JP2017529060A - 植物脂質から工業製品を製造する工程 - Google Patents
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Abstract
Description
トリアシルグリセロール類(TAG)は、種子中の脂質の主形態を構成し、エステル化されグリセロール主鎖となる3つのアシル鎖から構成される。脂肪酸は、アシル−アシル担体タンパク質(ACP)中間体として、最初の不飽和化触媒を受け得る色素体中で合成される。この反応は、ステアロイル−ACPデサチュラーゼ(不飽和化酵素)により触媒され、オレイン酸(C18:1Δ9)を生成する。次いで、アシル鎖は、アシル−コエンザイム(CoA)チオエステルとして細胞質ゾル及び小胞体(ER)へと移送される。主要なTAG生合成経路(ケネディ経路またはグリセロール3リン酸(G3P)経路としても知られる)に入る前に、アシル鎖は、通常、ER膜のリン脂質へと組み込まれ、更なる不飽和化を受けることができる。多価不飽和脂肪酸の産生における2つの重要な酵素は、膜結合FAD2及びFAD3デサチュラーゼであり、それらは、それぞれ、リノール酸(C18:2Δ9、12)及びαリノレン酸(C18:3Δ9、12、15)を産生する。
(i)反応器内で、
(a)乾重量が少なくとも2gであり、非極性脂質の総含有量を乾重量基準で少なくとも5重量%有する生育植物部分と、
(b)水、アルコールまたは両方を含む溶媒と、
(c)場合により触媒と、を含む組成物を処理するステップであって、
該処理が、酸化、還元または不活性環境にて組成物を温度約50℃〜約450℃、圧力5〜350barで1〜120分間加熱することを含むステップ、
(ii)生育植物部分の乾重量に対して、少なくとも35重量%の収率で反応器から油製品を回収すること、
それによって油製品を製造するステップ。
(i)回収された油製品の水素化脱酸素、
(ii)回収した油製品の水素処理により、油製品のケトンまたは糖のレベルを低減すること、
(iii)回収した油製品からの合成ガスの製造、及び
(iv)回収した油製品を分画し、1種以上の燃料油、ディーゼル油、灯油またはガソリンを製造すること。例えば、分画ステップは、分別蒸留によってなされる。
a)細胞内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする第1の外因性ポリヌクレオチド、
b)1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド、ならびに次の1つまたは2つまたは3つすべて:
c)遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞内のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第1の遺伝子改変、
d)第4の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第3の外因性ポリヌクレオチド、及び
e)細胞内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる第2の転写因子ポリペプチドをコードする、第4の外因性ポリヌクレオチド。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、細胞内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。
a)油体被覆(OBC)ポリペプチド、好ましくは脂肪滴会合タンパク質(LDAP)をコードする第5の外因性ポリヌクレオチド、
b)第2の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第2の遺伝子改変、ならびに
c)第3の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第3の遺伝子改変。
a)細胞内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする第1の外因性ポリヌクレオチド、
b)1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド、
c)遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞内のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第1の遺伝子改変。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、細胞内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結され、場合により細胞は次の1つ以上またはそのすべてを更に含む:
d)油体被覆(OBC)ポリペプチド、好ましくはLDAPをコードする第3の外因性ポリヌクレオチド、
e)第4の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第4の外因性ポリヌクレオチド、
f)第2の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第2の遺伝子改変、及び
g)第3の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第3の遺伝子改変。
a)細胞内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする第1の外因性ポリヌクレオチド、
b)1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド、及び
c)油体被覆(OBC)ポリペプチド、好ましくは脂肪滴会合ポリペプチド(LDAP)をコードする第3の外因性ポリヌクレオチド。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、細胞内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結され、かつ、該組み換え真核細胞では、ヌクレオチド配列が配列番号176に示された配列の補体である第3の外因性ポリヌクレオチドを含む、相当する細胞と比較して、1つ以上の非極性脂質のレベル及び/またはOBCポリペプチド量が増加している。
d)第1の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第1の遺伝子改変、
e)第4の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第4の外因性ポリヌクレオチド、
f)第2の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第2の遺伝子改変、及び
g)第3の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第3の遺伝子改変。
a)第2の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較して、細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド、
b)第1の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第1の遺伝子改変、及び
c)第2の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第2の遺伝子改変。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、細胞内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。
d)1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第3の外因性ポリヌクレオチド、
e)第3の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞内のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第3の遺伝子改変、及び
f)油体被覆(OBC)ポリペプチド、好ましくはLDAPをコードする第4の外因性ポリヌクレオチド。
a)細胞内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチド、好ましくはWRI転写因子をコードする第1の外因性ポリヌクレオチド、
b)中鎖長(C8〜C14)を有する脂肪酸に対して優先的活性のあるLPAATである、1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド、及び
c)第3の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体からのC8〜C14脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第3の外因性ポリヌクレオチド。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、細胞内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。
d)1つ以上の非極性脂質の生合成に関与する更に別のポリペプチドをコードする第4の外因性ポリヌクレオチド、
e)第1の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第1の遺伝子改変、
f)油体被覆(OBC)ポリペプチド、好ましくはLDAPをコードする第5の外因性ポリヌクレオチド、
g)第2の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第2の遺伝子改変、及び
h)第3の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第3の遺伝子改変。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、細胞内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。
a)外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド、
b)第1の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第1の遺伝子改変、及び
c)第2の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第2の遺伝子改変。ここでの外因性ポリヌクレオチドは、細胞内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。
i)配列番号21〜75または205〜210のいずれか1つに示された配列であるアミノ酸を含むポリペプチド、またはその生物学的に活性な断片、またはアミノ酸配列が配列番号21〜75または205〜210のいずれか1つ以上と少なくとも30%同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド、
ii)配列がi)と少なくとも30%同一であるヌクレオチド、及び
iii)ストリンジェントな条件下でi)及び/またはii)にハイブリダイズするヌクレオチド。WRI1ポリペプチドは、好ましくは、Arabidopsis thaliana WRI1(配列番号21または22)以外のWRI1ポリペプチドである。より好ましくは、WRI1ポリペプチドは、配列番号208に示された配列であるアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片、またはアミノ酸配列がそれと少なくとも30%同一であるポリペプチドを含む。
a)植物内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする第1の外因性ポリヌクレオチド、
b)1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド、ならびに次の1つまたは2つまたは3つすべて:
c)遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、植物内のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する遺伝子改変、
d)第4の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較したとき、植物細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第3の外因性ポリヌクレオチド、及び
e)植物内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる第2の転写因子ポリペプチドをコードする、第4の外因性ポリヌクレオチド。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、植物内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。
a)油体被覆(OBC)ポリペプチド、好ましくはLDAPをコードする第5の外因性ポリヌクレオチド、
b)第2の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、植物の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第2の遺伝子改変、及び
c)第3の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第3の遺伝子改変。
a)植物内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする第1の外因性ポリヌクレオチド、好ましくは構成的プロモーター以外のプロモーターから発現されるポリヌクレオチド、
b)1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド、及び
c)遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、植物内のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する遺伝子改変。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、植物内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結され、場合により植物は次の1つ以上またはそのすべてを更に含む:
d)油体被覆(OBC)ポリペプチド、好ましくはLDAPをコードする第3の外因性ポリヌクレオチド、
e)第4の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する植物と比較したとき、植物の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第4の外因性ポリヌクレオチド、
f)第2の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、植物の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第2の遺伝子改変、及び
g)第3の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第3の遺伝子改変。
a)植物内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする第1の外因性ポリヌクレオチド、
b)1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド、及び
c)油体被覆(OBC)ポリペプチド、好ましくはLDAPをコードする第3の外因性ポリヌクレオチド。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、植物内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結され、かつ、該植物では、ヌクレオチド配列が配列番号176に示された配列の補体である第3の外因性ポリヌクレオチドを含む、相当する植物と比較して、1つ以上の非極性脂質のレベル及び/またはOBCポリペプチド量が増加している。
d)第1の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、植物のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第1の遺伝子改変、
e)第4の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する植物と比較したとき、植物の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第4の外因性ポリヌクレオチド、
f)第2の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、植物の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第2の遺伝子改変、及び
g)第3の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第3の遺伝子改変。
a)第2の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する植物と比較したとき、植物の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド、
b)第1の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、植物の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第1の遺伝子改変、及び
c)第2の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第2の遺伝子改変。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、植物内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。
d)1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第3の外因性ポリヌクレオチド、
e)第3の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、植物のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第3の遺伝子改変、及び
f)油体被覆(OBC)ポリペプチド、好ましくはLDAPをコードする第4の外因性ポリヌクレオチド。
a)植物内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチド、好ましくはWRI転写因子をコードする第1の外因性ポリヌクレオチド、
b)中鎖長(C8〜C14)を有する脂肪酸に対して優先的活性のあるLPAATである、1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド、及び
c)第3の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する植物と比較したとき、植物の色素体からのC8〜C14脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第3の外因性ポリヌクレオチド。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、植物内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。
d)1つ以上の非極性脂質の生合成に関与する更に別のポリペプチドをコードする第4の外因性ポリヌクレオチド、
e)第1の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、植物のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第1の遺伝子改変、
f)油体被覆(OBC)ポリペプチド、好ましくはLDAPをコードする第5の外因性ポリヌクレオチド、
g)第2の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、植物の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第2の遺伝子改変、及び
h)第3の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第3の遺伝子改変。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、植物内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。
a)塊茎内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする第1の外因性ポリヌクレオチド、及び
b)1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、生長期のジャガイモ植物の塊茎内でのポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。
c)油体被覆(OBC)ポリペプチド、好ましくはLDAPをコードする第3の外因性ポリヌクレオチド、
d)第1の遺伝子改変を欠く、相当する塊茎と比較したとき、塊茎のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第1の遺伝子改変であって、該ポリペプチドがSDP1である遺伝子改変、
e)第4の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する塊茎と比較したとき、塊茎の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第4の外因性ポリヌクレオチド、
f)第2の遺伝子改変を欠く、相当する塊茎と比較したとき、塊茎の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第2の遺伝子改変、及び
g)第3の遺伝子改変を欠く、相当する塊茎と比較したとき、塊茎の色素体でのジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第3の遺伝子改変。
a)植物またはその一部での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする第1の外因性ポリヌクレオチド、
b)1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、生長期の植物またはその一部でのポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。
a)植物の茎(複数を含む)内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする第1の外因性ポリヌクレオチド、及び
b)1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド。ここでの外因性ポリヌクレオチドの少なくとも1つ、好ましくは少なくとも第1の外因性ポリヌクレオチドは、植物生育期の葉よりも、茎(複数を含む)内で優先的に発現するプロモーターと作動可能に連結される。
c)油体被覆(OBC)ポリペプチド、好ましくはLDAPをコードする第3の外因性ポリヌクレオチド、
d)第1の遺伝子改変を欠く、相当する植物またはその一部と比較したとき、植物またはその一部のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第1の遺伝子改変、
e)第4の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する植物またはその一部と比較したとき、植物またはその一部の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第4の外因性ポリヌクレオチド、
f)第2の遺伝子改変を欠く、相当する植物またはその一部と比較したとき、植物またはその一部の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第2の遺伝子改変、及び
g)第3の遺伝子改変を欠く、相当する植物またはその一部と比較したとき、植物またはその一部の色素体でのジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第3の遺伝子改変。
a)植物またはその一部での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする第1の外因性ポリヌクレオチド、及び
b)1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、植物生長期の植物またはその一部のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。
a)植物の内胚乳内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする第1の外因性ポリヌクレオチド、及び
b)1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド。ここでの外因性ポリヌクレオチドの少なくとも1つ、好ましくは少なくとも第1の外因性ポリヌクレオチドは、植物生育期の葉よりも、内胚乳内に高レベルで発現するプロモーターと作動可能に連結される。
c)油体被覆(OBC)ポリペプチド、好ましくはLDAPをコードする第3の外因性ポリヌクレオチド、
d)第1の遺伝子改変を欠く、相当する植物またはその一部と比較したとき、植物またはその一部のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第1の遺伝子改変、
e)第4の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する植物またはその一部と比較したとき、植物またはその一部の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第4の外因性ポリヌクレオチド、
f)第2の遺伝子改変を欠く、相当する植物またはその一部と比較したとき、植物またはその一部の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第2の遺伝子改変、及び
g)第3の遺伝子改変を欠く、相当する植物またはその一部と比較したとき、植物またはその一部の色素体でのジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第3の遺伝子改変。
a)外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する植物と比較して、植物の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド、
b)第1の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、植物の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第1の遺伝子改変、及び
c)第2の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第2の遺伝子改変。ここでの外因性ポリヌクレオチドは、植物またはその一部内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。
i)配列番号21〜75または205〜210のいずれか1つに示された配列であるアミノ酸を含むポリペプチド、またはその生物学的に活性な断片、またはアミノ酸配列が配列番号21〜75または205〜210のいずれか1つ以上と少なくとも30%同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド、
ii)配列がi)と少なくとも30%同一であるヌクレオチド、及び
iii)ストリンジェントな条件下でi)及び/またはii)にハイブリダイズするヌクレオチド。好ましくは、WRI1ポリペプチドは、Arabidopsis thaliana WRI1(配列番号21または22)以外のWRI1ポリペプチドである。より好ましくは、WRI1ポリペプチドは、配列番号208に示された配列であるアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片、またはアミノ酸配列がそれと少なくとも30%同一であるポリペプチドを含む。
a)PDATをコードする第1の外因性ポリヌクレオチド、
b)第1の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチド、好ましくはTGDポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第1の遺伝子改変、及び次の1つ以上:
c)遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞内のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチド、好ましくはSDP1ポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第2の遺伝子改変、
d)第2の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチド、好ましくは脂肪酸アシルチオエステラーゼをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド、及び
e)第3の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第3の遺伝子改変。ここでの各外因性ポリヌクレオチドは、細胞内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される。好ましい実施形態では、細胞内の第1、第2または第3の遺伝子改変または第2の外因性ポリヌクレオチドの存在により、PDATを有するが、付加的な遺伝子改変または外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の非極性脂質の総含有量が相乗作用的に増加する。より好ましくは、少なくとも1つの外因性ポリヌクレオチドは、構成的プロモーター以外のプロモーターから発現する。
i)本明細書で定義される少なくとも1つの外因性ポリヌクレオチド及び/または少なくとも1つの遺伝子改変を真核細胞に導入し、本明細書で定義される外因性ポリヌクレオチド及び/または遺伝子改変のセットを含む真核細胞を産生すること、
ii)細胞またはその子孫細胞の外因性ポリヌクレオチド(複数を含む)を発現させること、
iii)細胞または子孫細胞の脂質含有量を分析すること、及び
iv)本発明の細胞を選択すること。
i)一方の植物が本明細書で定義される少なくとも1つの外因性ポリヌクレオチド及び/または少なくとも1つの遺伝子改変を含み、他方の植物が本明細書で定義される少なくとも1つの外因性ポリヌクレオチド及び/または少なくとも1つの遺伝子改変を含み、かつ両者間で2つの親植物が本明細書で定義される1組の外因性ポリヌクレオチド及び/または遺伝子改変を含む、2つの親植物を交配すること、
ii)本明細書で定義される外因性ポリヌクレオチド及び/または遺伝子改変のセットが存在するまたは存在しない交配種から1つ以上の子孫植物を選別すること、
iii)本明細書で定義される外因性ポリヌクレオチド及び/または遺伝子組み替えのセットを含む子孫植物を選択し、
それによって植物を産生すること。
i)本発明の組み換え真核細胞、本発明のトランスジェニック非ヒト生物若しくはその一部、本発明のトランスジェニック植物若しくはその一部、本発明の種子、または本発明のトランスジェニック細胞若しくはトランスジェニック植物若しくはその一部を得ること、
ii)加熱手段、化学的手段、若しくは酵素的手段またはそれらの任意の組み合わせを非ヒト生物またはその一部の脂質にin situで適用することにより、細胞、非ヒト生物若しくはその一部、植物若しくはその一部、または種子の少なくとも一部の脂質を工業製品に転換すること、及び
iii)工業製品を回収すること、
それによって工業製品を製造すること。
i)本発明の組み換え真核細胞、本発明のトランスジェニック非ヒト生物若しくはその一部、本発明のトランスジェニック植物若しくはその一部、本発明の種子、または本発明のトランスジェニック細胞若しくはトランスジェニック植物若しくはその一部を得ること、
ii)ステップi)の細胞、非ヒト生物若しくはその一部、植物若しくはその一部または種子を物理的に処理すること、
iii)加熱手段、化学的手段、若しくは酵素的手段またはそれらの任意の組み合わせを、処理された細胞、非ヒト生物若しくはその一部、植物若しくはその一部、または種子の脂質に適用することにより、処理された細胞、非ヒト生物若しくはその一部、植物若しくはその一部、または種子の少なくとも一部の脂質を同時にまたは後に工業製品へと転換すること、及び
iv)工業製品を回収すること、
それによって工業製品を製造すること。
i)少なくとも約18%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、約18%〜75%、約20%〜75%、約30%〜75%、約40%〜75%、約50%〜75%、約60%〜75%、または約25%〜50%(w/w乾重量)の非極性脂質の総含有量を有する生育植物部分を得ること、
ii)加熱手段、化学的手段、若しくは酵素的手段またはそれらの任意の組み合わせを生育植物部分の脂質にin situで適用することにより、生育植物部分の少なくとも一部の脂質を工業製品に転換すること、及び
iii)工業製品を回収すること、
それによって工業製品を製造すること。
i)少なくとも約18%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、約18%〜75%、約20%〜75%、約30%〜75%、約40%〜75%、約50%〜75%、約60%〜75%、または約25%〜50%(w/w乾重量)の非極性脂質の総含有量を有する生育植物部分を得ること、
ii)ステップi)の生育植物部分を物理的に処理すること、
iii)加熱手段、化学的手段、若しくは酵素的手段またはそれらの任意の組み合わせを、処理された生育植物部分の脂質に適用することにより、処理された生育植物部分の少なくとも一部の脂質を同時にまたは後に工業製品へと転換すること、及び
iv)工業製品を回収すること、
それによって工業製品を製造すること。
i)少なくとも約11%、少なくとも約12%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、8%〜75%、10%〜75%、11%〜75%、約15%〜75%、約20%〜75%、約30%〜75%、約40%〜75%、約50%〜75%、約60%〜75%、または約25%〜50%(w/w乾重量)の非極性脂質の総含有量を有する生育植物部分を得ることであって、該植物が16:3植物またはその生育部分であるステップ、
ii)加熱手段、化学的手段、若しくは酵素的手段またはそれらの任意の組み合わせを生育植物部分の脂質にin situで適用することにより、生育植物部分の少なくとも一部の脂質を工業製品へと転換すること、及び
iii)工業製品を回収すること、
それによって工業製品を製造すること。
i)少なくとも約11%、少なくとも約12%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、8%〜75%、10%〜75%、11%〜75%、約15%〜75%、約20%〜75%、約30%〜75%、約40%〜75%、約50%〜75%、約60%〜75%、または約25%〜50%(w/w乾重量)の非極性脂質の総含有量を有する生育植物部分を得ることであって、該植物が16:3植物またはその生育部分であるステップ、
ii)ステップi)の生育植物部分を物理的に処理すること、
iii)加熱手段、化学的手段、若しくは酵素的手段またはそれらの任意の組み合わせを、処理された生育植物部分の脂質に適用することにより、処理された生育植物部分の少なくとも一部の脂質を同時にまたは後に工業製品へと転換すること、及び
iv)工業製品を回収すること、
それによって工業製品を製造すること。
(a)細胞、非ヒト生物若しくはその一部、植物若しくはその一部、または種子の非極性脂質含有量の少なくとも一部を非極性脂質として抽出すること、
(b)抽出された非極性脂質を回収すること。ここでのステップ(a)及び(b)は、細胞、非ヒト生物若しくはその一部、植物若しくはその一部、または種子の少なくとも一部の脂質を工業製品へと転換するステップの前に実施される。
i)本発明の組み換え真核細胞、本発明のトランスジェニック非ヒト生物若しくはその一部、本発明のトランスジェニック植物若しくはその一部、本発明の種子、または本発明のトランスジェニック細胞若しくはトランスジェニック植物若しくはその一部を得ること、
ii)細胞、非ヒト生物若しくはその一部、植物若しくはその一部または種子から脂質を抽出すること、及び
iii)抽出された脂質を回収すること、
それによって抽出された脂質を製造すること。
i)少なくとも約18%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、約18%〜75%、約20%〜75%、約30%〜75%、約40%〜75%、約50%〜75%、約60%〜75%、または約25%〜50%(w/w乾重量)の非極性脂質の総含有量を有する生育植物部分を得ること、
ii)生育植物部分から脂質を抽出すること、及び
iii)抽出された脂質を回収すること、
それによって抽出された脂質を製造すること。
i)少なくとも約11%、少なくとも約12%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、8%〜75%、10%〜75%、11%〜75%、約15%〜75%、約20%〜75%、約30%〜75%、約40%〜75%、約50%〜75%、約60%〜75%、または約25%〜50%(w/w乾重量)の非極性脂質の総含有量を有する生育植物部分を得ることであって、該植物が16:3植物またはその生育部分であるステップ、
ii)生育植物部分から脂質を抽出すること、及び
iii)抽出された脂質を回収すること、
それによって抽出された脂質を製造すること。
i)本発明の植物を生長させること、及び
ii)その植物から種子を採取すること。
i)本発明の組み換え真核細胞、または本発明のトランスジェニック非ヒト生物であって、発酵に好適である該細胞または該非ヒト生物、及び発酵及び脂肪酸生合成に必要な成分を含む液体組成物を収容する容器を提供すること、ならびに
ii)前記容器内に収容された液体組成物の発酵を促す条件を与えること。
i)本発明の脂質を、場合により触媒の存在下で、アルコールと反応させ、アルキルエステルを得ること、及び
ii)場合により、該アルキルエステルと石油系燃料を混合すること。
i)本発明の組み換え真核細胞、本発明のトランスジェニック非ヒト生物若しくはその一部、本発明のトランスジェニック植物若しくはその一部、本発明の種子、または本発明のトランスジェニック細胞若しくはトランスジェニック植物若しくはその一部中の脂質を、熱分解または熱水処理を含む工程によりバイオ油に転換すること、または気化により合成ガスに転換すること、
ii)分画、好ましくは約150℃〜約200℃または約200℃〜約300℃で凝縮する炭化水素化合物の選別を含む工程により、バイオ油を合成ディーゼル燃料に転換すること、または金属触媒または微生物触媒を使用して合成ガスをバイオ燃料に転換すること。
配列番号1:Arabidopsis thalianaのDGAT1ポリペプチド(CAB44774.1)
配列番号2:Arabidopsis thalianaのDGAT2ポリペプチド(NP_566952.1)
配列番号3:Ricinus communisのDGAT2ポリペプチド(AAY16324.1)
配列番号4:Vernicia fordiiのDGAT2ポリペプチド(ABC94474.1)
配列番号5:Mortierella ramannianaのDGAT2ポリペプチド(AAK84179.1)
配列番号6:Homo sapiensのDGAT2ポリペプチド(Q96PD7.2)
配列番号7:Homo sapiensのDGAT2ポリペプチド(Q58HT5.1)
配列番号8:Bos taurusのDGAT2ポリペプチド(Q70VZ8.1)
配列番号9:Mus musculusのDGAT2ポリペプチド(AAK84175.1)
配列番号10:YFPトリペプチド−DGAT2及び/またはMGAT1/2の保存配列モチーフ
配列番号11:HPHGテトラペプチド−DGAT2及び/またはMGAT1/2の保存配列モチーフ
配列番号12:EPHSテトラペプチド−植物DGAT2の保存配列モチーフ
配列番号13:RXGFX(K/R)XAXXXGXXX(L/V)VPXXXFG(E/Q)−推定グリセロールリン脂質ドメインの一部であるDGAT2の長い保存配列モチーフ
配列番号14:FLXLXXXN−推定中性脂質結合ドメインであるマウスDGAT2及びMGAT1/2の保存配列モチーフ
配列番号15:GPATのplsCアシルトランスフェラーゼドメイン(PF01553)
配列番号16:GPATのHAD様ヒドロラーゼ(PF12710)スーパーファミリードメイン
配列番号17:ホスホセリンホスファターゼドメイン(PF00702)。GPAT4〜8は、このドメインに相同のN末端領域を含む。
配列番号18:保存GPATアミノ酸配列GDLVICPEGTTCREP
配列番号19:保存GPAT/ホスファターゼアミノ酸配列(モチーフI)
配列番号20:保存GPAT/ホスファターゼアミノ酸配列(モチーフIII)
配列番号21:Arabidopsis thalianaのWRI1ポリペプチド(A8MS57)
配列番号22:Arabidopsis thalianaのWRI1ポリペプチド(Q6X5Y6)
配列番号23:Arabidopsis lyrata subsp.lyrataのWRI1ポリペプチド(XP_002876251.1)
配列番号24:Brassica napusのWRI1ポリペぺチド(polypepetide)(ABD16282.1)
配列番号25:Brassica napusのWRI1ポリペチド(polyppetide)(ADO16346.1)
配列番号26:Glycine maxのWRI1ポリペプチド(XP_003530370.1)
配列番号27:Jatropha curcasのWRI1ポリペプチド(AEO22131.1)
配列番号28:Ricinus communisのWRI1ポリペプチド(XP_002525305.1)
配列番号29:Populus trichocarpaのWRI1ポリペプチド(XP_002316459.1)
配列番号30:Vitis viniferaのWRI1ポリペプチド(CBI29147.3)
配列番号31:Brachypodium distachyonのWRI1ポリペプチド(XP_003578997.1)
配列番号32:Hordeum vulgare subsp.vulgareのWRI1ポリペプチド(BAJ86627.1)
配列番号33:Oryza sativaのWRI1ポリペプチド(EAY79792.1)
配列番号34:Sorghum bicolorのWRI1ポリペプチド(XP_002450194.1)
配列番号35:Zea maysのWRI1ポリペプチド(ACG32367.1)
配列番号36:Brachypodium distachyonのWRI1ポリペプチド(XP_003561189.1)
配列番号37:Brachypodium sylvaticumのWRI1ポリペプチド(ABL85061.1)
配列番号38:Oryza sativaのWRI1ポリペプチド(BAD68417.1)
配列番号39:Sorghum bicolorのWRI1ポリペプチド(XP_002437819.1)
配列番号40:Sorghum bicolorのWRI1ポリペプチド(XP_002441444.1)
配列番号41:Glycine maxのWRI1ポリペプチド(XP_003530686.1)
配列番号42:Glycine maxのWRI1ポリペプチド(XP_003553203.1)
配列番号43:Populus trichocarpaのWRI1ポリペプチド(XP_002315794.1)
配列番号44:Vitis viniferaのWRI1ポリペプチド(XP_002270149.1)
配列番号45:Glycine maxのWRI1ポリペプチド(XP_003533548.1)
配列番号46:Glycine maxのWRI1ポリペプチド(XP_003551723.1)
配列番号47:Medicago truncatulaのWRI1ポリペプチド(XP_003621117.1)
配列番号48:Populus trichocarpaのWRI1ポリペプチド(XP_002323836.1)
配列番号49:Ricinus communisのWRI1ポリペプチド(XP_002517474.1)
配列番号50:Vitis viniferaのWRI1ポリペプチド(CAN79925.1)
配列番号51:Brachypodium distachyonのWRI1ポリペプチド(XP_003572236.1)
配列番号52:Oryza sativaのWRI1ポリペプチド(BAD10030.1)
配列番号53:Sorghum bicolorのWRI1ポリペプチド(XP_002444429.1)
配列番号54:Zea maysのWRI1ポリペプチド(NP_001170359.1)
配列番号55:Arabidopsis lyrata subsp.lyrataのWRI1ポリペプチド(XP_002889265.1)
配列番号56:Arabidopsis thalianaのWRI1ポリペプチド(AAF68121.1)
配列番号57:Arabidopsis thalianaのWRI1ポリペプチド(NP_178088.2)
配列番号58:Arabidopsis lyrata subsp.lyrataのWRI1ポリペプチド(XP_002890145.1)
配列番号59:Thellungiella halophilaのWRI1ポリペプチド(BAJ33872.1)
配列番号60:Arabidopsis thalianaのWRI1ポリペプチド(NP_563990.1)
配列番号61:Glycine maxのWRI1ポリペプチド(XP_003530350.1)
配列番号62:Brachypodium distachyonのWRI1ポリペプチド(XP_003578142.1)
配列番号63:Oryza sativaのWRI1ポリペプチド(EAZ09147.1)
配列番号64:Sorghum bicolorのWRI1ポリペプチド(XP_002460236.1)
配列番号65:Zea maysのWRI1ポリペプチド(NP_001146338.1)
配列番号66:Glycine maxのWRI1ポリペプチド(XP_003519167.1)
配列番号67:Glycine maxのWRI1ポリペプチド(XP_003550676.1)
配列番号68:Medicago truncatulaのWRI1ポリペプチド(XP_003610261.1)
配列番号69:Glycine maxのWRI1ポリペプチド(XP_003524030.1)
配列番号70:Glycine maxのWRI1ポリペプチド(XP_003525949.1)
配列番号71:Populus trichocarpaのWRI1ポリペプチド(XP_002325111.1)
配列番号72:Vitis viniferaのWRI1ポリペプチド(CBI36586.3)
配列番号73:Vitis viniferaのWRI1ポリペプチド(XP_002273046.2)
配列番号74:Populus trichocarpaのWRI1ポリペプチド(XP_002303866.1)
配列番号75:Vitis viniferaのWRI1ポリペプチド(CBI25261.3)
配列番号76:Sorbi−WRL1
配列番号77:Lupan−WRL1
配列番号78:Riccco−WRL1
配列番号79:Lupin angustifoliusのWRI1ポリペプチド
配列番号80:Aspergillus fumigatusのDGAT1ポリペプチド(XP_755172.1)
配列番号81:Ricinus communisのDGAT1ポリペプチド(AAR11479.1)
配列番号82:Vernicia fordiiのDGAT1ポリペプチド(ABC94472.1)
配列番号83:Vernonia galamensisのDGAT1ポリペプチド(ABV21945.1)
配列番号84:Vernonia galamensisのDGAT1ポリペプチド(ABV21946.1)
配列番号85:Euonymus alatusのDGAT1ポリペプチド(AAV31083.1)
配列番号86:Caenorhabditis elegansのDGAT1ポリペプチド(AAF82410.1)
配列番号87:Rattus norvegicusのDGAT1ポリペプチド(NP_445889.1)
配列番号88:Homo sapiensのDGAT1ポリペプチド(NP_036211.2)
配列番号89:WRI1モチーフ(R G V T/S R H R W T G R)
配列番号90:WRI1モチーフ(F/Y E A H L W D K)
配列番号91:WRI1モチーフ(D L A A L K Y W G)
配列番号92:WRI1モチーフ(S X G F S/A R G X)
配列番号93:WRI1モチーフ(H H H/Q N G R/K W E A R I G R/K V)
配列番号94:WRI1モチーフ(Q E E A A A X Y D)
配列番号95:Brassica napusのオレオシンポリペプチド(CAA57545.1)
配列番号96:Brassica napusのオレオシンS1−1ポリペプチド(ACG69504.1)
配列番号97:Brassica napusのオレオシンS2−1ポリペプチド(ACG69503.1)
配列番号98:Brassica napusのオレオシンS3−1ポリペプチド(ACG69513.1)
配列番号99:Brassica napusのオレオシンS4−1ポリペプチド(ACG69507.1)
配列番号100:Brassica napusのオレオシンS5−1ポリペプチド(ACG69511.1)
配列番号101:Arachis hypogaeaのオレオシン1ポリペプチド(AAZ20276.1)
配列番号102:Arachis hypogaeaのオレオシン2ポリペプチド(AAU21500.1)
配列番号103:Arachis hypogaeaのオレオシン3ポリペプチド(AAU21501.1)
配列番号104:Arachis hypogaeaのオレオシン5ポリペプチド(ABC96763.1)
配列番号105:Ricinus communisのオレオシン1ポリペプチド(EEF40948.1)
配列番号106:Ricinus communisのオレオシン2ポリペプチド(EEF51616.1)
配列番号107:Glycine maxのオレオシンアイソフォームaポリペプチド(P29530.2)
配列番号108:Glycine maxのオレオシンアイソフォームbポリペプチド(P29531.1)
配列番号109:Linum usitatissimumのオレオシン低分子量アイソフォームポリペプチド(ABB01622.1)
配列番号110:Linum usitatissimumのオレオシン高分子量アイソフォームポリペプチドのアミノ酸配列(ABB01624.1)
配列番号111:Helianthus annuusのオレオシンポリペプチド(CAA44224.1)
配列番号112:Zea maysのオレオシンポリペプチド(NP_001105338.1)
配列番号113:Brassica napusのステロレオシンポリペプチド(ABM30178.1)
配列番号114:Brassica napusのステロレオシンSLO1−1ポリペプチド(ACG69522.1)
配列番号115:Brassica napusのステロレオシンSLO2−1ポリペプチド(ACG69525.1)
配列番号116:Sesamum indicumのステロレオシンポリペプチド(AAL13315.1)
配列番号117:Zea maysのステロレオシンポリペプチド(NP_001152614.1)
配列番号118:Brassica napusのカレオシンCLO−1ポリペプチド(ACG69529.1)
配列番号119:Brassica napusのカレオシンCLO−3ポリペプチド(ACG69527.1)
配列番号120:Sesamum indicumのカレオシンポリペプチド(AAF13743.1)
配列番号121:Zea maysのカレオシンポリペプチド(NP_001151906.1)
配列番号122:(ゲノムに挿入された)pJP3502 TDNA配列
配列番号123:pJP3507ベクター配列
配列番号124:リンカー配列
配列番号125:hpRNAiサイレンシングのために選択されたNicotiana benthamianaのCGI−58部分配列(pTV46)
配列番号126:hpRNAiサイレンシングのために選択されたN.tabacumのAGPase部分配列(pTV35)
配列番号127:GXSXGリパーゼモチーフ
配列番号128:HX(4)Dアシルトランスフェラーゼモチーフ
配列番号129:VX(3)HGF推定脂質結合モチーフ
配列番号130:Arabidopsis thalianaのCGi58ポリヌクレオチド(NM_118548.1)
配列番号131:Brachypodium distachyonのCGi58ポリヌクレオチド(XM_003578402.1)
配列番号132:Glycine maxのCGi58ポリヌクレオチド(XM_003523590.1)
配列番号133:Zea maysのCGi58ポリヌクレオチド(NM_001155541.1)
配列番号134:Sorghum bicolorのCGi58ポリヌクレオチド(XM_002460493.1)
配列番号135:Ricinus communisのCGi58ポリヌクレオチド(XM_002510439.1)
配列番号136:Medicago truncatulaのCGi58ポリヌクレオチド(XM_003603685.1)
配列番号137:Arabidopsis thalianaのLEC2ポリヌクレオチド(NM_102595.2)
配列番号138:Medicago truncatulaのLEC2ポリヌケロチド(polynucelotide)(X60387.1)
配列番号139:Brassica napusのLEC2ポリヌケロチド(polynucelotide)(HM370539.1)
配列番号140:Arabidopsis thalianaのBBMポリヌクレオチド(NM_121749.2)
配列番号141:Medicago truncatulaのBBMポリヌクレオチド(AY899909.1)
配列番号142:Arabidopsis thalianaのLEC2ポリペプチド(NP_564304.1)
配列番号143:Medicago truncatulaのLEC2ポリペプチド(CAA42938.1)
配列番号144:Brassica napusのLEC2ポリペプチド(ADO16343.1)
配列番号145:Arabidopsis thalianaのBBMポリペプチド(NP_197245.2)
配列番号146:Medicago truncatulaのBBMポリペプチド(AAW82334.1)
配列番号147:Aspergilus nigerの誘導性alcAプロモーター
配列番号148:エタノールの存在下でAlcAプロモーターを活性化する、AlcRインデューサー
配列番号149:Arabidopsis thalianaのLEC1;(AAC39488)
配列番号150:Arabidopsis lyrataのLEC1(XP_002862657)
配列番号151:Brassica napusのLEC1(ADF81045)
配列番号152:Ricinus communisのLEC1(XP_002522740)
配列番号153:Glycine maxのLEC1(XP_006582823)
配列番号154:Medicago truncatulaのLEC1(AFK49653)
配列番号155:Zea maysのLEC1(AAK95562)
配列番号156:Arachis hypogaeaのLEC1(ADC33213)
配列番号157:Arabidopsis thalianaのLEC1様(AAN15924)
配列番号158:Brassica napusのLEC1様(AHI94922)
配列番号159:Phaseolus coccineusのLEC1様(AAN01148)
配列番号160:Arabidopsis thalianaのFUS3(AAC35247)
配列番号161:Brassica napusのFUS3
配列番号162:Medicago truncatulaのFUS3
配列番号163:Arabidopsis thalianaのSDP1 cDNA配列、アクセッション番号NM_120486、3275nt
配列番号164:Brassica napusのSDP1 cDNA;アクセッション番号GN078290
配列番号165:Brachypodium distachyonのSDP1 cDNA、2670nt
配列番号166:Populus trichocarpaのSDP1 cDNA、3884nt
配列番号167:Medicago truncatulaのSDP1 cDNA;XM_003591377;2490nt
配列番号168:Glycine maxのSDP1 cDNA XM_003521103;2783nt
配列番号169:Sorghum bicolorのSDP1 cDNA XM_002458486;2724nt
配列番号170:Zea maysのSDP1 cDNA、NM_001175206;2985nt
配列番号171:Physcomitrella patensのSDP1 cDNA、XM_001758117;1998nt
配列番号172:Hordeum vulgareのSDP1 cDNA、AK372092;3439nt
配列番号173:Nicotiana benthamianaのSDP1 cDNA、Nbv5tr6404201
配列番号174:hpRNAiサイレンシングの標的とされるNicotiana benthamianaのSDP1 cDNA領域
配列番号175:Arabidopsis thalianaのSDP1遺伝子のプロモーター、1.5kb
配列番号176:pJP3502のT−DNA内のpSSU−オレオシン遺伝子の相補体であるヌクレオチド配列。順に(相補配列):Glycine maxレクチンターミネーター348nt、3´エキソン255nt、UBQ10イントロン304nt、5´エキソン213nt、SSUプロモーター1751nt
配列番号177:Arabidopsis thalianaの色素体GPAT cDNA、NM_179407
配列番号178:Arabidopsis thalianaの色素体GPATポリペプチド、NM_179407
配列番号179:Populus trichocarpaの色素体GPAT cDNA、XP_006368351
配列番号180:Jatropha curcasの色素体GPAT cDNA、ACR61638
配列番号181:Ricinus communisの色素体GPAT cDNA、XP_002518993
配列番号182:Helianthus annuusの色素体GPAT cDNA、ADV16382
配列番号183:Medicago truncatulaの色素体GPAT cDNA、XP_003612801
配列番号184:Glycine maxの色素体GPAT cDNA、XP_003516958
配列番号185:Carthamus tinctoriusの色素体GPAT cDNA、CAHG3PACTR
配列番号186:Solanum tuberosumの色素体GPAT cDNA、XP_006352898
配列番号187:Oryza sativa,Japonicaの色素体GPAT cDNA、NM_001072027
配列番号188:Sorghum bicolorの色素体GPAT cDNA、XM_002467381
配列番号189:Zea maysの色素体GPAT cDNA、NM_001158637
配列番号190:Hordeum vulgareの色素体GPAT cDNA、AK371419
配列番号191:Physcomitrella patensの色素体GPAT cDNA、XM_001771247
配列番号192:Chlamydomonas reinhardtiiの色素体GPAT cDNA、XM_001694925
配列番号193:Cinnamomum camphora 14:0−ACPチオエステラーゼ(Cinca−TE)、葉緑体、382aa、(アクセッション番号Q39473.1)
配列番号194:Cocos nuciferaのアシル−ACPチオエステラーゼFatB1(Cocnu−TE1;417aa、アクセッション番号AEM72519.1
配列番号195:Cocos nuciferaのアシル−ACPチオエステラーゼFatB2(Cocnu−TE2;423aa、アクセッション番号AEM72520.1)
配列番号196:Cocos nuciferaのアシル−ACPチオエステラーゼFatB3(Cocnu−TE3;414aa、アクセッション番号AEM72521.1)
配列番号197:Cuphea lanceolataのアシル−(ACP)チオエステラーゼB型(Cupla−TE、419aa、アクセッション番号CAB60830.1)
配列番号198:Cuphea viscosissimaのFatB1(Cupvi−TE;419aa、アクセッション番号AEM72522.1)
配列番号199:Umbellularia californicaの12:0−ACPチオエステラーゼ(ラウロイル−アシル担体タンパク質チオエステラーゼ)(Umbca−TE、382aa;アクセッション番号Q41635.1)
配列番号200:Cocos nuciferaのLPAAT(Cocnu−LPAAT、308aa、アクセッション番号Q42670.1)
配列番号201:Arabidopsis thalianaの色素体LPAAT1(Arath−PLPAAT;356aa、アクセッション番号AEE85783.1)
配列番号202:Arabidopsis thalianaのFATA1
配列番号203:Arabidopsis thalianaのFATA2
配列番号204:Arabidopsis thalianaのFATB
配列番号205:Arabidopsis thalianaのWRI3
配列番号206:Arabidopsis thalianaのWRI4
配列番号207:Avena sativaのWRI1
配列番号208:Sorghum bicolorのWRI1
配列番号209:Zea maysのWRI1
配列番号210:Triadica sebiferaのWRI1
配列番号211:S.tuberosum PatatinのB33プロモーター配列
配列番号212〜215及び245〜254:オリゴヌクレオチドプライマー
配列番号216:Z.maysのSEE1プロモーター領域(アクセッション番号AJ494982の1970nt)
配列番号217:A.littoralisのAlSAPプロモーター配列、アクセッション番号DQ885219
配列番号218:A.rhizogenesのArRolCプロモーター配列、アクセッション番号DQ160187
配列番号219:N.benthamianaの色素体GPATの732bp断片を含むhpRNAi構築物
配列番号220:Elaeis guineensis(アブラヤシ)のDGAT1
配列番号221:G.maxのMYB73、アクセッション番号ABH02868
配列番号222:A.thalianaのbZIP53、アクセッション番号AAM14360
配列番号223:A.thalianaのAGL15、アクセッション番号NP_196883
配列番号224:A.thalianaのMYB118、アクセッション番号AAS58517
配列番号225:A.thalianaのMYB115、アクセッション番号AAS10103
配列番号226:A.thalianaのTANMEI、継承番号BAE44475
配列番号227:A.thalianaのWUS、アクセッション番号NP_565429
配列番号228:B.napusのGFR2a1、アクセッション番号AFB74090
配列番号229:B.napusのGFR2a2、アクセッション番号AFB74089
配列番号230:A.thalianaのPHR1、アクセッション番号AAN72198
配列番号231:N.benthamianaのTGD1断片
配列番号232:ジャガイモのSDP1アミノ酸
配列番号233:ジャガイモのSDP1ヌクレオチド配列
配列番号234:ジャガイモのAGPase小サブユニット
配列番号235:ジャガイモのAGPase小サブユニットヌクレオチド配列:
配列番号236:Sapium sebiferumのLDAP−1ヌクレオチド配列
配列番号237:Sapium sebiferumのLDAP−1アミノ酸配列
配列番号238:Sapium sebiferumのLDAP−2ヌクレオチド配列
配列番号239:Sapium sebiferumのLDAP−2アミノ酸配列
配列番号:240:Sapium sebiferumのLDAP−3ヌクレオチド配列
配列番号241:Sapium sebiferumのLDAP−3アミノ酸配列
配列番号242:S.bicolorのSDP1(アクセッション番号XM_002463620)
配列番号243:T.aestivumのSDP1ヌクレオチド配列(アクセッション番号AK334547)
配列番号244:S.bicolorのSDP1 hpRNAi断片
別途具体的に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、(例えば、細胞培養、分子遺伝学、植物生物学、細胞生物学、タンパク質化学、脂質及び脂肪酸化学、バイオ燃料製造、ならびに生化学において)当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有するものと解釈されるものとする。
「トランスジェニック非ヒト生物」という用語は、例えば、1つ以上の外因性ポリヌクレオチド(導入遺伝子)またはポリペプチドを含む、植物、藻類、非ヒト動物、または酵母若しくは真菌等の発酵に好適な生物全体を指す。ある実施形態では、トランスジェニック非ヒト生物は、動物またはその一部ではない。一実施形態では、トランスジェニック非ヒト生物は、日光からエネルギーを得て、栄養のための有機化合物を合成することができる、光合成生物(例えば、植物または藻類)である。
本発明は、本明細書で指定する以下から選択される改変の組み合わせにより、組み換え真核細胞の非極性脂質含有量を増加させることができるという知見に基づいている:(A)プッシュ型、(B)プル型、(C)防御的、(D)パッケージ、(E)色素体移出、(F)色素体移入及び(G)原核型経路。本明細書に記載するように、色素体のない細胞は、A〜Dの種々の組み合わせを含み、対して色素体のある細胞、例えば植物及び藻類の細胞はA〜Gの種々の組み合せを含み得る。
1)A、B及び場合によりC、D、E、FまたはGのうちのいずれか;
2)A、C及び場合によりD、E、FまたはGのうちのいずれか;
3)A、D及び場合によりE、FまたはGのうちのいずれか;
4)A、E及び場合によりFまたはG;
5)A、F及び場合によりG;
6)A及びG;
7)A、B、C及び場合によりD、E、FまたはGのうちのいずれか;
8)A、B、D及び場合によりE、FまたはGのうちのいずれか;
9)A、B、E及び場合によりFまたはG;
10)A、B、F及び場合によりG;
11)A、B、C、D及び場合によりE、FまたはGのうちのいずれか;
12)A、B、C、E及び場合によりFまたはG;
13)A、B、C、F及び場合によりG;
14)A、B、D、E及び場合によりFまたはG;
15)A、B、D、F及び場合によりG;
16)A、B、E、F及び場合によりG;
17)A、C、D及び場合によりE、FまたはGのうちのいずれか;
18)A、C、E及び場合によりFまたはG;
19)A、C、F及び場合によりG;
20)A、C、D、E及び場合によりFまたはG;
21)A、C、D、F及び場合によりG;
22)A、C、E、F及び場合により第5の改変G;
23)A、D、E及び場合によりFまたはG;
24)A、D、F及び場合によりG;
25)A、D、E、F及び場合によりG;
26)A、E、F及び場合によりG;
27)A、B、C、D、E、FまたはGのうちのいずれかを除外した、A、B、C、D、E、F及びGのうちの6つ、ならびに
28)細胞内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、2つ以上の異なる転写因子ポリペプチドをコードする2つ以上の外因性ポリヌクレオチド、例えば、WRI1をコードする、ある外因性ポリヌクレオチドと、LEC2をコードする別の外因性ポリヌクレオチドとが存在している、上記1〜26のうちの任意のいずれか。
真核細胞では、脂肪酸の合成及び脂肪酸(例えばTAG)を組み込んでいる脂質の合成に、種々の転写因子が関与しているため、これを操作してプッシュ型改変を行うことができる。好適な転写因子は、WRI1である。本明細書で使用される場合、「Wrinkled 1」または「WRI1」または「WRL1」という用語は、解糖系及びde novo脂肪酸生合成に関与する数種の酵素の発現を調節するAP2/ER WEBPクラスの転写因子を指す。WRI1は、2つの植物特異的(AP2/EREB)DNA結合ドメインを有する。少なくともArabidopsisのWRI1は、解糖系を介してスクロースの解体も調節し、それにより脂肪酸生合成のための前駆体の供給を調節する。言い換えると、光合成産物から貯蔵脂質への炭素の流れを制御する。少なくともArabidopsisのwri1変異体は、TAGへのスクロース及びグルコースの組み込みに欠損があるため、しわのある種子の表現型を有する。
1.R G V T/S R H R W T G R(配列番号89)。
2.F/Y E A H L W D K(配列番号90)。
3.D L A A L K Y W G(配列番号91)。
4.S X G F S/A R G X(配列番号92)。
5.H H H/Q N G R/K W E A R I G R/K V(配列番号93)。
6.Q E E A A A X Y D(配列番号94)。
i)配列番号142〜144のいずれか1つに示された配列であるアミノ酸を含むポリペプチド、若しくはその生物学的に活性な断片、またはアミノ酸配列が配列番号142〜144のいずれか1つ以上と少なくとも30%同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド、
ii)配列がi)と少なくとも30%同一であるヌクレオチド、及び
iii)ストリンジェントな条件下で、i)またはii)の一方または両方とハイブリダイズするポリヌクレオチド。
i)配列番号145または146のいずれか1つに示された配列であるアミノ酸を含むポリペプチド、若しくはその生物学的に活性な断片、またはアミノ酸配列が配列番号145または146の一方または両方と少なくとも30%同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド、
ii)配列がi)と少なくとも30%同一であるヌクレオチド、及び
iii)ストリンジェントな条件下で、i)またはii)の一方または両方とハイブリダイズするポリヌクレオチド。
本明細書で使用される場合、「脂肪酸アシルアシルトランスフェラーゼ」という用語は、アシル−CoA、PCまたはアシル−ACP、好ましくはアシル−CoAまたはPCからアシル基を基質上に転移させ、TAG、DAGまたはMAGを形成できるタンパク質を指す。このようなアシルトランスフェラーゼとして、DGAT、PDAT、MGAT、GPAT及びLPAATが挙げられる。
i)配列番号1または80〜88のいずれか1つに示された配列であるアミノ酸を含むポリペプチド、またはその生物学的に活性な断片、またはアミノ酸配列が配列番号1または80〜88のいずれか1つ以上と少なくとも30%同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド、
ii)配列がi)と少なくとも30%同一であるヌクレオチド、及び
iii)ストリンジェントな条件下で、i)またはii)の一方または両方とハイブリダイズするポリヌクレオチド。
i)配列番号2〜9のいずれか1つに示された配列であるアミノ酸を含むポリペプチド、またはその生物学的に活性な断片、またはアミノ酸配列が配列番号2〜9のいずれか1つ以上と少なくとも30%同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド、
ii)配列がi)と少なくとも30%同一であるヌクレオチド、及び
iii)ストリンジェントな条件下で、i)またはii)の一方または両方とハイブリダイズするポリヌクレオチド。
植物の種子及び花粉は、一般に直径0.5〜2.5mの範囲である油体と呼ばれる細胞下構造にTAGを蓄積する。本明細書で使用される場合、「脂肪滴」(「油体」とも称する)は、主にTAGを含めた中性脂質の貯蔵または交換のための脂質豊富な細胞オルガネラである。脂肪滴の大きさは、約20nm〜100μmまでと、非常に様々である。これらのオルガネラは、いくつかの組み込みタンパク質を含有するリン脂質単層に囲まれたTAGコアを有し、このタンパク質は脂質代謝及び貯蔵ならびに他の膜への脂質輸送に関与し、油体が植物の種子または花組織由来である場合、オレオシンを含む(Jolivet et al.,2004)。これらは一般に0.5〜3.5%をタンパク質が占め、対する残りが脂質である。大部分の細胞で最も密度が低いオルガネラであり、したがって浮遊遠心法により容易に分離することができる。オレオシンは、種子由来の油体の膜内にある最も豊富なタンパク質である(少なくとも80%)。
i)配列番号95〜112のいずれか1つに示された配列であるアミノ酸を含むポリペプチド、またはその生物学的に活性な断片、またはアミノ酸配列が配列番号95〜112のいずれか1つ以上と少なくとも30%同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド、
ii)配列がi)と少なくとも30%同一であるヌクレオチド、及び
iii)ストリンジェントな条件下で、i)またはii)の一方または両方とハイブリダイズするポリヌクレオチド。
i)配列番号113〜117のいずれか1つに示された配列であるアミノ酸を含むポリペプチド、若しくはその生物学的に活性な断片、またはアミノ酸配列が配列番号113〜117のいずれか1つ以上と少なくとも30%同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド、
ii)配列がi)と少なくとも30%同一であるヌクレオチド、及び
iii)ストリンジェントな条件下で、i)またはii)の一方または両方とハイブリダイズするポリヌクレオチド。
i)配列番号237、239または241のいずれか1つに示された配列であるアミノ酸を含むポリペプチド、若しくはその生物学的に活性な断片、またはアミノ酸配列が配列番号237、239または241のいずれか1つ以上と少なくとも30%同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド、
ii)配列がi)と少なくとも30%同一であるヌクレオチド、及び
iii)ストリンジェントな条件下で、i)またはii)の一方または両方とハイブリダイズするポリヌクレオチド。
本明細書で使用される場合、「脂質分解に関与するポリペプチド及び/または脂質含有量を減少させるポリペプチド」という用語は、細胞中の正常レベル(野生型)を下回る下方調節により細胞中の、好ましくは植物の生育部分、塊茎、食用根または種子の細胞中の油(例えば、脂肪酸及び/またはTAG)のレベルの増加をもたらす、脂質を異化するいずれかのポリペプチドを指す。このようなポリペプチドの例として、リパーゼ、または例えばCGi58(Comparative Gene identifier−58様)ポリペプチド、SUGAR−DEPENDENT1(SDP1)トリアシルグリセロールリパーゼ(例えば、Kelly et al.,2012を参照)及びWO2009/027335に記載のリパーゼ等のリパーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
i)配列番号130〜136のいずれか1つに示された配列を含むヌクレオチド、
ii)配列番号130〜136のいずれか1つ以上と少なくとも30%同一である配列を含むヌクレオチド、及び
iii)ストリンジェントな条件下で、i)またはii)の一方または両方とハイブリダイズするポリヌクレオチド。
i)配列番号163〜174のいずれか1つに示された配列を含むヌクレオチド、
ii)配列番号163〜174に示された配列のいずれか1つ以上と少なくとも30%、配列が同一であるヌクレオチド、及び
iii)ストリンジェントな条件下で、i)またはii)の一方または両方とハイブリダイズするヌクレオチドの配列。
本明細書で使用される場合、「細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチド」という用語は、色素体内(植物の生育部分、塊茎、食用根または種子の細胞等の、色素体を有する細胞内)から、色素体外部(例えば小胞体(ER)等の細胞の他のいずれかの部分であっても良い)への脂肪酸の移送を補助する、いずれかのポリペプチドを指す。このようなポリペプチドの例としては、C16またはC18脂肪酸チオエステラーゼ(例えばFATAポリペプチドまたはFATBポリペプチド)、C8〜C14脂肪酸チオエステラーゼ(FATBポリペプチドでもある)、ABCA9ポリペプチド等の脂肪酸トランスポーター、または長鎖アシル−CoAシンテターゼ(LACS)が挙げられるが、これらに限定されない。
植物部分の色素体内でのジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの活性を抑制することによって、例えば、このようなポリペプチドをコードする内因性遺伝子の変異、または色素体内でのジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与する標的遺伝子の発現を抑制するサイレンシングRNA分子をコードする外因性遺伝子の導入のいずれかによって、例えば、生育植物部分の非極性脂質のレベルも増加させることができる。
植物部分のTGDポリペプチドの活性を抑制すること、例えばTGDポリペプチドをコードする内因性遺伝子の変異、または内因性TGD遺伝子の発現を抑制するサイレンシングRNA分子をコードする外因性遺伝子の導入のいずれかによっても、生育植物部分の非極性脂質のレベルを増加させることができる。本明細書で使用される場合、「トリガラクトシルジアシルグリセロール(TGD)ポリペプチド」は、ER内での葉緑体の脂質輸送(Xu et al.,2010)に関与するもの、及び脂質に対するパーミアーゼ機能を有するタンパク質複合体の形成に関与するものである。TGDパーミアーゼを形成する、またはそれと会合するこのようなポリペプチドとして、TGD−1(アクセッション番号At1g19800及び他種のホモログ)、TGD−2(アクセッション番号At2g20320及び他種のホモログ)、TGD−3(アクセッション番号NM−105215及び他種のホモログ)及びTGD−4(At3g06960及び他種のホモログ)(US20120237949)の4つが既知である。TGD−1、TGD−2及びTGD−3のポリペプチドは、葉緑体の内側エンベロープ膜に会合するATP結合カセット(ABC)トランスポーターの成分であると考えられている。TGD−2及びTGD−4ポリペプチドはホスファチジン酸と結合するが、TGD−3ポリペチド(TGD−3 polypetide)は葉緑体ストロマのATPaseとして機能する。本明細書で使用される場合、「内因性TGD遺伝子」は、植物のTGDポリペプチドをコードする遺伝子である。A.thalianaのTGD−1遺伝子変異によって、トリアシルグリセロール、オリゴガラクト脂質及びホスファチジン酸(PA)の蓄積が生じた(Xu et al.,2005)。TGD遺伝子またはSDP1遺伝子の変異、すなわち実際には所望するいずれの植物遺伝子の変異も、当技術分野において既知である、人工ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、TALエフェクター(TALEN)またはCRISPR技術(Cas9型ヌクレアーゼを使用)によって部位特異的な方式で導入することができる。サイレンシングRNAをコードする好適な外因性遺伝子は、二重鎖RNA分子、例えばヘアピンRNAまたは人工マイクロRNA前駆体をコードするものである。
本明細書で使用される場合、「FAD2」という用語は、オレイン酸(C18:1Δ9)を不飽和化してリノール酸(C18:2Δ9,12)を生成する膜結合デルタ12脂肪酸デスチュレーゼ(desturaze)を指す。
一実施形態では、本発明の組み換え/トランスジェニック細胞は、サイレンシングサプレッサーを含んで良い。
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は同じ意味で使用される。各用語は、長さを問わないポリマー形態のヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの両方、またはそのアナログを指す。本発明のポリヌクレオチドは、ゲノム、cDNA、半合成若しくは合成起源、2本鎖若しくは1本鎖のものであっても良く、また、その起源または操作によって、(1)自然界で伴うポリヌクレオチドの全部または一部を伴わない、(2)自然界で連結されるもの以外のポリヌクレオチドに連結する、または(3)自然界で生じない。ポリヌクレオチドの非限定的例としては、遺伝子または遺伝子断片のコード若しくは非コード領域、エキソン、イントロン、メッセンジャーRNA(mRNA)、転移RNA(tRNA)、リボソームRNA(rRNA)、リボザイム、cDNA、組み換えポリヌクレオチド、色素体、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、任意の配列のキメラDNA、核酸プローブ、及びプライマーが挙げられる。in vitroで使用するため、ポリヌクレオチドを標識化成分とのコンジュゲート等によって修飾しても良い。
RNA干渉
RNA干渉(RNAi)は、遺伝子の発現を特異的に抑制するのに特に有用であり、遺伝子がタンパク質をコードする場合は、特定のタンパク質の産生を抑制する。理論に束縛されるものではないが、Waterhouse et al.,(1998)により、dsRNA(二本鎖RNA)を用いてタンパク質産生を抑制できる機構モデルが提唱されている。この技術は、目的遺伝子またはその一部のmRNAと本質的に同一である配列を含むdsRNA分子の存在を利用する。好都合にも、dsRNAは、組み換えベクターまたは宿主細胞中で単一プロモーターから産生することができ、センス配列とアンチセンス配列の間に関連のない配列が隣接することにより、センス配列とアンチセンス配列をハイブリダイズさせ、ループ構造を形成する非関連配列を有するdsRNA分子を形成することができる。好適なdsRNA分子の設計及び製造は、具体的には、Waterhouse et al.,(1998)、Smith et al.,(2000)、WO99/32619、WO99/53050、WO99/49029及びWO01/34815を考慮して、当業者が十分達成し得る範囲である。
マイクロRNA(略語miRNA)は一般に、不完全なステムループ構造を形成する大きな前駆体から誘導される、19〜25ヌクレオチド(通常、植物においては約20〜24ヌクレオチド)の非コーディングRNA分子である。miRNAは、標的メッセンジャーRNA転写物(mRNA)上の相補的な配列に結合し、通常、翻訳の抑制または標的の分解及び遺伝子サイレンシングをもたらす。人工miRNA(amiRNA)は、当技術分野において周知のように、天然miRNAに基づいて設計し、目的とする任意の遺伝子の発現を抑制することができる。
遺伝子は、関連内因性遺伝子及び/またはゲノム中に既に存在している導入遺伝子の発現を抑制することができ、その現象は、相同性依存遺伝子サイレンシングと称される。
相同性依存遺伝子サイレンシングの事例のほとんどは、2つに分類され、1つは導入遺伝子の転写レベルで機能するものであり、もう1つは転写後に作動するものである。
「アンチセンスポリヌクレオチド」という用語は、内因性ポリペプチドをコードする特定のmRNAと少なくとも一部に対して相補的であり、mRNA翻訳等の転写後事象を阻害することができるDNAまたはRNA分子を意味すると理解すべきである。アンチセンス法の使用は、当技術分野において周知である(例えば、G.Hartmann and S.Endres,Manual of Antisense Methodology,Kluwer(1999)を参照)。植物におけるアンチセンス技法の使用は、Bourque(1995)及びSenior(1998)により概説されている。Bourque(1995)は、植物系での遺伝子不活化の方法としてアンチセンス配列をいかに利用するかについて、数多くの例を挙げている。Bourqueはまた、部分阻害は、ほぼ確実に系内に測定可能な変化をもたらすため、必ずしもいずれかの酵素活性の阻害を100%達成する必要はない場合があると述べている。Senior(1998)は、アンチセンス法は、現時点で非常によく確立された、遺伝子発現操作のための技術であることを述べている。
本発明の一実施形態は、組み換えベクターを含み、該組み換えベクターは、本明細書で定義される少なくとも1つのポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドを宿主細胞に送達することができる。組み換えベクターとしては、発現ベクターが挙げられる。組み換えベクターは、非相同のポリヌクレオチド配列、すなわち、自然には見出されず、本明細書で定義されるポリヌクレオチドに隣接し、好ましくは、異なる種に由来するポリヌクレオチド配列を含む。ベクターは、RNAまたはDNAのいずれかであり得、典型的にはウイルスに由来するウイルスベクター、またはプラスミドであるプラスミドベクターとしては、典型的に、原核生物細胞での発現カセットの容易な選択、増幅及び形質転換を提供する付加的な核酸配列、例えばpUC由来のベクター、pGEM由来のベクターまたは1つ以上のT−DNA領域を含むバイナリーベクターが挙げられる。付加的な核酸配列は、ベクターの自律複製を提供する複製起点、選択マーカー遺伝子(好ましくは、抗生物質耐性または除草剤耐性をコードする遺伝子)、核酸構築物中のコードされた核酸配列または遺伝子を挿入するための複数の部位を提供する固有の多重クローニング部位、ならびに原核細胞及び真核細胞(特に植物)の形質転換を増強する配列を含む。
本明細書で使用される場合、「発現ベクター」は、宿主細胞を形質転換すること、及び1個以上の特定のポリヌクレオチドの発現を生じさせることができる、DNAベクターである。本発明の発現ベクターは、転写制御配列、翻訳制御配列、複製起点等の調節配列、及び宿主細胞と適合性があり、かつ本発明のポリヌクレオチドの発現を制御する他の調節配列を含む。特に、本発明の発現ベクターは、転写制御配列を含む。転写制御配列は、転写の開始、伸長及び終結を制御する配列である。特に重要な転写制御配列は、プロモーター、エンハンサー、オペレーター及びリプレッサー配列等の、転写開始を制御するものである。使用する調節配列の選択は、目的とする植物及び/または標的器官若しくは組織等の標的生物に応じて異なる。このような調節配列は、植物若しくは植物ウイルス等の任意の真核生物から得ても良く、または化学的に合成しても良い。植物細胞の安定したトランスフェクションまたはトランスジェニック植物の確立に好適な数多くのベクターが、例えば、Pouwels et al.,Cloning Vectors:A Laboratory Manual,1985,supp.1987、Weissbach and Weissbach,Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,1989、及びGelvin et al.,Plant Molecular Biology Manual,Kluwer Academic Publishers,1990に記載されている。典型的には、植物発現ベクターは、例えば、5’及び3’調節配列の転写制御下の1つ以上のクローン化した植物遺伝子、ならびに優性選択マーカーを含む。ポリアデニル化このような植物発現ベクターはまた、プロモーター調節領域(例えば、誘発性若しくは構成的、環境的若しくは発生的調節、または細胞若しくは組織特異的発現を制御する調節領域)、転写開始出発部位、リボソーム結合部位、転写終結部位、及び/またはポリアデニル化シグナルも含むことができる。
(1996)により記載されているArabidopsis thalianaのmyb関連遺伝子プロモーター(Atmyb5)は、葉に特異的である。Atmyb5プロモーターは、若いロゼット及び茎葉の縁上にある成長期の葉トリコーム、托葉及び外皮細胞で、ならびに未成熟な種子で発現する。Busk et al.(1997)により、トウモロコシで同定された葉プロモーターもまた使用することができる。
転移核酸は、外因性ポリヌクレオチドを細胞に送達するために使用することができ、1つ、好ましくは2つの境界配列と、1つ以上の目的ポリヌクレオチドとを含む。転移核酸は、選択マーカーをコードしても良く、またはコードしなくても良い。好ましくは、転移核酸は、細菌中でバイナリーベクターの一部を形成し、該バイナリーベクターは、細菌中でのベクターの複製を可能にするか、またはバイナリーベクターを含む細菌細胞の選択若しくは持続を可能にする要素を更に含む。真核細胞へ転移すると、バイナリーベクターの転移核酸成分は、真核細胞へのゲノムの組み込み、あるいは一過性発現実験では、細胞内での発現のみが可能である。
本発明はまた、本明細書で定義される1つ以上のポリヌクレオチド若しくはベクター、またはその組み合わせを用いて形質転換される宿主細胞である、組み換え細胞、例えば、組み換え植物細胞または真菌細胞も提供する。本発明の好適な細胞としては、本明細書に記載するRNA、ポリペプチドまたは酵素をコードする本発明のポリヌクレオチドまたは組み換えベクターで形質転換することができる、あらゆる細胞が挙げられる。細胞は、それによって脂質の産生に使用できる細胞である。組み換え細胞は、培養物中の細胞、in vitro細胞、または例えば植物等の生物中の細胞、または例えば種子若しくは葉等の器官中の細胞であっても良い。好ましくは、細胞は植物中にあり、より好ましくは植物の種子中にある。一実施形態では、組み換え細胞は非ヒト細胞である。
本発明はまた、本発明の1つ以上の外因性ポリヌクレオチド若しくはポリペプチド及び1つ以上の遺伝子改変、本発明の細胞、本発明のベクター、またはこれらの組み合わせを含む植物も提供する。「植物」という用語は、名詞として使用される場合、植物全体を指すが、「その一部」という用語は、植物器官(例えば、葉、茎、根、花、果実)、単一の細胞(例えば、花粉)、種子、種子の部分(例えば、胚、内胚乳、胚盤または種皮等)、脈管組織等の植物組織、植物細胞及びその子孫を指す。本明細書で使用される場合、植物部分は植物細胞を含む。
またはその含水量によって観察可能である。
トランスジェニック植物は、一般に、Slater et al.,Plant Biotechnology−The Genetic Manipulation of Plants,Oxford University Press(2003)、及びChristou and Klee、Handbook of Plant Biotechnology,John Wiley and Sons(2004)に記載されているもの等の、当技術分野で既知の技術を使用して産生することができる。
一実施形態では、TILLING法(Targeting Induced Local Lesions IN Genomes)は、内因性遺伝子、例えば、SDP1若しくはTGDポリペプチド、色素体GPAT、色素体LPAAT、ホスファチジン酸ホスファターゼ(PAP)、またはその2つ以上の組み合わせをコードする遺伝子に突然変異が含まれる植物を産生するために使用することができる。第1のステップでは、化学的変異原で種子(または花粉)を処理することによって新しい一塩基対変化等の誘導型変異を植物の集団に誘発させ、その後、変異が安定的に継承される世代まで植物を成長させる。DNAを抽出し、集団の全メンバーからの種子を貯蔵して、経時的に繰り返して利用できる供給源を作成する。TILLINGアッセイのために、特異的エンドヌクレアーゼを用いるヘテロデュプレックス法を使用して、一塩基多型(SNP)を検出することができる。あるいは、突然変異誘発性植物プールからの次世代DNAシーケンシングを使用して、最適な遺伝子の突然変異体を同定することができる。典型的には、突然変異誘発性集団において1000植物当たり1つの突然変異体の変異頻度が達成される。この手法を使用することで、何千もの植物をスクリーニングし、ゲノムの任意の遺伝子または特定の領域における一塩基変化、ならびに小挿入若しくは欠失(1〜30bp)を伴うあらゆる個体を同定することができる。TILLINGについては、Slade and Knauf(2005)、ならびにHenikoff et al.(2004)に更に詳細に記載されている。
ゲノム編集は、非特異的DNA切断モジュールと融合された配列特異的DNA結合ドメインで構成される、RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼまたはヌクレアーゼ等の人工ヌクレアーゼを使用する。この人工ヌクレアーゼにより、標的DNA二本鎖の切断を誘発させ、細胞の内因性細胞DNA修復機構を刺激して、誘発された切断を修復することにより、効率的かつ正確な遺伝子改変を可能にする。このような機構として、例えば、エラーが発生しやすい非相同末端結合(NHEJ)と、相同組み換え修復(HDR)が挙げられる。
上記の部位特異的なヌクレアーゼとは異なり、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列(clustered regulatory interspaced short palindromic repeats、CRISPR)/CASシステムは、RNA誘導型DNA切断を経て、標的遺伝子の変更を誘発するためのZFN及びTALENの代替法を提供する。
植物バイオマスの総脂質含有量の増加は、エネルギー含有量が大きくなることと同じであり、飼料または馬草として、またはバイオ燃料の産生に使用したとき、より経済的になる。
燃焼とは、可燃性の物質を空気または酸素の存在下で発熱を伴い燃えるようにする方法である。基本的な方法は酸化である。燃焼は、バイオマスをエネルギーに使用できるようにする最も単純な方法であり、熱を提供するために用いられる。この熱は、それ自身、多くの方法で用いることができる:1)空内暖房、2)集中暖房若しくは地域暖房またはプロセス加熱用の水(または他の流体)加熱、3)発電または原動力のための蒸気発生。可燃性燃料物質がバイオマスの形態である場合、酸化は主に、セルロース、ヘミセルロース、リグニン及び存在する他の分子中の炭素(C)及び水素(H)による二酸化炭素(CO2)と水(H2O)の形成である。本発明の植物は、脂質含有量の増加によって、改善された燃焼用燃料を提供する。
ガス化は、部分的な酸化方法であり、これにより、植物バイオマス等の炭素源を一酸化炭素(CO)と水素(H2)、加えて二酸化炭素(CO2)、及び場合によってはメタン(CH4)等の炭化水素分子へと分解する。ガス化が比較的低温(例えば700℃〜1000℃)で行われる場合、生成物ガスは高温ガス化と比較して比較的高い濃度の炭化水素を有する。その結果、蒸気タービンを介した発熱または発電のための燃焼、または適切なガス浄化を伴う、発電のための内燃機関の稼働にこれを直接使用することができる。単純なボイラー用の燃焼チャンバは、ガス化装置に密連結されていても良く、または発生炉ガスは、長鎖炭化水素(タール)が浄化され、輸送され、貯蔵及び遠隔操作で燃焼されるものであっても良い。ガス化システムは、発電用の複合サイクルガスタービンと密に統合されていても良い(IGCC−石炭ガス化複合発電(integrated gasification combined cycle))。高温(1200℃〜1600℃)でのガス化により、生成物ガス中の炭化水素がほとんどなくなり、CO及びH2の比率が高くなる。これは、例えばフィッシャー・トロプシュ(FT)合成等の技術を用いた長鎖炭化水素の合成に使用できるため、合成ガス(合成ガスまたはバイオ合成ガス)として知られている。H2とCOとの比が適切(2:1)である場合、FT合成を使用して、合成ガスを従来の化石ディーゼル及びディーゼルエンジンとの適合性がある高品質の合成ディーゼルバイオ燃料へと転換することができる。
本明細書で使用される場合、「熱分解」という用語は、酸素の非存在下で徐加熱を利用して、バイオマスからガス生成物、油生成物、及び炭化生成物を製造する方法を意味する。熱分解は、脂質系物質、特にトリグリセリド系物質の熱転換または熱化学転換である。熱分解の生成物には、ガス、液体及び固体炭が含まれ、それぞれの比率は当該方法のパラメーターに依存する。蒸気の滞留時間が約1秒またはそれ以下に抑えられるという条件で、低温度(約400℃)では、より固形の炭が生成される傾向があり(低速熱分解)、一方、ある程度の高温(約500℃)では、はるかに高比率の液体(バイオ油)が生成される。約275℃〜約375℃の温度を用いると、長鎖炭化水素を高比率で有する液体バイオ油を製造することができる。熱分解は、脂質の直接熱分解または熱及び接触分解の併用を含む。約400〜500℃の温度で分解が発生し、短鎖炭化水素(例えばアルカン類、アルケン類、アルカジエン類、芳香族類、オレフィン類及びカルボン酸類)ならびに一酸化炭素及び二酸化炭素が産生される。
本明細書で使用される場合、「エステル交換」とは、アルカリまたは酸等の触媒の存在下で、メタノールまたはエタノール等の短鎖アルコールと反応させることにより、脂質(主にトリアシルグリセロール)を脂肪酸メチルエステルまたはエチルエステルに転換することである。低コスト及び入手の容易さにより、より一般的にはメタノールが使用されるが、エタノール、プロパノール若しくはブタノールまたはアルコールの混合物を使用しても良い。触媒は、均一触媒、不均一触媒または酵素触媒でも良い。均一触媒としては、硫酸第二鉄、次いでKOHが挙げられる。不均一触媒としては、CaO、K3PO4及びWO3/ZrO2が挙げられる。酵素触媒には、Candida antarcticaから産生されるNovozyme435が挙げられる。
当技術分野で日常的に行われている手法を使用して、本発明の細胞、生物、またはその一部によって産生される、TAG等の非極性脂質を抽出、処理、精製及び分析することができる。このような手法は、Fereidoon Shahidi,Current Protocols in Food Analytical Chemistry,John Wiley & Sons,Inc.(2001)D1.1.1−D1.1.11、及びPerez−Vich et al.(1998)等の出展の文献全体を通して記載及び説明されている。
通常、植物種子は煮沸、圧搾及び/または抽出され、粗種子油を得た後、脱ガム、精製、脱色及び脱臭される。一般に、種子を破砕するための手法は、当技術分野で既知である。例えば、油糧種子は、水を噴霧することによって、例えば8.5%まで含水量を上昇させることによって柔らかくし、滑面ロールを使用して0.23〜0.27mmの間隙調整でフレーク状にすることができる。種子の種類によっては、破砕する前に水を加えなくても良い。加熱により、酵素を不活性化し、更なる細胞破壊を促進し、脂肪滴を癒合させ、タンパク質粒子を塊にする。これらはいずれも抽出工程を容易にする。
脱ガムは、油精製の初期ステップであり、その主な目的は、油からリン脂質(総抽出脂質の約1〜2%で存在し得る)の大部分を除去することである。典型的には、リン酸を含む約2%の水を70〜80℃で原油に添加することにより、微量の金属及び色素とともにリン脂質の大部分が分離される。除去される不溶性物質は主にリン脂質とトリアシルグリセロールの混合物であり、レシチンとしてもまた知られている。脱ガムは、濃縮したリン酸を粗種子油に添加して非水和性リン脂質を水和可能な形態に変換し、存在する少量の金属をキレート化することによって行うことができる。ガムは、遠心分離によって種子油から分離される。種子油は、十分量の水酸化ナトリウム溶液を添加して、すべての脂肪酸を滴定し、それにより形成された石鹸を除去することによって精製することができる。
アルカリ精製は、原油を処理するための精製工程の一つであり、中和とも称される。通常、脱色の前、脱ガムの後に行われる。脱ガムの後、すべての脂肪酸及びリン酸を滴定するために十分な量のアルカリ溶液を添加して、それにより形成される石鹸を除去することにより、種子油を処理することができる。好適なアルカリ性物質としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム及び水酸化アンモニウムが挙げられる。この方法は通常、室温で実施され、遊離脂肪酸分画を除去する。遠心分離または溶媒中への石鹸の抽出により石鹸を除去し、中和された油を水で洗浄する。必要な場合、油中に過剰量のアルカリがあれば、好適な酸(例えば、塩酸または硫酸)で中和しても良い。
脱色は、漂白土の存在下(0.2〜2.0%)及び酸素の不在下で、窒素または蒸気とともに、または真空中で操作することにより、10〜30分、90〜120℃で油を加熱する精製工程の一つである。油処理のこのステップは、不必要な色素(カロチノイド、クロロフィル、ゴシポール等)の除去を目的としており、当該方法により、酸化産物、微量金属、硫黄化合物及び微量の石鹸もまた除去される。
脱臭は、高温(200〜260℃)及び低圧(0.1〜1mmHg)での油及び脂質の処理である。これは通常、種子油100mLあたり約0.1mL/分の速度で、蒸気を種子油に導入することにより行われる。脱臭は、真空下で種子油を260℃に加熱し、種子油100mLあたり約0.1mL/分の速度で蒸気を種子油中に緩やかに導入することによって行うことができる。約30分のスパージ後、種子油を真空下で冷却させる。種子油は通常、ガラス容器に移し、アルゴンでフラッシングした後、冷凍下で貯蔵される。種子油の量が限られている場合、種子油を真空下、例えばParr反応器中に置き、脱臭に要し得る時間と同じ長さで260℃まで加熱することができる。この処理は、種子油の色を改善し、大半の揮発性物質、または何らかの残留遊離脂肪酸、モノアシルグリセロール及び酸化生成物を含む臭気化合物を除去する。
脱ろうは、油及び脂質を、周囲以下の温度での結晶化により、固体(ステアリン)及び液体(オレイン)留分へと分離するために、市販の油製品に時折用いられる工程である。元々は、固形分のない製品を製造するために綿実油に適用されていた。典型的には、油の飽和脂肪酸含有量を減少させるために用いられる。
藻類は、陸生植物よりも、年に10〜100倍もの質量を産生することができ、開口池(水路型池及び湖等)またはフォトバイオリアクター内で培養することができる。最も一般的な油産生藻類は通常、珪藻植物(bacillariophytes)、緑藻類(chlorophytes)、青緑藻類(cyanophytes)及び金茶藻類(chrysophytes)を含み得る。加えて、ハプト藻類(haptophytes)として知られる第五の群を用いても良い。群には、褐藻類及び黄色藻類(heterokonts)を含む。非限定的な藻類の具体例としては、以下のクラスが含まれる:緑藻類(Chlorophyceae)、Eustigmatophyceae、ハプト藻類(Prymnesiophyceae)、珪藻類(Bacillariophyceae)。油を産生することができる珪藻類には、以下の属が含まれる:Amphipleura、Amphora、Chaetoceros、Cyclotella、Cymbella、Fragilaria、Hantzschia、Navicula、Nitzschia、Phaeodactylum及びThalassiosira。油を産生することができる緑藻類の非限定的な具体例としては、Ankistrodesmus、Botryococcus、Chlorella、Chlorococcum、Dunaliella、Monoraphidium、Oocystis、Scenedesmus及びTetraselmisが挙げられる。一態様では、緑藻類はChlorellaまたはDunaliellaであり得る。油を産生することができる青緑藻類(cyanophytes)の非限定的な具体例としては、Oscillatoria及びSynechococcusが挙げられる。油を産生することができる金茶藻類(chrysophytes)の具体例としては、Boekeloviaが挙げられる。ハプト藻類の非限定的な具体例としては、Isochysis及びPleurochysisが挙げられる。
記載される方法によって生成される脂質は、種々の用途を有する。いくつかの実施形態では、脂質は食物油として使用される。他の実施形態では、脂質は精製されて、潤滑剤としてまたはプラスチックの合成等の他の工業的用途に使用される。いくつかの好適な実施形態では、脂質を精製して、バイオディーゼルを製造する。本発明の植物、藻類及び菌類に由来される油から、バイオディーゼルを製造することができる。バイオ燃料を製造するための植物トリアシルグリセロールの使用は、Durrett et al.
(2008)に概説されている。この結果、得られる燃料は、一般にバイオディーゼルと称され、1.9〜6.0mm2s−1(ASTM D6751)の動的粘度範囲を有する。バイオアルコールは、糖類または脂質抽出後に残留した脂質以外のバイオマスの発酵から製造しても良い。バイオ燃料製造の一般的な方法は、例えば、Maher and Bressler(2007)、Greenwell et al.(2010)、Karmakar et al.(2010)、Alonso et al.(2010)、Liu et al.(2010a)、Gong and Jiang(2011)、Endalew et al.(2011)及びSemwal et al.(2011)で参照することができる。
バイオディーゼル、すなわちアルキルエステルの製造は周知である。脂質からのエステル製造には、次の3つの基本経路がある。すなわち、1)アルコールによる脂質の塩基触媒性エステル交換、2)メタノールによる脂質の直接的な酸触媒性エステル化、及び3)脂質を脂肪酸に変換した後の酸触媒によるアルキルエステルへの変換である。任意の方法を用いて、脂肪酸アルキルエステル及びグリセロールエーテル(グリセロール上の1、2、または3つのヒドロキシ基がエーテル化している)を調製することができる。例えば、脂肪酸は、例えば、TAGを酸触媒で加水分解または塩基触媒でけん化することにより、または酵素(例えばリパーゼまたはエステラーゼ)を使用することにより調製することができる。脂肪酸アルキルエステルは、酸触媒の存在下でアルコールと脂肪酸を反応させることにより調製することができる。脂肪酸アルキルエステルはまた、酸触媒または塩基触媒の存在下で、TAGとアルコールを反応させることによっても調製することができる。グリセロールエーテルは、例えば、塩基触媒の存在下で、グリセロールとアルキルハライドを反応させることにより、または酸触媒の存在下で、グリセロールと、オレフィン若しくはアルコールを反応させることにより調製することができる。アルキルエステルは、ディーゼル燃料と直接混合する、または混合前に、水若しくは他の水性溶液で洗浄し、様々な不純物(触媒を含む)を除去することができる。
バイオ燃料の性能を改善するために、バイオ油を石油由来のディーゼル燃料及び他の燃料(例えばジェット燃料)のバイオ由来代替物へと転換できる、熱及び触媒による化学結合の切断(クラッキング)技術が開発されている。
本発明は、飼料として使用することができる組成物を含む。本発明の目的とする「飼料」には、組織に栄養分を与える若しくは組織を作り上げる、またはエネルギーを供給する役目をする、及び/または適切な栄養状態若しくは代謝機能を維持、回復若しくは補助する役目をする、ヒトまたは動物の摂取のためのあらゆる食品または調製物が含まれる。本発明の飼料は、乳児及び/または幼児のための栄養組成物を含む。
本発明はまた、本発明の方法を使用して生成される1つ以上の脂質を含む組成物、特に医薬組成物も包含する。
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、一般に本明細書で同義に使用される。
一過性発現系での植物細胞における遺伝子の発現
遺伝子は、基本的に、Voinnet et al.(2003)及びWood et al.(2009)によって記載されたような一過性発現系を使用して植物細胞に発現させた。重複エンハンサー領域を含む強力なe35S構成的プロモーターによって発現するコード領域を含むバイナリーベクターを、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)系統AGL1に導入した。p19ウイルスサイレンシングサプレッサーを発現させるためのキメラバイナリーベクター35S:p19を、WO2010/057246に記載されたようなAGL1に別々に導入した。V2ウイルスサイレンシングサプレッサーを発現させるためのキメラバイナリーベクター35S:V2を、AGL1に別々に導入した。組み換え細胞を、50mg/Lのカナマイシン及び50mg/Lのリファンピシンを補充したLBブロス中で28℃にて静止期まで成長させた。次いで、室温にて5分間、5000gの遠心分離によって細菌をペレット化した後、10mMのMES(pH5.7)、10mMのMgCl2、及び100μMのアセトシリンゴンを含む浸潤緩衝液中に、OD600=1.0になるように再懸濁した。次いで、細胞を、28℃で3時間振盪しながらインキュベートした後、OD600を測定し、最終濃度OD600=0.125に達するまで、ウイルスサプレッサー構築物35S:p19または35S:V2を含む必要量の各培養物を新しい管に加えた。最終的な体積は、前述の緩衝液で補った。次いで、培養混合物を葉に浸潤させ、通常は浸潤後、更に3〜5日間植物を生長させた後、精製した細胞溶解物の調製または総脂質の単離のため、葉片を回収した。
Kereszt et al.(2007)によって記載されたように、塩素ガスを使用してBrassica napusの種子を殺菌し、組織培地上で発芽させた。Belide et al.(2013)によって記載されたように、2〜4mmの茎を有する子葉葉柄を単離し、外植体として使用した。バイナリーベクターを含むA.tumefaciensのAGL1(Lazo et al.,1991)培養物を調製し、Belide et al.(2013)によって記載されたように、子葉葉柄に培養物を接種した。感染させた子葉葉柄を1mg/LのTDZ+0.1mg/LのNAA+3mg/LのAgNO3+250mg/Lのセフォタキシム、50mg/Lのtimentin及び25mg/Lのカナマイシンを補充したMS培地で培養し、更に同一培地に対して隔週で継代培養しながら、16時間/8時間の明暗光周期にて24℃で4週間、培養した。緑色カルスを有する外植体をシュート誘導培地(MS+1mg/Lのカイネチン+3mg/LのAgNO3+250mg/Lのセフォタキシム+50mg/Lのtimentin+25mg/Lのカナマイシン)に移し、更に2〜3週間培養した。小さいシュート(約1cm)を耐性カルスから単離し、シュート伸長培地(0.1mg/Lのジベレリン酸+3mg/LのAgNO3+250mg/Lのセフォタキシム+25mg/Lのカナマイシンを有するMS培地)に移し、更に2週間培養した。1または2枚の葉を有する健康なシュートを選択して、発根培地(1mg/LのNAA+20mg/LのADS+3mg/LのAgNO3+250mg/Lのセフォタキシムを有する1/2MS)に移し、2〜3週間培養した。製造業者のプロトコルに記載されているように、植物DNA単離キット(Bioline、Alexandria,NSW,Australia)を使用して、耐性シュートの小さい葉からDNAを単離した。ゲノムDNAに対するPCR増幅試験によってT−DNA配列の存在を確認した。根を有する陽性トランスジェニックシュートを、育苗用混合物(seedling raising mix)を含むポットへ移し、温室内にて昼間24℃/夜間16℃(標準条件)で生長させた。
上記のように事前に浸潤させたNicotiana benthamianaの葉組織を、ガラスホモジナイザーを使用して、0.1Mのリン酸カリウム緩衝液(pH7.2)及び0.33Mのスクロースを含む溶液中ですりつぶした。葉ホモジェネートを、4℃、20,000gで45分間遠心分離し、その後、各上清を採集した。各上清中のタンパク質含有量を、Wallac1420マルチレベルカウンター及びBio−Rad Protein Assay色素試薬(Bio−Rad Laboratories、Hercules,CA USA)を使用して、Bradford(1976)に従って測定した。アシルトランスフェラーゼアッセイでは、Cao et al.(2007)に従い、一部変更を加え、100μgのタンパク質を使用した。反応培地には、100mMのTris−HCl(pH7.0)、5mMのMgCl2、1mg/mLのBSA(脂肪酸含まず)、200mMのスクロース、40mMの低温オレオイル−CoA、16.4μMのsn−2−モノオレオイルグリセロール[14C](55mCi/mmol、American Radiochemicals,Saint Louis,MO USA)または6.0μMの[14C]グリセロール−3−リン酸(G−3−P)ジナトリウム塩(150mCi/mmol、American Radiochemicals)を入れた。アッセイは、7.5分、15分、または30分にわたって行った。
Arabidposis種子中の含油量の分析
Arabidopsis種子等の小さな種子の種子含油量または総脂肪酸組成を計測しようとした場合、種子を破砕せずに、種子中の脂肪酸を直接メチル化した。種子はデシケーター中で24時間乾燥させ、およそ4mgの種子をテフロン(登録商標)加工のねじ蓋を含む2mLのガラスバイアルに移した。0.1mLのトルエンに溶解した0.05mgのトリヘプタデカノイン(3つのC17:0脂肪酸を有するTAG)を内部標準物質としてバイアルに添加した。0.7mLの1NメタノールHCl(Supelco)を、種子物質を含むバイアルに添加することにより、種子の脂肪酸をメチル化した。Arabidopsis種子等の小さな種子での完全なメチル化に、種子の破砕は必要なかった。混合物を短時間ボルテックスし、80℃で2時間インキュベートした。混合物を室温にまで冷却した後、0.3mlの0.9% NaCl(w/v)及び0.1mlのヘキサンをバイアルに添加し、10分間、Heidolph Vibramax 110中で十分に混合した。FAMEを0.3mLのガラスインサート中へ回収し、後述のように、水素炎イオン化検出器(FID)を搭載したGCにより分析した。
カノーラ種子及びCamelina種子等の大きな単一種子中の脂肪酸組成を決定するには、種皮を破砕することを除き、Arabidopsis種子の場合と同様に、種子中の脂肪酸に直接的なメチル化を実施する。この方法により、脂肪酸組成分析が可能である十分な油を種子から抽出した。種子から抽出された全脂質中の脂肪酸組成を決定するため、種子を破砕し、CHCl3/MeOHを用いて脂質を抽出した。抽出された脂質のアリコートをメチル化して、GCにより分析した。カノーラのプールされた種子全体の脂質含有量(種子油含有量)は、破砕後の既知重量の乾燥種子からCHCl3/MeOHを用いて脂質を2回抽出した後、この脂質のアリコートを内部標準物質である17:0脂肪酸とともにメチル化することにより測定した。Camelinaの場合、Arabidopsisの油分析と同様、既知量の種子からの脂質を既知量の17:0脂肪酸とともにメチル化して、FAMEをGCにより分析した。TAG定量化のため、17:0のTAGを内部標準物質として使用し、TLCを用いて抽出された脂質からTAGを分画し、シリカ中で直接メチル化した。この方法を以下で詳細に説明する。
溶解物アッセイによる脂質をクロロホルム:メタノール:0.1M KCl(2:1:1)を使用して抽出し、回収した。サンプル中の異なる脂質クラスを、10%のホウ酸を含浸させたSilica Gel60薄層クロマトグラフィー(TLC)プレート(Merck、Dermstadt,Germany)上で分離した。脂質抽出物からTAGを分画するために使用した溶媒系は、クロロホルム/アセトン(90/10v/v)であった。個々の脂質クラスを、プレートをヨウ素蒸気に露出することによって視覚化し、同じTLCプレート上で正規標準物質を並列に移動させることによって特定した。プレートを蛍光体撮像スクリーンに一晩露出して、Fujifilm FLA−5000ホスホイメージャーによって解析した後、液体シンチレーション計数法でDPMを定量化した。
葉及び他の生育組織サンプル中の総脂質の脂肪酸組成を、凍結乾燥させたサンプル中での脂肪酸の直接メチル化により決定した。総脂質定量化のために、17:0のFFAを加えた、既知重量の凍結乾燥させたサンプル中の脂肪酸を直接メチル化した。葉サンプル中の総TAGレベルを決定するために、抽出された総脂質からTLCによってTAGを分画し、17:0のTAG内部標準物質の存在下でメチル化した。これは、葉に相当量の極性脂質が存在するためである。これは以下のように実施した。葉サンプルを含む組織を凍結乾燥させ、計量し(乾重量)、Bligh and Dyer(1959)に記載のように、または溶媒としてクロロホルム:メタノール:0.1M KCl(CMK;2:1:1)を用いることにより総脂質を抽出した。凍結乾燥後、クロロホルム/メタノール(2/1v/v)混合物を、葉サンプル1cm直径当たり900μLで添加することにより、N.benthamiana葉サンプルから総脂質を抽出した。TLC−FID分析を実施した場合、葉乾重量0.5mg当たり0.8μgのDAGEを内部標準物質として添加した。サンプルをIKA ultra−turrax組織破砕機を用いてホモジナイズした後、500μLの0.1M KClを添加した。サンプルをボルテックスして、5分間遠心分離し、下相を回収した。残りの上相は、600μLのクロロホルムを添加し、ボルテックスして5分間遠心分離することにより、2回目の抽出をした。下相を回収し、先の回収物へプールした。脂質を窒素フロー下で乾燥させ、葉乾重量mg当たり2μLのクロロホルムで再懸濁した。N.tabacumの葉または葉サンプルの総脂質を、一部変更を加えて、上述のように抽出した。4または6枚の葉片(各々の表面積が約1cm2)を組み合わせた場合、1.6mLのCMK溶媒を使用し、一方、3枚以下の葉片を組み合わせた場合、1.2mLのCMKを使用した。凍結乾燥させた葉組織を、Reicht組織破砕機(Qiagen)を使用して3分間、20回/秒で、金属球を含むエッペンドルフ管内でホモジナイズした。
既知体積の葉抽出物全体(例えば、30μL)を、TLCシリカゲル60プレート(1x20cm)(Merck KGaA、Germany)上に載せた。中性脂質を種類別に分画し、ヘキサン/DEE/酢酸(70/30/1v/v/v)溶媒系を含む平衡化した展開槽内でTLCにより極性脂質から分離した。プリムリンを噴霧してTAGのバンドを視覚化し、紫外線下でマークして、TLCプレートから掻き取り、2mLのGCバイアルへと移し、N2で乾燥させた。各サンプルのTAG量に応じた、既知量の内部標準物質C17:0TAGとともに、750μLの1NメタノールHCl(Supelco analytical、USA)を各バイアルに添加した。通常、低TAGのサンプルには30μgの内部標準物質を添加し、対して高TAGのサンプルの場合は、最大200μgの内部標準物質を使用した。
SGE BPX70(70%シアノプロピルポリシルフェニレン−シロキサン)カラム(30mx0.25μm内径、フィルム厚0.25μm)、FID、スプリット/スプリットレスインジェクター及びAgilent Technologies 7693 Seriesオートサンプラー兼インジェクターを備えた、Agilent Technologies 7890A GC(Palo Alto,California,USA)を用いて、FAMEをGCにより分析した。キャリアガスとしてヘリウムを使用した。サンプルは、スプリットモード(スプリット比50:1)で、オーブン温度150℃で注入した。注入後、オーブンの温度を1分間、150℃に維持し、次いで3℃/min−1で210℃まで上げ、最終的に50℃/min−1で240℃まで上げた。既知量の外部標準物質GLC−411(Nucheck)及びC17:0−Me内部標準物質の応答に基づいて、Agilent Technologies ChemStationソフトウェア(Rev B.04.03(16)、Palo Alto,California,USA)でピークを定量化した。
1μLの脂質抽出物を、TLC−FID Iatroscan(商標)(Mitsubishi Chemical Medience Corporation−Japan)用のChromarod−SIIの1本に載せた。次に、Chromarodのラックを70mLのヘキサン/CHCl3/2−プロパノール/ギ酸(85/10.716/0.567/0.0567v/v/v/v)溶媒系を含む平衡化した展開槽へと移した。30分のインキュベーション後、Chromarodラックを100℃で3分間、乾燥させ、Iatroscan MK−6s TLC−FID分析器(Mitsubishi Chemical Medience Corporation−Japan)上で直ちにスキャンした。DAGE内部標準物質及びTAGのピーク面積を、SIC−480II積分ソフトウェア(Version:7.0−E SIC System instruments Co.,LTD−Japan)を使用して積分した。
最初に、市販の標準物質GLC−411(NU−CHEK PREP,Inc.,USA)中に存在する既知量の同じFAMEのピーク面積応答に基づいて、個々のFAMEのピーク面積を補正した。補正した面積を用いて、内部標準物質と比較することにより、サンプル中の各FAMEの質量を算出した。油は主にTAGの形態で貯蔵されているため、油の量は各サンプル中のFAMEの量に基づいて算出した。グリセロールの総モルは、FAMEのモル数を算出し、FAMEの総モルを3で割ることにより決定した。TAG量は、次式を使用してグリセロール及び脂肪酸アシル部分の総和として算出した:油重量%=100x((41x総モルFAME/3)+(総gFAME−(15x総モルFAME)))/g葉乾重量(ここで、41及び15は、それぞれグリセロール部分及びメチル基の分子量である)。
遺伝子構築物pJP3502を使用して、WO2013/096993のNicotiana tabacumに関する記載のように、アグロバクテリウム媒介性の形質転換プロトコルによって、Nicotiana benthamianaの安定的な形質転換植物を産生した。カナマイシン耐性によりトランスジェニック植物を選抜し、温室で成熟するまで生長させた。葉サンプルを結実時に採取し、凍結乾燥した。Bligh及びDyer(1959)によるサンプルからの総脂質の抽出に従った総脂肪酸(TFA)含有量(乾質量%)及び組成、ならびにトリアシルグリセロール(TAG)画分の含有量及び組成を決定した。データを表2及び表3に示す。最も油量の多い葉サンプルは、33重量%のTFA含有量を有したトランスジェニック植物#16由来であった。このサンプルは、22.5重量%(乾重量)のTAGを含有していた。
従来どおり構築物pJP3502を使用して、Nicotiana tabacumを形質転換した(WO2013/096993)。pJP3502由来のT−DNAによって形質転換されたホモ接合性T1植物から得た、高いTFA及びTAG含有量を有する種子を採取して播種し、導入遺伝子に対して均一なホモ接合性である新たな世代のT2子孫植物を確立した。植物の成熟葉が、野外での生長時に生じるような通常の樹冠構成で重なり合っている(「樹冠(canopy)」)か、または直射日光に最大限露出されるように(「非樹冠(non−canopy)」)、ポットを温室内に配置した。完全に生長した結実段階の葉サンプルを各植物から採集して、凍結乾燥した。Bligh及びDyer(1959)によるサンプルからの総脂質の抽出に従って、TAG画分の脂肪酸含有量を決定した(表6)。非樹冠の植物からの成熟葉組織のTAGレベルは通常、樹冠植物のものよりも高く、観察された葉のうち最大のTAG含有量は葉乾重量の20.6%であった。
トランスジェニック植物で、WRI1、Z.mays LEC1(アクセッション番号AAK95562;配列番号155)、DGAT及びオレオシンをコードする遺伝子の組み合わせを発現させることにより、単子葉植物(例えばC4植物S.bicolor(モロコシ))の含油量を増加させるようにキメラDNA構築物を設計した。バイオリスティック共形質転換のための数対の構築物を設計し、以下の通り、制限酵素ライゲーションによりクローニングして作製した。
放牧種として一般に使用されるマメ科植物である、双子葉植物種Trifolium repens(クローバー)の含油量を、生育部分にWRI1、DGAT及びオレオシン遺伝子の組み合わせを発現させることにより増加させた。構築物pJP3502を使用して、アグロバクテリウム媒介性の形質転換によってT.repensを形質転換した(Larkin et al.,1996)。簡潔には、遺伝子構築物pJP3502を、標準的なエレクトロポレーション手順によってA.tumefaciensに導入した。バイナリーベクターは、T−DNA内に35S:NptII選択マーカー遺伝子も含有した。形質転換したアグロバクテリウム細胞を、カナマイシン(50mg/L)及びリファンピシン(25mg/L)を補充した固体LB培地で増殖させ、28℃で2日間インキュベートした。単一のコロニーを使用して、新しい培養を開始した。48時間の活発な培養の後、Larkin et al.,(1996)による記載のように、吸水種子から全裂したT.repens(栽培変種Haifa)子葉を、アグロバクテリウム細胞群を使用して処理した。3日間の共存培養の後、外植体を25mg/Lのカナマイシンに曝露させ、形質転換されたシュートを選抜し、次いで発根培地に移して、根を形成させた後、土壌へ移した。
種子及び/または生育組織のTAG蓄積に対する効果を調査するために、2つのバイナリー発現ベクターを使用して、B.napus(栽培変種Oscar)を形質転換した。最初に、コドンを最適化したA.thalianaのWRI1タンパク質コード配列を空の35S発現カセットを含んだバイナリーベクター35S−pORE04に挿入することによって、プラスミドpJP3414を構築した。したがってpJP3414のT−DNAは、35S構成的プロモーターの制御下にある、コドンを最適化した変形型のA.thaliana WRI1転写因子含んでいる。実施例1に記載するように、pJP3414で形質転換した11本の個別に形質転換されたB.napus T0苗からの葉組織は各々、空のベクター(pORE04)で形質転換された植物と比較して、高いTAGレベルを含有した。しかしながら、いかなる場合でもTAGのレベルは1%を超えなかった。最大レベルを検出したのは系統31で、乾重量基準で最大0.58%のTAGを含有した。T1トランスジェニック種子の含油量は、野生型(Oscar)及び空のベクターの対照種子と比較して有意に上昇しなかった。葉組織に最も高いTAGレベルを呈する3つの系統のT1種子を、3%のスクロースを含有するMS培地で発芽させた。未形質転換の対照(Oscar)と比較したとき、5日後及び8日後の発芽に差は観察されなかった。
植物細胞中の色素体GPATの過剰発現
多数の実験を実施し、植物(すなわちいわゆる16:3植物)に高活性の16:3原核型経路が存在すると、pJP3502上への遺伝子組み合わせの導入時に、18:3植物と比較して、はるかに低レベルのTAGを生育組織中にもたらすという仮説を検証した。以下の実施例でこの実験について説明する。最初に発明者らは、トランスジェニックN.benthamianaに観察される高レベルのTAG蓄積が、原核型経路へのフラックスを増加させる色素体GPATの過剰発現によって妨害され得るかどうかを試験した。
A.thalianaのats1突然変異体は、色素体GPATをコードする遺伝子の分裂変異を有し、これにより色素体GPAT活性が野生型のわずか3.8%のレベルに減少する(Kunst et al.,1988)。A.thalianaの親とats1突然変異体の両方において、種子以外、少なくとも葉、茎及び根のTAG蓄積レベルを試験して比較する。WRI1、DGAT及びオレオシンをコードする遺伝子の組み合わせを過剰発現させるpJP3502構築物のT−DNAを、形質転換によって両方の遺伝子型の植物に導入する。pJP3502のT−DNA内の遺伝子組み合わせは、両方の植物環境での脂肪酸合成を増加させる。しかしながら、ats1突然変異体でのTAGの蓄積は、色素体GPAT活性の低下及びそれによる色素体原核型経路への脂肪酸のフラックスの減少によって、野生型(親)遺伝子型から誘導されたトランスジェニック植物よりも、平均して有意に高くなると予測される。C18:3に対するC16:3の脂肪酸比は、ats1突然変異体の葉では、形質転換及び非形質転換いずれの場合でも有意に減少する。
色素体GPATをコードする遺伝子に突然変異を導入することにより、植物を遺伝的に改変することに加えて、色素体GPATのサイレンシングによって、16:3の原核型経路を経由する脂肪酸のフラックスを減少させ、それによって生育部分の含油量を増加させることができる。選択された種由来の色素体GPATをコードする遺伝子の領域に対応するRNAヘアピンを発現する構成的または葉特異的プロモーターを有するトランスジェニックカセットを作製することにより、これを実証する。一例として、A.thalianaの色素体GPATのcDNA配列(NM_179407、配列番号177)の581bp SalI−EcoRV断片を使用して、RNAiヘアピン発現カセットを作製する。色素体GPATをコードする遺伝子の領域が、NM_179407のヌクレオチド配列と高度な配列同一性を有していれば、内因性の色素体GPAT遺伝子をサイレンシングするためのヘアピンRNAを発現させる遺伝子の構築にも、この領域を使用することができる。SmaI及びKasI固有の部位が隣接する、N.benthamianaの色素体GPATの732bpの断片(配列番号219)を含んでいるhpRNAi構築物を、N.tabacumに安定的に形質転換されるように設計した。合成されたN.benthamianaの色素体GPAT断片を、pJP3303のSmaI−KasI部位にサブクローニングし、pOIL113を得た。色素体脂肪酸の保持が減少すると、特に、WRI1等の転写因子の過剰発現のような「プッシュ型」要素と組み合わせたとき、またはDGAT若しくはPDAT等の「プル型」要素によって、TAG蓄積の増加及び/またはSDP1若しくはTGD活性の減少が生じることが予測される。
De novo脂肪酸合成は真核細胞の色素体中で行われ、そこで脂肪酸が合成されると同時に、アシル−ACP複合体としてアシル担体タンパク質に結合する。C16:0及びC18:0アシル基への鎖伸長、次いでACPとの連結時のC18:1への不飽和化に続いて、脂肪酸はチオエステラーゼによってACPから切断され、色素体からの移出を経て真核型経路に入り、ERへと輸送され、そこで膜脂質生合成及び貯蔵脂質生合成に関与する。葉緑体では、移出過程で次の2段階を有する:最初に、アシル−ACPチオエステラーゼ(脂肪酸アシルチオエステラーゼ;FAT)の酵素活性によりアシル鎖が遊離脂肪酸として放出される、次に、長鎖アシル−CoAシンテターゼ(LACS)によって触媒されるCoAとの反応により、アシル−CoAエステルが形成される。A.thalianaは、アシル鎖特異性に基づいて区別できる3つの脂肪酸アシルチオエステラーゼを含む。FATA1及びFATA2は不飽和アシル−ACPを優先的に加水分解する一方、飽和アシル−ACP鎖は通常、FATBによって切断される。
pOIL121:SSU::AtWRI1、35S::AtDGAT1、enTCUP2::AtFATA2。
pOIL122:SSU::AtWRI1、35S::AtDGAT1、enTCUP2::AtFATA2、enTCUP2::SDP1ヘアピン。
pOIL123:SSU::AtWRI1、35S::AtDGAT1、enTCUP2::SDP1ヘアピン。
Eccleston et al.(1996)は、California Bay Laurelの12:0−ACPチオエステラーゼ(Umbellularia californica)をコードする遺伝子を恒常的発現させて形質転換したトランスジェニックBrassica napus植物の種子及び葉の両方でのC12:0及びC14:0脂肪酸の蓄積について研究した。その研究報告によれば、成熟したB.napus種子には相当なレベルのC12:0が蓄積されたが、12:0−ACPチオエステラーゼの発現及び活性が高レベルであったにもかかわらず、葉組織では、極低レベルのC12:0しか観察されなかった。遺伝子がA.thalianaに形質転換された場合にも同様の結果を得た(Voelker et al.,1992)。その研究を発展させた、Cocos nuciferaのLPAATと、Umbellularia californicaのチオエステラーゼとの共発現の結果、総C12:0の蓄積が増加するとともに、B.napusの種子でのトリラウリン画分も増加した(Knutzon et al.,1999)。したがって、この従来技術は、生育植物細胞中の中鎖脂肪酸(MCFA)合成に問題があることを示した。
発明者らは以前に、A.thalianaのWRI1、A.thalianaのDGAT1及びS.indicumのオレオシンをコードするキメラ遺伝子の協調的発現によって、N.tabacum葉で15%のTAG生成を得た(Vanhercke et al.,2014)LPAATと組み合わせたチオエステラーゼの発現後に観察されたMCFAの蓄積が、高レベルのTAGを生成する植物細胞(Vanhercke et al.,2013)でも発生または増加するかどうかを試験するため、これらの遺伝子を共発現させた。C12:0、C14:0及びC16:0チオエステラーゼ/LPAATの最適に機能する組み合わせ(それぞれ、Umbca−TE、Cinca−TE及びCocnu−TE2チオエステラーゼを加えたCocnu−LPAAT)を、前述のArath−WRI1+DGATの組み合わせ(Vanhercke et al.,2013)とともに、またはそれなしで浸潤した。そのデータを図4に示す。
生育組織にMCFAを生成する遺伝子を組み合わせて、タバコ等の植物を安定的に形質転換するために、バイナリーベクター内に一連の遺伝子構築物を作製し、最適な遺伝子の組み合わせを同定した。これらの構築物は、SSUプロモーター(実施例8、pOIL121を参照)または老化特異的SAG12プロモーターいずれかの制御下でWRI1を発現する遺伝子、アブラヤシDGATをコードする遺伝子(下記)、enTCUPプロモーターの制御下にあるココナッツのLPAATをコードする遺伝子(CocnuLPAAT、上記参照)及び35SプロモーターまたはSAG12プロモーターのいずれかから発現される種々の脂肪酸アシルチオエステラーゼ(FATB)を発現するいくつかの遺伝子を含んだ。これらについて以下に述べる。
まず、代表的なDGAT1、DGAT2及びDGAT3酵素を含め、種々のDGAT酵素を試験するために、公開されたトランスクリプトーム(Dussertら,2013)からアブラヤシのDGAT配列候補を特定し、Nicotiana tabacumでの発現のためコドンを最適化した。次に、タンパク質コード領域を各々、実施例1に記載したようなN.benthamiana葉の一過性アッセイの試験用35Sプロモーターの制御下で、バイナリー発現ベクターに個別にクローニングした。試験した遺伝子の組み合わせは以下の通りである:
1 p19(陰性対照)
2 P19+CnLPAAT+WRI1
3 P19+CnLPAAT+AtWRI1+AtDGAT1
4 P19+CnLPAAT+AtWRI1+EgDGAT1
5 P19+CnLPAAT+AtWRI1+EgDGAT2
6 P19+CnLPAAT+AtWRI1+EgDGAT3
7 P19+CincaFatB
8 P19+CincaFatB+CnLPAAT+WRI1
9 P19+CincaFatB+CnLPAAT+AtWRI1+AtDGAT1
10 P19+CincaFatB+CnLPAAT+AtWRI1+EgDGAT1
11 P19+CincaFatB+CnLPAAT+AtWRI1+EgDGAT2
12 P19+CincaFatB+CnLPAAT+AtWRI1+EgDGAT3
安定的形質転換のための遺伝子構築物(表8)を、適合性を持つ制限酵素部位を用いた遺伝子カセットの順次挿入によりアセンブリした。4遺伝子の構築物(表8)は各々、35Sプロモーターから発現したアブラヤシDGAT1(EgDGAT1)をコードする遺伝子、enTCUP2構成的プロモーターから発現したC.nuciferaのLPAAT(CnLPAAT)をコードする遺伝子、及びSSUプロモーターまたはSAG12プロモーターいずれかから発現したAtWRI1をコードする遺伝子に加え、FATB酵素をコードする一連の遺伝子の1つを含んでいた。
本研究から、Umbca−TE単独(表7)の発現後、葉細胞でのC12:0の生成は、総脂肪酸含有量のわずか約1.6%であったことが見出された。Arath−WRI発現遺伝子の付加は、ココナッツLPAAT(図4及び5)の付加よりも葉組織でのC12:0及びC14:0の蓄積に対してはるかに強い影響を及ぼした。これは、WRI1とチオエステラーゼとの組み合わせが、相乗的に作用し、葉細胞のMCFA蓄積を大幅に増加させたことを示した。重要なことに、C12:0、C14:0及びC16:0の多くが、野生型葉では脂質が実質的なレベルでは蓄積しない、葉中でTAGに蓄積することが見出された。これらの実験は、植物の生育部分の細胞を改変すると、MCFA、特にC12:0及びC14:0をTAGに高レベルで生成できることを示した。C16:0のレベルもまた実質的に増加した。
WRI1及びDGATを用いた従来の報告済み実験(Vanhercke et al.,2013)は、A.thalianaのAtWRI1をコードする合成遺伝子(アクセッション番号AAP80382.1)及び同じくA.thaliana由来のAtDGAT1をコードする合成遺伝子(アクセッション番号AAF19262;配列番号1)を使用した。DGATとの組み合わせで含油量を増加させる能力を他のWRIポリペプチドとAtWRI1とで比較するために、他のWRIコード配列を同定して、N.benthamiana葉で発現させる構築物の産生に使用した。A.thalianaのWRI3(アクセッション番号AAM91814.1、配列番号205)及びWRI4(アクセッション番号NP_178088.2、配列番号206)転写因子(To et al.,2012)をコードするヌクレオチド配列を合成して、35Sプロモーターの制御下でEcoRI断片としてpJP3343に挿入した。得られたバイナリー発現ベクターは、それぞれpOIL027及びpOIL028と称した。オートムギ(Avena sativa)のWRI1に対するコード配列を(AsWRI1、配列番号207)、付加的なEcoRI部位を含んでいるフランキングプライマーを使用して、Sten Stymne教授(Swedish University of Agricultural Sciences)によって提供されたベクターからPCR増幅した。増幅した断片をpJP3343に挿入して、pOIL055を得た。S.bicolor(アクセッション番号XP_002450194.1、配列番号208)由来のWRI1候補配列を、Zea maysのWRI1アミノ酸配列(アクセッション番号NP_001137064.1、配列番号209)をクエリとして使用し、NCBIサーバ上でBLASTp検索により同定した。S.bicolorのWRI1遺伝子(SbWRI1)のタンパク質コード領域を合成して、EcoRI断片としてpJP3343に挿入し、pOIL056を産生した。WRI1をコードする遺伝子候補を、Chinese tallow(Triadica sebifera;TsWRI1、配列番号210)トランスクリプトーム(Uday et al.,が提出)から同定した。タンパク質コード領域を合成して、EcoRI断片としてpJP3343に挿入し、pOIL070を得た。A.thalianaのWRI1及びDGAT1ポリペプチドを発現するコード配列を含んでいるpJP3414及びpJP3352バイナリーベクターが、Vanhercke et al.,(2013)によって記載された。
サンプルはすべてP19構築物にも浸潤した。TAGサンプルは更に、0.1〜0.4%のC14:0、0.5〜1.2%のC16:3及び0.1〜0.7%のC18:1Δ11も含有していた。
植物細胞で14種類の転写因子各々を発現させる遺伝子構築物を調製し、TAG生合成及び蓄積に関与する他の遺伝子との組み合わせで、TAGレベルを増加させるように機能する能力を試験した。これらの転写因子は、WRI1の代替候補、または植物細胞、特に生育植物部分に用いるためのWRI1、LEC1及びLEC2のうち1つ以上の転写因子を含む組み合わせに付加する候補であった。各転写因子は主として、LEC2と同様に、報告された胚形成への関与(Baud and Lepiniec(2010)、及びIkeda et al.,(2006)に概説)に基づいて選択した。したがって、以下の通り、N.benthamiana発現系(実施例1)を用いて、その機能を分析する実験を実施した。
Sugar Dependent 1(SDP1)TAGリパーゼは、A.thalianaの種子以外の組織ならびに種子発芽期のTAG代謝回転に関与することが示された(Eastmond et al.,2006;Kelly et al.,2011;Kelly et al.,2013)。SDP1は成長中の種子に発現し、SDP1ポリペプチドは油体を伴う(ただし被覆されない)成熟種子にも存在する。SDP1をコードする遺伝子のサイレンシングの結果、A.thalianaの根及び茎に少量だが有意なTAGレベルの増加(乾重量基準で0.4%未満)が生じた一方、葉組織では更に少ない増加が観察された(Kelly et al.,2013)。
LEC2等の胚及び種子成長の主要制御因子の異所性発現は、種子以外の組織でTAGレベルを増加させることが報告された(Santos−Mendoza et al.,2005;Slocombe et al.,2009;Andrianov et al.,2010)。しかしながら、35S−LEC2遺伝子で形質転換された植物でのLEC2の構成的過剰発現は、体細胞不定胚形成及び異常な葉構造を含めた、植物成長及びモルホロジーに対する望ましくない多面発現性効果を生じさせた(Stone et al.,2001;Santos−Mendoza et al.,2005)。植物成長の葉老化段階、すなわち植物が完全に生長し、十分にバイオマスに達した後に、LEC2発現を制限すると、葉の脂質レベルは引き続き増加させるが、望ましくない表現型効果は最小化するかどうかを試験するため、SAG12遺伝子(U37336;Gan and Amasino 1995)からのA.thaliana老化特異的プロモーターの制御下で、LEC2を発現するキメラDNAを設計して作製した。
野生型植物、ならびにpJP3502由来のT−DNA、またはpJP3502及びpOIL51若しくはpJP3502及びpOIL049由来のT−DNAを含んでいるトランスジェニック植物からサンプル採取した葉組織において、デンプン及び可溶性糖のレベルを測定した。一般に、両方のT−DNAを有する葉では、乾重量基準で葉組織内のTAGレベルとデンプンレベルとの間に逆の相関が見られた(図13)。対照的に、トランスジェニック植物での葉の可溶性糖レベルは、野生型と比較してほぼ同じであった。これは、糖からTAGへの転換に重大なボトルネックが存在しなかったことを示唆している。野生型植物では、植物の葉の位置による影響が観察され、下部葉から上部葉へとデンプンレベルが増加する傾向があったこのような影響は、トランスジェニック植物には検出されなかった。
WRI1、DGAT及びオレオシンをコードする導入遺伝子を発現するN.tabacum植物の葉は、成長の結実段階で約16%のTAGを含有している。しかしながら、TAGレベルは、植物の茎(1%)及び根(1.4%)ではるかに低かった(Vanhercke et al.,2014)。発明者らは、茎及び根でTAGレベルが低くなる理由が、このトランスジェニック植物でWRI1をコードする遺伝子の発現に使用されたRubisco SSUプロモーターのプロモーター活性不足に起因するかどうかを考察した。茎及び根でより強く発現し、その結果、茎及び根にTAGを蓄積させるための因子を制限する可能性がない、CaMV35Sプロモーターによって、pJP3502のT−DNA内にDGAT導入遺伝子を発現させた。
WRI1及びDGAT1をコードする個々の遺伝子の過剰発現時に、トウモロコシ、カノーラまたはArabidopsis thalianaの種子組織でTAGレベルが増加することを複数のグループが報告している(Shen et al.,2010;Liu et al.,2010;Weselake et al.,2008;Jako et al.,2001;Liu et al.,2012に概説)。近年では、van Erp et al.(2014)が、A.thalianaでの種子含油量に対するWRI1とDGAT1との共発現の効果を調査した。TAGの絶対レベルは、野生型及び空ベクター対照では38%であったが、トランスジェニック系統では44%に増加した。WRI1及びDGAT1の過剰発現にSDP1 TAGリパーゼのサイレンシングを組み合わせると、TAGレベルを45%まで更に増加させた。特筆すべきことに、平均種子重量は増加することが見出されたが、植物当たりの種子の数は対照植物よりも少なかった。
pTV55:ProCnl1::MGAT2+ProCnl2::DGAT1+ProCnl1::GPAT4+ProFAE1::WRI1;
pTV56:ProCnl1::MGAT2+ProCnl2::DGAT1+ProFAE1::WRI1;
pTV57:ProCnl2::DGAT1+ProFAE1::WRI1;
pTV58;ProCnl2::DGAT1;
pTV59:ProFAE1::WRI1。
pJP3502のT−DNAで形質転換され、A.thaliana WRI1、DGAT1及びS.indicumオレオシンをコードする導入遺伝子を発現するN.tabacum植物は、生育組織のTAGレベルが増加していた。上記の実施例11に示すように、これらの植物でSDP1 TAGリパーゼをコードする内因性遺伝子をサイレンシングすると、葉のTAGレベルが更に増加した。このことは、SDP1活性を保持した植物で相当なTAG代謝回転が発生していたことを発明者らに示した。そこで、植物の導入遺伝子の発現レベルを決定した。ノーザンハイブリダイゼーションブロッティングにより、WRI1及びDGAT1の強い発現及び若干のオレオシンmRNA発現を確認した一方、デジタルPCR及びqRT−PCRによる発現分析で、極低レベルのオレオシン転写物のみを検出した。発現分析により、オレオシンをコードする遺伝子がWRI1及びDGAT1導入遺伝子と比較して十分に発現しなかったことが明らかとなった。これらの実験から、発明者らは、pJP3502のT−DNAによってコードされるとき、オレオシンタンパク質の不適切な産生のため、葉組織の油体が、TAG分解から完全には保護されなかったという結論を得た。植物成長期を通じてTAGの安定的な蓄積を改善するために、オレオシン遺伝子を置換した、いくつかのpJP3502改変型を設計した。これらの改変型構築物は以下の通りである。
オレオシンは、オリーブ、アブラヤシ及びアボカドの中果皮等の種子以外の油蓄積植物組織で高度に発現しない(Murphy,2012)。その代わりに、種子組織のオレオシンのものと類似した役割を果たすことができる脂肪滴会合タンパク質(LDAP)が、これらの組織に確認されている(Horn et al.,2013)。したがって、発明者らは、植物の生育組織で蓄積された油をTAGリパーゼまたは他のサイトゾル酵素の活性から保護するための最適なパッケージングタンパク質に、オレオシンがなり得ない可能性について考察した。そこでTAG蓄積の増強について、以下の通り、LDAPポリペプチドを確認及び評価した。
S.sebifera由来のLDAPの機能を試験するために、葉細胞において35Sプロモーターの制御下でこれらのポリペプチドをそれぞれ発現させる、発現ベクターを作製した。全長SsLDAP cDNA配列を、組み換え反応によってpDONR207のデスティネーションベクターに挿入し、デスティネーションベクターのCcdB及びCm(R)領域をSsLDAP cDNA断片に置き換えた。制限消化分析及びDNAシーケンシングによる確認の後、構築物をAgrobacterium tumefaciens株AGL1に導入し、N.benthamiana葉細胞での一過性発現及びN.tabacumの安定的形質転換の両方に使用した。
in vivoでSsLDAPを性質決定し、それらの動的挙動を観察するために、黄色蛍光タンパク質(YFP)と融合させたLDAPポリペプチドからなる融合ポリペプチドを発現する、発現構築物を作製した。融合ポリペプチドごとに、YFPをSsLDAPのC末端にインフレームで融合した。その3´末端に終止コドンのない3つのLDAP遺伝子それぞれの全オープンリーディングフレームをYFP配列に融合し、キメラ遺伝子をpDONR207に挿入した。制限消化及びDNAシーケンシングにより、得られた構築物を確認した後、構築物をA.tumefaciens株AGL1に導入し、N.benthamiana葉細胞での一過性発現及びN.tabacumの安定的形質転換の両方に使用した。葉細胞とLDAP−YFP構築物の浸潤後3日目に、浸潤帯からの葉片を、脂肪滴を陽性染色させるNile Redで染色して、共焦顕微鏡下で観察し、YFPポリペプチドから赤い染色(脂肪滴)及び蛍光の両方を検出した。LDAP−YFPと脂肪滴との共局在化が観察され、LDAPが葉細胞の脂肪滴と関連することが示された。
発明者らは、A.thaliana WRI1、A.thaliana DGAT1及びS.indicumオレオシン(Vanhercke et al,2014)をコードする導入遺伝子の共発現によって、N.tabacum葉でのTAGレベルの増加した産物について記載した。葉中に存在する種々の脂質プールの脂肪酸修飾が、WRI1とDGAT1遺伝子組み合わせの共発現により可能であったかどうかを調査するために、一過性発現実験を実施し、アシル−CoA及びアシル−PCプールの脂肪酸が発生し得るかどうかを調べた。一実験では、C18:1−CoAをC20:1−CoAへと伸長するA.thaliana脂肪酸エロンガーゼ(AtFae1)をコードする導入遺伝子の発現を、WRI1及びDGATをコードする遺伝子と組み合わせて、アシル−CoAプールの修飾を試験した。第2の実験では、C18:1−PCからC18:2−PCへと不飽和化するA.thaliana脂肪酸デサチュラーゼ2(AtFAD2)をコードする導入遺伝子を、WRI1及びDGAT遺伝子と組み合わせて、PCプールの修飾を試験した。これらの実験は、植物細胞のERにおけるアシル基質の有効性を試験するように設計された。
Li−Beisson et al.(2013)は、Arabidopsis葉(16:3植物)では、葉緑体で合成された脂肪酸の約40%が原核型経路に入り、それに対して60%は移出して真核型経路に入ると推定した。ERで脂肪酸が不飽和化された後、移出された脂肪酸の約半分は色素体に戻され、チラコイド膜のガラクト脂質合成を補助する。脂肪酸のDAGまたはリン脂質としての色素体への輸送(移入)は、TGD1(葉緑体内包膜のパーミアーゼ様タンパク質)と関連する。TGD1、2及び3タンパク質を含むArabidopsisのABC脂質トランスポーターは、Benning et al.(2008及び2009)によって、更に最近になりRoston et al.(2012)によって同定された。このタンパク質複合体は、葉緑体内包膜に局在化され、この膜全体へのホスファチジン酸の転送を媒介することが提唱されている。TGD2ポリペプチドはホスファチジン酸結合タンパク質であり、TGD3はATPaseである。新規なArabidopsisタンパク質(TGD4)が遺伝子手法(Xu et al.,2008)によって同定され、そのTGD4遺伝子の失活はまた、ERから色素体への脂質輸送を阻害した。最近の生化学データから、TGD4は葉緑体外包膜に存在するホスファチジン酸結合タンパク質であることが示された(Wang and Benning,2012)。
N.benthamianaトランスクリプトームで同定された全長mRNA転写物に基づいて、TGD1色素体インポーターに対するサイレンシング構築物を産生した。685bpの断片をN.benthamiana葉のcDNAから増幅すると同時に、5´末端にPmlI部位を組み込んだ。最初にTGD1断片をpENTR/D−TOPO(Invitrogen)にクローニングし、続いてLRクローニング(Gateway)によってpHELLSGATE12デスティネーションベクターに挿入した。得られた発現ベクターは、pOIL025と称した。これをN.benthamianaで一過性発現させ、葉のTAGレベルに対するTGD1遺伝子サイレンシングの効果を評価する。TGD1ヘアピン構築物を、A.nigerの誘発性プロモーターalcAの制御下で、PmlI−EcoRV断片としてpOIL020(下記)のNheI(klenow)−SfoI部位にサブクローニングすることにより配置する。葉の油レベルを更に増加させるため、得られたベクター(pOIL026と称する)を、ホモ接合性N.tabacumのpJP3502系統に超形質転換する。
pJP3506の構築
ジャガイモ塊茎に発現させる3つの遺伝子を含んでいる遺伝子構築物を作製し、ジャガイモの形質転換に使用した。この構築物をpJP3506と称した。これは、既存のベクターpJP3502(WO2013/096993)を基に、塊茎特異的発現をもたらすプロモーターの置換を有した。pJP3506は、(i)選択マーカー遺伝子として、重複エンハンサー領域(e35S)を有する35Sプロモーターによって誘導されるNPTIIカナマイシン耐性遺伝子、ならびに3つの遺伝子発現カセットを含んでおり、このカセットは、(ii)Arabidopsis thalianaのDGAT1をコードする35S::AtDGAT1、(iii)Arabidopsis thalianaのWRI1をコードするB33::AtWRI1、及び(iv)Sesame indicum由来のオレオシンをコードする、B33::ゴマオレオシンであった。これらのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、pJP3502と同様であった。パタチンB33プロモーター(B33)は、Dr Alisdair Fernie,Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology,Potsdam,Germanyにより提供された、Solanum tuberosumに由来する塊茎特異的プロモーターであった。pJP3506の環状プラスミド地図を図17に示す。
組織培養で無菌的に(asceptically)生長させたAtlantic栽培品種のジャガイモ苗(Solanum tuberosum)をToolangi Elite、Victorian Certified Seed Potato Authority(ViCSPA)(Victoria,Australia)から購入した。pJP3506を含んでいるAgrobacterium tumefaciens株LBA4404の懸濁液下で、茎節間を長さ約1cm片に切断した。アグロバクテリウム細胞をOD0.2まで増殖させ、等体積のMS培地で希釈した。無菌の濾紙上で茎片を軽く拭き取って過剰なアグロバクテリウム懸濁液を除去し、次にこれをMS培地上に留置して、2日間24℃に維持した(共存培養)。次に、200μg/LのNAA、2mg/LのBAP及び250mg/LのCefetaximeを補充した新しいMS培地に、節間を移した。2mg/LのBAP、5mg/LのGA3、50mg/Lのカナマイシン及び250mg/LのCefetaximeを補充した新しいMS培地に節間を移して、10日目以降にトランスジェニックカルスの選抜を開始した。カルスから再生されるシュートを切断して、根誘導のための無添加のMS培地上に留置した後、ポッティングミックスを含有した15cm径のポットに移植し、温室内で塊茎の生長を含め植物が成熟するまで生長させた。
温室内の植物のジャガイモの葉から直径約1cmの葉片を得た。これらを、深型ウェルマイクロタイタープレート内に配置し、48時間凍結乾燥した。次に、各ウェルに鋼鉄製ボールベアリングを加えて、Reicht組織破砕機(Qiagen)にてマイクロタイタープレートの各側に対して2分ずつ、最大頻度28回/秒でプレートを振盪することにより、凍結乾燥された葉サンプルを粉砕した。0.1Mのトリス−HCl(pH8.0)、0.05MのEDTA及び1.25%のSDSを含有する375μLの抽出緩衝液を、粉末状の葉組織を入れた各ウェルに添加した。65℃で1時間インキュベートした後、187μLの6M酢酸アンモニウムを各ウェルに添加し、この混合物を4℃で30分間保存した後、3000rpmで30分間、プレートを遠心した。各ウェルから340μLの上清を、220μLのイソプロパノールを入れた新しい深型ウェルマイクロタイタープレートに移し、室温にて5分間保持した後、3000rpmで30分間遠心した。沈降したDNAペレットを70%のエタノールで洗浄し、空気乾燥して、サンプル当たり225μLのH2Oで再懸濁した。
確認済みのトランスジェニック植物及び非形質転換対照として再生されたジャガイモ植物から採取した塊茎の薄片を72時間凍結乾燥して、脂質含有量及び組成を分析した。クロロホルム:メタノール:0.1MのKCl(2:1:1v/v/v)を使用して、以下に従って乾燥塊茎組織から総脂質を抽出した。最初に、凍結乾燥させた塊茎組織を、Reicht組織破砕機(Qiagen)を使用して、1秒当たり29回の頻度で3分間、金属球を入れたエッペンドルフ管内のクロロホルム:メタノール(2:1、v/v)中でホモジナイズした。各ホモジェネートを、Vibramax 10(Heidolph)を用いて、2,000rpmで15分間混合した後、0.1MのKCl溶液を1/3量ずつ各サンプルに添加し、更に混合した。10,000gで5分間遠心分離した後、脂質を含む下相を各サンプルから回収し、N2フローを使用して完全に蒸発させた。各脂質調製物を塊茎乾重量ミリグラム当たり3μLのCHCl3に溶解した。脂質調製物のアリコートを薄層クロマトグラフィー(TLC)プレート(20cmx20cm、シリカゲル60、Merk)に載せ、ヘキサン:ジエチルエーテル:酢酸(70:30:1、v/v/v)にて展開した。TLCプレートにPrimulineを噴霧し、UV下で視覚化して脂質スポットを示した。適切なバンドのシリカを掻き取ってTAG及びPLを回収し、この材料を1Nメタノール性HCl(Supelco、Bellefonte,PA)中で、内部標準物質である既知量のTriheptadecanoin(Nu−Chek PREP,Inc.USA)とともに、80℃で2時間、インキュベートすることにより、脂肪酸メチルエステル(FAME)に変換し、脂質を定量化した。従来の記載の通り(Petrie et al.,2012)、30mのBPX70カラム(内径0.25mm、膜厚0.25mm、SGE、Austin,USA)を備えるGC−FID(7890A GC、Agilent Technologies、Palo Alto,CA)によりFAMEを分析した。Agilent Technologies ChemStationソフトウェア(B.04.03版)でピークを積分した。
新しい成長中のジャガイモ(Solanum tuberosum L.栽培変種Atlantic)塊茎から、全RNAをTRIzol法(Invitrogen)により抽出した。ジャガイモAGPase小サブユニット及びSDP1をコードするcDNAの選択領域を、以下のプライマーを用いてRT−PCRから得た:st−AGPs1:5’−ACAGACATGTCTAGACCCAGATG−3’(配列番号251)、st−AGPa1:5’−CACTCTCATCCCAAGTGAAGTTGC−3’(配列番号252)、st−SDP1−s1:5’−CTGAGATGGAAGTGAAGCACAGATG−3’(配列番号253)、及びst−SDP1−a1:5’−CCATTGTTAGTCCTTTCAGTC−3’(配列番号254)。次に、PCR産物を精製し、pGEMT Easyにライゲーションした。
内胚乳での発現
内胚乳特異的プロモーターを使用して、穀粒成長期の内胚乳に、WRI1、DGAT及びオレオシンをコードする遺伝子の組み合わせを発現させることにより、単子葉植物種Triticum aestivum(コムギ)の内胚乳、ひいては植物の穀粒での含油量が増加した。構築物(pOIL−Endo2と称した)は以下のキメラ遺伝子を含んでいた:(a)BrachypodiumのGlu1遺伝子プロモーター::ZmWRI1ポリペプチドをコードするZea mays遺伝子のタンパク質コード領域(配列番号35)::Glycine maxレクチン遺伝子由来のターミネーター/ポリアデニル化領域、(b)Triticum aestivumのBx17グルテニン遺伝子のプロモーター::AtDGAT1ポリペプチドをコードするA.thaliana遺伝子のタンパク質コード領域(配列番号1)::Agrobacterium tumefaciens Nos遺伝子由来のターミネーター/ポリアデニル化領域、(c)Oryza sativaのGluB4遺伝子プロモーター::オレオシンポリペプチドをコードするSesame indicum遺伝子のタンパク質コード領域::Glycine maxレクチン遺伝子由来のターミネーター/ポリアデニル化領域、及び(d)35Sプロモーター::選択マーカー遺伝子としてのハイグロマイシン耐性コード領域。この構築物を使用して、アグロバクテリウム媒介性の形質転換によってT.aestivum(栽培変種Fielder)の未成熟胚を形質転換した。接種された未成熟胚をハイグロマイシンと作用させ、形質転換されたシュートを選抜した後、発根培地に移し、根が形成されたら土壌へと移した。
生育組織の含油量を増加させるために、モロコシ(S.bicolor)及びコムギ(Triticum aestivum)のアグロバクテリウム媒介性の形質転換に適した、一連のバイナリー発現ベクターを設計した。構築のための出発ベクターは、pOIL093−095、pOIL134及びpOIL100−104(実施例4を参照)であった。最初に、Z.maysのWRI1ポリペプチドをコードするDNA断片を、テンプレートとしてのpOIL104及びKpnI制限部位を含むプライマーを使用して、PCRにより増幅した。この断片を、pOIL095のOryza sativa Actin1構成的プロモーターの下流に、KpnI部位を利用してサブクローニングした。得られたベクターをpOIL154と称した。Z.maysユビキチンプロモーター(pZmUbi)の制御下でUmbelopsis ramannianaのDGAT2aをコードするDNA断片を、NotI断片としてpOIL134から分離し、pOIL154のNotI部位に挿入して、pOIL155を得た。pZmUbiプロモーターの制御下にあり、3´末端にA.tumefaciens NOSターミネーター/ポリアデニル化領域が隣接するPATコード領域からなる発現カセットを、テンプレートとしてpJP3416を使用して、PATコード領域を増幅することにより構築した。プライマーは、5´及び3´末端にそれぞれBamHI及びSacI制限部位を組み込むように設計した。BamHI+SacIの二重消化後、PAT断片をpZLUbi1casNKのそれぞれの部位にクローニングした。得られた中間体をpOIL141と称した。次に、PAT選択マーカーカセットをpOIL155主鎖に導入した。この目的のため、pOIL141を最初にNotIで切断して、DNAポリメラーゼIのKlenow断片で平滑化し、続いてAscIで消化した。次に、この2622bpの断片を、pOIL155のZraI−AscI部位にサブクローニングし、pOIL156を得た。最後に、pOIL156のWRI1発現を誘導するActin1プロモーターを、Z.maysのRubisco小サブユニットプロモーター(pZmSSU)と交換し、pOIL157を得た。このベクターは、テンプレートとしてのpOIL104、ならびにAsiSI及びPmlI制限部位を含むフランキングプライマーを使用して、Z.maysのSSUプロモーターのPCR増幅によって得た。次に、得られたアンプリコンをSpeI+MluIで切断し、pOIL156のそれぞれの部位にサブクローニングした。
pOIL156:プロモーターO.sativa Actin1::Z.mays WRI1、プロモーターZ.mays Ubiquitin::U.rammaniana DGAT2a及びプロモーターZ.mays Ubiquitin:PAT
pOIL157:プロモーターZ.mays SSU::Z.mays WRI1、プロモーターZ.mays Ubiquitin::U.rammaniana DGAT2a及びZ.mays Ubiquitin::PAT。
葉からの脂質抽出
夏季に温室内で生長させた植物から、pJP3502由来のT−DNAで形質転換されたトランスジェニックタバコ葉を採取した。葉を乾燥させ、次いで1〜3mm大の葉片に破砕した後、抽出した。後述のように、破砕した材料に選択溶媒で24時間にわたってソックスレー(還流)抽出を施した。各抽出実験に5gの乾燥タバコ葉材料及び250mLの溶媒を使用した。
ヘキサンは、中性(非極性)脂質を抽出する、カノーラ等の圧搾油糧種子からの商業的な油抽出に溶媒として一般に使用されるため、最初にこの方法を試した。脂質抽出量は5gの葉材料から1.47gであり、脂質回収率は29重量%であった。DMSO中でヘキサン抽出した脂質の1H NMR分析を実施した。分析は、芳香族生成物の存在しない長鎖脂肪酸トリグリセリドの典型的シグナルを示した。次に、脂質をGCMSにかけ、主成分を同定した。ヘキサン抽出した脂質の直接的GCMS分析は、沸点が高すぎ、GCMS内で成分が分解されるため困難であることが実証された。このような状況では、最初に脂肪酸のメチルエステルを作製することが一般的な分析方法である。これを以下に従って実施した:1mLのトルエンに18mgの脂質抽出物を溶解させ、3mLの乾燥3Nメタノール性HCLを添加して、60℃で一晩撹拌した。5mLの5%NaCl及び5mLのヘキサンを冷却されたバイアルに加えて振盪させた。有機層を除去し、新たに5mLのヘキサンを追加して抽出を繰り返した。複合有機画分を、8mLの2%KHCO3によって中和して分離し、Na2SO4で乾燥させた。ヘキサン中の濃度を1mg/mLになるようにN2流下で溶媒を蒸発させ、GCMSで分析した。存在する主脂肪酸は、16:0(パルミチン、38.9%)及び18:1(オレイン、31.3%)であった。
アセトンは、その溶解特性により、葉からほぼすべての脂質、すなわち非極性脂質と極性脂質の両方を必然的に抽出するため、抽出溶媒として使用した。アセトン抽出した油は、ヘキサン抽出した脂質と外観は類似していた。脂質抽出量は5gのタバコ葉から1.59g、すなわち31.8重量%であった。DMSO中で脂質の1HのNMR分析を実施した。芳香族生成物のシグナルが存在しない長鎖脂肪酸トリグリセリドに典型的なシグナルが観察された。
タバコ葉から油を得るのに適しているかどうかを確認するため、熱水を抽出溶媒として試した。水抽出物質は、外観上はゲル様であり、冷却するとゲル化した。抽出量は1.9g、すなわち38重量%であった。この物質は濃密なゲル様であり、多くの場合、葉からの極性化合物、例えば糖及びその他の炭水化物等を含んでいた。DMSO中で物質の1H NMR分析を実施した。分析は、芳香族生成物が抽出されていない長鎖脂肪酸トリグリセリドの典型的シグナルを示した。残留固体物質をヘキサンで抽出し、20重量%の脂質を得た。これは、水抽出が非極性脂質の抽出には非効率であったことを示す。
タバコ葉から油を得るのに適しているかどうかを確認するため、エタノールを抽出溶媒として使用した。エタノール抽出した脂質は、水抽出及びヘキサン抽出した脂質の両方と外観が類似しており、色は黄赤色で、ゲル状の外観を有し、冷却するとゲル化した。脂質抽出量は5gのタバコ葉から1.88g、すなわち37.6重量%であった。エタノール溶媒は、タバコ葉の極性化合物の一部も抽出したと思われる。
ジエチルエーテルを抽出溶媒として試した理由は、他の溶媒よりも不純物の少ない抽出が可能であり得ると考えたためである。抽出により1.4g、すなわち28重量%を得た。エーテル抽出した脂質は、外観上はヘキサン抽出物と類似しており、色は黄色っぽく、ヘキサン抽出物よりもわずかに清澄な外観をしていた。ジエチルエーテル抽出は最も清澄な油が得られたように見えたが、NMR分析では、より多くの有機化合物の混合物を示した。
トランスジェニックタバコ植物のバッチを冬季にわたり(通常の生長時季ではない)生長させ、自然光の少ない寒冷な季節の間、葉内の油生成を評価した。成熟植物からの葉は、乾重量基準で約10%の油を有した。これは夏季に生長した植物よりもはるかに低かった。しかしながら、脂質を抽出して、以下に従ってバイオディーゼルに変換した。工程の各段階は、(a)粗脂質の抽出、(b)脂質からのTAGの精製、及び(c)精製されたTAGのバイオディーゼルへの変換であった。
生育植物部分を液体燃料等の工業製品に変換するためのより直接的な別の手法は、熱水処理(HTP)によるものである。これを用いて、約30重量%のTFAを含有するトランスジェニックタバコ葉材料を、従来の石油精製原料に添加して再生可能ディーゼル(パラフィン系ディーゼル)を製造できる再生可能バイオ油に変換した。石油ディーゼルは多くの炭化水素化合物(主にアルカン)の混合物で、精製装置から200〜300℃で生じる画分であると定義され、典型的には主にC13〜C22炭化水素を含む。HTPによるトランスジェニックタバコ葉の典型的変換では、トランスジェニックタバコ生育植物の固体材料を水と混合し、濃度16〜50%の固体を作成する。次に、このスラリーを温度270〜400℃にし、圧力70〜350barをかけた。反応時間は1〜60分の間で変化し、実験は触媒としてNaOH及びKOHあり、またはなしで実施した。
別の一連の実験では、HTP反応の水成分を、メタノール溶媒と置き換えた。メタノールの使用を試みる理由は多数あるが、1つは葉内のTAG油を一段階で直接(現場で)変換し、植物脂質中の脂肪酸のメチルエステル(FAME)を生成し、バイオディーゼルを直接製造するためである。前述のHTP実験と同様の反応条件及び装置を用い、水をメタノールに置き換え、反応温度は圧力240barで335℃、NaOHを触媒とした。トランスジェニックタバコ生育植物部分が、投入重量に対して47重量%のバイオ油を生成したのに対して、野生型タバコは35重量%のバイオ油を生成した。得られた2種類のバイオ油のH1 NMRは、ごく少量のFAMEを示したのに対して、トランスジェニックタバコのバイオ油のNMRは大量のバイオディーゼルFAMEを示した。
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Claims (40)
- 油製品の製造工程であって、該工程が、
(i)反応器内で、
(a)乾重量が少なくとも2gであり、非極性脂質の総含有量を乾重量基準で少なくとも5重量%有する生育植物部分と、
(b)水、アルコールまたは両方を含む溶媒と、
(c)場合により触媒と、を含む組成物を処理するステップであって、
該処理は、酸化、還元または不活性環境にて組成物を温度約50℃〜約450℃、圧力5〜350barで1〜120分間加熱することを含むステップと、
(ii)生育植物部分の乾重量に対して、少なくとも35重量%の収率で反応器から油製品を回収すること、
それによって油製品を製造するステップと、を含む、前記工程。 - 以下の1つ以上またはそのすべてを特徴とする、請求項1に記載の工程:
(i)前記生育植物部分が、少なくとも1kgの乾重量を有する、
(ii)前記生育植物部分が、乾重量基準で少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、約25%、約30%、約35%、または30%〜75%の非極性脂質の総含有量を有する、
(iii)前記組成物が、5%〜90%の固体濃度を有する、
(iv)前記触媒が、NaOHまたはKOHまたは両方を、好ましくは0.1M〜2Mの濃度で含む、
(v)前記処理時間が、1〜60分、好ましくは10〜60分、より好ましくは15〜30分間である、
(vi)前記溶媒が水である場合、前記工程により、前記生育植物部分の乾重量に対して、最小36重量%、37重量%、38重量%、39重量%または40重量%から、最大55%または60重量%までの収率の前記油製品が製造される、
(vii)前記溶媒がアルコールを含む場合、前記工程により、前記生育植物部分の乾重量に対して、最小36重量%、37重量%、38重量%、39重量%または40重量%から、最大65%または70重量%までの収率の前記油製品が製造される、
(viii)前記溶媒が約80%の水を含む場合、前記油製品は約30%のC13〜C22炭化水素化合物を含む、
(ix)前記溶媒が約50%のメタノールを含む場合、前記油製品は約50%の脂肪酸メチルエステル(FAME)を含む、
(x)前記回収した油製品が、約15重量%未満の含水量を有する、
(xi)油製品の前記収率が、非極性脂質の含有量が乾重量基準で2%未満である、相当する生育植物部分を用いた相当する工程と比較して、少なくとも2重量%多い、
(xii)工程(i)(a)において、前記生育植物部分が、乾燥、切断、破砕、粉砕、回転、加圧、圧縮または摩砕のうち1つ以上によって物理的に処理された。 - 以下の1つ以上を更に含む、請求項1または請求項2に記載の工程:
(i)前記回収した油製品の水素化脱酸素、
(ii)前記回収した油製品の水素処理により、前記油製品のケトンまたは糖のレベルを低減すること、
(iii)前記回収した油製品からの合成ガスの製造、及び
(iv)前記回収した油製品を分画し、1種以上の燃料油、ディーゼル油、灯油またはガソリンを製造すること。 - 前記生育植物部分が、植物の葉、茎または両方を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の工程。
- 組み換え真核細胞であって、
a)細胞内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする第1の外因性ポリヌクレオチド、
b)1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド、ならびに
c)遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞内のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第1の遺伝子改変、
d)第4の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第3の外因性ポリヌクレオチド、及び
e)細胞内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる第2の転写因子ポリペプチドをコードする、第4の外因性ポリヌクレオチドのうち、1つまたは2つまたは3つすべてを含み、
ここでの各外因性ポリヌクレオチドが、細胞内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される、前記組み換え真核細胞。 - 以下の1つ以上またはそのすべてを更に含む、請求項5に記載の細胞
a)油体被覆(OBC)ポリペプチドをコードする第5の外因性ポリヌクレオチド、
b)第2の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第2の遺伝子改変、ならびに
c)第3の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第3の遺伝子改変。 - 前記細胞が、植物の生育部分由来の、またはその内部の植物細胞であり、該生育部分では、該植物の種子と比較して、プロモーターの1つ以上またはそのすべてを高レベルで発現する、請求項5または請求項6に記載の細胞。
- 以下の特徴の1つ以上またはすべてが該当する、請求項5〜7のいずれか1項に記載の細胞;
i)前記細胞が、第1の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較して、総脂肪酸の合成が増加しているか、または第1の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較して、総脂肪酸の異化が減少しているか、またはその両方であり、それによって第1の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較して、総脂肪酸のレベルが増加している、
ii)前記細胞が、第1の外因性ポリヌクレオチドを有し、1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較して、TAG、DAGまたはMAG、好ましくはTAGの合成を触媒する脂肪酸アシルアシルトランスフェラーゼの発現及び/または活性が増加している、
iii)前記細胞が、第1の外因性ポリヌクレオチドを有し、細胞内の色素体でのジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較して、色素体中のアシル−ACP及びG3Pからのリゾホスファチジン酸(LPA)の産生が減少している、
iv)前記細胞が、外因性ポリヌクレオチド(複数を含む)及び/または遺伝子改変(複数を含む)を欠く、相当する細胞と比較して、総脂肪酸含有量及び/またはガラクト脂質の含有量のうち、C18:3脂肪酸に対するC16:3の比率が変化している、好ましくは比率が減少している、
v)前記細胞が、植物の生育部分にあり、少なくとも約8%、少なくとも約10%、少なくとも約11%、少なくとも約12%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、8%〜75%、10%〜75%、11%〜75%、約15%〜75%、約20%〜75%、約30%〜75%、約40%〜75%、約50%〜75%、約60%〜75%、または約25%〜50%(w/w乾重量)の非極性脂質の総含有量を含む、
vi)前記細胞が、植物の生育部分にあり、少なくとも約8%、少なくとも約10%、少なくとも約11%、少なくとも約12%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、8%〜75%、10%〜75%、11%〜75%、約15%〜75%、約20%〜75%、約30%〜75%、約40%〜75%、約50%〜75%、約60%〜75%、または約25%〜50%(w/w乾重量)のTAG含有量を含む、
vii)前記転写因子ポリペプチドが、Wrinkled 1(WRI1)、Leafy Cotyledon 1(LEC1)、LEC1様、Leafy Cotyledon 2(LEC2)、BABY BOOM(BBM)、FUS3、ABI3、ABI4、ABI5、Dof4及びDof11からなる群から選択される、
viii)オレイン酸が、前記細胞中、総脂肪酸含有量の少なくとも20%(mol%)、少なくとも22%(mol%)、少なくとも30%(mol%)、少なくとも40%(mol%)、少なくとも50%(mol%)または少なくとも60%(mol%)、好ましくは約65%(mol%)または20%〜約65%を占める、
ix)前記細胞内の非極性脂質に含まれる脂肪酸が、水酸基、エポキシ基、シクロプロパン基、炭素−炭素二重結合、炭素−炭素三重結合、共役二重結合、分枝鎖(例えばメチル化若しくはヒドロキシル化された分枝鎖、またはそれらの2つ以上の組み合わせ)、または上述の基、結合若しくは分枝鎖のうち任意の2つ、3つ、4つ、5つまたは6つを含む、
x)前記細胞の非極性脂質が、エイコサジエン酸(EDA)、アラキドン酸(ARA)、ステアリドン酸(SDA)、エイコサトリエン酸(ETE)、エイコサテトラエン酸(ETA)、エイコサペンタエン酸(EPA)、ドコサペンタエン酸(DPA)、ドコサヘキサエン酸(DHA)またはそれらの2つ以上の組み合わせから選択される1種以上の多価不飽和脂肪酸を含む、
xi)前記細胞が、植物またはその一部、好ましくは生育植物部分にあり、または前記細胞が、珪藻植物(bacillariophytes)、緑藻類(chlorophytes)、青緑藻類(cyanophytes)、金茶藻類(chrysophytes)、ハプト藻、茶藻類または不等毛藻類等の藻細胞であり、または前記細胞が、真菌等の発酵に適した微生物であるか、またはそれらに由来する、
xii)1つ以上またはすべての前記プロモーターが、組織特異的プロモーター(例えば葉及び/または茎に特異的なプロモーター)、老化特異的プロモーター等の発生的調節プロモーター(例えば、SAG12プロモーター)、誘導性プロモーター、または概日リズム調節プロモーターから選択される、
xiii)前記細胞が、中鎖脂肪酸、好ましくはC12:0、C14:0または両方を総脂肪酸含有量のうち少なくとも5%のレベルで含む、総脂肪酸含有量を含み、更に場合により、中鎖長(C8〜C14)、好ましくはC12:0またはC14:0を有する脂肪酸に対して優先的活性のあるLPAATをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、
xiv)前記細胞に含まれる総脂肪酸含有量のうち、オレイン酸レベルが、外因性ポリヌクレオチド(複数を含む)及び/または遺伝子改変(複数を含む)を欠く、相当する細胞と比較して、少なくとも2%増加している、及び/またはαリノレン酸(ALA)レベルが、外因性ポリヌクレオチド(複数を含む)及び/または遺伝子改変(複数を含む)を欠く、相当する細胞と比較して、少なくとも2%低下している、
xv)前記細胞内の非極性脂質に含まれる、ステロール、好ましくは遊離(非エステル型)ステロール、ステロイルエステル、ステロイルグリコシドの総量のレベルが外因性ポリヌクレオチド(複数を含む)及び/または遺伝子改変(複数を含む)を欠く、相当する細胞の非極性脂質と比較して変化している、
xvi)前記細胞の非極性脂質が、ワックス及び/またはワックスエステルを含む、
xvii)前記細胞が、少なくとも約1000のこのような細胞、好ましくは生育植物部分または種子の集団またはコレクションの1つのメンバーである、
xviii)前記細胞がサイレンシングサプレッサーをコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、該外因性ポリヌクレオチドが細胞内でのポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結されている、
xix)前記細胞の1つ以上の非極性脂質のレベル及び/または非極性脂質の総含有量が、Arabidposis thaliana WRI1(配列番号21)及びArabidposis thaliana DGAT1(配列番号1)をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む相当する細胞中よりも、重量基準で少なくとも2%多い、及び
xx)外因性ポリヌクレオチド(複数を含む)及び/または遺伝子改変(複数を含む)を欠く、相当する細胞の多価不飽和脂肪酸(PUFA)の総含有量と比較して、PUFAの総含有量が減少している。 - 関連する場合に、以下の特徴の1つ以上またはすべてが該当する、請求項5〜8のいずれか1項に記載の細胞;
i)1つ以上の非極性脂質の生合成に関与する前記ポリペプチドが、細胞内のTAG、DAGまたはモノアシルグリセロール(MAG)の生合成に関与する脂肪酸アシルアシルトランスフェラーゼであり、例えば、DGAT、PDAT、LPAAT、GPATまたはMGAT、好ましくはDGATまたはPDATである、
ii)細胞のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与する前記ポリペプチドが、SDP1リパーゼ、Cgi58ポリペプチド、アシル−CoAオキシダーゼ(例えばACX1またはACX2)、またはPXA1ペルオキシソームATP結合カセットトランスポーター等の細胞内での脂肪酸のβ酸化に関与するポリペプチドであり、好ましくはSDP1リパーゼである、
iii)前記油体被覆(OBC)ポリペプチドが、ポリオレオシン若しくはカレオシン等のオレオシン、または脂肪滴会合タンパク質(LDAP)である、
iv)細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させる前記ポリペプチドが、FATAポリペプチドまたはFATBポリペプチド等のC16またはC18脂肪酸チオエステラーゼ、ABCA9ポリペプチド等の脂肪酸トランスポーター、または長鎖アシル−CoAシンテターゼ(LACS)である、
v)細胞の色素体への脂肪酸の移入に関与する前記ポリペプチドが、脂肪酸トランスポーターまたはそのサブユニット、好ましくはTGDポリペプチドである、及び
vi)色素体のジアシルグリセロール(DAG)産生に関与する前記ポリペプチドが、色素体GPAT、色素体LPAATまたは色素体PAPである。 - 請求項5〜9のいずれか1項に記載の細胞であって、
i)16:3植物由来であるか、若しくは16:3植物内、若しくはその生育部分若しくは種子内のものであり;
a)外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド、
b)第1の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第1の遺伝子改変、及び
c)第2の遺伝子改変を欠く、相当する細胞と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第2の遺伝子改変のうち、1つ以上またはすべてを含み、
ここでの外因性ポリヌクレオチドが、細胞内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される、前記細胞、または
ii)18:3植物由来であるか、若しくは18:3植物内、若しくはその生育部分若しくは種子内のものである、前記細胞。 - 前記細胞が、植物開花前の植物の葉または茎に由来する、またはそれら内部のものであり、少なくとも約8%、少なくとも約10%、少なくとも約11%、8%〜15%または9%〜12%(w/w乾重量)の非極性脂質の総含有量を含む、請求項10に記載の細胞。
- 前記遺伝子改変が、遺伝子を部分的に、または完全に不活性化する内因性遺伝子の変異、例えばポイントミューテーション、挿入または欠失等であるか、または前記遺伝子改変が、内因性遺伝子の発現を阻害するRNA分子をコードする外因性ポリヌクレオチドであり、該外因性ポリヌクレオチドが、細胞内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される、請求項5〜11のいずれか1項に記載の細胞。
- 請求項5〜12のいずれか1項以上に記載の1種以上の細胞を含む、非ヒト生物またはその一部。
- トランスジェニック植物またはその一部であって、
a)植物内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、転写因子ポリペプチドをコードする第1の外因性ポリヌクレオチド、
b)1つ以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする第2の外因性ポリヌクレオチド、ならびに
c)遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、植物内のトリアシルグリセロール(TAG)の異化に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する遺伝子改変、
d)第4の外因性ポリヌクレオチドを欠く、相当する細胞と比較したとき、細胞の色素体からの脂肪酸の移出を増加させるポリペプチドをコードする第3の外因性ポリヌクレオチド、及び
e)細胞内での1つ以上の解糖系遺伝子及び/または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる第2の転写因子ポリペプチドをコードする、第4の外因性ポリヌクレオチドのうち、1つまたは2つまたは3つすべてを含み、
ここでの各外因性ポリヌクレオチドが、植物内のポリヌクレオチドの発現を誘導できるプロモーターに作動可能に連結される、前記トランスジェニック植物またはその一部。 - 以下の1つ以上またはそのすべてを更に含む、請求項14に記載の植物またはその一部
a)油体被覆(OBC)ポリペプチドをコードする第5の外因性ポリヌクレオチド、
b)第2の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、植物の色素体への脂肪酸の移入に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第2の遺伝子改変、及び
c)第3の遺伝子改変を欠く、相当する植物と比較したとき、色素体のジアシルグリセロール(DAG)の産生に関与するポリペプチドの内因性の産生及び/または活性を下方調節する第3の遺伝子改変。 - 前記部分が生育部分であり、プロモーターのうちの1つ以上またはすべてが植物の種子と比較して、該生育部分において高レベルで発現する、請求項14または請求項15に記載の植物またはその一部。
- 請求項9〜12のいずれか1項に記載の1つ以上の特徴を含む、請求項14〜16のいずれか1項に記載の植物またはその一部。
- 各々が請求項14〜17のいずれか1項に記載の植物であり、耕地で生長する少なくとも約1000の植物集団、または各々が請求項14〜17のいずれか1項に記載の生育植物部分であり、該生育植物部分が耕地で生長する植物から採取された、少なくとも約1000の生育植物部分のコレクション。
- 請求項14〜17のいずれか1項に記載の植物の種子または植物から得た種子。
- 請求項5〜12のいずれか1項に記載の組み換え真核細胞を得るための工程であって、該工程が、
i)請求項5〜12のいずれか1項に記載の少なくとも1つの外因性ポリヌクレオチド及び/または少なくとも1つの遺伝子改変を真核細胞に導入し、請求項5〜12のいずれか1項に記載の外因性ポリヌクレオチド及び/または遺伝子改変のセットを含む真核細胞を産生すること、
ii)細胞またはその子孫細胞の外因性ポリヌクレオチド(複数を含む)を発現させること、
iii)細胞または子孫細胞の脂質含有量を分析すること、及び
iv)請求項5〜12のいずれか1項に記載の細胞を選択することを含む、前記工程。 - 請求項14〜17のいずれか1項に記載の外因性ポリヌクレオチド及び/または遺伝子改変のセットをゲノムに統合した植物の製造方法であって、該方法が、
i)一方の植物が請求項14〜17のいずれか1項に記載の少なくとも1つの外因性ポリヌクレオチド及び/または少なくとも1つの遺伝子改変を含み、他方の植物が請求項14〜17のいずれか1項に記載の少なくとも1つの外因性ポリヌクレオチド及び/または少なくとも1つの遺伝子改変を含み、かつ両者間で2つの親植物が請求項14〜17のいずれか1項に記載の外因性ポリヌクレオチド及び/または遺伝子改変のセットを含む、2つの親植物を交配するステップ、
ii)請求項14〜17のいずれか1項に記載の外因性ポリヌクレオチド及び/または遺伝子改変のセットが存在するまたは存在しない交配種から1つ以上の子孫植物を選別するステップ、
iii)請求項14〜17のいずれか1項に記載の外因性ポリヌクレオチド及び/または遺伝子改変のセットを含む子孫植物を選択し、
それにより植物を産生するステップを含む、前記方法。 - 工業製品の製造工程であって、該工程が、
i)請求項5〜12のいずれか1項に記載の組み換え真核細胞、請求項13に記載のトランスジェニック非ヒト生物若しくはその一部、請求項14〜17のいずれか1項に記載のトランスジェニック植物若しくはその一部、または請求項19に記載の種子を得るステップ、及び
ii)
a)加熱手段、化学的手段、若しくは酵素的手段またはそれらの任意の組み合わせを、細胞、非ヒト生物若しくはその一部、植物またはその一部、または種子の脂質にin situで適用することにより、ステップi)の細胞、非ヒト生物若しくはその一部、植物若しくはその一部、または種子の少なくとも一部の脂質を工業製品に転換するステップ、または
b)ステップi)の細胞、非ヒト生物若しくはその一部、植物若しくはその一部、または種子を物理的に処理し、同時にまたは後に加熱手段、化学的手段、若しくは酵素的手段またはそれらの任意の組み合わせを、処理された細胞、非ヒト生物若しくはその一部、植物若しくはその一部、または種子の脂質に適用することにより、処理された細胞、非ヒト生物若しくはその一部、植物若しくはその一部、または種子の少なくとも一部の脂質を工業製品へと転換するステップのいずれか、及び
iii)工業製品を回収すること、
それによって、工業製品を製造するステップを含む、前記工程。 - 前記植物部分が生育植物部分である、請求項22に記載の工程。
- 請求項22または請求項23に記載の工程であって、
(a)細胞、非ヒト生物若しくはその一部、植物若しくはその一部、または種子の非極性脂質含有量の少なくとも一部を非極性脂質として抽出するステップ、及び
(b)抽出された非極性脂質を回収するステップを更に含み、
ここでのステップ(a)及び(b)が、細胞、非ヒト生物若しくはその一部、植物若しくはその一部、または種子の少なくとも一部の脂質を工業製品へと転換するステップの前に実施される、前記工程。 - 抽出された脂質の製造工程であって、該工程が、
i)請求項5〜12のいずれか1項に記載の組み換え真核細胞、請求項13に記載のトランスジェニック非ヒト生物若しくはその一部、請求項14〜17のいずれか1項に記載のトランスジェニック植物若しくはその一部、または請求項19に記載の種子を得るステップ、
ii)細胞、非ヒト生物若しくはその一部、植物若しくはその一部または種子から脂質を抽出するステップ、及び
iii)抽出された脂質を回収すること、
それによって、抽出された脂質を製造するステップを含む、前記工程。 - 前記抽出された脂質を容器内に収集するにより回収すること、ならびに/または抽出された脂質、開花及び/若しくは抽出された脂質由来のワックスエステルの脱ガム、脱臭、脱色、乾燥、分画のうち、1つ以上を行うこと、または抽出された脂質の脂肪酸成分を分析することを含む、請求項24または請求項25に記載の工程。
- 前記工程が、抽出された脂質を工業製品に転換することを更に含む、請求項24〜26のいずれか1項に記載の工程。
- 前記工業製品が、炭化水素製品、例えば脂肪酸エステル、好ましくは脂肪酸メチルエステル及び/または脂肪酸エチルエステル、アルカン(例えば、メタン、エタンまたは長鎖アルカン)、長鎖アルカン類の混合物、アルケン、バイオ燃料、一酸化炭素及び/または水素ガス、バイオアルコール(例えば、エタノール、プロパノールまたはブタノール)、バイオ炭、または一酸化炭素、水素及びバイオ炭の混合物等である、請求項22〜24または27のいずれか1項に記載の工程。
- 前記植物部分が、植物地上部若しくは縁色植物部分、好ましくは生育植物部分、例えば植物の葉若しくは茎であるか、または前記植物部分が、塊茎若しくは食用根、例えばジャガイモ(Solanum tuberosum)塊茎若しくはサトウダイコンである、請求項22〜28のいずれか1項に記載の工程。
- 種子の製造工程であって、該工程が、
i)請求項14〜17のいずれか1項に記載の植物を生長させること、及び
ii)その植物から種子を採取することを含む、前記工程。 - 請求項5〜12のいずれか1項に記載の組み換え真核細胞、請求項13に記載のトランスジェニック非ヒト生物若しくはその一部、請求項14〜17のいずれか1項に記載のトランスジェニック植物若しくはその一部、請求項19に記載の種子から得られる、または請求項25〜29のいずれか1項に記載の工程により得られる、回収または抽出された脂質。
- 炭化水素製品、例えば脂肪酸エステル、好ましくは脂肪酸メチルエステル及び/または脂肪酸エチルエステル、アルカン(例えば、メタン、エタンまたは長鎖アルカン)、長鎖アルカン類の混合物、アルケン、バイオ燃料、一酸化炭素及び/または水素ガス、バイオアルコール(例えば、エタノール、プロパノールまたはブタノール)、バイオ炭、または一酸化炭素、水素及びバイオ炭の混合物等である、請求項22〜24、27または28のいずれか1項に記載の工程により製造された工業製品。
- 請求項5〜9のいずれか1項に記載の組み換え真核細胞、請求項13に記載のトランスジェニック非ヒト生物若しくはその一部、請求項14〜17のいずれか1項に記載のトランスジェニック植物若しくはその一部、請求項19に記載の種子、または請求項31に記載の回収若しくは抽出された脂質の工業製品の製造への使用。
- 燃料の製造工程であって、該工程が、
i)請求項31に記載の脂質を、場合により触媒の存在下で、アルコールと反応させ、アルキルエステルを得ること、及び
ii)場合により、該アルキルエステルと石油系燃料を混合することを含む、前記工程。 - 合成ディーゼル燃料の製造工程であって、該工程が、
i)請求項5〜12のいずれか1項に記載の組み換え真核細胞、請求項13に記載のトランスジェニック非ヒト生物若しくはその一部、請求項14〜17のいずれか1項に記載のトランスジェニック植物若しくはその一部、または請求項19に記載の種子内の脂質を、熱分解または熱水処理を含む工程によりバイオ油に転換すること、またはガス化により合成ガスに転換すること、及び
ii)分画、好ましくは約150℃〜約200℃または約200℃〜約300℃で凝縮する炭化水素化合物の選別を含む工程により、バイオ油を合成ディーゼル燃料に転換すること、または金属触媒または微生物触媒を使用して合成ガスをバイオ燃料に転換することを含む、前記工程。 - 請求項5〜12のいずれか1項に記載の組み換え真核細胞、請求項13に記載のトランスジェニック非ヒト生物若しくはその一部、請求項14〜17のいずれか1項に記載のトランスジェニック植物若しくはその一部、または請求項19に記載の種子内の脂質を、熱分解によりバイオ油に、発酵によりバイオアルコールに、またはガス化若しくは嫌気性消化によりバイオガスに転換することを含む、バイオ燃料の製造工程。
- 前記部分が生育植物部分である、請求項35または請求項36に記載の工程。
- 請求項5〜12のいずれか1項に記載の組み換え真核細胞、請求項13に記載のトランスジェニック非ヒト生物若しくはその一部、請求項14〜17のいずれか1項に記載のトランスジェニック植物若しくはその一部、請求項19に記載の種子、若しくは請求項31に記載の回収または抽出された脂質、またはそれらの抽出物若しくは一部を少なくとも1つの他の食品原料成分と混合することを含む、飼料の製造工程。
- 請求項5〜12のいずれか1項に記載の組み換え真核細胞、請求項13に記載のトランスジェニック非ヒト生物若しくはその一部、請求項14〜17のいずれか1項に記載のトランスジェニック植物若しくはその一部、請求項19に記載の種子、若しくは請求項31に記載の回収若しくは抽出された脂質、またはそれらの抽出物若しくは一部を含む、飼料、化粧品または化学薬品。
- 請求項14〜17のいずれか1項に記載のトランスジェニック植物若しくはその一部、請求項19に記載の種子、または請求項31に記載の回収若しくは抽出された脂質を動物に与える工程を含む、動物に給餌する工程。
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