CN113061613A

CN113061613A - CbDREB2AL基因在制备耐盐转基因植物中的应用

Info

Publication number: CN113061613A
Application number: CN201911405345.4A
Authority: CN
Inventors: 岳修乐; 安黎哲; 张国艳; 赵智星
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2019-12-30
Publication date: 2021-07-02

Abstract

本发明提供了一种CbDREB2AL基因的新应用，该基因可应用到耐盐转基因作物育种中以提高其耐盐性，具有广阔的应用前景。

Description

CbDREB2AL基因在制备耐盐转基因植物中的应用

技术领域：

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种高山离子芥CbDREB2AL基因在制备耐盐转基因植物中的应用。

背景技术：

盐胁迫是重要的非生物胁迫之一，高盐会直接或间接的在分子和生理水平上影响作物的生长发育，最终影响作物的产量(Abogadallah 2014)。盐胁迫也是现代农业的主要威胁，据统计受盐胁迫影响的土地面积在日益增加(Wang,Vinocur et al.2003)。随着人口的增加以及土地资源的减少，人们越来越重视对盐碱地的开发和利用(Chang,Yang etal.2014)。在盐胁迫条件下，有些植物可以通过调控细胞内相关基因的表达，重新形成离子和渗透平衡，以减少或避免受到的损害，使植物能够在高盐胁迫下恢复生长(Liu,Liu etal.2014)。筛选此类耐盐的基因用于对作物的耐盐性改良，是一项非常迫切也同时具有重要应用价值的工作。

高山离子芥(Chorispora bungeana)是十字花科离子芥属多年生草本植物，分布在高海拔亚高山草甸和砾石质山坡上，寒冷、干旱、强辐射的环境使其进化出了优秀的抗逆机制，具有丰富的抗逆基因资源。

发明人在前期研究中发现了高山离子芥CbDREB2AL基因，该基因编码高山离子芥(Chorispora bungeana，又名Chorispora exscapa)CbDREB2AL蛋白。该基因编码的蛋白与山萮菜(Es)、天蓝遏蓝菜(Nc)、琴叶拟南芥(Al)、拟南芥(At)以及花生(Ah)的同源基因有较近的亲缘关系。该基因具有耐旱和抗冻的特性，并因此获得了授权专利号为“CN108018291B”和“CN108018293B”的中国发明专利，在后续研究中，发明人又意外的发现了该基因具有耐盐特性，发明人通过检索并未发现CbDREB2AL基因还未被用于制备具有耐盐特性的转基因植株。

本发明公开了CbDREB2AL基因的新用途，该基因可应用到转基因作物育种中以提高植物的耐盐性，具有广阔的应用前景。

发明内容：

本发明目的是提供了一种CbDREB2AL基因用于制备具有耐盐特性转基因双子叶植物的用途，所述CbDREB2AL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

所述双子叶植物优选拟南芥。

所述CbDREB2AL基因通过质粒转化方式制备具有耐盐特性转基因双子叶植物，该过程包括以下步骤：(1)表达载体的构建；(2)农杆菌介导的转化；(3)转基因株系的筛选。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本领域技术人员可用现有的植物表达载体构建含有CbDREB2AL基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如PMDC32、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300或其它衍生植物表达载体。携带有本发明编码基因CbDREB2AL的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。被转化的宿主植物可以是拟南芥等双子叶植物。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GFP基因、GUS基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

本发明所提供的转基因植物的方法，是将CbDREB2AL基因转化导入植物中，得到具有耐盐特性的转基因植物。

本发明将CbDREB2AL基因的cDNA构建在CaMV35s启动子下游，得到表达载体(其图谱如图2所示)，利用电击转化的方法即得到含有该表达载体的农杆菌菌株，利用侵花发转染野生型拟南芥得到过表达的转基因植株。所述植物可为双子叶植物，如烟草。

本发明验证了转基因植株具有耐盐特性，结果显示(图3，图4)，CbDREB2AL基因的过表达可以显著增强拟南芥的耐盐特性，使高盐处理之后的存活率提高了40％左右。这对于培养优良的作物品种特别是耐盐作物品种具有重要的理论及实践意义。

附图说明：

图1高山离子芥CbDREB2AL蛋白的氨基酸序列在NCBI同源性比对，利用MEGA软件分析的进化关系。

图2构建的过表达载体图谱，PMDC32-CbDREB2AL。

图3对照(野生型WT)和转基因植株(#2，#4)耐盐性表型比较。

图4对照(野生型WT)和转基因植株(#2，#4)在300mM NaCl盐胁迫处理后的存活率比较。误差线表示SD(n>30)，**P<0.01,***P<0.001基于t检验。

具体实施方式：

下面结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。

在本发明的下述实施例中，所用的实验材料为高山离子芥(Chrispora bungeana)(西部地区特色植物种质资源库平台)和拟南芥(Arabidopsis thaliana，Col-0)(美国拟南芥生物资源中心)，农杆菌GV3101(普如汀生物技术有限公司),质粒PMDC32(美国拟南芥生物资源中心)。

实施例1

高山离子芥编码基因CbDREB2AL序列的克隆：

利用RNA提取分离试剂(Trizol，Invitrogen)分离高山离子芥再生苗总RNA，其具体方法是：收集高山离子芥再生苗100mg，立即置于液氮中研磨成粉末，之后加入1mlTrizol试剂，充分混匀，吸入到一个1.5ml的离心管中；室温放置5min；加入0.2ml新鲜氯仿，剧烈振摇15s，室温静置3min；4℃，12000g离心15min；上清转移到一个新的1.5ml离心管中，加入0.5ml异丙醇混匀，4℃，12000g离心10min沉淀RNA；RNA沉淀用1ml 75％乙醇洗涤后溶于适量DEPC处理过的水中，-70℃保存备用。

根据快速末端扩增技术(RACE)获取该基因全长序列，然后利用生物信息学技术，设计以下引物：

5’端引物：

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGCAGTATACGATCAGAGTGGAG，(其中划线序列为Invitrogen Gateway系统attB1序列)；

3’端引物：

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCACTTCTCCAGATCCAAGAAACTCAAG，(其中划线序列Invitrogen Gateway系统attB2序列)。

通过RT-PCR扩增得到CbDREB2AL的cDNA序列，具体方法是：依据Plant RT-PCR Kit2.01(TaKaRa,Japan)的用户手册进行。1-2μg总RNA(大约1-2μl)和Kit的各种反转录试剂混合(MgCl₂4μl；10×RNA PCR Buffer 2μl；RNase Inhibitor 0.5μl；RNase free Water 8.5μl；dNTP Mixture 2μl；Reverse Transcriptase 1μl；Oligo dT-Adaptor 1μl)。混匀后，42℃ 30min；99℃ 5min；5℃ 5min，完成反转录反应。吸取2μl反转录产物，作为模板进行PCR反应：94℃ 2min后进入扩增程序：94℃ 30s、56℃ 30s、72℃ 50s,30个循环后，72℃ 5min。扩增得到的SEQ ID NO：1序列总长1005个碱基(含终止密码子)，编码334个氨基酸,根据the1997IUPAC standard atomic weights,assuming pH＝7.0计算分子量为37.294kD,根据ExPASy's Compute pI/Mw program计算等电点为4.954。

本发明中CbDREB2AL基因编码的蛋白与双子叶植物与山萮菜(Es)、天蓝遏蓝菜(Nc)、琴叶拟南芥(Al)、拟南芥(At)以及花生(Ah)的同源基因有较近的亲缘关系

实施例2

转CbDREB2AL基因植株的获得及耐盐特性的测定

高山离子芥CbDREB2AL基因植物过表达载体的构建：利用Invitrogen公司Gateway技术将测序验证过的实施例1得到的片段通过BP反应(BP

II Enzyme mix，Invitrogen No.11789020)重组到pDONR/Zeocin载体(Invitrogen No.12535-035)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经20mg/L的Zeocin筛选获得入门克隆，之后提取质粒再通过Gateway技术中的LR反应(LR

II Enzyme mix，Invitrogen No.11791100)将CbDREB2AL基因重组到PMDC32载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经50mg/L卡那霉素筛选得成功重组的过表达载体PMDC32-CbDREB2AL(如图3)。

农杆菌介导的转化：将构建好的过表达质粒通过电击的方式(电压2400V，电容25μF，阻抗200Ω，电击杯1mm)转化农杆菌GV3101，用10mg/l利福平+50mg/l卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆。将阳性克隆接种到YEP液体培养基中(含抗生素：链霉素25mg/l、利福平50mg/l、卡那霉素50mg/l)于恒温摇床上28℃，180rpm摇培至OD₆₀₀＝0.6-0.8，离心后用侵染培养基(1/2MS，5％sucrose，0.01％silwet L-77，pH5.7)重悬OD₆₀₀＝0.8-1。将拟南芥倒置使花苞侵没在溶液里30-60秒，用保鲜膜将侵染之后的拟南芥地上部分包裹，黑暗培养两天之后去掉保鲜膜，并用清水轻柔冲洗侵染部分，正常条件(25℃，16小时光照、8小时黑暗)继续培养直至收获种子。

转基因株系的筛选：将转基因拟南芥收获的种子，经表面消毒后，种在含有50mg/l潮霉素的MS平板上进一步筛选，经过传代，半定量PCR验证，最后得到纯合的CbDREB2AL过表达的拟南芥T2代转基因株系。

转基因CbDREB2AL拟南芥株系的耐盐性测定：对在土壤中生长的四周大的野生型和转基因拟南芥，开始浇灌300mM NaCl的盐水，持续处理14-16天，统计存活率，结果显示盐处理后野生型拟南芥存活率仅有约30％，但CbDREB2AL转基因植株存活率高达70-80％。

序列表

<110> 兰州大学

<120> CbDREB2AL基因在制备耐盐转基因植物中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1005

<212> DNA

<213> 高山离子芥(Chorispora bungeana)

<400> 1

atggcagtat acgatcagag tggagaagtc aatagaaccc aactcgatac atcgaggaaa 60

aggaaatcta gaagtagagg tgatggtaca acagtggcag agaggttaaa gagatggaaa 120

gagtacaatg cgactgtaga agaagcatca gccacaaaga aaaggaaagt acctgcaaaa 180

gggtctaaga aaggttgtat gaaaggcaaa ggaggaccag agaatggtcg ttgtagtttc 240

agaggagtta gacaaaggat ttggggtaaa tgggttgctg agattagaga gcctaataga 300

ggaagtagac tttggctcgg cactttccca acagctgaag cagctgcctc tgcttatgat 360

gaggctgcta aagccatgta tggtcctttg gctcgtctta atttccctca atccgctgct 420

tctgatgtca cgagtacttc tagtcagtct gaggtgtgta cggctgagac ttatcctggt 480

ggtggtgttc atgtgaaaac agaggatgca gattgcgaat ccaaaccatc tgttatgtat 540

catcaggaga acggtgtaaa tgctgaagag acgatgaagg atgttaagaa agatgattgg 600

ctgagcgagt tcgagcagaa gtattggagt ggagttgtga aggagaaaga gaaacagaag 660

aaggagattg atgaaacttg tcatcagcaa caacagcaac aacaacaaca acaagagcaa 720

gtagattcgc tttctgtttc ggattacggt tggccttgtg atgtggatca ggctcaatgg 780

gactcgtctg agatgtttga tgttaatgag cttctaggag acatcaatgg cgacattttc 840

acaggtttga accaggatca atactcaggg aacaatgttg gattatccga ggcagagaag 900

cagcaaagcg ggtactatgc tctagactct ggttatggat tgcctccact tcaaatcgaa 960

gcgccggatg gtttcgactt gagtttcttg gatctggaga agtga 1005

<210> 2

<211> 334

<212> PRT

<213> 高山离子芥(Chorispora bungeana)

<400> 2

Met Ala Val Tyr Asp Gln Ser Gly Glu Val Asn Arg Thr Gln Leu Asp

1 5 10 15

Thr Ser Arg Lys Arg Lys Ser Arg Ser Arg Gly Asp Gly Thr Thr Val

20 25 30

Ala Glu Arg Leu Lys Arg Trp Lys Glu Tyr Asn Ala Thr Val Glu Glu

35 40 45

Ala Ser Ala Thr Lys Lys Arg Lys Val Pro Ala Lys Gly Ser Lys Lys

50 55 60

Gly Cys Met Lys Gly Lys Gly Gly Pro Glu Asn Gly Arg Cys Ser Phe

65 70 75 80

Arg Gly Val Arg Gln Arg Ile Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg

85 90 95

Glu Pro Asn Arg Gly Ser Arg Leu Trp Leu Gly Thr Phe Pro Thr Ala

100 105 110

Glu Ala Ala Ala Ser Ala Tyr Asp Glu Ala Ala Lys Ala Met Tyr Gly

115 120 125

Pro Leu Ala Arg Leu Asn Phe Pro Gln Ser Ala Ala Ser Asp Val Thr

130 135 140

Ser Thr Ser Ser Gln Ser Glu Val Cys Thr Ala Glu Thr Tyr Pro Gly

145 150 155 160

Gly Gly Val His Val Lys Thr Glu Asp Ala Asp Cys Glu Ser Lys Pro

165 170 175

Ser Val Met Tyr His Gln Glu Asn Gly Val Asn Ala Glu Glu Thr Met

180 185 190

Lys Asp Val Lys Lys Asp Asp Trp Leu Ser Glu Phe Glu Gln Lys Tyr

195 200 205

Trp Ser Gly Val Val Lys Glu Lys Glu Lys Gln Lys Lys Glu Ile Asp

210 215 220

Glu Thr Cys His Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Glu Gln

225 230 235 240

Val Asp Ser Leu Ser Val Ser Asp Tyr Gly Trp Pro Cys Asp Val Asp

245 250 255

Gln Ala Gln Trp Asp Ser Ser Glu Met Phe Asp Val Asn Glu Leu Leu

260 265 270

Gly Asp Ile Asn Gly Asp Ile Phe Thr Gly Leu Asn Gln Asp Gln Tyr

275 280 285

Ser Gly Asn Asn Val Gly Leu Ser Glu Ala Glu Lys Gln Gln Ser Gly

290 295 300

Tyr Tyr Ala Leu Asp Ser Gly Tyr Gly Leu Pro Pro Leu Gln Ile Glu

305 310 315 320

Ala Pro Asp Gly Phe Asp Leu Ser Phe Leu Asp Leu Glu Lys

325 330

Claims

1.CbDREB2AL基因用于制备具有耐盐特性转基因双子叶植物的用途，所述CbDREB2AL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的CbDREB2AL基因用于制备具有耐盐特性转基因双子叶植物的用途，其特征在于所述双子叶植物为拟南芥。

3.如权利要求1所述的CbDREB2AL基因用于制备具有耐盐特性转基因双子叶植物的用途，其特征在于所述CbDREB2AL基因通过质粒转化方式制备具有耐盐特性转基因双子叶植物，该过程包括以下步骤：(1)表达载体的构建；(2)农杆菌介导的转化；(3)转基因株系的筛选。