificam enzimas FATB.

[650] Os constructos de cinco genes também continham um gene para a expressão de um RNA em hairpin para reduzir a expressão de um gene endógeno que codifica a enzima ativadora de acil (AAE). O hairpin foi construído com base na semelhança de sequência com o AAE15 identificado a partir de Arabidopsis lyrata (EFH44575.1) e o genoma de N. benthamiana. Foi demonstrado que a AAE está envolvida na reativação de MCFA e, consequentemente, no alongamento adicional. Considerou-se que o silenciamento de AAE pode aumentar a acumulação de MCFA. A cassete em hairpin foi construída no vetor pKANNIBAL e depois subclonada no vetor expressão pWBVec2 (Wang et al., 2004), com a expressão do hairpin a ser conduzida pelo promotor de 35S. Tabela 8. Resumo de construções genéticas montadas.

[651] Estes constructos genéticos foram utilizados para produzir plantas de tabaco transformadas de cultivares Wisconsin 38 e uma linhagens de óleo elevada transformada com o T-DNA de pJP3502. Observou-se que as plantas transformadas com os constructos FATB de gene único expressas a partir do promotor de 35S eram significativamente menores do que as transformadas com o constructo FATB correspondente expresso a partir do promotor SAG12 ou a partir dos constructos de quatro genes. Considerou-se que o tamanho de planta menor era causado por um acúmulo de MCFA que não foi incorporado eficientemente em TAG.

Discussão

[652] O presente estudo descobriu que a produção de C12:0 em células foliares foi apenas cerca de 1,6% do teor de ácidos graxos totais após a expressão de Umbca-TE sozinha (Tabela 7). A adição de um gene para a expressão de Arath-WRI teve um efeito muito mais forte na acumulação de C12:0 e C14:0 no tecido foliar do que a adição de LPAAT de coco (Figuras 4 e 5). Isto indicou que WRI1 em combinação com a tioesterase aumentou grandemente a acumulação de MCFA em células vegetais agindo sinergicamente. Importantemente, a maior parte de C12:0, C14:0 e C16:0 foi encontrado acumulando-se nas folhas em TAG, cujo lipídeo não se acumula em níveis substanciais em folhas de tipo selvagem. Estas experiências mostraram que as células nas partes vegetativas das plantas poderiam ser modificadas para produzir MCFA, especialmente C12:0 e C14:0 no TAG em níveis elevados. Os níveis de C16:0 também aumentaram substancialmente.

[653]Exemplo 10. O efeito de diferentes polipeptídeos de fatorde transcrição na acumulação de TAG

[654] Experiências anteriormente relatadas com WRI1 e DGAT (Vanhercke et al., 2013) usaram um gene sintético que codifica A. thaliana AtWRI1 (N.° de Acessão AAP80382.1) e um gene sintético que codifica AtDGAT1, também de A. thaliana (N.° de Acessão AAF19262; SEQ ID NO: 1). Para comparar outros polipeptídeos de WRI com AtWRI1 para a sua capacidade de combinar com DGAT para aumentar o teor de óleo, foram identificadas outras sequências de codificação de WRI e utilizadas para gerar constructos para expressão em folhas de N. benthamiana. As sequências de nucleotídeos que codificam a A. thaliana WRI3 (N.° de Acessão AAM91814.1, SEQ ID NO:205) e WRI4 (N.° de Acessão. NP_178088.2, SEQ ID NO: 206) fatores de transcrição (To et al,. 2012) foram sintetizadas e inseridas como fragmentos de EcoRI em pJP3343 sob o controle do promotor de 35S. Os vectores de expressão binários resultantes foram designados pOIL027 e pOIL028, respectivamente. A sequência de codificação para a WRI1 de aveia (Avena sativa)(AsWRI1, SEQ ID NO: 207) foi amplificada por PCR a partir de um vetor fornecido pelo Prof. Sten Stymne (Universidade Sueca de Ciências Agrícolas), utilizando iniciadores de flanqueamento contendo sítios EcoRI adicionais. O fragmento amplificado foi inserido em pJP3343 resultando em pOIL055. Uma sequência de WRI1 candidata de S. bicolor (N.° de Acessão XP_002450194.1, SEQ ID NO: 208) foi identificada por uma pesquisa BLASTp no servidor NCBI usando a sequência de aminoácidos de WRI1 de Zea mays (N.° de Acessão NP_001137064.1, SEQ ID NO: 209) como consulta. A região de codificação de proteína do gene S. bicolor WRI1 (SbWRI1) foi sintetizada e inserida como um fragmento de EcoRI em pJP3343, produzindo pOIL056. Um gene candidato que codifica uma WRI1 foi identificado a partir do transcriptoma de sebo chinês (Triadica sebifera; TsWRI1, SEQ ID NO:. 210) (Uday et al, enviado). A região codificante da proteína foi sintetizada e inserida como um fragmento de EcoRI em pJP3343 resultando em pOIL070. Os vetores binários pJP3414 e pJP3352 contendo as sequências de codificação para expressão dos polipeptídeos WRI1 e DGAT1 de A. thaliana foram descritos por Vanhercke et al. (2013).

[655] Os plasmídeos contendo as diferentes sequências de codificação de WRI foram introduzidos no tecido foliar de N. benthamiana para a expressão transiente utilizando um gene que codifica a proteína supressora viral p19 em todas as inoculações, tal como descrito no Exemplo 1. Os genes que codificam os polipeptídeos de WRI foram testados sozinhos ou em combinação com o gene da aciltransferase DGAT1, este último para fornecer uma maior biossíntese e acumulação de TAG. O controle positivo nesta experiência foi a combinação de genes que codificam o fator de transcrição de WRI1 de A. thaliana e AtDGAT1. Todas as infiltrações foram feitas em triplicado utilizando três plantas diferentes e os níveis de TAG foram analisados como descrito no Exemplo 1. A expressão da maior parte dos polipeptídeos WRI individuais na ausência de DGAT1 adicionada exogenamente resultou em níveis de TAG aumentados, ainda que baixos (<0,23% em relação ao peso seco) em manchas foliares infiltradas, em comparação com o controle que tinha apenas o constructo p19 (Figura 7). A exceção foi TsWRI1 que, por si só, não parece aumentar significativamente os níveis de TAG. Além disso, as diferenças nos níveis de TAG produzido por expressão dos diferentes fatores de transcrição de WRI por conta própria não eram boas. Ambas AsWRI1 e SbWRI1 produziram níveis de TAG semelhantes a AtWRI1 por conta própria. A análise da composição de ácidos graxos TAG revelou apenas pequenas alterações, para níveis aumentados de C18:1Δ9 a partir da expressão de AtWRI3 nos tecidos foliares infiltrados (Tabela 9). Tabela 9. A composição de ácido graxo TAG em amostras de folhas de N. benthamiana infiltrado com diferentes genes quiméricos para expressão de WRI (n = 3). Todas as amostras foram infiltradas com o constructo P19 também. As amostras de TAG também continham 0,1-0,4% de C14:0; 0,5-1,2% de C16:3 e; 0,1-0,7% de C18:1Δ11.

[656] Em contraste, as diferenças nos rendimentos de TAG a partir da expressão dos diferentes polipeptídeos de WRI foram mais pronunciadas após co-expressão com a AtDGAT1 aciltransferase. Isto novamente demonstrou o efeito sinérgico da coexpressão de WRI1 e DGAT na biossíntese de TAG em tecidos foliares infiltrados deN. benthamiana como relatado por Vanhercke et al. (2013). Os níveis de TAG intermediários foram observados após co-expressão de DGAT1 com vetores expressão AtWRI3, AtWRI4 e TsWRI1 enquanto que os níveis obtidos com AsWRI1 e AtWRI1 foram significativamente menores. Em um resultado que não poderia ter sido previamente previsto, os maiores rendimentos de TAG foram obtidos com coexpressão de DGAT com SbWRI1, embora o ensaio fosse feito em células dicotiledôneas. A análise da composição do ácido graxo TAG revelou níveis de C18:1A9 e níveis reduzidos de C18:3A9,12,15 (ALA) no caso de SbWRIl, AsWRIl e do controle positivo de AtWRI1 (Tabela 9). Ao contrário de AtWRI1, no entanto, a expressão de AsWRI1 e SbWRI1 ambos exibiram níveis de C16:0 aumentados em comparação com o controle negativo p19. Curiosamente, as amostras de folhas infiltradas com AtWRI3 exibiram um perfil de TAG com C18:1A9 sendo enriquecido enquanto C16:0 e ALA foram apenas ligeiramente afetados.

[657] Esta experiência mostrou que o fator de transcrição S. bicolor WRI1, SbWRI1, foi superior ao AtWRI1 quando coexpressa com DGAT para aumentar os níveis de TAG em partes vegetativas das plantas. Os inventores também concluíram que um fator de transcrição, por exemplo um WRI1, de uma planta monocotiledônea poderia funcionar bem em uma célula de planta dicotiledônea, de fato poderia mesmo ter uma atividade superior em comparação com um fator de transcrição correspondente de uma planta dicotiledônea. Do mesmo modo, um fator de transcrição de uma planta dicotiledônea poderia funcionar bem em uma célula de planta monocotiledônea. Uso de outros fatores de transcrição

[658] Os constructos genéticos foram preparados para a expressão de cada um dos 14 fatores de transcrição diferentes em células de plantas para testar a sua capacidade de funcionar para aumentar os níveis de TAG em combinação com outros genes envolvidos na biossíntese e acumulação de TAG. Estes factores de transcrição foram candidatos como alternativas para WRI1 ou para adição a combinações incluindo um ou mais dos fatores de transcrição de WRI1, LEC1 e LEC2 para utilização em células de plantas, particularmente em partes vegetativas da planta. A sua seleção baseou-se largamente no seu envolvimento relatado na embriogênese (revisto em Baud e Lepiniec (2010) e Ikeda et al. (2006)), semelhante a LEC2. As experiências foram realizadas, por conseguinte, para testar a função, utilizando o sistema de expressão de N. benthamiana (Exemplo 1), como se segue.

[659]As sequências de nucleotídeos das regiões de codificação de proteínas dos seguintes fatores de transcrição foram otimizadas por códon para expressão em N. benthamiana e N. tabacum, sintentizadas e subclonadas como fragmentos de NotI-SacI nos sítios respectivos de pJP3343: A. thaliana FUS3 (pOIL164) (Luerssen et al., 1998; Número de Acessão AAC35247; SEQ ID NO: 160), A. thaliana LEC1L (pOIL165) (Kwong et al. 2003; Número de Acessão AAN15924; SEQ ID NO: 157), A. thaliana LEC1 (pOIL166) (Lotan et al., 1998; Número de Acessão AAC39488; SEQ ID NO: 149), G. max MYB73 (pOIL167) (Liu et al., 2014; Número de Acessão ABH02868; SEQ ID NO: 221), A. thaliana bZIP53 (pOIL168) (Alonso et al., 2009; Número de Acessão AAM14360; SEQ ID NO: 222), A. thaliana AGL15 (pOIL169) (Zheng et al., 2009; Número de Acessão NP_196883; SEQ ID NO: 223), A. thaliana MYB118 (Número de Acessão AAS58517; pOIL170; SEQ ID NO: 224), MYB115 (Wang et al,. 2002; Número de Acessão AAS10103; pOIL171; SEQ ID NO: 225), A. thaliana TANMEI (pOIL172) (Yamagishi et al., 2005; Número de Acessão BAE44475; SEQ ID NO: 226), A. thaliana WUS (pOIL173) (Laux et al., 1996; Número de Acessão NP_565429; SEQ ID NO: 227), A. thaliana BBM (pOIL174) (Boutilier et al., 2002; Número de Acessão AAM33893, SEQ ID NO: 145), B. napus GFR2a1 (Número de Acessão AFB74090; pOIL177; SEQ ID NO: 228) e GFR2a2 (Número de Acessão AFB74089; pOIL178; SEQ ID NO: 229) (Liu et al. (2012c)). Além disso, uma versão otimizada por códon do fator de transcrição de PHR1 A. thaliana envolvido na adaptação a condições de inanição fosfatada elevada foi subclonado de forma semelhante em pJP3343 (pOIL189) (Nilsson et al. (2012), Número de Acessão AAN72198; SEQ ID NO:230). Estes fatores de transcrição estão resumidos na Tabela 10.

[660] Como um ensaio de rastreio para determinar a função destes fatores de transcrição, os constructos genéticos são introduzidos em células foliares de N. benthamiana como descrito no Exemplo 1, com ou sem um gene que codifica DGAT1, ou outras combinações de genes, tais como de codificação de WRI1, LEC2, hpSDP1 ou FATA tioesterase, e mede-se o teor total de lipídeos e a composição de ácidos graxos das células foliares. Os fatores de transcrição que aumentaram significativamente o teor total de lipídeos são identificados e selecionados.

[661] Para a transformação estável de plantas usando genes que codificam os fatores de transcrição alternativos, os seguintes constructos binários são feitos. Os genes para a expressão dos fatores de transcrição utilizam ou o promotor de SSU ou o promotor de SAG12. A expressão excessiva de fatores de transcrição embriogênicos, tais como LEC1 e LEC2 demonstrou induzir uma variedade de efeitos pleotrópicos, indesejáveis no presente contexto, incluindo a embriogênese somática (Feeney et al. (2012); Santos-Mendoza et al. (2005); Stone et al. (2008); Stone et al. (2001); Shen et al. (2010)). Para minimizar o possível impacto negativo sobre o desenvolvimento da planta e o rendimento da biomassa, os promotores específicos do tecido ou do estágio de desenvolvimento são preferidos aos promotores constitutivos para conduzir a expressão ectópica dos reguladores principais da embriogênese. Tabela 10. Fatores de transcrição adicionais e os constructos genéticos para a sua expressão

Exemplo 11. Silenciamento de uma TAG lipase em plantas acumulando altos níveis de TAG no tecido foliar

[662]A TAG lipase dependente de açúcar 1 (SDP1) demonstrou desempenhar um papel na movimentação de TAG em tecidos não semente de A. thaliana as well as during seed germination (Eastmond et al., 2006; Kelly et al., 2011; Kelly et al., 2013). A SDP1 é expressa em sementes em desenvolvimento e o polipeptídeo de SDP1 está também presente em sementes maduras em associação com (mas não revestindo) corpos oleosos. O silenciamento do gene que codifica SDP1 resultou em um aumento pequeno, mas significativo nos níveis de TAG em raízes e caules de A. thaliana (< 0,4% em uma base de peso seco) enquanto que um aumento ainda menor foi observado no tecido foliar (Kelly et al., 2013).

[663] Para determinar se os níveis de TAG poderiam ser aumentados mais em tecidos foliares e de caule relativamente à coexpressão de AtWRI1 e AtDGAT1, foi concebido um experimento para silenciar um gene endógeno de SDP1 em plantas N. tabacum que eram homozigóticas para um T-DNA possuindo genes para expressão transgênica dos polipeptídeos WRI, DGAT1 e Oleosina (Vanhercke et al., 2014). Uma pesquisa BLAST do transcriptoma de N. benthamiana (Naim et al., 2012) usando a sequência de nucleotídeos de AtSDP1 como consulta identificou um transcrito (Nbv5tr6385200, SEQ ID NO: 173) com homologia com o gene de A. thaliana SDP1. Foi selecionada uma região de 713 pb (SEQ ID NO:174) para o silenciamento de genes mediado por hairpin. Foi concebido um fragmento sintético de 3,903 kb, com base no vetor pHELLSGATE12, que compreende, por ordem, o promotor constitutivo de enTCUP2, o fragmento de 713bp de N. benthamiana SDP1 na orientação dos sentidos, flanqueada pelos sítios attB1 e attB2, um íntron Pdk, uma sequência de íntron cat em orientação reversa, um segundo fragmento de 713bp de N. benthamiana SDP1 flanqueada pelos sítios de attB1 e attB2 sites em orientação reversa (antissenso), e o sítio de terminação/poliadenilação da região OCS 3' (Figura 8). A inserção foi subclonada em pJP3303 usando sítios de restrição SmaI e KasI e o vetor expressão resultante foi designado pOIL051. Este DNA quimérico contém um gene marcador selecionável por resistência à higromicina.

[664] O POIL051 foi utilizado para produzir plantas transformadas de N. tabacum por transformação mediada de Agrobacterium. As células vegetais de partida eram de plantas transgênicas que eram homozigóticas para o T-DNA de pJP3502 (Vanhercke et al., 2014). As plantas transgênicas que contêm o T-DNA de pOIL051 foram selecionadas por resistência à higromicina e transferidas para o solo na estufa ou em um gabinete de ambiente controlado para crescimento contínuo. As amostras foliares foram colhidas a partir de transformantes duplos confirmados (plantas T0) antes da floração, na floração e nas fases de desenvolvimento das sementes, e o nível de TAG em cada uma delas determinada. Plantas transgênicas contendo apenas baixos níveis de TAG foliar ou TAG no mesmo nível que os controles foram identificadas por meio de extração de lipídeos de amostras foliares e análise por mancha de TLC e descartadas. Os níveis de TAG na população restante de transformantes foram quantificados por GC como descrito no Exemplo 1. Antes da floração, a maioria destas plantas exibia níveis de TAG significativamente maiores (> 5% em peso seco de folhas) em seu tecido foliar enquanto que 4 plantas continham níveis de TAG acima de 10% (Tabela 11). O nível máximo de TAG observado nas folhas destas plantas, antes da floração, foi de 11,3% na planta 5113. Como comparação, as plantas transgênicas da linhagens progenitora de N. tabacum AtWRI1, AtDGAT1 e Oleosin apresentaram níveis de TAG de cerca de 2% antes da floração e cerca de 6% durante a floração (Vanhercke et al., 2014). A adição do constructo inibidor de SDP1 à combinação AtWRI1 mais AtDGAT1 foi, portanto, sinérgica para aumentar os níveis de TAG nestas plantas. Surpreendentemente, o teor de TAG nas folhas colhidas a partir das plantas duplamente transformadas na fase de floração foi grandemente aumentado, observando 30,5% em peso seco (Tabela 12), representando um aumento de 5 vezes em relação às plantas não silenciadas para SDP1. Para grande espanto dos inventores, o nível de TAG atingiu um surpreendente 70,7% (% em peso seco) em amostras de folhas de senescência (verdes e amarelas) na fase de semeaduras (Tabela 13). Quando a NMR foi usada para medir o teor de óleo de folhas inteiras das plantas de tabaco no estágio de semeadura, o teor de TAG em algumas folhas verdes que haviam iniciado a senescência era de cerca de 43% e em algumas folhas marrons dessecadas era de 42%. Quando essas folhas foram prensadas entre dois filtros de papel marrons, o óleo exsudado embebeu-se no papel e tornou-o translúcido, enquanto que as folhas de tabaco de controle não o fizeram, fornecendo um método de rastreio simples para detectar plantas com elevado teor de óleo.

[665]Analisaram-se dois transformantes primários (# 61, # 69) contendo cada um dos T-DNAs de pJP3502 e pOIL51 e apresentando níveis elevados de TAG por PCR digital (ddPCR) utilizando um par de iniciadores específicos de gene de higromicina para determinar o número de inserções de T-DNA de pOIL51. A planta designada # 61 continha uma inserção de T- DNA de pOIL51, enquanto que a planta # 69 continha três inserções de T-DNA de pOIL51. As plantas descendentes T1 de ambas as linhagens foram novamente rastreadas por ddPCR para identificar plantas homozigóticas, heterozigóticas e nulas. As plantas descendentes da planta # 61 que não continham inserções de pOIL51 (nulos, total de 7) ou 2 inserções de T- DNA (isto é, homozigóticas para esse T-DNA, total de 12) foram selecionadas para análise posterior. De forma semelhante, as plantas descendentes da linhagens # 69 contendo zero inserções de T-DNA de pOIL51 (nulos, total de 2) ou 2 inserções deste tipo (total de 15) ou 4 ou 5 inserções (total de 5) foram mantidas para análise posterior. Tabela 11. Os níveis de TAG (% em peso seco de folhas) e a composição de ácidos graxo TAG no tecido foliar de plantas de N. tabacum (geração T0) expressando transgenes de WRI1, DGAT1 e Oleosina e supertransformado com um T-DNA codificando um constructo em hairpin de SDP1 (pOIL051), em comparação com o tipo selvagem (não transformado). As amostras de folhas foram colhidas durante a fase vegetativa (antes da floração) As amostras de lipídeos também continham 0,0-0,2 % de C16:3, 0,0-0,4% de C20 :1; 0,0 -0,1% de C20:2 n-6.

Tabela 12. Os níveis de TAG (% em peso seco de folhas) e a composição de TAG no tecido foliar de plantas de N. tabacum (geração T0) expressando transgenes de WRI1, DGAT1 e Oleosina e supertransformado com um T-DNA codificando um constructo em hairpin de SDP1 (pOIL051),. As amostras de folhas foram colhidas durante a floração.

Tabela 13. Os níveis de TAG (% em peso seco de folhas) e a composição de TAG no tecido foliar de plantas de N. tabacum (geração T0) expressando transgenes de WRI1, DGAT1 e Oleosina e supertransformado com um T-DNA codificando um constructo em hairpin de SDP1 (pOIL051),. Amostras de folhas foram colhidas na fase de fixação das sementes. Y = folha amarela, G = folha verde.

[666]As plantas T1 selecionadas foram cultivadas na estufa ao mesmo tempo e nas mesmas condições que as plantas de controle. As amostras de tecido foliar verde das plantas T1 antes da floração foram secas e os teores de ácido graxo total (TFA) e TAG foram determinados por análise GC. Os teores de TFA das plantas que continham ambos T-DNAs variavam entre 4,6% e 16,1% em peso seco, incluindo os níveis de TAG nas mesmas folhas de 1,2% a 11,8% em peso seco (Figura 9). Isto foi muito maior em comparação com as plantas contendo apenas o T-DNA de pJP3502 e cultivo ao longo das mesmas condições e análises no mesmo estágio de cultivo, mostrando novamente o sinergismo entre a redução da atividade da TAG lipase e da combinação WRI1 mais DGAT. Plantas contendo apenas o T-DNA de pJP3502 continham entre 4,2% e 6,8% de TFA incluindo níveis de TAG de 1,4% a 4,1% em peso seco (Figura 9). As plantas de tipo selvagem continham, em média, cerca de 0,8% de TFA incluindo menos de 0,5% de TAG em uma base de peso seco. A composição de ácidos graxos no teor de ácidos graxos totais e o teor de TAG das folhas de cada uma das linhagens # 61 e # 69 foram semelhantes à composição em folhas contendo apenas o T-DNA de pJP3502 (progenitora). Em comparação com as folhas de controle de tipo selvagem, as plantas que continham ambos os T-DNA de pOIL51 e pJP3502 exibiram níveis aumentados de ácidos graxos C16:0, C18:1 e C18:2. Esta mudança significativa na composição de ácidos graxos veio em grande parte à custa de C18:3 que foi reduzida de cerca de 50-55% a cerca de 20-30% como uma percentagem do teor total de ácidos graxos.

[667] O aumento substancial dos níveis de TFA incluindo os níveis de TAG entre as plantas contendo apenas o T-DNA de pJP3502 e as plantas que contêm os T-DNA de pOIL51 e pJP3502 foi mantido ao longo do desenvolvimento da planta. As plantas de controle contendo apenas o T-DNA de pJP3502 continham 7,7% a 17,5% de TAG durante a floração enquanto que os níveis de TAG variaram de 14,1% a 20,7% em uma base de peso seco durante a semeadura. O teor de TAG em folhas de plantas contendo T-DNA pJP3502 e pOIL51 variou entre 6,3% e 23,3% durante a floração e 12,6% e 33,6% durante a semeadura. Alterações semelhantes na composição de ácidos graxos da fração de TAG em ambos os estágios foram detectadas como descrito anteriormente para o estágio de crescimento vegetativo.

[668]Verificou-se também que os níveis de TAG aumentaram ainda mais em outros tecidos vegetativos das plantas transgênicas, tais como raízes e caule. Alguns tecidos da raiz das plantas transgênicas de N. tabacum transformados com o T-DNA de pOIL051 continham 4,4% de TAG, e alguns tecidos do caule 7,4% de TAG, em uma base de peso seco (Figura 10). Plantas de tipo selvagem e N. tabacum contendo apenas o T-DNA de pJP3502 exibiram níveis muito mais baixos de TAG em ambos os tecidos. A adição do constructo de SDP1 em hairpin para diminuir a expressão da TAG lipase endógena foi claramente sinérgica com os genes que codificam o fator de transcrição e biossíntese de TAG (WRI1 e DGAT) para aumentar o conteúdo de TAG nos caules e raízes. De notar que os níveis de TAG nas raízes foram mais baixos em comparação com o tecido de caule dentro da mesma planta, enquanto uma tendência inversa foi observada em plantas de tipo selvagem e N. tabacum contendo apenas o T-DNA de pJP3502. A composição de TAG de tecidos radiculares e de caule apresentou alterações semelhantes nos ácidos graxos C18:1 e C18:3, como observado anteriormente no tecido foliar transgênico. Os níveis de C18:2 em TAG foram reduzidos em tecido de caule transgênico enquanto que os ácidos graxos C16 foram tipicamente reduzidos em tecidos radiculares transgênicos quando comparados com o controle de tipo selvagem.

[669] Por conseguinte, os inventores concluíram que a adição de um gene exógeno para silenciar o gene SDP1 endógeno à combinação de WRI1 e DGAT aumentou o teor de ácidos graxos totais, incluindo o teor de TAG, em todos os estágio do crescimento da planta, e agiram sinergicamente com WRI1 e DGAT, particularmente nos caules e raízes. Sementes T1 das plantas transgênicas foram plaqueadas em meio de cultura de tecidos in vitro à temperatura ambiente para testar a extensão e o momento da germinação. A germinação da semente T1 a partir de três linhagens transformadas independentemente foi a mesma em comparação com a semente das plantas transgênicas transformadas com o T-DNA de pJP3502. Além disso, o vigor das mudas precoce pareceu não ser afetado. Isto foi surpreendente dado o papel de SDP1 em germinação em sementes de A. thaliana e os defeitos observados em germinação em mutantes de SDP1 mutantes (Eastmond et al. 2006). Para superar quaisquer defeitos de germinação se tal tivesse ocorrido, é concebida um segundo constructo na qual o RNA inibidor de SDP1 é expresso a partir de um promotor que não é essencialmente expresso, ou em níveis baixos, em sementes, tal como, por exemplo, um promotor de um gene fotossintético, tais como SSU. Os inventores consideram que é benéfico reduzir o risco de efeitos deletérios na germinação das sementes ou no vigor das mudas precoces para evitar um promotor constitutivo, ou pelo menos evitar um promotor expresso nas sementes, para conduzir a expressão do RNA inibidor da SDP1.

[670] Observou-se que as plantas T0 com os níveis de TAG mais elevados tinham sido cultivadas sob condições de luz elevada na sala de ambiente controlado (500 micro mols de intensidade de luz, luz por 16 horas/26oC-escuro por 8 horas/18oC ciclo de um dia) e pareceram menores (cerca de 70% em altura em relação às plantas transformadas com o T-DNA de pJP3502) do que as plantas de controle de tipo selvagem. Os inventores concluíram que a combinação de transgenes e/ou modificações genéticas para as abordagens "impulsionar", "retirar", "proteger" e "empacotar" foi particularmente favorável para alcançar níveis elevados de TAG em partes vegetativas de plantas. Neste exemplo, a WRI1 forneceu o "impulso", a DGAT forneceu a "retirada", o silenciamento de SDP1 forneceu a "proteção" e a oleosina forneceu o "empacotamento" de TAG. Exemplo 12. A expressão específica de senescência de um fator de transcrição

[671]A expressão ectópica de reguladores mestres do desenvolvimento de embriões e de sementes como LEC2 tem sido relatada como aumentando os níveis de TAG em tecidos não semente (Santos-Mendoza et al. 2005; Slocombe et al., 2009; Andrianov et al., 2010). Contudo, a sobre-expressão constitutiva de LEC2 em plantas transformadas com um gene 35S-LEC2 resultou em efeitos pleiotrópicos indesejados no desenvolvimento e morfologia de plantas, incluindo embriogênese somática e estruturas foliares anormais (Stone et al. 2001; Santos-Mendoza et al., (2005). Para testar se a limitação da expressão de LEC2 ao estágio de senescência foliar do desenvolvimento da planta, isto é, depois de as plantas terem crescido completamente e atingido a sua biomassa completa, minimizaria os efeitos fenotípicos indesejáveis, mas ainda aumentaria os níveis de lipídeos das folhas, foi concebido um DNA quimérico e feito para expressão de LEC2 sob o controle de um promotor específico de senesência de A. thaliana do gene SAG12 (U37336; Gan e Amasino, 1995).

[672] Para fazer o constructo genético, fez-se um fragmento de DNA sintético de 3,635 kb compreendendo, em ordem, um promotor específico de senescência de A. thaliana SAG12, a sequência de codificação da proteína LEC2 e uma região de terminador/poliadenilação de gena da Lectina de Glycine max. Este fragmento foi inserido entre os sítios de restrição SacI e NotI de pJP3303. Este constructo foi designado pOIL049 e testado em folhas de plantas de N. tabacum que foram transformados de forma estável com genes que codificam os polipeptídeos WRI1, DGAT1 e Oleosina, contendo o T-DNA de pJP3502. Usando métodos de trasnformação mediada por Agrobacterium,o constructo pOIL049 foi utilizado para transformar as células vegetais de N. tabacum que eram homozigóticas para o T-DNA de pJP3502 (Exemplo 3). As plantas transgênicas compreendendo os genes de pOIL049 foram selecionadas por resistência à higromicina e foram cultivadas até à maturidade na estufa. As amostras são retiradas do tecido foliar transgênico em diferentes fases de crescimento, incluindo na senescência foliar e contêm níveis de TAG aumentados em comparação com a linhagens progenitora de N. tabacum pJP3502.

[673] Foi obtido um total de 149 plantas T0 independentes (isto é, transformantes primárias). As folhas superiores verdes de todas as plantas e as folhas mais baixas, marrons, totalmente senescentes de eventos selecionados foram amostradas no estágio de semeadura do desenvolvimento da planta e os teores de TAG foram quantificados por TLC-GC. O número de inserções de T-DNA de pOIL49 em plantas selecionadas foi determinado por ddPCR utilizando um par de iniciadores específicos do gene de higromicina. Um nível de TAG de 30,2% em uma base de peso seco foi observado em tecido de folha verde colhido na fase de semeadura. Os níveis de TAG nas folhas marrons foram menores na maioria das plantas amostradas. No entanto, três plantas (# 32b, # 8b e # 23c) apresentaram maiores níveis de TAG no tecido foliar marrom senescente do que nas folhas verdes em expansão. Estas plantas continham 1, 2 ou 3 inserções de T-DNA de pOIL49.

[674]A descendência T1 das plantas # 23c e # 32b foi rastreada por ddPCR para identificar plantas nulas, heterozigotas e homozigóticas para o T-DNA de pOIL049. As plantas descendentes da planta # 23c contendo zero inserções de T-DNA de pOIL049 (nulos, total de 7) ou duas inserções de T-DNA do T-DNA de pOIL049 (homozigóticas, total de 4) foram selecionadas para análise posterior. De forma semelhante, as plantas descendentes da planta # 32b contendo zero inserções (nulas, total de 6) ou duas inserções (homozigóticas, total de 9) foram mantidas para análise posterior. O tecido foliar verde foi amostrado antes da floração e os teores de TFA e TAG foram determinados por GC. As plantas de tipo selvagem e as plantas transformadas com o T-DNA de pJP3502 eram as mesmas que antes (Exemplo 11) e foram cultivadas ao lado na mesma estufa. Os níveis de TFA nas folhas dos transformantes contendo o T-DNA de pOIL049 variaram de 5,2% a 19,5% em peso seco antes da floração (Figura 12). Os níveis de TAG nas mesmas tecidos variaram de 0,8% a 15,4% em uma base de peso seco. Isto foi consideravelmente maior do que em plantas contendo apenas o T-DNA de pJP3502. Os níveis de TAG em plantas contendo os T-DNA de pJP3502 e pOIL049 aumentaram ainda mais para 38,5% e 34,9% durante a floração e a semeadura, respectivamente. Quando se analisou a composição de ácido graxo do teor de ácidos graxos totais para as folhas homozigóticas para o T-DNA de pOIL049, observaram-se níveis aumentados de C18:2 e níveis reduzidos de C18:3 (Figura 12) enquanto que as percentagens de C16:0 e C18:1 permaneceram aproximadamente o mesmo em relação às folhas transformadas apenas com o T-DNA de pJP3502. Estes dados demonstraram que a adição de um segundo gene do fator de transcrição sob o controle de um promotor não constitutivo para fornecer uma expressão regulada pelo desenvolvimento foi capaz de aumentar ainda mais os níveis de TAG nos tecidos vegetativos de uma planta. Os dados também indicaram que o promotor específico da senescência SAG12 tinha alguma expressão no tecido verde antes da senescência das folhas.

[675] Os níveis de TAG eram muito mais elevados no tecido de caule quando comparados com as plantas de N. tabacum de tipo selvagem e plantas transgênicas contendo o T-DNA de pJP3502 sozinho. Alguns tecidos do caule de plantas transgênicas de N. tabacum transformadas com o T-DNA de pOIL049 continham 4,9% de TAG em uma base de peso seco (Figura 11). Por outro lado, os teores de TAG no tecido radicular apresentaram grande variação entre as três plantas pOIL049 com algum teor de raízes contendo TAG a 3,4%. De notar que os níveis de TAG nas raízes foram mais baixos em comparação com o tecido de caule dentro da mesma planta, enquanto uma tendência inversa foi observada em plantas de tipo selvagem e N. tabacum contendo apenas o T-DNA de pJP3502. A composição de TAG de tecidos radiculares e de caule apresentou alterações semelhantes nos ácidos graxos C18:1 e C18:3, como observado anteriormente no tecido foliar transgênico. Os níveis de C18:2 em TAG foram reduzidos em tecido de caule transgênico enquanto que os ácidos graxos C16 foram tipicamente reduzidos em tecidos radiculares transgênicos quando comparados com o controle de tipo selvagem.

[676] Os constructos genéticos correspondentes são feitos codificando outros fatores de transcrição sob o controle do promotor SAG12, nomeadamente LEC1, tipo LEC1, FUS3, ABI3, ABI4 e ABI5 e outros (Exemplo 10). Por exemplo, foram feitos constructos adicionais para a expressão do fator de transcrição da monocotiledônea Zea mays LEC1 (Shen et al., 2010) ou Sorghum bicolor LEC1 (N.° de Acessão Genbank XM_002452582.1) sob o controle do homólogo derivado de monocotiledônea do promotor de SAG12 de A. thaliana, tal como o promotor de SEE1 do milho (Robson et al., 2004). Outros constructos são feitos para a expressão dos fatores de transcrição sob promotores controlados pelo desenvolvimento, por exemplo que são preferencialmente expressos na floração (por exemplo, promotores sensíveis à duração de um dia), promotores de fitocromo, promotores de croptocromo ou em caules de plantas durante o crescimento secundário, tal como um promotor de um gene CesA gene. Esses constructos são utilizados para transformar plantas e são selecionadas plantas que produzem pelo menos 8% de TAG em partes vegetativas. Níveis de amido e açúcar

[677] Os níveis de amido e de açúcar solúveis foram medidos em tecido foliar amostrado a partir de plantas do tipo selvagem e transgênicas contendo o T-DNA de pJP3502 ou os T-DNAs de pJP3502 e pOIL51 ou pJP3502 e pOIL049. Em geral, foi encontrada uma correlação inversa entre o TAG e os níveis de amido no tecido foliar em uma base de peso seco nas folhas tendo ambos os T-DNAs (Figura 13). Em contraste, os níveis de açúcares solúveis em folhas eram aproximadamente iguais nas plantas transgênicas em relação ao tipo selvagem, sugerindo que não havia obstáculo significativo na conversão de açúcares para TAG. Um efeito da posição foliar na planta foi observado em plantas de tipo selvagem onde os níveis de amido tenderam a aumentar desde a posição inferior da folha inferior até a posição mais alta. Nenhum efeito deste tipo foi detectado nas plantas transgênicas. Exemplo 13. Expressão específica de caule de um gene que codifica um fator de transcrição

[678] Folhas de plantas de N. tabacum que expressam transgenes que codificam WRI1, DGAT e Oleosina contêm cerca de 16% de TAG no estágio de semeadura de desenvolvimento. No entanto, os níveis de TAG foram muito menores nos caules (1%) e raízes (1,4%) das plantas (Vanhercke et al., 2014). Os inventores consideraram se os níveis mais baixos de TAG em caules e raízes eram devidos a uma atividade promotora fraca do promotor de Rubisco SSU utilizado para expressar o gene que codifica WRI1 nas plantas transgênicas. O transgene DGAT no T-DNA de pJP3502 foi expresso pelo promotor de CaMV35S que é expresso mais fortemente em caules e raízes e portanto era pouco provável que fosse o fator limitante para a acumulação de TAG em caules e raízes.

[679] Em uma tentativa de aumentar a biossíntese de TAG no tecido de caule, foi concebido um constructo em que o gene que codifica WRI1 foi colocado sob o controle de um promotor de SDP1 de A. thaliana. Um fragmento de DNA sintético de 3,156 kb foi sintetizado compreendendo 1,5 kb do promotor de SDP1 de A. thaliana SDP1 (SEQ ID NO: 175) (Kelly et al., 2013), seguida da região de codificação para o polipeptídeo de WRI1 de A. thaliana e a região de temrinador/poliadenilação de lectina de G. max. Este fragmento foi inserido entre os sítios SacI e NotI de pJP3303. O vetor resultante foi designado pOIL050, que foi então utilizado para transformar células a partir das plantas de N. tabacum homozigótica para o T-DNA de pJP3502 por transformação mediada por Agrobacterium. As plantas transgênicas foram selecionadas para resistência à higromicina e um total de 86 plantas transgênicas independentes cresceram até à maturidade na estufa. As amostras foram retiradas de tecido foliar e de caule transgênicos no estágio de semeadura e continham níveis de TAG aumentados comparados com as plantas descendentes de N. tabacum transformadas com pJP3502. Exemplo 14. Aumentando o teor de óleo nas sementes

[680]Vários grupos relataram o aumento dos níveis de TAG no tecido da semente de milho, canola ou Arabidopsis thaliana mediante a sobre-expressão de genes individuais que codificam WRI1 e DGAT1 (Shen et al., (2010), Liu et al. 2010; Weselake et al., 2008; Jako et al., 2001; revisto em Liu et al., 2012). Recentemente, van Erp et al. (2014) exploraram o efeito da co-expressão de WRI1 e DGAT1 no teor de óleo de sementes em A. thaliana. Os níveis absolutos de TAG aumentaram de 38% no controle de tipo selvagem e de vetor vazio para 44% nas linhagens transgênicas. O silenciamento da SDP1 TAG lipase em combinação com sobre-expressão de WRI1 e DGAT1 aumentou ainda mais os níveis de TAG até 45%. De notar que, enquanto se verificou que o peso médio das sementes era aumentado, o número de sementes por planta era mais baixo em comparação com as plantas de controle.

[681] Um fragmento de DNA sintético de cerca de 14,3 kb de comprimento e contendo as estruturas de leitura abertas que codificam os polipeptídeos de MGAT2 de M. musculus, DGAT1 de A. thaliana, WRI1 de A. thaliana e GPAT4 de A. thaliana sob o controle dos promotores específicos de sementes de genes que codificam FAE1, Conlinin1 e Conlinin2 foram sintetizados e inseridos como um fragmento de Not I-PstI em pJP3416. O vetor resultante foi designado pTV55 (Figura 14). Uma série de vetores rivados foram construídos a partir de pTV55 por remoção sequencial de cassetes de expressão individuais, cada etapa utilizando digestão com enzimas de restrição seguida por autoligação. A cassete GPAT4 foi eliminada por digestão PacI, resultando em pTV56. A digestão subsequente com SrfI removeu a cassete de expressão de MGAT2, produzindo pTV57. A cassete de WRI1 foi excluída usando sítios de restrição de flanqueamento SbfI, resultando em pTV58. Finalmente, a cassete de DGAT1 em pTV58 foi trocada pela cassete de WRI1 por digestão com SrfI e PacI, seguida por tratamento com T4 e DNA polimerase e ligação. A cassete de WRI1 foi excisada de pTV57 usando SbfI e tratada com T4 polimerase. A ligação da cassete de WRI de extremidade cega no pTV58 digerido por SrfI - PacI produziu pTV59. Cada vetor continha o gene e35S (contendo região potenciadora dupla)::PAT como gene marcador selecionável, fornecendo resistência a BASTA.

[682] Em resumo, os constructos continham as seguintes combinações de genes: pTV55: ProCnl1::MGAT2 + ProCnl2::DGAT1 + ProCnl1::GPAT4 + ProFAE1::WRI1; pTV56: ProCnl1::MGAT2 + ProCnl2::DGAT1 + ProFAE1::WRI1; pTV57: ProCnl2::DGAT1 + ProFAE1::WRI1; pTV58; ProCnl2::DGAT1; pTV59: ProFAE1::WRI1.

[683] Os constructos de pTV55 - pTV59 foram introduzidos separadamente na cepa de A. tumefaciens AGL1 e usados para transformar C. sativa (cv. Celine) por um método de imersão floral adaptado de Liu et al (2012). Resumidamente, os botões de flores recém-abertos foram imergidos em solução de A. tumefaciens por 15 s, envoltos em filme plástico e deixados durante a noite no escuro a 24oC e depois o plástico foi removido. Um total de 3-4 imersões florais foram realizadas com base na qualidade das flores disponíveis. As plantas foram cultivadas até à maturidade e sementes de T1 foram colhidas. Após germinação da semente T1 no solo, as mudas T1 estabelecidas (7-10 dias) foram pulverizadas com herbicida BASTA a 0,1% (250 g/L de glufosinato de amônio, Bayer Crop Science Pty Ltd, VIC Austrália) para selecionar plantas que expressam o marcador selecionável de PAT. As mudas sobreviventes foram separadas e transferidas para vasos de solo fresco e cultivadas até à maturidade na estufa a 22+1oC (dia) e 18+1oC (noite). As sementes T2 foram colhidas e o teor de óleo (que é pelo menos 95% TAG) de 3 lotes independentes de 50 mg de semente de cada linhagens foi medido por NMR (MQC, Oxford Instruments). As amostras de calibração foram preparadas com papéis de Kimwipes secos contendo quantidades conhecidas de óleo de semente de C. sativa em tubos de ensaio de NMR de 10 mm de diâmetro, para gerar um intervalo de teor de óleo com base nos pesos de papel e óleo. As amostras de calibração foram vedadas com parafilme e mantidas a 40oC em bloco de aquecimento mínimo por uma hora antes de usar para permitir que o óleo se distribuísse uniformemente no tecido. As amostras de calibração foram medidas três vezes com um ímã de 0,55 Tesla e uma sonda de 10 mm de diâmetro operando a uma frequência de ressonância de prótons de 23,4 MHz durante 16 segundos. A temperatura do ímã foi mantida a 40oC. As amostras de sementes foram primeiro secas em um forno a 105oC durante a noite para assegurar que o teor de umidade fosse inferior a 5%. As amostras foram, subsequentemente, pesadas, transferidas para um tubo de vidro de diâmetro de 10 mm e incubadas a 40oC durante 1 hora antes da análise por NMR. O teor de óleo foi medido em triplicado por NMR contra a calibragem, com base no peso da massa.

[684] O número de cópias do(s) T-DNA(s) inserido(s) em cada linhagens transformada foi determinado por PCR digital (dPCR). O DNA genômico foi digerido em primeiro lugar com EcoRI e BamHI para assegurar a separação física de T-DNA no caso de inserções múltiplas. O gene de C. sativa LEAFY (lfy) foi escolhido como gene de referência e o marcador selecionável, como o gene alvo em uma reação multiplex dPCR. As sondas foram marcadas com HEX (gene de referência) ou FAM (gene alvo). As condições da reação de amplificação foram como se segue: 95oC por 10 minutos (aumentando 2,5oC/s), 39 ciclos de 94oC por 30 s (aumentando 2,5oC/s) e 61oC durante 1 min (aumentando 2,5oC/s), 98oC durante 10 min. Após amplificação por PCR, a fluorescência de gotículas individuais foi medida em um leitor de gotículas QX100 (BioRad) e o número de cópias foi calculado utilizando o software QuantaSoft (versão 1.3.2.0, BioRad).

[685]A transformação de C. sativa produziu vários fenômenos transgênicos que apresentem níveis aumentados de TAG na segregação de sementes T2 em comparação com o controle não transformada de tipo selvagem (Figura 15). Interessantemente, os níveis mais elevados de TAG foram obtidos com pTV57 que contém os genes que codificam para WRI1 e DGAT1. A inserção adicional de MGAT2 (pTV56) e MGAT2 + GPAT4 (pTV55) resultou em níveis de TAG ligeiramente mais baixos em comparação com pTV55. A determinação do número de cópias revelou 1 ou 2 inserções de T-DNA para as linhagens pTV57 apresentando o segundo maior e o maior teor de óleo de semente, respectivamente (Tabela 14).

[686] Plantas T2 homozigóticas transformadas com o T-DNA de pTV057 também foram cruzadas com plantas de C. sativa transformadas com genes para a expressão das dessaturases e elongases de ácidos graxos necessárias para a síntese e acumulação de DHA em sementes (WO2013/185184). As sementes F1 apresentaram um aumento do teor de óleo, medido por NMR, comparadas com as sementes de C. sativa transformadas com o constructo de DHA e sem o T-DNA de pTV57. O teor de DHA nas sementes é determinado medindo os níveis de DHA na fração de TAG em comparação com o DHA da planta descendente de C. sativa. O teor de DHA total das sementes (mg DHA/g de sementes) contendo ambos os T-DNAs está aumentado em relação ao teor de DHA total das sementes contendo apenas o constructo de DHA. Tabela 14. Teor de óleo (%) nas sementes T2 e número de cópia (por PCR digital) de eventos transgênicos de pTV57 de C. sativa.

Exemplo 15. Efeito da expressão da proteína do corpo oleoso na acumulação e movimentação de TAG

[687] Plantas N. tabacum transformada com o T-DNA de pJP3502 e expressando transgenes que codificam WRI1 de A. thaliana, DGAT1 e Oleosina de S. indicum tinham níveis de TAG aumentados nos tecidos vegetativos. Como mostrado no Exemplo 11 acima, quando o gene endógeno que codifica SDP1 TAG lipase foi silenciado nessas plantas, os níveis de TAG foliar aumentou adicionalmente, o que indicou aos inventores que a movimentação substancial de TAG estava ocorrendo nas plantas que retinham a atividade de SDP1. Por isso, foi determinado o nível de expressão de transgenes em plantas. Enquanto a transferência de hibridação Northern confirmou uma expressão forte de WRI1 e DGAT1 e alguma expressão de mRNA de oleosina, a análise de expressão por PCR digital e qRT-PCR detectou apenas níveis muito baixos de transcritos de oleosina. A análise de expressão revelou que o gene que codifica a oleosina foi mal expresso em comparação com os transgenes WRI1 e DGAT1. A partir destas experiências, os inventores concluíram que os corpos oleosos no tecido foliar não estavam completamente protegidos da degradação de TAG devido à produção inadequada de proteína Oleosina quando codificada pelo T-DNA em pJP3502. Para melhorar a acumulação estável de TAG ao longo do desenvolvimento da planta, foram concebidas várias modificações de pJP3502 nas quais o gene de Oleosina foi substituído. Esses constructos foram modificados como se segue. 1. O pJP3502 contém um gene (SEQ ID NO: 176 fornece a sequência do seu complemento) que codifica a oleosina de S. indicum que foi fracamente expressa. Esse gene tem um íntron UBQ10 interno que pode estar reduzindo o nível de expressão. Para testar isto, um fragmento de DNA sintético 502bp contendo o gene de oleosina de S. indicum e sem o íntron UBQ10 interno foi sintetizado e inserido como um fragmento de pJP3502 NotI, para substituir o gene de oleosina contendo o íntron em pJP3502. O plasmídeo resultante foi designado pOIL040. 2. O promotor da subunidade pequena de Rubisco (SSU) que dirige a expressão do gene da oleosina em pJP3502 foi substituído pelo promotor de enTCUP2 constitutivo. Para este fim, um fragmento de 2321 pb contendo o promotor enTCUP2, a região de codificação da proteína Oleosina, a região de terminador/poliadenilação de lectina deG. max e os primeiros 643 pb do promotor de SSU a jusante que conduzem a uma expressão de wri1 foi sintetizado e subclonado nos sítios AscI e SpeI de pJP3502 resultando em pOIL038. 3. Uma estratégia semelhante foi seguida para a expressão de uma versão de engenharia do gene da oleosina de S. indicum contendo 6 resíduos de cisteína introduzidos (o3-3) sob o controle do promotor de enTCUP2 (Winichayakul et al., 2013). Um fragmento de 2298 pb contendo o promotor de enTCUP2, a região de codificação da proteína Oleosina o3-3, a região de terminador/poliadenilação de lectina de G. max e os primeiros 643 pb do promotor de SSU a jusante que conduzem a expressão de wri1 foi sintetizado e subclonado nos sítios de AscI e SpeI de pJP3502 resultando em pOIL037. 4. Os sítios NotI que flanqueiam o gene da olesoina de S. indicum de pJP3502 foram utilizados para trocar a região de codificação de proteína por uma codificação de Oleosina 3 de amendoim (N ° de Acesso AAU21501.1) (Parthibane et al., 2012a; Parthibane et al., 2012b). Um fragmento de 528bp contendo o gene de oleosin3 do gene, flanqueado por sítios NotI, foi sintetizado e subclonado para o respectivo sítio de pJP3502. O vetor resultante foi designado pOIL041. 5. Da mesma forma, um fragmento de 1077bp NotI flanqueado contendo o gene que codifica para a esteroleosina de A. thaliana (Arab-1) (N° de Acesso AAM10215.1) (Jolivet et al., 2014) foi sintetizado e subclonado no sítio NotI de pJP3502, resultando em pOIL043. 6. A proteína da superfície de gotícula lipídica Nannochloropsis oceanic (LDSP) (N.° de Acessão AFB75402.1) (VIELER et al., 2012) foi sintetizada como um fragmento de 504bp não flanqueado por NotI e subclonado no síto NotI de pJP3502, produzindo pOIL044. 7. Finalmente, a caleosina de A. thaliana (CLO3) (N.° de Acessão O22788.1) (Shimada et al., 2014) foi sintetizada como um fragmento flanqueado de 612bp NotI e subclonado em pJP3502, resultando em pOIL042.

[688] Cada um destes constructos foi introduzido em células foliares de N. benthamiana como descrito no Exemplo 1. A expressão transiente de ambos pJP3502 e pOIL040 no tecido foliar de N. benthamiana resultou em níveis elevados de TAG e mudanças similares no perfil de ácidos graxos TAG, mas o pOIL040 aumentou mais o nível de TAG (1,3% em comparação com 0,9%). Cada um dos constructos de pOIL037, pOIL038, pOIL041, pOIL042 e pOIL043 foram usados para transformar de forma estável plantas de N. tabacum (cultivar W38) por métodos mediados por Agrobacterium. As plantas transgênicas foram selecionadas na base para resistência à canamicina e cultivadas até a maturidade na estufa. As amostras são retiradas do tecido foliar transgênico em diferentes fases durante o desenvolvimento da planta e contêm níveis aumentados de TAG em comparação com a N. tabacum de tipo selvagem e plantas N. tabacum transformadas com pJP3502. Clonagem e caracterização de polipeptídeos LDAP de Sapium sebifera

[689]As oleosinas não são altamente expressas em tecidos de plantas que não acumulam óleo de semente, como o mesocarpo de azeitona, palmeira e abacate (Murphy, 2012). Em vez disso, foram identificadas proteínas associadas a gotículas lipídicas (LDAP) nestes tecidos que podem desempenhar um papel semelhante ao da oleosina em tecidos de sementes (Horn et al., 2013). Os inventores consideraram, portanto, que a oleosina pode não ser a proteína de empacotamento ideal para proteger o óleo acumulado da TAG lipase ou outras atividades enzimáticas citosólicas em tecidos vegetativos de plantas. Por conseguinte, foram identificados polipeptídeos LDAP e avaliados para a potencialização de acumulação de TAG, como se segue.

[690] O fruto da árvore de sebo chinês, Sapium sebifera, um membro da família Euphorbiaceae, foi de particular interesse para os inventores, uma vez que contém um tecido rico em óleo fora da semente. Um estudo recente (Divi et al, enviaram para publicação) indicou que este tecido oleoginoso, chamado de camada de sebo, pode ser derivado do mesocarpo do seu fruto. Portanto, os inventores consultaram o transcriptoma de S. sebifera para sequências de LDAP. Uma análise comparativa dos genes expressos nos tecidos de casca de frutos e de sementes revelou um grupo de três genes LDAP anteriormente não identificados que foram altamente expressos na camada de sebo.

[691]As sequências de nucleotídeos que codificam os três LDAP foram obtidas por RT-PCR utilizando RNAs derivados de tecido de sebo utilizando três pares de iniciadores. As sequências de iniciadores foram baseadas nas sequências de DNA que flanqueiam toda a região de codificação de cada um dos três genes. As sequências de iniciadores eram: para LDAP1, 5’-TTTTAACGATATCCGCTAAAGG-3’ (SEQ ID NO: 245) e 5’- AATGAATGAACAAGAATTAAGTC-3’ (SEQ ID NO: 246) AT-3’; LDAP2, 5’- CTTTTCTCACACCGTATCTCCG-3’ (SEQ ID NO: 247) e 5’-AGCATGATATA CTTGTCGAGAAAGC-3’ (SEQ ID NO: 248); LDAP3, 5’- GCGACAGTGTAGCGTTTT-3’ (SEQ ID NO: 249) e 5’- ATACATAAAATGAAAACTATTGTGC-3’ (SEQ ID NO: 250).

[692]A análise do transcriptoma de S. sebifera revelou vários ortólogos para cada um dos genes LDAP, incluindo oito LDAP1, seis LDAP2 e seis genes LDAP3, com menos de 10% de divergência de sequências dentro de cada família de genes. As sequências de peptídeos putativas foram alinhagensdas e uma árvore filogenética foi construída usando o software Genious (Figura 16), juntamente com homólogos de LDAPs de outras espécies de plantas, incluindo dois de abacate (Pam), um de óleo de palma, um de Parthenium argentatum (Par), dois de Arabidopsis(Ath), cinco de Taraxacum brevicorniculatum (Tbr), três de Hevea brasiliensis (Hbr), como apresentado na Figura 16. A árvore filogenética revelou que o SsLDAP3 partilhou maior identidade de sequência de aminoácidos com os polipeptídeos LDAP1 e LDAP2 de abacate e o LDAP de óleo de palma, enquanto que os polipeptídeos SsLDAP1 e SsLDAP2 eram mais divergentes. Construtos genéticos para a sobre-expressão de LDAP

[693]A fim de testar a função dos LDAPs de S. sebifera, vetores expressão foram feitos para expressar cada um destes polipeptídeos, sob o controle do promotor de 35S nas células foliares. As sequências de cDNA de SsLDAP de comprimento total foram inseridas no vetor destino pDONR207 por reações de recombinação, substituindo as regiões CcdB e Cm (R) do vetor destino pelos fragmentos de cDNA de SsLDAP. Após a confirmação por análise de digestão de restrição e sequenciação de DNA, os constructos foram introduzidos na cepa de Agrobacterium tumefaciens AGL1 e utilizados tanto para a expressão transitória em células foliares de N. benthamiana quanto para transformação estável de N. tabacum.

[694]A expressão de cada um dos três genes de SsLDAP sob o controle transcricional do promotor de 35S nas folhas de N. benthamiana em combinação com a expressão de 35S::AtDGAT1 e 35S::AtWRI1 produziu níveis substancialmente mais elevados de acumulação de TAG em relação às células infiltradas com 35S::AtDGAT1 e genes de 35S: AtWRI1 sem o constructo de LDAP. O nível de TAG foi aumentado cerca de 2 vezes acima do nível de TAG nas células de controle. Um aumento significativo no nível de aácido linolênico (ALA) e um nível reduzido de ácidos graxos saturados foi observado nas células que receberam a combinação de genes, em relação às células de controle. Co-localização de polipeptídeos LDAP fundidos com YFP com gotículas lipídicas em células foliares.

[695]A fim de caracterizar SsLDAPs in vivo e observar o seu comportamento dinâmico, constructos de expressão foram feitos para expressão dos polipeptídeos de fusão que consistem nos polipeptídeos LDAP fundidos à proteína fluorescente amarela (YFP). Para cada polipeptídeo de fusão, a YFP foi fundida em estrutura com o C-terminal da SsLDAP. A estrutura de leitura aberta completa de cada um dos três genes de LDAP sem um códon de terminação, na sua extremidade 3', foi fundida com a sequência de YFP e os genes quiméricos foram inseridos em pDONR207. Após a confirmação dos constructos resultantes por análise de digestão de restrição e sequenciação de DNA, os constructos foram introduzidos na cepa de A. tumefaciens AGL1 e utilizados tanto para a expressão transitória em células foliares de N. benthamiana quanto para transformação estável de N. tabacum. Três dias após a infiltração das células foliares com os constructos LDAP-YFP, os discos foliares das zonas infiltradas foram corados com Vermelho Nilo, que coraram positivamente gotículas lipídicas, e observados sob um microscópio confocal para detectar tanto a mancha vermelha (gotículas lipídicas) como fluorescência a partir do polipeptídeo de YFP. Observou-se a colocalização de LDAP-YFP com as gotículas lipídicas, indicando que o LDAP se associou às gotículas lipídicas nas células foliares. Exemplo 16. Modificação de ácidos graxos em diferentes pools de lipídeos nas folhas que acumulam altos níveis de TAG

[696] Os inventores descrevem a produção de níveis aumentados de TAG em folhas de N. tabacum por coexpressão de transgenes que codificam WRI1 de A. thaliana, DGAT 1 de A. thaliana e Oleosina de S. indicum (Vanhercke et al, 2014). Para explorar se as modificações de ácido graxo em diferentes pools de lipídeos que existem nas folhas eram possíveis com a co-expressão da combinação do gene de WRI1 e DGAT1, as experiências de expressão transiente foram realizadas para ver se os ácidos graxos nos pools de acil-CoA e acil-PC poderiam ocorrer. Em uma experiência, a expressão de um transgene que codifica A. thaliana ácido graxo alongase (AtFae1) que alonga C18: 1-CoA em C20: 1-CoA foi combinada com os genes que codificam WRI1 e DGAT para testar modificação na pool de acil-CoA. Em uma segunda experiência, um transgene que codifica A. thaliana ácido graxo desaturase 2 (AtFAD2) que dessaturou C18:1-PC para C18:2-PC foi combinado com os genes WRI1 e DGAT para testar a modificação no pool de PC. Estas experiências foram concebidas para testar a disponibilidade dos substratos de acil na ER das células foliares.

[697] O gene que codifica AtFAE1 foi expresso a partir de um promotor de CaMV35S em folhas de N. benthamiana separadamente ou em combinação com WRI1 e DGAT1 como descrito no Exemplo 1, em triplicado. Amostras de folhas foram recolhidas 5 dias depois da infiltração com as células de Agrobacterium que compreendem diferentes combinações de genes. O lipídeo total foi extraído das amostras de folhas e a fração de TAG foi separada de cada uma por TLC. A composição de ácidos graxos de cada fração de TAG foi determinada e quantificada com GC utilizando uma quantidade conhecida de C17:0-TAG como padrão interno. Como mostrado na Tabela 15, a proporção C20:1 em TAG foi significativamente aumentada quando AtAFE1 foi expressa. A coexpressão de WRI1 e DGAT1 com AtFAE1 também aumentou o nível de produto C20:1 em comparação com o controle, ao passo que a quantidade total de TAG foi aumentada de 0,8 a 14.9 μg/mg de folha. O produto C20:1 em TAG acumulado tão alto quanto 0,96 μg por mg, comparado com 0,04 μg por mg sem a combinação WRI1 e DGAT1. Tabela 15. Níveis de ácidos graxos modificados após a expressão transgênica de enzimas modificadoras em folhas de N. benthamiana.

[698] Da mesma forma, a AtFAD2 foi coexpressa a partir do promotor CaMV35S nas folhas de N. benthamiana separadamente ou em combinação com WRI1 e DGAT1. A composição de ácidos graxos da fração de TAG foi determinada e quantificada como acima. O nível de ácido graxo C18:2 no TAG aumentou significativamente quando a AtFAD2 foi co-expressa com WRI1 e DGAT1, de 10,7% para 37,9% e o nível de C18:1 diminuiu de 19,5% para 7,6%. Além disso, os níveis substanciais de TAG (13,4 μg /mg folha) foram observados quando WRI +DGAT1 + AtFAD2 foram coexpressas nas folhas. Estes resultados demonstraram claramente que a composição e a quantidade de ácidos graxos podiam ser modificadas por adição de enzimas de modificação de ácidos graxos em combinação com pelo menos WRI1 e DGAT e, por conseguinte, poderiam ser utilizadas para aumentar a acumulação de produtos de ácidos graxos modificados gerados em ambos ou nos dois pools de Acil-CoA e PC, e eventualmente armazenados em TAG nas partes vegetativas da planta. Exemplo 17. Silenciamento de genes de TGD em plantas

[699] Li-Beisson et al. (2013) estimou que em folhas de Arabidopsis (uma planta 16:3), cerca de 40% dos ácidos graxos sintetizados nos cloroplastos entram na via procariótica, ao passo que 60% foram exportados para entrar na via eucariótica. Depois de terem sido dessaturados no ER, cerca de metade dos ácidos graxos exportados são devolvidos ao plastídeo para suportar a síntese de galactolipídeo para membranas tilacoides. O transporte (importação) dos ácidos graxos como DAG ou fosfolipídeos para o plastídeo envolve TGD1, uma proteína semelhante à permease do envelope interior do cloroplasto. O transportador de lipídeo ABC de Arabidopsis compreendendo as proteínas de TGD1, 2, 3 foi identificado por Benning et al. (2008 e 2009) e mais recentemente por Roston et al. (2012). Este complexo proteico é localizado na membrana interna do envelope de cloroplasto e é proposto para mediar a transferência de fosfatidato através desta membrana. O polipeptídeo TGD2 é uma proteína de ligação fosfatídica e TGD3 uma ATPase. Uma proteína nova de Arabidopsis, TGD4, foi identificada por uma abordagem genética (Xu et al., 2008) e a inativação do gene TGD4 também bloqueou a transferência de lipídeos do ER para os plastídeos. Dados bioquímicos recentes indicam que o TGD4 é uma proteína de ligação ao fosfatidato que reside na membrana externa do envelope do cloroplasto (Wang e Benning, 2012).

[700] Xu et al. (2005) descreveram alelos de tgd1 que vazam em A. thaliana resultando em crescimento de planta reduzida e elevada ocorrência de aborto embrião. O tecido da folha de A. thaliana tgd1 mutantes continham níveis aumentados de TAG, provavelmente como gotículas de óleo citosol. Além disso, os níveis de TAG elevados também foram encontrados em raízes de tgd1 mutantes. Não foram detectadas diferenças no teor de óleo das sementes. Semelhante acumulação de TAG em tecido foliar foi reportada para A. thaliana tgd2 (Awai et al., 2006), tgd3 (Lu et al., 2007) e tgd4 mutantes (Xu et al., 2008). Todos os alelos mutantes de tgd ou estavam suficientemente vazando ou prejudicando sensivelmente o desenvolvimento da planta. Silenciamento de TGD1

[701] Um constructo silencioso dirigido contra o importador de TGD1 plastidial foi gerado com base em um transcrito de mRNA de comprimento completo identificado no transcriptoma de N. benthamiana. Um fragmento de 685 pb foi amplificado a partir do cDNA da folha de N. benthamiana, enquanto incorporava um sítio PmlI na extremidade 5'. O fragmento TGD1 foi primeiro clonado em pENTR/D-TOPO (Invitrogen) e subsequentemente inserido no vetor de destino pHELLSGATE12 via clonagem LR (Gateway). O vetor de expressão resultante foi designado pOIL025 e é expresso transientemente em N. benthamiana para avaliar o efeito de silenciamento de genes de TGD1 nos níveis de TAG nas folhas. O constructo em hairpin de TGD1 é colocado sob o controle do A. niger promotor induzível de alcA subclonando-o como um fragmento de PmlI-EcoRV nos sítios NheI (klenow)-SfoI de pOIL020 (abaixo). O vetor resultante, designado pOIL026, é super-transformada em uma linhagens de pJP3502 homozigótica de N. tabacum para aumentar ainda mais os níveis de óleo de folha.

[702] Outros constructos são feitos para expressar RNA em hairpin para reduzir a expressão dos genes de TGD-2, -3 e -4. As plantas transformadas são produzidas utilizando estes constructos e o teor de óleo determinado nos transformantes. As plantas transformadas são cruzadas com os transformantes gerados com pJP3502 ou outras combinações de genes como descrito acima. Exemplo 18.Expressão de combinações de genes em tubérculos de batata Construção de pJP3506

[703] Um constructo genético contendo três genes para expressão em tubérculos de batata foi feito e usado para a transformação de batata. Este constructo foi designado pJP3506 e baseou-se em um vetor existente pJP3502 (WO2013 / 096993) com substituição de promotores para fornecer expressão específica de tubérculo. O pJP3506 continha (i) um gene de resistência à canamicina NPTII, conduzido pelo promotor 35S com a região potenciadora duplicada (e35S) como o gene marcador selecionável e três cassetes de expressão gênica, que eram (ii) 35S::AtDGAT1 que codifica a DGAT1 de Arabidopsis thaliana, (iii) B33::AtWRI1 que codifica a WRI1 de Arabidopsis thaliana, e (iv) B33::sesame oleosin, que codifica a oleosina de Sesame indicum. As sequências de nucleotídeos que codificam estes polipeptídeos eram como em pJP3502. O promotor da patatina B33 (B33) foi um promotor específico de tubérculos derivado de Solanum tuberosum, que foi fornecido pelo Dr. Alisdair Fernie, Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology, Potsdam, Alemanha. Um mapa do plasmídeo circular de pJP3506 é apresentado na Figura 17.

[704]A sequência de S. tuberosum de promotor de patatina B33 utilizado na construção pJP3506 era uma versão truncada, tendo 183 nucleotideos eliminados a partir do terminal 5' e 261 nucleotídeos suprimidos a partir da extremidade 3' em relação ao Número de Acessão GenBank. X14483. A sequência de nucleotídeos do promotor da patatina B33 como utilizado no pJP3506 é dada como a SEQ ID NO: 211. Transformação da batata

[705]Mudas de batata (Solanum tuberosum) da cultivar Atlantic que tinham sido cultivadas ascepticamente em cultura de tecidos foram adquiridas na Toolangi Elite, Victorian Certified Seed Potato Authority (ViCSPA), Victoria, Austrália. Os entrenós de caule foram excisados em pedaços de aproximadamente 1 cm de comprimento sob uma suspensão de cepa de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 contendo pJP3506. As células de Agrobacterium foram cultivadas até uma OD de 0,2 e diluídas com um MS de volume igual. O excesso de suspensão de Agrobacterium foi removido por meio de breve mancha das peças de caule em papel de filtro estéril, as quais foram então plaqueadas em meio MS e mantidas a 24°C durante dois dias (cocultivo). Os entrenós foram então transferidos para um meio MS fresco suplementado com 200 μg/L de NAA, 2 mg/L de BAP e 250 mg/L de Cefetaxime. A seleção dos calos transgênicos foi iniciada 10 dias mais tarde quando os entrenós foram transferidos para um meio MS fresco suplementado com 2 mg/L de BAP, 5 mg/L de GA3, 50 mg/L de canamicina e 250 mg/L de Cefetaxime. Os brotos regenerados a partir de calos foram excisados e colocados em meio MS simples para a indução da raiz antes do transplante para um vaso de 15 cm de diâmetro contendo mistura de envasamento e cultivados em estufa até a maturidade da planta incluindo o crescimento do tubérculo. Extração de DNA e identificação molecular das plantas transgênicas por PCR

[706] Discos de cerca de 1 cm de diâmetro foram obtidos a partir de folhas de batata das plantas em estufa. Estes foram colocados em uma placa de microtitulação de poço profundo e liofilizados durante 48 horas. As amostras de folhas liofilizadas foram então trituradas em pó por adição de um rolamento de esferas de aço a cada poço e agitando a placa em um Lyser de tecido Reicht (Qiagen) a uma frequência máxima de 28/seg durante 2 min de cada lado da placa de microtitulação. 375 μL de tampão de extração contendo Tris-HCl 0,1 M pH 8,0, EDTA 0,05 M e SDS a 1,25% foram adicionados a cada poço contendo o tecido foliar em pó. Após incubação de 1 hora a 65°C, 187 μL de acetato de amônio a 6 M foi adicionado a cada poço e as misturas armazenadas a 4°C durante 30 minutos antes da centrifugação das placas durante 30 min a 3000 rpm. 340 μL de sobrenadante de cada poço foi transferido para uma nova placa de microtítulo de poço profundo contendo 220 μL de isopropanol e mantido durante 5 min à temperatura ambiente antes de centrifugação a 3000 rpm durante 30 min. Os sedimentos de DNA precipitados foram lavados com etanol 70%, secos ao ar e ressuspensos em 225 μLH2O por amostra.

[707] Dois μL a partir de cada preparação de DNA da amostra de folhas foram adicionados a uma mistura de reação de 20μL de PCR utilizando o sistema de reação de PCR HotStar (Qiagen). Um par de iniciadores oligonucleotídeos com base nas sequências de 5 'e 3' do gene de WRI1 de Arabidopsis thaliana, otimizadas por códon para o tabaco, foi utilizada nas reações de PCR. As suas sequências eram: Nt-Wri-P3: 5’- CACTCGTGCTTTCCATCATC -3’ (SEQ ID NO: 212) e Nt-Wri-P1: 5’- GAAGGCTGAGCAACAAGAGG -3’(SEQ ID NO: 213). Um par de iniciadores de oligonucleotídeos com base no gene de DGTA1 de Arabidopsis thaliana, otimizados por códon para a tabaco, também foi usado em uma reação de PCR separada em cada amostra de DNA. As suas sequências eram: Nt-DGAT-P2: 5’- GGCGATTTTGGATTCTGC -3’ (SEQ ID NO: 214) e Nt-DGAT-P3: 5’- CCCAACCCTTCCGTATACAT -3’ (SEQ ID NO: 215). A amplificação foi realizada com um ciclo inicial a 95°C durante 15 min, seguido por 40 ciclos de 95°C durante 30 segundos, 57°C durante 30 segundos e 72°C durante 60 segundos. Os produtos de PCR foram submetidos a eletroforese em um gel de agarose a 1% para detectar produtos de amplificação específicos. Análise dos lipídeos de tubérculos de batata

[708]As fatias finas de tubérculos colhidas de plantas de batata regeneradas, para plantas transgênicas confirmadas e controles não transformados, foram liofilizadas durante 72 horas e analisadas quanto ao teor de lipídeos e composição. Os lipídeos totais foram extraídos dos tecidos de tubérculos secos utilizando clorofórmio:metanol: KCl 0,1 M (2:1: 1 v/v/v) como se segue. Os tecidos de tubérculos liofilizados foram primeiro homogeneizados em clorofórmio: metanol (2:1, v/v) em um tubo eppendorf contendo uma esfera metálica utilizando uma lisadora de tecido Reicht (Qiagen) durante 3 min a uma frequência de 29 por segundo. Depois de se misturar cada homogeneizado com um Vibramax 10 (Heidolph) a 2000 rpm durante 15 min, adicionou-se 1/3 de volume de solução de KCl 0,1 M a cada amostra e misturou-se ainda mais. Após a centrifugação a 10.000 g durante 5 min, a fase inferior contendo ipídeos a partir de cada amostra foi recolhida e evaporou-se completamente utilizando fluxo de N2. Cada preparação de lipídeo foi dissolvido em 3 uL de CHCl3 por miligrama de peso seco de tubérculo. Alíquotas das preparações lipídicas foram carregadas em uma placa de cromatografia em camada fina (TLC) (20 cm x 20 cm, Silica gel 60, Merck) e desenvolvidas em hexano:éter dietílico:ácido acético (70: 30: 1, v/v/v). A placa de TLC foi pulverizada com Primuline e visualizada sob UV para mostrar manchas lipídicas. TAG e PL foram recuperados por raspagem da sílica das bandas apropriadas e convertidos em ésteres metílicos de ácidos graxos (FAME) por incubação do material em HCl metanólico 1 N (Supelco, Bellefonte, PA) a 80°C durante 2 h juntamente com quantidades conhecidas de Triheptadecanoin (Nu-Chek PREP, Inc. EUA) como padrão interno para quantificação de lipídeos. FAME foram analisados por GC-FID (GC 7890A, Agilent Technologies, Palo Alto, CA), equipado com uma coluna BPX70 de 30 m (diâmetro interno de 0,25 mm, espessura de película de 0,25 mm, SGE, Austin, EUA) como descrito anteriormente (Petrie et al. 2012). Os picos foram integrados com o software Agilent Technologies ChemStation (Rev B.04.03).

[709] Entre as aproximadamente 100 linhagens transgênicas individuais regeneradas, a análise de lipídeos derivados de tubérculos de batata jovens de cerca de 2 cm de diâmetro revelou níveis aumentados nos lipídeos totais, TAG e frações de fosfolipídeos em tubérculos de muitas das plantas transgênicas, com um intervalo observado entre nenhum aumento a aumentos substanciais. A primeira análise dos lipídeos de tubérculos de batata indicou que um tubérculo de batata de tipo selvagem típico na sua fase inicial de desenvolvimento (cerca de 2 cm de diâmetro) continha cerca de 0,03% de TAG em peso seco.

[710] O teor de lipídeos totais foi aumentado para 0,5-4,7% em peso (peso seco) em tubérculos de 21 plantas transgênicas individuais, representando 16 linhas transformadas independentemente (Tabela 16). Tubérculos de linhagem # 69 apresentaram a maior acumulação de TAG em uma média de 3,3% em base seca. Este foi de aproximadamente um aumento de 100 vezes em relação aos tubérculos do tipo selvagem no mesmo estágio de desenvolvimento. Os tubérculos da mesma linhagem transgênica também acumularam os níveis mais elevados observados de fosfolipídeos a 1,0% em peso nos tubérculos jovens em uma base de peso seco (Tabela 18). A acumulação de lipídeos potencializada foi também acompanhada por uma composição de ácidos graxos alterada nos tubérculos transgênicos. Os tubérculos transgênicos acumularam consistentemente maiores porcentagens de ácidos graxos saturados e monoinsaturados (MUFA) e menores níveis de ácidos graxos poliinsaturados (PUFA), tanto no teor total de ácidos graxos como na fração de TAG do teor total de ácidos graxos (Tabela 17), particularmente um nível reduzido de 18:3 (ALA) que foi reduzido de cerca de 17% no tipo selvagem para menos de 10% nos tubérculos transgênicos. O nível de ácido oleico (18:1) no teor de ácidos graxos totais aumentou de cerca de 1% no tipo selvagem para mais de 5% em muitas das linhagens e mais de 15% em alguns dos tubérculos. Embora os níveis de ácido palmítico tenham aumentado, os níveis de ácido esteárico (18: 0) diminuíram nas melhores linhagens transgênicas (Tabelas 16 e 17).

[711]As plantas de batata transgênicas foram mantidas em estufa para permitir o crescimento contínuo dos tubérculos. Os tubérculos maiores da linhagem # 69 continham maiores níveis de TFA e TAG do que os tubérculos de cerca de 2 cm de diâmetro.

[712]Níveis aumentados de TFA e TAG são obtidos em tubérculos de batata por adição de um gene quimérico que codifica um RNA silenciador para regulação descendente da expressão do gene de SDP1 endógeno, em combinação com os genes de WRI1 e DGAT. Outras combinações de genes para transformação da batata

[713] RNA total de tubérculos de batata fresca em desenvolvimento (Solanum tuberosum L. cv. Atlantic) foram extraídos pelo método de TRIzol (Invitrogen). As regiões selecionadas dos cDNAs que codificam a subunidade pequena de AGPase de batata e SDP1 foram obtidas através de RT-PCR utilizando os seguintes iniciadores: st-AGPs1: 5’- ACAGACATGTCTAGACCCAGATG-3’ (SEQ ID NO: 251), st-AGPa1: 5’- CACTCTCATCCCAAGTGAAGTTGC-3’ (SEQ ID NO: 252); st-SDP1-s1: 5’- CTGAGATGGAAGTGAAGCACAGATG-3’ (SEQ ID NO: 253), e st-SDP1-a1: 5’-CCATTGTTAGTCCTTTCAGTC-3‘ (SEQ ID NO: 254). Os produtos de PCR foram, em seguida, purificados e ligados ao pGEMT Easy. Tabela 16. Rendimento de lipídeo total (% em peso de peso seco de tubérculos de batata) e sua composição em ácidos graxos em tubérculos de batata jovens representativos transformados com o T-DNA de pJP3506, antes da floração das plantas. Tubérculos da linhagem 65 eram equivalentes aos tubérculos de tipo selvagem (não transgênicos).

Tabela 17. Produção de TAG (% em peso de peso seco de tubérculos de batata) e sua composição em ácidos graxos em tubérculos de batata jovens representativos transformados com o T-DNA de pJP3506, antes da floração das plantas.

Tabela 18. Produção de fosfolipídeos (% em peso de peso seco de tubérculos de batata) e sua composição em ácidos graxos em tubérculos de batata jovens representativos transformados com o T-DNA de pJP3506, antes da floração.

[714]Após verificação por sequenciação de DNA, os produtos de PCR clonados foram ou diretamente utilizados como a sequência de gene alvo para fazer um constructo de RNAi em hairpin ou fundidos por sobreposição de PCR. Três fragmentos de PCR (SDP1, AGPase, SDP+AGP) foram subsequentemente clonados no vetor de pKannibal que continham locais de restrição específicos para clonar o fragmento desejado na orientação de sentido e antissenso. Os sítio de restrição selecionados eram BamHI e HindIII para clonagem do fragmento na orientação de sentido e KpnI e XhoI para inserção do fragmento na orientação antissenso. Os conjuntos de iniciantes utilizados para a amplificação dos três fragmentos de gene alvo foram alterados por adição de sítios de restrição que dirigem o fragmento para sítios de clonagem de pKannibal. As cassetes de expressão contendo o fragmento de DNA alvo entre o promotor de 35S e terminador OCS em pKannibal foram liberados com Not1 e clonados em um vetor binário pWBVec2 com higromicina como marcador selecionável de planta. Estes vetores binários foram introduzidos na cepa de A. tumefaciens AGL1 e utilizados para transformação de batata, tal como descrito acima. Exemplo 19. Aumentando o teor de óleo nas plantas monocotiledôneas Expressão em endosperma

[715] O teor de óleo no endosperma das espécies de plantas monocotiledôneas Triticum aestivum (Trigo) e, por conseguinte, no grão das plantas foi aumentado através da expressão de uma combinação de genes que codificam WRI1, DGAT e Oleosina no endosperma durante o desenvolvimento de grãos utilizando promotores específicos de endosperma. O constructo (designado poil-Endo2) continha os genes quiméricos: (a) o promotor do gene GLU1 de brachypodium distachyon::proteína da região de codificação do gene de Zea mays que codifica o polipeptídeo ZmWRI1 (SEQ ID NO: 35):: região de terminador/poliadenilação do gene da lectina de Glycine max, (b), o promotor do gene da glutenina Bx17 Triticum aestivum::proteína da região de codificação do gene A. thaliana que codifica o polipeptídeo AtDGAT1 (SEQ ID NO: 1)::região de terminador/poliadenilação do gene Agrobacterium tumefaciens Nos, (c), o promotor do gene GluB4 de Oryza sativa::proteína da região de codificação do gene de Sesame indicum que codifica o polipeptídeo de Oleosina:região de terminador/poliadenilação do gene da lectina de Glycine max e (d) um promotor de 35S::região de codificação de resistência à higromicina como um gene marcador selecionável. O constructo foi usado para transformar embriões imaturos de T. aestivum (cv. Fielder) pela transformação mediada por Agrobacterium. Os embriões imaturos inoculados foram expostos a higromicina para selecionar brotos transformados e depois transferidos para meio de enraizamento para formar raízes, antes da transferência para o solo.

[716] Trinta plantas transformadas foram obtidas e produzem sementes T1 e continham o T-DNA de pOIL-Endo2. As sementes maduras foram colhidas de todas as 30 plantas, e 6 sementes de cada família cortadas pela metade. As metades contendo o embrião foram armazenadas para posterior germinação; A outra metade contendo principalmente endosperma foi extraída e testada quanto ao teor de óleo. O T-DNA inserido no genoma do trigo ainda estava segregando nas sementes T1 destas plantas, de modo que as sementes T1 eram uma mistura de homozigotos transformados, heterocigados transformados e nulos para o T-DNA. O aumento do teor de óleo foi observado no endosperma de alguns dos grãos, com alguns grãos mostrando um aumento maior de 5 vezes nos níveis de TAG. As metades de endosperma de seis grãos do tipo selvagem (cv. Fielder) tinham um teor de TAG de cerca de 0,47% em peso (intervalo de 0,37% a 0,60%), em comparação com um teor de TAG de 2,5% em alguns grãos. Algumas famílias tiveram todos os seis grãos com TAG em excesso de 1,7%; outros estavam evidentemente segregando tanto com o tipo selvagem como com o teor elevado de TAG. Em endospermas com elevado TAG, a composição de ácidos graxos também foi alterada, apresentando aumentos nas percentagens de ácido oleico e ácido palmítico e diminuição da porcentagem de ácido linoleico (Tabela 19). O grão T1 germinou sem dificuldade ao mesmo ritmo que o grão correspondente do tipo selvagem e as plantas que representavam tanto o óleo alto como os indivíduos com baixo teor de óleo de 14 famílias T0 foram cultivadas até à maturidade. Estas plantas eram inteiramente machos e fêmeas férteis.

[717] O grão é útil para a preparação de produtos alimentares para consumo humano ou como alimento para animais, fornecendo grãos com um maior conteúdo de energia por unidade de peso (densidade de energia) e resultando em um aumento das taxas de crescimento em animais, tais como, por exemplo, aves domésticas, suínos, bovinos, ovelhas e cavalos. Tabela 19. Composição de ácido graxo (% de ácidos graxos totais) de teor de TAG e o teor de TAG total (% de óleo em peso de metades de endospermas) no em endosperma de trigo transgênico

[718] O constructo de poil-Endo2 também é utilizado para transformar milho (Zea mays) e arroz (Oryza sativa) para obtenção de plantas transgênicas que aumentaram o teor de TAG no endosperma e, por conseguinte, no grão. Expressão em folhas e caules

[719] Uma série de vetores de expressão binários foi concebida para transformação mediada por Agrobacteriumde sorgo (S. bicolor) e trigo (Triticum aestivum) para aumentar o teor de óleo nos tecidos vegetativos. Os vetores de partida para os constructos foram pOIL093-095, pOIL134 e pOIL100-104 (ver Exemplo 4). Em primeiro lugar, um fragmento de DNA que codifica o polipeptídeo WRI1 de Z. mays foi amplificado por PCR utilizando pOIL104 como um molde e iniciadores contendo sítios de restrição KpnI. Este fragmento foi subclonado a jusante do promotor constitutivo de Actin1 de Oryza sativa de pOIL095, usando o sítio KpnI. O vetor resultante foi designado pOIL154. O fragmento de DNA que codifica a DGAT2a de Umbelopsis ramanniana sob o controle do promotor de ubiquitina de Z. mays (pZmUbi) foi isolado de pOIL134 como um fragmento de NotI e inserido no sítio NotI de pOIL154, resultando em pOIL155. Uma cassete de expressão consistindo da região de codificação do PAT sob o controle do promotor pZmUbi e flanqueada na extremidade 3' pela região de terminador/poliadenilação de A. tumefaciens NOS foi construída por amplificação da região de codificação de PAT usando pJP3416 como um modelo. Os iniciadores foram concebidos para incorporar sítios de restrição BamHI e SacI nas extremidades 5' e 3', respectivamente. Depois da dupla digestão de BamHI + SacI, o fragmento de PAT foi clonado nos sítios respectivos de pZLUbi1casNK. O intermediário resultante foi designado pOIL141. Em seguida, a cassete de marcador selecionável PAT foi introduzido na cadeia principal de pOIL155. Para este fim, pOIL141 foi cortado primeiro com NotI, cega com fragmento Klenow de DNA polimerase I e subsequentemente digerido com AscI. Este fragmento de 2622bp foi então subclonado nos sítios ZraI - AscI de pOIL155, resultando em pOIL156. Finalmente, o promotor Actin1 dirige a expressãode WRI1 em pOIL156 foi trocada pelo promotor da subunidade pequena de Z. mays Rubisco (pZmSSU), resultando em pOIL157. Este vetor foi obtido através de amplificação por PCR do promotor de SSU de Z. mays usando pOIL104 usando como um molde e iniciadores de flanqueamento contendo sítios de restrição AsiSI e PmlI. O fragmento amplificado resultante foi depois cortado com SpeI + MluI e subclonado nos sítios respectivos de pOIL156.

[720] Estes vetores, por conseguinte, continham as seguintes cassetes de expressão:

[721]pOIL156: promotor O. sativa Actin1 ::Z. mays WRI1, promotor Z. mays ubiquitina ::U. rammaniana DGAT2a e promotor Z. mays Ubiquitina :: PAT

[722]pOIL157: promotor Z. mays SSU ::Z. mays WRI1, promotor Z. mays ubiquitina ::U. rammaniana DGAT2a e Z. mays Ubiquitina :: PAT.

[723] Uma segunda série de vetores de expressão binário contendo o promotor de senescência SEE1 de Z. mays (Robson et al., 2004, ver Exemplo 4), fator de transcrição de LEC1 de Z. mays (Shen et al., 2010) e um fragmento de hpRNAi de SDP1 de S. bicolor foram construídos como se segue. Em primeiro lugar, introduziu-se uma região de ligação de matriz (MAR) em pORE04 por digestão de AatII+SnaBI digest de pDCOT e subclonando em sítios AatII+EcoRV de pORE04. O vetor resultante intermediário foi designado pOIL158. Em seguida, o gene do marcador selecionável de PAT sob o controle do promotor da ubiquitina de Z. mays foi subclonado em pOIL158. Para este fim, o pOIL141 foi primeiro digerido com NotI, tratado com fragmento de Klenow deDNA polimerase I e finalmente digerido com AscI. O fragmento resultante foi inserido nos sítios AscI+ZRAI de pOIL158, resultando em pOIL159. A origem de replicação RK2 oriV original em pOIL159 foi trocada pela origem RiA4 por digestão de restrição de SwaI+SpeI de pJP3416, seguido de subclonagem nos sítios SwaI+AvrII de pOIL159. O vetor resultante foi designado pOIL160. Sintetiza-se um fragmento de 10,019kb 'Monocot senescence part1' contendo as seguintes cassetes de expressão: O. sativa Actin1::A. thaliana DGAT1, otimizado por códon para expressão de Z. mays, Z. mays SEE1::Z. mays WRI1, Z. mays SEE1::Z. mays LEC1. Este fragmento é subclonado como um fragmento de SpeI-EcoRV nos sítios SpeI-StuI de pOIL160, resultando em pOIL161. Um segundo fragmento de "fragmento Monocot senescência part2" de 7,967 kb é sintetizado e contém os seguintes elementos: MAR, fragmento Ubiquitin::hpRNAi direcionado contra Z. mays SDP1 S. bicolor/T. aestivum, uma cassete vazia sob o controle do promotor de Actin 1 de O. sativa. As sequências dos duas SDP1 TAG lipases de S. bicolor (N.°s. de Acessão XM_0 02 4 63 62 0; SEQ ID NO. 242 e XM_002458486; SEQ ID NO: 169) e uma sequência de SDP1 de T. aestivum (N.° de Acessão AK334547) (SEQ ID NO: 243) foram obtidos por uma pesquisa BLAST com a sequência de SDP1 de A. thaliana (N.° de Acessão NM_120486). Uma constructo em hairpin sintético (SEQ ID NO: 244) foi desenhado incluindo quatro fragmentos (67bp, 90bp, 50bp, 59bp) da sequência XM_002458486 de S. bicolor que mostrou maior grau de identidade com a sequência SDP1 de T. aestivum. Além disso, um fragmento de 278 pb originado de XM_002463620 SDP1 lipase de S. bicolor foi incluído para aumentar a eficiência do silenciamento contra ambas as sequências SDP1 de S. bicolor. O fragmento 'Monocot senescence part2' é subclonado como um fragmento de BsiWI-EcoRV nos sítios de BsiWI-FspI de pOIL161. O vetor resultante é designado pOIL162.

[724]As construções genéticas pOIL156 pOIL157, pOIL162 e pOIL163 são utilizadas para transformar S. bicolor e T. aestivum usando transformação mediada por Agrobacterium. As plantas transgênicas são selecionadas para resistência à higromicina e contêm níveis elevados de TAG e TFA em tecidos vegetativos em comparação com plantas de controle não transformadas. Tais plantas são úteis para fornecer alimento para animais como feno ou silagem, bem como para produzir grão, ou podem ser usadas para extrair óleo. Exemplo 20. Extração de óleo e produção de biodiesel Extração de lipídeos a partir de folhas

[725] Folhas de tabaco transgênicas que tinham sido transformadas com o T-DNA de pJP3502 foram colhidas a partir de plantas cultivadas em uma estufa durante os meses de verão. As folhas foram secas e depois trituradas para pedaços de tamanho 1-3mm antes da extração. O material triturado foi submetido à extração em soxhlet (refluxo) ao longo de 24 horas com solventes selecionados, como descrito abaixo. Utilizaram-se 5 g de material de folha de tabaco seco e 250 ml de solvente em cada experiência de extração. Extração de solvente com hexano

[726] O hexano é comummente utilizado como solvente comercialmente para a extração de óleo de sementes de óleo prensadas, tais como canola, extraindo lipídeos neutros (não polares), e por conseguinte foi tentado em primeiro lugar. A massa lipídica extraída foi de 1,47 g a partir de 5 g de material foliar, uma recuperação de lipídeos de 29% em peso. Realizou-se a análise por NMR 1H do lipídeo extraído com hexano em DMSO. A análise mostrou sinais típicos de ácidos graxos de triglicerídeos de cadeia longa, sem produtos aromáticos estarem presentes. O lipídeo foi então submetido a GCMS para identificação dos principais componentes. A análise direta do GCMS do lipídeo extraído com hexano revelou-se difícil, dado que o ponto de ebulição era elevado demais e o material decomposto no GCMS. Em tais situações, uma técnica de análise comum é fazer primeiro ésteres metílicos dos ácidos graxos, o que foi feito da seguinte forma: 18 mg de extrato de lipídeo foram dissolvidos em 1 mL de tolueno, foram adicionados 3 mL de HCL metanólica 3N seca e agitada durante a noite a 60 oC. 5 mL de NaCl a 5% e 5 mL de hexano foram adicionados ao frasco resfriado e agitada. A camada orgânica foi removida e a extração foi repetida com mais 5 mL de hexano. As frações orgânicas combinadas foram neutralizadas com 8 mL de KHCO3 a 2%, separadas e secas com Na2SO4. O solvente foi evaporado sob uma corrente de N2 e depois feito até uma concentração de 1 mg/mL em hexano para análise de GCMS. Os principais ácidos graxos presentes foram de 16:0 (palmítico, 38,9%) e 18:1 (ácido oleico, 31,3%).

Extração com solvente de acetona

[727]A acetona foi utilizada como um solvente de extração porque as suas propriedades solventes deveriam extrair quase todos os lipídeos das folhas, isto é, tanto os lipídeos não polares quanto polares. O óleo extraído com acetona parecia semelhante ao lipídeo extraído com hexano. A massa lipídica extraída foi de 1,59 g a partir de 5 g de folha de tabaco, i.e. 31,8% em peso. Realizou-se a análise por NMR 1H do lipídeo em DMSO. Foram observados sinais típicos de ácidos graxos de triglicerídeos de cadeia longa, sem sinal para produtos aromáticos. Extração de solvente de água quente

[728] Tentou-se usar água quente como um solvente de extração para ver se era adequado para obter óleo das folhas de tabaco. O material de água extraído era semelhante à gel e gelificado quando resfriado. A massa extraída foi 1,9 g, ou 38% em peso. Este material era como um gel grosso e era provável ter incluído compostos polares das folhas, tais como açúcares e outros carboidratos. Realizou-se a análise por NMR 1H do material em DMSO. A análise mostrou sinais típicos de ácidos graxos de triglicerídeos de cadeia longa, sem produtos aromáticos sendo extraídos. Extraiu-se o material sólido sobre o extrato com hexano, obtendo-se 20% de lipídeo em peso, indicando que a extração de água não tinha extraído lipídeos não polares de forma eficaz. Extração de etanol com solvente

[729] O etanol foi usado como um solvente de extração para ver se era adequado para obter óleo das folhas de tabaco. O lipídeo extraído com etanol era semelhante em aparência ao lipídeo extraído com água e hexano, sendo amarelo-vermelho na cor, tinha uma aparência de gel e gelificou quando resfriado. A massa lipídica extraída foi de 1,88 g de 5 g de tabaco, ou 37,6% em peso. O solvente de etanol também teria extraído alguns dos compostos polares nas folhas de tabaco. Extração de solvente de éter

[730] Tentou-se usar o éter dietílico como um solvente de extração uma vez que se pensava que poderia extrair menos impurezas do que outros solventes. A extração produziu 1,4 g, ou 28% em peso. O éter extraído lipídico era semelhante ao material de hexano extraído em aparência, era de cor amarelada, e ele pareceu um pouco mais limpo do que o extrato de hexano. Embora a extração com éter dietílico pareça ter dado o óleo mais limpo, a análise por NMR mostrou uma mistura de compostos mais orgânicos. Produção de biodiesel a partir de plantas de tabaco

[731] Um lote de plantas de tabaco transgênicas foi cultivado durante o inverno (não é sua estação de crescimento normal) para avaliar a produção de óleo nas folhas durante a estação mais fria com menos luz natural. As folhas de plantas maduras tinham aproximadamente 10% de óleo em uma base de peso seco; muito menor do que as plantas cultivadas durante a temporada de verão. No entanto, o lipídeo foi extraído e convertido em biodiesel como se segue. Os estágios do processo foram as seguintes: (a) extração de lipídeo bruto, (b) purificação de TAG a partir do lipídeo, e (c) conversão do TAG purificado em biodiesel.

[732] Utilizou-se hexano (éter de óleo 40-60°C) como solvente de extração para a obtenção de óleo compreendendo principalmente lipídeo não polar. 500 g de material de folha de tabaco foram secos, pesados e depois embebidos em hexano durante a noite com agitação. A mistura foi filtrada e o extrato de hexano foi então seco com sulfato de magnésio e tratado com carvão ativo para descolorir o óleo. A solução foi filtrada e o líquido resultante foi evaporado em um evaporador rotativo, resultando em cerca de 42 gramas de óleo em bruto. Esta era de cor amarela/verde e tinha uma consistência viscosa quando resfriada. Parte deste óleo foi usada na tentativa de produzir biodiesel diretamente, mas o número de impurezas e grande quantidade de ácidos graxos livres deu origem à produção de um lote de sabão que impediu a reação de metilação e separação do produto. Por conseguinte, era necessária uma purificação adicional deste óleo para enriquecer a fração de TAG antes da reação de transesterificação para se obter biodiesel.

[733] Um problema com a amostra cultivada no inverno foi a presença de níveis relativamente elevados de ácidos graxos livres (FFAs) no material extraído, resultando em excesso de sabão, o que impediu a separação dos ésteres metílicos e dos produtos de glicerol. Para purificar o TAG no óleo, foram investigados vários sistemas solventes e foi escolhida uma mistura de hexano/acetato de etil de 80:20 como apropriada para cromatografia em coluna. A separação em uma coluna de sílica utilizando hexano:acetato de etil (80:20) foi realizada. O TAG mais hidrofóbico foi o primeiro a eluir a partir da coluna como um óleo laranja/amarelo. Em seguida uma banda verde escuro foi eluída, contendo uma mistura de componentes solúveis em hexano nas folhas de tabaco, incluindo clorofila misturada com algum TAG e FFAs. O produto final lavou a coluna com acetato de etil puro e era principalmente FFAs.

[734] O TAG purificado que foi enriquecido longe de FFAs e fosfatos e outras impurezas poderiam agora ser transformadas em biodiesel. Isto foi feito por reação do TAG com metanol na presença de um catalisador de base para produzir o éster metílico (biodiesel) e glicerol como um produto. Um método alternativo, a esterificação catalisada por ácido, pode ser usado para reagir ácidos graxos com álcool para produzir biodiesel na presença de FFAs, requerendo TAG menos puro. Outros métodos tais como reatores de leito fixo, reatores supercríticos e reatores ultrassônicos renunciam ou diminuem o uso de catalisadores químicos e também podem ser usados para a produção de biodiesel a partir de lipídeos. No entanto, os métodos catalisados por bases são os mais econômicos para converter TAG purificado, requerendo apenas baixas temperaturas e pressões e produzindo rendimentos de conversão de mais de 98% desde que o óleo de partida seja baixo em umidade e ácidos graxos livres.

[735] Tratou-se o TAG purificado com uma solução de metóxido (NaOH e metanol misturados até à dissolução completa) a uma temperatura de óleo de 60oC. A mistura foi mantida a 60oC e agitada durante 2 horas, enquanto a reação de transesterificação ocorreu. A reação de mistura foi resfriada até à temperatura ambiente e separaram-se duas fases que eram uma camada superior de biodiesel e uma camada inferior de glicerol. As fases foram então separadas usando um funil de separação e o biodiesel recuperado. Processamento hidrotérmico de tecidos vegetativos de óleo elevado

[736] Uma outra abordagem, mais direta para converter partes vegetativas em produtos industriais, tais como combustíveis líquidos é através do processamento hidrotérmico (HTP). Este foi utilizado para converter o material de folha de tabaco transgênico contendo cerca de 30% de TFA em peso em um bio-óleo renovável que poderia ser adicionado a uma matéria-prima de refinaria de óleo convencional para produzir diesel renovável (diesel parafínico). O diesel de óleo é uma mistura de muitos compostos de hidrocarbonetos, principalmente alcanos, e é definido como sendo a fração da refinaria entre 200-300oC, compreendendo tipicamente predominantemente hidrocarbonetos C13-C22. Em uma conversão típica de folha de tabaco transgênico via HTP, o material vegetativo sólido de tabaco transgênico da planta foi misturado com água para criar uma concentração de sólidos entre 16-50%. Esta suspensão foi, em seguida, submetida a temperaturas entre 270-400oC e 70-350 bar de pressão. Os tempos de reação variam entre 1-60 minutos e as experiências foram realizadas com e sem NaOH e KOH como catalisador.

[737] Uma vez que o processamento por HTP tinha terminado e a reação resfriada, ele foi separado em três fluxos de produtos diferentes, nomeadamente gás, sólido e bio-óleo líquido. Os rendimentos de bio-óleo tinham entre 25-40% em uma base de peso seco em relação à quantidade de matéria- prima. A Figura 18 mostra que foram obtidos rendimentos de bio-óleo muito maiores para o material de folha de tabaco transgênico em relação ao material de folha de tabaco de tipo selvagem correspondente. Conversão de lipídeosdireta in situ em partes vegetativas de biodiesel

[738] Em uma outra série de experiências, o componente de água da reação HTP foi substituído com o solvente metanol. Há um número de razões para tentar utilizar metanol, um sendo tentar converter óleo TAG na folha diretamente (in situ) em uma etapa para produzir os ésteres metílicos dos ácidos graxos (FAME) no lipídeo vegetal e produzir biodiesel diretamente. Usando as mesmas condições reacionais e equipamentos como os experimentos HTP anteriores, a água foi substituída com metanol, a temperatura de reação foi de 335oC a uma pressão de 240 bar com NaOH como catalisador. As partes de plantas vegetais de tabaco transgênico produziram 47% de bio-óleo em peso em relação ao peso de entrada, enquanto que o tabaco de tipo selvagem produziu 35% de bio- óleo em peso. A H1 NMR dos dois bio-óleos resultantes mostrou apenas uma pequena quantidade de FAME, enquanto a NMR do bio-óleo do tabaco transgênico mostrou uma grande quantidade do FAME biodiesel.

[739] Será apreciado por pessoas versadas na técnica que numerosas variações e/ou modificações podem ser feitas à invenção como mostrado nas modalidades específicas sem se afastar do espírito ou âmbito da invenção como amplamente descrito. As presentes modalidades, portanto, serão consideradas em todos os aspectos como ilustrativas e não restritivas.

[740] Todas as publicações discutidas e/ou aqui mencionadas são aqui incorporadas na sua totalidade.

[741] Qualquer discussão de documentos, atos, materiais, dispositivos, artigos ou análogos que foram incluídos no presente relatório descritivo é exclusivamente com o objetivo de fornecer contexto para a presente invenção. Não é para ser tomado como uma admissão que qualquer um algum ou todos estes assuntos fazem parte do estado da técnica de base ou eram de conhecimento geral no campo relevante para a presente invenção, tal como existia antes da data de de prioridade de qualquer reivindicação deste pedido. REFERÊNCIAS Alenianno et al. (2008) Planta 227:853-866. Almeida and Allshire (2005) TRENDS Cell Biol. 15:251-258. Alonso et al. <2009) Plant Cel I 21: 1747-1761. Alonso etal. (2010) Green Chem. 12:14934513, Alvarez et al. (2000) Them. Appl. Genet. 100:319-327, Andre ata! (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109:10107-10112. Andrianov et al. (2010) Plant Biotech. J. 3:277-287. Atirai et ai (2006) Biochβm, Soc. Trans. 34:395-398. Bartlett et al. (2008) Plant Methods 4:22. Baud et al. 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Claims

1. Processo para produzir um produto de óleo caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de (i) tratar, em um reator, uma composição que compreende (a) partes vegetativas da planta cujo peso seco é de pelo menos 2g e que tenham um teor de lipídeos não polares total de pelo menos 5% em peso em uma base de peso seco, (b) um solvente que compreende água, um álcool ou ambos e (c) opcionalmente, um catalisador, em que o tratamento compreende o aquecimento da composição a uma temperatura entre 50oC e 450oC e a uma pressão entre 5 e 350 bar durante entre 1 e 120 minutos em um ambiente oxidativo, redutivo ou inerte, e (ii) recuperar o produto de óleo a partir do reator (a) a um rendimento de entre 36% e 60% em peso em peso em relação ao peso seco das partes vegetativas da planta, se o solvente é água, ou (b) a um rendimento de entre 36% e 70% em peso em relação ao peso seco das partes vegetativas da planta, se o solvente compreende um álcool, produzindo desse modo o produto de óleo.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por um ou mais de: (i) as partes vegetativas da planta terem um peso seco de, pelo menos, 1 kg, (ii) a composição ter uma concentração de sólidos entre 5% e 90% (iii) o catalisador compreender NaOH ou KOH em uma concentração de 0,1 M a 2 M, (iv) o tempo de tratamento ser entre 1 e 60 minutos, 80% de água, e o produto de óleo compreender 30% de C13-C22 de compostos hidrocarbonetos, (v) o solvente compreender 80% de água, o produto de óleo compreender 30% de compostos de hidrocarboneto C13-C22, (vi) o solvente compreender 50% de metanol, o produto de óleo compreender 50% de ésteres metílicos de ácidos graxos (FAME), (vii) o produto de óleo recuperado ter um teor de água de menos do que 15% em peso, e (viii) o rendimento do produto de óleo ser pelo menos 2% maior, em peso, em relação a um processo correspondente utilizando partes vegetativas da planta cujo teor de lipídeos não polares é inferior a 2% em uma base de peso seco, e

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende um ou ambos de: (i) hidrodeoxigenação do produto de óleo recuperado, e (ii) tratamento do produto de óleo recuperado com hidrogênio para reduzir os níveis de cetonas ou açúcares no produto de óleo.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as partes vegetativas da planta compreendem folhas, caules das plantas ou ambos.

5. Processo para produzir um produto de óleo a partir do óleo da planta caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: i) obter uma parte vegetativa da planta tendo um teor de lipídeos não polares total de entre 30% e 75% (p/p peso seco), ii) ou a) converter pelo menos parte do lipídeo na parte vegetativa da planta na etapa i) no produto de óleo pelo tratamento, em um reator, de uma composição compreendendo (1) a parte vegetativa da planta, (2) um solvente o qual compreende água, um álcool, ou ambos e (3) opcionalmente um catalisador, ou b) fisicamente processar a parte vegetativa da planta da etapa i), e converter pelo menos parte do lipídeo na parte vegetativa da planta processada no produto de óleo pelo tratamento, em um reator, de uma composição compreendendo (1) a parte vegetativa da planta processada, (2) um solvente o qual compreende água, um álcool, ou ambos, e (3) opcionalmente um catalisador, e iii) recuperar o produto de óleo, a) em um rendimento de entre 36% e 60% em peso em relação ao peso seco das partes vegetativas da planta se o solvente compreende água, ou b) em um rendimento de entre 36% e 70% em peso em relação ao peso seco das partes vegetativas da planta se o solvente compreende um álcool, em que o tratamento compreende aquecer a composição em uma temperatura entre 50°C e 450°C, e uma pressão entre 5 e 350 bar para entre 1 e 120 minutos em um ambiente oxidativo, redutivo ou inerte, assim produzindo o produto de óleo.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a etapa de fisicamente processar a parte vegetativa da planta compreende um ou mais de enrolar, pressionar, esmagar e triturar a parte vegetativa da planta.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o volume do produto de óleo é pelo menos 1 litro.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o produto de óleo é um produto hidrocarboneto.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a parte vegetativa da planta é uma parte aérea da planta ou uma parte verde da planta.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a parte vegetativa da planta é uma folha ou caule da planta.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a parte vegetativa da planta é colhida a partir da planta em um tempo entre o tempo de floração da planta e o tempo de senascência da planta ser iniciado.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a parte vegetativa da planta tem uma ou mais ou todas as seguintes características: i) um teor total de lipídeos não polares de pelo menos 35% (p/p peso seco), ii) um teor TAG total de pelo menos 35% (p/p peso seco), iii) um teor de ácidos graxos de lipídeos não polares total compreende 19% de ácido oleico na parte vegetativa da planta, iv) um teor de ácidos graxos de lipídeos não polares total compreende 20% de ácido palmítico na parte vegetativa da planta, v) um teor de ácidos graxos de lipídeos não polares total compreende 15% de ácido linoleico na parte vegetativa da planta, e vi) um teor de ácidos graxos de lipídeos não polares total compreende menos que 15% de ácido a-linolênico na parte vegetativa da planta.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o produto de óleo compreende ésteres de alquila, e o processo ainda compreende misturar os ésteres de alquila com combustível a base de petróleo.

14. Processo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que os ésteres de alquila são ésteres de metila.

15. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o produto de hidrocarboneto é um éster de ácido graxo, um alcano, uma mistura de alcanos de cadeia mais longa, um alceno, um biocombustível, um bioálcool, um biochar, ou uma combinação de monóxido de carbono, hidrogênio e biocarvão.

16. Processo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que: i) se o produto de hidrocarboneto é um éster de ácido graxo, então o éster de ácido graxo é um éster de metila de ácido graxo ou um éster de etila de ácido graxo; ii) se o produto de hidrocarboneto é um alcano, então o alcano é metano, etano ou alcano de cadeia mais longa; e iii) se o produto de hidrocarboneto é um bioálcool, então o bioálcool é um etanol, propanol ou butanol.

17. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição tem uma concentração de sólidos entre 5% e 90% em peso.

18. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o catalisador compreende NaOH ou KOH em uma concentração de 0,1M a 2M, ou ambos NaOH e KOH em uma concentração total de 0,1M a 2M.

19. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tempo de tratamento é entre 10 e 60 minutos.

20. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o solvente compreende 80% de água e o produto de óleo compreende 30% de compostos de hidrocarboneto C13-C22.

21. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o solvente compreende 50% de metanol e o produto de óleo compreende 50% de ésteres de metila de ácido graxo.

22. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o produto de óleo recuperado tem um teor de água de menos que 15% em peso.

23. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o rendimento do produto de óleo é pelo menos 2% maior em peso em relação a um processo correspondente usando partes vegetativas de planta correspondentes cujo teor de lipídeos não polares é menos que 2% em peso em um peso seco.

24. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa i), o tratamento compreende aquecimento da composição em uma temperatura de entre 270°C e 350°C.

25. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que na etapa ii), o tratamento compreende aquecimento da composição em uma temperatura de entre 270°C e 350°C.

26. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o solvente compreende um álcool e o produto de óleo compreende pelo menos 1,5 vezes mais ésteres de acila graxo do que compostos de hidrocarboneto.

27. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o solvente compreende um álcool e o produto de óleo compreende pelo menos 1,5 vezes mais ésteres de acila graxo do que compostos de hidrocarbonetos.