TW201722264A - 具有增厚的糊粉層的水稻穀粒 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及具有增厚的糊粉層的水稻穀粒。還提供的是包含至少一個遺傳變異的水稻植物，所述遺傳變異降低植物中至少一個ROS1a基因的表現。本發明的穀粒，或來自其的糊粉層，具有改良的營養特性，並因此特別可用於人或動物食物產品。

Description

具有增厚的糊粉層的水稻穀粒
本發明涉及具有增厚的糊粉層(aleurone)的水稻穀粒(grain)。還提供的是包含至少一個導入的遺傳變異的水稻植物，所述遺傳變異降低所述植物中至少一個ROS1a基因的活性。本發明的穀粒，或其中的糊粉層，具有改善的營養特性，且因此對於人或動物飼料產品特別有用。
世界性的穀物穀粒例如小麥、水稻、玉米以及較小範圍的大麥、燕麥和黑麥是人類從所述穀粒的澱粉含量中攝取熱量的主要來源。穀物穀粒對於提供其它營養成分例如蛋白質、維生素、礦物質和膳食纖維也是重要的。穀粒的不同部分對於這些營養成分的貢獻不同。澱粉儲存於穀物穀粒的澱粉質胚乳中，而其它營養成分更集中於胚和麩皮(Buri et al.,2004)。然而，在用於食物前，麩皮經常被去除，尤其是在水稻中，其然後作為白米食用。
穀物穀粒發育自母本和父本配子體之間的雙受精事件。來自花粉管的兩個精細胞之一和卵融合產生發育成胚的合子，而另一精細胞和雌配子體的二倍體中央細胞融合產生初生胚乳核，其發育成遺傳學三倍體的胚乳。因此，包括糊粉層的胚乳是三倍體，具有兩個複本的母本單倍體基因體和一個複本的父本單倍體基因體。在雙子葉種子中，胚乳被發育中的胚消耗，而在單子葉植物例如水稻中，胚乳保留以填充成熟穀粒的主體。
穀物的成熟胚乳具有四種特性不同的細胞類型，即澱粉質胚乳，特徵在於其澱粉粒和儲存蛋白的豐富含量；表皮樣糊粉層，其最經常是一層細胞厚，圍繞大部分的澱粉質胚乳；位於種子基部在主要母本維管結構上的轉移細胞；以及圍繞胚的一層細胞，其在穀粒發育早期形成胚的襯層而在後期將僅僅圍繞連接胚和澱粉質胚乳的胚柄(Becraft et al.,2001a)。胚在澱粉質胚乳內的腔中形成。穀物糊粉層組織因此包含穀物穀粒中胚乳的最外層，並圍繞澱粉質胚乳核部分的胚。
糊粉層細胞在它們的形態學、生物化學組成和基因表現譜上不同於澱粉質胚乳細胞(Becraft and Yi,2011)。糊粉層細胞一般富含油和蛋白質並分泌酶使得在種子萌發期間可以動員胚乳儲備。每個糊粉層細胞被包在纖維狀細胞壁內，所述纖維狀細胞壁比胚乳細胞壁厚且主要由不同比例的並且是高度自發瑩光的阿拉伯木聚糖(arabinoxylan)和β葡聚糖組成。糊粉層是穀物胚乳中唯一有時候用花青苷類著色的層。
穀物糊粉層在小麥和野生型玉米中厚僅僅一個細胞層(Buttrose 1963；Walbot,1994)，在水稻胚乳的背側區域大部分是一個但最多三個細胞層(Hoshikawa,1993)，而在野生型大麥中是三個細胞層(Jones,1969)。在正常胚乳中，糊粉層是極度規則的且細胞分裂的模式高度有組織。野生型成熟糊粉層細胞切面幾乎是立方形，具有稠密的細胞質，包括顆粒、小液泡和包涵體，所述包涵體由蛋白質、脂質和植酸鈣鎂組成或由蛋白質加碳水化合物組成。在成熟穀物穀粒中，糊粉層是唯一仍然活著的胚乳組織，儘管是處於休眠、乾燥形式。在吸脹後，胚產生赤黴素(gibberellin)，其誘導糊粉層合成澱粉酶和其它水解酶，釋放至澱粉質胚乳來降解儲存化合物以形成糖 和胺基酸，用於胚早期生長成幼苗。
穀物穀粒中糊粉層發育的調控已經由Becraft和Yi(2011)進行綜述。多水平的遺傳調控控制糊粉層細胞的命運、分化和組織，且許多基因參與這些過程，其中僅僅鑒別了所述基因中的一些。例如，玉米defective kernal1(dek1)功能缺失突變體沒有糊粉層，表明野生型Dek1多肽是外細胞層特化成糊粉層所需的(Becraft et al.,2002)。Dek1多肽是大的膜整合蛋白，具有21個跨膜結構域和一個含有活性鈣蛋白酶(calpain)的胞質結構域。玉米中的另一個基因，CRINKLY4(Cr4)編碼受體激酶，其功能是糊粉層命運的正調節物，而cr4cr4突變體具有減少的糊粉層(Becraft et al.,2001b)。
文獻已有報導在穀物穀粒突變體中增厚的糊粉層的若干例子，然而由於多效性效應或農藝和生產問題，沒有一個被證明是有用的。
Shen et al.(2003)報導鑒別玉米supernumary aleurone layers1(sal1)基因中的突變體，在不同突變體中具有2-3層或多達7層的糊粉層細胞，而不是正常的單層。SAL1多肽被鑒別為E類液泡分選蛋白。同基因型組合sal1-1突變體穀粒具有無法萌發的缺陷胚，且具有大大減少的澱粉質胚乳。對sal1-2等位基因為同基因型組合的較不完全的突變體顯示2個細胞層的糊粉層。然而，突變體植物僅僅生長至野生型的30%的高度，具有減少的根質量並且結實差(Shen et al.2003)。這些植物在農藝上無用。
Yi et al.(2011)報導在玉米中鑒別到thick aleuronel(thk1)突變體。突變體籽粒顯示多層的糊粉層。然而，突變體籽粒缺乏良好發育的胚且在播種時不萌發。野生型Thk1基因編碼Thk1多肽，其作用於玉米種糊粉層發育所需的Dek1多肽下游(Becraft et al.,2002)。
通過其對葉形態的作用而鑒別到玉米extra cell layer(Xcl)基因突變體。其產生雙糊粉層以及多層的葉表皮(Kessler et al.,2002)。Xcl突變是半顯性突變，其在玉米中破壞細胞分裂和分化模式，產生厚及窄的具有不正常的帶光澤外觀的葉片。
Disorgal1和disorgal2(dil1和dil2)基因的玉米突變體顯示糊粉層具有可變的層數，細胞具有不規則形狀和大小(Lid et al.,2004)。然而，同基因型組合的dil1和dil2突變體穀粒由於減少的澱粉累積是皺縮的，且成熟的突變體穀粒萌發率低且不發育成能存活的植物。
在大麥中，elo2突變體類似地顯示無組織的細胞和糊粉層的不規則，其由異常的平周細胞分裂造成(Lewis et al.,2009)。所述植物還顯示葉表皮增加的細胞層，在表皮上具有突起和扭曲的細胞。重要的是，同基因型組合的突變體植物是矮化的，產生的穀粒重比野生型低60%，對於穀粒生產無用。
在水稻中，控制種子貯藏蛋白表現的兩種轉錄因子也影響糊粉層細胞命運(Kawakatsu et al.,2009)。通過編碼水稻醇溶蛋白盒結合因子(RPBF)多肽(其是DOF鋅指轉錄因子類)的基因的共抑制構築體降低表現導致散發的多層糊粉層，其由大的、無序的細胞組成。種子貯藏蛋白表現和累積也有顯著減少，並且澱粉和脂質以實質降低的水平累積。玉米Dek1、CR4和SAL1基因的水稻同源物的表現也被降低，顯示RPBF和RISBZ1因子與那些基因在相同的調控途徑運作。
DNA的甲基化
在植物科學的一個完全不同方面，現在概述DNA的甲基化。植物對核DNA中一些胞嘧啶核苷酸在嘧啶環的5位碳甲基化，形成5-甲基胞嘧啶(5-meC)。甲基化的胞嘧啶可以在三種上下文中的任一種中發生，即CG、CHG(其中H=A、C或T)和CHH甲基化，各自由不同的甲基轉移酶催化。至少在阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)以及可能在大多數植物包括水稻中(Zemach et al.,2010)，CG甲基化是由甲基轉移酶1(Met1)家族催化，CHG甲基化是由Chromomethylase家族中的甲基化酶催化，且CHH甲基化通過Domains Rear-ranged Methylases(DRM)使用小RNA作為嚮導序列催化的RNA介導的反應發生(Law and Jacobsen,2010)。胞嘧啶甲基化，其僅僅在全部胞嘧啶的一小部分發生，最經常發生於異染色質DNA和富含重複DNA和轉位子的區域，抑制它們的活性。其也發生於核DNA的轉錄區域，包括在基因的啟動子區域，並因此參與控制許多基因的表現。
DNA的胞嘧啶甲基化通過去甲基化是可逆的，其可以通過DNA複製被動地發生或者通過去甲基化酶的活性主動地發生。植物中DNA主動去甲基化的一個途徑是通過鹼基切除修復(BER)途徑，其使用DNA糖基化酶(glycosylase)。這些酶從雙鏈DNA主鏈去除5-meC，然後在無鹼基位點通過β-和δ消除反應切割DNA主鏈(裂解酶活性)。通過DNA聚合酶活性插入未甲基化胞嘧啶核苷酸完成修復。
在擬南芥基因體中有4種5-meC DNA糖基化酶/裂解酶，稱為Demeter(DME)、Demeter-like 2(DML2)、Demeter-like 3(DML3)和Repressor of Silencing(ROS1)。遺傳學和生物化學分析顯示全部四種功能都是DNA去甲基化酶(Gong et al.,2002；Agius et al.,2006；Morales-Ruiz et al.,2006)，DME主要在卵 細胞和胚乳起作用而其它在其它組織起作用。其它植物類似地顯示去甲基化酶的多樣性(Zemach et al.,2010)。
存在對具有增厚的糊粉層的水稻穀粒的需要，所述穀粒來自表型正常及農藝學有用的植物特別是水稻植物。
在一方面，本發明提供水稻植物的穀粒，所述穀粒包含糊粉層、澱粉質胚乳、編碼ROS1a多肽的ROS1a基因和(i)一或多個遺傳變異，與相應野生型水稻植物相比，其各自降低所述植物中至少一個ROS1a基因的活性，和/或(ii)相比於來自相應野生型穀粒的糊粉層，所述糊粉層是增厚的。
在一實施方式中，所述ROS1a多肽具有DNA糖基化酶活性。在一實施方式中，述ROS1a多肽具有相應野生型ROS1a多肽和/或具有SEQ ID NO：2所示胺基酸序列的ROS1a多肽的DNA糖基化酶活性水平的2%至約60%的DNA糖基化酶活性水平。
在另一實施方式中，所述ROS1a多肽是相應野生型ROS1a多肽的變體，它們的胺基酸序列是不同的。在一較佳實施方式中，所述水稻穀粒包含ROS1a(Ta2)變體多肽，其具有SEQ ID NO：1提供的胺基酸序列，所述多肽是野生型ROS1a多肽的變體，所述野生型ROS1a多肽的胺基酸序列提供於SEQ ID NO：2。
在一實施方式中，與相應野生型穀粒中的ROS1a多肽水平相比，所述穀粒中具有2%至約60%的ROS1a多肽水平。
在一實施方式中，所述增厚的糊粉層包含至少2層、至少3層、至少4層、或至少5層細胞，約3層、約4層、約5層或約6層細胞， 或2-8層、2-7層、2-6層或2-5層細胞。在一實施方式中，所述穀粒來自水稻且所述增厚的糊粉層包含5-8、5-7、5-6或2-5層細胞。在一實施方式中，與野生型水稻穀粒的糊粉層相比，所述糊粉層厚度增加大約100%，或大約150%或大約200，或大約250%。
所述遺傳變異，較佳導入的遺傳變異，其降低所述植物中至少一個ROS1a基因的活性，可以是降低或破壞水稻穀粒中野生型水平的ROS1a多肽產生的任何遺傳操作。例示性的此類遺傳變異包括，但不必限於，(a)編碼與野生型ROS1a多肽(SEQ ID NO：2)相比具有降低的DNA糖基化酶活性的突變體ROS1a多肽的ROS1a基因；(b)ROS1a基因，其表現時產生降低水平的野生型ROS1a多肽，例如其包含剪接位點突變，所述剪接位點突變導致相對於cDNA序列提供於SEQ ID NO：8的野生型ROS1a基因，所述ROS1a基因降低水平的表現，或者所述ROS1a基因在其啟動子包含突變，導致所述ROS1a基因相對於野生型ROS1a基因降低的表現；(c)外源核酸構築體，其編碼降低所述水稻植物中ROS1a基因表現的多核苷酸，其中所述核酸構築體包含編碼可操作地連接於啟動子的所述多核苷酸的DNA區域，所述啟動子至少在開花至開花後7天的時間之間的時間點在所述水稻植物的發育中的穀粒中表現，和(d)ROS1a基因，其在蛋白編碼區包含早熟轉譯終止密碼子，使得所述基因編碼，但可能產生或可能不產生，相對於野生型ROS1a多肽截短的多肽。
在一較佳實施方式中，所述水稻穀粒包含(i)糊粉層，(ii)澱粉質胚乳，(iii) 包含遺傳變異的ROS1a基因，相對於野生型ROS1基因，所述遺傳變異在水稻植物中降低所述ROS1基因的活性，其中所述包含遺傳變異的ROS1a基因編碼相對於SEQ ID No：2的變體ROS1a多肽，且其中所述糊粉層相對於來自相應野生型水稻穀粒的糊粉層是增厚的。在一實施方式中，所述ROS1a基因中的遺傳變異是導入的遺傳變異。在一較佳實施方式中，所述變體ROS1a多肽與SEQ ID NO：2提供的序列在胺基酸序列上的不同至少在於一個或多個胺基酸的插入或缺失或相對於SEQ ID NO：2的胺基酸取代。在一甚至更佳的實施方式中，所述變體ROS1a多肽與SEQ ID NO：2提供的序列在胺基酸序列上的不同至少在於一個或多個胺基酸的插入或在於相對於SEQ ID NO：2的單胺基酸取代，例如，表3中所列的胺基酸取代之一。所述水稻穀粒可以被處理使得其不再能夠萌發，例如，其被煮過，或者其可以不處理使得其能夠萌發和生長並由此提供本發明的水稻植物。在一最佳的實施方式中，所述水稻穀粒的糊粉層是著色的，例如，所述水稻穀粒是如本文所定義的黑米。
在另一較佳實施方式中，所述水稻穀粒包含(i)糊粉層，(ii)澱粉質胚乳，(iii)包含遺傳變異的ROS1a基因，相對於野生型ROS1基因，所述遺傳變異在水稻植物中降低所述ROS1基因的活性，其中所述包含遺傳變異的ROS1a基因編碼胺基酸序列與野生型ROS1a多肽例如SEQ ID No：2相同的ROS1a多肽，其中相對於野生型ROS1a基因，所述ROS1a基因在水稻植物中以降低的水平表現，其中所述糊粉層與來自相應野生型水稻穀粒的糊粉層相比是增厚的。在一實施方式中，所述ROS1a基因中的遺傳變異是導入的遺傳變異，其導致所述ROS1a基因以降低的水平表現。在一實施方式中，所述 遺傳變異選自(i)剪接位點突變，所述剪接位點突變導致相對於cDNA序列提供於SEQ ID NO：8的野生型ROS1a基因，所述ROS1a基因降低水平的表現，(ii)ROS1a基因啟動子突變，其導致所述ROS1a基因相對於野生型ROS1a基因降低的表現，和(iii)外源核酸分子，較佳地整合進所述水稻植物的核基因體中，其編碼在水稻植物中降低ROS1a基因表現的RNA多核苷酸。所述水稻穀粒可以被處理使得其不再能夠萌發，例如，其被煮過，或者其可以不處理使得其能夠萌發和生長並由此產生本發明的水稻植物。在一最佳的實施方式中，所述水稻穀粒的糊粉層是著色的，例如，所述水稻穀粒是如本文所定義的黑米。
在一實施方式中，所述水稻植物在其發育中的穀粒中具有相應的野生型發育中的穀粒中DNA糖基化酶活性水平的2%至約60%的DNA糖基化酶活性水平。在一較佳實施方式中，所述水稻植物在其發育中的穀粒中具有相應的野生型發育中的穀粒中DNA糖基化酶活性水平的2%至50%，或2%至40%，或2%至30%，或2%至20%的DNA糖基化酶活性水平。
在一實施方式中，所述水稻植物中的至少一個ROS1a基因的活性在發育中的穀粒的糊粉層、果皮、珠心突起、子房、種皮和澱粉質胚乳中的一或多種或全部被降低。
在一實施方式中，ROS1a基因的活性至少在開花至開花後7天的時間之間的時間點和/或在開花前的卵細胞中被降低。在一實施方式中，所述外源核酸分子可以可操作地與啟動子連接，所述啟動子至少在開花至開花後7天的時間之間的時間點表現，使得所編碼的RNA多核苷酸在該時間期間在水稻植物中降低所述ROS1a基因的表現。
在一實施方式中，所述水稻植物是雄性和雌性可孕的。
在一實施方式中，所述水稻植物顯示延遲的穀粒成熟。在一實施方式中，所述穀粒成熟相對於野生型水稻植物被延遲2-10天或2-15天。
在一實施方案中，當與相應的野生型穀粒相比時，所述穀粒包含以下的一或多種或全部，各自基於重量，i)更高的礦物質含量，較佳所述礦物質含量是鋅、鐵、鉀、鎂、磷和硫中的一或多種或全部的含量，ii)更高的抗氧化劑含量，iii)更高的植酸鹽含量，iv)維生素B3、B6和B9中的一或多種或全部的更高含量，v)更高的膳食性纖維含量和/或不溶性纖維含量，vi)相對於相應野生型穀粒的澱粉含量，以重量計約90%至約100%的澱粉含量；vii)更高的蔗糖含量，viii)更高的單糖含量，和ix)相對於相應野生型穀粒的脂質含量，至少90%或至少100%的脂質含量。在一實施方式中，所述組分的含量相對於野生型水稻穀粒中的相應含量被增加10-50%或較佳10-100%。
在一實施方式中，所述穀粒包含胚。
在一實施方式中，所述穀粒是全穀粒或破碎的穀粒。
在一實施方式中，所述穀粒被加工使得其不再能夠萌發，較佳通過熱處理加工。例如，所述穀粒被用水在100℃煮至少5分鐘。在一實施方式中， 所述穀粒是破碎的穀粒或經研磨的穀粒。
在一可選實施方式中，相對於相應野生型穀粒的萌發率，所述穀粒具有約70%-約100%的萌發率。也就是，至少100個穀粒的集合相對於野生型具有70-100%的平均萌發率。當所述穀粒萌發和並生長，就產生本發明的水稻植物。
在一實施方式中，所述穀粒包含編碼具有DNA糖基化酶活性的ROS1a多肽的ROS1a基因，較佳在所述穀粒的糊粉層、種皮和澱粉質胚乳的一或多種中，其中所述具有DNA糖基化酶活性的ROS1a多肽較佳是突變體ROS1a多肽。
在另一實施方式中，所述穀粒包含突變體ROS1a多肽，其在所述水稻植物表現時，與相應野生型ROS1a多肽相比具有降低的DNA糖基化酶活性，較佳其中所述突變體ROS1a多肽包含一或多個胺基酸取代、缺失或插入，與相應野生型ROS1a多肽相比，所述一或多個胺基酸取代、缺失或插入降低DNA糖基化酶活性。所述突變體ROS1a多肽可以沒有DNA糖基化酶活性，條件是所述穀粒包含另一具有DNA糖基化酶活性的ROS1a多肽。例如，所述ROS1a基因通過可變剪接可以編碼兩個ROS1a多肽，其中之一具有DNA糖基化酶活性而另一個沒有。在一較佳實施方式中，所述突變體ROS1a多肽相對於野生型ROS1a多肽具有七個胺基酸的插入，例如所述突變體ROS1a多肽的胺基酸序列提供於SEQ ID NO：1。
在另一實施方式中，與相應野生型穀粒相比，所述穀粒具有降低的ROS1a多肽總量，較佳在所述穀粒的糊粉層、種皮和澱粉質胚乳的一或多種中被降低，條件是所述穀粒包含編碼具有DNA糖基化酶活性的ROS1a 多肽的ROS1a基因。ROS1a多肽總量也可以在所述水稻植物的花粉中被降低。
在另一實施方式中，所述遺傳變異，較佳導入的遺傳變異是外源核酸構築體，其編碼降低所述水稻植物中ROS1a基因表現的多核苷酸，較佳地在所述水稻植物中至少在開花至開花後7天的時間之間的時間點被降低，條件是所述穀粒包含至少一個編碼具有DNA糖基化酶活性的ROS1a多肽的ROS1a基因。
在一實施方式中，所述穀粒在其外層或多個外層著色，例如所述穀粒是所述水稻植物的褐色穀粒或黑色穀粒，所述穀粒包含(i)具有至少2個細胞層或2-7個細胞層的厚度的糊粉層，和(ii)編碼包含一或多個胺基酸取代、插入或缺失的ROS1a多肽的突變體ROS1a基因，與相應野生型水稻ROS1a多肽相比，所述一或多個5胺基酸取代、插入或缺失降低DNA糖基化酶活性，所述降低的DNA糖基化酶活性在所述水稻植物中至少在開花至開花後7天的時間之間的時間點發生，條件是至少在開花至開花後7天的時間之間的時間點，與野生型水稻植物相比，所述水稻植物在發育中的穀粒中具有2%至約60%的DNA糖基化酶活性水平。
在一實施方式中，所述穀粒在其外層或多個外層著色，例如所述穀粒是水稻植物的褐色穀粒或黑色穀粒，所述穀粒包含(i)具有至少2個細胞層或2-7個細胞層的厚度的糊粉層，和(ii)編碼降低所述水稻植物中ROS1a基因表現的多核苷酸的外源核酸構築體，其中所述外源核酸構築體包含編碼可操作地連接於啟動子的所述多核苷酸的DNA區域，所述啟動子至少在開花至開花後7天的時間之間的時間點在所述水稻植物的發育中的穀 粒中表現，使得至少在開花至開花後7天的時間之間的時間點，與野生型水稻植物相比，所述水稻植物在發育中的穀粒中具有2%至約60%的DNA糖基化酶活性水平。在一較佳實施方式中，所述啟動子是除組成型啟動子之外的啟動子，例如，在發育中的種子的胚乳中表現的啟動子。在一最佳的實施方式中，所述啟動子是LTP啟動子。
在另一實施方式中，所述ROS1a多肽包含與SEQ ID NO：2具有至少95%同一性的胺基酸序列，或所述ROS1a多肽包含與SEQ ID NO：2具有至少95%同一性、至少97.5%同一性、或至少99%同一性的胺基酸序列且所述序列與相應的野生型ROS1a多肽的胺基酸序列不同。
在一實施方式中，所述ROS1a多肽以下模體(motif)中的一個或多個或全部：DHGSIDLEWLR(SEQ ID NO：44)、GLGLKSVECVRLLTLHH(SEQ ID NO：45)、AFPVDTNVGRI(SEQ ID NO：46)、VRLGWVPLQPLPESLQLHLLE(SEQ ID NO：47)、ELHYQMITFGKVFCTKSKPNCN(SEQ ID NO：48)和HFASAFASARLALP(SEQ ID NO：49)。
本發明還提供水稻穀粒的群體，所述水稻穀粒各自包含相同的遺傳變異、相同的ROS1a基因、相同的ROS1a多肽和/或具有相同的如上面實施方式所描述的特徵。也就是，所述群體在遺傳學和/或表型上是均一的。這樣的水稻穀粒的群體可以獲得自或衍生自單一祖先水稻植物或穀粒，例如，可以從祖先植物或穀粒衍生至少2代、至少3代或至少4代。
本發明人已經鑒別到具有降低的DNA糖基化酶活性的變體ROS1a多肽。因此，在另一方面，本發明提供了純化的和/或重組的ROS1a多肽，其胺基酸序列與相應的野生型ROS1a多肽的胺基酸序列不同，且當與相應 野生型ROS1a多肽相比時，其具有降低的DNA糖基化酶活性，較佳沒有DNA糖基化酶活性。
在一實施方式中，所述純化的和/或重組的ROS1a多肽包含與SEQ ID NO：2具有至少95%同一性、至少97.5%同一性、或至少99%同一性的胺基酸序列。
在另一方面，本發明提供分離的和/或外源的多核苷酸，其編碼本發明的ROS1a多肽。
在另一方面，本發明提供分離的和/或外源的多核苷酸，其當存在於水稻植物中時，降低ROS1a基因的表現。
本領域技術人員完全瞭解不同類型的能夠用於降低靶基因(target gene)表現的多核苷酸，以及如何能夠設計這些多核苷酸。實例包括但不限於，反義多核苷酸、正義多核苷酸、催化性多核苷酸、微RNA、雙鏈RNA(dsRNA)分子或其經加工的RNA產物。
在一實施方式中，所述多核苷酸是dsRNA分子或其經加工的RNA產物，其包含至少19個連續的核苷酸，其與SEQ ID NO：7或8(其中胸腺嘧啶(T)是尿嘧啶(U))的互補序列至少95%相同，或與編碼胺基酸序列提供於SEQ ID NO：1或2的多肽的mRNA的互補序列至少95%相同。
在另一實施方式中，所述dsRNA分子是微RNA(miRNA)前體和/或其中所述其經加工的RNA產物是miRNA。
在一實施方式中，所述多核苷酸用於至少在開花至開花後7天的時間之間的時間點降低水稻植物發育中的穀粒中的ROS1a基因表現。
在另一方面，本發明提供編碼本發明的多核苷酸的核酸構築體和/或載 體，其中所述核酸構築體或載體包含編碼可操作地連接於啟動子的所述多核苷酸的DNA區域，所述啟動子至少在開花至開花後7天的時間之間的時間點在水稻植物的發育中的穀粒中表現。
在另一方面，本發明提供重組細胞，其包含本發明的外源多核苷酸，或本發明的核酸構築體和/或載體。
在一實施方式中，所述細胞是水稻植物細胞例如水稻穀粒較佳水稻糊粉層的細胞。
在一實施方式中，所述外源多核苷酸、核酸構築體或載體被整合進所述細胞的基因體，較佳整合進核基因體。
還提供的是水稻植物的細胞，其包含編碼ROS1a多肽的ROS1a基因以及遺傳變異，較佳導入的遺傳變異，與相應野生型細胞相比，所述遺傳變異降低所述細胞中至少一個ROS1a基因的活性。
在一實施方式中，所述細胞是糊粉層細胞、果皮細胞、珠心突起細胞、子房細胞、種皮細胞或澱粉質胚乳細胞。
在另一方面，本發明提供水稻植物或水稻植物的群體，其產生本發明的穀粒、本發明的多肽、本發明的多核苷酸、本發明的核酸構築體和/或載體和/或其包含本發明的細胞。在一實施方式中，所述水稻植物各自還提供的是在田間生長的至少100株或至少1000株本發明的水稻植物的群體。在一較佳實施方式中，所述田間的水稻植物大部分(>50%)是，較佳全部是本發明的水稻植物。在一最佳的實施方式中，所述至少100株或至少1000株水稻植物在遺傳學上和/或表型上是相同的，例如包含相同的遺傳變異。
在另一方面，本發明提供了產生本發明的細胞的方法，所述方法包括將本發明的外源多核苷酸，或本發明的核酸構築體和/或載體導入至細胞，較佳水稻細胞的步驟。
在另一方面，本發明提供產生本發明的水稻植物或來自其的轉基因穀粒的方法，所述方法包括以下步驟i)向水稻細胞導入本發明的外源多核苷酸，或本發明的核酸構築體和/或載體，ii)從獲得自步驟i)的細胞獲得轉基因水稻植物，所述轉基因水稻植物是以所述外源多核苷酸、核酸構築體或載體或其部分轉基因的，和iii)任選地從步驟ii)的植物收穫穀粒，所述穀粒是以所述外源多核苷酸、核酸構築體或載體轉基因的，和iv)任選地從所述轉基因穀粒產生一或多代的轉基因子代植物，所述子代植物是以所述外源多核苷酸、核酸構築體或載體轉基因的，由此產生所述水稻植物或轉基因穀粒。
在另一方面，本發明提供產生本發明的水稻植物或來自其的穀粒的方法，所述方法包括以下步驟i)向水稻細胞導入內源ROS1a基因的突變，使得所述突變的ROS1a基因編碼本發明的ROS1a多肽，或不編碼ROS1a多肽，ii)從獲得自步驟i)的細胞獲得水稻植物，所述水稻植物包含所述內源ROS1a基因的突變，和iii)任選地從步驟ii)的植物收穫穀粒，所述穀粒包含所述內源ROS1a基因的突變，和 iv)任選地從所述穀粒產生一或多代的子代植物，所述子代植物包含所述內源ROS1a基因的突變，由此產生所述水稻植物或穀粒。
在一實施方式中，所述水稻植物或穀粒包含至少一個編碼具有DNA糖基化酶活性的ROS1a多肽的ROS1a基因。
在另一方面，本發明提供選擇本發明的水稻植物或水稻穀粒的方法，所述方法包括以下步驟i)針對本發明的穀粒的產生或針對ROS1a基因中突變的存在或本發明的水稻穀粒的存在，篩選水稻植物或穀粒的群體，所屬水稻植物或穀粒各自獲得自祖先水稻細胞、穀粒或植物的誘變處理，和ii)從步驟i)的群體選擇水稻植物，其產生本發明的穀粒或其包含突變體ROS1a基因，或選擇步驟i)的水稻穀粒，其是本發明的水稻穀粒，由此選擇所述水稻植物或穀粒。
所述方法還包括從所選擇的水稻植物產生一或多個子代植物或穀粒或至少兩代子代植物，和/或從子代植物收穫穀粒的步驟。較佳地，所述子代植物對所述遺傳變異是同基因型組合的。
在另一方面，本發明提供選擇本發明的水稻植物的方法，所述方法包括以下步驟i)從水稻穀粒產生一或多個子代植物，所述水稻穀粒衍生自兩種親本水稻植物的雜交，ii)針對本發明的穀粒的產生來篩選步驟i)的所述一或多個子代植物，和 iii)選擇產生所述穀粒的子代植物，由此選擇所述水稻植物。在較佳實施方式中，所述水稻穀粒是黑米穀粒。
在一實施方式中，步驟i)或ii)包含以下一或多項或全部：i)針對所述遺傳變異對包含來自子代植物的DNA的樣品進行分析，ii)分析獲得自子代植物的穀粒的糊粉層的厚度，和iii)分析所述穀粒或其部分的營養含量。
較佳地，所述遺傳變異是導入的遺傳變異。
在一實施方式中，步驟iii)包含以下一或多項或全部：i)選擇對所述遺傳變異是同基因型組合的子代植物，其中與相應野生型水稻植物相比，所述遺傳變異降低所述水稻植物中的DNA糖基化酶活性，ii)選擇子代植物，與相應野生型穀粒相比，所述子代植物的穀粒具有增加的糊粉層厚度，iii)選擇子代植物，與相應野生型穀粒或其部分相比，所述子代植物的穀粒或其部分具有改變的營養含量。
在進一步的實施方式中，所述方法還包括：i)使兩種親本水稻植物雜交，較佳其中所述親本水稻植物中的一種產生本發明的穀粒，或ii)使來自步驟i)的一或多個子代植物與基因型和不產生本發明的穀粒的第一親本水稻植物相同的植物回交足夠次數，以產生具有所述第一親本水稻植物大部分基因型但產生本發明的穀粒的植物，和 iii)選擇產生本發明的穀粒的子代植物。
還提供的是使用本發明的方法產生的水稻植物和水稻穀粒以及來自其的產品。
還提供的是本發明的外源多核苷酸或本發明的核酸構築體和/或載體用於產生重組細胞、轉基因水稻植物或轉基因穀粒的用途。
在一實施方式中，所述用途是用於產生本發明的水稻穀粒。
在另一方面，本發明提供鑒別產生本發明的穀粒的水稻植物的方法，所述方法包括以下步驟i)從水稻植物獲得核酸樣品，和ii)針對存在或不存在遺傳變異對所述樣品進行篩選，與相應野生型水稻植物相比，所述遺傳變異降低所述植物中至少一個ROS1a基因的活性。
在一實施方式中，所述遺傳變異是以下之一或兩者：a)表現多核苷酸的核酸構築體，或由其編碼的多核苷酸，其當存在於水稻植物中時降低ROS1a基因的表現，和b)基因，或由其編碼的mRNA，其表現具有降低的ROS1a多肽活性的突變體ROS1a多肽。
在一實施方式中，存在所述遺傳變異表明所述植物的穀粒與相應缺少所述遺傳變異的植物相比具有增厚的糊粉層。
在仍另一方面，本發明提供鑒別產生本發明的穀粒的水稻植物的方法，所述方法包括以下步驟i)從水稻植物獲得穀粒，和ii)針對以下一或多項篩選所述穀粒或其部分 a)增厚的糊粉層，b)所述穀粒中ROS1a多肽的量和/或活性，和c)所述穀粒中由ROS1a基因編碼的mRNA的量。
在一實施方式中，所述方法鑒別本發明的水稻植物。
在另一方面，本發明提供產生水稻植物部分較佳穀粒的方法，所述方法包括，a)生長本發明的水稻植物或在田間的至少100株這樣的水稻植物，和b)從所述水稻植物收穫所述水稻植物部分。
在另一方面，本發明提供從穀粒產生麵粉(flour)、麩(bran)、粗麵粉(wholemeal)、麥芽(malt)、澱粉或油的方法，所述方法包括：a)獲得本發明的穀粒，和b)加工所述穀粒以產生所述麵粉、麩、粗麵粉(wholemeal)、麥芽、澱粉或油。
在另一方面，本發明提供從本發明的穀粒或本發明的水稻植物，或從所述穀粒或水稻植物的一部分產生的產品。
在一實施方式中，所述產品包含所述ROS1a基因、所述遺傳變異(較佳導入的遺傳變異)、所述外源核酸構築體和所述增厚的糊粉層中的一或多種或全部。
在一實施方式中，所述部分是水稻麩。
在一實施方式中，所述產品是食物成分、飲料成分、食物產品或飲料產品。實例包括但不限於，i)所述食物成分或飲料成分選自粗麵粉、麵粉、麩、澱粉、麥芽和油， ii)所述食物產品選自：經發酵的或未經發酵的麵包、通心粉(pasta)、麵條、動物飼料、早餐穀物(breakfast cereals)、零食(snack food)、糕餅(cake)、糕點(pastry)和含有基於麵粉的醬的食物，或iii)所述飲料產品是包裝飲料或含乙醇的飲料。
在另一方面，本發明提供製備本發明的食物或飲料成分的方法，所述方法包括加工本發明的穀粒或來自所述穀粒的麩、麵粉、粗麵粉、麥芽、澱粉或油以產生所述食物或飲料成分。
在另一方面，本發明提供製備本發明的食物或飲料產品的方法，所述方法包括將本發明的穀粒或來自所述穀粒的麩、麵粉、粗麵粉、麥芽、澱粉或油和另一食物或飲料成分混合。較佳地，用於所述方法的穀粒、麩、麵粉、粗麵粉、麥芽、澱粉或油的重量以重量計是所述食物產品的至少10%。
還提供的是本發明的穀粒或其部分、本發明的水稻植物或其部分用作動物飼料或食物的用途，或用來產生用於動物消耗的飼料或用於人消耗的食物的用途。
在另一方面，本發明提供了組合物，其包含本發明的多肽、本發明的多核苷酸、本發明的核酸構築體和/或載體或本發明的細胞當中的一或多種，以及一或多種可接受的載劑。
除非另外具體指明，本文的任何實施方式根據情況作適當變動應當可應用於任何其他實施方式。
本發明的範圍不受本文描述的具體實施方式的限制，所述具體實施方式僅僅是出於例示的目的。顯然，功能性等同的產物、組合物和方法屬本發明的範圍，如本文所描述一樣。
在本說明書全文，除非另外具體指明或上下文另有要求，提及單一步驟，物質組成、步驟組和物質組成組應該認為涵蓋一和多個(即，一或多個)這些步驟、物質組成、步驟組或物質組成組。
在下文通過如下非限制性實施例並參考附圖描述本發明。
序列表說明
SEQ ID NO：1-水稻ROS1a突變體(Ta2)多肽。
SEQ ID NO：2-野生型水稻ROS1a多肽。
SEQ ID NO：3-野生型水稻ROS1b多肽。
SEQ ID NO：4-野生型水稻ROS1c多肽。
SEQ ID NO：5-野生型水稻ROS1d多肽。
SEQ ID NO：6-擬南芥DEMETER多肽。
SEQ ID NO：7-編碼水稻ROS1a突變體(Ta2)多肽的全長cDNA。開放讀框跨越核苷酸341至6220。
SEQ ID NO：8-編碼水稻ROS1a多肽的全長cDNA。開放讀框跨越核苷酸341至6199。
SEQ ID NO：9-水稻ROS1a基因。啟動子和5’UTR：核苷酸1-4726，轉譯起始密碼子ATG 4727-4729；轉譯終止密碼子TAG 15867-15869；從15870-16484的3’-UTR，從16485-16885的所述基因的下游。內含子的核 苷酸位置為：內含子1，7494-7724；2，7816-7909；3，9426-9571；4，9652-10452；5，10538-10628；6，10721-10795；7，10865-10951；8，10989-11069；9，11153-11834；10，12282-12385；11，12423-12508；12，12567-12650；13，12791-13017；14，13084-13201；15，13317-14668；16，14708-15732.-11006。該序列包括3'端並不形成該基因一部分的401個核苷酸。
SEQ ID NO：10-在圖2提供的部分野生型水稻ROS1a cDNA序列。
SEQ ID NO：11-在圖2提供的部分突變體(Ta2)水稻ROS1a cDNA序列。
SEQ ID NO：12-在圖3提供的部分野生型水稻ROS1a蛋白序列。
SEQ ID NO：13-在圖3提供的部分突變體(Ta2)水稻ROS1a蛋白序列。
SEQ ID NO：14-與野生型(SEQ ID NO：2)相比，ROS1a突變體(Ta2)多肽的額外的胺基酸。
SEQ ID NO 15至43-寡核苷酸引子。
SEQ ID NO 44至49-野生型水稻ROS1a多肽的糖基化酶結構域內高度保守的胺基酸模體。
SEQ ID NO：50-擬南芥ROS1a多肽。
圖1.ta2基因圖位選殖的示意圖。每條線底下的數字顯示定位群體中的重組體的數目，其顯示標記和ta2基因之間的重組。第三條線上的實心條顯示水稻基因體上的編碼區域。第四條線上的實心條顯示基因中的蛋白編碼區域；間隔的線代表內含子(內含子1在5'UTR內而在此不顯示)。星號顯示ta2突變在內含子14的位置，位於參照水稻基因體序列的位置Chr1：6451738處。
圖2.cDNA的核苷酸序列，所述cDNA對應於獲得自野生型(WT)和ta2基因型的發育中的穀粒的mRNA。野生型和兩個ta2序列中的短橫線表示不存在核苷酸。ta2 mRNA中大多數具有21個核苷酸插入。野生型序列是SEQ ID NO：10，突變體序列是SEQ ID NO：11。
圖3.從對應於獲得自野生型和ta2發育中的穀粒的mRNA的cDNA預測的胺基酸序列，野生型(上面的胺基酸序列，SEQ ID NO：12)和ta2(下面序列，SEQ ID NO：13)。WT序列中的短橫線表示不存在對應於ta2多肽中的7個胺基酸插入(CSNVMRQ；SEQ ID NO：14)的胺基酸。序列下的星號表示在那些位置處野生型和突變體多肽存在相同胺基酸。
圖4.擬南芥Arabidopsis DME(NM001085058.1)、擬南芥ROS1a(NM129207.4)和水稻ROS1a同源物的胺基酸序列比對。比對下的星號代表 在全部三種多肽中保守的胺基酸位置。冒號代表完全保守的胺基酸變化，而單一的點代表部分保守的胺基酸變化。
圖5.擬南芥ROS1a(NM129207.4)和水稻ROS1a同源物的胺基酸序列比對。比對下的星號代表在全部三種多肽中保守的胺基酸位置。冒號代表完全保守的胺基酸變化，而單一的點代表部分保守的胺基酸變化。
圖6.顯示水稻TA2基因在多種組織中的相對表現的即時RT-PCR結果。
通用技術和定義
除非另外特別指明，本文使用的全部技術和科學術語將被認為具有與本領域(例如細胞培養、分子遺傳學、植物分子生物學、蛋白質化學和生物化學領域)的普通技術人員通常所理解的相同的含義。
除非另外指明，本發明中所採用的重組蛋白、細胞培養和免疫學技術是本領域技術人員公知的標準程序。這樣的技術在來源於以下的文獻到處 被描述和解釋，例如J.Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley and Sons(1984)、J.Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)、T.A.Brown(editor),Essential Molecular Biology：A Practical Approach,Volumes 1 and 2,IRL Press(1991)、D.M.Glover and B.D.Hames(editors),DNA Cloning：A Practical Approach,Volumes 1-4,IRL Press(1995 and 1996)以及F.M.Ausubel et al.(editors),Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括直到目前的全部更新)、Ed Harlow and David Lane(editors)Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory,(1988)、以及J.E.Coligan et al.(editors)Current Protocols in Immunology,John Wiley & Sons(包括直到目前的全部更新)。
術語“和/或”，例如“X和/或Y”，應當理解為指“X和Y”或“X或Y”，且應當被認為是給兩種含義或兩種含義之一均提供明確支持。
如本文所用，術語“約”，除非有相反指明，指的是指定值的+/- 10%，更佳+/- 5%，更佳+/- 2%，甚至更佳+/- 1%。術語“約”包括準確的指定值。
本說明書通篇詞語“包含(comprise)”，或其變形如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”，將理解為意味著包括所陳述的元素、整數或步驟，或元素、整數或步驟的組，但不排除任何其它元素、整數或步驟，或元素、整數或步驟的組。
選擇的定義
術語“糊粉”和“糊粉層”在本文中可互換使用。糊粉層是水稻穀粒胚乳的最外層，區別於內部的澱粉質胚乳，且圍繞澱粉質胚乳和部分的胚。構成糊粉層的細胞因此是胚乳(穀粒的澱粉質組分)的最外的細胞。儘管其技術上是胚乳的一部分，有時候稱作外周胚乳，糊粉層從實際觀點被認為是麩的一部分，由於其和麩的果皮和種皮層一起被去除。不像澱粉質胚乳的細胞，糊粉層細胞在穀粒成熟保持活著。糊粉層是水稻穀粒營養價值的重要部分，其包含礦物質、維生素例如A和B族維生素，植物素和纖維。
本發明的實施方式涉及“細胞層”的數目範圍，至少部分是因為在本發明的穀粒的任一橫切點，在所述橫切內的任意單一點處或橫切面之間觀察到的細胞的層在一定程度會有變化。更具體而言，具有例如七層細胞的糊粉層可能沒有七層圍繞整個內部澱粉質胚乳，但有七層圍繞所述內部澱粉質胚乳的至少一半。
術語“增厚的”當用於涉及本發明的穀粒的糊粉層時，是當比較本發明的穀粒與相應的野生型穀粒時使用的相對性術語。當與相應的野生型穀粒比較時，本發明的穀粒的糊粉層具有增加的細胞數目和/或增加的細胞層數。由此糊粉層厚度增加，如以μm測量的。在一實施方式中，所述厚度被增加至少50%，較佳至少100%，且可以增加多達500%或600%，各百分比是相對於相應的野生型穀粒的糊粉層的厚度，且理解各百分比為沿著所述穀粒腹側且較佳沿著整個穀粒的平均增加。在一實施方式中，糊粉層的厚度跨越所述穀粒整個橫切面測定。在一實施方式中，糊粉層的厚度通過至少對所述穀粒的腹側的分析來測定。在另一實施方式中，與其中糊粉層通常具有規律朝向的矩形細胞的相應野生型穀粒相比，本發明的穀粒的增 厚的糊粉層包含不同大小和不規則朝向的細胞。
多肽
如本文所用，術語“ROS1多肽”指的是DNA糖基化酶相關分子的蛋白家族成員，其與SEQ ID No：1-5的胺基酸序列相關，相關在於它們與SEQ ID No：1-5所示的胺基酸序列的一或多個具有至少95%的同一性。ROS1多肽包括野生型水稻的ROS1a、ROS1b、ROS1c和ROS1d多肽，包括天然發生的變體和其突變體形式。ROS1多肽包括在野生型水稻植物中發現的這樣的多肽以及其人工產生或天然發現(例如在秈稻和粳稻水稻植物中發現的)的變體，且具有或不具有DNA糖基化酶活性，包括具有一些DNA糖基化酶活性但水平與相應野生型ROS1多肽相比降低的ROS1多肽。野生型水稻植物的ROS1多肽的實例具有SEQ ID NO：2-5之一所示胺基酸序列的那些，以及具有與SEQ ID NO：2-5所示胺基酸序列中的一或多個至少95%、至少97%、或較佳至少99%相同的胺基酸序列且天然發現的變體多肽。如本文所用，ROS1多肽並不包括Demeter(DME)多肽，其是相關的DNA糖基化酶家族，與SEQ ID NO：1-5在胺基酸序列上的同一性遠小於95%。
如本文所用，“ROS1a多肽”指的是DNA糖基化酶相關分子，其胺基酸序列與SEQ ID NO：2至少95%相同，較佳地與SEQ ID NO：2至少97%相同或更佳地至少99%相同。ROS1a多肽包括在野生型水稻植物中發現的多肽以及其人工產生或天然發現的變體，且具有或不具有DNA糖基化酶活性，條件是它們與SEQ ID NO：2具有要求的胺基酸序列同一性水平。例如，其序列提供為SEQ ID NO：1的ROS1a多肽被認為不具有DNA糖基化酶活 性，其仍然是本文所定義的ROS1a多肽。在一較佳實施方式中，所述ROS1a多肽具有一些DNA糖基化酶活性但水平與相應野生型ROS1a多肽相比降低，所述野生型ROS1a多肽的胺基酸序列提供為SEQ ID NO：2。例如，表3列出被認為具有降低的DNA糖基化酶活性的ROS1a突變體多肽。
本領域技術人員能夠容易地使用已知的技術將ROS1a多肽與其他結構相關蛋白例如其他ROS1多肽，尤其是ROS1b、ROS1c和ROS1d多肽區分開，例如使用電腦進行親緣關係分析或蛋白比對。ROS1a多肽因此可以單獨基於結構特徵被鑒別為ROS1a多肽。例如，見本文的圖4和5。本發明的ROS1a多肽可以具有或可以不具有DNA糖基化酶活性，或可以具有與野生型ROS1a多肽相比降低的DNA糖基化酶活性，所述野生型ROS1a多肽例如具有SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列。
如本文所用，術語“其序列不同於相應的野生型ROS1a多肽的胺基酸序列”或類似語段，是比較性術語，其中本發明的ROS1a多肽的胺基酸序列不同於其衍生自的和/或最緊密相關的天然存在的蛋白的胺基酸序列。在一實施方式中，所述ROS1a多肽的胺基酸序列相對於相應的野生型胺基酸序列具有一個或多個插入、缺失或胺基酸取代(或這些的組合)。所述ROS1a多肽相對於相應的野生型ROS1a多肽可以具有2個、3個、4個、5個或6-10個胺基酸取代。在一較佳實施方式中，所述ROS1a多肽相對於相應的野生型多肽僅僅具有單一插入、單一缺失或單一胺基酸取代。在該語境中，“單一插入”和“單一缺失”包括其中多個(如2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多)鄰接的胺基酸分別被插入或缺失，且“相應的野生型多肽”指的是所述變體衍生自的野生型多肽和/或所述變體最緊密 相關的天然多肽。所述ROS1a多肽可以是截短的ROS1a多肽，其可以由例如相對於其衍生自的野生型ROS1a基因，在蛋白開放讀框中包含未成熟轉譯終止密碼子的ROS1a基因編碼，或所述ROS1a多肽可以是全長的，即和相應的野生型ROS1a多肽具有相同數目的胺基酸殘基。天然存在的(野生型)ROS1a多肽的實例是胺基酸序列示於SEQ ID NO：2的多肽，而僅僅具有單一插入、缺失或胺基酸取代的變體ROS1a多肽的實例在SEQ ID NO：1和表3給出。
如本文所用，術語“DNA糖基化酶活性”指的是參與鹼基切除修復的酶(分類於EC號EC 3.2.2)。所述酶一般也具有DNA裂解酶活性，其中DNA鹼基被切除且主鏈DNA鏈被切割。在一實施方式中，如本發明上下文所用“DNA糖基化酶活性”涉及主動去甲基化，其中5-甲基胞嘧啶殘基被切除並被未甲基化的胞嘧啶替換。在一較佳實施方式中，具有DNA糖基化酶活性的本發明的ROS1a多肽具有至少五個可鑒別的模體。一個是螺旋-髮夾-螺旋(HhH)模體(例如SEQ ID NO：2的胺基酸1491-1515或同源胺基酸序列)。另一個是甘胺酸/脯胺酸富含模體，其接著是保守的天冬胺酸(GPD)，以及四個保守的半胱胺酸殘基(在SEQ ID NO：2的胺基酸1582-1598的區域)以容納[4Fe-4S]簇。還有一個離胺酸富含模體(例如SEQ ID NO：2中胺基酸87-139或同源胺基酸序列)。不像HhH DNA糖基化酶超家族成員的其它成員，ROS1a多肽家族成員在中央糖基化酶結構域的側翼含有兩個額外的保守結構域(結構域A和B)。在水稻ROS1a多肽(SEQ ID NO：2)中，結構域A出現在胺基酸859-965，糖基化酶結構域出現在胺基酸1403-1616，而結構域B出現在胺基酸1659-1933。結構域A在胺基酸882-892含有重複的混合電荷簇。DNA糖 基化酶活性可以使用本領域已知的標準技術測量，例如描述於實施例8。
野生型水稻ROS1a多肽的糖基化酶結構域內的高度保守的胺基酸模體包括DHGSIDLEWLR(SEQ ID NO：44，amino acids 1467-1477 in SEQ ID NO：2),GLGLKSVECVRLLTLHH(SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：2中胺基酸1493-1509)、AFPVDTNVGRI(SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：2中胺基酸1511-1521)、VRLGWVPLQPLPESLQLHLLE(SEQ ID NO：47，SEQ ID No：2中胺基酸1523-1543)、ELHYQMITFGKVFCTKSKPNCN(SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：2中胺基酸1569-1590)和HFASAFASARLALP(SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：2中胺基酸1600-1613)。這些模體中可以存在一個或兩個胺基酸取代，或者不存在。通過比對野生型水稻ROS1a(SEQ ID No：2)和來自阿拉伯芥的DME多肽(SEQ ID NO：6)和/或阿拉伯芥ROS1a多肽(見圖4和5)可以容易地鑒別其他保守的胺基酸。關於鑒別保守胺基酸的進一步的指導可以獲得自Kapazoglou et al.(2012)。
如本文所用，術語“與相應野生型ROS1a多肽相比其降低DNA糖基化酶活性”，“與相應野生型ROS1a多肽相比其具有降低的DNA糖基化酶活性，較佳無DNA糖基化酶活性”，或類似語句，是相對性術語，其中變體/突變體ROS1a多肽的DNA糖基化酶活性低於其衍生自和/或最緊密相關的天然存在的蛋白。例如，如本領域技術人員將理解的，本文所描述的水稻Ta2突變體(SEQ ID NO：1)，當與相應野生型水稻ROS1a多肽(SEQ ID NO：2)相比時，具有降低的DNA糖基化酶活性。具有降低的DNA糖基化酶活性的ROS1a多肽的其他實例包含對應於表3中描述的胺基酸的突變/變異，其賦予增厚的糊粉層表型，例如用另一胺基酸如苯丙胺酸取代對應於SEQ ID NO：2的胺基酸編號156的胺基酸位置處的絲胺酸，用另一胺基酸如苯丙胺酸取代對應於SEQ ID NO：2的胺基酸編號214的胺基酸位置處的絲胺酸，用另一胺基酸如天冬醯胺取代對應於SEQ ID NO：2的胺基酸編號1413的胺基酸位置處的絲胺酸，用另一胺基酸如纈胺酸取代對應於SEQ ID NO：2的胺基酸編號441的胺基酸位置處的丙胺酸，用另一胺基酸如苯丙胺酸取代對應於SEQ ID NO：2的胺基酸編號1357的胺基酸位置處的絲胺酸，用另一胺基酸如絲胺酸取代對應於SEQ ID NO：2的胺基酸編號501的胺基酸位置處的離胺酸，和用另一胺基酸如離胺酸取代對應於SEQ ID NO：2的胺基酸編號482的胺基酸位置處的精胺酸。在一特別較佳的實施方式中，所述穀粒具有至少一些DNA糖基化酶活性，較佳一些ROS1a DNA糖基化酶活性，因為證據提示在卵細胞中和種子發育早期缺失DNA糖基化酶活性對於水稻植物是致死的。在一實施方式中，與來自相應的缺乏在穀粒中降低DNA糖基化酶活性的遺傳變異(較佳導入的遺傳變異)的等基因植物的穀粒相比，所述穀粒具有約30%-98%，或約40%-98%，或約40%-90%，或約40-85%，或約40%-80%的較少DNA糖基化酶活性。
通過“基本上純化的多肽”或“純化的多肽”，我們指的是通常已經和其在天然狀態時伴隨的脂質、核酸、其它肽和其它污染分子分開的多肽。較佳地，所述基本上純化的多肽至少90%不含其天然伴隨的其它組分。在一實施方式中，本發明的多肽具有不同於天然存在的ROS1a多肽的胺基酸序列，即，是如上文定義的胺基酸序列變體。
本發明的穀粒、植物和宿主細胞可以包含編碼本發明的多肽的外源多核苷酸。在這些例子中，所述穀粒、植物和細胞產生重組多肽。術語“重 組的”在多肽語境下指的是當由細胞產生時由外源多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸通過重組DNA或RNA技術如轉形被導入至所述細胞或祖先細胞。一般而言，所述細胞包含非內源基因，所述非內源基因導致待產生的所述多肽的改變的量。在一實施方式中，“重組多肽”是由外源(重組的)多核苷酸在植物細胞中表現製造的多肽。
術語“多肽”和“蛋白”一般可互換使用。
多肽的%同一性通過GAP(Needleman and Wunsch,1970)分析(GCG程序)使用缺口創建罰分=5，和缺口延伸罰分=0.3來確定。查詢序列至少長1000個胺基酸，而GAP分析在至少1000個胺基酸的區域比對兩個序列。更佳地，查詢序列至少長1,250個胺基酸，而GAP分析在至少1,250個胺基酸的區域比對兩個序列。更佳地，查詢序列至少長1,500個胺基酸，而GAP分析在至少1,500個胺基酸的區域比對兩個序列。甚至更佳地，GAP分析在它們的整個長度比對兩個序列，對於ROS1a多肽是大約1800至2100個胺基酸殘基。
對於限定的多肽，將理解高於上文提供的那些%同一性數字將涵蓋較佳的實施方式。因此，如果適用，根據最小%同一性數字，較佳所述多肽包含與相關指定SEQ ID NO至少95%，更佳至少96%，更佳至少97%，更佳至少98%，更佳至少99%，更佳至少99.1%，更佳至少99.2%，更佳至少99.3%，更佳至少99.4%，更佳至少99.5%，更佳至少99.6%，更佳至少99.7%，更佳至少99.8%，和甚至更佳至少99.9%相同。
如本文所用，語句“在對應於胺基酸編號的位置處”或其變形指的是與周圍胺基酸相比較的胺基酸的位置。就這一點而言，在一些實施方式中本 發明的多肽可以具有缺失或取代突變，其改變胺基酸在與例如SEQ ID NO：2比對時的相對位置。確定兩種緊密相關的蛋白之間的相應胺基酸位置完全在本領域技術人員的能力範圍內。
本發明的多肽的胺基酸序列突變體可以通過向本發明的核酸導入合適的核苷酸改變來製備，或者通過所需多肽的體外合成製備。這樣的突變體包括，例如，胺基酸序列內的殘基缺失、插入或取代。可以進行缺失、插入和取代的組合以達到最終構築體，條件是所述最終肽產物具有所需的特性。較佳的胺基酸序列突變體相對於參考野生型多肽具有僅僅一個、兩個、三個、四個或少於10個胺基酸改變。與相應的野生型天然存在的ROS1a多肽相比，本發明的突變體多肽具有降低的“ROS1a多肽活性”，所述野生型天然存在的ROS1a多肽例如包含SEQ ID NO：2所示胺基酸序列的多肽。
突變體(改變的)多肽可以使用本領域已知的任何技術製備，例如，使用定向演化或理性設計策略(見下文)。衍生自突變的/改變的DNA的產物可以使用本文描述的技術容易地篩選以確定當與包含提供為SEQ ID NO：2的胺基酸序列的ROS1a多肽中的一種或多種或全部相比較時，它們是否具有降低的ROS1a多肽活性，例如降低的DNA糖基化酶活性。例如，所述方法可以包括產生表現所述突變的/改變的DNA的轉基因植物和確定i)所述突變的/改變的DNA對糊粉層厚度的影響和ii)ROS1a基因是否已經被突變/改變。
在設計胺基酸序列突變體中，突變位點的位置和突變的性質將取決於待修飾的特性。用於突變的位點可以個別地或成系列地修飾，例如通過(1)用非保守胺基酸選擇取代，(2)缺失靶殘基，或(3)在定位位點鄰近插入另外的殘基。
胺基酸序列缺失通常範圍為約1-15個殘基，更佳約1-10個殘基以及典型地約1-5個連續殘基。
取代突變體在多肽分子中有至少一個胺基酸殘基被去除且不同的殘基被插入其位置。如果不期望保留某一活性，或者要降低某一活性，較佳進行非保守取代，尤其是在相關蛋白家族中高度保守的胺基酸位置處。保守胺基酸取代的實例示於表1，因此非保守取代將是表1沒顯示的那些。
在一實施方式中，與天然存在的多肽相比，突變體/變體多肽具有一個或兩個或三個或四個胺基酸改變。在一較佳實施方式中，所述改變位於本文提供的不同ROS1a多肽之間高度保守的一或多個模體內，特別是位於已知的保守結構結構域內。如本領域技術人員將明白，可以合理地預測當在細胞中表現時，這樣的改變改變所述多肽的活性。
基於和緊密相關的酶，特別是DNA糖基化酶的比較，本發明的多肽的一級胺基酸序列可以用來設計其變體/突變體。如本領域技術人員將理解，在緊密相關的蛋白中高度保守的殘基比較不保守的殘基更可能被改變，特別是用非保守取代，且活性降低(見上文)。
還包括在本發明的範圍內的是本發明的多肽，其在合成後被不同地修飾，如，通過細胞中的轉譯後修飾，例如通過磷酸化，其可能調節它的活性。
多核苷酸和基因
本發明涉及多種多核苷酸。如本文所用，“多核苷酸”或“核酸”或“核酸分子”指的是核苷酸的聚合物，其可以是DNA或RNA，且包括基因體DNA、mRNA、cRNA、dsRNA和cDNA。其可以是細胞、基因體或合成 來源(例如在自動化合成儀上製備)的DNA或RNA，且可以與碳水化合物、脂質、蛋白或其他材料組合，用瑩光或其他基團標記，或附著於固體支持物上以實現本文定義的特定活性，或包含自然界沒有發現的，本領域技術人員公知的一個或多個修飾的核苷酸。所述聚合物可以是單鏈的，基本上雙鏈的或部分雙鏈的。鹼基配對如本文所用指的是核苷酸之間的標準鹼基配對，包括G：U鹼基配對。“互補”指的是兩個多核苷酸能夠沿著它們長度的一部分或者沿著一個或兩個的全長鹼基配對(雜交)。“雜交的多核苷酸”指的是多核苷酸實際上與其互補物鹼基配對。術語“多核苷酸”在本文和術語“核酸”可互換使用。本發明的較佳的多核苷酸編碼本發明的多肽。
通過“分離的多核苷酸”我們指的是通常已經與其在天然狀態下所伴隨的或連接的多核苷酸序列分開的多核苷酸，如果該多核苷酸是在自然界發現的。較佳地，所述分離的多核苷酸至少90%不含其天然伴隨的其它組分，如果它是在自然界發現的。較佳地所述多核苷酸不是天然存在的，例如是以自然界沒有發現的方式通過共價連接兩個較短的多核苷酸序列(嵌合多核苷酸)。
本發明涉及基因活性的降低以及嵌合基因的構建和用途。如本文所用，術語“基因”包括任何去氧核糖核苷酸序列，其包括蛋白編碼區或其在細胞中轉錄但不轉譯，以及伴隨的非編碼和調控區域。這樣的伴隨區域一般位於編碼區或轉錄區鄰近，在5’和3’端，每側距離約2kb。就這點而言，所述基因可以包括天然伴隨給定基因的控制信號如啟動子、增強子、終止信號和/或多腺苷酸化信號，或異源控制信號，在異源控制信號的情況 下所述基因被稱作“嵌合基因”。位於編碼區5’且存在於mRNA上的序列被稱作5’非轉譯序列。位於編碼區3’或下游且存在於mRNA上的序列被稱作3’非轉譯序列。術語“基因”涵蓋基因的cDNA和基因體形式兩者。
“等位基因”指的是細胞、個體植物內或群體內遺傳序列的一種特定形式，在基因序列內的至少一個，且頻繁地多於一個的變體位點的序列中，該特定形式與相同基因的其它形式不同。在不同等位基因之間不同的這些變體位點處的序列稱作“變異”或“多型性”。“多型性”如本文所用指的是植物不同物種、栽培種、株系或個體的本發明的遺傳基因座處的等位基因之間的核苷酸序列的變異。“多型性位置”是所述基因的序列內在所述序列差異發生處的預選擇的核苷酸位置。在一些情況中，遺傳多型性導致所述基因編碼的多肽內的胺基酸序列變異，且因此多型性位置可以導致將胺基酸序列中的多型性定位於所述多肽序列中的預定位置處。在其它例子中，多型性位置可以在基因的非多肽編碼區域中，例如在啟動子區域中且由此可以影響基因的表現水平。典型的多型性是缺失、插入或取代。這些可以包括單個核苷酸(單核苷酸多型性或SNP)或兩個或更多個核苷酸。
如本文所用，“突變”是在植物或其部分中產生表型改變的多型性。如本領域已知的，一些多型性是沉默的，例如蛋白編碼區中由於遺傳密碼的冗餘而不改變所編碼多肽的胺基酸序列的單核苷酸改變。二倍體植物一般具有單一基因的一個或兩個不同等位基因，但如果基因的兩個複本是相同的則僅僅具有一個，即，所述植物對於該等位基因是同基因型組合的。多倍體植物通常具有任何特定基因的多於一個的同源物。例如，多倍體小麥具有三個亞基因體(通常稱作基因體)，稱為A、B和D基因體，因此對其 大部分基因具有三個同源物，A、B和D基因體各一個。
術語“編碼ROS1a多肽的ROS1a基因”或“ROS1a基因”如本文所用指的是編碼本文所定義的ROS1a多肽的核苷酸序列。所述ROS1a基因可以是內源的天然存在的基因，或者包含如本文所定義的遺傳變異(較佳導入的遺傳變異)。在本發明的穀粒中編碼ROS1a多肽的ROS1a基因可以具有內含子或可以不具有內含子。在一個實例中，本發明的穀粒來自水稻且ROS1a基因的至少一個等位基因編碼與來自相應野生型水稻植物的ROS1a多肽(例如其包含提供於SEQ ID NO：2的胺基酸序列)相比具有降低的DNA糖基化酶活性的ROS1a多肽。這樣的具有降低的DNA糖基化酶活性的ROS1a多肽的實例是水稻Ta2突變體(SEQ ID NO：1)。
如本文所用，語句“ROS1a基因的失活”或“ROS1a基因的表現降低”或其變形指的是降低(部分地)，或完全阻止編碼功能性ROS1a多肽的基因表現的任何遺傳變異。這樣的遺傳變異包括在所述基因啟動子區域的突變，其降低待轉錄基因的轉錄，例如通過使用基因編輯來從ROS1a基因缺失或取代核苷酸，或內含子剪接突變，其改變形成mRNA的剪接的量或位置。
含有轉錄區域的基因的基因體形式或殖株可以被稱作“內含子”或“介入區域”或“介入序列”的非編碼區域(其相對於基因的外顯子可以是同源的或異源的)間斷。如本文所用“內含子”是基因的片段，其被轉錄為初級RNA轉錄物的一部分但不存在於成熟mRNA分子中。內含子從核或初級轉錄物中被去除或“剪掉”；內含子因此不存在於信使RNA(mRNA)中。如本文所用“外顯子”指的是對應於RNA序列的DNA區域，其存在於成熟mRNA或成熟的RNA分子(其中RNA分子不轉譯的情況)中。在轉譯期 間，mRNA功能為指定初生多肽中的胺基酸的序列或順序。術語“基因”包括編碼本文描述的本發明的蛋白的全部或部分的合成或融合分子，以及上述任一個的互補核苷酸序列。基因可以被導入合適的載體用於在細胞中的染色體外維持，或較佳地，用於整合進宿主基因體。
如本文所用，“嵌合基因”指的是共價連接的序列的任何基因，所述共價連接的序列沒有發現在自然界中被連接。一般而言，嵌合基因包含沒有在自然界發現在一起的調控和轉錄或蛋白編碼序列。因此，嵌合基因可以包含衍生自不同來源的調控序列和編碼序列，或衍生自相同來源但以不同於在自然界中發現的方式排列的調控序列和編碼序列。在一實施方式中，ROS1a的蛋白編碼區域與對所述ROS1a基因為異源的啟動子或多腺苷酸化/終止子區域可操作地連接，由此形成嵌合基因。在一可選實施方式中，編碼在水稻植物穀粒中存在時下調穀粒中ROS1a多肽的產生和/或活性的多核苷酸的基因與對所述多核苷酸為異源的啟動子或多腺苷酸化/終止子區域可操作地連接，由此形成嵌合基因。
如本文所用術語“內源”指的是在與正在研究的植物處於相同發育階段的未修飾的植物中正常存在或產生的物質。“內源基因”指的是在生物體基因體中其天然位置的天然基因。如本文所用，“重組核酸分子”、“重組多核苷酸”或去變形因此指的是已經通過重組DNA技術構建或修飾的核酸分子。術語“外來多核苷酸”、“外源多核苷酸”或“異源多核苷酸”等指的是通過實驗操作導入進細胞的基因體的任何核酸。
外來或外源基因可以使被插入進非天然生物體的基因，導入進天然宿主內新位置的天然基因，或嵌合基因。“轉基因”是已經通過轉形程序導 入進基因體中的基因。術語“遺傳學修飾”包括通過轉形或轉導將基因導入細胞中，在細胞中突變基因以及對已經完成這些行為的細胞或生物體或它們的子代中的基因的調控進行改變或調節。
此外，在多核苷酸(核酸)語境中的術語“外源”指的是多核苷酸存在於天然並不包含該多核苷酸的細胞中。所述細胞可以是包含導致所編碼多肽的產生的量改變的非內源多核苷酸(例如增加外源多肽表現的外源多核苷酸)的細胞，或者是其天然狀態下不產生所述多肽的細胞。本發明的多肽的增加的產生本文也稱作“過度表現”。本發明的外源多核苷酸包括沒有和其存在的轉基因(重組)細胞或無細胞表現系統的其他組分分開的多核苷酸，以及在這樣的細胞或無細胞系統產生的隨後純化掉至少一些其它組分的多核苷酸。所述外源多核苷酸(核酸)可以是天然存在的核苷酸的連續延伸(stretch)，或包含被連接以形成單個多核苷酸的來自不同來源(天然存在的和/或合成的)的兩個或更多個核苷酸連續延伸。一般而言，這樣的嵌合多核苷酸包含至少一個編碼本發明的多肽的開放讀框，其與適於驅動所述開放讀框在感興趣的細胞中轉錄的啟動子可操作地連接。
多核苷酸的%同一性通過GAP(Needleman and Wunsch,1970)分析(GCG程序)使用缺口創建罰分=5，和缺口延伸罰分=0.3來確定。查詢序列至少長3,000個核苷酸，而GAP分析在至少3,000個核苷酸的區域比對兩個序列。甚至更佳地，查詢序列至少長3,750個核苷酸而GAP分析在至少3,750個核苷酸的區域比對兩個序列。甚至更佳地，查詢序列至少長4,500個核苷酸而GAP分析在至少4,500個核苷酸的區域比對兩個序列。甚至更佳地，GAP分析在它們的整個長度比對兩個序列。
對於限定的多核苷酸，將理解高於上文提供的那些%同一性數字將涵蓋較佳的實施方式。因此，如果適用，根據最小%同一性數字，較佳所述多核苷酸包含與相關指定SEQ ID NO至少95%，更佳至少96%，更佳至少97%，更佳至少98%，更佳至少99%，更佳至少99.1%，更佳至少99.2%，更佳至少99.3%，更佳至少99.4%，更佳至少99.5%，更佳至少99.6%，更佳至少99.7%，更佳至少99.8%，和甚至更佳至少99.9%相同。
本發明還涉及寡核苷酸的用途，例如用於篩選本發明的多核苷酸或編碼本發明的多肽的多核苷酸的方法中。如本文所用，“寡核苷酸”是至多長50個核苷酸的多核苷酸。這樣的寡核苷酸的最小大小是寡核苷酸和本發明的核酸分子上的互補序列之間形成穩定雜交所需的大小。它們可以是RNA、DNA或兩者的組合或衍生物。寡核苷酸一般是10-30個核苷酸的相對短的單鏈分子，通常長15-25個核苷酸。當用作探針或在擴增反應中用作引子時，這樣的寡核苷酸的最小大小是所述寡核苷酸與靶核酸分子上的互補序列形成穩定雜交所需的大小。較佳地，所述寡核苷酸長至少15個核苷酸，更佳至少18個核苷酸，更佳至少19個核苷酸，更佳至少20個核苷酸甚至更佳至少25個核苷酸。用作探針的本發明的寡核苷酸一般與標記共軛，例如放射性同位素、酶、生物素、瑩光分子或化學發光分子。
本發明包括能夠被用作例如探針來鑒別核酸分子，或用作引子來產生核酸分子的寡核苷酸。探針和/或引子可以用於從其它物種選殖本發明的多核苷酸的同源物。此外，本領域已知的雜交技術也可以用於在基因體或cDNA文庫篩選這樣的同源物。
本發明的多核苷酸和寡核苷酸包括在嚴格條件下與SEQ ID NO：1或2 的序列中的一或多個雜交的那些。如本文所用，嚴格條件是(1)採用低離子強度和高溫洗滌，例如，0.015M NaCl/0.0015M檸檬酸鈉/0.1% NaDodSO4，在50℃；(2)在雜交期間採用變性劑例如甲醯胺，例如，具有0.1%牛血清白蛋白的50%(vol/vol)甲醯胺、0.1% Ficoll、0.1%聚乙烯吡咯啶酮、具有750mM NaCl的pH 6.5的50mM磷酸鈉緩衝液、75mM檸檬酸鈉在42℃；或(3)採用50%甲醯胺，5xSSC(0.75M NaCl,0.075M檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH 6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5 x Denhardt’s溶液、超聲處理的鮭魚精子DNA(50g/ml)、0.1% SDS和10%硫酸右旋糖酐，在0.2 x SSC和0.1% SDS中42℃。
與天然存在的分子相比，本發明的多核苷酸可以具有一個或多個突變，其是核苷酸殘基的缺失、插入或取代。突變體可以是天然存在(也就是說，分離自天然來源)的或合成的(例如，通過在所述核酸上進行定點誘變)。本發明的多核苷酸或寡核苷酸的變體包括水稻基因體的不同大小的分子和/或能夠與水稻基因體雜交的分子，其接近本文定義的參考多核苷酸或寡核苷酸分子，較佳內源ROS1a基因。例如，變體可以包含額外的核苷酸(例如1、2、3、4個或更多)或較少核苷酸，只要它們仍然和靶區域雜交。此外，少數核苷酸可以被取代而不影響所述寡核苷酸與靶區域雜交的能力。此外，可以容易地設計變體，其雜交至植物基因體中本文定義的特定寡核苷酸所雜交的區域附近(例如50個核苷酸內)。具體而言，這包括多核苷酸，其編碼相同的多肽或胺基酸序列但由於遺傳密碼子的冗餘性而在核苷酸序列上不同。術語“多核苷酸變體”和“變體”還包括天然存在的等位基因變體。
遺傳變異
如本文所用，術語“遺傳變異”指的是穀粒的一或多個細胞，較佳發育中的穀粒的糊粉層、果皮、珠心突起、子房、種皮或澱粉質胚乳中的一種或多種或全部中的細胞，或本發明的植物或其部分的細胞，其具有可以人工導入的或可以在水稻植物中天然存在的(例如，雜交以產生本發明的植物)遺傳變異。
如本文所用，術語“一或多個導入的遺傳變異”指的是穀粒的一或多個細胞，較佳發育中的穀粒的糊粉層、果皮、珠心突起、子房、種皮或澱粉質胚乳中的一種或多種或全部中的細胞，或本發明的植物或其部分的細胞，其具有人工導入的遺傳變異。在一較佳實施方式中，所述穀粒或所述植物或其部分的每個細胞均包含所述導入的遺傳變異。如本領域技術人員將理解，有許多類型的可以製備的遺傳變異，例如但不限於，編碼降低ROS1a基因表現的外源多核苷酸(例如dsRNA分子或微RNA)的核酸構築體；編碼外源多核苷酸的核酸構築體，所述外源多核苷酸編碼胺基酸序列不同於相應野生型ROS1a多肽的胺基酸序列的ROS1a多肽，且所述ROS1a多肽與相應野生型ROS1a多肽相比具有降低的(較佳有一些但可以沒有)DNA糖基化酶活性；通過基因編輯操作基因體以降低內源ROS1a基因的活性；以及使用TILLING來導入突變並選擇產生具有降低的ROS1a多肽DNA糖基化酶活性的穀粒的植物。
如本文所用，術語“降低至少一個ROS1a基因的活性”，由於其涉及“一或多個遺傳變異”或“一或多個導入的遺傳變異”，指的是所述遺傳變異導致與相應野生型水稻植物相比，所述基因表現的ROS1a多肽的量或 活性的降低。在一實施方式中，所述穀粒包含具有至少一些DNA糖基化酶活性的ROS1a多肽。
在一實施方式中，所述遺傳變異並不下調非ROS1a多肽的DNA糖基化酶活性。例如，所述遺傳變異並不使本發明的水稻植物中ROS1b、ROS1c和ROS1d多肽各自的DNA糖基化酶活性降低超過10%或30%。可選地，所述遺傳變異使ROS1b、ROS1c和ROS1d多肽中的至少一種的DNA糖基化酶活性降低至少30%。
RNA干擾
RNA干擾(RNAi)特別可用於特異性降低基因表現，如果該基因編碼蛋白，其導致特定蛋白降低的產生。儘管不希望受理論限制，Waterhouse et al.(1998)已提供dsRNA(雙鏈體RNA)可用於降低蛋白產生的機制的模型。該技術基於含有與感興趣的基因的mRNA或其一部分基本上相同的序列的dsRNA分子的存在。方便地，所述dsRNA在重組載體或宿主細胞中產生自單一啟動子，其中正義和反義序列通過一不相關序列側接，使得所述正義和反義序列雜交形成dsRNA分子而所述不相關序列形成環結構。合適的dsRNA分子的設計和產生完全在本領域技術人員的能力範圍內，尤其是考慮到Waterhouse et al.(1998)、Smith et al.(2000)、WO 99/32619、WO 99/53050、WO 99/49029和WO 01/34815。
在一實例中，導入DNA，其指導合成與ROS1a基因具有同源性的至少部分雙鏈RNA產物。所述DNA因此包含正義和反義序列兩者，其當轉錄成RNA時，能夠雜交形成雙鏈RNA區。在本發明的一實施方式中，所述 正義和反義序列由包含內含子的間隔物區分開，所述內含子當轉錄成RNA時被剪切掉。已經顯示該設置導致更高的基因沉默效率(Smith et al.,2000)。雙鏈區可以包含一個或兩個RNA分子，轉錄自一個或兩個DNA區域。雙鏈分子的存在被認為觸發來自內源系統的反應，其破壞所述雙鏈RNA以及也破壞來自靶基因的同源RNA轉錄物，有效地降低或消除靶基因的活性。
雜交的正義和反義序列的長度各自應當為至少19個連續的核苷酸，較佳至少30個或至少50個連續的核苷酸，更佳地，至少100個或至少200個連續的核苷酸。一般而言，使用相應於靶基因mRNA區域的100-1000個核苷酸的序列。可以使用相應於整個基因轉錄物的全長序列。正義序列與靶向的轉錄物的同一性程度(以及因此也是反義序列與靶轉錄物的互補序列的同一性)應當為至少85%、至少90%或95-100%，較佳與靶向的序列相同。所述RNA分子當然可以包含不相關序列，其功能為穩定所述分子。所述RNA分子可以在RNA聚合酶II或RNA聚合酶III啟動子控制下表現。後者的實例是tRNA或snRNA啟動子。
較佳的小干擾RNA(“siRNA”)分子包含與靶mRNA的約19-25個連續核苷酸相同的核苷酸序列。較佳地，所述siRNA序列開始於雙核苷酸AA，包含約30-70%的GC含量(較佳30-60%，更佳40-60%以及更佳約45-55%)，且與其要導入的生物體的基因體中除了靶之外的任何核苷酸序列不具有高的百分比同一性，如通過標準BLAST搜索確定。
對於本發明有用的dsRNA可以使用常規方法容易地產生。
微RNA
微RNA(microRNA，縮寫為miRNA)是長度通常為19-25個核苷酸(在植物中通常為約20-24個核苷酸)的非編碼RNA分子，其衍生自形成不完美莖-環結構的較大的前體。miRNA一般與表現待降低的靶mRNA的一區域完全互補，但不需要完全互補。
miRNA結合至靶信使RNA轉錄物(mRNA)上的互補序列，通常導致轉錄抑制或靶降解和基因沉默。如本領域公知，可以基於天然miRNA設計人工miRNA(amiRNA)用於降低任何感興趣基因的表現。
在植物細胞中，據信miRNA前體分子大部分在核中加工。pri-miRAN(含有一或多個局部雙鏈或“髮夾”區域以及mRNA通常的5’“帽”和多聚腺苷酸尾巴)被加工為較短的miRNA前體分子，所述miRNA前體分子也包括莖-環或回-疊結構且被稱作“pre-miRNA”。在植物中，pre-miRNA被不同的DICER-樣(DCL)酶切割，產生miRNA：miRNA*雙鏈體。在運輸出核之前，這些雙鏈體被甲基化。
在細胞質中，來自miRNA：miRNA雙鏈體的miRNA鏈被選擇性地併入活性RNA-誘導的沉默複合物(RISC)用於靶識別。RISC-複合物含有一個特定亞組的Argonaute蛋白，其執行序列特異性基因抑制(見例如，Millar and Waterhouse,2005；Pasquinelli et al.,2005；Almeida and Allshire,2005)。
對於本發明有用的微RNA可以使用常規方法容易地產生。例如，ROS1a amiRNA(人工微RNA)構築體的設計可以基於Fahim et al.(2012)描述的通用方法。可以使用WMD3軟體(www.wmd3.weigelworld.org/)鑒別ROS1a中合適的amiRNA靶。所述amiRNA靶根據以下四個標準進行選擇：1)相對的5’不穩定性，通過使用5’-末端處富含AT而在3’-末端處富含GC的序列； 2)在第1位的U和在切割位點(在第10位和11位之間)處的A；3)在第1至9位和第13位至21位分別最大1個和4個錯配；和4)當amiRNA和靶RNA雜交是具有小於-30kcal mol-1的預測的自由能(△G)(Ossowski et.al.,2008)。對於基因特異性的表現降低，在這樣的區域選擇候選amiRNA序列，其在比對OsROS1a的全部同源物時顯示最低的同源性，因此降低脫靶降低ROS1同源物和部分同源物的表現的可能。水稻miR395(Guddeti et al.,2005；Jones-Rhoades and Bartel,2004；Kawashima et al.,2009)可以選擇為用於插入amiRNA序列的amiRNA主鏈。為了設計和製備構築體，miR395中的五個內源miRNA靶被用於TA2減量的五個amiRNA靶替換。
共抑制
基因能夠抑制相關內源基因和/或已經存在於基因體中的轉基因的表現，該現象稱為同源性-依賴型基因沉默。大部分的同源性依賴型基因沉默的例子分為兩類-作用於轉基因的轉錄水平的那些，以及轉錄後作用的那些。
轉錄後同源性依賴型基因沉默(即，共抑制)描述了轉基因植物中轉基因和相關內源的或病毒基因的表現的喪失。共表現經常但不總是在轉基因轉錄物豐富時發生，且其通常被認為是在mRNA加工、定位和/或降解層次上被觸發。存在若干模型解釋共抑制如何工作(見Taylor,1997)。
共抑制涉及以針對用於其表現的啟動子的正義方向向植物導入額外複本的基因或其片段。所述正義片段的大小、其與靶基因區域的對應性以及其與靶基因的序列同一性程度可以由本領域技術人員確定。在一些例子中，所述額外複本的基因序列干擾靶植物基因的表現。實施共抑制的方法 參考WO 97/20936和EP 0465572。
反義多核苷酸
術語“反義多核苷酸”應當被認為意思為與編碼內源多肽的特定mRNA分子至少一部分互補的且能夠干擾轉錄後事件例如mRNA轉譯的DNA或RNA分子。反義方法的使用時本領域公知的(see for example,G.Hartmann and S.Endres,Manual of Antisense Methodology,Kluwer(1999))。反義技術在植物中的使用已經由Bourque(1995)and Senior(1998)綜述。Bourque(1995)列出了如何在植物系統中利用反義序列作為基因失活的方法的大量實例。Bourque還表示獲得任何酶活性的100%抑制可能是不必要的，因為部分抑制將更可能在所述系統中導致可測量的改變。Senior(1998)表示反義方法現在是十分良好建立的用於操作基因表現的技術。
在一實施方式中，反義多核苷酸在生理學條件下雜交，即是，所述反義多核苷酸(其是完全或部分單鏈)至少能夠在細胞中正常條件下與編碼內源ROS1a多肽的mRNA形成雙鏈多核苷酸。
反義分子可以包括對應於結構基因的序列或影響對基因表現或剪接事件的控制的序列。例如，所述反義序列可以對應於內源基因的靶向的編碼序列，或5’-非轉譯序列(UTR)或3’-UTR或這些的組合。其可以與內含子序列部分互補，內含子序列在轉錄期間或之後會被剪切掉，較佳地僅僅與靶基因的外顯子序列互補。鑒於UTR通常更高的多樣性，靶向這些區域提供基因抑制的更高的特異性。
反義序列的長度應當為至少19個連續的核苷酸，較佳至少30個或至少 50個核苷酸，且更佳地，至少100個、200個、500個或1000個核苷酸。可以使用與整個基因轉錄物互補的全長序列。長度最佳是100-2000個核苷酸。反義序列與靶向的轉錄物的同一性程度應當為至少90%且更佳95-100%，一般是100%相同。所述反義RNA分子當然可以包含不相關序列，其功能為穩定所述分子。
使用位點特異性核酸酶的基因體編輯
基因體編輯使用工程化的核酸酶，其包含與非特異性DNA切割模塊融合的序列特異性DNA結合結構域。這些嵌合的核酸酶使得可以進行高效和精准遺傳修飾，通過誘導靶向的DNA雙鏈缺口，刺激細胞內源細胞DNA修復機制以修復所誘導的缺口。這樣的機制包括，例如，易錯非同源末端連接(NHEJ)和同源性指導的修復(HDR)。
在存在具有延伸的同源臂的供體質體時，HDR能夠導致導入單個或多個轉基因以校正或替換現在的基因。在不存在供體質體時，NHEJ介導的修復對靶產生小的插入或缺失突變，其導致基因斷裂。
本發明的方法中有用的工程化核酸酶包括鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄激活因子-樣(TAL)效應物核酸酶(TALEN)和CRISPR-Cas9類型位點特異性核酸酶。
一般而言，核酸酶編碼基因通過質體DNA、病毒載體或體外轉錄的mRNA遞送至細胞。使用瑩光替代物報告載體(fluorescent surrogate reporter vector)也允許富集ZFN-、TALEN-或CRISPR修飾的細胞。
複雜基因體經常含有多複本的預目標DNA靶相同或高度同源的序列， 可能導致脫靶活性和細胞毒性。為解決該問題，基於結構(Miller et al.,2007；Szczepek et al.,2007)和基於選擇(Doyon et al.,2011；Guo et al.,2010)的方法可以用來產生改良的ZFN和TALEN異二聚體，其具有優化的切割特異性和降低的毒性。
根據本發明的一較佳實施方式，為了通過ZFN靶向遺傳重組或突變，必須自宿主DNA中鑒別出兩個9bp的鋅指DNA識別序列。這些識別位點可以是彼此顛倒的方向並且由大約6bp的DNA分開。然後通過設計和產生特異性地在靶基因體結合DNA的鋅指組合，然後將所述鋅指連接至DNA切割結構域來生成ZFN。
轉錄激活因子-樣(TAL)效應物核酸酶(TALEN)包含TAL效應物DNA結合結構域和核酸內切酶結構域。
TAL效應物是植物致病細菌的蛋白，其被所述病原體注射進植物細胞，其中它們轉移進核並作為轉錄因子來啟動特定植物基因。TAL效應物的一級胺基酸序列指定其結合的核苷酸序列。因此，可以預測TAL效應物的靶位點，且出於結合特定核苷酸序列的目的，可以工程化並產生TAL效應物。
與TAL效應物編碼核酸序列融合的是編碼核酸酶或核酸酶一部分的序列，一般是II型限制性內切核酸酶如FokI的非特異性切割結構域(Kim et al.,1996)。其他有用的內切核酸酶可以包括，例如，HhaI、HindIII、Nod、BbvCI、EcoRI、BglI、和AlwI。可以利用一些內切核酸酶(如，FokI)僅僅作為二聚體起作用的事實來增強TAL效應物的靶特異性。例如，在一些例子中，每個FokI單體可以與識別不同DNA靶序列的TAL效應物序列融合，且僅僅當兩 個識別位點緊密相鄰時，失活的單體靠在一起產生功能性酶。通過要求DNA結合來激活核酸酶，可以產生高度位點特異性的限制性酶。
序列特異性TALEN可以識別細胞中預先選定的靶核苷酸序列內的特定序列。因此，在一些實施方式中，可以針對核酸酶識別位點掃描靶核苷酸序列，且基於靶序列可以選擇具體的核酸酶。在另外的例子中，TALEN可以被工程化為靶向特定的細胞序列。
核酸構築體
本發明包括含有本發明的多核苷酸或可用於本發明的多核苷酸的核酸構築體，以及含有這些的載體和宿主細胞，產生和使用它們的方法，以及其用途。
本發明涉及可操作地連接(conected)或連接(linked)的元件。“可操作地連接(operably connected)”或“可操作地連接(operably linked)”等指的是多核苷酸以功能關係的連接。一般而言，可操作地連接的核酸序列是連續地連接的，且如果需要拼接兩個蛋白編碼區，連續且符合讀框地連接。當RNA聚合酶將兩個編碼序列轉錄成單一RNA，如果轉譯則然後轉譯成具有來自兩個編碼序列的胺基酸的單一多肽，則編碼序列可操作地連接於另一編碼序列。編碼序列不必相互連續，只要所表現的序列最終被加工產生所需的蛋白。
如本文所用，術語“順式作用序列”、“順式作用元件”或“順式調控區域”或“調控區域”或類似術語應當被認為是意指核苷酸的任何序列，其當相對於可表現的遺傳序列合適地放置或連接，能夠調控(至少部分 地)所述遺傳序列的表現。本領域技術人員將明白順式調控區域可以能夠在轉錄或轉錄後水平上激活、沉默、增強、抑制或者改變基因序列的表現水平和/或細胞類型特異性和/或發育特異性。在本發明的一較佳實施方式中，所述順式作用序列是激活子序列，其增強或刺激可表現的遺傳序列的表現。
將啟動子或增強子元件”可操作地連接”至可轉錄多核苷酸指的是將所述可轉錄多核苷酸(如蛋白編碼多核苷酸或其他轉錄物)置於啟動子的調節控制下，啟動子然後控制該多核苷酸的轉錄。在異源啟動子/結構基因組合的構建中，通常較佳將啟動子或其變體置於離所述可轉錄多核苷酸的轉錄起始位點一段距離，所述距離大約與該啟動子和其在天然設定下控制的蛋白編碼區域(即該啟動子所衍生自的基因)之間的距離相同。如本領域已知，該距離可以做出一些變化而不喪失功能。類似地，調控序列元件(如，操縱子、增強子等)相對於待置於其控制下的可轉錄多核苷酸的較佳位置通過所述元件在其天然設定(即其所衍生自的基因)中的位置來定義。
如本文所用，“啟動子”或“啟動子序列”指的是基因的一個區域，通常在RNA編碼區域的上游(5’)，其在感興趣的細胞中控制轉錄的起始和水平。“啟動子”包括經典基因體基因的轉錄調控序列，例如TATA盒和CCAAT盒序列，以及反應於發育和/或環境刺激或以組織特異性或細胞類型特異性的方式改變基因表現的額外的調控元件(即上游激活序列、增強子和沉默子)。啟動子通常但不一定(如一些PolIII啟動子)被置於其調控表現的結構基因的上游。此外，所述包含啟動子的調控元件通常置於基因的轉錄起始位點2kb內。啟動子可以含有額外的特定調控元件，位於起始位點更遠端以進一步增強在細胞中的表現，和/或改變其可操作連接的結構基因的表 現時間和誘導性。
“組成型啟動子”指的是指導可操作地連接的可轉錄序列在生物體如植物的許多組織或全部組織中表現的啟動子。如本文所用，術語組成型並不一定表示基因在全部細胞類型中以相同水平表現，而是所述基因在廣範圍的細胞類型中表現，不過經常可檢測到一些水平差異。“選擇性表現”如本文所用指的是差不多專門地在例如植物的特定器官(例如，胚乳、胚、葉、果實、塊莖或根)表現。在一較佳實施方式中，啟動子選擇性地或優先地在植物(較佳水稻植物)的穀粒中表現。選擇性表現因此與組成型表現相反，組成型表現指的是在植物經歷的大多數或全部條件下在植物的許多或全部組織中表現。
選擇性表現也可以導致基因表現的產物被分隔於特定植物組織、器官或發育階段。分隔於特定的亞細胞位置例如色素體、細胞質液、液泡或質外(apoplastic)空間可以通過在基因產物的結構中包含合適的信號來實現，例如，信號肽，用於運輸進所需的細胞區室，或者在半自主細胞器(色素體和粒線體)的情況下，通過將轉基因和合適的調控序列直接整合進所述細胞器基因體。
“組織特異性啟動子”或“器官特異性啟動子”這樣的啟動子，相對於例如植物中的許多其他組織或器官(較佳如果不是全部則大部分其他組織或器官)，其優先地在一種組織或器官表現。一般而言，所述啟動子在特定組織或器官中以比其它組織或器官高10倍的水平表現。
適合用於本發明的種子特異性啟動子是油菜蕓薹素基因啟動子(US 5,608,152)、蠶豆(Vicia faba)USP啟動子(Baumlein et al.,1991)、擬南芥油質 蛋白啟動子(WO 98/45461)、菜豆(Phaseolus vulgaris)菜豆球蛋白啟動子(US 5,504,200)、蕓薹(Brassica)Bce4啟動子(WO 91/13980)或豆球蛋白B4啟動子(Baumlein et al.,1992)，以及導致在水稻等中的種子特異性表現的啟動子。特別合適的啟動子是大麥LPT2或LPT1基因啟動子(WO 95/15389和WO 95/23230)或描述於WO 99/16890的啟動子(來自大麥醇溶蛋白基因的啟動子)。其它啟動子包括Broun et al.(1998)、Potenza et al.(2004)、US 20070192902和US 20030159173描述的那些。在一實施方式中，所述種子特異性啟動子優先地在種子的限定部分例如胚乳，較佳發育中的糊粉層中表現。在另一實施方式中，所述種子特異性啟動子在種子萌發後不表現或僅僅以低水平表現。
在一實施方式中，所述啟動子至少在開花和開花後7天的時間之間的時間點是有活性的，或在整個該時期期間是有活性的。這樣的啟動子的實例是ROS1a基因啟動子。
在一實施方式中，所述可操作地連接於降低ROS1a基因表現的外源多核苷酸的啟動子不是高MW麥穀蛋白啟動子。
本發明考慮的啟動子可以對於待轉形的宿主植物是天然的，或者可以衍生自替代來源，其中所述區域在宿主植物中是有功能的。其它來源包括農桿菌T-DNA基因，例如用於胭脂鹼、章魚鹼(octapine)、甘露鹼生物合成的基因的啟動子，或者其它冠癭鹼啟動子，組織特異性啟動子(見例如，US 5,459,252和WO 91/13992)；來自病毒(包括宿主特異性病毒)的啟動子，或部分或全部合成啟動子。本領域公知許多在單子葉和雙子葉植物中有功能的啟動子(見例如，Greve,1983；Salomon et al.,1984；Garfinkel et al.,1983； Barker et al.,1983)；包括分離自植物和病毒的啟動子如花椰菜花葉病毒啟動子(CaMV 35S,19S)。用於評價啟動子活性的非限制性方法公開於Medberry et al.(1992和1993),Sambrook et al.(1989，同上)和US 5,164,316。
可選地或額外地，所述啟動子可以是誘導型啟動子或發育調節的啟動子，器能夠驅動導入的多核苷酸在例如植物的合適發育階段表現。其它可採用的順式作用序列包括轉錄和/或轉譯增強子。增強子區域是本領域技術人員熟知的，且可包括ATG轉譯起始密碼子和鄰近序列。當被包含時，所述起始密碼子應當與涉及外來或外源多核苷酸的編碼序列符合讀框以確保整個序列的轉譯(如果其是待轉譯)。可以從轉錄起始區域的來源或從外來或外源多核苷酸提供轉譯起始區域。所述序列還可以衍生自選為驅動轉錄的啟動子的來源，且可以被特別地修飾以便增加mRNA的轉譯。
本發明的核酸構築體可以包含約50至1000個核苷酸鹼基對的3’非轉譯序列，其可以包括轉錄終止序列。3’非轉譯序列可以含有轉錄終止信號，其可包含或可不包含多腺苷酸化信號以及能夠影響mRNA加工的其它調控信號。多腺苷酸化信號作用為向mRNA前體的3’末端添加多腺苷酸束。多腺苷酸化信號通常識別為與規範形式5’AATAAA-3’存在同源性，儘管變異不常見。不包括多腺苷酸化信號的轉錄終止序列包括PolI或PolIII RNA聚合酶的終止子，其包含連續的四個或更多個胸苷。合適的3’非轉譯序列的實例是來自根癌土壤農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的章魚鹼合酶(ocs)基因或胭脂鹼合酶(nos)基因的含有多腺苷酸化信號的3’轉錄的非轉譯區(Bevan et al.,1983)。合適的3’非轉譯序列也可以衍生自植物基因，例如核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)基因，不過也可以使用本領 域技術人員已知的其它3’元件。
由於插入於轉錄起始位點和編碼序列起點之間的DNA序列，即非轉譯5’前導序列(5’UTR)，能夠影響基因表現(如果其被轉錄和轉譯)，也可以採用特定的前導序列。合適的前導序列包括含有選擇為指導外來或內源DNA序列的最優表現的序列的那些。例如，這樣的前導序列包括較佳的共同序列，其能夠增加或維持mRNA穩定性且防止不合適的轉譯起始，例如描述於Joshi(1987)。
載體
本發明包括用於操作或轉移遺傳構築體的載體的用途。“嵌合載體”是指核酸序列可以插入或選殖進去的核酸分子，較佳DNA分子，其例如衍生自質體、噬菌體或植物病毒。載體較佳地是雙鏈DNA且含有一或多個唯一的限制性位點且可以能夠在限定的宿主細胞包括靶細胞或組織或其祖先細胞或組織中自主複製，或者能夠整合進限定的宿主的基因體中使得選殖的序列能夠複製。因此，載體可以是自主複製型載體，即以染色體外實體存在的載體，其複製獨立於染色體複製，例如線性的或閉環質體，染色體外元件、微型染色體或人工染色體。載體可含有確保自我複製的任何工具。可選地，所述載體可以是當導入細胞時，其被整合進受體細胞的基因體並且和其被整合進的染色體一起複製的載體。載體系統可以包含單一載體或質體，兩種或更多種載體或質體(其一起含有待轉入宿主細胞的總DNA)，或轉位子。載體的選擇一般取決於載體和所述載體待導入的細胞的相容性。載體還可以包括選擇標記例如抗生素抗性基因、除草劑抗性基因或其 它能用來選擇合適的轉形株的基因。這樣的基因的實例是本領域技術人員熟知的。
本發明的核酸構築體可以被導入至載體例如質體中。質體載體一般包括額外的核酸序列使得表現盒可以在原核細胞和真核細胞中容易選擇、擴增和轉形，例如pUC-衍生的載體、pSK-衍生的載體、pGEM-衍生的載體、pSP-衍生的載體、pBS-衍生的載體、或含有一或多個T-DNA區域的雙元載體。額外的核酸序列包括允許載體自主複製的複製原點；選擇標記基因，較佳編碼抗生素或除草劑抗性；獨特的多選殖位點，提供多個位點以插入核酸序列或核酸構築體中編碼的基因；和增強原核和真核(特別是植物)細胞轉形的序列。
“標記基因”是指賦予表現所述標記基因的細胞不同表型且因此允許這樣轉形的細胞和不含有所述標記的細胞區分開的基因。選擇標記基因賦予這樣的性狀，使得因此能夠基於對選擇劑(例如除草劑、抗生素、放射性標記、熱或其它傷害未轉形的細胞的處理)的抗性而進行“選擇”。選擇標記基因(或報告基因)賦予這樣的性狀，使得能夠通過觀察或測試，即通過“篩選”而進行鑒別(例如未轉形的細胞中不存在的β-半乳糖苷酶、瑩光素酶、GFP或其它酶活性)。標記基因和感興趣的核苷酸序列不必是連接的。
為了有利於鑒別轉形株，作為外來或外源多核苷酸或除了外來或外源多核苷酸之外，期望核酸構築體包含可選擇的或可篩選的標記基因。標記的實際選擇不是關鍵的，只要其與選擇的植物細胞組合是有功能的(即，選擇性的)。標記基因和感興趣的外來或外源多核苷酸不一定是連接的，因為未連接的基因的共轉形(例如描述於US 4,399,216)也是植物轉形中有效的方 法。
細菌選擇標記的實例是賦予抗生素抗性的標記，例如胺苄青黴素、紅黴素、氯黴素或四環素抗性，較佳卡那黴素抗性。用於植物轉形的選擇的例示性選擇標記包括但不限於hyg基因，其編碼潮黴素B抗性；新黴素磷酸轉移酶(nptII)基因，其賦予對卡那黴素、巴龍黴素、G418的抗性；來自鼠肝的麩胱甘肽-S-轉移酶基因，賦予對麩胱甘肽衍生的除草劑(例如描述於EP 256223)的抗性；麩醯胺酸合成酶基因，過度表現時賦予對麩醯胺酸合成酶抑制劑(例如草丁膦，描述於WO 87/05327)的抗性；來自Streptomyces viridochromogenes的乙醯轉移酶基因，賦予對選擇劑草丁膦的抗性，例如描述於EP 275957；編碼5-烯醇式丙酮醯莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的基因，賦予對N-膦醯甲基甘胺酸的耐受性，例如描述於Hinchee et al.(1988)；bar基因，賦予對雙丙氨磷的抗性，例如描述於WO91/02071；腈水解酶基因例如來自臭鼻桿菌(Klebsiella ozaenae)的bxn，其賦予對溴苯腈的抗性(Stalker et al.,1988)；二氫葉酸還原酶(DHFR)基因，賦予對胺甲喋呤的抗性(Thillet et al.,1988)；突變體乙醯乳酸合酶基因(ALS)，其賦予對咪唑啉酮、磺醯脲或ALS-抑制性化學品的抗性(EP 154,204)；突變的胺基苯甲酸酯合酶基因，賦予對5-甲基色胺酸的抗性；或茅草枯脫鹵素酶基因，賦予對除草劑的抗性。
較佳的可篩選標記包括但不限於編碼β-葡糖苷酸酶(GUS)的uidA基因，其已知多種顯色基質；編碼顯色基質已知的β-半乳糖苷酶基因；水母瑩光素(aequorin)基因(Prasher et al.,1985)，其可用於鈣敏感的生物瑩光檢測；綠色瑩光蛋白基因(Niedz et al.,1995)或其衍生物；螢光素酶(luc)基因(Ow et al.,1986)，其允許生物瑩光檢測；以及其它本領域已知的可篩選標記。本說明 書所用的“報導分子”是指通過其化學性質，提供分析學可鑒別的信號的分子，該信號有利於通過參考蛋白產物測定啟動子活性。
較佳地，核酸構築體被穩定地併入進例如本發明的植物或細胞的基因體。因此，所述核酸包含允許所述分子被併入進基因體的合適的元件，或所述構築體被置於合適的載體中，所述載體能夠被併入植物細胞的染色體。
本發明的一實施方式包括重組載體，其包括至少一個本發明的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子被插入進任何能將核酸分子遞送進宿主細胞的載體。這樣的載體含有異源核酸序列，其是並不天然地發現與本發明的核酸分子鄰近的核酸序列，且較佳地衍生自除了所述核酸分子衍生自的物種之外的物種。所述載體可以是RNA或DNA，是原核的或真核的，且典型地是病毒或質體。
許多適於穩定轉染植物細胞或適於建立轉基因植物的載體已經描述於例如Pouwels et al.,Cloning Vectors：A Laboratory Manual,1985,supp.1987；Weissbach and Weissbach,Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,1989；和Gelvin et al.,Plant Molecular Biology Manual,Kluwer Academic Publishers,1990。一般而言，植物表現載體包括，例如，在5’和3’調控序列的轉錄控制下的一或多個選殖的植物基因和顯性選擇標記。這樣的植物表現載體還可含有啟動子調控區域(如控制誘導型或組成型表現、環境調節或發育調節表現、或細胞或組織特異性表現的調控區域)、轉錄起始位點、核糖體結合位點、RNA加工信號、轉錄終止位點、和/或多腺苷酸化信號。
ROS1a多肽的水平可以通過降低水稻植物中編碼所述蛋白的基因的表現水平來調節，導致增加的糊粉層厚度。基因的表現水平可以通過改變每 細胞的複本數來調節，例如通過導入合成的遺傳構築體，所述構築體包含編碼序列和與其可操作連接且在細胞中有功能的轉錄控制元件。可以選擇和篩選那些具有良好的轉基因表現水平和/或特異性的多種轉形株，其產生於轉基因整合位點附近的內源序列的影響。轉基因表現的良好水平和模式是導致增加的糊粉層厚度的水平和模式。可選地，可以針對具有增加的糊粉層厚度的個體株系選擇來自育種程序的經誘變的種子群體或植物群體。
重組細胞
本發明的另一實施方式包括重組細胞，其包含用本發明的一或多個重組分子轉形的宿主細胞，或其子代細胞。將核酸分子轉形進細胞可以通過任何方法實現，通過所述方法能夠將核酸分子插入細胞。轉形技術包括但不限於，轉染、電穿孔、顯微注射、脂轉染、吸附和原生質體融合。重組細胞可以保持單細胞或可以生長成組織、器官或多細胞生物體。本發明的經轉形的核酸分子可以保持在染色體外，或能夠以保留它們被表現的能力的方式整合進轉形的(即重組的)細胞的染色體的一或多個位點。較佳的宿主細胞是植物細胞，更佳水稻細胞。
具有遺傳變異的植物
本文用作名詞的術語“植物”意指完整植物並且意指植物界的任何成員，但用作形容詞時指的是存在於、獲得自、衍生自或涉及植物的任何物質，例如，植物器官(如葉、莖、根、花)、單細胞(如花粉)、種子、植物細胞等。根和枝條(shoot)從其出現的小植株和萌發的種子也包括在“植物”的 含義內。術語“植物部分”如本文所用指的是一或多個植物組織或器官，其獲得自植物且其包含植物的基因體DNA。植物部分包括營養性結構(例如葉、莖)、根、花器官/結構、種子(包括胚、子葉和種皮)、植物組織(例如維管組織、基本組織等)、細胞和它們的子代。如本文所用，“植物細胞”指的是獲得自植物或在植物中的細胞，且包括原生質體或衍生自植物的其它細胞、產配子細胞以及再生成完整植物的細胞。植物細胞可以是培養中的細胞。“植物組織”是指植物中的或獲得自植物的(外植體)分化的組織，或衍生自未成熟或成熟的胚、種子、根、枝條、果實、塊莖、花粉、腫瘤組織(如冠癭瘤)以及多種形式的培養中的植物細胞的聚集物(如癒傷)的未分化組織。種子中的或來自種子的例示性植物組織為子葉、胚和胚軸。本發明因此包括植物和植物部分和包含這些的產品。
術語“穀粒”和“種子”在本文中可互換使用。“穀粒”根據上下文可以指植物中成熟的穀粒，植物中發育中的穀粒，收穫的穀粒，或指加工(如研磨或拋光)後其中大部分穀粒保持完整的穀粒，或指吸脹或萌發後的穀粒。成熟的穀粒通常具有少於約18-20%的水分含量。在一實施方式中，本發明的發育中的穀粒為授粉後至少10天(DAP)。在一實施方式中，本發明的發育中的穀粒至少包括開花和開花後七天之間的穀粒。
本文所用“轉基因植物”指的是具有本文所限定的一或多個遺傳變異的植物，例如含有在相同物種、品種或栽培種的野生型植物中沒有發現的核酸構築體。也就是，轉基因植物(經轉形的植物)含有它們在轉形之前不含的遺傳材料(轉基因)。所述轉基因可以包括獲得自或衍生自植物細胞、或另一種植物細胞、或非植物來源的遺傳序列或合成的序列。一般而言，所述 轉基因已經通過人工操作被導入進植物，例如通過轉形，但是如本領域技術人員所承認，也可以使用任何方法。所述遺傳材料較佳地穩定整合進植物的基因體。所導入的遺傳材料可以包含相同物種天然存在的序列，但以重排的順序或以元件的不同排列(例如反義序列。含有這樣的序列的植物以“轉基因植物”包括在本文。
“非轉基因植物”是沒有通過重組DNA技術導入遺傳材料而遺傳修飾的植物。
如本文所用，“野生型”指的是沒有根據本發明進行修飾的細胞、組織、穀粒或植物。野生型細胞、組織或植物用作對照以比較外源核酸的表現水平或和如本文描述修飾的細胞、組織、穀粒或植物比較性狀修飾的程度和性質。
如本文所用，術語“相應的野生型”水稻植物或穀粒或類似語句，指的是包含本發明的水稻植物或穀粒的至少50%、更佳至少75%、更佳至少95%、更佳至少97%、更佳至少99%及甚至更佳99.5%的基因型的水稻植物或穀粒，但是不包含所述一或多個遺傳變異(例如導入的遺傳變異)和/或增厚的糊粉層，所述一或多個遺傳變異各自在植物或穀粒中降低ROS1a基因的活性。在一實施方式中，本發明的水稻穀粒或植物相對於野生型水稻穀粒或植物，除了所述一或多個遺傳變異(如導入的遺傳變異)外是等基因的。較佳地，所述相應的野生型植物或穀粒與本發明的植物/穀粒的祖先屬□/來自相同的栽培種或品種，或是缺乏所述一或多個遺傳變異和/或不具有增厚的糊粉層的姊妹植物株系，經常稱作“分離子(segregant)”。在一實施方式中，本發明的水稻植物或穀粒具有與水稻栽培種中花11(ZH11)的基因型同一性 小於50%的基因型。ZH11自從1986年就已經商購可得。
如本發明上下文所定義的轉基因植物包括已經用重組技術遺傳修飾的水稻植物的子代，其中所述子代包含感興趣的基因。這樣的子代可以通過初代轉基因植物的自交獲得或通過這樣的植物和另一種水稻植物雜交獲得。這通常是為了在期望的植物或植物器官中調節至少一種本文定義的蛋白的產生。轉基因植物部分包括全部部分以及所述植物包含所述轉基因的細胞，例如，培養的組織、癒傷和原生質體。
如本文所用，術語“水稻”指的是稻(Oryza)屬的任何物種，包括其祖先，以及其通過和其它物種雜交產生的子代。較佳地所述植物是商業化栽培的稻屬物種，比如水稻(Oryza sativa)的或適於商業化生產穀粒的株系或栽培種或品種。
如本文所用，“褐米”指的是水稻包括麩皮層和胚(胚芽)的整個穀粒，但不包括穀殼，穀殼通常在收穫期間已經被去除。也即是，褐米沒有被拋光以去除糊粉層和胚。“褐”指的是在麩皮層存在褐色或黃褐色色素。褐米被認為是全穀粒。如本文所用，“白米”(研磨的米)意指已經從其去除麩皮和胚芽的水稻穀粒，即基本上全水稻穀粒的澱粉質胚乳。水稻穀粒的這些分類均可以有短、中等或長穀粒形式。與白米相比，褐米具有較高含量的蛋白質、礦物質和維生素以及在其蛋白質含量中較高的離胺酸含量。
如本文所用，“著色米”包括黑米和紅米，其各自在糊粉層含有色素，例如原花青素類(單寧類)。著色米比非著色米具有更高的核黃素含量，但具有類似的硫胺素(thimine)含量。“黑米”由於花青苷類而具有黑色或幾乎黑色的麩皮層，且可以在煮了之後變成深紫色。“紫米”(也已知為“禁米”) 是黑米的短穀粒變體，且包括在本文定義的黑米中。其在未煮狀態是紫色，而煮了是深紫色。“紅米”含有多種花青苷類，其給出麩皮紅/褐紅的顏色，包括矢車菊素-3-葡糖苷(菊色素)和芍藥花青素-3-葡糖苷(oxycoccicy-anin)。
這些類型的水稻穀粒各自可以被處理以防止萌發，例如通過煮(沸騰)或通過乾燥加熱。褐米和著色米一般煮20-40分鐘，取決於期望的結構，而白米一般煮12-18分鐘。煮或加熱降低水稻穀粒中抗營養因子例如胰蛋白酶抑制劑、水稻巰基蛋白酶抑制劑(oryzacystatin)和血凝素(凝集素)的水平，其通過變性這些蛋白，但是不降低植酸鹽的含量。如本領域已知的，水稻穀粒在煮之前可以在水中浸泡，或者慢煮更長時間。水稻穀粒還可以被破碎、煮半熟(parboiled)或熱穩定化。水稻麩可以被蒸汽處理以穩定它，例如在100℃約6分鐘。
在一實施方式中，本發明的穀粒與相應的野生型穀粒相比具有延遲的穀粒成熟。延遲的成熟可以通過使用結實率(%)測定，結實率必須計算穀粒成熟期之前植物中被種子填充的小花的百分比。
在一實施方式中，本發明的穀粒與相應的野生型穀粒相比具有增加的萌發能力。例如，在生長室中無濕度控制在28℃，12h光/12h暗循環下，所述穀粒具有相應的野生型穀粒約70%至約80%，或約75%，較佳70%至100%的萌發能力如本文所用，術語“萌發”定義為根穿過種皮可視地出現的時候。
在一實施方式中，本發明的植物相對於野生型親本品種(例如包含SEQ ID No：2所示胺基酸序列的ROS1a多肽的等基因植物)具有正常植物高、育性(雄性和雌性)、穀粒大小和千粒重中的一或多種或全部。在一實施方式 中，本發明的穀粒能夠產生具有以下一或多種或全部的植物：相對於野生型親本品種的正常植物高、育性(雄性和雌性)、穀粒大小和千粒重。如本文所用，術語“正常”可通過測量與本發明的植物在相同條件下生長的野生型親本品種的同一性狀來確定。在一實施方式中，為了是正常的本發明的植物與野生型親本品種相比具有所限定特徵的水平/數目等的+/- 10%，更佳+/- 5%，更佳+/- 2.5%，甚至更佳+/- 1%。
轉基因植物，如本發明上下文所定義包括植物(以及所述植物的部分和細胞)和它們的子代，其已經使用重組技術遺傳修飾以在期望的植物或植物器官中導致產生至少一種本發明的多肽。轉基因植物可以使用本領域已知的技術產生，例如一般描述於A.Slater et al.,Plant Biotechnology-The Genetic Manipulation of Plants,Oxford University Press(2003)和P.Christou and H.Klee,Handbook of Plant Biotechnology,John Wiley and Sons(2004)的那些。
在一較佳實施方式中，所述轉基因植物對於各個或每個已經被導入的基因或核酸構築體(轉基因)是同基因型組合的，使得它們的子代不對期望的表型分離。所述轉基因植物還可以對所導入的轉基因是雜合的，例如，從雜交種子生長而來的F1子代。這樣的植物可以提供例如本領域公知的優勢如雜種優勢。
在一實施方式中，選擇本發明的水稻植物的方法還包括針對至少一個“其它遺傳標記”分析來自所述植物的DNA樣品。如本文所用，所述“其它遺傳標記”可以是與植物的期望性狀連鎖的任何分子。這樣的標記是本領域技術人員熟知的且包括與決定性狀的基因連鎖的分子標記，所述性狀例如疾病抗性、產量、植物形態、穀粒質量、休眠性狀、穀粒顏色、種子 中赤黴酸含量、植物高、花顏色等。這樣的基因的實例是Rht基因，其決定半矮化生長習性並因此決定倒伏抗性。
已經描述了四種直接遞送基因進細胞的一般方法：(1)化學方法(Graham et al.,1973)；(2)物理方法如顯微注射(Capecchi,1980)；電穿孔(見例如，WO 87/06614，US 5,472,869、5,384,253，WO 92/09696和WO 93/21335)；以及基因槍(見例如，US 4,945,050和US 5,141,131)；(3)病毒載體(Clapp,1993；Lu et al.,1993；Eglitis et al.,1988)；和(4)受體介導的機制(Curiel et al.,1992；Wagner et al.,1992)。
可以使用的加速方法包括，例如微粒轟擊等。用於遞送轉形核酸分子進植物細胞的方法的一個實例是微粒轟擊。該方法由Yang et al.,Particle Bombardment Technology for Gene Transfer,Oxford Press,Oxford,England(1994)綜述。非生物學顆粒(微粒)可以用核酸包被並通過推進力遞送進細胞。例示性的顆粒包括包含鎢、金、鉑等的那些。除了是可重複地轉形單子葉植物的有效手段，微粒轟擊的特別優勢是無需分離原生質體或對農桿菌感染的易感性。適於本發明使用的顆粒遞送系統是氦氣加速PDS-1000/He槍，可從Bio-Rad Laboratories獲得。為了轟擊，可以將未成熟胚或衍生的靶細胞如來自未成熟胚的盾片或癒傷排列在固體培養基上。
在另一可選實施方式中，可以穩定地轉形色素體。公開用於高等植物中色素體轉形的方法包括顆粒槍遞送含選擇標記的DNA並將所述DNA通過同源重組靶向至色素體基因體(US 5,451,513, US 5,545,818, US 5,877,402, US 5,932479，和WO 99/05265。
農桿菌介導的轉移是用於將基因導入植物細胞的廣泛適用的系統，因 為DNA可以導入至完整植物組織，由此避免需要從原生質體再生完整植物。使用農桿菌介導的植物整合載體來將DNA導入植物細胞是本領域公知的(見例如US 5,177,010、US 5,104,310、US 5,004,863、US 5,159,135)。此外，T-DNA的整合是相對精確的方法，導致很少重排。待轉移的DNA區域由邊界序列限定，而中間的DNA通常被插入至植物基因體。
使用農桿菌轉形方法形成的轉基因一般在一個染色體含有單一遺傳基因座。這樣的轉基因植物可以稱作為對於添加的基因是半合子的。更佳的是對所添加的結構基因是同基因型組合的轉基因植物；即，含有兩個添加的基因的轉基因植物，染色體對的每個染色體上的相同基因座處一個基因。同基因型組合的轉基因植物可以通過使含有單個添加基因的獨立分離的轉基因植物性交配(自交)，萌發所產生種子中的一些並針對感興趣的基因分析獲得的植物。
其它細胞轉形方法也可以使用，且包括但不限於通過直接轉移DNA進花粉，通過直接注射DNA進植物的繁殖器官，或通過直接注射DNA進未成熟胚的細胞隨後再水化乾燥的胚來將DNA導入至植物。
從單植物原生質體轉形株或從不同的轉形外植體再生、發育和栽培植物是本領域公知的(Weissbach et al.,Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,San Diego,(1988))。該再生和生長過程一般包括以下步驟：選擇轉形的細胞，培養那些個體化細胞通過通常的胚發育階段通過生根小植株階段。轉基因胚和種子類似地再生。獲得的轉基因生根苗然後種植於合適的植物生長介質如土壤。
含有外來的、外源基因的植物的發育和再生是本領域公知的。較佳地， 再生的植物自交以提供同基因型組合的轉基因植物。或者，獲得自再生植物的花粉與農藝學重要的品系的種子生長(seed-grown)植物雜交。反過來，來自這些重要品系的植物的花粉用於授粉再生的植物。使用本領域技術人員熟知的方法栽培含有期望的外源核酸的本發明的轉基因植物。
為了確認轉基因在轉基因細胞和植物的存在，可以使用本領域技術人員已知的方法進行聚合酶連鎖反應(PCR)或Southern印漬分析。可以以多種途徑中的任一種檢測轉基因的表現產物，取決於產物的性質，包括Western印漬和酶測定。定量蛋白表現和檢測在不同植物組織的複製的一種特別有用的方式是使用報告基因，例如GUS。一旦獲得了轉基因植物，它們可以被種植以產生具有期望表型的植物組織或部分。可以收穫所述植物組織或植物部分，和/或收集種子。所述種子可以作為生長具有符合期望特性的組織或部分的額外植物的來源。
標記輔助選擇
標記輔助選擇是經典育種程序中當和輪回親本回交時所需的選擇雜合植物的公認方法。每一回交世代的植物群體將對於通常以1：1比例存在於回交群體的感興趣的基因是雜合的，而分子標記能夠用於區分所述基因的兩個等位基因。通過從例如幼苗萃取DNA並用特定標記測試滲入的期望性狀，進行用於進一步回交的植物的早期選擇，同時精力和資源集中於較少的植物。為了進一步加速回交程序，可以從未成熟種子(開花後25天)切下胚並在無菌條件下在營養培養基上生長，而不是允許種子完全成熟。該方法，稱為“胚拯救”，結合在三葉期萃取DNA以及分析改變ROS1a活性並 賦予植物增加的糊粉層厚度的至少一個遺傳變異，允許快速選擇攜帶期望性狀的植物，所述植物可以在溫室或田間養成至成熟，用於進一步與輪回親本回交。
在本發明的所述方法中可以使用本領域已知的任何分子生物學技術。這樣的方法包括但不限於，核酸擴增的使用、核酸定序、核酸和合適地標記的探針雜交、單鏈構形分析(SSCA)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)、異雙鏈體分析(HET)、化學切割分析(CCM)、催化性核酸切割和它們的組合(見例如，Lemieux,2000；Langridge et al.,2001)。本發明也包括使用分子標記技術檢測與改變ROS1a活性並賦予所述植物增加的糊粉層厚度的(例如)ROS1a基因的等位基因連鎖的多型性。這樣的方法包括檢測或分析限制片段長度多型性(RFLP)、RAPD、擴增片段長度多型性(AFLP)和微衛星(簡單序列重複，SSR)多型性。緊密連鎖的標記可以容易地通過本領域公知的方法獲得，例如混合分離子分析(bulked segregant analysis)，如Langridge et al.(2001)所綜述。
在一實施方式中，用於標記輔助選擇的連鎖基因座與編碼本發明的多肽的基因至少在1cM、或0.5cM、或0.1cM或0.01cM以內。
“聚合酶連鎖反應”(PCR)是其中使用由上游和下游引子組成的“引子對”或“引子組”，以及聚合催化劑例如DNA聚合酶(典型是熱穩定聚合酶)製備靶多核苷酸的複製複本的反應。PCR的方法是本領域已知的，並且在“PCR”(M.J.McPherson and S.G Moller(editors),BIOS Scientific Publishers Ltd,Oxford,(2000))中教導。可以在從分離自植物細胞的mRNA反轉錄獲得的cDNA上進行PCR，所述植物細胞表現ROS1a基因或基於其所述植物具 有增加的糊粉層厚度的等位基因。然而，如果在分離自植物的基因體DNA上進行PCR將通常更容易。
引子是能夠以序列特異性方式與靶序列雜交且在PCR中被延伸的寡核苷酸序列。擴增子或PCR產物或PCR片段或擴增產物是包含所述引子和新合成的靶序列複本的延伸產物。多重PCR體系含有多組引子，導致同時產生多於一種擴增子。引子可以與靶序列完美配對或者它們可以含有內部錯配鹼基，其可以導致在特定靶序列導入限制性酶或催化性核酸的識別/切割位點。引子還可以含有額外的序列和/或含有修飾的或標記的核苷酸以利於捕獲或檢測擴增子。DNA熱變性、引子降溫貼合至它們的互補序列、以及聚合酶對降溫貼合的引子的延伸的重複循環導致靶序列的指數擴增。術語靶或靶序列或模板指的是被擴增的核酸序列。
核酸序列直接定序的方法是本領域技術人員公知的並可以例如在Ausubel et al.(同上)和Sambrook et al.(同上)中找到。可以使用任何合適的方法進行定序，例如，雙去氧定序、化學定序或其變形。直接定序具有測定特定序列中任意鹼基對中的變異的優勢。
TILLING
本發明的植物可以使用已知為TILLING(定向誘導基因體局部突變，Targeting Induced Local Lesions IN Genomes)的方法產生。在第一步，通過用化學誘變劑處理種子(或花粉)在植物群體中誘導導入的突變例如新的單鹼基對改變，然後推動植物至其中突變將穩定遺傳的一代。萃取DNA，儲存來自所述群體的所有成員的種子以產生可以隨時間重複獲得的源。
對於TILLING法，PCR引子設計為特異性擴增感興趣的單個基因。如果靶是基因家族的成員或是多型性基因體的一部分，特異性尤其重要。然後，可以使用染料標記的引子從多個個體合併的DNA擴增PCR產物。這些PCR產物被變性並重新降溫貼合以允許形成錯配的鹼基對。錯配，或異雙鏈體，代表天然存在的單核苷酸多型性(SNP)(即來自所述群體的若干植物很可能攜帶相同多型性)和誘導的SNP(即僅僅罕有的個體植物很可能顯示所述突變)。在異雙鏈體形成後，使用識別和切割錯配的DNA的內切核酸酶例如CelI是發現TILLING群體內的新SNP的關鍵。
使用該方法，可以篩選數千的植物以鑒別在任何基因或基因體特定區域具有單鹼基改變以及小插入或缺失(1-30bp)的任何個體。被測定的基因體片段在任何地方大小可以是0.3至1.6kb。在8倍合併、1.4kb片段(扣除SNP檢測由於雜訊而有問題的片段末端)和96泳道每測定，該組合允許每單次測定篩選多達百萬的基因體DNA鹼基對，使得TILLING為高通量技術。
TILLING進一步描述於Slade and Knauf(2005)和Henikoff et al.(2004)。
除了允許有效檢測突變外，高通量TILLING技術對於檢測天然多型性也是理想的。因此，通過與已知序列形成異雙鏈體查詢未知的同源DNA顯示多型性位點的數目和位置。鑒別到核苷酸改變和小插入和缺失，包括至少一些重複數目多型性。這已經被稱為Ecotilling(Comai et al.,2004)。
記錄各SNP其幾個核苷酸內的大概位置。因此，可以基於其移動性將各單倍型建檔。用增加相對小的努力使用用於錯配-切割測定的相同的擴增DNA的等分部分，能夠獲得序列數據。通過其與多型性的接近程度選擇用於單個反應的左或右定序引子。定序儀軟體進行多重比對並發現鹼基改 變，其在各例子中確認凝膠條帶。
相比當前用於大多SNP發現的方法，全定序，Ecotilling可以更便宜地進行。可以篩選含有陣列化的生態型DNA的平板，而不是來自經誘變植物的DNA的合併。因為檢測在凝膠上以接近鹼基對分辨率進行且泳道見背景模式均一，具有相同大小的條帶可以匹配，因此在單一步驟發現並對SNP基因分型。以該方式，SNP的最終定序是簡單和高效的，用於篩選的同一PCR產物可以進行DNA定序使得更是如此。
穀粒加工
由於增厚的糊粉層，本發明的水稻穀粒，和來自其的麵粉和麩，具有改善的營養含量。分離的糊粉層組織應含有低水平的澱粉和果皮，並代表穀粒對人類營養生理學有益的物質的主要部分。例如，與相應的野生型穀粒和/或由其產生的麵粉相比，本發明的穀粒和/或由其產生的麵粉包含以下的一或多種，各自以重量計：i)更高的礦物質含量，例如高至少約20%或至少約25%，較佳所述礦物質含量是鋅(例如高至少約10%或至少約15%)、鐵(例如高至少約10%或至少約15%)、鉀(例如高至少約20%或至少約25%)、鎂(例如高至少約18%或至少約22%)、磷(例如高至少約17%或至少約21%)和硫(例如高至少約5%或至少約8%)中一種或多種或全部的含量，ii)更高的抗氧化劑含量例如多至少約25%，或至少約35%的總酚類化合物，和/或多至少約60%，或至少約70%的親水性抗氧化劑，iii)更好的植酸鹽含量，例如高至少約10%或至少約15%， iv)維生素B3、B6和B9中的一或多種或全部的更高含量，v)更高的膳食性纖維含量和/或可溶性纖維含量(例如高至少約150%，或至少約180%的總纖維)，vi)相對於相應野生型穀粒的澱粉含量，以重量計約90%至約100%的澱粉含量，vii)更高的蔗糖含量，Viii)更高的單糖含量(例如阿拉伯糖、木糖、半乳糖、葡萄糖含量)，比如高至少約1.5倍或至少約2倍，ix)更高的脂肪含量，例如高至少約20%，至少約30%或至少約50%，或約50%，X)類似的氮水平。
穀粒的這些營養成分各自可以使用常規技術測定，例如實施例1和5中概要的。
在一實施方式中，本發明的水稻穀粒和/或從其產生的麵粉包含以下的一或多種或全部，各自按重量計：i)與相應野生型穀粒/麵粉相比多至少約20%、至少約30%或至少約50%，或約50%的脂肪，ii)至少約11mg/g或至少約12mg/g的總植酸鹽，iii)與獲得自相應野生型穀粒的麵粉相比，獲得自所述穀粒的麵粉中多至少約20%或至少約25%的礦物質含量，iv)至少約14mg/kg或至少約15mg/kg的總鋅，v)至少約13mg/kg或至少約13.5mg/kg的總鐵， vi)與相應野生型穀粒/麵粉相比多至少約150%、或至少約180%的總纖維vii)相對於相應野生型穀粒/麵粉的澱粉含量，以重量計約90%至約100%的澱粉含量，viii)與相應野生型穀粒/麵粉相比，高至少約1.5倍或至少約2倍的單糖含量(例如阿拉伯糖、木糖、半乳糖、葡萄糖含量)，比如高至少約1.5倍或至少約2倍，ix)與相應野生型穀粒/麵粉相比，多至少約25%、或至少約35%的總酚類化合物，和/或多至少約60%，或至少約70%的親水性抗氧化劑。
在一實施方式中，與相應野生型穀粒相比，所述穀粒在其總澱粉含量中包含增加比例的直鏈澱粉。產生這樣的穀粒的方法例如描述於WO 2002/037955、WO 2003/094600、WO 2005/040381、WO 2005/001098、WO 2011/011833和WO 2012103594。
在一實施方式中，與相應野生型穀粒相比，本發明的穀粒在其總脂肪酸含量中包含增加比例的油酸和/或降低比例的棕櫚酸。產生這樣的穀粒的方法例如描述於WO 2008/006171和WO 2013/159149。
本發明的穀粒/種子，或本發明的其它植物部分，能夠使用本領域已知的任何技術加工產生食物成分、食物或非食物產品。
如本文所用，“其它食物或飲料成分”指的是適於動物消耗的任何物質，較佳適於人消耗的任何物質，當提供為食物或飲料的一部分的時候。實例包括但不限於，來自其它植物物種的穀粒、糖等，但排除水。
在一實施方式中，所述產品是全穀粒麵粉，例如超細研磨全穀粒麵粉， 或約100%從所述穀粒製備的麵粉。所述全穀粒麵粉包括精製的麵粉組分(精製麵粉或精製麵粉)和粗製部分(coarse fraction)(超細研磨的粗製部分)。
精製麵粉可以是例如通過研磨和篩選淨化的穀粒製備。精製麵粉的顆粒大小描述為麵粉中不少於98%通過具有不大於那些稱為“212測微計(U.S.Wire 70)”的紡織物的開口的織物。粗製部分包括麩和胚芽的至少之一。例如，所述胚芽是在穀粒核(kernel)內發現的胚性植物。所述胚芽包括脂質、纖維、維生素、蛋白質、礦物質和植物素，例如黃酮類。麩包括若干細胞層且具有顯著量的脂質、纖維、維生素、蛋白質、礦物質和植物素，例如黃酮類。此外，所述粗製部分可以包括糊粉層，其也包含脂質、纖維、維生素、蛋白質、礦物質和植物素，例如黃酮類。所述糊粉層，當技術上認為是胚乳的一部分，與麩展現許多相同的特性並因此一般在研磨過程和麩和胚芽一起去除。糊粉層含有蛋白質、維生素和植物素，例如阿魏酸。
此外，所述粗製部分可以和精製麵粉組分混合。所述粗製部分可以和精製麵粉組分混合以形成全穀粒麵粉，因此提供與精製麵粉相比具有增加的營養價值、纖維含量和抗氧化能力的全穀粒麵粉。例如，所述粗製部分或全穀粒麵粉可以不同的量使用來在烘焙商品、零食產品和食物產品中替換精製的或全穀粒麵粉。本發明的全穀粒麵粉(即超細研磨的全穀粒麵粉)還可以直接賣給消費者用於他們的自製烘焙產品。在一例示性實施方式中，所述全穀粒麵粉的顆粒譜使得所述全穀粒麵粉重量計的98%的顆粒小於212測微計。
在另一實施方式中，在所述全穀粒麵粉和/或粗製部分內發現的酶是滅活的以穩定化所述全穀粒麵粉和/或粗製部分。穩定化是一種方法，其使用 蒸汽、熱、輻射或其它處理來滅活在麩和胚芽層中發現的酶。已經被穩定化的麵粉保留其烹飪特性並具有更長的貨架期。
在另外的實施方式中，所述全穀粒麵粉、所述粗製部分或所述精製麵粉可以是食物產品的組分且可以用於產生食物產品。例如，所述食物產品可以是圈餅、軟餅、麵包、小麵包、新月形麵包、餃子、英國松餅、松餅、披塔麵包、速制糕餅、冷藏/冷凍的生麵團產品、生麵團、烘焙的豆類、墨西哥玉米煎餅(burrito)、辣椒、玉米麵豆卷(taco)、tamale、玉蜀黍餅(tortilla)、餡餅(pot pie)、即食穀物、即食餐、填料、可微波餐食、布朗尼、蛋糕、奶酪蛋糕、咖啡蛋糕、點心、甜點、油酥糕點(pastry)、甜圈、糖棒、餡餅殼、餡餅填料、嬰兒食品、烘焙混合物、糊、拌粉、肉汁混合物、肉混合劑、肉替代品、佐料混合物、湯混合物、肉汁、麵粉糊、沙拉裝飾、湯、酸乳酪、麵條、意大利麵、拉麵、炒麵、冰淇淋內含物、冰淇淋棒、冰淇淋錐、夾心冰淇淋、薄脆餅乾、碎麵包片(crouton)、甜甜圈、蛋捲、擠壓式零食、水果和穀物棒、可微波的零食產品、營養棒、烙餅、平價烘焙產品、椒鹽卷餅(pretzel)、布丁、基於格蘭諾拉麥片的產品、零食片、零食、零食混合物、鬆餅、披薩皮、動物食物或寵物食物。
在可選的實施方式中，所述全穀粒麵粉、所述粗製部分或所述精製麵粉可以是營養補充劑的組分。例如，所述營養補充劑可以是被添加至飲食中的產品，其含有一或多種額外的營養成分，一般包括維生素、礦物質、香草、胺基酸、酶、抗氧化劑、香草、香料、益生菌、萃取物、益生質(prebiotics)和纖維。本發明的全穀粒麵粉、粗製部分或精製麵粉包括維生素、礦物質、胺基酸、酶和纖維。例如，所述粗製部分含有濃縮量的膳食性纖維以及其 它必須營養，例如B族維生素、硒、鉻、鎂、錳、和抗氧化劑，其對健康飲食是必需的。例如，22克的本發明的粗製部分輸送一個個體33%的每日推薦消耗纖維。所述營養補充劑可以包括任何已知的營養成分，其將有助於個體的整體健康，實例包括但不限於維生素、礦物質、其它纖維組分、脂肪酸、抗氧化劑、胺基酸、肽、蛋白質、葉黃素、核糖、Ω-3脂肪酸和/或其它營養成分。所述補充劑可以如下形式(但不限於)輸送：即時混合飲料、即飲飲料、營養棒、鬆餅、點心、薄脆餅乾、凝膠補充包(gel shot)、膠囊、咀嚼物、可咀嚼片和丸劑。一個實施方式以奶昔飲料或麥芽類飲料的形式輸送纖維補充劑，該實施方式可能對於兒童纖維補充劑是特別有吸引力的。
在另外的實施方式，可以使用研磨過程來製備多穀粒麵粉或多穀粒粗製部分。例如，來自一種類型穀粒的麩和胚芽可以被研磨並和另一種穀物的研磨的胚乳或全穀粒穀物麵粉混合。可選地，來自一種類型穀粒的麩和胚芽可以被研磨並和另一種穀粒的研磨的胚乳或全穀粒麵粉混合。考慮本發明涵蓋混合一或多種穀粒的麩、胚芽、胚乳核全穀粒麵粉的一或多種的任何組合。該多穀粒方法可以用於製備訂制麵粉並合併多種類型的穀物穀粒的質量和營養含量來製備一種麵粉。
考慮本發明的全穀粒麵粉、粗製部分和/或穀粒產品可以通過本領域已知的研磨方法產生。例示性的實施方式涉及在單一蒸汽中研磨穀粒而不將穀粒的胚乳、麩和胚芽分開至單獨的蒸汽。淨化的和緩和的穀粒被輸送至第一通道磨床，例如錘磨機、輥磨機、針磨機、衝擊式碾磨機、盤磨機、氣流磨、凹口研磨機等。在研磨後，所述穀粒被排出並輸送至篩粉機。此 外，考慮本發明的全穀粒麵粉、粗製部分和/或穀粒產品可以通過多種其它方法被修改或增強，例如：發酵、速溶化、擠壓、包囊化、燒烤、焙燒等。
實施例 實施例1.一般性材料和方法 通過用蘇丹紅溶液染色觀察糊粉層
通過將1g的蘇丹紅IV添加至50ml的聚乙二醇溶液(平均分子量400,Sigma,Cat.No.202398)，在90℃培育1小時並和等體積90%甘油混合製備染色溶液.在去除各穀粒的果實包被物(內稃和外稃)後，成熟水稻穀粒在蒸餾水中培育5小時，然後使用刀片橫向或縱向切片。切片在蘇丹紅溶液中在室溫染色24至72小時。切片然後在室溫用Lugol染色溶液反染20分鐘(Sigma,32922)，在解剖顯微鏡(Sreenivasulu,2010)下觀察。
用依文思(Evans)藍染色糊粉層
通過將0.1g的依文思藍(Sigma,E2129)溶解於100ml蒸餾水而製備依文思藍染色溶液。在去除各穀粒的果實包被物(內稃和外稃)後，成熟水稻穀粒用刀片橫向切片。切片在蒸餾水中室溫培育30分鐘，加入染色液並置於室溫2分鐘。然後丟棄染色溶液，切片用蒸餾水洗滌兩次並在解剖顯微鏡下觀察。
水稻胚乳的光學顯微鏡觀察
水稻穀粒在福爾馬林-醋酸-乙醇(FAA)溶液(60%乙醇，5%冰醋酸和2% 甲醛)，脫氣1小時，在含70%、80%、95%的乙醇溶液系列及然後100%乙醇脫水，用LR白樹脂(Electron Microscopy Sciences,14380)浸潤並在60℃聚合24小時。用Leica UC7切片機完成切片機切片。切片在室溫用0.1%甲苯胺藍溶液(Sigma,T3260)染色2分鐘，然後用蒸餾水洗滌兩次並通過光學顯微鏡檢查。或者，切片在室溫用0.01% Calcofluor white溶液(Sigma,18909)染色2分鐘並通過光學顯微鏡檢查。
用PAS和考馬斯藍染色
載玻片上經固定的切片在預熱的0.4%高碘酸(Sigma,375810)在57℃下培育30分鐘，然後在蒸餾水中漂洗3次。加入希夫試劑(Sigma,3952016)，載玻片在室溫培育15分鐘，然後在蒸餾水中漂洗3次。切片然後在1%考馬斯藍(R-250)ThermoScientific,20278)中在室溫培育2分鐘，並在蒸餾水中漂洗3次。使用含有30%、50%、60%、75%、85%、95%至100%乙醇的醇溶液系列各2分鐘，實現切片的脫水，隨後在50%二甲苯和100%二甲苯溶液(Sigma,534056)中各2分鐘使各載玻片變清楚。然後用Eukitt®快速硬化封片介質(Fluka,03989)對蓋玻片進行封固，並且在光學顯微鏡下觀察切片。
DNA萃取和PCR條件
使用兩種方法從植物葉子樣品萃取DNA：提供較不純的DNA的快速DNA萃取方法和更廣泛的用於更純DNA的DNA萃取方法，修改自Huang(2009)。在第一種方法中，將4顆直徑2mm的玻璃珠(Sigma,273627)、1-2mg的水稻葉組織和150μl的萃取緩衝液(10mM Tris,pH9.5,0.5mM EDTA, 100mM KCl)添加至96孔PCR板的個孔中。然後密封該板並使用Mini-Beadbeater-96混合器(GlenMills,1001)對混合物均質1分鐘。在3000rpm離心5分鐘後，所萃取的含DNA上清液用於PCR反應。
在第二種方法中，兩顆直徑2mm的玻璃珠和0.2g的葉子置於1.5ml的Eppendorf管並在液氮冷卻10分鐘。樣品然後在Mini-Beadbeater-96均質1分鐘，然後向各管加入600μl DNA萃取緩衝液(2% SDS,0.4M NaCl,2mM EDTA,10mM Tris-HCl,pH8.0)並且混合物在65℃培育一小時。在冷卻混合物後，加入450μl的6M NaCl，混合並於12000rpm離心20分鐘。各上清液轉移至新管且使用等體積的2-丙醇於-20℃一小時沉澱DNA。通過在4℃以2400rpm離心20分鐘回收DNA，且沉澱物用75%乙醇洗滌兩次。沉澱物在室溫空氣乾燥，且各自重懸於600μl含10ng/ulRNAse(ThermoScientific,EN0201))的蒸餾水並用於PCR反應。
PCR反應使用5μl的2xPCR緩衝液，其含有Taq聚合酶(ThermoScientific,K0171)、5’和3’寡核苷酸引子和1μl的DNA樣品，總體積10μl。使用35個循環的94℃ 30sec，55℃ 30sec和72℃ 30sec進行擴增。擴增產物使用3%瓊脂糖凝膠通過凝膠電泳進行分析。對照PCR反應使用來自同基因合子中花11(ZH11)(野生型粳稻)、同基因合子NJ6(野生型秈稻)和ZH11與NJ6的混合物的DNA製備物。
對於ta2等位基因的遺傳定位，對遺傳標記的PCR擴增使用以下引子對(5'至3'序列)：INDEL 127(染色體1上的6,343,260位)，正向引子TGAGTAGTTGCGTTGTTCT(SEQ ID NO：15)，反向引子TCTTAGTGAGCCGTTTCT(SEQ ID NO：16)；INDEL 129(染色體上的 6,560,681位)，正向引子CCTTCTGTGCTATGGGTT(SEQ ID NO：17)，反向引子CATGCCAAGACACCACTT(SEQ ID NO：18)；INDEL 128(染色體1上的6,470,027位)，正向引子TGGCTTTGGAAACGGTAG(SEQ ID NO：19)，反向引子TTTAGAGGGATGTGCGTCA(SEQ ID NO：20)；INDEL 149(染色體上的6,427,144位)，正向引子AAACAACGATCCAGCAAA(SEQ ID NO：21)，反向引子TTGGCACCGTATTACTTTC(SEQ ID NO：22)。
TILLING測定
用於TILLING測定的引子具有核苷酸序列：
TA2-1F：ACGCATTCTTCATTGACTGTATGT(SEQ ID NO：23)
TA2-1R：GCCCTTTCAATACAATGACTAGGT(SEQ ID NO：24)
TA2-2F：GAACATTTGAATCATGTTCCTCAC(SEQ ID NO：25)
TA2-2R：ACTATCCTTTGATGCAAGTTCTCC(SEQ ID NO：26)
TA2-3F：GTTGGAAGAGCAGTTAAAGCAAAT(SEQ ID NO：27)
TA2-3R：CTTCGGCAGTGAAATTTAGTAACA(SEQ ID NO：28)
TA2-4F：TACAGAACTTCTACGAATGCAGGA(SEQ ID NO：29)
TA2-4R：GCAACATGAATTGCTAAAGATGAG(SEQ ID NO：30)
使用ExTaq以以下反應條件進行PCR擴增：95℃ 2分鐘；8個循環的94℃ 20s，68℃ 30s(每循環下降1℃)，和72℃每1kb擴增子長度60s，隨後是35個循環的94℃ 20s，60℃ 30s，和72℃每1kb擴增子長度60s，和在72℃ 5分鐘的最終擴增。將來自野生型和測試樣品的PCR產物混合並進行完全 變性-緩慢降溫貼合程序以形成異源雙鏈體，條件如下：99℃ 10分鐘進行變性，隨後70個循環的遞減，從70℃開始，每循環20s，每循環降低0.3℃，然後保持於15℃以重新降溫貼合所述變性的PCR產物以形成異源雙鏈體。降溫貼合的PCR產物的CelI消化在15μL反應混合物中進行，混合物中含有CelI緩衝液(10mM HEPES,pH 7.5,10mM KCl,10mM MgSO4,0.002% Triton X-100，和0.2μg/mL b牛血清白蛋白(BSA),4μL的PCR產物，以及如果PCR產物由ExTaq聚合則1單位CelI(10單位/μL)，或如果PCR產物由KOD聚合則20單位CelI)，45℃ 15分鐘，之後添加3μL的0.5M EDTA(pH 8.0)以終止反應。或者，消化在15-μL反應混合物中進行，所述混合物含有4μL的PCR產物和MBN緩衝液(20mM Bis-Tris,pH 6.5,10mM MgSO4,0.2mM ZnSO4,0.002% Triton X-100，和0.2μg/mL BSA)中的2單位的綠豆核酸酶(MBN,10單位/μL,Cat.No.M0250S；New England Biolabs,USA)，60℃ 30分鐘，之後添加2μL的0.2% SDS以終止反應。
96孔PCR板中的CelI-消化的PCR產物用去離子水稀釋至100μL，且在AdvanCETM FS96儀器(Advanced Analytical Technologies,USA)在9kV進行毛細管電泳，30s預運行，15s用於注射1ng/μL分子量標記75和15kb或50和3kb dsDNA(Fermentas,Canada)，45s用於樣品注射，和40分鐘樣品分離。使用用於毛細管電泳的PROSize軟體(Advanced Analytical Technologies,USA)獲得凝膠圖像並進行分析。
DNA糖基化酶(DME)酶測定
Demeter(DME)是對5-甲基胞嘧啶基質具有活性的雙功能DNA糖基化酶 /裂解酶。植物在三種序列環境中具有5-甲基胞嘧啶：CpG、CpNpG和CpNpN，且DME對這些序列環境中的每種的5-甲基胞嘧啶具有活性。在體外進行的酶測定中，檢測甲基化胞嘧啶5'側的磷酸二酯鍵的裂解，產生δ消除產物。在凝膠電泳前用強鹼(NaOH)處理DNA反應產物確認在預測位置處的δ消除過程。
在酶測定中用作基質的合成寡核苷酸如下合成，核苷酸修飾在括號中指明：
MEA-1.6F,5’-CTATACCTCCTCAACTCCGGTCACCGTCTCCGGCG(SEQ ID NO：31)
MEA-1.6F18meC,5’-CTATACCTCCTCAACTC(5-meC)GGTCACCGTCTCCGGCG(SEQ ID NO：32)
MEA-1.6F17meC,5’-CTATACCTCCTCAACT(5-meC)CGGTCACCGTCTCCGGCG(SEQ ID NO：33)
MEA-1.6F22meC,5’-CTATACCTCCTCAACTCCGGT(5-meC)ACCGTCTCCGGCG(SEQ ID NO：34)
MEA-1.6F18AP,5’-CTATACCTCCTCAACTC(abasic)GGTCACCGTCTCCGGCG(SEQ ID NO：35)
MEA-1.6F17AP, 5’-CTATACCTCCTCAACT(abasic)CGGTCACCGTCTCCGGCG(SEQ ID NO：36)
MEA-1.6F15AP,5’-CTATACCTCCTCAA(abasic)TCCGGTCACCGTCTCCGGCG(SEQ ID NO：37)
MEA-1；6F12AP,5’-CTATACCTCCT(abasic)AACTCCGGTCACCGTCTCCGGCG(SEQ ID NO：38)
MEA-1.6F18T,5’-CTATACCTCCTCAACTCTGGTCACCGTCTCCGGCG(SEQ ID NO：39)
MEA-1.6R,5’-CGCCGGAGACGGTGACCGGAGTTGAGGAGGTATAG(SEQ ID NO：40)
MEA-1.6R17meC,5’-CGCCGGAGACGGTGAC(5-meC)GGAGTTGAGGAGGTATAG(SEQ ID NO：41).
20pmol的各寡核苷酸在50μL反應中使用20單位的T4多核苷酸激酶在30μCi的(γ-32P)-ATP(6000Ci/mmol,Perkin Elmer Life Sciences)存在時在37℃下1hr進行末端標記。各經標記的寡核苷酸使用Qiaquick Nucleotide Removal Kit(Qiagen)如說明書所描述進行純化。經標記的寡核苷酸在10mMTris-HCl(pH 8.0)、1mM EDTA和0.1M NaCl中降溫貼合至合適的互補寡核苷酸。各混合物加熱至100℃ 10分鐘，然後緩慢地過夜冷卻至室溫。使用MspI或HpaII限制性內切核酸酶消化隨後凝膠電泳以確定降溫貼合效 率。僅僅使用大於90%雙鏈的基質進行糖基化酶活性測定。
5’-標記的寡核苷酸基質(13.3nM)和DME蛋白(250nM)在具有40mM HEPES-KOH(pH 8.0)、0.1M KCl、0.1mM EDTA、0.5mM二硫蘇糖醇和200mg/ml BSA的15ml反應中在37º培育1hr。用15ml的95%甲醯胺、20mM EDTA、0.05%溴酚藍、0.05%二甲苯藍FF終止反應且反應物煮沸5分鐘。為了誘導消除，添加終濃度0.1M的NaOH並且煮沸反應物7分鐘。產物在含7.5M尿素和1xTBE的15%聚丙烯醯胺凝膠上分級。用Hoefer SQ3凝膠設備在1000V 4hr完成電泳。凝膠在-80ºC曝光於Kodak BioMax MR膠片。
分析方法
穀粒、食物成分和食物樣品中的近似值(Proximates)和其它主要成分使用標準方法測定，例如如下面所描述。
穀粒含水量根據(Association of Official Analytical Chemists)AOAC Method 925.10測量。簡言之，穀粒樣品(~2g)在烘箱中130℃ 1小時乾燥至恒重。
根據AOAC Method 923.03測量含灰量。用於水分測定的樣品在馬弗爐中520℃灰化15h。
穀粒、食物成分和食物樣品的蛋白含量。
根據AOAC Method 992.23測量蛋白含量。簡言之，使用自動氮分析儀(Elementar Rapid N cube,Elementar Analysensysteme GmbH,Hanau,Germany)通過Dumas燃燒法分析總氮。通過氮含量乘以6.25估算穀粒或食物樣品的蛋白含量(g/100g)。
糖、澱粉和其它多糖
總澱粉含量根據使用McCleary et al.(1997)的酶促方法的AOAC Method 996.11進行測量。
根據AOAC Method 982.14測量糖含量。簡言之，用含水乙醇(80%乙醇)萃取簡單糖類然後使用聚胺-結合的聚合凝膠柱通過HPLC定量，使用乙腈：水(75：25 v/v)作為流動相以及蒸發光散射檢測儀。
總中性非澱粉多糖(NNSP)通過稍微修改的Theander et al.(1995)的氣相層析方法進行測量，其包括用1M硫酸水解2h然後離心。
果聚糖(果糖-寡糖)通過AOAC Method 999.03詳細描述的方法進行分析。簡言之，將果糖-寡糖萃取至水中然後用蔗糖酶/麥芽糖酶/轉化酶混合物消化。獲得的游離糖然後用硼氫化鈉還原並用果聚糖酶(fructanose)消化成果糖/葡萄糖。所釋放的果糖/葡萄糖使用對羥基苯甲酸醯肼(PAHBAH)測量。
纖維含量
總膳食纖維(TDF)根據AOAC Method 985.29測量而可溶性和不可溶性纖維(SIF)根據AOAC Method 991.43測量。簡言之，TDF通過Prosky et al.(1985)的重量分析技術測定，如AOAC Method 985.29所詳細描述，而SIF通過AOAC 991.43中的重量分析技術測定。
總脂質
5g麵粉樣品和1% Clarase 40000(Southern Biological,MC23.31)在45℃培 育一小時。通過多次萃取從所述樣品將脂質萃取進氯仿/甲醇中。在離心進行相分離後，去除氯仿/甲醇部分並在101℃乾燥30分鐘以回收脂質。剩下的殘餘物的質量代表樣品中的總脂質(AOAC Method 983.23)。
脂質的脂肪酸譜
根據AOAC Method 983.23從磨好的麵粉將脂質萃取進氯仿。含有脂質的氯仿部分的一部分在加入等分部分的器-癸酸作為內部標準後在氮氣流下蒸發。殘餘物懸浮於乾甲醇中的1%硫酸並將混合物50℃加熱16h。混合物用水稀釋並用己烷萃取兩次。合併的己烷溶液裝載至Florisil小柱上，所述柱用己烷洗滌，且然後用己烷中的10%乙醚洗脫脂肪酸甲基酯。洗脫物蒸發至乾燥，殘餘物溶解於異辛烷中以注射至GC上。脂肪酸甲基酯針對標準脂肪酸混合物進行定量。GC條件：柱SGE BPX70 30 m x 0.32mm x 0.25um；注射0.5μL；注射器250℃；15：1拆分；流速1.723ml/分鐘恒定流速；烘箱150℃ 0.5分鐘，10℃/分鐘至180℃，1.5℃/分鐘至220℃，30℃/分鐘至260℃(總運行時間33分鐘)；檢測器FID於280℃。
抗氧化劑活性(ORAC-H)
親水性抗氧化劑活性(ORAC-H)遵循Huang(2002a和2002b)並如Wolbang et al.(2010)所描述修改的方法進行測定。如下對樣品進行親脂性抗氧化劑隨後是親水性抗氧化劑萃取：稱取3份100mg樣品至2ml微型管中。然後加入1mL己烷：二氯甲烷(50：50)並劇烈混合2分鐘，並且在10℃以13000rpm離心2分鐘。上清液轉移至玻璃小瓶中，沉澱物用另外2mL的己烷：二氯甲 烷混合物再萃取。然後重複混合和離心步驟，並且將上清液轉移至同一玻璃小瓶中。在溫和氮氣流下蒸發所述沉澱物的殘餘溶劑。然後加入1mL的丙酮：水：醋酸混合物(70：29.5：0.5)並劇烈混合2分鐘。混合物然後如前一樣離心並且上清液用於ORAC-H平板測定。根據需要用磷酸緩衝液稀釋樣品。計算曲線(AUC)下的面積並與Trolox標準的AUC值比較。ORAC值報告為uMTrolox當量/g樣品。
酚類
總酚含量以及游離、共軛和結合狀態的酚類在根據Li et al.(2008)描述並略微修改的方法萃取後進行測定。簡言之，通過在玻璃小瓶(8ml容量)中超聲處理10分鐘萃取進2mL 80%甲醇後，測定100mg樣品的游離酚類。上清液轉移至第二個玻璃小瓶中並重複殘餘物的萃取。合併的上清液在氮氣中蒸發至乾燥。添加2mL醋酸(2%)以調節pH至大約2，然後加入3mL乙酸乙酯並搖動2分鐘萃取酚類。小瓶在10℃以2000xg離心5分鐘。將上清液轉移至乾淨的玻璃小瓶並再重複萃取兩次。合併的上清液在氮氣中37℃蒸發。殘餘物溶解於2mL80%甲醇並冷凍。
對於初始80%甲醇萃取，共軛的酚類的樣品如對游離酚類測定一樣處理。此時，向玻璃小瓶中的蒸發的上清液添加2.5mL(2M)氫氧化鈉和磁棒，然後用氮氣填充小瓶並加蓋密封。然後小瓶攪拌混合並110℃加熱1h。樣品在冰上冷卻，之後用3mL乙酸乙酯通過搖動2分鐘萃取。小瓶在10℃以2000xg離心5分鐘。丟棄上清液並用12M HCL將pH調節至大約2。如對游離酚類所描述的，使用3x3mL等分的乙酸乙酯萃取酚類。合併上清液並在 氮氣中37℃蒸發至乾燥，且殘餘物吸收於2mL 80%甲醇並冷凍。
從游離酚類甲醇萃取後的殘餘物測量結合的酚類。向所述殘餘物加入2.5mL(2M)氫氧化鈉和磁棒，然後用氮氣填充小瓶並加蓋密封。然後小瓶攪拌混合並110℃加熱1h。樣品在冰上冷卻，之後用3mL乙酸乙酯通過搖動2分鐘萃取。小瓶在10℃以2000xg離心5分鐘。丟棄上清液並用12M HCL將pH調節至大約2。如對游離酚類所描述的，使用3x3mL等分的乙酸乙酯萃取酚類。合併上清液並在氮氣中37℃蒸發至乾燥，且殘餘物吸收於2mL 80%甲醇並冷凍。
使用100mg樣品，通過在水解前加入200uL 80%甲醇濕潤樣品測定總酚類。加入2.5mL(2M)氫氧化鈉和磁棒，然後用氮氣填充小瓶並加蓋密封。然後小瓶攪拌混合並110℃加熱1h。樣品在冰上冷卻，之後用3mL乙酸乙酯通過搖動2分鐘萃取。小瓶在10℃以2000xg離心5分鐘。丟棄上清液並用12M HCL將pH調節至大約2。如對游離酚類所描述的，使用3x3mL等分的乙酸乙酯萃取酚類。合併上清液並在氮氣中37℃蒸發至乾燥，且殘餘物吸收於4mL 80%甲醇並冷凍。
使用用於測定酚類的Folin Ciocalteu’s測定法對處理的/萃取的樣品中的酚類的量進行測量。使用0、1.56、3.13、6.25、12.5和25μg/mL的沒食子酸標準品製備標準曲線。1mL的標準品添加至4mL玻璃管。對於測試樣品，100μL等分的充分混合的樣品添加至4mL玻璃管中的900μL水中。然後將100mL的Folin Ciocalteu’s試劑添加至各管，立即渦旋。2分鐘後加入700μL碳酸氫鈉溶液(1M)，然後通過渦旋混合。各溶液室溫在黑暗中培育1h，然後在765nm讀取吸光度。結果表現為μg沒食子酸當量/g樣品。
植酸鹽
麵粉樣品的植酸鹽含量的測定基於Harland和Oberleas的方法，如AOAC Official Methods of Analysis(1990)中所描述。簡言之，稱量0.5g麵粉樣品並用2.4% HCl使用轉輪(30rpm)室溫萃取1小時。混合物然後以2000xg離心10分鐘，且上清液用milli-Q水萃取並稀釋20倍。將陰離子交換柱(500mg Agilent Technologies)置於真空歧管中並根據製造商說明調整以適於使用。稀釋的上清液然後裝載於柱上並且通過用0.05M HCl洗滌去除非植酸鹽物質。然後用2M HCl洗脫植酸鹽。收集的洗脫液使用加熱塊消化。冷卻樣品並用milli-Q水補足體積至10mL。磷水平通過分光光度計使用鉬酸鹽、硫酸著色法在640nm讀取吸光度進行測定。使用下式計算植酸鹽：植酸鹽(mg/g)=P conc*V1*V2/(1000*樣品重*0.282)其中P conc是由分光光度法測定的磷的濃度(μg/mL)，V1是最終溶液的體積，V2是所萃取的植酸鹽溶液的體積，以及0.282是磷至植酸鹽的轉換係數。
總礦物含量估計
樣品的總礦物含量通過使用AOAC Methods 923.03和930.22的灰分測定進行測量。大約2g的麵粉在540℃加熱15小時，然後稱量灰分殘餘物的質量。0.5g的粗麵粉樣品使用管塊消化用8M硝酸在140℃消化8小時。然後使用電感耦合等離子體原子發射光譜法(ICP-AES)根據Zarcinas(1983a和1983b)分析鋅、鐵、鉀、鎂、磷和硫含量。
礦物質在CSIRO,Urrbrae,Adelaide South Australia，在Waite Analytical Service(University of Adelaide,Waite,South Australia)以及在Dairy Technical Services(DTS,North Melbourne,Victoria.)進行分析。在用硝酸溶液(CISRO)或稀硝酸和過氧化氫(DTS)消化後通過電感耦合等離子體-光學發射光譜法(ICP-OES)，或者在用硝酸/高氯酸溶液消化後通過電感耦合等離子體原子發射光譜法(ICP-AES)測定元素。
維生素
維生素B1(菸酸)、B3(吡哆醇)和總葉酸分析由DTS以及National Measurement Institute(NMI)進行。通過AOAC Methods 13th Ed(1980)43.045，根據Lahey,et al.(1999進行菸酸測量。根據Mann et al.(2001)測量吡哆醇。該方法包括將磷酸化和游離的維生素B6形式柱前轉換成吡哆醇(pyridoxine/pyridoxol)。使用酸性磷酸酶來去磷酸化，隨後用乙醛酸在Fe2+存在下進行脫胺以將吡哆胺轉化為吡哆醛。吡哆醛然後由硼氫化鈉還原成吡哆醇。
根據VitaFast葉酸試劑盒使用製造商說明或根據AOAC方法2004.05測量葉酸。
實施例2.分離和定性厚糊粉層(ta)突變體 建立和栽培經誘變的水稻群體
來自野生型水稻栽培種中花11(ZH11)的大約8000個穀粒通過用60mM乙基甲磺酸(EMS)使用標準條件處理進行誘變。經誘變的穀粒在田裡播種並 栽培所獲得的植物以產生M1穀粒。收穫M1穀粒，然後播種於田裡以產生M1植物。從1327株個體M1植物收穫8925個穗。從這些植物中，篩選了36420個M2穀粒，包括每穗的至少4個穀粒。
通過半穀粒染色篩選突變體
去除M2水稻穀粒的果實包被物(內稃和外稃)。36420個穀粒每個橫向切成兩半。含胚的一半保存於96孔板用於隨後的萌發，而沒有胚的每個半穀粒用依文思藍染色並在解剖顯微鏡下觀察以檢測相對於野生型具有增厚的糊粉層的突變體穀粒。染色基於這樣的原理，即依文思藍只能夠穿透和染色非活細胞例如澱粉質胚乳的細胞，而在活的糊粉層中觀察不到顏色改變。從初始依文思藍染色和組織學分析，觀察到顯示糊粉層厚度顯著增加的個體穀粒以及顯示種子腹側糊粉層顯著增厚的穀粒。其它穀粒顯示糊粉層厚度的增加但是程度較小。特別針對糊粉層厚度檢查各種子腹側未染色區域。也觀察到在穀粒背麵糊粉層厚度增加的變體。僅僅具有橫跨整個橫切面的糊粉層厚度顯著增加的變體被選擇用於進一步分析。
選擇與野生型半穀粒相比，具有更厚的依文思藍未染色區域的半穀粒。在所檢查的36240個穀粒中，鑒別並選擇出具有糊粉層厚度差異的219個穀粒(0.60%)。這些獲得自140株個體M1植物的162個穗，並因此大部分代表獨立突變體。如下所描述，鑒別並進一步定性一個具體的突變體穀粒，其具有命名為thick-aleurone 2(ta2)的突變。相應的野生型基因因此命名為Ta2；該命名用於本文。
為了維持可能的突變體系，各相應的具胚半穀粒在用1%Bacto瓊脂 (Bacto,214030)固化的含半強度MS鹽的培養基(Murashige and Skoog,1962)上萌發，並在25℃在光照強度1500~2000Lux，16h光/8h暗週期下培養。在2-4葉期將小植株轉移至土壤，且獲得的植物生長至成熟。在相應具胚半穀粒萌發和培養後，115個種子(52.5%)長大，產生成熟和可孕植物。
鑒別、選擇並進一步分子顯示很少或沒有一般農業性狀缺陷的候選突變體植物，例如那些相對於野生型親本品種具有正常植物高度、育性(雄性和雌性育性)、穀粒大小和穀粒千粒重且顯示糊粉層增厚性狀穩定遺傳的植物。其中，選擇並詳細分析命名為ta2的突變體，其顯示更極端的多糊粉層表型，具有6至7個細胞層。如預期的，野生型穀粒顯示一個細胞層的糊粉層。
ta2突變體穀粒的組織學分析
針對授粉後天數(DAP)從1至30天的形態學變化研究並比較來自野生型ZH11和ta2突變體植物的發育中穀粒。水稻穀粒的成熟階段可認為具有三個時期：乳熟期(milk grain stage)、蠟熟期(dough grain stage)和完熟期(mature grain stage)。在蠟熟期，野生型穗中的穀粒顏色開始從綠色變成黃色，隨後是連接莖和穎果的泡狀組織(vesicular tissue)的逐漸破壞。顯微鏡檢查水稻穀粒的橫切片也顯示ta2突變體穀粒中堊白(不透明性)程度的增加。ta2突變體穗在顏色改變上被延遲。然後使用掃描電子顯微鏡(SEM)研究澱粉質胚乳的中間部分的澱粉顆粒組織結構。在野生型穀粒中，澱粉顆粒被緊密包裝並顯示平滑表面和規則形狀，而在ta2穀粒中，觀察到較鬆散包裝的不規則形狀的澱粉顆粒。總之，在具有ta2突變的植物和穀粒中觀察到至少三個改 變：穀粒成熟的延遲，穀粒堊白程度的增加和澱粉顆粒結構的增加。
6、7、8、9、10、12、15、18、21、24、27和30 DAP的發育中的突變體和野生型穀粒用依文思藍染色並通過光學顯微鏡檢查糊粉層。直到10DAP沒有觀察到野生型和ta2突變體穀粒之間發育中糊粉層厚度的顯著差異。在10DAP之後，ta2突變體的糊粉層比野生型穀粒中的更厚，並且在大約20DAP差異達到最大。這些結果與那些來自蘇丹紅染色的一致。
通過切片(1μm)、染色和光學顯微鏡術進一步檢查野生型和ta2突變體穀粒(DAP)的組織學差異。在用0.1%甲苯胺藍(其將核酸染藍，將多糖染紫)染色後，在野生型糊粉層觀察到單層的大的、規則朝向的矩形細胞。相反，ta2突變體穀粒切片具有6-8個細胞層的糊粉層，所述細胞具有不同大小和不規則朝向。這些觀察表明ta2穀粒中增厚的糊粉層主要是由細胞層數的增加導致而不是個體糊粉層細胞的增大。
進一步用0.01%的Calcoflour White(瑩光細胞壁染料)染色，顯示野生型和ta2突變體穀粒之間沒有細胞壁厚度的差異。對於野生型和ta2穀粒兩者，糊粉層細胞的細胞壁厚於澱粉質胚乳中的細胞壁。
ta2突變體植物和穀粒農藝特性的分析
在田間與野生型(ZH11)植物回交三代產生BC3F3代，由此去除可能有誘變處理引起的額外的不相關突變，之後針對一些農藝性狀分析ta2突變體植物。與野生型植物和穀粒相比，ta2突變體植物和穀粒在植物高度、穀粒千粒重、穀粒大小(長度、寬度和厚度)以及穎果形態上沒有顯著不同(表2)。相反，野生型植物顯示98.9%的結實率而ta2突變體植物顯示73.4%的降低 的結實率。結實率計算為截止完熟期所述植物中由種子填充的穎花的百分比。此外，在生長室中28℃在12h光light/12h暗週期無濕度調節下培養時，相比於野生型穀粒的97.3%，ta2突變體穀粒顯示75.1%的降低的萌發能力。萌發定義為胚根可見地穿過種皮出現。
實施例3.ta2突變體的遺傳分析
基於生長中的植物中糊粉層和胚乳組織的母體來源，進行兩種遺傳實驗以測定厚糊粉層表型是母體決定的。首先，進行母本ta2(突變體)植物和父本野生型植物之間的測交(test cross)，獲得F2代穀粒。在F2穀粒中，49.4%(n=634)顯示增厚糊粉層表型，其顯著偏離孟德爾遺傳學顯性基因在F2群體中預測的3：1(野生型：突變體)比率。其次，進行ta2植物和野生型植物之間的反交。全部F1種子(100%；n=589)顯示增厚糊粉層表型，而在使用野生型作為母本植物的反交中，全部F1種子(n=197)導致野生型表型。這些雜交顯示糊粉層表型由母本植物基因型決定。
為了確立該母體效應是由配子體基因型還是孢子體基因型決定，獲得自同基因型組合Ta2/Ta2和同基因型組合ta2/ta2植物雜交的F1雜合Ta2/ta2植物用於和ta2同基因型組合(ta2/ta2)或野生型植物反交。在母本雜合體和父本野生型的反交中，47.3%(n=188)的F1穀粒顯示ta2突變體表型，而在母本ta2植物和父本雜合體的反交中，99.3%(n=425)的F1個體顯示ta2突變體表型。從這些結果可以得出結論，TA2基因通過配子體、母體遺傳模式賦予所述表型。
根據上面的遺傳分析，根據配子體母體遺傳模式可以提出ta2遺傳模型。當母本配子體的基因型是ta2，胚乳的表型是突變體ta2(增厚的糊粉層)且獨立於父本基因型。因此，厚糊粉層表型只是由三倍體澱粉質胚乳和糊粉層發育期間的母本配子體基因型決定，使得母本雜合體導致50%的子代具有厚糊粉層表型，獨立於父本基因型，且母本ta2/ta2同基因型組合體導致100%的子代具有厚糊粉層表型。需要進一步的實驗測試TA2的配子體母體效應是否由於三倍體胚乳中存在額外複本的母體基因或是否由於母本配子體的基因印痕效應抑制父本TA2基因的表現。
實施例4.通過遺傳作圖和序列分析鑒別Ta2基因 鑒別和使用SSR和INDEL標記進行基因定位
對於基因定位，從在ZH11(粳稻品種)遺傳背景中含ta2突變的植物和秈稻品種NJ6的遺傳雜交產生F2群體植物。為了鑒別在ZH11和NJ6具有多型性並能夠用於基因定位的遺傳標記，對來自同基因合子ZH11植物、同基因合子NJ6植物的葉DNA和所述DNA的1：1混合物進行一組PCR實驗。 通過凝膠電泳分析PCR產物使得可以比較ZH11、NJ6和混合物的產物而鑒別多型性標記。只有當用單獨的ZH11和NJ6DNA擴增顯示離散的和不同的擴增產物而混合DNA顯示兩種產物的組合時，選擇引子對用於基因定位。由此選擇出124個引子對，包括54個插入-缺失多型性(INDEL)和70個短序列重複(SSR)多型性。這些遺傳標記沿著水稻基因體以大約3-4Mbp的間隔分佈並給出良好的覆蓋度用於基因定位。
對於ta2等位基因的遺傳作圖，來自F2群體的143柱植物用所述124個多型性標記進行評估(score)。定位群體中個體F2植物對糊粉層表型的同基因型組合性通過對獲得自各F2植物的F3子代穀粒的表型分型而仔細評價。如實施例1所描述萃取葉DNA。如實施例1所描述進行PCR擴增，且產物通過3%瓊脂糖凝膠電泳分離。從結果可以得出結論，ta2基因座位於染色體1上的標記INDEL127和INDEL129之間(圖1，最上面的線)，其來自對應於大約217kb的物理距離的水稻基因體序列。
用該標記對篩選另外的5000株F2植物。鑒別和選擇顯示在INDEL127和INDEL129之間的重組的362個個體。當這些重組植物被表型分型時，ta2基因座由此被定為至INDEL149和INDEL 128標記之間的42.8kb的區域(圖1，第二條線)。
為了獲得ta2突變體植物中該區域的核苷酸序列並將其與野生型序列比較而由此鑒別相應於ta2的突變，設計了所述基因體區域側翼的序列並進行DNA定序。基因體DNA序列的比較鑒別出該定序區域中的兩個單核苷酸多型性(SNP)，兩者均在注釋為LOC_01g11900的基因中。第一個是單核苷酸G(野生型)至A(ta2)多型性，在核苷酸位置Chr1：6451738處，參考粳稻 品種的水稻基因體序列，位於染色體1上的基因LOC_01g11900的外顯子14和外顯子15之間的內含子14中(圖1中的星號)。第二個多型性是G(野生型)至A(ta2)取代，在位置Chr1：6452308處，其位於染色體1中的基因LOC_01g11900的外顯子15和16之間的內含子區域(內含子15)。
萃取RNA，反轉錄並定序對應於ta2等位基因的cDNA後，觀察到在Chr1：6451738處的第一個G至A多型性與外顯子14和外顯子15之間的21bp插入(圖2)相關，對應於在預測的胺基酸序列中七個胺基酸的符合讀框的插入(圖3)。相反，對於相應於基因座Chr1：6452308位置處的第二個多型性的外顯子15和16之間的突變，沒有cDNA序列的改變。從這些結果得出結論，內含子14中的第一個多型性是該穀粒中的改變原因，即ta2突變。該結論在下面實施例中證實。還得到結論，該突變導致ta2基因的RNA轉錄物相對於野生型Ta2基因的剪接模式的改變，由此引起ta2表型。從具有所述21個核苷酸插入的cDNA數目與缺少該插入的cDNA數目的比率，估計來自ta2(突變體)基因的RNA轉錄物的80%在新產生的剪接位點被剪接。假設具有該7個胺基酸插入的突變體多肽是失活的，得出結論是所述突變體ta2基因相對於野生型保留大約20%的活性。
水稻基因體染色體1中位置LOC_01g11900的基因已經被注釋為水稻ROS1a基因(OsROS1a)，編碼雙功能DNA糖基化酶/裂解酶的阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)Demeter基因(AtDME)的同源物。擬南芥DMA酶充當DNA脫甲基酶，降低DNA中C殘基的甲基化。因此，Ta2基因和OsROS1a基因是同義的並且是擬南芥DME基因的同源物。
水稻ROS1a基因的核苷酸序列示於SEQ ID NO：9，包括4726個核苷酸 的啟動子和5-UTR(非轉譯區)，包括16個內含子的從核苷酸4727-15869的蛋白編碼區，和615個核苷酸的3’UTR。16個內含子的核苷酸位置在SEQ ID NO：16的圖例中提供。SEQ ID NO：9還在其3’端包括401個核苷酸的下游區域，其並不被認為是OsROS1基因的一部分。對應於野生型OsROS1基因的cDNA的核苷酸序列提供於SEQ ID NO：8，且所編碼的1952個胺基酸的多肽提供為SEQ ID NO：2。
水稻具有四個ROS1基因，其編碼命名為OsROS1a、OsROS1b(LOC_Os02g29230)、OsROS1c(LOC_Os05g3735)和OsROS1d(LOC_Os05g37410)的多肽。水稻還具有兩個其它Demeter同源物，被認為是編碼DNA糖基化酶，即Demeter-樣-2(DML2)和Demeter-樣-3(DML3)。
野生型水稻TA2多肽中的結構特徵的描述
在發現水稻TA2基因與OsROS1a相同後，檢查了OsTA2(OsROS1)多肽胺基酸序列。鑒別到若干典型的DNA糖基化酶結構特徵。ROS1a蛋白的糖基化酶結構域具有至少三個經鑒別的模體，其足夠保守而可以識別：螺旋-髮夾-螺旋(HhH)模體(由例如OsTA2中胺基酸1491-1515代表)，甘胺酸/脯胺酸-富含模體接著保守的天冬胺酸(GPD)，和四個保守的半胱胺酸殘基(例如在胺基酸1582-1598的區域)以保持[4Fe-4S]簇的位置。還有離胺酸-富含結構域(例如由OsTA2中的胺基酸87-139代表)。不像HhH DNA糖基化酶超家族的其他成員，ROS1家族成員含有中央糖基化酶結構域側翼的兩個額外的保守結構域(結構域A和B)(Mok et al.,2010)。在水稻TA2多肽(SEQ ID NO：2)，結構域A存在於胺基酸859-965，糖基化酶結構域存在於胺基酸1403-1616， 而結構域B存在於胺基酸1659-1933。結構域A在胺基酸882-892處含有重複的混合-電荷簇。已報導AtDMA的保守DNA糖基化酶結構域和側翼的結構域A和B對於DNA糖基化酶/裂解酶酶促活性是必要的和足夠的，如由誘變分析所顯示(Mok et al.,2010)。
實施例5.分析ta2突變體穀粒的營養組分
為了測量突變體穀粒的組成，尤其是重要的營養組分，ZH11和ta2植物在田間在相同時間且在相同條件下生長。從收穫自所述植物的穀粒製備全穀粒麵粉樣品並用於組成分析。麵粉近似(proximate)分析的結果(重複測量的均值)在表2中給出。
近似分析表明ta2突變體麵粉中總脂肪含量大約50%的增加。總氮分析顯示ta2突變體和野生型穀粒之間在蛋白水平沒有顯著改變。灰分測定，其測量乾燥的麵粉樣品燃燒後剩餘物質的量，表明ta2穀粒相對於野生型26%的增加。總纖維水平在ta2穀粒中增加大約200%。相對於野生型，澱粉含量在ta2穀粒中減少8.6%。這些數據表明ta2突變體中糊粉層厚度的增加引起糊粉層富含的營養例如脂質、礦物質和纖維水平的增加而不改變種子的 大小。為了更詳細瞭解這些和其它改變，如下進行更詳盡的分析。
礦物質
為了測量礦物質含量，使用ICP-AES，其組合了電感耦合等離子體(ICP)和原子發射光譜(AES)技術。這是測量礦物質含量的標準方法，在單一分析中提供大量元素的靈敏的和高通量的定量。從該分析獲得數據顯示突變體穀粒的鋅和鐵水平相對於野生型穀粒基於重量增加大約15%。鋅水平從13.9mg/kg增加至16.0mg/kg，而鐵從12.4mg/kg增加至14.2mg/kg。
也觀察到鉀、鎂、磷和硫的增加，分別增加大約28%、23%、22%和9%。這些結果與ta2穀粒中灰分含量增加(其主要測量礦物質)相一致。
抗氧化劑
抗氧化劑這樣的生物分子，其能夠在動物組織中對抗氧化作用的負面效應，因此保護免受氧化脅迫-相關疾病例如炎症、心血管疾病、癌症和老化相關疾病(Huang,2005)。
獲得自ta2突變體和野生型水稻穀粒的麵粉中的抗氧化能力通過實施例1所描述的氧自由基吸收能力(ORAC)測定進行測量。在ORAC測定中，抗氧化能力由內源自由基清除生物分子和可氧化分子瑩光探針瑩光素之間的針對由AAPH(2,2’-偶氮(2-脒基-丙烷)二氫氯化物)產生的合成游離自由基的競爭動力學代表。通過比較所述穀粒的動力學曲線(AUC)(代表分子探針瑩光素的瑩光降解動力學)和用Trolox標準品產生的AUC下的面積計算所述能力。定量抗氧化能力的替代方法是通過使用Folin-Ciocalteau試劑 (FCR)；這通過測量食物樣品中的總酚類化合物的還原能力代表抗氧化能力。FCR測定相對地簡單、便利和可再現。然而，更耗時間的ORAC測定測量更加生物學相關的活性。由於抗氧化劑包括廣泛的多酚、還原劑和親核物質，通過FCR和ORAC兩者測量可以提供更好的覆蓋度和對總抗氧化能力更全面的瞭解。如Prior(2005)所報導，FCR測定和ORAC測量的結果通常是一致的。
FCR和ORAC測定均顯示來自ta2突變體的全穀粒麵粉相對於野生型ZH11全穀粒麵粉的增加的抗氧化能力。FCR顯示ta2突變體中總酚類化合物大約35%的增加。來自ta2突變體的麵粉中的親水性抗氧化劑含量也有83%的增加。
植酸鹽
當生長於有足夠磷的環境下時，水稻穀粒中大約70%的總磷含量是植酸鹽或植酸(肌(myo)-肌醇-1,2,3,4,5,6-六磷酸)的形式。膳食性植酸鹽還可能作為強抗氧化劑對健康具有有益作用(Schlemmer,2009)。總植酸鹽分析顯示與野生型相比，ta2中植酸鹽含量大約19%的增加，從大約10.8mg/g增加至大約12.7mg/g。
B族維生素
ta2麵粉中的維生素B3、B6和B9的水平分別比野生型麵粉中的那些高大約19%、63%和58%。當測定重複四個重複時，平均增加分別為大約20%、33%和38%。已知糊粉層比胚乳更富含維生素B3、B6和B9(Calhoun,1960)， 因此認為ta突變體穀粒中糊粉層厚度的增加決定了維生素B3、B6和B9含量的增加。
膳食性纖維
如實施例1所描述測量的總膳食性纖維，如所觀察的，增加大約70%。不溶性纖維增加大約55%。
碳水化合物
ta2穀粒的澱粉含量基於重量有9%的減少。相反，突變體穀粒中蔗糖水平增加2.5倍，且單糖(阿拉伯糖、木糖、半乳糖、葡萄糖)相對於野生型增加31%至118%。
結論
營養分析顯示從田間生長的ta2穀粒產生的全穀粒麵粉，相對於野生型，大部分的糊粉層富含的營養物顯著增加，包括大量營養物如脂質和纖維，微量營養物如礦物質(鐵、鋅、鉀、鎂、磷、硫)，B族維生素如B3、B6和B9，抗氧化劑和糊粉層相關的生物分子如酚類化合物和植酸鹽。游離蔗糖和單糖也有實質增加。伴隨這些營養物和微量營養物的增加的是ta2突變體中澱粉含量(相對百分比)的小量減少。
實施例6.篩選Ta2基因中額外的突變體等位基因
通過實施例所描述的TILLING測定篩選ZH11遺傳背景的水稻植物的 經誘變群裡(實施例2)以鑒別Ta2基因中另外的多型性，使得可以測試它們的增厚糊粉層表型。基本上如Jiang et al.(2013)所描述，該方法使用經標記的野生型RNA和候選突變體RNA的異源雙鏈體，通過內切酶CelI進行消化.首先選擇TA2基因的5'區域進行篩選，但可以選擇該基因的任何區域。
通過TILLING測定在Ta2基因的5'區域鑒別出多個單核苷酸多型性。如同第一個ta2突變體，針對增厚的糊粉層和其它穀粒表型檢查來自具有所述多型性的植物的穀粒。一些穀粒顯示增厚的糊粉層。選擇顯示突變體表型的那些穀粒並從其獲得子代植物。測定各自Ta2基因的核苷酸序列，確認存在所述突變。鑒別在各突變體的Ta2基因中的改變的核苷酸。另外的三個厚糊粉層突變體也被定序。也鑒別出其他含有多型性但不顯示增厚糊粉層的穀粒並保留用於比較。所鑒別的突變體和其它多型性株系，以及他們的糊粉層表型總結於表3。具有增厚的糊粉層的突變體顯示為：++，大大地增厚的糊粉層；+，弱增厚的糊粉層；-，未改變的糊粉層表型。顯然獲得了許多種突變和表型結果。
野生型ZH11穀粒中的糊粉層顯示一個細胞層的厚度。相反在具體突變體中，包含V441A突變的突變體穀粒中的糊粉層在背側增厚，包含大約5-6個細胞層。突變體S1357F穀粒中的糊粉層厚度為大約4-5個細胞層且所述穀粒皺縮，而突變體R482K穀粒的糊粉層為2-3個細胞層厚且所述穀粒不皺縮。突變體S214F穀粒中的糊粉層含有2-4個細胞層且所述穀粒皺縮，如來自突變體S156F和S1413N的穀粒一樣。相反，K501S穀粒的糊粉層具有2-3個細胞層並且其穀粒不皺縮。因此，容易地獲得了Ta2基因中的多種突 變體和表型。
在具有Ta2基因中的多型性的60個新鑒別的株系，19個在預測的多肽 產物中具有胺基酸變化(取代)。其中，至少7個顯示增厚的糊粉層表型。S1413N和D1425N突變位於糖基化酶結構域；其它鑒別的突變位於糖基化酶結構域之外。除了最初的剪接位點變體突變體之外，全部所鑒別的突變時胺基酸取代。沒有一個是缺失或終止密碼子，使得本發明人的結論為OsROS1中的無效突變可能是致死的。已報導在擬南芥中，母體dme突變導致敗育種子(Choi et al.,2002 and 2004)。在水稻中，ros1a母體無效等位基因的存在導致早期胚乳發育失敗而不管父本基因型如何(Ono et al.,2012)。
TA2(OsROS1a)基因中10個新的獨立突變體等位基因(各自在穀粒中具有增厚的糊粉層)的恢復最終表明該基因中的所述突變導致了所述厚糊粉層表型。此外，這些新的突變全部位於該基因與第一個的ta2突變不同的區域，表明該基因可以沿著全長基因的不同位置被改變以實現厚糊粉層表型。
若干來自顯示厚糊粉層的所述突變體的ta2基因被選殖且編碼的多肽被表現並測試DNA糖基化酶/裂解酶活性。這確認了所述多肽與野生型多肽相比具有降低的DNA糖基化酶/裂解酶活性。
實施例7.ta2突變體的互補分析
為了加強Ta2(OsROS1a)基因中的突變負責增厚的糊粉層和相關表型的結論，通過將所述基因的野生型複本通過轉形導入至所述突變體株系進行互補實驗。為了構建用於互補實驗的轉形質體，從野生型水稻基因體分離包括Ta2基因的16882個核苷酸DNA片段(核苷酸序列提供於SEQ ID NO：9)。該片段按順序含有，被認為是含有該基因啟動子的4726-bp上游序列，包括全部內含子的整個OsTA2蛋白編碼區，615個核苷酸的3’-UTR 和401-bp下游區域。其使用一系列的寡核苷酸引子從ZH11基因體DNA擴增，組裝，且然後用KpnI和SalI消化並連接至二元載體pCAMBIA1300。該載體還含有潮黴素抗性基因作為選擇標記基因。用於轉形的質體和對照質體(空載體)各自導入根瘤農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105中並用於通過Nishimura et al.(2006)描述的方法轉形水稻受體細胞。從用野生型Ta2基因的轉形中再生出總共32株T0轉基因植物。將這些植物轉移至土壤並在生長室中生長至成熟。使用PCR測試潮黴素抗性基因的存在時，鑒別並選擇出20個攜帶所述潮黴素基因的轉形株株系。將這些生長至成熟並從各植物收穫穀粒(T1種子)。如通過PCR測定所證明的，這些植物的每一株含有來自載體的含所述野生型Ta2基因的T-DNA。
收穫自這些植物的穀粒通過用依文思藍染色檢查它們的糊粉層表型。至少三株轉形的植物產生具有像野生型的正常糊粉層的穀粒，表明所導入的基因的陽性表現且因此互補ta2突變。這最終證明Ta2基因中的突變導致所述突變體表型。
Ta2基因以下稱作ROS1a基因；這些術語可互換。
實施例8.重組表現的TA2和ta2蛋白的體外酶活性測定
如上實施例4所述，水稻中的Ta2基因和OsROS1a基因相同，其與阿拉伯芥命名為Demeter的DNA脫甲基酶/糖基化酶(DME；Gehring et al.,2006)同源。DME打斷半甲基化DNA基質中5-甲基胞嘧啶的3'側的磷酸二酯鍵。
因此重組表現的水稻Ta2和ta2蛋白的酶活性測試通過測量其對經標記的半甲基化DNA基質的活性進行，生成在變性聚丙烯醯胺凝膠上遷移至預 測的β消除產物位置處的末端標記的DNA基質，如Gehring et al(2006)所述。
為了重組表現和純化Ta2和ta2多肽，來自野生型和突變體ta2植物的全長ROS1a cDNA在PCR反應中用作模板，使用寡核苷酸JH021(5’-TTAATCTAGAATGCAGAGCATTATGGACTCG-3’；SEQ ID NO：42)和JH017(5’-CGGTCGACTTAGGTTTTGTTGTTCTTCAATTTGC-3’；SEQ ID NO：43)，其分別向所擴增的DNA片段添加XbaI和SalI限制性位點。PCR產物用XbaI和SalI消化並選殖進pMAL-c2x載體(NEB)以產生c2x-ROS1a遺傳構築體。將所述遺傳構築體轉形至大腸桿菌Rosetta細胞(Novagen)。為產生所述多肽，經轉形的細胞於28℃在補充0.2%葡萄糖、100μg/mL胺苄青黴素和50μg/mL氯黴素的LB中生長直至達到0.4的OD600。ROS1a-Mal融合蛋白表現用10μM的IPTG在18℃誘導1hr。培養物在4℃以6500rpm離心15分鐘，且沉澱物重懸於30mL的4℃柱緩衝液(20mM Tris-HCl,pH 7.4,200mM NaCl,1mM EDTA)。使用Branson Sonifier 250以設定為4的輸出功率在冰上超聲處理所述細胞兩分鐘。裂解物在4℃以9000rpm離心25分鐘，且收集上清液並進行重力柱純化。通過直鏈澱粉樹脂遵循製造商方案(New England Biolabs)純化ROS1a-Mal融合蛋白。洗脫的蛋白在Slide-A-Lyzer透析盒(10,000MWCO；Pierce)針對50%甘油4℃透析過夜。使用蛋白測定試劑盒(Bio-Rad Laboratories)通過Bradford法測定蛋白濃度，且將蛋白儲存於-20℃直到進一步使用。
如實施例1所述(Gehring et al.,2006)，測定ROS1a-Mal融合蛋白針對半甲基化雙鏈DNA基質的DNA糖基化酶活性。
作為對照，當ROS1a和未甲基化DNA寡核苷酸培育時或當半甲基化 DNA基質在不存在酶情況下培育時，沒有檢測到裂解酶活性或共價捕獲(covalent trapping)。
實施例9. ROS1a基因在水稻中的同源物
編碼介導DNA去甲基化的DNA糖基化酶的植物基因已經主要在阿拉伯芥中定性(Chan et al.,2005；Law and Jacobsen,2010；Zhu,2009)。它們包括Demeter(DME,Choi et al.,2002；Gehring et al.,2006)、ROS1(Gong et al.,2002；Agius et al.,2006),Demeter-like 2(DML2)和Demeter-樣3基因(DML3,Choi et al.,2002；Ortega-Galisteo et al.,2008)。這些基因(和編碼多肽)中最大的，DME，主要在受精前在雌配子體的同二倍體(homodiploid)中央細胞中強表現，其(包括在胚乳中)促進母體等位基因特異性全域甲基化和印痕基因表現。相反，ROS1、DML2和DML3在營養組織中表現(Gong et al.,2002；Penterman et al.,2007)。相比於ROS1，DML2和DML3基因的表現水平低(Mathieu et al.,2007)。此外，ros1、dml2和dml3中的同基因型組合突變沒有產生明顯的形態學表型而母體dme突變導致敗育種子，即胚胎致死，且不傳遞給子代(Choi et al.,2002 and 2004)。儘管它們表現水平低，ROS1、DML2和DML3多肽仍然起DNA糖基化酶/裂解酶的功能(Gong et al.,2002；Morales-Ruiz et al.,2006；Penterman et al.,2007)。從該數據，將無法預期ROS1突變導致增厚的糊粉層表型。
親緣關係分析揭示水稻基因體編碼6個用於胞嘧啶去甲基化的假定DNA糖基化酶，包括四個似乎屬□ROS1異種同源物(OsROS1a,OsROS1b,OsROS1c,OsROS1d)和兩個明顯的DML3異種同源物(Zemach et al.,2010)。鑒 別到OsROS1a中的無效突變但並不從含有所述突變的雄性或雌性植物傳遞到子代，推測是因為ROS1a野生型DNA糖基化酶對於雄性和雌性配子體發育均是不可或缺的(Ono et al.,2012)。本發明人沒有發現OsROS1a中部分突變的任何發表的報導。
DNA糖基化酶結構域中三個鑒別到的模體，即螺旋-髮夾-螺旋(HhH)模體、甘胺酸/脯胺酸-富含模體接著保守的天冬胺酸(GPD)、和四個保守的半胱胺酸(實施例4)存在於Demeter家族的每個成員中。所述糖基化酶結構域結構也在人8-側氧基鳥嘌呤DNA糖基化酶(hOGG1)、大腸桿菌腺嘌呤DNA糖基化酶(MutY)和核酸內切酶III(Endo III)中發現(Bruner et al.2000；Guan et al.1998；Mok et al.,2010)。不像HhH DNA糖基化酶超家族的其他成員，DME-家族成員含有中央糖基化酶結構域側翼的兩個額外的保守結構域(結構域A和結構域B)(Mok et al.,2010)。
所述同源基因的蛋白編碼區域的核苷酸序列通過ClustalW(www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)進行比對。水稻ROS1a蛋白編碼區域與其它物種中同源基因相應區域的序列同一性程度示於表4。
本發明人從這些分析得出結論是水稻具有多個ROS1基因同源物但沒有DME基因。在水稻中，如同擬南芥，在序列同一性程度上，ROS1可以清楚地與其同一物種中的同源物DML1和DML3區別開。
實施例10.在水稻和小麥中表現ROS1a基因
進行實驗分析TA2基因在不同水稻組織中的表現，包括發育中穀粒的部分。在第一個實驗中，通過原位雜交如Brewer et al.(2006)所描述檢測水稻組織切片中的TA2 mRNA。簡言之，不同的水稻組織在真空浸潤後在FAA固定劑中4℃固定8h，使用逐級乙醇系列隨後二甲苯系列脫水，並包埋在Paraplast Plus(Sigma-Aldrich)中。切片機切片(8μm)被封裝在Probe-On Plus顯微鏡載玻片(Fisher)上。
從雜交信號得出結論是，TA2在水稻的果皮、種皮和糊粉層組織以及在澱粉質胚乳中表現，但不在維管束中表現。
使用即時反轉錄聚合酶連鎖反應(RT-PCR)測定不同植物組織中的相對表現水平。出乎意料地，結果表明最高表現在花粉，然後是花藥、年輕穗和糊粉層組織(圖6)。據認為OsROS1a在花藥中的特異性表現可能參與抑制雄配子體中的轉位子。在擬南芥三細胞花粉中，活性DNA去甲基化對維持 營養性細胞核轉位子的基礎表現是重要的，從而產生siRNA以增強雄配子(即兩個精子細胞)中轉位子的RNA依賴性DNA甲基化(RdDM)(Zhu,2009；Zhu et al.,2007)。
ROS1a在發育中的種子中的表現增加至開花後10天，此後開始下降。在澱粉質胚乳和糊粉層組織中均觀察到強表現。種子發育中的早表現模式與增厚糊粉層的形成一致，先於種子發育期間胚乳的細胞化。本發明人的結論是ROS1a在開花當天至開花(授粉)後7天(0-7DAP)的時期內的表現降低對厚糊粉層的形成是關鍵的。
實施例11.水稻中基因甲基化模式
為了確定全部水稻基因全體地在ta2突變體植物相對於野生型TA2植物的甲基化模式，從胚乳和胚分離DNA並用亞硫酸氫鹽(其和非甲基化胞嘧啶反應)處理，隨後進行Illumina定序。胚乳在10DAP分離自ta2和野生型(ZH11)植物的發育中的水稻穀粒，而胚分離自穀粒發育相同時期的野生型植物。對於亞硫酸氫鹽處理後的定序，合成訂制的Illumina連接物(adapter)，其中胞嘧啶用5-甲基胞嘧啶置換，使得所述連接物在亞硫酸氫鹽轉化中被保留。合成末端配對(PE)的連接物，其允許每個分子從兩端被定序，因此有利於隨後比對至基因體支架序列。分離來自從野生型和ta2植物各自切下的胚乳以及來自野生型的胚的大約0.5-1μg基因體DNA。所分離的DNA製備物通過超聲處理剪切至100-500bp的片段。遵循Illumina方案將所述連接物連接至經剪切的片段。然後使用Qiagen EpiTect試劑盒用將非甲基化胞嘧啶(C)轉化為尿嘧啶(U)的亞硫酸氫鈉處理所述DNA兩次，使用PfuTurboCx DNA聚合酶(Stratagene)(耐受模板鏈中的尿嘧啶的校正性酶)通過18個循環的PCR擴增。該PCR擴增產生在各末端具有不同連接物的DNA片段文庫，從而“正向”Illumina定序引子從“原始”基因體衍生鏈產生核苷酸序列(其中C對應於甲基化C，而T對應於非甲基化的C，如果基因體序列存在C)，而“反向”Illumina定序引子從互補鏈產生核苷酸序列(其中G對應於相對鏈上甲基化的C，而A對應於非甲基化的C，如果基因體序列存在C)。
獲得自ta2胚乳的DNA中的CG和CHG甲基化程度大於獲得自對照ZH11胚乳的DNA的程度，表明TA2(OsROS1a)中的突變減少水稻胚乳中的去甲基化過程，而ta2胚乳中的CHH甲基化程度與野生型ZH11胚乳中的無顯著不同。
實施例12 進一步分析ta2突變體穀粒中營養成分
進行進一步分析以測量與相應野生型穀粒(ZH11)相比的突變體穀粒的營養成分，其在田間生長於相同時間和相同條件下。從自植物收穫的穀粒製備的全穀粒麵粉樣品並用於如實施例5所描述的組分分析。生長於澳大利亞的穀粒的麵粉的近似分析結果給出於表5。生長於中國的穀粒的結果給出於表6。
近似分析顯示ta2突變體麵粉中總脂質含量約50%的增加。總氮分析顯示ta2突變體和野生型穀粒在中國在蛋白質水平上的顯著變化，但在澳大利亞不是，其可能是由於不同的氮肥方案。在ta2突變體中，總纖維水平增加約66%或91%。ta2穀粒中澱粉含量相對於野生型降低9%。這些結果確認ta2突變體中糊粉層厚度的增加導致糊粉層富含的營養乳脂質、礦物質和纖維 的水平顯著增加，而不改變種子大小。即使兩種生長環境中的絕對數字不同，ta2穀粒中的相對增加是合理地一致的。
本領域技術人員將理解，不背離概括描述的本發明的精神和範圍，可 以對在具體實施方式中所示的本發明進行多種變化和/或修改。因此，所述實施方式在全部方面都應被認為是例示性的而不是限制性的。
本申請要求2015年11月18日提交的AU2015904754的優先權，其全部內容以其整體通過引用併入本文。
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<120> 具有增厚的糊粉層的水稻穀粒
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<150> AU 2015904754
<151> 2015-11-18
<160> 50
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 1959
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 水稻ROS1a突變(Ta2)多肽
<400> 1
<210> 2
<211> 1952
<212> PRT
<213> 水稻
<400> 2
<210> 3
<211> 1636
<212> PRT
<213> 水稻
<400> 3
<210> 4
<211> 1847
<212> PRT
<213> 水稻
<400> 4
<210> 5
<211> 1829
<212> PRT
<213> 水稻
<400> 5
<210> 6
<211> 1987
<212> PRT
<213> 阿拉伯芥
<400> 6
<210> 7
<211> 6835
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼水稻ROS1a突變(Ta2)多肽的全長cDNA
<400> 7
<210> 8
<211> 6814
<212> DNA
<213> 水稻
<400> 8
<210> 9
<211> 16885
<212> DNA
<213> 水稻
<400> 9
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> 水稻
<400> 10
<210> 11
<211> 56
<212> DNA
<213> 水稻
<400> 11
<210> 12
<211> 152
<212> PRT
<213> 水稻
<400> 12
<210> 13
<211> 159
<212> PRT
<213> 水稻
<400> 13
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> 水稻
<400> 14
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子
<400> 15
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子
<400> 16
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子
<400> 17
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子
<400> 18
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子
<400> 19
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子
<400> 20
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子
<400> 21
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子
<400> 22
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子
<400> 23
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子
<400> 24
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子
<400> 25
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子
<400> 26
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子
<400> 27
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子
<400> 28
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子
<400> 29
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子
<400> 30
<210> 31
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子
<400> 31
<210> 32
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子
<220>
<221> C
<222> (18)..(18)
<223> 5-甲基胞嘧啶
<400> 32
<210> 33
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子
<220>
<221> C
<222> (17)..(17)
<223> 5-甲基胞嘧啶
<400> 33
<210> 34
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子
<220>
<221> C
<222> (22)..(22)
<223> 5-甲基胞嘧啶
<400> 34
<210> 35
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子
<220>
<221> g
<222> (18)..(18)
<223> 無鹼基位
<400> 35
<210> 36
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子
<220>
<221> C
<222> (17)..(17)
<223> 無鹼基位
<400> 36
<210> 37
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子
<220>
<221> T
<222> (15)..(15)
<223> 無鹼基位
<400> 37
<210> 38
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子
<220>
<221> A
<222> (12)..(12)
<223> 無鹼基位
<400> 38
<210> 39
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子
<400> 39
<210> 40
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子
<400> 40
<210> 41
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子
<220>
<221> C
<222> (17)..(17)
<223> 5-甲基胞嘧啶
<400> 41
<210> 42
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子
<400> 42
<210> 43
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子
<400> 43
<210> 44
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 模體
<400> 44
<210> 45
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 模體
<400> 45
<210> 46
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 模體
<400> 46
<210> 47
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 模體
<400> 47
<210> 48
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 模體
<400> 48
<210> 49
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 模體
<400> 49
<210> 50
<211> 1393
<212> PRT
<213> 阿拉伯芥
<400> 50

Claims (50)

  1. 一種水稻植物的穀粒，所述穀粒包含糊粉層、澱粉質胚乳、編碼ROS1a多肽的ROS1a基因和(i)一或多個遺傳變異，與相應野生型水稻植物相比，其各自降低所述植物中至少一個ROS1a基因的活性，和/或(ii)相比於來自相應野生型穀粒的糊粉層，所述糊粉層是增厚的。
  2. 根據請求項1的穀粒，其進一步的特徵為以下的一或多種或全部：(a)所述ROS1a多肽具有DNA糖基化酶(glycosylase)活性；(b)所述ROS1a多肽是相應野生型ROS1a多肽的變體，其中它們的胺基酸序列是不同的；(c)所述ROS1a多肽具有相應野生型ROS1a多肽和/或具有SEQ ID NO：2所示胺基酸序列的ROS1a多肽的DNA糖基化酶活性水平的2%至約60%的DNA糖基化酶活性水平；(d)與相應野生型穀粒中的ROS1a多肽水平相比，所述穀粒中存在2%至約60%的ROS1a多肽水平；和(e)所述增厚的糊粉層包含至少2層、至少3層、至少4層、或至少5層細胞，約3層、約4層、約5層或約6層細胞，或2-8層、2-7層、2-6層或2-5層細胞。
  3. 根據請求項1或2的穀粒，其中所述一或多個遺傳變異各自獨立地是：(a)編碼與野生型ROS1a多肽(SEQ ID NO：2)相比具有降低的DNA糖基化酶活性的突變體ROS1a多肽的ROS1a基因； (b)ROS1a基因，其表現時產生降低的野生型ROS1a多肽水平，例如其包含剪接位點突變，所述剪接位點突變導致相對於cDNA序列如SEQ ID NO：8提供的野生型ROS1a基因，所述ROS1a基因的表現水平降低，或者所述ROS1a基因在其啟動子包含突變，導致所述ROS1a基因相對於野生型ROS1a基因表現降低；(c)外源核酸構築體，其編碼降低所述水稻植物中ROS1a基因表現的多核苷酸，較佳其中所述核酸構築體包含編碼可操作地連接於啟動子的所述多核苷酸的DNA區域，所述啟動子至少在開花至開花後7天的時間之間的時間點在所述水稻植物的發育中的穀粒中表現，和(d)ROS1a基因，其在其蛋白編碼區包含早熟轉譯終止密碼子，使得所述基因相對於野生型ROS1a多肽編碼截短的多肽，較佳地，其中所述遺傳變異包含導入的遺傳變異。
  4. 根據請求項1-3中任一項的穀粒，其中所述水稻植物的特徵在於以下的一或多種或全部：(a)所述水稻植物在其發育中的穀粒中具有相應的野生型發育中的穀粒中DNA糖基化酶活性水平的2%至約60%的DNA糖基化酶活性水平；(b)所述水稻植物中的至少一個ROS1a基因的活性在發育中的穀粒的糊粉層、果皮、珠心突起、子房、種皮和澱粉質胚乳中的一或多種或全部被降低；(c)ROS1a基因的活性至少在開花至開花後7天的時間之間的時間點和/或在開花前的卵細胞中被降低； (d)所述水稻植物是雄性和雌性可孕的；及(e)所述水稻植物顯示延遲的穀粒成熟。
  5. 根據請求項1-4中任一或多項的穀粒，其進一步特徵為以下的一或多種：(a)當與相應的野生型穀粒相比時，所述穀粒包含以下的一或多種或全部，各以重量為基礎，i)更高的礦物質含量，較佳所述礦物質含量是鋅、鐵、鉀、鎂、磷和硫中的一或多種或全部的含量，ii)更高的抗氧化劑含量，iii)更高的植酸鹽含量，iv)維生素B3、B6和B9中的一或多種或全部的更高含量，v)更高的膳食性纖維含量和/或不溶性纖維含量，vi)相對於相應野生型穀粒的澱粉含量，以重量計約90%至約100%的澱粉含量；vii)更高的蔗糖含量，viii)更高的單糖含量，和ix)相對於相應野生型穀粒的脂質含量，至少90%或至少100%的脂質含量；(b)所述穀粒包含胚；(c)所述穀粒是全穀粒或破碎的穀粒；(d)所述穀粒被加工使得其不再能夠萌發，較佳通過熱處理加工；(e)相對於相應野生型穀粒的萌發率，所述穀粒具有約70%至約100% 的萌發率；(f)與相應野生型穀粒相比，所述穀粒在其總澱粉含量中包含增加比例的直鏈澱粉；和(g)與相應野生型穀粒相比，所述穀粒在其總脂肪酸含量中包含增加比例的油酸和/或降低比例的棕櫚酸。
  6. 根據請求項1-5中任一或多項的穀粒，其特徵為以下的一或多種或全部：(a)所述穀粒包含編碼具有DNA糖基化酶活性的ROS1a多肽的ROS1a基因，較佳在所述穀粒的糊粉層、種皮和澱粉質胚乳的一或多者中，其中所述具有DNA糖基化酶活性的ROS1a多肽較佳是突變體ROS1a多肽；(b)所述穀粒包含突變體ROS1a多肽，其在所述水稻植物表現時，與相應野生型ROS1a多肽相比具有降低的DNA糖基化酶活性，較佳其中所述突變體ROS1a多肽包含一或多個胺基酸取代、缺失或插入，與相應野生型ROS1a多肽相比，所述一或多個胺基酸取代、缺失或插入降低DNA糖基化酶活性；(c)與相應野生型穀粒相比，所述穀粒具有降低的ROS1a多肽總量，較佳在所述穀粒的糊粉層、種皮和澱粉質胚乳的一或多者中被降低，條件是所述穀粒包含至少一個編碼具有DNA糖基化酶活性的ROS1a多肽的ROS1a基因；和(d)所述遺傳變異是外源核酸構築體，其編碼降低所述水稻植物中ROS1a基因表現的多核苷酸，較佳地在所述水稻植物中至少在開花至開花 後7天的時間之間的時間點被降低，條件是所述穀粒包含至少一個編碼具有DNA糖基化酶活性的ROS1a多肽的ROS1a基因。
  7. 根據請求項1-6中任一項的穀粒，其在它的外層著色。
  8. 根據請求項7的穀粒，其是：(a)水稻植物的褐色穀粒或黑色穀粒，所述穀粒包含(i)具有至少2個細胞層或2-7個細胞層的厚度的糊粉層，和(ii)編碼包含一或多個胺基酸取代、插入或缺失的ROS1a多肽的突變體ROS1a基因，與相應野生型水稻ROS1a多肽相比，所述一或多個胺基酸取代、插入或缺失降低DNA糖基化酶活性，所述降低的DNA糖基化酶活性在所述水稻植物中至少在開花至開花後7天的時間之間的時間點發生，條件是至少在開花至開花後7天的時間之間的時間點，與野生型水稻植物相比，所述水稻植物在發育中的穀粒中具有2%至約60%的DNA糖基化酶活性水平；或(b)水稻植物的褐色穀粒或黑色穀粒，所述穀粒包含(i)具有至少2個細胞層或2-7個細胞層的厚度的糊粉層，和(ii)編碼降低所述水稻植物中ROS1a基因表現的多核苷酸的外源核酸構築體，其中所述外源核酸構築體包含編碼可操作地連接於啟動子的所述多核苷酸的DNA區域，所述啟動子至少在開花至開花後7天的時間之間的時間點在所述水稻植物的發育中的穀粒中表現，使得至少在開花至開花後7天的時間之間的時間點，與野生型水稻植物相比，所述水稻植物在發育中的穀粒中具有2%至約60%的DNA糖基化酶活性水平。
  9. 根據請求項1-8中任一項的穀粒，其中所述ROS1a多肽包含與SEQ ID NO：2具有至少95%同一性的胺基酸序列，或所述ROS1a多肽包含與SEQ ID NO：2具有至少95%同一性的胺基酸序列且所述序列與相應的野生型ROS1a多肽的胺基酸序列不同。
  10. 一種純化的和/或重組的ROS1a多肽，其胺基酸序列與相應的野生型ROS1a多肽的胺基酸序列不同，且當與相應野生型ROS1a多肽相比時，其具有降低的DNA糖基化酶活性，較佳沒有DNA糖基化酶活性。
  11. 根據請求項10的多肽，其包含具有與SEQ ID NO：2至少95%相同的序列的胺基酸。
  12. 一種編碼根據請求項10或11的ROS1a多肽的分離的和/或外源的多核苷酸。
  13. 一種分離的和/或外源的多核苷酸，其當存在於水稻植物中時，降低ROS1a基因的表現。
  14. 根據請求項13的多核苷酸，用於至少在開花至開花後7天的時間之間的時間點降低水稻植物發育中的穀粒中的ROS1a基因表現。
  15. 一種編碼根據請求項12-14中任一項的多核苷酸的核酸構築體和/或載體，其中所述核酸構築體或載體包含編碼可操作地連接於啟動子的所述多核苷酸的DNA區域，所述啟動子至少在開花至開花後7天的時間之間的時間點在水稻植物的發育中的穀粒中表現。
  16. 一種重組細胞，其包含根據請求項12-14中任一項的外源多核苷酸或根據請求項15的核酸構築體和/或載體。
  17. 根據請求項16的細胞，其中所述外源多核苷酸、核酸構築體或載體被整合進所述細胞的基因體，較佳整合進核基因體。
  18. 一種水稻植物的細胞，其包含編碼ROS1a多肽的ROS1a基因以及遺傳變異，與相應野生型細胞相比，所述遺傳變異降低所述細胞中至少一個ROS1a基因的活性。
  19. 根據請求項18的細胞，其是糊粉層細胞、果皮細胞、珠心突起細胞、子房細胞、種皮細胞或澱粉質胚乳細胞。
  20. 根據請求項19的細胞，其是糊粉層細胞。
  21. 一種水稻植物，其產生根據請求項1-9中任一項的穀粒、根據請求項10或11的多肽、根據請求項12至13中任一項的多核苷酸、根據請求項15 的核酸構築體和/或載體，和/或其包含根據請求項16-20中任一項的細胞。
  22. 一種在田間生長的至少100株根據請求項21的水稻植物的群體。
  23. 一種產生根據請求項16-20中任一項的細胞的方法，所述方法包括將根據請求項12-14中任一項的外源多核苷酸或根據請求項15的核酸構築體和/或載體導入至細胞、較佳水稻細胞的步驟。
  24. 一種產生根據請求項21的水稻植物或得自其的轉基因穀粒的方法，所述方法包括以下步驟i)向水稻細胞導入根據請求項12-14中任一項的外源多核苷酸或根據請求項15的核酸構築體和/或載體，ii)從獲得自步驟i)的細胞獲得轉基因水稻植物，所述轉基因水稻植物是以所述外源多核苷酸、核酸構築體或載體轉基因的，和iii)任選地從步驟ii)的植物收穫穀粒，所述穀粒是以所述外源多核苷酸、核酸構築體或載體轉基因的，和iv)任選地從所述轉基因穀粒產生一或多代的轉基因子代植物，所述子代植物是以所述外源多核苷酸、核酸構築體或載體轉基因的，由此產生所述水稻植物或轉基因穀粒。
  25. 一種產生根據請求項21的水稻植物或得自其的轉基因穀粒的方法，所述方法包括以下步驟 i)向水稻細胞導入內源ROS1a基因的突變，使得所述突變的ROS1a基因編碼根據請求項9或10定義的ROS1a多肽，或不編碼ROS1a多肽，ii)從獲得自步驟i)的細胞獲得水稻植物，所述水稻植物包含所述內源ROS1a基因的突變，和iii)任選地從步驟ii)的植物收穫穀粒，所述穀粒包含所述內源ROS1a基因的突變，和iv)任選地從所述穀粒產生一或多代的子代植物，所述子代植物包含所述內源ROS1a基因的突變，由此產生所述水稻植物或穀粒。
  26. 根據請求項25的方法，其中所述水稻植物或穀粒包含至少一個編碼具有DNA糖基化酶活性的ROS1a多肽的ROS1a基因。
  27. 一種選擇根據請求項21的水稻植物或根據請求項1-9中任一項的水稻穀粒的方法，所述方法包括以下步驟i)針對根據請求項1-9中任一項的穀粒的產生或針對ROS1a基因中突變的存在或根據請求項1-9中任一項的水稻穀粒的存在，篩選水稻植物或穀粒的群體，所述水稻植物或穀粒各自獲得自祖先水稻細胞、穀粒或植物的誘變處理，和ii)從步驟i)的群體選擇水稻植物，其產生根據請求項1-9中任一項的穀粒或其包含突變體ROS1a基因，或選擇步驟i)的水稻穀粒，其是根據請求項1-9中任一項的水稻穀粒， 由此選擇所述水稻植物或穀粒。
  28. 一種選擇根據請求項21的水稻植物的方法，所述方法包括以下步驟i)從水稻穀粒產生一或多個子代植物，所述水稻穀粒衍生自兩種親本水稻植物的雜交，ii)針對根據請求項1-9中任一項的穀粒的產生來篩選步驟i)的所述一或多個子代植物，和iii)選擇產生所述穀粒的子代植物，由此選擇所述水稻植物。
  29. 根據請求項28的方法，其中步驟ii)包括以下的一或多種或全部：i)針對所述遺傳變異對包含來自子代植物的DNA的樣品進行分析，ii)分析獲得自子代植物的穀粒的糊粉層的厚度，和iii)分析所述穀粒或其部分的營養含量。
  30. 根據請求項28的方法，其中步驟iii)包括以下的一或多種或全部：i)選擇對所述遺傳變異是同基因型組合的子代植物，其中與相應野生型水稻植物相比，所述遺傳變異降低所述水稻植物中的DNA糖基化酶活性，ii)選擇子代植物，與相應野生型穀粒相比，所述子代植物的穀粒具有增加的糊粉層厚度，iii)選擇子代植物，與相應野生型穀粒或其部分相比，所述子代植物的 穀粒或其部分具有改變的營養含量。
  31. 根據請求項28-30中任一項的方法，其還包括i)使兩種親本水稻植物雜交，較佳其中所述親本水稻植物中的一種產生根據請求項1-9中任一項的穀粒，或ii)使得自步驟i)的一或多個子代植物與基因型和不產生根據請求項1-9中任一項的穀粒的第一親本水稻植物相同的植物回交足夠次數，以產生具有所述第一親本水稻植物大部分基因型但產生根據請求項1-9中任一項的穀粒的植物，和iii)選擇產生根據請求項1-9中任一項的穀粒的子代植物。
  32. 一種使用根據請求項27至31中任一項的方法產生的水稻植物。
  33. 一種根據請求項12-14中任一項的外源多核苷酸或根據請求項15的核酸構築體和/或載體的用途，其係用於產生重組細胞、轉基因水稻植物或轉基因穀粒。
  34. 根據請求項33的用途，其用於產生根據請求項1-9中任一項的水稻穀粒。
  35. 一種鑒別產生根據請求項1-9中任一項的穀粒的水稻植物的方法，所述方法包括以下步驟 i)從水稻植物獲得核酸樣品，和ii)針對存在或不存在遺傳變異對所述樣品進行篩選，與相應野生型水稻植物相比，所述遺傳變異降低所述植物中ROS1a基因的活性。
  36. 根據請求項35的方法，其中所述遺傳變異是以下之一或兩者a)表現多核苷酸的核酸構築體，或由其編碼的多核苷酸，其當存在於水稻植物中時降低ROS1a基因的表現，和b)基因，或由其編碼的mRNA，其表現具有降低的ROS1a多肽活性的突變體ROS1a多肽。
  37. 根據請求項35或36的方法，其中所述遺傳變異的存在表明所述水稻植物的穀粒與相應缺少所述遺傳變異的水稻植物相比具有增厚的糊粉層。
  38. 一種鑒別產生根據請求項1-9中任一項的穀粒的水稻植物的方法，所述方法包括以下步驟i)從水稻植物獲得穀粒，和ii)針對以下一或多項篩選所述穀粒或其部分a)增厚的糊粉層，b)所述穀粒中ROS1a多肽的量和/或活性，和c)所述穀粒中由ROS1a基因編碼的mRNA的量。
  39. 根據請求項35-38中任一項的方法，其鑒別根據請求項21或根據請求項 31的水稻植物。
  40. 一種產生水稻植物部分的方法，所述方法包括，a)使根據請求項21或32水稻植物或在田間的至少100株這樣的水稻植物生長，和b)從所述水稻植物收穫所述水稻植物部分。
  41. 一種產生獲得自穀粒的水稻麵粉、麩、粗麵粉(wholemeal)、麥芽、澱粉或油的方法，所述方法包括：a)獲得根據請求項1至9中任一項的穀粒，和b)加工所述穀粒以產生所述麵粉、麩、粗麵粉、麥芽、澱粉或油。
  42. 一種產品，其從根據請求項1-9中任一項的穀粒或根據請求項21或32的水稻植物或從所述穀粒或水稻植物的一部分產生。
  43. 根據請求項42的產品，所述產品包含所述ROS1a基因、所述遺傳變異、所述外源核酸構築體和所述增厚的糊粉層中的一或多種或全部。
  44. 根據請求項42或43的產品，其中所述部分是麩。
  45. 根據請求項42-44中任一項的產品，其中所述產品是食物成分、飲料成分、食物產品或飲料產品。
  46. 根據請求項45的產品，其中i)所述食物成分或飲料成分選自由以下者所組成的群組：粗麵粉、麵粉、麩、澱粉、麥芽和油，ii)所述食物產品選自由以下者所組成的群組：經發酵的或未經發酵的麵包、通心粉(pasta)、麵條、動物飼料、早餐穀物(breakfast cereals)、零食(snack food)、糕餅(cake)、糕點(pastry)和含有基於麵粉的醬的食物，或iii)所述飲料產品是包裝飲料或含乙醇的飲料。
  47. 一種製備根據請求項45或46的食物或飲料成分的方法，所述方法包括加工根據請求項1-9中任一項的穀粒或來自所述穀粒的麩、麵粉、粗麵粉、麥芽、澱粉或油來產生所述食物或飲料成分。
  48. 一種製備根據請求項45或46的食物或飲料產品的方法，所述方法包括將根據請求項1-9中任一項的穀粒或來自所述穀粒的麩、麵粉、粗麵粉、麥芽、澱粉或油和其它食物或飲料成分混合。
  49. 一種根據請求項1-9中任一項的穀粒或其部分或根據請求項21或32的水稻植物或其部分的用途，其係用作動物飼料或食物，或用來產生用於動物消耗的飼料或用於人消耗的食物。
  50. 一種組合物，其包含根據請求項10或11的多肽、根據請求項12至14 中任一項的多核苷酸、根據請求項15的核酸構築體和/或載體，和/或根據請求項16-20中任一項的細胞中的一或多種，以及一或多種可接受的載劑。
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