CN109913467B - 一种抗冻基因crnp1在制备抗冻转基因植物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗冻基因CRNP1、由抗冻基因CRNP1编码的CRNP1蛋白、含有所述抗冻基因CRNP1的转基因植物的制备方法及其在制备抗冻转基因植物中的应用，本发明所公开的抗冻基因CRNP1能够显著增强抗冻转基因植物拟南芥的抗冻特性，使低温处理之后的拟南芥的存活率显著提高，具有重要的理论和实践意义，可以推广应用。

Description

一种抗冻基因CRNP1在制备抗冻转基因植物中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高山离子芥抗冻基因CRNP1、其编码产物CRNP1蛋白、含有抗冻基因CRNP1的植物的制备方法及其在制备抗冻转基因植物中的应用。

背景技术

低温是影响植物地理分布和生长发育的最主要的环境因素之一，低温冻害严重地影响着农作物的生长状况和产量[1,2]。大量的研究表明，冷响应基因的表达对植物的抗冻有着至关重要的作用[3-5]。冷响应基因编码种类繁多的蛋白，如植物呼吸、碳循环、脂类、苯丙素和抗氧化代谢过程相关的酶，调控基因表达的转录因子，以及抗冻蛋白等[6-8]。

高山离子芥(Chorispora bungeana，又名Chorispora exscapa)是十字花科离子芥属多年生草本植物，分布在高海拔亚高山草甸和砾石质山坡上，该地区的环境特点是气候寒冷、干旱、强辐射。在我国主要分布于乌鲁木齐河源区，恶劣环境使高山离子芥时常受到低温胁迫。高山离子芥为了适应低温、强紫外等不利的环境条件，进化出了优秀的逆境适应机制[9,10]。

本发明公开了一种冷响应基因CRNP1(Cold Responsive Novel Protein 1)，该基因编码高山离子芥一个新的受低温诱导而产生的蛋白CRNP1。该基因编码的蛋白与芜菁(Brassica rapa)、高山南芥(Arabis alpina)、欧洲油菜(Brassica napus)、荠菜(Capsella rubella)以及拟南芥(Arabidopsis thaliana)的同源基因有较近的亲缘关系，这些同源基因的功能目前仍不清楚。本发明公开的CRNP1基因可应用到转基因作物育种中以提高其抗冻性，具有广阔的应用前景。

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发明内容

本发明的目的是提供一种抗冻基因CRNP1及其编码蛋白CRNP1。

本发明的另一个目的在于提供一种培育抗冻转基因植物的方法，具体是将所述的编码基因转入植物中，得到具有抗冻特性的转基因植物。

本发明的又一个目的在于提供一种所述抗冻基因CRNP1用于转化植物以产生抗冻转基因植物的用途。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种抗冻基因CRNP1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

一种由所述的抗冻基因CRNP1编码的蛋白质CRNP1，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

含有本发明基因的表达载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

一种培育含有抗冻基因CRNP1的抗冻转基因植物的方法，是将所述的编码基因转入植物中，得到具有抗冻特性的转基因植物，具体包括以下步骤：①含有所述的抗冻基因CRNP1的表达载体的构建；②表达载体转化；③转基因株系的筛选。

步骤①可用现有的植物表达载体构建含有CRNP1基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如PMDC32、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300或其它衍生植物表达载体。

步骤②是指携带有本发明基因CRNP1的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等方法转化到植物细胞或组织中。被转化的宿主植物可以是拟南芥、烟草等双子叶植物。

步骤③转基因株系的筛选过程中，为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GFP基因、GUS基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。

优选地，从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

本发明所提供的获得抗冻的转基因植物的方法，是将上述植物抗冻蛋白的编码基因CRNP1导入植物中，得到抗冻转基因植物。

本发明将CRNP1基因的cDNA构建在CaMV35s启动子下游，得到表达载体(其图谱如图2所示)，利用电击转化的方法即得到含有该表达载体的农杆菌菌株，利用浸花法转染野生型拟南芥得到过表达的转基因植株。

优选地，所述植物可为双子叶植物，如烟草、拟南芥等。

本发明的有益效果是：本发明通过对比试验验证了含有CRNP1基因的转基因植株具有抗冻特性，结果显示抗冻基因CRNP1的过表达可以显著增强拟南芥的抗冻特性，使低温处理之后的拟南芥的存活率显著提高。这对于培养优良的作物品种特别是抗冻作物品种具有重要的理论及实践意义。

附图说明

图1高山离子芥CRNP1蛋白的氨基酸序列经同源性比对，利用MEGA软件分析的进化关系。

图2构建的过表达载体图谱，PMDC32-CRNP1。

图3对照(野生型拟南芥Col-0)和CRNP1过表达株抗冻性表型比较。

图4对照(野生型拟南芥Col-0)和CRNP1过表达株在-4℃低温处理32小时，4℃恢复24小时，正常温度生长7天后的存活率统计，转基因植株的存活率和野生型相比差异极显著(n＝108,***P<0.001,by Student’s t-test)。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行详细的阐述，但本发明的保护范围并不限于以下实施例，任何本领域的技术人员在本发明的基础上，结合本领域公知常识所能想到的技术方案，都属于本发明的保护范围。

在本发明的下述实施例中，所用的实验材料和试剂来源入下：

①高山离子芥(Chorispora bungeana，又名Chorispora exscapa)：西部地区特色植物种质资源库平台；

②拟南芥(Arabidopsis thaliana，Col-0)：美国拟南芥生物资源中心；

③农杆菌GV3101：普如汀生物技术有限公司；

④质粒PMDC32：美国拟南芥生物资源中心；

⑤大肠杆菌DH5α感受态细胞：深圳康体生命科技有限公司；

实施例1高山离子芥抗冻蛋白编码基因CRNP1序列的克隆：

利用RNA提取分离试剂(Trizol，Invitrogen)分离高山离子芥再生苗总RNA，其具体方法是：收集高山离子芥再生苗100mg，立即置于液氮中研磨成粉末，之后加入1mlTrizol试剂，充分混匀，吸入到1.5ml的离心管中；室温放置5min；加入0.2ml新鲜氯仿，剧烈振摇15s，室温静置3min；4℃，12000g离心15min；上清转移到新的1.5ml离心管中，加入0.5ml异丙醇混匀，4℃，12000g离心10min沉淀RNA；RNA沉淀用1ml 75％乙醇洗涤后溶于适量DEPC处理过的水中，-70℃保存备用。

根据快速末端扩增技术(RACE)获取该基因全长序列，然后设计以下引物进行编码区的克隆：

5’端引物：

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGGTCTAAGAGCATTGCCCCTTC，

(其中划线序列为Invitrogen Gateway系统attB1序列)；

3’端引物：

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCTAGAGAAGAGTCTGGTGAAG，

(其中划线序列Invitrogen Gateway系统attB2序列)。

通过RT-PCR扩增得到CRNP1的cDNA序列，具体方法是：依据PrimeScript II 1stStrand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa,No.6210A)的手册进行:4μl总RNA(约3μg)和试剂盒中的部分试剂混合(Oligo dT Primer 1μl，dNTP Mixture 1μl，RNase free Water 4μl)，65℃处理5min之后立刻冰上冷却，继续加入试剂混合(5×PrimeScript II Buffer 4μl，RNase Inhibitor 0.5μl，PrimeScript II RTase 1μl，RNase free Water 4.5μl)，混匀后，42℃处理60min；95℃处理5min，完成反转录反应。

吸取2μl上述反转录产物，作为模板进行PCR反应：94℃处理2min后进入扩增程序：94℃处理30s、56℃处理30s、72℃处理60s，30个循环后，72℃处理5min。扩增得到的SEQ IDNO：1序列总长528个碱基，编码176个氨基酸，根据the 1997IUPAC standard atomicweights，assuming pH＝7.0计算分子量为20.191kDa，根据ExPASy's Compute pI/Mwprogram计算等电点为9.432。

本发明中CRNP1基因编码的蛋白与双子叶植物CRNP1基因编码的蛋白与双子叶植物芜菁(Brassica rapa)、高山南芥(Arabis alpina)、欧洲油菜(Brassica napus)、荠菜(Capsella rubella)以及拟南芥(Arabidopsis thaliana)的同源基因具有较近的亲缘关系，如图1所示。

实施例2含有抗冻基因CRNP1的转基因植株的获得及抗冻特性的测定

1.高山离子芥CRNP1基因植物过表达载体的构建：利用Invitrogen公司Gateway技术将测序验证过的实施例1得到的片段通过BP反应(BPII Enzyme mix，Invitrogen No.11789020)重组到pDONR/Zeocin载体(Invitrogen No.12535-035)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经20mg/L的Zeocin筛选获得入门克隆，之后提取质粒再通过Gateway技术中的LR反应(LR/>II Enzyme mix，Invitrogen No.11791100)将CRNP1基因重组到PMDC32载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经50mg/L卡那霉素筛选得成功重组的过表达载体PMDC32-CRNP1(如图2)。

2.农杆菌介导的转化：将构建成功的过表达质粒PMDC32-CRNP1通过电击的方式(电压2400V，电容25μF，阻抗200Ω，电击杯1mm)转化农杆菌GV3101，用10mg/L利福平+50mg/L卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆。将阳性克隆接种到YEP液体培养基中(含抗生素：链霉素25mg/L、利福平50mg/L、卡那霉素50mg/L)于恒温摇床上28℃，180rpm摇床培养至OD₆₀₀＝0.6-0.8，离心后用侵染培养基(1/2MS，5％sucrose，0.01％silwet L-77，pH5.7)重悬OD₆₀₀＝0.8-1。将拟南芥倒置使花苞浸没在侵染培养基溶液里30-60秒，用保鲜膜将侵染之后的拟南芥地上部分包裹，黑暗培养两天之后去掉保鲜膜，并用清水轻柔冲洗侵染部分，正常条件(25℃，16小时光照、8小时黑暗)继续培养直至收获种子。

3.转基因株系的筛选：将转基因拟南芥收获的种子，经表面消毒后，种在含有50mg/L潮霉素的MS平板上进一步筛选，经过传代，半定量PCR验证，最后得到纯合的CRNP1过表达的拟南芥T2代转基因株系。

4.转基因CRNP1拟南芥株系的抗冻性测定：将萌发4周的转基因拟南芥和野生型拟南芥放入低温培养箱，梯度降温，每小时降2℃，降至-4℃开始计时，处理32小时，4℃恢复24小时后正常培养，7天之后统计存活率。

结果显示CRNP1的过表达可以显著增强拟南芥的抗冻性，如图3所示，使低温处理之后的拟南芥的存活率提高了30-40％，如图4所示。

综上所述，本发明所提供的抗冻基因CRNP1及其编码的蛋白质CRNP1，能够用于转化植物以产生抗冻转基因植物，经过转化所得的转基因植物的抗冻性得到了显著的提高，具有重要的理论和实践意义，可以推广应用。

序列表

<110> 兰州大学

<120> 一种抗冻基因CRNP1在制备抗冻转基因植物中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 528

<212> DNA

<213> 高山离子芥(Chorispora bungeana)

<400> 1

atgggtctaa gagcattgcc ccttcaacac aacaatgggt ttatcaccag gaccaaagtt 60

ccgatctcaa gaacttcgcc gagaattaac cggaacccta gatgggtcgt cgtgacggcg 120

aagcaagaga aagacgagga gaagaagaag aacaaggaag atgagacttc gttgttcact 180

caactaacgg atgcgttgga tttcgcacaa gtccggtcgg agaaagacgc cgagcttctc 240

tacgaggccc gtgaagccac caaaaccggt ggcaagatga gcaaagaaca gtatggggca 300

ttgaggagaa aaatcggagg tacatacaag gactttttta aatcctacgt tgaagtggat 360

ggggaatatg tggaggaagg atgggtggac aaaacatgta agatatgcaa aaaggataca 420

aagggtgagg caagacaagt ggacaagtta gggagatatg ctcatgtctc ttgtcttcaa 480

aatccaccct cttcttctgg aaatttcttc accagactct tctctaga 528

<210> 2

<211> 176

<212> PRT

<213> 高山离子芥(Chorispora bungeana)

<400> 2

Met Gly Leu Ala Ala Leu Pro Leu Gly His Ala Ala Gly Pro Ile Thr

1 5 10 15

Ala Thr Leu Val Pro Ile Ser Ala Thr Ser Pro Ala Ile Ala Ala Ala

20 25 30

Pro Ala Thr Val Val Val Thr Ala Leu Gly Gly Leu Ala Gly Gly Leu

35 40 45

Leu Leu Ala Leu Gly Ala Gly Thr Ser Leu Pro Thr Gly Leu Thr Ala

50 55 60

Ala Leu Ala Pro Ala Gly Val Ala Ser Gly Leu Ala Ala Gly Leu Leu

65 70 75 80

Thr Gly Ala Ala Gly Ala Thr Leu Thr Gly Gly Leu Met Ser Leu Gly

85 90 95

Gly Thr Gly Ala Leu Ala Ala Leu Ile Gly Gly Thr Thr Leu Ala Pro

100 105 110

Pro Leu Ser Thr Val Gly Val Ala Gly Gly Thr Val Gly Gly Gly Thr

115 120 125

Val Ala Leu Thr Cys Leu Ile Cys Leu Leu Ala Thr Leu Gly Gly Ala

130 135 140

Ala Gly Val Ala Leu Leu Gly Ala Thr Ala His Val Ser Cys Leu Gly

145 150 155 160

Ala Pro Pro Ser Ser Ser Gly Ala Pro Pro Thr Ala Leu Pro Ser Ala

165 170 175

Claims (9)

1.一种抗冻基因CRNP1，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种含有如权利要求1所述的抗冻基因CRNP1的表达载体。

3.一种含有如权利要求1所述的抗冻基因CRNP1的细胞系。

4.一种含有如权利要求1所述的抗冻基因CRNP1的宿主菌。

5.一种含有如权利要求1所述的抗冻基因CRNP1的转基因植物的制备方法，其特征在于，所述的方法包含以下步骤：①含有如权利要求1所述的抗冻基因CRNP1的表达载体的构建；②表达载体转化；③转基因株系的筛选。

6.根据权利要求5所述的转基因植物的制备方法，其特征在于，所述步骤①中的表达载体为双元农杆菌载体和用于植物微弹轰击的载体，具体包括PMDC32、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300。

7.根据权利要求5所述的转基因植物的制备方法，其特征在于，所述步骤②中表达载体转化是指表达载体通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导或农杆菌介导方法进行转化。

8.根据权利要求5所述的转基因植物的制备方法，其特征在于，所述步骤③中转基因株系的筛选是通过在植物中加入表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因或具有抗性的抗生素标记物或抗化学试剂标记基因，对表达载体进行标记，根据标记物进行筛选；或直接以逆境筛选转化植株，所述的植株为拟南芥。

9.如权利要求1所述的抗冻基因CRNP1用于转化植物以产生抗冻转基因植物的用途，其特征在于，所述的植物为拟南芥。