CN104178509A - 蛋白质GmDREB2AL及其相关生物材料在调控种子植物油脂和千粒重中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了蛋白质GmDREB2AL及其相关生物材料在调控种子植物油脂和千粒重中的应用。其中的一种应用是培育具种子中总油脂含量、脂肪酸含量和千粒重的转基因种子植物的方法，包括向受体种子植物中导入GmDREB2AL的编码基因得到所述转基因种子植物的步骤；所述GmDREB2AL是氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质，或是将SEQ ID No.2经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基且与种子总油脂含量和/或脂肪酸含量和/或种子千粒重相关的由a）衍生的蛋白质。GmDREB2AL基因可用于提高和改良作物油脂成份和增加产量、培育高油脂和高产量品种。

Description

蛋白质GmDREB2AL及其相关生物材料在调控种子植物油脂和千粒重中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及来源于大豆的蛋白质GmDREB2AL及其相关生物材料在调控种子植物油脂和千粒重中的应用。

背景技术

大豆是油脂和植物蛋白质的主要来源之一。人类饮食中71％的油脂来自于植物。在世界上的几种主要产油作物中，大豆总产油量约占30％，居世界植物油产量的第一位(表1)。

表1为世界上主要的产油作物

脂肪酸的合成是植物体中最重要的代谢途径之一，它存在于植物体的任何一个细胞中，是生长发育所必须的。对它的阻断会导致细胞的死亡，因而至今为止还没有发现一个阻断脂肪酸合成的植物突变体。

植物同其它真核生物在参与脂肪酸合成途径的酶上有很大差异。从乙酰CoA和丙二酰CoA合成16或18个碳原子的脂肪酸至少需要30个不同的酶催化的反应来完成这一过程，而在动物、真菌及一些细菌中，以上反应是由一个存在于胞质中的多酶复合体来完成的。植物中，参与脂肪酸合成的酶以可溶的形式存在于质体的胞质中。

人们已对脂类合成途径有了认知，并且已经克隆了参与脂类合成的酶基因。然而，植物中，对脂类合成的调控机理及其相关基因仍然知之甚少。

目前我国每年进口的大豆量是产量的2倍以上，我国大豆单产较低是提高产量的瓶颈之一。大豆产量的要素包括：株型、单株产量、每荚粒数等。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供来源于大豆的蛋白质GmDREB2AL及其相关生物材料的新用途。

本发明所提供的一种新用途是利用GmDREB2AL的编码基因培育总油脂含量高和/或脂肪酸含量高和/或种子千粒重高的转基因种子植物的方法。

本发明所提供的培育具有三种农艺性状中的三种、两种或一种农艺性状的转基因种子植物的方法，包括向受体种子植物中导入GmDREB2AL的编码基因得到具有所述三种农艺性状中的三种、两种或一种性状的转基因种子植物的步骤；

所述GmDREB2AL是如下a）或b）的蛋白质：

a）氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；

b）将SEQ ID No.2经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基且与种子总油脂含量和/或脂肪酸含量和/或种子千粒重相关的由a）衍生的蛋白质；

所述三种农艺性状为1）-3）：

1）种子中总油脂含量高于所述受体种子植物；

2）种子千粒重高于所述受体种子植物；

3）种子中脂肪酸含量高于所述受体种子植物；

所述脂肪酸为棕榈酸（软脂酸）（16:0）、亚油酸和油酸中的三种、两种或一种。

上述方法中，所述一个或几个氨基酸残基是指不多于十个氨基酸残基。SEQ ID No.2由211个氨基酸残基组成。

上述方法中，所述受体种子植物具体可为被子植物；进一步，所述被子植物可为双子叶植物，如拟南芥。

当所述受体种子植物为十字花科植物时，所述转基因种子植物除具有所述三种性状外，还具有角果长度大于所述受体种子植物的性状。如当所述种子植物为拟南芥时，转基因拟南芥除具有所述三种农艺性状外，还具有角果长度大于所述受体拟南芥的农艺性状。

所述GmDREB2AL基因为编码所述GmDREB2AL的DNA分子，具体可为1）-3）中任一种DNA分子：

1）其编码序列是SEQ ID No.1的DNA分子；

2）在严格条件下与1）限定的DNA分子杂交且编码所述GmDREB2AL的DNA分子；

3）与1）限定的DNA分子至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码所述GmDREB2AL的DNA分子。

上述GmDREB2AL基因中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠（SDS）、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1%SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次。

上述方法中，其中所述GmDREB2AL基因可先进行如下修饰，再导入受体种子植物中，以达到更好的表达效果：

1）根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述GmDREB2AL基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；

2）修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

3）与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

4）与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

5）引入增强子序列，如内含子序列（例如来源于Adhl和bronzel）和病毒前导序列（例如来源于TMV,MCMV和AMV）。

上述方法中，所述GmDREB2AL基因通过含有GmDREB2AL基因表达盒的重组表达载体导入所述受体种子植物中，所述GmDREB2AL基因表达盒中，启动GmDREB2AL基因转录的启动子是花椰菜花叶病毒35S启动子，终止所述GmDREB2AL基因转录的终止子是农杆菌胭脂碱合成酶终止子。

本发明中所述GmDREB2AL基因表达盒均可含有所述GmDREB2AL基因和启动所述GmDREB2AL基因转录的启动子。本发明中所述GmDREB2AL基因表达盒均指能够在宿主细胞中表达SEQ ID No.2所示的GmDREB2AL的DNA，该DNA不但可包括启动所述GmDREB2AL基因转录的启动子，还可包括终止所述GmDREB2AL基因转录的终止子。进一步，所述GmDREB2AL基因表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S;来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人（1999)Plant Physiol120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128（CN101063139B(中国专利200710099169.7)），种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子（Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子（NOS终止子）、花椰菜花叶病毒CaMV35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子（参见，例如：Odell等人（I⁹⁸⁵)Nature313:810；Rosenberg等人（1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141;Proudfoot(1991)Cell,64:671;Sanfacon等人Genes Dev.,5:141;Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人（1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

在本发明的实施例中，所述GmDREB2AL基因表达盒中启动所述GmDREB2AL基因转录的启动子为花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S，终止所述GmDREB2AL基因转录的终止子为NOS。

可用现有的植物表达载体构建含有所述GmDREB2AL基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pGWB412、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb（CAMBIA公司）等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、抗生素的标记基因（如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因）或是抗化学试剂标记基因等（如抗除莠剂基因）、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。

在本发明的实施例中，所述GmDREB2AL基因通过含有所述GmDREB2AL基因表达盒的GmDREB2AL基因表达载体导入目的植物。

所述GmDREB2AL基因表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞（Weissbach,1998，Methodfor Plant Molecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463;Geiserson and Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition)。

上文中，所述转基因种子植物理解为不仅包含将所述基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

本发明所提供的另一种新用途是GmDREB2AL相关生物材料在调控如下四种性状中四种、三种、两种或一种性状中的应用；所述四种性状为A）-D）：

A）种子植物的种子中总油脂含量；

B）种子植物的种子千粒重；

C）种子植物的种子中脂肪酸含量；

D）十字花科植物角果形态；

所述脂肪酸为棕榈酸、油酸、亚油酸、硬脂酸和花生四烯酸中五种、四种、三种、两种或一种；

所述GmDREB2AL相关生物材料为B1）-B6）中至少一种：

B1）GmDREB2AL；

所述GmDREB2AL是如下a）或b）的蛋白质：

a）氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；

b）将SEQ ID No.2经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基且与总油脂含量和/或脂肪酸含量相关的由a）衍生的蛋白质；

B2）编码所述GmDREB2AL的核酸分子；

B3）含有B2）所述核酸分子的表达盒；

B4）含有B2）所述核酸分子的重组载体、或含有B3）所述表达盒的重组载体；

B5）含有B2）所述核酸分子的重组微生物、或含有B3）所述表达盒的重组微生物、或含有B4）所述重组载体的重组微生物；

B6）含有B2）所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B3）所述表达盒的的转基因植物细胞系、或含有B4）所述重组载体的的转基因植物细胞系、或含有B5）所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述应用中，所述角果形态具体可为角果长度。

上述应用中，所有术语的定义同上文。

实验证明，GmDREB2AL相关生物材料可用于调控种子植物的种子中总油脂含量、调控种子植物的种子千粒重、调控种子植物的种子中脂肪酸含量和调控十字花科植物角果长度。

上文中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。编码所述GmDREB2AL的核酸分子具体可为1）-3）中任一种DNA分子：

1）其编码序列是SEQ ID No.1的DNA分子；

2）在严格条件下与1）限定的DNA分子杂交且编码所述GmDREB2AL的DNA分子；

3）与1）限定的DNA分子至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码所述GmDREB2AL的DNA分子。

所述重组微生物具体可为细菌,酵母,藻和真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属（Escherichia）,欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属（Agrobacterium）、黄杆菌属（Flavobacterium）,产碱菌属（Alcaligenes）,假单胞菌属（Pseudomonas）,芽胞杆菌属（Bacillus）等。所述转基因植物细胞系为非植物繁殖材料。

上述B2）-B6）中任一种所示的GmDREB2AL相关生物材料也属于本发明的保护范围。

本发明的实验证明，将GmDREB2AL基因转入野生型拟南芥中得到的转基因拟南芥种子中的油脂含量和部分脂肪酸含量、千粒重和角果长度显著高于野生型拟南芥。说明GmDREB2AL及其编码基因可以调控种子植物种子中油脂含量、脂肪酸含量和千粒重，过表达后提高种子植物种子中油脂含量、部分脂肪酸含量和千粒重。GmDREB2AL基因可用于提高和改良作物油脂成份和增加产量、培育高油脂和高产量品种。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1A为克隆载体GW/TOPO示意图

图1B为植物表达载体pGWB412–GmDREB2AL示意图

图2为GmDREB2AL在大豆不同器官的表达分析

图3为转GmDREB2AL拟南芥株系的分子鉴定

图4为转GmDREB2AL拟南芥株系籽粒中油脂含量测定

图5为转GmDREB2AL拟南芥株系籽粒中脂肪酸含量测定

图6为转GmDREB2AL拟南芥株系的千粒重测定

图7为转GmDREB2AL拟南芥株系的角果长度测定

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

大豆黑农44（HN44）记载在如下文献中：满为群等，大豆新品种黑农44的选育及不同种植方式对其产量和品种的影响，黑龙江农业科学2004年5期，1-5；公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；该大豆2006年获自黑龙江农业科学院大豆研究所；由黑龙江农业科学院大豆研究所2002年经黑龙江省农作物品种审定委员会审定的大豆品种，第一育成人为杜维广研究员，专利号为：CNA20020216.2，审定号为：黑审豆2002003。

表达载体pGWB412（Department of Molecular and Functional Genomics,ShimaneUniversity,Aatsue,Shimane690-8504,Japan,E.mail:

tnakagawlife.shimane-u.ac.jp Isuyoshi Nakagawa,et al.,Gatway Vectors forPlant Transformation,Plant Biotechnology,2009,26,275-284）。由TsuyoshiNakagawa博士提供，公众得到Tsuyoshi Nakagawa博士同意后可从中科院遗传与发育生物学研究所获得，以重复本申请的实验。

根癌农杆菌GV3101（Lee CW等，Agrobacterium tumefaciens promotes tumorinduction by modulating pathogen defense in Arabidopsis thaliana,Plant Cell,2009,21(9),2948-62），公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，以重复本申请的实验。

实施例1、大豆与油脂代谢调控相关的GmDREB2AL编码基因的cDNA克隆和植物表达载体的构建

1、蛋白质GmDREB2AL基因克隆和植物表达载体的构建

提取黑农44幼苗的总RNA，将RNA用逆转录酶反转录合成cDNA。

根据在PlantGDB的大豆基因组序列中GmDREB2AL全长cDNA序列的信息，设计引物，引物序列如下：

GmDREB2AL-up：5’-ATGCACATGTTAGTGAAAAACC-3’；

GmDREB2AL-dp：5’-TCAAGACAATGAAAGATAGGAAGAAC-3’。

以HN44cDNA为模板，用GmDREB2AL-up和GmDREB2AL-dp为引物，进行PCR扩增,得到约650bp的PCR产物。经过测序，该PCR产物为636bp,其核苷酸序列为SEQ ID No.1，该核苷酸序列所示的DNA分子为GmDREB2AL基因（GmDREB2AL），该基因编码的蛋白命名为GmDREB2AL，GmDREB2AL的氨基酸序列为SEQ ID No.2。

基因克隆使用invitrogen公司提供的Gateway系统，载体3′-T突出端，用于直接连接Taq酶扩增的PCR产物。

将上述1得到的636bp的PCR产物运用TA克隆的原理克隆与载体GW/TOPO上（GW/TA Cloning Kit,Catalog number:K2500-20,InvitogenCorporation,Carlsbad,CA,USA载体示意图如图1A）连接，得到中间载体GW/-GmDREB2AL。

将GW/-GmDREB2AL与过表达载体pGWB412在重组酶的作用下进行LR重组反应，最终目的基因GmDREB2AL成功构建到过表达载体pGWB412上，得到重组载体。

具体方法如下：1ulGW/-GmDREB2AL（中间载体）,1ul pGWB412,1ul LR buffer,1ul LR Enzyme mix,1ul TE buffer PH8.0,25℃6h,加0.5ul蛋白酶K后，37℃，10min,得到重组载体(详细操作见公司提供的说明书或参照上述文献)。

测序结果表明重组载体为将序列表中序列1所示的DNA分子同源重组到载体pGWB412中得到的GmDREB2AL基因表达载体，命名为pGWB412-GmDREB2AL（部分结构示意图如图1B）。

2、GmDREB2AL在大豆不同器官的表达分析

取大豆黑农44根、茎、叶、花和籽粒的总RNA，用逆转录酶反转录合成cDNA。引物为：5’-TTCTCCAGCTGCTGCTTACC-3’和5’-CTGCTGCATCTCCACCAGAA-3’，进行RealTime-PCR鉴定。大豆Tublin基因为内标，所用引物为Primer-TF：5’-AACCTCCTCCTCATCGTACT，和Primer-TR：5’-GACAGCATCAGCCATGTTCA-3’。图2显示，在根、茎、叶和花中几乎检测不到GmDREB2AL基因的转录，而在籽粒中其相对表达量很高，因此GmDREB2AL是籽粒特异表达的基因。

实施例2、转GmDREB2AL拟南芥的获得

一、重组农杆菌的获得

将实施例1得到的含有GmDREB2AL的重组载体pGWB412-GmDREB2AL用电击法导入根癌农杆菌GV3101，得到含有pGWB412-GmDREB2AL的重组农杆菌GV3101/GmDREB2AL。

二、转GmDREB2AL拟南芥的获得及鉴定

将重组农杆菌GV3101/GmDREB2AL培养至对数期，然后用抽真空法将其转化哥伦比亚生态型拟南芥(col-0)中,种子购自Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC)。经培育后收获种子（T₁代），将种子播于含卡那霉素（50mg/L）的MS筛选培养基上，收集T₁代植株转化植株的新鲜叶片，提取RNA，反转录得到cDNA作为模板，引物为：5’-TTCTCCAGCTGCTGCTTACC-3’和5’-CTGCTGCATCTCCACCAGAA-3’，进行Real Time-PCR鉴定。以野生型拟南芥（Col-0，在下文中简称Col）为对照。拟南芥AtActin2基因为内标，所用引物为Primer-TF：5’-ATGCCCAGAAGTCTTGTTCC-3’，和Primer-TR：5’-TGCTCATACGGTCAGCGATA-3’。以内标AtActin2基因的表达量为1，测定GmDREB2AL的相对表达量。实验重复三次，结果取平均值±标准差。取10棵T₁代阳性植株，待长至4-6叶时移到蛭石上生长，收获T₁代单株，各单株种子分别播种，用相同的MS筛选培养基继续筛选以观察T₂代的分离情况，如此重复数代直至获得遗传稳定的转基因纯合株系，共获得10个转GmDREB2AL拟南芥纯系。提取上述10个株系苗RNA，再次用上述Real Time-PCR方法鉴定纯系植株。结果表明转基因株系OE-2、OE-7、OE-11、OE-13、OE-15和OE-22中的GmDREB2AL相对表达量的平均值分别为0.05、0.045、0.072、0.085、0.055和0.038，野生型拟南芥（Col）（受体拟南芥）中未能检测出GmDREB2AL的表达。

上述结果进一步证明，GmDREB2AL转入拟南芥中，且得到表达。

采用同样的方法将空载体pGWB412转入野生型拟南芥中，得到T₀代转空载体拟南芥，播种、收种，直到得到T₅代转空载体纯系拟南芥。

三、转GmDREB2AL基因拟南芥的表型分析

测定野生型拟南芥（col）、步骤二中T₅代转空载体拟南芥、步骤二中编号为OE-2、OE-7、OE-11、OE-13、OE-15和OE-22的T₅代转GmDREB2AL拟南芥的成熟种子（籽粒）总油脂含量和脂肪酸含量。

种子总油脂含量测定方法如下:将干燥的种子研磨成粉，称取100mg到离心管中，平行称取四份。加入500μl的正己烷，充分混匀，37℃过夜。慢速离心3分钟，将正己烷吸入称量过新管中。剩下的粉末继续加正己烷重复浸泡、然后离心、然后收集正己烷到同一的离心管中。将离心管放入真空泵中，抽真空，使正己烷完全挥发。然后再次称取离心管的重量。离心管前后重量的变化即是提取的总油脂重量；总油脂含量（%）的计算公式为总油脂含量（%）=（提取的油脂重量/种子重量）*100%）。

每个株系取30株的种子，实验重复三次，结果取平均值±标准差。

种子中脂肪酸含量的检测方法如下:彻底干燥待测籽粒，研磨成粉，取10mg加入螺口的2ml离心管中，每份样品平行称取四份。加入10μl的17:0脂肪酸（10mg/ml）做内标。加含2.5%浓硫酸的甲醇溶液1ml，85℃水浴中保温1小时，期间晃动数次。自然冷却后，取上清500μl到新管中，加入600μl的0.9%NaCl溶液、300正己烷，震荡混匀几分钟，4000转离心10分钟，取上清至新管中。通风橱中过夜使正己烷挥发完全，然后加入50μl乙酸乙酯溶解甲酯化的脂肪酸。将甲酯化的脂肪酸样品用气相色谱质谱联用仪测（Perkin-Elmer Turbomass)各个组分的相对含量，然后各个成分的脂肪酸与加入的17:0内标比较得出相对含量。(Shen,B.,et al.,The homeobox gene GLABRA2affects seed oil content in Arabidopsis,Plant Mol.Biol.,60,377-387,2006.)

每个株系取30株的籽粒，实验重复三次，结果取平均值±标准差。

种子总油脂含量测定结果如图4所示，野生型拟南芥种子总油脂量为34.2±0.2%（即为种子总重量的百分比）；

转GmDREB2AL拟南芥纯系OE-2、OE-7、OE-11、OE-13、OE-15和OE-22种子总油脂量为35.0±0.2%；36.7±0.3%；37.0±0.2%；35.6±0.3%;35.4±0.2%;35.7±0.2%。（图4）。结果表明，6个转基因株系种子中的总油脂含量均高于对照，其中，2个株系OE-15和OE-22达到显著差异水平，3个株系OE-7、OE-11和OE-13达到极显著高的水平。

上述实验表明，GmDREB2AL对种子中总油脂的合成呈正调控作用，其编码基因GmDREB2AL的表达，可提高转基因植株种子中总油脂的含量。

另外，野生型拟南芥和转空载体拟南芥的种子总油脂含量无显著差异。

种子中脂肪酸含量的检测结果如图5所示，共检测了8种脂肪酸含量，其中五个转基因植株籽粒中亚麻酸（18:3）、贡多酸（20:1）和芥子酸（22:1）的含量与野生型拟南芥（col）相比无明显差异;野生型拟南芥（col）、OE-7、OE-11、OE-13、OE-15和OE-22籽粒中棕榈酸（16:0）占籽粒总重量的百分比的平均值分别为2.8%、3.3%、3.3%、3,2%和3.2%；硬脂酸（18:0）占籽粒总重量的百分比的平均值分别为1.0%、0.9%、0.9%、0.8%、0.8%和0.8%；油酸（18:1）占籽粒总重量的百分比的平均值分别为4.2%、5.2%、5.5%、5.1%、5.4%和5.4%；亚油酸（18:2）占籽粒总重量的百分比的平均值分别为10.1%、12.0%、11.8%、11.2%、11.4%和11.6%；花生四烯酸（20:4）占籽粒总重量的百分比的平均值,野生型拟南芥（col）为0.3%，五个转基因株系均为0.2%。另外，野生型拟南芥和转空载体拟南芥的种子中上述脂肪酸含量无显著差异。

总结上述结果：GmDREB2AL的过量表达在籽粒中提高了棕榈酸、油酸和亚油酸的含量，降低了硬脂酸和花生四烯酸含量。因此GmDREB2AL对不同脂肪酸合成途径的调控有差异。

上述实验表明，GmDREB2AL对种子中总油脂的合成呈正调控作用，其编码基因GmDREB2AL的过量表达，可提高转基因植株种子中总油脂的含量和一些脂肪酸如棕榈酸、油酸和亚油酸的含量，降低硬脂酸和花生四烯酸含量。

图4和图5中，*表示与野生型拟南芥相比，具有显著差异；**表示与野生型拟南芥相比，具有极显著差异。

2.种子千粒重检测

测定野生型拟南芥（col）、步骤二中T₅代转空载体拟南芥、步骤二中编号为OE-2、OE-7、OE-11、OE-13和OE-15的T₅代转GmDREB2AL拟南芥的成熟种子（籽粒）的种子千粒重。每个转基因株系的种子，数1000粒种子，用精密天平称重，得到该株系的种子千粒重数据。重复4次试验，4次试验的平均值即为该株系的千粒重结果。

结果表明野生型拟南芥（col）、OE-2、OE-7、OE-11、OE-13和OE-15的种子千粒重的平均值分别为14.0mg、16.0mg、16.5mg、15.0mg、16.2mg和16.3mg，转基因株系种子千粒重均高于野生型拟南芥（col）。其中OE-2呈现显著水平，OE-7、OE-13和OE-15株系种子千粒重极显著地高于野生型拟南芥（col）（图6）。另外，野生型拟南芥和转空载体拟南芥的种子千粒重无显著差异。

结果说明GmDREB2AL过表达提高了转基因植株种子千粒重。图6中，*表示与野生型拟南芥相比，具有显著差异；**表示与野生型拟南芥相比，具有极显著差异。

3.角果长度检测

比较了野生型拟南芥（col）、步骤二中T₅代转空载体拟南芥、步骤二中编号为OE-2、OE-7、OE-11和OE-15的T₅代转GmDREB2AL拟南芥的角果长度。上述拟南芥均在相同的环境下生长。等结荚后收集相同成熟度的角果测定其长度，每次试验各株系收集10个，试验重复4次。图7中B显示GmDREB2A过表达的四个株系OE-2、OE-7、OE-11和OE-15的角果长度极显著长于野生型拟南芥（col）。统计显示，野生型拟南芥（col）角果长度的平均值为1.12cm，而转基因植株OE-2、OE-7、OE-11和OE-15的角果长度的平均值分别为1.33cm、1.24cm、1.20cm和1.18cm。除此之外，所有转基因植株的大小，开花时间，叶片的形态并没有明显差异。另外，野生型拟南芥和转空载体拟南芥的角果长度无显著差异。图7中，*表示与野生型拟南芥相比，具有显著差异；**表示与野生型拟南芥相比，具有极显著差异。

上述结果表明，GmDREB2A的过表达明显增加了转基因植株角果长度。

Claims (10)

1.培育具有三种农艺性状中的三种、两种或一种农艺性状的转基因种子植物的方法，包括向受体种子植物中导入GmDREB2AL的编码基因得到具有所述三种农艺性状中的三种、两种或一种农艺性状的转基因种子植物的步骤；

所述GmDREB2AL是如下a）或b）的蛋白质：

a）氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；

b）将SEQ ID No.2经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基且与种子总油脂含量和/或脂肪酸含量和/或种子千粒重相关的由a）衍生的蛋白质；

所述三种农艺性状为1）-3）：

1）种子中总油脂含量高于所述受体种子植物；

2）种子千粒重高于所述受体种子植物；

3）种子中脂肪酸含量高于所述受体种子植物；

所述脂肪酸为棕榈酸、亚油酸和油酸中的三种、两种或一种。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述种子植物为被子植物；进一步，所述被子植物为双子叶植物。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述受体种子植物为十字花科植物，所述转基因种子植物除具有所述三种农艺性状外，还具有角果长度大于所述受体种子植物的农艺性状。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述GmDREB2AL基因为1）-3）中任一种DNA分子：

1）其编码序列是SEQ ID No.1的DNA分子；

2）在严格条件下与1）限定的DNA分子杂交且编码所述GmDREB2AL的DNA分子；

3）与1）限定的DNA分子至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码所述GmDREB2AL的DNA分子。

5.根据权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述GmDREB2AL基因通过含有GmDREB2AL基因表达盒的重组表达载体导入所述受体种子植物中，所述GmDREB2AL基因表达盒中，启动GmDREB2AL基因转录的启动子是花椰菜花叶病毒35S启动子，终止所述GmDREB2AL基因转录的终止子是农杆菌胭脂碱合成酶终止子。

6.GmDREB2AL相关生物材料在调控四种性状中四种、三种、两种或一种性状中的应用；所述四种性状为A）-D）：

A）种子植物的种子中总油脂含量；

B）种子植物的种子千粒重；

C）种子植物的种子中脂肪酸含量；

D）十字花科植物角果形态；

所述脂肪酸为棕榈酸、油酸、亚油酸、硬脂酸和花生四烯酸中五种、四种、三种、两种或一种；

所述GmDREB2AL相关生物材料为B1）-B6）中至少一种：

B1）GmDREB2AL；

所述GmDREB2AL是如下a）或b）的蛋白质：

a）氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；

b）将SEQ ID No.2经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基且与总油脂含量和/或脂肪酸含量相关的由a）衍生的蛋白质；

B2）编码所述GmDREB2AL的核酸分子；

B3）含有B2）所述核酸分子的表达盒；

B4）含有B2）所述核酸分子的重组载体、或含有B3）所述表达盒的重组载体；

B5）含有B2）所述核酸分子的重组微生物、或含有B3）所述表达盒的重组微生物、或含有B4）所述重组载体的重组微生物；

B6）含有B2）所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B3）所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B4）所述重组载体的转基因植物细胞系。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述角果形态为角果长度。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述受体种子植物为被子植物；进一步，所述被子植物为双子叶植物。

9.根据权利要求6-8中任一所述的应用，其特征在于：编码所述GmDREB2AL的核酸分子为1）-3）中任一种DNA分子：

1）其编码序列是SEQ ID No.1的DNA分子；

2）在严格条件下与1）限定的DNA分子杂交且编码所述GmDREB2AL的DNA分子；

3）与1）限定的DNA分子至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码所述GmDREB2AL的DNA分子。

10.B2）-B6）中任一种所示的GmDREB2AL相关生物材料：

B2）编码GmDREB2AL的核酸分子；

所述GmDREB2AL是如下a）或b）的蛋白质：

a）氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；

b）将SEQ ID No.2经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基且与总油脂含量和/或脂肪酸含量相关的由a）衍生的蛋白质；

B3）含有B2）所述核酸分子的表达盒；

B4）含有B2）所述核酸分子的重组载体、或含有B3）所述表达盒的重组载体；

B5）含有B2）所述核酸分子的重组微生物、或含有B3）所述表达盒的重组微生物、或含有B4）所述重组载体的重组微生物；

B6）含有B2）所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B3）所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B4）所述重组载体的转基因植物细胞系。