JPH05503836A

JPH05503836A - 植物類における遺伝性雄性不稔および単為生殖の無性生殖性誘導

Info

Publication number: JPH05503836A
Application number: JP50673988A
Authority: JP
Inventors: マクソン，エレン、ジョーンズ; マクソン，ノーマン、パトリック
Original assignee: エレン　ジョーンズ　マクソン; ノーマン　パトリック　マクソン
Priority date: 1988-07-27
Filing date: 1988-07-28
Publication date: 1993-06-24
Also published as: CN1040123A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

植物類における遺伝性雄性不稔および単為生殖の無性生殖性誘導１、産業上の利用分野本発明は、植物類における遺伝性雄性不稔の無性生殖誘導に関する。以下、この誘導発および遺伝という現象を「無性生殖雄性不稔」またはｒＡＭｓＪという。また、本発明は、雄性不稔と関連するが区別される植物類における単為外様現象を誘導する方法に関するものである。より詳しくいうと、本発明は、一定の受領植物に適用した際に該受領体における遺伝性雄性不稔および／または単為生殖を誘導する一定の植物から誘導し得る因子に関するものである。以下、これらの因子をｒＡＭＳ／ベクター」と呼ぶ。本発明はさらに、遺伝的に異なる雄性不稔植物類を発生させる迅速かつ無性生殖性の方法に関するものである。このような植物類は、作物学、園芸学、果実園芸学および林学に重要なハイブリッドを産生ずるのに用いることができる。２、従来の技術単性化植物類は、雄（雄すい性の）および雌（雌すい性の）器官が独立して同一個別植物上に結実するものである。雄および雌器官は、例えばトウモロコシ植物類のごとく別々の花に位置されるか、あるいは大豆植物類のごとく閉じられた物理的に並列に配置される。単性化植物は、広く自然界において生じ、また重要な農作物、園芸学的変種、木材、果実および木の実収穫樹木等の栽培種の１つとしてよく表わされる。単性化植物類が雄性および雌性器官の両方を有するので、単性化植物類は、自己授精し得る。すなわち、雌器官からの花粉は、雌器官に授粉して、結実をもたらす。雄性および雌性器官が植物上にお互離間配置されるトウモロコシ等の交雑授精（ｃｒｏｓｓ　ｆｅｒｔＮｉｚａｔｆｏｎ）により通常生殖する単性化植物類においてでさえも、自己授精が可能である。単性化は、この上なく有利であるが、栽培変種植物産生において課題を与える。事実、栽培単性化植物が自己授精できないような雄性不稔であることは、極めて望ましい。雄性不稔が有効であるとという状況は、単為結実性果実の産生、花の長期保持を与える濫費用植物の非種子結実および雄性生殖不能の結果、朽が花弁に移動する二重の花の産生を含む。しかしながら、雄性不稔が繁殖（Ｂｒｅｅｄｉｎｇ）手段としてａ効に用いられる最も重要な例は、ハイブリッド、特にＦ＋　（雑種第１代）ハイブリッドの産生である。　ハイブリダイゼーションは、ある遺伝子学的に独特の植物を他で交雑生殖することである。その主な長所は、植物の遺伝子的変異個体およびそれらの子孫を増やし、個体群を安定に保持しさらには植物生長力を増加することである。ハイブリダイゼーションにより得られた増加された植物生長を、当該技術分野においてへテロ−シスと呼んでいる。一般に、最も強力なヘテロ−シスは、最も関連されない遺伝子型がお互いに交雑（ｃｒｏｓｓ）された際に観察される。例えは、未関連載培変種植物間の交配は、より大きい遺伝子型相異のため関連栽培変種植物間の交雑より良好なハイブリッドを産生ずる傾向がある。技術的には、Ｆ１ハイフリットは、その同型接合状態に関係なく、いずれか２つの遺伝子学的に別個の母体植物間の交雑の結果生じる。しかしながら、当該技術分野の一般的に受け入れられた含意において、Ｆ＋ハイブリッドは、２つの同型（しかしながら遺伝子学的に別個の）母体また系の間の交雑の産生物であり、全Ｆ１植物は、確実に、お互い類似じする。Ｆ１ハイブリッドの設定された利点は、ａ）改良された収穫量、花または種子生産物、早期発芽、耐疾患性、耐虫性および他のへテロ−シスの徴候として特に表現されるより大きい生長力であり、ｂ）主な遺伝子が異質状態において存在するため種々の環境条件に対するより大きな適合性であり、Ｃ）これらが雄性対立形質により制限されている際の有効な特徴の発現であり、またｄ）得られるハイブリッド産生物にわたってる栽培者による制御である。栽培者がハイブリッドから作成することを欲する多くの植物は、単性化、すなわち、自己受精並びに交雑受精を行うことができるので、所望のハイブリダイゼーションは、確かな、特に工業的レベルに基づいて達成することが困難である。従って、単性化植物を必須に含むハイブリダイゼ−ションブロダラムの究極的目標は、自己受精を極小化、好ましくは排除することにより交雑受精を制御または促進させることででる。この目的を達成する１つの手段として、種まき機構における１つの母体として雄性不稔植物が用いられている。従来、母体系の雄性不稔は、種々の方法で達成されているが、全て種々の欠点を伴う。例えば、単性孔植物は、植物から雄花、器官または花粉運搬朽を物理的に（機械的または手動的に）除くことにより雄性不稔を行うことができる。この方法は、労働集約的であり、特にフェール−セーフ（ｆａｉ　ｌ−５ａｆｅ）でない大または機械エラーを与えられる。当該分野における物理的去勢は、天候依存であり、その結果、組織または収量の損失がおこる。別法として、単性孔植物を、生育可能な花粉を得る植物の能力を破壊する生殖体撲滅薬等の化学薬品または花粉生育性を影響しないが花粉が自己受精を起こすのを禁止する化学ハイブリダイジング剤で処置してもよい。しかしながら、この方法は、高価および／または有害な環境的影響を導く。単性孔植物における雄の生殖不能に最もよく行なわれる方法は、植物が生長可能花粉を産生ずることを不能にする生物学手段によるものである。生物学的雄性不稔の一例は、当業者において遺伝子的雄性不稔として知られている［オールラード（Ａｌｌａｒｄ、　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｃｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９６０．　ｐ、２５４）　；ワソッ（Ｗａｔｔｓ、Ｆｌｏｗｅｒ　＆　Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｅａｄｉｎｇ、Ｇｒｏｗｅｒ　Ｂｏｏｋｓ　Ｌ。ｎｄｏｎ、　１９８０．　ｐ、４２）コ。要するに、数例の植物において、雄性不稔または雄授精可能状態は、単一遺伝子による。劣性対立遺伝子に関して同型接合の植物は、雄性不稔性であり、ハイブリッド産生の母体系として用いることができる。同系接合雄性不稔系は、５０％同系接合雄性不稔子孫および５０％同系接合雄授精可能子孫を得る公知の異系接合体（生殖不能／受精可能対立形質として）でこれを交雑することにより保持される。つぎのハイブリダイゼーション用母系母体として同型接合雄性不稔子孫のみを用いることを注意すべきである。また、系を反転する雄性不稔となるような他と内部交雑する同系接合体を認めないように注意すべきである。総じて、この方法は、信頼できない。生物学的雄性不稔の別の例は、細胞形質雄性不稔またはＣＭＳとして当該技術分野に公知であり、細胞形質因子に依存する。オールラード前２２２４５〜２４６頁参照をこと。細胞形質の特別な型を担持する植物は、雄性不稔であり、Ｆ１ハイブリッドを作る母体系として用いることができる。これらのＦ１ハイブリッドは、これらの細胞形質が雌配偶子（雄性不稔母体からの）から完全に誘導されるので、全て雄性不稔である。言い換ると、ＣＭＳ特性は、母系的に遺伝されない。雄性不稔の特性を与えることのできる多くのトウモロコシ細胞形質は、ミトコンドリア中に３つのプラスミド様ＤＮＡをｉ’３にすること見い出されているＳグループに属する［シスコ、ピー、エイチ、ら（Ｓｉｓｃｏ、　Ｐ、Ｈ，、ｅｔ　ａｌ、＋　１９８４、　Ｐｌａｎｔ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　３４：Ｌ２７（３４）プリング、ディー。アールら（Ｐｒｉｎｇ、　Ｄ、Ｒ，、ｅｔ　ａｔ、、　１９７７、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７４：２９０４）：ケンベル、アール、ジエイ、ら（Ｋｅｍ旧ｅ、　Ｒ，Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８０．　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　９５：４５１）；コンシス、ンイーら（Ｋｏｎｃｚ、　Ｃ，、ｅｔ　ａｔ、、　１９８１．　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　１８３：４４９）］。Ｓ細胞形質は、安定な雄性不稔を示しておらず［ラーグナン、ジエイ、アール、およびギヤバイーラーグナン（Ｌａｕｇｈｎａｎ、　Ｊ、Ｒ，ａｎｄ　Ｇａｂａｙ−Ｌａｕｇｈｎａｎ、　１９８３．　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、　１７：２７−４８）コ、また数例の遺伝子背景においては、高い割合で雄受精可能に転換する。生物学的雄性不稔のさらに別の例は、しばしば細胞形質−遺伝子雄性不稔と呼ばれる（オールラード、前記ｐｐ。２４６〜２７６参照）。これは、細胞形質雄性不稔と雄性不稔（母系）植物の子孫が必ずしも雄性不稔である必要でないか、一定の遺伝子構造の植物が母体植物として用いられる場合には雄受精可能をなし得るという点のみで相異する。雄性不稔Ｆ１、子孫を産生ずるこれらの父系母体は、雄性不稔細胞形質を有する植物の花粉産生能力を復元する力を育する遺伝子を担持する。これらの遺伝子は、レスドラ−（ｒｃｓｔｏｒｅｒ）遺伝子として知られ、これらを担持する植物は、レスドラ−として知られている。このような細胞形質−道伝子雌生殖不能は、例えばタマネギ繁殖に実施されているしジョーンズおよびデービス（Ｊｏｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｓ、　１９４４、　Ｕ、Ｓ、Ｄ、Ａ、　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　８７４：１−２８＞を参照のこと。］細胞形質雄性不稔または細胞形質−遺伝子雄性不稔によるハイブリッドの産生に関する新規の雄性不稔母体の創造は、戻し交配による困難なかつ時間のかかる有性伝播（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）を要する。細胞形質雄性不稔の有性伝播、より正確には遺伝子型または核成分の雄性不稔産生細胞形質への移動の機構は、オールラード前記２４６〜２４７頁に説明されている。種子工業は、長い間ハイブリッド種子産生物の産生における授粉制御用に有性伝播細胞形質雄性不稔を用いている。しかしながら、有性伝播細胞形質雄性不稔は、いずれか１つの種の極く少ない変異体に担持され、また先に記載されたとおりに、伝播は、新規の雄性不稔母体系に達するために繁殖の数多くの世代を必要とする時間のかかるかつ高価な方法である。複合的繁殖世代の時間、労力および経費に加えて、有性伝播細胞形質の使用は、細胞形質が従来の受粉によっては遺伝子学的に改質されていないので非常に狭い細胞形質基質を誘導している。これは、有害な結果を示している。例えば、１９７０年においてアメリカ合衆国にて発育したトウモロコシの８５％以上は、ハイブリッドトウモロコシの産生においてＣＭＳ系を用いて達成された成功によりＣＭＳ細胞形質のＴ株を担持する。しかしながら、同年度において、南部トウモロコシ葉枯れ病（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｃｏｒｎ　１ｅａｆ　ｂｌｌｇｈｔ）という植物風土病が高いパーセンテージのトウモロ１種、ＣＭＳ−Ｔ細胞形質を有する植物に対して特に有害な子嚢菌によって、引き起こされた。細胞形質雄性不稔の有性生殖伝播による繁殖プログラムの固有の欠点のため、当該技術分野における従事者は、雄性不稔に応答する細胞形質因子を伝播する無性生殖手段を捜しめている。１つの無性生殖手段は、つぎ穂（ｇｒａｆｔｉｎｇ）である。雄性不稔は、ペチュニア［フランケル（Ｆｒａｎｋｅ、、　１９５６．５ｃｉｅｎｃｅ　１２４：６８４−６８５）　；エドワードソンおよびコルペット（Ｅｄｗａｒｄｓｏｎ　ａｎｄおよびアルファルファ［トンプソンおよびアクステル（Ｔｈ。ｍｐｓｏｎ　ａｎｄ　Ａｘｔａｌｌ、　１９７ｇ、　Ｊ、　Ｈｃｒｅｄ、　６９：　１５９−１６４９］等（こおいてつぎ穂伝播性（しかしながらＦ１世代までは発現されない）であることが見い出されている。この方法の有する問題点は、雄性不稔の伝播が低照度でのみ達成されるということである。細胞形質雄性不稔因子もまた、体性融合により無性生殖伝播されている。異なる植物における原形質体を培養液中で融合して、しばしばサイブリッド（ｃｙｂｒｉｄｓ）と呼ばれるハイブリットを形成している。このような技術は、タバコにおいてベルリアードおよびペレティア−（Ｂｅｌｌｆａｒｄ　ａｎｄＰｅｌｌｅｔｉｅｒ　）　（１９８０，Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　２２（１）：６０５）によって用いられている。細胞形質雄性不稔伝播の無性生殖手段としての体性融合の主な欠点は、非常に低い再生顕度と生体外において融合ハイブリッドを選択する適当なスクリーンまたはマーカーを必要とすることである。細胞形質雄性不稔の転移に用いられている他の無性生殖技術は、ネナシカズラ（ネナシカズラ科（Ｃｕｓｃｕｔａ　ｓｐ、）　等の中間宿主による伝播である。このような中間宿主は、当該技術分野においてネナシカズラブリッジ（ｄｏｄｄｅｒ　ｂｉｒｄｇｅ）として知られている。この方法の主な欠点は、ネナシヵズラ自身が雑草および疾病の両方である有害な寄生植物であり、それ故に大規模使用の確実な候補でないということである。グリルおよびギャーガ−（Ｇｒ４１１　ａｎｄ　Ｇａｒｇｅｒ）（Ｌ９８１．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ　７８　（１１）ニア０４３ −７０４６）は、ビシアファヴア　（Ｖｉｃｉａ　ｆ’ａｂａ）　（マメ科植物）とのネナシカズラブリッジを用いている。彼らは、ピン７　ファブアにおける細胞形質雄性不稔と結合する二重鎖ＲＮＡ　（ｄｓＲＮＡ）を同定し、特徴づけた。ｄｓＲＮＡは、外見上直径７０ナノメートルの球状体に位置され、ウィルスによく似た植物の細胞形質に位置された。ｄｓＲＮＡは、まずＣＭＳ　Ｖ。ファヴア上にネナシカズラ生長させ、ついで、このネナシブ１−の受精可能系に伝播された。受領体からネナシカズラを除いた後、その開化が観察された。このように処置された予め受精可能な植物の６０％が雄性不稔となり、もとの雄受精可能植物のｄｓＲＮＡ特性を持続していた。上首尾ではあるが細胞形質雄性不稔の無性生殖伝播の手段としての継穂、原形質体融合およびネナシカズラブリッジの使用は、困難であり、かつ大規模操作に十分に適さない。細胞形質生殖不能はまた、トンジンビニに関してエチジウムブロマイドへの暴露しバートン、ジー、ダブリュ、およびハンチ、ダブリュ、ダブリュ、　、（Ｂｕｒｔｏｎ、Ｇ、Ｗ、　ａｎｄ　Ｈａｎｒ＋ａ、Ｗ、Ｗ、、１９７６、ｃｒｏｐ　５ｃｉｅｎｃｅ　１６：７３１−７３２）によっておよび米に関してＥＭＳでの処置［マリツク、イー、エイチ。側ａｌｌｉｃｋ、Ｅ、Ｈ，，１９８０，Ｇｅｎｅｔ、Ａｇｒ、３４：２０７−２１３）］によって突然変異誘導によって誘導されている。分子量１．９Ｘ１０”および０．５Ｘ１０６の二重鎖ＲＮＡからなる２つの母系伝播核酸種は、ＬＢＮ細胞形質と命名されているトウモロコシの雄性不稔細胞形質におけるミトコンドリアと結合することが見い出されている［シスコ、ピー、エイチ、ら（Ｓｉｓｃｏ、Ｐ、Ｈ，、ｅｔ　ａｌ、、１９８４．Ｐｌａｎｔ　５ｃ１ｅｎｃｃ　Ｌａｔｔｅｒｓ　３４：１２７−１３４）：　グラセンら（Ｇｒａｃｅｎ　ｅｔ　ａｌ　）による米国特許第４５６．１５２　、出願臼１９８４年４月２６日］。プラスミド様ＤＮＡもまた、ソースｌ５１１１２Ｃ雄性不稔モロコシ細胞形質のミトコンドリアに検出されている［ブリング、ディー、アール、ら（Ｐｒｉｎｇ、Ｄ、Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、１９８２．Ｍ雄性不稔を達成する従来技術方法の欠点を克服する植物における遺伝性雄性不稔を誘導する手段を提供することが本発明の目的である。したがって、物理的去勢、化学処理雄性生殖伝播における戻し交配、継穂、原形質体融合および中間宿主ブリッジの困難で、高価でかつ時間のかかる態様を回避する雄性不稔を誘導する迅速な無性生殖的方法を提供することが本発明の目的である。本発明の別の目的は、ヘテローンスを示す新規かつ有効なハイブリッドの工業的産生に有効な新規系の大範囲世代に適する植物における遺伝性雄性不稔を誘導する無性生殖手段および植物自身並びに新規母系を提供することである。この後者に関して、本発明の目的は、このようにして誘導された雄性不稔系の子孫によりひきつづいき受け継がれて工業的規範のハイブリッド生産用雄受精可能母体の数を増加する雄性不稔を無性生殖的に誘導する手段を提供することである。また、従来は雄性不稔母体系としてのみ有効である植物類における雄性不稔を誘導することによるハイブリダイゼーションに用いられる雄性不稔母体系の遺伝子多様化を増加することも、本発明の目的である。本発明のさらなる目的は、高収率で耐疾病性、耐病害性および／または耐悪環境条件性を有する作物学、園芸学、林学、および果実園芸学的に重要なハイブリッドを提供することである。　さらにまた、本発明の目的は、異なる種のみならず異なる放間の並びにジコット（ｄｉｃｏｔｓ）およびモノコツト（ｍｏｎｏｃｏｔ　ｓ　）間の遺伝性雄性不稔植物類を転移する多用途の無性生殖性手段を提供るすことである。さらにまた、今迄多数の植物種に対して可能である方法より便利で効率的な方法で作物学的に望ましいハイブリッド系の永存を認める植物における単為生殖を誘導する方法を提供することである。単為生殖の確立は、配偶子融合を必要とせず雌植物の有する遺伝子組成が同一である種子の開発を認める。これに関して、本発明の目的は、次世代によりの受け継がれることによりハイブリッド種子を連続的に生産するために選別された母体系を繰り返し交雑する必要性を回避するという特徴を有する単為性再生を誘導する手段を提供することである。これらのおよび他の目的は、本明細書に与えられる物質および方法によって達成される。本発明は、一定の雄性不含アルファルファ植物からの抽出物に存在する無性生殖伝播可能雄性不稔および単為性ファクター、ＡＭＳ／ベクターを導く。該抽出物と特徴的に会合され処理された不含植物は、（１）分子量約Ｉ　Ｘ　１０Ｓダルトンを有する独特の単離可能な核酸であり、また（２）顕微鏡で観察されるとおりの２層膜で囲まれた稠密コアからなる直径約４〜１０ナノメートルの粒子である。本発明は、さらに該抽出物および受領植物における雄性不稔および／または単為生殖を無性生殖的に誘導することへのその使用を導く。より詳しくは、ＡＭＳ特性を表わすアルファルファ植物からの抽出物は、例えば噴霧により感受性受領植物に適用した際に受領体において雄性不稔を誘導または付与する。また、これらの抽出物は、このようにして処理された植物において再生の単為性形態を誘導または付与する。特に、ＡＭＳ／ベクター抽出物は、種属にわたって並びにジコットおよびモノコツトの開維性不稔または単為生殖を誘導するのに有効である。本発明は、さらに、改良がＦ１交雑における母性母体として無性生殖的にＡＭＳ／ベクターが誘導された雄性不稔植物を用いることからなる改良されたＦ１ハイブリッド植物を産生ずる方法を提供する。また、本発明は、一方がＡＭＳ／ベクター処理された２つのｆＪＪ体系を交雑してＦ１ハイブリッド子孫を産生じ、Ｆ１ハイブリッド子孫を用いてＦ２子孫を産生じ、表現型がＦｌ　と同一であるこれらＦ２植物を同定して結実させ、該植物を増殖させかつハイブリッド種子を回収することからなる改良されたハイブリッド種子の産生方法を提供する。本発明はさらに、単為生殖植物を産生じ得るハイブリッド種子、該種子から誘導された単為生殖物を提供する。本発明はまた、伝播可能植物植物デリバリ−または発現ベクター系としてＡＭＳ／ベクターを含有する抽出物と独特に会合する約Ｉ　Ｘ　１０６ダルトンの核酸および／または４０〜１１００ｎ粒子の使用を予期する。３．１．定　義以下の略号は、明細書において次の意味で用いられる。Ａ　Ｍ　Ｓ＝無性生殖雄性不稔ＣＭＳ＝細胞形質雄性不稔ＤＮアーゼ＝デオキシリボヌクレアーゼＲＮアーゼ＝リボヌクレアーゼＫｂ　エキロベース　ペアＯＢ　Ｓ＝観察、実験的処置グループＲＥ　Ｐ＝複製（ｒｅｐｌ　１ｃａｔｉｏｎ）Ｔ　ＲＴ＝処　置４、

【図面の簡単な説明】

第１Ａ図は、アルファルファＡＭＳ／ベクターソース１゜２９　（ｌＪ、ｓ、Ｄ、Ａ、ＰＩ　Ｎｏ、２２３３８６）から抽出された核酸（レーン１）、未処置受精可能アルファルファ保持体（ｍａｆｎｔａｆｎｅｒ）から抽出された核酸（変種Ａｒｃ）（レーン３）および未処置受精可能アルファルファ非保持体からの核酸（レーン４）を操作したエチジウムブロマイド染色アガロースゲルの写真である。ＡＭＳ／ベクターソースに会合する約３゜５Ｋｂにおける単一ハンドがレーン１に見られるが、レーン３または４には見られない。第１Ａ図中レーン２は、分子量（上から下まで）２３．６Ｋｂ、９，６Ｋｂ、６．６Ｋｂ、４．３Ｋｂ、２．２ｋｂおよび１，９Ｋｂを有するバクテリオファージラムダＤＮＡのＨｉｎｄｍ消化物である。第１Ｂ図は、受精可能アルファルファから抽出された核酸（変種Ａｒｃ）（レーン１）およびアルファルファＡＭＳ／へフタ−ソース１．　２９（Ｌｌ、Ｓ、Ｄ、Ａ、ＰＩ　Ｎｏ、２２３３８６）での処置により雄性不稔に転換されたアルファルファからの核酸（レーン３）（変種Ａｒｃ）を操作したエチジウムブロマイド染色アガロースゲルの写真である。第１Ｂ図において、Ａ　Ｍ　Ｓ特性に関連する約３，５Ｋｂにおける単一／）ンドがレーン３に見られるが、レーン２には見られない。第１Ｂ図中レーン２は、第１図に記載のとおりバクテリオファージラムダＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ消化物である。第１Ｃ図は、ＡＭＳ／ベクターソース１　＋　２６　（Ｕ、Ｓ、Ｄ、Ａ、Ｐ！　Ｎｏ、２２１４６９）での処置により雄性不稔に転換されたトウモロコシ（変種Ｂ７３）から抽出された核酸（レーン１）および受精可能トウモロコシ（変種Ｂ７３）のもの（レーン２）を操作したエチジウムブロマイド染色アガロースゲルの写真である。ＡＭＳ特性に関連する約３，５Ｋｂにおける単一ハンドがレーン１に見られるが、レーン２には見られない。レーン３は、第１Ａ図に記載されたとおりのバクテリオファージラムダＤＮＡのＨｉｎｄｍ消化物である。第１Ｄ図は、ＡＭＳ／ベクターソース１．３６（υ、Ｓ、Ｄ、Ａ、ＰＩ　Ｎｏ、２４３２２３）での処置により雄性不稔に転換された大豆［変種ウィリアムス（ＷＮＩｉａｍｓ）８２　］から抽出された核酸および受精可能大豆（変種ウィリアムス８２）のもの（レーン２）を操作したエチジウムブロマイド染色アガロースゲルの写真である。ＡＭＳ特性に関連する約３．５Ｋｂにおける単一ハンドがレーン１に見られるが、レーン２には見られない。レーン３は、第１Ａ図に記載されたようなバクテリオファージラムダＤＮＡのＨｉｎｄｍ消化物である。第１Ｅ図は、約３．５Ｋｂ核酸のＤＮＡ特性がＡＭＳ／ベクター含有抽出物と関連したことを表す後述の第６．２節に記載された実験の結果を示す。アルファルファから抽圧された核酸をアガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド染色の前にＤＮアーゼ（レーン１〜７）またはＲＮアーゼ（レーン８〜１４）で処置した。第１Ｅ図は、エチジウムブロマイド染色パターンの写真である。レーン１は、バクテリオファージラムダＤＮＡのＨｉｎｄｍ消化物（第１Ａ図に記載のとおり）であり、レーン２は、レストアラ−アルファルファ−系インジアナ合成（Ｉｎｄｉａｎａ　５ｙｎｔｈｃｔｉｅ）　（Ｃ）であり、レーン３は、ＡＭＳ／ヘクターソース１．　２６（ｔｌ、ｓ、Ｄ、Ａ、ＰＩ　Ｎｏ、２２１４８９）であり、レーン４は、ＡＭＳ／ベクターソース１．　３６（Ｌｌ、Ｓ、Ｄ、Ａ、ＰＩ　Ｎｏ、２４３２２３）であり、レーン５は、アルファルファ保持体（変１Ａｒｃ）であり、レーン６は、ＡＭＳベクターソース１．、　２９（Ｕ、Ｓ、Ｄ、Ａ、ＰＩ　Ｎｏ、２２３３８６）であり、レーン７は、ＡＭＳ／ベクターソース１．　７（Ｕ、Ｓ、Ｄ、Ａ、ＰＩ　Ｎｏ、１７３７３３）であり、レーン８は、バクテリオファージラムダＤＮＡのＨｉｎｄ■消化物（第１Ａ図に記載のとおり）であり、レーン９は、レスドラ−アルファルファ−系インジニア合成（Ｃ）であり、レーン１０は、ＡＭＳ／ベクターソース１　、　２６　（Ｕ、Ｓ、Ｄ、Ａ、ＰＩ　Ｎｏ、２２１４６９）であり、レーン１１は、ＡＭＳ／ベクターソース１．　３６（Ｕ、Ｓ、Ｄ、Ａ、ＰＩ　Ｎｏ、２４３２２３）テあり、レ−：／１２は、アルファルファ保持体（変種Ａｒｃ）であり、レーン１３は、ＡＭＳベクターソース１．　２９（ｔｌ、ｓ、Ｄ、Ａ、ＰＩ　Ｎｏ、２２３３８６）でありまたレーン１４は、ＡＭＳ／ベクターソース１、　７（Ｌ！、Ｓ、Ｄ、Ａ、ＰＩ　ＮＯ，１７３７３３）である。ＡＭＳ／ベクターソースにおいて存在する約３．５Ｋｂバンド（矢示する）がＲＮアーゼ処置後に残るが、ＤＮアーゼ処置後は、不存第２Ａ図は、雄性不稔アルファルファ植物Ｕ、Ｓ、　Ｄ。Ａ　ＰＩ　Ｎｏ、２２３３８６の粗抽出物に存在する４０〜１１０ナノメートル粒子の電子顕微鏡写真である。倍率：２０．０００倍。第２Ｂ図は、雄性不稔アルファルファ植物Ｕ、　Ｓ、　Ｄ。Ａ　ＰＩ　Ｎｏ、２２１４６９＋７）小卵に観察される４０〜１１０ナノメートル粒子の電子顕微鏡写真である。倍率：１０．０００倍。第２Ｃ図は、アルファルファ保持体とアルファルファＡＭＳ／ベクターソースＵ、Ｓ、Ｄ、Ａ　ＰＩ　Ｎｏ、２２３３８６の抽出物での処置により雄性不稔に転換された以前は受粉可能であったアルファルファ植物との交配からの種子の薄片の電子顕微鏡写真である。暗かっ色スポットを示す白色封入体は、ＡＭＳ／ベクターに関連する約３．５Ｋｂ核酸を含有するであろう。倍率：２０．０００倍。第３（３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄ）図は、後述の第６゜関する裂開花粉を含有する雄花の穂からの朽に存在する花粉を示す代表的顕微鏡写真である。第４図は、後述の第６．９節の記載されたフィールドテストからのレーン　マイズ　の変種２に関する裂開花粉を示す雄花の穂からの朽を示す顕微鏡写真である。第５Ａ図は、圧力を加えた後の第４図に示された変種１の朽からの花粉の放出を示す顕微鏡写真である。第５Ｂ図は、圧力を加えた後の第４図に示された変種２の朽からの花粉の放出を示す顕微鏡写真である。第６図は、後述の第６．９節に記載のフィールドテストからのレーン　マイズ　エル、トウモロコシ植物の変種４において、圧力を加えた後の裂開されていない花粉を有する朽中の観察可能な伝播組織を不存在を示す顕微鏡写真である。第７図は、後述の第６．１０節に記載の栽培室テストかな均一が寸法および形状の花粉粒子を有する朽を示す顕微鏡写真である。第８図は、第７図に示す朽のアセトカーミンでの赤色染色を示す代表的顕微鏡写真である。第９図は紅斑を付着された第７図に示す朽の花粉粒子の特徴的塊を示す代表的顕微鏡写真である。第１０図は、後述の第６．１０節に記載の栽培室テストからの処置大豆植物（グリシン　マックス　変種、ウィリアムス　８２）からの非染色異常形状花粉粒子と正常花粉との混合物を含む杓を示す代表的顕微鏡写真である。第１１図は、第１０図に示される規則的形状の、アセトカーミンでの染色不足の、および高程度の空胞化の朽を示す代表的顕微鏡写真である。第１２図は、後述の第６．１０図に記載の栽培室テストからの処理大豆植物（グリシン　マックス　変種　ウィリアムス　８２）からの花粉粒子を欠く朽を示す代表的顕微鏡写真である。第１３図は、圧力を加えた後の、第１２図に示される朽における観察可能花粉粒子の不存在を示す代表的顕微鏡写真である。第１４図は、後述の第６．１１節に示された実験からの「同系交配置」レーン　マイズ　エル、トウモロコシ植物の代表的授精可能雄花の穂の写真である。視覚できる朽の裂開はなかった。このような雄花の穂は、花粉を脱落せず、また生殖不能と評価された。第１５図は、後述の第６．１１節に示された実験からの「同系交配２」ジーア　マイズ　エル、トウモロコシ植物の代表的不含雄花の穂の写真である。視覚できる巧の裂開はなかった。このような穂は、花粉を脱落せず、また生殖不能と評価された。第１６図は、後述の第６．１１節に示された実験からの同系交配ジーア　マイズ　エル、トウモロコシ植物の代表的雄花の穂の写真である。第１６Ａ図は、裂開朽を示す同系交配置の授精可能雄花の穂を示す。（青色紙上の花粉の塊が明らかである。）第１６Ｂ図は、不稔と評価された同系交配置の穂を示す。第１６Ｃ図は、授精可能と評価された同系交配２の雄花の穂を示す。第１６Ｄ図は、授精不能と評価された同系交配台２の雄花の穂を示す。第１７図は、後述の第６．１１節に示された実験からの同系交配ジーア　マイズ　エル、トウモロコシ植物の代表的雄花の穂の写真である。第１７Ａ図は、授精可能と評価された同系交配４の雄花の穂を示す。第１７Ｂ図は、不稔と評価された同系交配４の雄花の穂を示す。第１７Ｃ図は、授精可能と評価されたがただ１つの裂開巧のみを示す同系交配２の雄花の穂を示す。第１７Ｄ図は、授精可能と評価された１０までの裂開朽を示す同系交配台４の雄花の穂を示す。第１８図は、後述の第６．１１節に記載された実験から雄花の穂からの朽のアセトカーミン染色の結果を示す代表的な顕微鏡写真である。第１８Ａ図は、授精可能と評価された雄は花の穂からの同系交配置の正常な丸いかつ染色可能な花粉を示す。第１８Ｂ図は、授精可能と評価された同系交配２の雄花の穂からの花粉を示す。第１８Ｃ図は、授精可能と評価された同系交配３の雄花の穂からの花粉を示す。第１８Ｄ図は、授粉可能と評価された同系配列４の雄花の穂からの花粉を示す。第１９図は、後述の第６．１１節に記載された実験からの同系交配台ジーア　マイズ　エル、トウモロコシ植物の雄花の穂からの朽のアセトカーミン染色の結果を示す代表的な顕微鏡写真である。第１９Ａ図は、授精可能と評価された同系交配置の雄花の穂からの十分に裂開された朽を示す。ＦＪ壁および単一花粉粒子が明らかである。第１９Ｂ図は、授精可能と評価された同系交配２の雄花の穂からの十分裂開された朽を示す。第１９Ｃ図は、授精可能と評価された同系交配３の雄花の穂からの十分に裂開された朽を示す。第１９Ｄ図は、授精可能と評価された同系配列４の雄花の穂からの十分に裂開されためを示す。第２０図は、後述の第６．１１節に記載された実験からの同系交配台ジーア　マイズ　エル、トウモロコシ植物の雄花の穂からの朽のアセトカーミン染色の結果を示す代表的な顕微鏡写真である。第２０Ａ図は、生殖不能と評価された同系交配置の穂からの朽における花粉を示す。第１８Ｂ図は、生殖不能と評価された同系交配２の雄花の穂からの朽における異常な花粉を示す。第２０Ｃ図は、生殖不能と評価された同系交配３の雄花の穂からの朽における異常な花粉を示す。第２０Ｄ図は、生殖不能と評価された同系配列４の雄花の穂からの朽における異常な花粉を示す。第２１図は、後述の第６．１１節に記載された実験からの同系交配台ジーア　マイズ　エル、トウモロコシ植物の雄花の穂からの朽のアセトカーミン染色の結果を示す代表的な顕微鏡写真である。第２１Ａ図は、粉砕して異常な、不規則形状の染色不能な花粉を表わした生殖不能と評価された同系交配置の雄花の穂からの朽を示す。第２１Ｂ図は、粉砕して異常な不規則形状の染色不能を表わした授粉可能と評価された同系交配２の雄花の穂からの朽を示す。第２１Ｃ図は、粉砕して異常な花粉を表わした生殖不能と評価された同系交配３の雄花の穂からの巧を示す。第２０Ｄ図は、粉砕した後、花粉を表わさない生殖不能と評価された同系配列４の雄花の穂からの朽を示す。第２２図は、後述の第６．１１節に記載された実験からの同系交配台ジーア　マイズ　エル、トウモロコシ植物の雄花の穂からの朽のアセトカーミン染色の結果を示す代表的な顕微鏡写真である。第２２Ａ図は、一般でないやや染色可能な正常外観花粉を現わす生殖不能と評価された同系交配置の雄花の穂からの杓を示す。第２２Ｂ図は、授粉可能と評価された同系交配２の雄花の穂からの裂開されていない朽における主に異常であり少数の正常な外観の花粉を示す。第２２Ｃ図および第２２Ｄ図は、主に正常な外観の花粉を附与した突起部分を表わす第２２Ｂ図に記載の朽を中東原産の外国産アルファルファ［メディカゴ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）属は、ＡＭＳ／ベクターのソース（宿主）として利用できる。シード、インクリース、コレクション、ニー、ニス、ディー、エイ９．レノ、ネバダ州（１９７９〜１９８４年）［５ｅｅｄ　Ｉｎｃｒｅａｓｅ　Ｃｏｔ）ｅｃｔｉｏｎ、Ｕ、ｓ、Ａ、、Ｒｅｎｏ、Ｎｅｖａｄａ　（１９７９−１９８４）］から得られた植物は耐虫性が保１され、結実を減少した。約１７．０００本の中から、５本をＡＭＳ／ベクター特性を産み出すように選択した。すなわち、感受性受領体に適用された際に雄性不稔を附与する抽出可能因子を全て有していた。全てのＡＭＳ／ベクター産生植物は、雄性不稔、四倍体の、紫色孔の多年草であることを特徴とした。該植物の抽出物は、直径約４０〜１００の粒子および分子量約１．ｌＸ１０Ｂダルトンを有する単離可能な核酸を含有していた（第６．２節参照）。本明細書に記載される特定の実施態様におけるＡＭＳ／ベクターとして利用できる該特定植物は、シード、インクリース、コレクションより得られた際に以下の植物提供番号［ＰＩａｎｔ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｎｕ＋ｗｂｃｒ（ＰＩ　Ｎｏ、）を示した。すなわち、ＰＩ　Ｎｏ、１７２４２９、ＰＩ　Ｎｏ、１７３７３３．　ＰＩ　Ｎｏ、２２１４６９、ＰＩ　Ｎｏ、２２３３８６およびＰＩ　Ｎｏ。２４３２２３である。各々５つのソースとＡｒｃ誘導保持体植物［メディカゴ　サティビア　変種　Ａｒｃ　ニー。ニス、ディー、エイ、ラボラトリーズ、ペルトスビレ　ＭＤにて開発側ｅｄ１ｃａｇｏ　５ａｔ１ｖａ　ｖａｒ、Ａｒｃ、　Ｕ、Ｓ、Ｄ、Ａ、Ｌａｂｓ、　Ｂｅ１ｔｓｖｉｌｌｅ、　ＭＤ）］との交雑から得られる植物からの種子は、ＡＭＳ／ベクターのソースとして利用できる植物を発生させるのに利用できる。ＡＭＳ／ベクターの他のソースは、存在し得る。これらは、第５．２０節および第５．３０節の方法に従って実験的に決定され得る。５、　２．　Ａ、ＭＳ／ベクター抽出物の調製および適用Ａ　Ｍ　Ｓ　／ベクター含有調製物は、単純な抽出法によって調製し寿る。宿主アルファルファ植物は、これが十分に発達した樹冠を有する際、通常は１／１０開花期または一週間前に収穫される。葉および茎を直ちに用いるか将来の使用のため凍結保存される。植物原料は、リン酸カリウム緩衝液（例えば、０．０６７Ｍ　ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６，９）等の好適な非致死緩衝液に懸濁される。具体的には、緩衝液５〜７ｍｌごとに、約１ｇの植物細胞を懸濁する。浸飾物（ａｂｒａｄｏｒｓ）　（例えばセライト等のケイソウ土）または吸収増進剤（例えばジメチルスルホキシドまたはＤＭＳＯ）等の他の成分を加えて抽出してもよい。植物原料を例えば高速ブレングー中でブレンドする等の好適な手段で離解してホモジネートを形成する。残った植物残渣を濾過、デカンテーションまたは他の好適な手段によって除去する。該抽圧法は、滅菌条件下にて行なわれる必要はなく、また得られる濾過または抽出物を、滅菌条件に貯蔵する必要はない。該抽出物は、使用前約３時間までの間冷凍保存される。他に、これを使用まで例えば液体窒素中に冷凍保存してもよい。このようにして調製されたＡＭＳ／ベクター抽出物は、標準フィールド装置を用いて受領植物上に噴霧される。一般には、抽出物のただ一度の適用が必要である。特定の実施態様において、１植物に対して約５〜２５ｍ１を適用する。抽出物は、受領体の葉の上に噴霧する。浸飾物（例えばセライト）の含有が好ましい。受領植物は、葉群を有するが開化および結実の前の時点で噴霧されるべきである。例えば、大豆植物受領体は、少なくとも発芽後約２週間において噴霧される。すなわち、時期早尚の適用は、雄性不稔を誘導しないかあるいはほとんど誘導しない。トウモロコシ植物受領体は、発芽後約２週間最生長期間の初めに第５葉をさらした際噴霧され得る。アルファルファの場合、受領体が樹冠上′ｆＪ２　ｃｍ狩り込み、２週間以内に、アルファルファ受領体は、抽出物を適用される。適用の他の方法は、限定されるものではないが組織培養（ＡＭＳ／ベクター含有培地中の植物組織の懸濁）、原形質内へのＡＭＳ／ベクターのエレクトロポーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒｔｊｏｎ）　（例えば野菜栽培に関して）および接種（例えば、樹木に関して）がある。５．３．ＡＭＳ／ベクターによる雄性不稔誘導性植物全植物は、誘導性に遺伝子的に予めさらされた場合に、ＡＭＳ／ベクターによる雄性不稔への潜在的誘導性できる。これは、雌雄同体性植物および雄性不稔を誘導する結果、雄植物が雌植物に転換される場合に雌雄異株体（すなわち、雄および雌植物が異なる個体に生じる植物である）をも含む。以下の理論に結びつけられることを望まないが、誘導性受領体にお〜）で、全染色体がＡＭＳ／ベクターによって媒介される雄性不稔の誘導性に関して劣性対立遺伝子を運搬することを仮定する。例えば、雄性不稔の誘導性に関する劣性対立遺伝子が誘導性受領体であるｒｒＪで示される場合、四倍体（例えば、アルファルファ）は、植物の細胞の核内でｌ”ｒｒｒｒＪ状態になければならず、一方二倍体（例えば大豆またはトウモロコシ）は、ｒｒｒＪ状態でなければならない。非常に興味深い植物は、限定されるものでないが、穀粒作物、飼料作物、種子繁殖果実、種子繁殖観賞植物および工業的種を含む作物学的および園芸学的に重要な植物である。ＡＭＳ／ベクターの受領体として用いられ新規の雄性不稔植物を創作することができる代表的な雌雄同体性植物を第１表に挙げる。表は、例示のために示され総括的なものでない。第１表ＡＭＳ／ベクターにより雄性不稔に誘導され得る生花性植物モロコシ　みかんカブベニバナ　繊維亜麻アブラナ　ケルブＡ、　Ｍ　Ｓ　／ベクターによる雄性不稔に誘導性の受領植物は、第５．２節に記載のごとく適用し、花粉産生および結実に関して該受領植物を目視評価することによって同定し得る。花粉および／または種子を産出しないものは、誘導性受領体である。本発明は、誘導性受領体を同定するためのＤＮＡプローブの使用を誘導する。公地の誘導性または非誘導性植物のＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ消化させる。誘導性植物に独特のフラグメントは、同定され、ＤＮＡプローブを作成するテンプレートとして利用できる。ついで、これらのプローブは、ハイブリダイゼーション方法論を介して他の受領体に関してスクリーンするのに用いられる［マニアナイス、ティー、ら（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、ｅｔ　ａｌ、、１９８２．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｏｒｙ　Ｍａｎｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）参照のこと］０別に、プローブは、独特の核酸がＡＭＳ特性を表す植物と結合された誘導植物を同定するのに用いることもできる。５．４．ハイブリッドを産生ずるためのＡＭＳ／ベクター誘導雄性不稔植物の使用ＡＭＳ／ベクター誘導雄性不稔植物は、当該技術分野公知のハイブリダイゼーション機構における母系の母体系として使用することができる。このような雄性不稔母系系は、「保持体」、すなわち遺伝子学的に同一の非ＡＭＳベクター処置植物とこれらを交配することによって保持または数を広げることができる。ＡＭＳ／ベクター誘導雄性不稔母体系と交雑する母体系の選択は、Ｆ、子孫の使用目的により多様である。Ｆ１子孫が例えば飼料作物または観月植物に望ましいまたはそれ自身そのようである場合、Ｆ１ハイブリッドが雄受精可能であり、それゆえに種子を産生ずることができるという必要はない。従って、雄受精可能であるＦ１ハイブリッドになる雄母体系を選択する必要はない。しかしながら、Ｆ１子孫植物が種子生産性物であることが望ましい場合、レスドラ−を雄母体系として使用することかてぎる。レスドラ−は、交雑を行ない、Ｆ１子孫の受精パーセントを観察することによって同定され得る。雄性不稔植物ユ体植物と交雑された際に受精可能Ｆ１子孫を得る雄母体植物は、レスドラ−とみなされる。同系交配トウモロコシ系に関する説明のために、８７３は、ＡＭＳ／ベクター誘導不稔Ｍ　ｏ　１７の公知のレスドラ−であり、Ｍｏ１７は、ＡＭＳ／ベクター誘導生殖不能Ｂ１７の公知のレスドラ−でありまたＨ２ＳはＡＭＳ／ベクター誘導不稔Ａ６３２の公知のレスドラ−である。一般に、２つの同系交配系かより無関係になるに従って、一方は、他方に関するリスドラ−として使用する傾向あり逆も同様である。リスドラ−に変って、雄性不稔母系植物と交雑した際に種子により植物的に繁殖されるＦｌを得る雄性不稔植物は、種子産生Ｆ１ハイブリッドの産生に関する父系植物として用いることができる。ＡＭＳ／ベクターを含有するＦ１子孫および雄性不稔植物の両者は、他の方法に加えて、植物的に繁殖され得る。植物の茎は、土壌に移植する前に、根もとから狩り採られ、根づけ培地（ｒｏｏｔｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍ）に配置され根づかせる。繁殖の組織培養液はまた、使用を示唆される［文献に関しては、バフシル。アイ、ら（Ｖａｓｉｌ、　１．、　ｅｔ　ａｌ、、　１９７９．　ｉｎ　Ａｄｖａｎｃｃｓ　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｖｏｌ、２０．　Ｃａ５ｐａｒｉ、　Ｅ、Ｗ、、　ｅｄ、　Ａｃａｄｅｇ＋ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐｐ−１２７−２１８）参照のことコ。５．５．単為生殖の誘導５、　５．　１．高等植物における無性生殖再生一般に、高等植物（ｈｆｇｈｅｒ　ｐｌａｎｔ）は、日常的には有性生殖繁殖、すなわち、配偶子融合により繁殖するが、一定の型の植物中には、種々の型の無性生殖再生がある。いくつかの変種は、具体的には人工的植物繁殖により無性生殖繁殖させることができる。この技術は、結実力の乏しい植物において植物栽培者によりしばしば用いられる。すなわち、これもまた、種子繁殖より生じる望ましくない遺伝的多様性を排除するのに用いることができる。植物繁殖は、根、塊茎、はうく枝、地下茎、茎または葉を切ることによって、または組織培養により達成され、この方法で得られたそれらの植物は、突然変異種がなく、遺伝子型または表現型的に母体植物と同一である。数多くの公知の商業作物は、日常的にこの方法で産生される。例えば、茎の部分は、しばしばサトウキビの繁殖に用いられるが、これは単に非熱帯領域において花を産生ずるのみである。同様に、根および塊茎は、キャラサバ、サツマイモ、ジャガイモおよびヤムイモ等の球根作物類に利用される。結実を含む非常に異なる型の無性生殖段階は、単為生殖として知られている。自然発生的に、すなわち、ヒトの介在のない再生のこの形態は、数百種の植物種がある。有性生殖器官および関連構造は、再生に参加するが、形成される種子は、配偶子の結合なしで産生される。一定の植物種において、単為生殖は、唯一の再生形態であり、そしてこれらの植物は、強制アポミクトとして知られている。しかしながら、しばしば単為生殖性植物は、しばしば配偶子および単為性再生の両者を表わし、該植物は、条件的アポミクトと呼ばれる。後者のグループにおいて、有性および無性生殖段階は、個々の植物において同時に操作する。強制および条件的アポミクトの両者において１、無性生殖段階にふくまれるいくつかのメカニズムおよび該メカニズムの組合せがあり得る。４つの基本型の無性生殖がある。無配生殖において、胚は、卵子以外の２つの単相核から発達する。すなわち、しばしばシネロギッツ（ｓｙａ＋ｅｒｇｉｄｓ）または対鍍細胞の胚嚢の２つの細胞の融合から生じる。無配子生殖において、胚嚢は、胞子の減数分裂および形成なしで体細胞から直接発達する。すなわち、胚は、授粉なしで二倍子卵子から発達する。配偶子生殖において、胚は、減数分裂なしで大胞子母細胞から発達する。最終的には、単為性胞子原（ｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓｓ）において胚は、未授粉卵子から直接発達し、卵子を産生ずる減数分裂の秩序により単相であってもよく単相でなくてもよい。この議論のために、用語「単為生殖」を一般的に用いてこれらの現象のいずれかまたは全てのまたは同一の結果を生じるいずれかの変更に適用する。一般に、単為生殖が一般に制御されることが信じられており　［タリアフエ口、シー、エム、　、（Ｔａｌｉａｆｅｒｒｏ、　Ｃ，Ｍ、、　５ｏｕｔｈｅｒｎ　Ｐａ５ｔｕｒｅ　Ｆｏｒａｇｅ　Ｃｒｏｐ　１ｍｐｒ、　Ｃｏｎｆ。Ｒｅｐ、　２Ｂ　＋　４４−４３．１９６９）］、また、単一遺伝子により制御されるであろうことが提案されている［バーランら（Ｈａｒｌａｎｅｔ　ａｌ、、Ｂｏｔ、Ｇａｚ、１２５：４４−４６．　１９６４）コ　。５、　５．　２．繁殖における単為生殖の使用最初に見い出された齢に、単為生殖は、植物繁殖に対する完全なバリアーであるとみなされていた。強制アポミクト間のハイブリダイゼーションは、はとんどのようなことがあっても、事実上不可能な期待である。はとんどの型の単為生殖において、胚は、母系植物と同一の遺伝子構造を有しており、これは真性クローンである。したがって、新規の変種またはハイブリッドを開発する目的で単為性系に変種を採り込む可能性は、厳密に制限されるらしい。事実、早期の従事者は、再生的単離に関する可能性のため単為生殖を進化論的「行き詰まり」とみなしていた［ダーリングトン（Ｄａｒｌｉｎｇｔｏｎ、　Ｔｈｅ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、　ｐ、１４９　じｎｆｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、１９３９）］。しかしながら、近年、該現象が繁殖に貴重な適用を示し得ることが植物栽培者に明らかになった。単為生殖が完全に制御することができるなら、種子増殖の利点を有して植物器官より繁殖する一定性および信頼性を提供するシステムである手段が提供されることによって生産者は、利益を得る。さらに栽培者は、優れたハイブリッド組合せを単離し、同時に真性繁殖体Ｆ１を得ることによってヘテロ− シスを「固定」する種々の母系ベアリングを用いて実験することのできるという利益を達成する。この技術は、ハイブリッド種子産生が不適切な授精のための低い結実により生産量において阻害されている穀物に特に有効であるとみなし得る。このような重要な穀物としては、例えば、小麦、大豆および綿がある。５、　５．　３．単為生殖のＡ　Ｍ　Ｓ　／ベクター誘導植物の処置により得ることのできる雄性不稔に対する観察された効果に加えて、ＡＭＳ／ベクターが処置植物における単為生殖を誘導する能力を有することも予期せずに見い出した。ＡＭＳ／ベクター処置植物における雄性不稔の遺伝形質のパターンの研究プロセスにおいて、他の表現型特性の遺伝子形質における一定の初期の観察は、いくつかの処置植物が有性生殖再生植物間の正常ハイブリッド産生から期待されるパターンを表わさないことを示した。例えば、交雑は、一方の母体がＡＭＳ／ベクターで処置された異なる大豆植物系間で行なわれ、雄性不稔が示された。大豆は、本来単為性であることが知られていない。雄母体として用いられる選択雄性不稔植物は、白色の花および緑色の胚軸を産生じ、雄母体として用いられた雄授粉可能植物は、紫色の花および紫色の胚軸を産生じた。各々これらは、単一遺伝子により制御された。この交雑により産生されたＦｌは全て期待されたとおりに紫色の花および、紫色の胚軸の表現型を表わした。すなわち、これらの植物の中で相当のパーセンテージで雄性不稔であり、数パーセントか結実する。ついで、Ｆ、は、自己的にＦ２世代を産生１．た。有性生殖増殖および遺伝の正常のパターンが生じていたなら、得られるＦ２世代は、花および胚軸の色に関して分離されるはずであることが期待される。しかしながら、驚くべきことに、花および胚軸の色の分離が事実上なく、そしてさらにＦ２における著しい数の植物は、結実する雄性不稔であった。このパターンは、正常有性生殖再生に期待されるものと正反対であるばかりでなく単為性種子産生、すなわち、（１）Ｆ＋ハイブリット交雑の子孫の間に期待される分離の不存在、および（２）なお結実する雄性不稔子孫の発生と一致している。この観察されたパターンは、少しの衰退がＦ５世代において観察されたが、ひきつつきＦ３およびＦ４世代に繰り返された。それにもかかわらす、単為生殖または単為生殖様現象は、感受性植物にＡＭＳ／ベクターを適用することによって誘導可能であるようだ。同様なパターンは、小麦およびトウモロコシによる予備試験に観察されている。単為生殖を誘導するだめの植物の処置は、雄性不稔の誘導とほぼ同一の方法で達成される。通常の適用方法は、開花前、かつ植物が十分に成熟して群葉を発生する時に披見植物を噴霧する。他に、生長種子を直接作用させるために開花直後噴霧することも望ましい。ある種の植物への適用練した植物培殖者の範中である。ＡＭＳ／ベクター適用に従って、交雑より得られる種子を種まきして成熟させ、Ｆ１ハイブリッド世代を構成する。全種類のＦｌは、同−表現型であるべきである。これらは、通常処置より得られる数多くの雄性不稔植物である。Ｆ１植物を自己受粉（ｓｅｌｆ＞させる。この種子は、回収され種まきされて、得られるＦ２世代の表現型が観察される。単為生殖の誘導が生じない場合、Ｆ２の植物は、３：１の特性比示し、減数分裂の際の分離により種々の母体特性の組合せを示す。しかしながら、単為生殖が生じた場合、得られるＦ２は、Ｆ１世代と実質的に全て表現型的に同一である。補足的に、多くが結実する数多く雄性不稔植物がある。これらの両特性の存在は、単為生殖が生じかつ産生される種子がもとのハイブリトッド交雑により産生されたちの同一であることを示す。ＡＭＳ／ベクターはまた、植物ベクターシステムとじて貴重である。ＡＭＳ／ベクターを含有する抽出物と結合された４０〜ｂリーンステム、として、例えば栄養素、農薬等の生体活性分子のデリバリ−用の利用可能性を有する。ＡＭＳ／ベクターまたはその誘導体、突然変異体またはフラグメントを含有するｌＸ１０Ｂ　（程度）ドルトンの核酸もまた、伝播性発現ベクターとしての潜在的価値を有する。この核酸は、異形遺伝子配列から構成された際に異種遺伝子配列の発現ベヒクルとして用いることができるる。このような核酸は、４０〜１１０ｎｍ粉子と接合または接合なしで用いることが不稔アルファルファ系（シード、インクリース、コレクション、ニー、ニス、ディー、ユイ、、レノ、ネバダ州より得られた）は、つぎ穂実験によりＡＭＳ／ベクターの存在をスクリーニングした。まず、１７の不稔アルファルファ系は、目視評価および種子に対するアセトカーミン染色によって同定され、ついで保持体とみなされるアルファルファ植物と交雑することにより不稔として確認された。つぎ穂として異なる保持体を用いて、各不稔系に対して１５のつぎ穂を行った（つぎ穂の上部）。２５５のつぎ穂をミストチャンバーに配置し、開花させ、（ドリッピングにより）自己授精させた。種子を収穫した。つぎ穂世代において観察された不稔の事例はなかった。次世代の植物を発芽し、生殖不能の存在または不存在に関して、開花時に評価した。花をトリップし、ついで次のとおり１．３．５または７と評価した。１＝朽なし、非裂開花粉。３＝朽あり、非裂開花粉。５＝朽あり、裂開花粉あり。７＝朽あり、豊富な裂開花粉あり。すなわち、評価１または３を与えられた植物は、不稔であり、評価５または７を得られた植物は、授精可能である。植物不稔を確認するために、不稔植物を自己授精する企みを行った。また、不稔植物は、不稔と近親繁殖効果とを混合するのをさけるために異なる保持体植物に交雑された。不稔植物はまた、リスドラ−型インディアナ、シンセティック（Ｃ）に交雑させた。２つの評価基準は、植物をＡＭＳ／ベクターとみなすために、（ｉ）未関連保持体植物との交雑後の不稔性の保持および（ｉ　ｉ）レスドラ−型との交雑後の授精可能子孫を満足しなければならない。スクリーニングされた１７の不稔系のうち、５つの系は、ＡＭＳ／ベクター宿主として同定された。この５つの同定されたＡＭＳ／ベクターソースをさらにつぎ穂実験に用いた。− 年生閉花授精（すなわち開花前にＳ／ベクター系に関してつぎ穂としてつぎ穂した。つぎ穂は、つぎ木世代において授精可能を変えず、全て授精可能であった。しかしながら、次世代は、顕度約１０％で雄性不稔植物を含んだ。６．２、ＡＭＳ／ベクター宿主と結合する核酸の特徴づけ第６．１０節に議論されたごと（ＡＭＳ／ベクターに関して陽性をスクリーニングしたアルファルファ植物は、独特の核酸を有する。該植物の抽出物を受領体（保持体）に適用する際、同一の核酸は、受領体（雄性不稔に無性生殖誘導された）からつづいて抽出できる。この核酸は、未処置同種同形保持体からは抽出できない。この核酸は、分子量約１．ｌＸ１０８ダルトン（約３゜３〜３．５キロベース）を有しておりＤＮＡであるとみなされる。全植物からのＤＮＡおよびＲＮＡ抽出の方法に従って、独特な核酸は、第６．１１節に記載されたアルファルファの葉、茎および／または胚珠から誘導された第一癒傷組織から単離されている。同一の方法をＡＭＳ／ベクター抽出物での処置により雄性不稔に誘導されたアルファルファ、大豆およびトウモロコシ植物について行ない、独特な核酸をこれらの植物からも単離した。５０ｍ１の遠沈管における植物組織５ｇにｌｘ　ＳＴＥ抽出緩衝液、０．１Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣ，１２）　、０．　０５Ｍトリス、０．００１Ｍエチレンジアミントリクロロ酢酸（ＥＤＴＡ）　、ｐＨ７，１％メルカプトエタノール含有を加える。組織を４℃にて１分間テクマーブレンダー（Ｔｅｋｍａｒ　ｂｌｅｎｄｅｒ）中粉砕する。ついで、補足的に１％メルカプトエタノール含有沸騰ｌｘ　ＳＴＥ抽出緩衝液１０ｍ１を加え、管を５５℃の水浴に移し、温度が５０℃ に達するまで手で攪拌する。この時点で、等容量（２０ｍｌ）の２４：１クロロホルム：イソアミルアルコール混合物を加えて、管を１０℃にてソーパル（Ｓｏｒｖａｌ　Ｉ）遠心機中ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）　Ｊ　２１　Ｃロータで１３．００Ｏｒｐｍにて１０分間遠心分離する。得られた水相を、新たな管に移し、水相の１０分の１容量の１０％セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）溶液を加えついで２４：１クロロホルム：イソアミルアルコール混合液を加えた。さらに、管を１３．００Ｏｒｐｍにて１０分間遠心分離した。遠沈分離後、得られた水相を新たな管に移し等歯のＳＴＥ緩衝液を加えた。管を室温（約２５℃）にて３０分間放置し、ついでベックマンゴ２ＩＣローター中４．−０００ｒｐ国で５分間遠心分離する。上澄フラクションを除き、残ったベレットを窒素気流中乾燥する。ベレットを必要となるまで一２０℃にて凍結保存する。ついで、ベレットを５０ｍＭトリス、ｐＨ８，０，５ｍＭ　ＥＤＴＡ；５０ｍＭ　ＮａＣΩおよび２００ミリグラムパーミリリツトル（以後“ｕｇ／ｍｌ“という）エチジウムブロマイドの溶液５ｍｌに再懸濁する。これに、塩化セシウム（Ｃｓ　Ｃｆｌ　）　４．　４　ｇを加える。得られた混合物をベックマンＪ２ＩＣロータ中２８．０Ｃ１Ｏｒｐ１１にて１０分間延伸して、清澄上澄液・を保持する。この上澄液３ｍｌを５Ｗ５０．１を有するベックマン超遠心分離機用遠心管に移し、ＣｓＣ，Ｑによる屈折指数１．３９０に調節する。鉱油２．５ｍｌを加え、１管につき６．１ｇに管をつりあわせる。この管を３３，０００ｒｐｒＡにて２３℃で６０分間、５Ｗ５０．１０−夕に平衡に高速回転させる。これより、ＤＮＡフラクションを除く。エチジウムブロマイドを当容量の２０ｘＳＳＣ，０，１５ＭＮａＣρ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ６，８で平衡させたイソプロパツールで３回抽出してＤＮＡフラクションから除く。ＤＮＡフラクションを１０ｍＭトリス、ｐＨ７，６および１ｍＭ　ＥＤＴＡ　０．３Ｍ酢酸す）　ＩＪウムで調節の溶液で２倍に希釈する。沈降物をさらに使用するまで一２０℃で冷凍する。上記６０時間回転を０．５ｍｌの１０ｍＭ）リス、ｐＨ７゜６．１ｍＭ　ＤＴＡ緩衝液およびエチジウムブロマイドに再懸濁した後に得られるＲＮＡペレットを当容量の２０ＸＳＳＣで平衡にされたイソプロパツールで抽出する。ＲＮＡを０．３Ｍ酢酸ナトリウムで調節された１０ｍＭトリスｐＨ７，６，１ｍＭ　ＥＤＴＡで２倍に希釈する。エタノール２容量を加え、混合物をさらに用いるまで２０ ℃で冷凍する。ＤＮＡおよびＲＮＡサンプルを解凍する。ＲＮＡを有する管をベックマンＪ２１Ｃローター中１０．ＯＯＯｒｐｍにて４℃で１０分間遠・心する。上澄フラクションをそそぎ出す。管に残るＲＮＡベレットを窒素気流中乾燥する。各ＲＮＡベレットを２５０マイクロリツトル（以下「ＵΩコと言う）のトリスホウ酸緩衝液、０．０８９Ｍ　トリス、０゜０８９Ｍホウ酸、２．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８，３および数滴の０．１Ｍ酢酸ナトリウムに再懸濁し、ついで１容量のエタノールを加える。これらの混合物を必要とされるまで２０℃に冷凍する。解凍ＤＮＡサンプルを４５ｔｌ遠心管に移す。トリス１０ｍＭ、ｐＨ７，６，１ｍＭ　ＥＤＴＡ　５ｕｆＩを加え、沈降物が溶解するまで混合する。エタノール１０ｕＮおよび０．１Ｍ　酢酸ナトリウムを加える。ＣｓＣ１沈降物は、観察されない。ＤＮＡ溶液は、必要とされるまで一２０℃にて冷凍する。ＲＮＡサンプルをさらに解凍し、ディスクトップエベンドロフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠心機中３分間遠心する。上澄フラクションを注ぎ出し、管中のベレットを窒素気流中乾燥する。ベレットを８ｕｆｌトリスホウ酸緩衝液および２０ｕ、Ｑグリセロール／染料（ブロモフェノールブルー）混合物中に再懸濁する。サンプルをよく混合し、必要とされるまで一２０℃にて冷凍する。ＤＮＡサンプルをさら解凍する。これらをベックマンＪ２ＩＣローター中１０．　ＯＯＯａ＋にて４℃で１０分間遠心し、寿られる上澄フラクションをそぞき出す。ベレットを窒素気流中乾燥し、ついで０．３Ｍａ度になるまで酢酸ナトリウムを加えられた１０ｍＭ）リス、ｐＨ７，６、ｍＭＥＤＴＡ緩衝液５ｍ緩衝液５濁ｌる。ついでエタノール１０ｍ１を加える。ＤＮＡを１時間−７０℃で沈降する。これらのＤＮＡサンプルをもう一度解凍しベックマンゴ２ＩＣローター中１０，０００ｒｐｍにて４℃で１０分間遠心する。上澄フラクションをそぞき出し、残ったベレットを窒素気流中乾燥する。ベレットを５００＋、ｌ　トリスホウ酸緩衝液中に再懸濁し、混合物を１．　５ｕ、Ｑマアクロ遠心管に移す。容管に数滴の０．３Ｍ酢酸ナトリウムおよび１ｍｌのエタノールを加える。サンプルを１晩 −２０℃にて冷凍する。これらのＤＮＡサンプルを再び解凍してディスクトップエベンドロフ遠心機中３分間遠心する。上澄フラクションを注ぎ出し、ベレットを窒素気流中乾燥する。ベレットを８０ｔｌ）リスホウ酸緩衝液中に再懸濁する。グリセロール／染料混合物２０ｕ１を加え、よく混合する。このようにして調製されたＤＮＡおよびＲＮＡを１晩透析し、１％アガロース、１×トリス−リン酸−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）ゲル上操作される。ＤＮＡおよびＲＮＡをゲル操作する前にプールする。エチジウムブロマイド染色後、ＡＭＳ／ベクターを担持する植物のバンド特性は、約３゜５Ｋｂに見られる。上記の実験からのこのようなゲルの写真を第１Ａ、ＩＢ、ＩＣおよびＩＤ図に示す。第１Ａ図は、アルファルファＡＭＳ／べ’ｙツタ−−ス１．　２９　（Ｕ、Ｓ、Ｄ、Ａ、　ＲＩ　Ｎｏ、２２３３８６）に存在する３、５Ｋｂバンドおよび授精可能未処置アルファルファ保持体（変種Ａｒｃ）および授精可能未処置非保持体（変種Ａｒｃ）における３、５Ｋｂバンドの不存在を示す。第１Ｂ図は、ＡＭＳ／ベクターソース１．　２９　（Ｌｌ。Ｓ、Ｄ、Ａ、　ＰＩ　Ｎｏ、２２３３８６）での処置により雄性不稔に転換されたアルファルファ（変種Ｂ７３）において存在する３、５Ｋｂバンドを示す。第１Ｃ図は、ＡＭＳ／ベクターソース１、　２６　（Ｌｌ、Ｓ、Ｄ、Ａ、　ＰＩ　Ｎｏ、２２１４６９）での処置により雄性不稔に転換されたトウモロコシ（変種８７３）において存在する３、５Ｋｂを示す。第１Ｄ図は、ＡＭＳ／ベクターソース１．　３６　（Ｌｌ、Ｓ、Ｄ、Ａ、　ＰＩ　Ｎｏ、２４３２２３）での処置により雄性不稔に転換された大豆（変種ウィリアムス８２）において存在する３、５Ｋｂバンドを示す。ＡＭＳ／ベクターを含有する抽出物と結合する約３．５Ｋｂの核酸は、ＤＮＡよりなるらしい（第１Ｅ図）。これは、前述のごとく調製されたアルファルファからの各酸サンプルをデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ、ボエフリンガー　マニハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　、　３０００ｕ　／１ｇ）またはりボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ、ボエフリンガー　マニハイム、　３００　ｕ／ａ＋ｇ）で消化させることによって示された。ＤＮアーゼまたはＲＮアーゼ２０ｕＮ　（５０ｍＭＮａＣ１，５０％グリセロール中１０ｕ／ｕｕ）を６０ｕΩ核酸サンプルに加え、混合物を１５分間３７℃にて放置した。サンプルをアガロースゲル電気泳動する前に０．４Ｍ　ＥＤＴＡ　１５ｕ１を加えて反応 ”を停止した。得られるエチジウムブロマイド染色バンドを第１Ｅ図に示す。ＡＭＳ／ベクター抽出物と結合する約３．５Ｋｂバンドは、ＲＮアーゼ処置サンプルに確認できるがＤＮアーゼ処置サンプルからは存在しない。従って、３．５Ｋｂ核酸は、ＤＮアーゼに対するその感受性より明らかなとおりＤＮＡよりなるらしい。６．３．ＡＭＳ／ベクター粒子の電子顕微鏡検定法ＡＭＳ／ベクター１．　２９　（ＰＩ　Ｎｏ、２２３２８６）と結合する４０〜１１０ｎｍ粒子を示す電子顕微鏡写真を得るために、以下の方法を使用した。全階段を４℃でまたは氷上にて行った。緩衝液Ｉは、５０ｍＭｈリスＨＣＤ　（ｐＨ７，５）　、０．４Ｍショ糖、１０ｍＭ　ＫＣ，Ｑ、５ｍＭ　ＭｇＣｆＩ２．１０％（Ｖ／Ｖ）グリセロールおよび０１ｍＭ２−メルカプトエタノールより構成した。緩衝液■は、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０より構成した。植物組織のサンプルを６容量（ｖ　／　ｓ　）の緩衝液中バーチイス（Ｖｉｒｔｉｓ）ホモジナイザーにて３０秒間低速で、ついで３０秒間高速でホモシネ−ジョンした。ホモジネートを４層のマイクロクロスで濾過し、５分間２．０００ｘｇで遠心した。上澄液を２０．０００ｘｇで２０分間遠心した。博られる上澄液を２つの管にて６０分間１８０．０００ｘｇにて遠心分離した。さらに純化するために、小さい暗線−色ペレットを１．５ｍｌの緩衝液Ｈに再懸濁して、緩衝液■中の１２〜４２％（ｗ　／　ｗ　）傾斜ショ糖上に積層した。傾斜は、７５秒間４℃で５Ｗ４１０−ター中３５．００Ｏｒｐｍで遠心された。傾斜において視覚できるバンドはなかった。約０．５ｍｌフラクションを管の頂部から除き、各フラクションを０Ｄ２５４の決定のため０．８ｍｌに希釈した。ピークの前面における層領域（管の頂部から約３分１離れた点）からのフラクションをプールし、１晩４℃にて保存した。サンプルを緩衝液Ｈに対して透析してショ糖を除き、ついで５Ｗ５０゜１０−ター中４０．００Ｏｒｐｍにて７５分間遠心した。陰性染色に関して、小さい白色ベレットを緩衝液■０゜２ｍｌに懸濁した。５微小力価の懸濁液をフオームバー（Ｆ。ｒｍｖａｒ）コートグリッドに配置し２分間すえた。過剰液を洗い出し、グリッド（サンプルダイ下向）を２分間２％ウラニルアセテート一層上に浮遊させた。過剰液を除いた。サンプルを透過電子顕微鏡により検査した。いくつかの小胞状粒子が見られ、いくつかは、稠密コアを有したがこれらは、はっきりと構造を決定されていない。ＡＭＳ／ベクターソース雄性不稔系を写した数枚の顕微鏡写真は、４０〜１１０ｎＩｇ粒子を表わしたようだ。第２Ａ図は、雄性不稔アルファルファ植物ＡＭ５１．　２９　（ＰＩ　Ｎｏ、２２３３８８）の粗抽出物（本明細に記載のごとく調製）に存在する４０〜１１０ｎｍ粒子を示す。第２Ｂ図は、雄性不稔アルファルファ植物、ＡＭ３１．　２６　（ＰＩ　Ｎｏ、２２１４６９）の胚珠に存在する４０〜１１０ｎｍ粒子を示す。第２Ｃ図は、アルアルファ保持体植物とＡＭＳ／ベクターソース１．２つの抽出物での処置により雄性不稔に転換されたかつて授精可能であったアルファルファ植物との間の交雑からの種子の薄片を示す。かっ色スポットを示す白色封入体は、ＡＭＳ／ベクターの抽出物と結合した約３．５に６核酸を含み得る。６．４．アルファルファにおける雄性不稔の誘導本節に示す実験は、ＡＭＳ／ベクターにより媒介されたアルファルファにおける雄性不稔の無性生殖誘導を示す。実験デザインは、主要区画として処置および分割として変種による分割一区画として任意抽出された完全ブロックデザインである。各複製内に１６処置プロツトを有する４つの複製および各区画において８列のうちの１つとしてランダムに分布された８遺伝子型があった。１６処置および８遺伝子型を第１Ａ表および第１Ｂ表に示す。第工Ａ表Ｔ１　接種、ソースｉ、７　ＡＭＳ／ベクターＴ２　接種、ソース１．４ＡＭり／ベクターＴ３　接種、ソース１．２６ＡＭＳ／ベクターＴ４　接種、ソース１．３６ＡＭＳ／ベクターＴ５　接種、ソース１．２９ＡＭＳ／ベクターＴ６　接種、インジアナシンセティック（Ｃ）（アルファルファリスドラ−）Ｔ７　接種、アルアルファのＡｒｃ変種から単離された保持体Ｔ８　セライト適用、緩衝液のみ（Ｋｌｌ　２　ＰＯ４、ｐＨ６，）Ｔ９　セライト適用、ソース１．７　ＡＭＳ／ベクターＴＩＯセライト適用、ソース１．４ＡＭＳ／ベクターＴＩＬ　セライト適用、ソース１．２６ＡＭＳ／ベクターＴＬ２　セライト適用、ソース１．３６ＡＭＳ／ベクターＴ１３　セライト適用、ソース１．２９ＡＭＳ／ベクターＴ１４　セライト適用、インジアナシンセティック（Ｃ）（アルファルファリスドラ−）Ｔ１５　セライト適用、アルアルファのＡｒｃ変種から単離された保持体ＴＬ６　セライト適用、緩衝液のみ（ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６、）第１Ｂ表１　ソース１．２６　ＡＭＳ／ベクター２　ソース１．３６　ＡＭＳ／ベクター３　ソース１．２９　ＡＭＳ／ベクター４　授精可能保持体５　授精可能保持体６　授精可能保持体７　授精可能保持体８　インディアナ　シンセティック（Ｃ）。レスドラ− 各ＡＭＳ／ベクターソースに関するＵ、Ｓ、Ａ、植物提出（ＰＩ）番号を第１Ｃ表に示す。第１Ｃ表アルファルファ　ＡＭＳ／ベクターソースの１．４　１７２４２９１．７　１７３７３３１．２６　２２１４６９１．３６　２４３２２３１．２９　２２３３８６処置は、可溶性抽出物の接種またはセライト（ケイソウ土、第１級、シグマ　ケミカルズ　キャット（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｔｓ　ｃａｔ、）　Ｎｏ、Ｄ５３８４適用より構成した。接種は、２８ゲージ針で行った。針を植物の茎を通し、抽田物−滴を一方の側ににじませ、そして針を茎より抜いた。 −植物につき約５つの茎の接種した。接種されない茎をもどした。セライト処置を基本的には後述の第６．　９．　１゜６．３節に記載のごとく行った。各遺伝子を処置後３週間生殖不能について評価した。花をエモリー（ｅｍｏｒｙ）クロスにトリップし、次のごとく評価した。１＝朽なし、花粉なし３＝約あり、花粉なし５＝朽あり、生歯の花粉あり７＝朽あり、十分な花粉あり評価１または３は不稔とみなされ、また評価５または７は、受精可能とみなされた。アセトカーミン染色を用いて目視評価を確認した。結果は、処置Ｔ１〜Ｔ５およびＴ９〜Ｔ１３（全ＡＭＳ／ベクターソース）が遺伝子表現型４〜７の受粉化膿を７から３までに変えた、すなわち、受精可能保持体を生殖不能状態に転換したことを現した。分散（Ｖａｒｆ　ａｎｃｅ）の分析は、処置効果がＰ＝０．０１で非常に著しく、また保持体の処置世代内の授精可能が影響されかつＡＭＳ／ベクターソース（遺伝子型１〜３）と著しく相異しなかったことを示した。予想されたとおりに、遺伝子型８（レスドラ−）は、全処置により受精可能を残し、また遺伝子型１〜３　（ＡＭＳ／ベクターソース）は、全処置により不稔性を残した。複製結果における全変化は、著しくなかった。６．５大豆における雄性不稔の誘導本節に記載される実験はＡＭＳ／ベクターによって媒介される大豆における雄性不稔の無性生殖誘導を示すものである。実験デザインは、前記第６，４節に記載されたごとく任意抽出完全ブロックデザイン、分割一区画である。処置Ｔ１〜Ｔ５およびＴ９〜Ｔ１３は、第６．４節に記載のとおりである。処置Ｔ６およびＴ１４は、各々処置される特定遺伝子型の抽出物の接種およびセライト適用である。処置Ｔ７およびＴ１５は、未処置植物である。処置Ｔ８およびＴ１６は、各々緩衝液（ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６，９）のみでの接種およびセライト適用である。接種を各植物の節において葉柄（茎と葉との間の茎組織）に行った。８つの処置遺伝子型を第１Ｄ表に示す。第１Ｉ）表１　ウィリアムス　８２２　ウエルス　（％／ｅｌｌｓＩＩ）３　センチユリ−（Ｃｅｎｔｕｒｙ）４　ホーヒツト　ｏ（Ｏｂｂｉｔ）５　キュンバーランド（Ｃｕｍｂｅｒｌａｎｄ）６　マッキャル　（Ｍｅ　Ｃａ１ｌ）７　トラフ　（Ｔｒａｆｆ）授精可能性を第６．４節に記載ごとく評価した。結果は、全ＡＭＳ／ベクターソース（Ｔｌ〜Ｔ５、Ｔ９〜Ｔ１３）での処置がウィリアムス８２において観察された２０％不稔性およびウェルス■およびセンチユリ−において観察された１７〜３０％で遺伝子型１．２および３の受精可能を影響したことを示した。分散の検定は、著しい処置効果（０，０１におけるＰ）を示した。複製結果の変化は、著しくなかった。遺伝子型４〜８は、その受精可能性を変えなかった。接種またはセライト適用による処置の間に観察された相異なはかった。６．６大豆における雄性不稔に対する補足的データ雄（紫色、ウエルス■）および雌（白色花：ウィリアムス８２）大豆の種子をまいた。２７日および３５日後、約３節間（ｔｈｒｅｅ−ｉｎｔｅｒｎｏｄｅ）段階において総計１８６の雌および２４の雄植物をアルファルファＡＭ８１．４またはＡＭＳＬ、３６系からＡＭＳ／ベクター抽出物で噴霧した。噴霧は、ＫＨ２ＰＯ４ＰＨ６，９中のセライトで行なわれた（第６．．１０．　１．６．３．節後述参照）。最終噴霧後９〜１０日および１９日、花を産生じた処理大豆植物を花から削られた朽における花粉の存在または不存在に基づく受精能に関して評価した。１植物につき少なくとも３つの花を評価した。全ての場合において、全検査孔は、大量の花粉（受精可能）または花粉なしの種（生殖不能）をもたらした。この「白黒」評価は、不稔植物が一定範囲の表現型（例えば、花粉なし、減少量の花粉、不完全花粉または朽から放出されない花粉）を示すアルファルファ系における場合と対照大豆における生殖不能の結果を第１Ｅ表に示す。第工Ｅ表大豆におけるＡＭＳ／ベクター誘導不稔処理大豆植物において観察された不稔パーセントＡＭＳ／ベクターソース　ＡＭＳ／ベクターソース大豆受領体　ＡＭＳＬ、３Ｂ　ＡＭＳＬ、４白雌　１９／４９（３９％”）　３５／１２６（２５％）紫雄　２／１０（２０％’）　６／１４　（４３％）第１Ｅ表に示した結果は、両ＡＭＳ／ベクターソース抽出物が紫色花大豆系がＡＭＳｌ、４抽出物により強く応答し、一方白色花系がＡＭＳｌ、３６抽出物により強く応答して雄性不稔を誘導することができたことを示す。評価された全１７５のうち５０の雌（白色孔）植物は、不稔であり、評価された全２４のうち８の雄（紫色孔）植物は、不稔であった。従って、不稔性は、評価された植物１つ９のうち５８あるいは′２９％誘導された。６．７トウモロコシにおける雄性不稔の誘導本節に記載される実験は、トウモロコシにおける雄性不稔の無性生殖誘導を示す。実験デザインおよび処置１〜５および９〜１３は、前記第６．４節のごとくであった。処置６および１４は、各々処置される特定遺伝子型の抽出物の接種およびセライト適用であった。処置７および１５は、未処置植物であった。処置８および１６は、各々緩衝液のみでの接種またはセライト適用であった。セライト適用は、後述の第６．９．１．６．３節に記載のごとく行われた。接種は、２８ゲージ針を用いて植物の髄に挿入した。実験処置を表現型を第１Ｆ表に示す。第１Ｆ表４　ＭＯＬ７　［インディアナ　コーポレーションインブルーブメント　アソシエーション（Ｉｎｄｉａｎａ　Ｃｒｏｐ　Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ）］５　８７３　（インディアナ　コーポレーションインプルーブメント　アソシエーション）＊ビアーデユー　アグリカルチュラル　エクスピアリメント　ステーション（Ｐｕｒｄｕｅ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔＳｔａｔ　ｔｏｎ）より得られる。不稔は、次のとおり評価した。１＝奇形朽あり、花粉なし３＝正常朽あり、花粉なし、アセトカーミンで染色せず５＝正常朽あり、染色可能花粉あり７＝正常朽あり、豊富な花粉あり結果は、遺伝子型１〜７の授精能がＡＭＳ／ベクターソースでの全処理により変化させたことを示した。授精可能性転換の範囲は非常に著しい処置効果（Ｐｏ、０１未満）で遺伝子型１〜７に関して１５〜２６％であった。遺伝子型８に対する処置効果は観察されなかった。複製結果の変化は著しくなかった。６．８．他の植物における雄生殖不能の誘導観察に基づくテストを行ないモロコシ、ヒマワリ、トンジンビニおよびトマトにおけるＡＭＳ／ベクターによって媒介される雄性不稔の誘導を評価した。ＡＭＳ／ベクターソースでの処置は、モロコシ、ヒマワリおよびヒエの種子結実を減少しトマトの果実結実を減少したようだ。６．９大豆における単為生殖の誘導ハイブリッド交雑は、雌植物としてＡＭＳ／ベクター処置雄性不稔白色花「ウィリアムス８２」大豆系をまた雄植物として正常花粉産生授精可能紫色孔「ウエルス■」を用いて開始された。予想されたとおり、産生されたＦ１世代は、完全に紫色孔紫色胚軸植物から構成された。このＦ１世代は、自己授粉してＦ２世代を産生じ、これらは交互にＦ５世代による遺伝形質研究の基礎として用いられた。これらの植物は、花および胚軸の色、朽および花粉の特性（雄性不稔性）およびさや状態を検査された。６．９．１胚軸および花の色紫色の胚軸を有する植物は、紫色の花を有し、緑色の胚軸を有するものは、白色の花を有していた。全４世代（Ｆ２〜Ｆ４）において紫色の胚軸および紫の花が優性であった。Ｆ２において評価された３８植物のうち３７（９７゜４％）、Ｆ３において３９植物のうち３８　（９７，４％）、Ｆ４において４０植物のうち３９（９５％）およびＦ５において３２植物のうち２２　（６８，８％）は、紫色の胚軸および紫色の花を有していた。Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４およびＦ５世代において緑色の胚軸および白色の花を産生じた植物のパーセンテージは、各々２．６％、２．５％、５％および３１．２％であった。６、　９．　２．雄性不稔の特性Ｆ２〜Ｆ５世代の各植物から２つの花を検査した。朽、花粉および柱頭をアセトカーミンで染色して顕微鏡で検査した。２つのカテゴリーの花が観察された。一方のカテゴリーにおいて、朽、花粉および柱頭の特性は、授精可能大豆化に関する文献［アルバートセンおよびパーマ−（Ａｌｂｅｒｔｓｃｎ　ａｎｄ　Ｐａ１Ｉｅｒ、　Ａｃ　Ｊ、　Ｂｏｔ、　６６：２５３−２６５．１９７９）］の記載における非常に典型的であった。杓の裂開は、完全であり、朽は、柱頭を取り込み、また朽からの裂開花粉は柱頭表面に堆積された。時おり、花粉管が、柱頭表面において見られた。花粉は、寸法および形状が均一でありアセトカーミンで濃赤色に染色された。このカテゴリーに族する花またはこのような花を産生ずる植物は、正常花粉を産生ずることが示された。部分烈開の少数の例外を除いて、花の第２カテゴリーにおいて杓は、裂開しなかった。花粉粒子は、朽に残り、該花粉粒子は、朽を破壊した時だけ遊離できた。花粉粒子は、寸法および形状が均一でなく異常にみえた。染色可能および不稔花粉粒子の混合物が存在した。寸法および形状が多様な染色不能花粉は、十分に明解にされた花粉壁を有さなかった。染色可能花粉は、円形形状であり異常に巨大（正常烈開花粉粒子と比べて）に見えた。数回の調製において、花粉壁生長は、不規則的でありかつ不完全であることが見い出された。時おり、細胞形質は、このような花粉粒子から流れ出ていることが見い出された。花粉粒子は、Ｆ５世代に属する２つの植物の朽において検出されなかった。花粉粒子は、柱頭表面上には見い出されなかった。花またはこのような花を産生ずる植物は、「雄性不稔」と示される。具体的には、各植物からの両方の花は、これらのカテゴリーの一方または他方のいずれかに属した。次の記載において、植物は、「正常花粉産生」または「雄性不稔」のいずれかを示される。著しい堅牢性が全４世代にわたって各これら２つのカテゴリーの朽、花粉および柱頭の形態学的特性において見い各世代におけるほとんどの植物は、「不稔花粉」を産生じまた「雄性不稔」が示された。Ｆ２において評価された３８植物のうち２９　（７６，３％）、Ｆ３において３９植物のうち２９　（７４，４％）およびＦ４において４０植物のうち３１　（７７，５％）およびＦ５において３２植物のうち１８　（５６，２％）が「雄性不稔」であった。このデータより明らかなとおり、Ｆ２、Ｆ３およびＦ４世代における雄性不稔は、Ｆ５世代におけるより高かった。これららの結果を、第１Ｇ表に要約する。６、９．４．さや状態「正常花粉産生」として評価された全植物は、全４第にわたって数多くの種子産生さやを形成した（第１Ｈ表）。このカテゴリーにおけるさやの大部分は１さやにつき３種子を有し、少数は１さやにつき２種子および１種子を生じた。「雄性不稔」として評価された数多くの植物もまた、種子産生さやを形成した。Ｆ２において２９植物のうち１０（３４％）、Ｆ３において２９植物のうち１８（６２％）、Ｆ４において３１植物のうち１８（５８％）およびＦ５において１８植物のうち９（５０％）が種子産生さやを有した。のこのカテゴリーにおける多数の植物は、１さやにつき３種子を有した。いくつかの植物において１さやにつき１種子および１さやにつき２種子もあった。残りの「雄性不稔」植物は、数多くの花を咲かせたがさやを灯さなかった。Ｆ２　、Ｆ３　、Ｆ４およびＦ４世代におけるさやを有さない「雄性不稔」植物のパーセンテージは、各々１４，３．３および６であった。６．９．５．生育可能性各４　＋＝代からの種子のサンプルを成熱さやから回収して湿潤濾紙上で発芽させた。発芽は、全般的に９０％以上であった。Ｆ２〜Ｆ５世代における正常花粉産生植物およびＦ２〜Ｆ４世代における「雄性不稔」植物の両方から産生された種子は、優れた種子生殖可能性を示した。Ｆ５世代の雄性不稔植物からの種子は、発芽テストを行った際成熟しなかった。第１Ｇ表Ｆ２．Ｆ３．Ｆ４およびＦ５世代に属する植物における胚軸の色、花の色および雄性不稔性に関するデータの要約Ｆ２　旦３　旦４　旦５評価植物数　３８　３９　４０　３２紫色の胚軸および　３７　３８　３８　２２紫色の花を有する　（９７，４％） ’　（９７，４％）（９５％）　（８８，８％）植物緑色の胚軸および　ｌ　１　２　１０白色の花を有する　（２，６％）　（２，６％）（５％）　（３１，２％）植物正常花粉を示す　９　１０　９　１４植物　（２３，７％）（２，６％）　（２２，５％＞　（４３，８％）生殖不能花粉を　２９　２９　：Ｈ１ｇ示す植物　（７６，３％）（７４，４％）（７７゜５％）　（５６，２％）（「雄性不稔」） “全評価植物に対するパーセンテージをかっこ内に示す。第１８表Ｆ２　Ｆ３　Ｆ４　旦５評価植物数　３８　３９　３８　３２正常花粉を有する　９　１０　９　１４植物種子を有するさや　９　ｔｏ　９　１４を有する植物　（１００％）”　（１００％＞　（１００％＞　（１００％）生殖不能花粉を　２９　２９　３１　１８有する植物種子を有するさや　１０　１８　ｆ８９を含有する植物　（３４％）″′（６２％）（５８％）（５０％）さやを有さない　４　１　１　１植物　（１４％）′″″（３％）（３％）（６％）十正常花粉および不稔花粉評価植物の各々２つのカテ　ゴリーに関してかっこ内に示されたパーセンテージとし　て表わされた花評価とさや状態との関係を表中独立した　水平の欄に項目別けする。５正常花粉評価植物のパーセンテージ。 ”生殖不能評価植物のパーセンテージ。６、　９．　６．結果および議論光の結果は、Ｆ２およびハイブリッド世代における分離の欠損および雄性不稔植物における種子の結実が示されている点でハイブリッド種子の単為生殖再生のパターンと一致した。このパターンは、数世代にわたって保持されることが示されている。いかなる理論によっても結びつけられることも望まないが、観察されている単為生殖における衰退が一定の型の単為性植物のうちに自然に日常的に生じるような条件的型の単為生殖のもとの誘導を表わすらしい。しかしながら、いかなる正常再生への先祖返りも、もとのハイブリッドにＡＭＳ／ベクターを再適用することによって回復され得る。６．１０．ｈウモロコシ植物におけるＡＭＳ／ベクター処置のフィールドテスト本節に記載される実施例は、フィールド条件下生長したトウモロコシにおけるＡＭＳ／ベクターによって媒介された雄性不稔の誘導を示す。ＡＭＳ／ベクター不稔ソースを含む４つの処置および４つの対照処置をフィールド条件下生長したトウモロコシに適用してトウモロコシにおける雄性不稔の誘導に対するＡＭＳ／ベクター（アルファルファからの抽出物）の効果を評価した。４つのトウモロコシの変種（同系交配）をこの研究に用いて、変種−ＡＭＳ／ベクター相互作用を検査した。花粉の存在または不存在を観察した。花粉染色性、植物の高さ、穂たけおよび７５％開花するまでの時間もまた観察して、植物生長刺激等地の処置効果があるかどうか調ぺた。処置差異の統計的顕著性（ｓｉｇｎｌｆ　１ｃａｎｃｅ）を分散の分析およびダンカン並列範囲テスト（Ｄｕｎｃａｎ’ｓ　ｒＡｕｌｔｉｐｌｅ　ｒａｎｇｅ　ｔｅｓｔ）を用いて評価した。花粉不稔（花粉存在または不存在）変数に関する強い処置効果があった。分散の分析は、この特性に関してＰｏ。０００１未満で著しい処置相異を示した。分散の分析はまた、強い変種効果を示した。処置平均における比較は、トウモロコシの３変種（後述の第１表の変種１，２および４）について行なわれ、これは、トウモロコシ生殖不能が本実験に用いられた処置によって影響されるという強力な証拠であった（Ｐ、０．０００１未満）。変種３には処置効果の統計的にきわだった証拠はなかった。ダンカン並列範囲テストは、トウモロコシ抽出物（ＡＭＳ／ベクターなし）、緩衝液のみおよびアルファルファ抽出物（ＡＭＳ／ベクターなし）での処置および未処置植物の平均がソース１．２．３および４ＡＭＳ／ベクター処置のものと著しく相異することを示した。変種１において、ソース４ＡＭＳ／ベクター処置に関する平均は、残りと相異し、一方変種４においてソース２ＡＭＳ／ベクター処置の平均は、他と相異した。植物の高さに関する分散の分析は、著しい処置相異（ＰＯ，０１０６未満において）を示し、またトウモロコシの４変種間も相異を示した。ダンカン並列範囲テストは、いずれか２つの変種の植物の高さの全ての比較が、２０１０５未満で著しく相異したことを示した。穂たけに関する分散結果の分析は、この特性に関する処置相異を表わさなかった。しかしながら、ダンカン並列範囲テストは、トウモロコシの穂だけがお互いに著しく相異することを示した。いずれのトウモロコシ変種における７５％開花までの日数における処置効果は、明らかでなかった。しかしながら、分散の分析およびダンカン並列範囲テストの両者は、この特性に関して４つのトウモロコシ変種間における著しい相異を表わした。ソース１．２．３および４ＡＭＳ／ベクターによる処置は、トウモロコシ変種１，２および４にらおて花粉不稔を示した。トウモロコシ抽出物（ＡＭＳ／ベクターなし）、緩衝液のみおよびアルファルファ抽出もの（ＡＭＳ／ベクターなし）での処置および未処置植物は、いずれのトウモロコシ変種においても花粉不稔を示さなかった。変種３は、いずれの処置のおいても花粉不稔を示さなかった。生殖不能の発現において位置効果があり、植物は、授精植物間の集団に生じる不稔を示した。裂開なし花粉（花粉生殖不能）を示す各植物からの１つの花の顕微鏡検査は、変種１および２がそれらの朽内に裂開されない不稔の異常なかつ不規則な花粉を有していることを表わした。変種４は、花粉を産生ぜずまた朽を裂開しなかった。変種３における全植物からの花粉および変種１．２および４における授精可能植物からの花粉は、典型的な未処置トウモロコシ植物の正常な、丸い染色可能な花粉を４つのトウモロコシ変種（第１表に記載）を本研究に選択した。変種は、オハイオ　ファウンデーション　シードカンパニー、クロトン、オハイオ　（Ｑｈｉ□　）’□ｕｎｄａｔｉｏｎ　５ｅｅｄ　Ｃｏｃｐａｎｙ、　Ｃｒｏｔｏｎ、　０ｃｈｉ）より得られた。４変種を受けとり、同一性をフィールド部位職員により記録した。変種をコードし、研究チームに既知として提供した。第■表Ａ６３２Ｈｔ、　Ｌｏｔ　９５０．　第Ｆ級　ＩＢ７３Ｈｔ、　Ｌｏｔ　４５５１　ＳＴ、第２３〜２１級　２Ｈ９５Ｈｔ、　Ｌｏｔ　１５０．第ＭＦ級　３Ｍ０Ｌ７ｔ（ｔ、　Ｌｏｔ　０５５．　第ＭＦ級　４種子を植えるまで３８°Ｆにて冷室中に保存した。６、　１０．　１．　２．フィールド準備この実験は、ウェスト　ジェファーソン、オノＸイオ　（Ｗｅｓｔ　Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ、　０ｈ１ｏ）のフィールド部位で行なわれた。フィールド部位（１５０フイート×１２０フイート）を耕作し、農耕機で耕し、回転耕耘した。肥料アプリケーターを用いて各々、リン、カルシウムおよび窒素源としてＰ２Ｏ５（２８１１！ｂｓ）、Ｋ２Ｏ（３９１ｂｓ）および尿素（１４０ρｂｓ）からなる基礎肥料を用いて肥沃化した。さらに１４０Ωｂｓ量の尿素を発生後４週間手で列の間に適用した。発生前除草剤であるラツソー（センサンド。セントルイス）　［Ｌａｓｓｏ（Ｍｏｎｓａｎｔｏ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ）を適用して雑草を抑制した。フィールドを肥料よおび除草剤の適用後さらに４インチの深さで回転耕耘した。実験区画は、生態学実験で２方向を農業者に貸したフィールドで２方向を囲まれた。これらのフィールドは実験期間は活性であった（ｏａｔＳ）。６．１０．１．３．実験デザイン用いられたデザインは、主区画として処置および分割としての変種を有する分割一区画であった。各複製体において８処置区画および各区画における４列のうちの１つとしてランダムに分布された４変種を用いて４複製があった。各変種を６インチ内列（ｉｎ−ｒｏｗ）および３フィート間列（ｂｅｔνｃａｎ −ｒｏｗ）離して種まきした。全区画を６フィート幅の小道で分離した。処置および変種任意抽出を概略として第■表に示した。第■表トウモロコシ処置および変種任意抽出Ｔ７　Ｔ６　Ｔ３　Ｔ８　Ｔ４　Ｔ５　Ｔ２　ＴｌＲ１４２３１１２４３１２３４４２１３４１３２１３２４３１４２２３４１Ｔ８　Ｔ４　Ｔ７　Ｔ２　ＴＩ　Ｔ６　Ｔ５　ＴａＨ２１４３２４２１３１２４３２１４３３２１４４３１２４２１３２４１３Ｔ２　Ｔ８　ＴＩ　Ｔ５　Ｔ３　Ｔ８　Ｔ４　Ｔ７Ｒ３１，３４２３４１２４１３２１４２３４，１３２２１３４２４３１３４１２Ｔ５　Ｔ２　Ｔ８　ＴＩ　Ｔ３　Ｔ４　Ｔ７　ＴａＨ４４３２１１２４３４３１２４１２３３１２４１２４３２３４１３２４１各複製において用いた８つの処置Ｔ１〜Ｔ８を第 ■表に示す。第■表トウモロコシプロジェクト処置コードトウモロコシ抽出物　ＴＩ　Ｂ２（ＡＭＳ／ベクターなし）ソース２．ＡＭＳ／ベクター　Ｔ２　Ｂ６（Ｌｌ、Ｓ、Ｄ、Ａ、　ＰＩ　Ｎｏ、１７２４２９）ソース１．ＡＭＳ／ベクター　７３　Ｂｌ（ＩＪ、Ｓ、Ｄ、Ａ、　ＰＩ　Ｎｏ、２２１４６９＞アルファルファ抽圧物　Ｔ４　Ｂ８（ＡＭＳ／ベクターなし）未処置　Ｔ５　Ｂ７ソース３．ＡＭＳ／ベクター　Ｔ６　Ｂ４（Ｕ、Ｓ、Ｄ、Ａ、　ＰＩ　Ｎｏ、２２３３８６）ソース４　、　ＡＭＳ／ベクター　Ｔ７　Ｂ５（し、Ｓ、Ｄ、Ａ、ＰＩ　Ｎｏ、２４３２２３）緩衝液のみ　Ｔ８　Ｂ３全４トウモロコシ変種を手で種まきした。各変種を２０フィート列に各植物の間を６インチ間隔で種まきした（すなわち、各列に４０植物）。変種は、任意抽出チャートに一致して種まきされた（第■表）。６．１０．１．５．処置および対象材料の回収および発送アルファルファ材料を新たにフィールドから切って、液体窒素に含浸して、液体窒素冷凍材料を一晩フイールド部位に発送した。アルファルファ材料を８処置のうち５つに対するベースとして用いた。そのうち１つはＡＭＳ／ベクターなしの対照であり、４つは、ＡＭＳ／ベクターを含んだ。ＡＭＳ／ベクターソースは、４つのアルファルファ系すなわちＰＩ　Ｎｏ、２２１４６９．１７２４２９．２２３３８６および２４３２２３から生長した４つの異なる雄性不稔遺伝子型であった。アルファルファ対照抽出物（ＡＭＳ／ベクターなし）は、保持体同種同系遺伝子非生殖不能系であった。Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４およびＴ５として提供された冷凍アルファルファ材料は、密封プラスチックバックに入れた（第７表前記参照）。対照およびＡＭＳ／ベクター処置材料の記録およびプラスチックバック上の相当するコードを他に保管した。処置コードは、それ故にフィールドテストを行ったものにわかなかった。６．１０．１．６．ＡＭＳ／ベクター処置および受けとりかつ冷凍保存されたアルファルファ材料を用いて４つのＡＭＳ／ベクター含有抽出物および対照として１つのＡＭＳ／ベクターなしフアルファルファ抽出物を調製した。４つのトウモロコシ変種からの材料を用いてトウモロコシ抽出物対照を調製した。これらの変種は、各々長さ９０フイートの１度種につき２列、８列において十分な実験として同一フィールドに種まきされた未処置植物であった。各これらの変種から新たに回収された植物組織を用いてトウモロコシ対照処置を調製した。他の２つの対照処置は、一方は緩衝液（０，０６７Ｍ　ＫＨ２ｐｏ４．ｐＨ６゜９）のみを適用し、他方は、緩衝液および植物抽出物のいずれも平過用しなかった（前記第■ 表参照）。６゜１０．１．６．２．抽出法リン酸緩衝液（ＫＨ２ＰＯ４，０，０６７Ｍ、ｐＨ６゜９）を植物材料の抽出３日前に調製し、１１℃にて保存した。全抽出法は、使い捨て外科用手袋をはめて行った。手袋を各処置材料を終了した後に捨てた。新しい一対の手袋を各処置に用いた。冷凍アルファルファ植物材料をドライアイス下、ボックス中のウエストジェファーソン（Ｗｅｓｔ　Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ）設備に移した。アイスボックスを抽出をはじめるまで３７°Ｆの冷室内に保った。各処置抽圧に対して総ｆｆ１３１０ｇの植物材料および２２００ｍ１の緩衝液を用いた。一度のみの遠心の有効性のため、抽出は、各々植物材料１５５ｇおよび緩衝液１１００ｍｌを用いて各処置に対して２バッチ行った。緩衝液および植物材料をワエアリング（Ｗａｒｉｎｇ）強カブレンダー中２〜３分間離解した。ホモジネートを、４層の荒目綿布で濾過して、植物かすを除去した。ろ液を滅菌２５００１１遠心ビンに回収してＧＳＡＳ−ロータ中℃にて５分間遠心分離した。上澄液を滅菌フラスコ中デカンテーションし、標識して、ついで噴霧に用いるまで３８’Ｆの冷室内に置いた。４トウモロコシ変種からの新たに回収された葉材料を同様に抽出した。上記方法で得られた上澄液をトウモロコシ植物を噴霧する処置材料として用いた。６．１０．１．６．３．抽出物の適用フィールドテストを行う職員は、処置の同一性を知らず、処置区画は、彼らによりコードされた（第■表、前記参照のこと）。従って、研究は、「２重ブラインド」であった。セライト（ケイソウ土、第■表、シグマ　ケミカルズキャットＮｏ、Ｄ５３８４）を浸蝕物として用いた。セライト１００ｇを１ガロン園芸タンク噴霧器中ＫＨ２ＰＯ４緩衝液（０，０６７Ｍ、ｐＨ６，９，１１℃）１０００ｍｌに加えた。セライト緩衝液混合物を激しく振とうして、噴霧用の均一なセライトの緩衝液を確保した。トウモロコシ植物は第５葉が十分にふくらんだ際、すなわち、種まき４週間後に噴霧された。全植物は、１ガロン噴霧器を用いてセライトで輪性（トウモロコシ植物の先端）あたりに噴霧された。６植物抽出物および緩衝液のみの対照を１ガロンタンク噴霧器を用いて輪性付近に噴霧した。処置Ｔ５植物は、緩衝液および植物抽出液を受けなかった。６、　１０．　１．　７．データの収集データ収集は、５つのパラメータを含んだ。すなわち、花粉の存在または不存在、花粉染色性、植物の高さくインチ）、７５％開花までの時間（日）および穂たけ（インチ）である。パラメータ植物高さ、７５％開花までの時間および穂たけは、植物生長刺激等の他の処置適用効果があるかどうかを決定するために観察された。植物高さ、７５％開花までの日数および穂たけの平均は、各処置区画内の各列に関して計算された。花粉評価の代表的様子を示す写真を写した。花粉不存在または存在のデータ収集は、朽が最初に雄花の穂に現われた際にはじめた。８〜１／２インチ×１１インチ黒紙を雄花の穂の下に配置した。花粉が落ちた時に（午前７＝３０〜１１：３０）、植物を２度ゆすった。植物を次のとおり花粉評価に従って下げ札を（ａ色ひもにより）附した。１、裂開なし花粉＝オレンジ下げ札。２、裂開花粉の存在＝黄色下げ札。各処置における各変種の各々の１つの花粉染色性を各２つの型の結果の１つについて評価した。各変種処置に関する１つの授精可能孔を染色した。フィールドからの裂開なし花粉を有する雄花の穂の部分をアセトカーミンで染色して正常または異常様子を観察した。花粉染色は、朽をスライドガラスに移し、アセトカーミノ１滴を塗布しついで雄ずいをカバースリップで覆うことによって行なわれた。花粉染色性は、直ちに観察された。代表的正常または異常顕微鏡写真もまた、写した。６、　１０．　１．　８．データの統計的分析４つの依存変種を以下のテストを用いて別々に分析した。４つのデーター変数は、花粉量、穂たけ、植物の高さおよび７５％開花までの日数であった。花粉染色性変数は、各カテゴリー、すなわち、裂開花粉を有するまたは裂開花粉を有さない花においておいて唯一１つの花のみを染色したので統計的に分析されなかった。データおよび傾向を花粉染色性に関して一覧表にした。データを統計分析システム（ＳＡＳ）プログラムを用いて好適なエラー条件（ｅｒｒｏｒ　ｔｅｒｍｓ）でこの分割区画デザインに関して分析した。分散（Ｆ統計量）の分析は、８処置の間に統計的な著しい相違をテストするのに用いられた。分散の分析は、観察されたもの（処置）と期待ランダム値（未処置）との著しい相異があるかどうかを決定する。このような相異から推論することは、本発明者らが実験エラーの正当な測定を確実にするため実験エラーおよび任意抽出を本発明者らに計算できるようにするための複製を行うことが必要である。本発明者らは、４複製を行なうことによってこれらの必要性の両方を満足した。植物は、処置内で任意抽出され、処置を各複製内で任意抽出した。有意性の確率ｐ＝０．０１以下は、処置効果を支持する強力の証拠とみなされる。平均分離は、新規のダンカン並列範囲テストを用いて行なわれた。ダンカン並列範囲テストは、それ自身帰無仮説からの１著しい相異」があるかどうかを決定しないが、本発明者の処置をお互い著しく相違するグループに分離する。例えば、処置Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３およびＴ４が全てＰＯ３０５未満と仮定する。ダンカンのテストは、これらが例えばクラスＡにおけるＴ１およびＴ２およびクラスＢにおけるＴ３およびＴ４において平等に相違する（１クラス）のかまたは不平等に相違するのかを決定できる。処置平均は、臨界範囲値を用いて比較される。本研究のために確立された実験計画を分割区画デザインと呼ぶ。この分割−区分計画は、処置ブロックをお互い保持することによりエラーを減少させる。さらに、各処置内の植物および各複製内の処置の任意抽出である。（完全に任意抽出されたデザインは、処置をブロックに分離しない。）本発明者の分割一区画デザインにおいて、８つの「完全な」区画が間離をあけて直線的に連続するように選ばれた。８処置のうち１つ（他のいくつかは対照）をこれらの完全区画単位に与えた。ついで、各完全区画単位を分割一区画に区画別けまたは「分割」した。各分割区分単位を任意にその分割区画に種まきされるトウモロコシ植物の４変種の１つにｌ −すえた。最終的に、このデザインを４度複製した。処置に対する５つの応答、すなわち、不稔植物の数、授精可能の植物の数、植物の高さ、穂たけおよび開花までの日数を測定した。他の応答変数は、不稔植物の数を授精可能植物および不稔植物の総数で割ることによって作成された。この応答変数は、不稔の植物のパーセントである。パーセンテージとして表されたデータは、同様に処置された植物の間の一定応答変位の仮定に結びつかないので、より適性な統計分析を与える変換を固定する分散を適用した。この実験においてＰが不稔を表わす場合、適性変換は、次のとおりである。（ただし、Ｚは分析に用いられる新たな応答変数である。）各処置および変種の組合せに関する不稔パーセント、植物の高さ、穂たけおよび開花までの日数の相加平均を各々以下の第Ｖ表、第Ｘｖ表、第■Ｘ表および第ＸＸ■表に示す。各相加平均は、４複製の平均である。不稔パーセントおよび開花までの日数の相加平均は、実際の「逆反換」相加平均である。すなわち、これらの２変数の平均を変換しく第（Ｉ）式）、変換値の平均を計算し、ついでこれらの平均をそれらのもとの尺度に逆反換した。６、　１０．　２．　１．　１．花粉評価の分析（第Ｖ−ＸＩＶ表）雄性不稔性は、変種１．２および４における処置Ｂ１（ソースＩ　ＡＭＳ／ベクター）　、Ｂ４　（ソース３　ＡＭＳ／ベクター）、Ｂ５（ソース４　ＡＭＳ／ベクター）およびＢ６（ソース２　ＡＭＳ／ベクター）のみに観察された。雄性不稔性は、変種３においては見い出さなかった（第７表）。雄性不稔であったトウモロコン植物のパーセンテージに関する分散結果の分析は、強い処置効果（Ｐｏ、０００１未満）があったことを示す。すなわち、処置グループにおいて不稔になるトウモロコシ植物のパーセンテージが全処置グループについて同一であることは、はとんどありえない（１，０００分の１）（第■表）。分散結果の分析はまた、強い変種効果を示した（２０１０００１未満）。しかしながら、いずれか２つの処置平均の相違の度合は、１つのトウモロコシ植物の変種から他まで一定でない。相互作用効果として知られているこの後者の効果は、処置平均間の比較が単−変種内で行なわれるべきであることを示す。変種１．２および４に関して、トウモロコシ植物不稔が本実験に用いられる処置によって影響されるという強い証拠があることを示す。しかしながら、変種３における処置効果の統計的に著しい証拠はない（第■表、第■表、第■表および第Ｘ表）。第ＸＩ表、第Ｘ■表、第ｘ■表および第ＸＩＶ表は、各々トウモロコシ変種１．２．３および４に関する対の不稔処置平均の比較に関するダンカン並列範囲テスト結果を示す。再び、同一グループに属するとして特定された全処置平均は、お互い著しく相違しない。すなわち、同様に処置されたトウモロコシ植物の各グループにおいて不稔となる植物のパーセンテージは、グループ間で相違しない。従って、ソース１．２．３、および４ＡＭＳ／ベクターによる処置平均（各々、Ｂ１、Ｂ６、Ｂ４およびＢ５）は、変種１．２および４において、トウモロコシ抽出物（ＡＭＳ／ベクタターなし）、緩衝液のみ、アルファルファ抽出者（ＡＭＳ／ベクターなし）での処置および未処置植物のもの（各々、Ｂ２．Ｂ３．Ｂ８およびＢ７）と著しく相違する。雄性不稔は、変種３においては観察されなかった。６、　１０．　２．　１．　２．植物の高さの分析（第ＸＶ−Ｘ■表）植物の高さに関する分散の分析は、処置間に著しい相違があることを示した（Ｐｏ、０１０６未満）。これは、全ての不稔（対照を含む）処置が植物の高さに対して効果がないという可能性が約１パーセントあるいは１０００分の１１であることを意味する。言い換えると、不稔処置が植物の高さを影響するという強力な証拠がある（第Ｘ■表お智処置が他と著しく相違するかを決定するため、ダンカン並列範囲テストとして知られている並列比較法を行った。この統計的分析は、著しく相違するいくつかの比較の断言するという間違いの可能性を増すことなしに、事実これらがそうでない隙に対の平均を比較することを認める。第Ｘ■衷に示されるように、特定グループ別は範囲内の全平均は、お互いに著しく相違せず、一方異なるグループからのいずれか２つの平均は誤りの機会２０分の１のみで著しく異なるとして断言され得る。従って、緩衝液のみ、ソース３および４ＡＭＳ／ベクターおよびアルファルファ抽出物での処置の平均（各々、Ｂ３．Ｂ４．Ｂ５およびＢ８）は、ソースｌおよび２ＡＭＳ／ベクターおよびトウモロコシ抽出物（ＡＭＳ／ベクターなし）での処置および未処置植物のもの（各々、Ｂ１、Ｂ６、Ｂ２およびＢ７）のものと著しく相違した。分散の全ての分析はまた、トウモロコシ植物の変種の間に著しい相違（Ｐｏ、００１未満）を示した（前記第ＸＶＩ表）。植物の高さ応答が各トウモロコシ変種に関して相違するという間違った結果となる可能性は、０．０１パーセントまたは１０，０００分の１未満である。第Ｘ■表は、トウモロコシ変種の平均の間のダンカン並列範囲テストからの結果（すなわち、処置にわたる平均）である。強い処置効果がなくても、ダンカン並列範囲テストは、処置・１′、均における相違のパターンおよび相対度数を解明するのに釘効である。第ＸＸＩ表は、処置の間のダンカン並列範囲テストの結果を示す。穂たけは、トウモロコシ植物の変種により多様化するようであった。分散結果の分析は、穂たけがトウモロコシ植物の間に著しく変化するという誤った解釈をする可能性が、０．０１パーセントまたは１０，０００分の１未満であることを示す。第ＸＸ■表は、トウモロコシ植物変種平均に関するダンカン並列範囲テスト結果を示す。第ＸＸＩＩ表は、各トウモロコシ変種が各地の３つの変種と著しく相近する（Ｐｏ、０５未満）ことを示す。この解釈があやまりであるという可能性は、５パーセントまたは２０分の１以下である。６．１０．２．１．４．開花までの日数の分析（第ＸＸ■〜ＸＸＶＩ表）分散結果の分析は、処置が開花までの日数に対していずれの効果も示さないが変種効果があることを示す。開花までの日数は、あるトウモロコシ植物の変種から他まで著しく相違する（Ｐｏ、０００１未満）（第ＸＸ■表および第ＸＸ■表）。ダンカン並列範囲テストは、処置の平均の間で著しい相違を示さなかった（第ｘＸＶ表）。第ＸＸＶＩ表は、開花までの日数の変数に関するトウモロコシ植物変種平均の比較に関するダンカン並列範囲テストの結果である。全ての２つの変種の可能な比較は、著しく相違する（Ｐｏ、０５未満）。この状態が誤りまである可能性は、５パーセントまたは２０分の１以下である。植物（各々、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ８およびＢ７）が全変種にしてソース１．２．３および４ＡＭＳ／ベクターによるのと著しく相違することを示した。変種１において、ジス４Ａ処置平均と異なり、一方、変種４においてソース２ＡＭ／ベクターによる処置平均（Ｂ６）は、残りの処置平均異なった。処置における相違は、分散データの分析およびダン力に並列範囲テストの両者からの「植物の高さ」特性に明らかであった。著しい相違（Ｐｏ．０５未満）もまた、ダンカン４ｔ２列範囲テストを用いて変種間の植物の高さ特性に関して示された。穂たけは、８処置のいすずれによっても影響されなかったかトウモロコシ植物の変種によって著しく変化したようだ。全４変種の穂たけの平均は、お互いに著しく相違した。「開花までの日数」の変数に関して処置間の著しい相違はなかった。分散の分析（Ｐｏ．００１未満）およびダンカン並列範囲テスト（Ｐｏ．０５未満）の両者は、著しい変種の相違を示した。６、１０．　２．　２．生殖不能の特徴の説明ソース１、２、３および４ＡＭＳ／ベクターによる処置（各々、Ｂ１、Ｂ６、Ｂ４およびＢ５）は、全ての反復製にわたって裂開花粉のない植物を示した。裂開花粉を示さない雄花の穂において、杓は、包頴て覆われていた。花粉を示す雄花の穂において黒紙上でゆすった際に、杓が包頴から出て、容易に見られた。裂開花粉を示さない植物は、しばしば群生が見られ、全処置において観察された位置効果は、４複製にわたってこの特性を示す。裂開花粉を有する雄花の穂からの朽の顕微鏡検査は、処置および複製において全４変種に関してなされた。全４変種において、このような雄花の穂における花粉は、稠密な細胞形質を有して特徴的に丸くかく均一であり、またアセトカーミンで染色可能であった（第３図）。しかしながら、変種１および２において裂開花粉を示さない雄花の穂からの朽は、裂開を示さず、また豊富な異常な不均一な形状の中味のない花粉が顕微鏡により朽壁より明らかに視覚できた（第４図）。これらの杓からの花粉は、相当な圧力を、カバースリップを押圧することにより朽に加えた時のみに放出することができた（第５Ａおよび５Ｂ図）。変種４において、裂開花粉を有さないれこらの朽からの花粉は、はんの少しの雄花の穂を除いて花粉粒子を形成しなかった（第ＸＸ■図）。朽を破壊した後でさえも、胞子形成細胞は、識別できなかった（第６図）。６．１１．大豆植物におけるＡＭＳ／ベクター処置の栽培室テスト本節に記載される実施例は、大豆におけるＡＭＳ／ベクターによって媒介される雄性不稔の誘導を示す。ＡＭＳベクターを含む４つの処置および４つの対照処置を発生４週間後（開花前）適用して、ＡＭＳ／ベクターが大豆において雄性不稔を誘導するかどうかテストした。朽および花粉の顕微鏡観察を行ってＡＭＳ／ベクター処置の効果を評価した。植物の高さ、開花頭数およびさや数を、植物生長刺激等の他の処置適用の効果があるかどうかを調べるために花粉検査を終了後に、各植物に関して測定した。分散の分析およびダンカン並列範囲テストを用いて、処置効果の統計的顕著性を測定した。雄性不稔植物は、ソース１．２．３および４ＡＭＳ／ベクターによる処置において観察された。大豆抽出物（ＡＭＳ／ベクターなし）による処理により検査された４１植物のうち１つが雄性不稔となった。緩衝液のみまたはアルファルファ抽出物（ＡＭＳ／ベクターなし）による処置または未処置は、雄性不稔を与えなかった。花粉生殖不能に関して１〜７の顕微鏡評価を用いて統計的分析を全処置および全複製にわたって行った。分散の分析は、処置相違が雄性不稔に関して非常に顕著であった（Ｐｏ、０００１未満）ことを示した。ダンカン並列範囲テストは、ソース１．２．３および４による処置平均が、緩衝液なしまたはアルファルファ抽出物（ＡＭＳ／ベクターなし）による処置または未処置地のものと著しく相違したことを示した。分散の分析は、植物の高さ、開花節／植物およびさや／植物の数に関して処置相違を示さなかった。ダンカン並列範囲テストを用いた際に、ソースＩＡＭＳ／ベクターによるおよびアルファルフｙ（ＡＭＳ／ベクターなし）による処置の平均は、植物の高さ変数に関して、ソース２ＡＭＳ／ベクターによるる処置の平均および未処置のものと著しく相違し、またソース３ＡＭＳベクターによる処置の平均は、さや／植物の数に関してアルファルファ（ＡＭＳ／ベクターなし）による処置と相違した。ダンカン並列範囲テストは、開花節／植物に関して処置相違を示さなかった。３つの識別パターンが花の顕微鏡検査の脛に観察された。すなわち１つは、花が正常外観朽、形状および寸法が規則的でありかつアセトカーミンで染色できる豊富な花粉を有し、第２は、朽が正常外観であるが正常および異常花粉の混合物でなる内部花粉を有し、そして第３は、明らかに正常な外観の朽において花粉粒子がないものであった。本節に記載される実験において用いられる大豆の種子は、ウィリアムス−８２変種であった。該種子は、−晩フイールドテスト部位に移された。種子は、種まきされるまで３８″Ｆの冷室に保存された。種子は、Ｔ１〜Ｔ８と示された種子包みにおける８バツチに入れられた。６、　１１．　１．　２．テスト材料の回収および運搬アルファルファ植物をフィールドから新たに刈って、液体窒素中に含浸した。液体窒素凍結材料をドイラアイス中、−晩フイールド部位に運んだ。これらの材料の４つ（４雄性不稔アルフアルフア系、ＰＩ　Ｎｏ、２２１４６９．１７２４２９、２２３３８６および２４３２２３）は、ＡＭＳ／ベクターを含んでおり１つは、アルファルファ対照（同種同型非不稔系）であった。この材料をＴ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４おびＴ５と予めコードした密封プラスチックバックに入れた。処置および対照に関するソースおよびこれらの相当丁番号の記録を保持した。フィールドテストを行なわない職員は、ＩＴＪ表示のみ知り、各場合における処置の特性は知らなかった。フィールドテストを行うものは、それ故装置に対して「ブラインド」であった。６、　１１．　１．　３．植物成長に関する生長システムおよび条件不稔、植物生長集合体を大豆を生長させるのに用いた。植物は、ＣａＨＰＯ４１，０８ｇ、に２　ＨＰＯ４０゜２ｇ、Ｍｇ５Ｏ＋　０．２ｇ、ＮａＣ，Ｑ　、０．２ｇ、ＦｅＣΩ：ｌ　０．１６ｇ、水１０１００Ｏからなるマクロおよびミクロ栄養剤を含む栄養剤溶液をほどこされた。根鉢元素Ｂｏ−０，０５％、Ｍｎ−０，０５％、Ｚｎ−０，００５％、Ｍｏ−０，００５％およびＣｕ−０，００２％　ｌｔｎｌを加えた。この栄溶剤溶液は、１０分１強度で用いられ、窒素源としてＫＮＯ３（０，０５％）で補なわれた。この実験用の制御環境栽培室は、１４時間昼／１０時間夜サイクルに２５℃の一定温度管理体制でかつ光強度３４０　ｕｍｏｌ−２Ｓ−’の植物天蓋にセットされた。６．１１．１．４．種まきおよび発芽各色み（Ｔｌ〜Ｔ８）からの種子を滅菌ジャーに移し、表面を９５％エタノール５０ｍ１で直ちにすすぐことによって滅菌し、ついで１．５分間酸性化塩化水銀溶液（０，２％ＨｇＣｆ１．０．５％濃度ＨＣＮ水溶液）にて処置した。塩化水銀溶液をデカンテーションし、種子を滅菌蒸留水で１０回すすいだ。最終すすぎの後、種子をまく前に１時間滅菌蒸留水に吸収させた。１ポツトにつき３種子を土壌中深さ１．５〜２ｃｍにまいた。土壌の表面を、種まき後細菌またはカビ汚染を防ぐため、水槽砂利１インチで覆った。全集合体をかっ色紙で覆って光から土壌および根システムを遮断した。ポットを標識（Ｔｌ〜Ｔ８）して栽培室に移した。各８バツチの種子を総計２４ポツトにまいた。発芽データを、種まき６日後に記録した。各バッチの種子に関して書きとめられた発芽パーセンテージは、Ｔｌ−４４、Ｔ２−４２、Ｔ３−３５、Ｔ４−５４、Ｔ５−４７、Ｔ６−３９、Ｔ７−３３およびＴ８−３２であった。発芽は、通常より低く　（通常は９０％以上）、そのためポット中の全実生が残され間引きを行わなかった。上記と同じ方法を用いて栽培変種ウィリアムス−８２［デワイン　シード　カンパ＝　−（Ｄｅｆｉｎｅ　５ｈｅｃｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ。Ｙｅｌｌｏｗ　Ｓｐｒｉｎｇ、　０ｈ１ｏ）製コの補足的種子を滅菌して３実生未満でポットにまいた。種子をまいて１ポツトにつき最少の３実生植物を達成した。もとの種子バッチに相当する実生植物を標識してこれらを補足的グループのウィリアムス−８２種子と区別した。補足的グループのウィリアムス−８２の種子のみを実生植物が１ポツトにつき３を越えたときに間引きした。続いて、第２組のポットに各々２０種子を含むＴ１〜Ｔ８と標識された包みからの８バツチの種子として大豆種子をまいた。これらの種子を、まくまで３８’　Ｆの冷室に保った。２種子を１包の種子について１０ポツト、各８０ポツトにまいた。植物成長システムおよび種まき方法は、第２種まきにおける種子を表面滅菌しなかった以外は同様であった。運搬ダメージから種子表面に細かい亀裂がありまた滅菌法が該細かい亀裂から種子に造語して、生育可能性をおよび発芽を減じるので、第２種まきにおける種子は、滅菌処理されなかった。第２種まきにおける種子の発芽パーセンテージは、Ｔｌ−８０、Ｔ２−１００　、Ｔ３−７０　。Ｔ４−８０　；Ｔ５−６０　；Ｔ６−１０．０　、Ｔ７−９０およびＴ８−６５であった。第２種まきの発芽後、もとの種子が発芽しなかった第１種まきからのポットを捨てた。捨てられたポットの数は、Ｔｌ−０；Ｔ２−６　、Ｔ３−７　、Ｔ４−１　；Ｔ５−２　；Ｔ６−４；Ｔ７−５およびＴ８−３であった。６．１１．１．５．実験デザインおよび処置実験デザインは、全分割としての複製および区画としての処置を行う分割一区画であった。分割一区画デザインは、処置ブロック同志を保持することによりエラーを減少させた。各処置内および各複製内の処置内の植物の任意抽出があった。（完全に任意抽出されたデザインは、処置をブロックに分離しなかった。）８処置の６複製があった。８処置（第ＸＸ■に記載）は、ソースとして異なるアルファルファ遺伝子型からのＡＭＳ／ベクターを含有する４つの材料および種々の対照を含む。第ＸＸ■表ソースｌ、ＡＭＳ　／ベクター　Ｂ６　Ｔｌ（Ｕ、Ｓ、Ｄ、Ａ、ＰＩ　Ｎｏ、　２２１４８９）未処置　Ｂ５　Ｔ２大豆抽出物、　Ｂ７　Ｔ３ＡＭＳ／ベクターなしソース２．ＡＭＳ／ベクター　Ｂ８　Ｔ４（Ｕ、Ｓ、Ｄ、Ａ、ＰＩ　Ｎｏ、Ｌ７２４２９）ソース３．ＡＭＳ／ベクター　Ｂ２　Ｔ５（Ｕ、Ｓ、Ｄ、Ａ、ＰＩ　Ｎｏ、２２３３８６）アルファルファ抽出物、　Ｂ３　Ｔ６ＡＭＳ／ベクターなし緩衝液のみ、植物抽出物なし　ＢＩ　Ｔ７ソース４　、　ＡＭＳ／ベクター　Ｂ４　Ｔ８（ＬＩ　Ｓ、Ｄ、Ａ、ＰＩ　Ｎｏ、２４３２２３）申６．１１．１．６．ＡＭＳ／ベクター処置および対照処置の準備および適用６、　１１．　１．　６．　１．処置材料およびそのソース受けとりかつ冷凍保存されたアルファルファ材料は、４つのＡＭＳ／ベクター処置およびアルファルファ対照処置用のソース材料であった。大豆抽出物用ソース材料は、フィールド部位で成長した変種ウィリアムスであった。他の２つの対照処置は、緩衝液（０，０６７Ｍ　ＫＨ２ＰＯ４゜ｐＨ６，９）のみの適用または全処置に共通のセライト適用を越えて全ての材料を適用なしく未処置）であった。６、１１．１．６．２．抽出法リン酸緩衝液（ＫＨ２ＰＯ４，０，０６７Ｍ、ｐＨ６゜９）を植物材料の抽出３日前に調製し、１１℃にて保存した。全抽出法は、使い捨て外科用手袋をはめて行った。新しい一対の手袋を複合汚染を避けるために各処置に用いた。冷凍アルファルファ植物材料をフリーザーから取り出し、秤量した。各処置に関して材料１６０ｇをウェアリング強力カブレンダー中２〜３分間に’Ｈ２ＰＯ４緩衝液（０，０６７Ｍ、ｐＨ６，９，１１℃）中離解した。ホモジネートを４層の荒目綿布で濾過して、植物かすを除去した。濾液を滅菌２５０ｍ１遠心ビンに回収して冷蔵ツルバール（Ｓｏｒｖａｌｌ）遠心機中のＧＳＡｏ−夕を用いて２００Ｏｒｐｍにて５分間遠心分離した。上澄液を滅菌フラスコ中デカンテーションし、標識して、ついで噴霧に用いるまで３８’Ｆにて保存した。得られた上澄液は、大豆植物を噴霧する抽出物を構成した。６、　１１．　１．　６．　３．抽出物の適用セライト（ケイソウ土、第■級、シグマ　ケミカルズキャット　Ｎｏ、Ｄ５３８４）を浸蝕物として用いた。セライト１００ｇを１ガロン園芸タンク噴霧器中ＫＨ２ＰＯ４緩衝液（０，０６７Ｍ、ｐＨ６，９，１１℃）１０００ｍｌに加えた。セライト緩衝液混合物を激しく振とうして、噴霧用の均一なセライトの分散液を確保した。大豆植物は、第５葉がみられるが花原生（ｆ’１ｏｒａｌ　ｐｒｉａ＋ｏｒｄｉａ）が目視できない際に噴霧された。全植物は、最初にセライト緩衝液混合物により噴霧された。ついで、植物を栽培室から取り出し、その時点ので処置（抽出物）にて噴霧した。植物抽出物および緩衝液のみを含む６処置をエーロゾル噴霧ユニット［シグマ　ケミカルズ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）キャットＮｏ、８４８８５）およびエーロゾル　プロペラ補充容器（シグマ　ケミカルズ　キャット　ＮＯ＞Ａ４５３２）を用いて噴霧した。各大豆植物は、第１節から噴霧しはじめ、若葉端（ｓｈｏｏｔ　ｔｉｐ＞まで行なった。大豆植物を適用の際に回転した。植物抽出（または緩衝液のみ）約２５ｍ１を各植物に適用した。１つの対照処置（緩衝液なし、抽出物なし）における植物は、セライトのみを適用させた。噴霧する時に、フィールド部位でない職員は、ポット上のｒＴＪ番号およびそれらの相当処置コードを書きとめた。ついで、フィールド部位における職員は、名称８１〜Ｂ８を任意に付与されたＴ１〜Ｔ８ポットを再標識した。フィールド部位の職員は、ｒＢＪ番号のｒＴＪ番号に関連するコードを保存した（第ＸＸ■表参照）。以後この点から研究は、個々のパーティ−により保持されたコードを破壊しなければだれも各処置の特性にきすくことができないという点で「２重ブランド」になった。ポットをフィールド部位コードで標識した後、これらを栽培室に移し、４ブロツク内で任意抽出した（複製）。補足的種子の第２の種まきにおける大豆の抽出物調製および噴霧は、第１種まきの方法と同じ方法で行なわれた。ついで、ポットを第１種まきに関して設定された同一コードを用いて相当フィールド部位番号（Ｂｌ〜Ｂ８）でコードした。これらのポットを栽培室に配置し、各複製において８処置した複製５および６とみなされた。全植物をくいでつないで垂直に保った。６．１１．１．７．データの収集データ収集は、４つのパラメータを含んだ。すなわち、花粉不稔、１２０日における植物の高さくインチ）、１植物に対する開花節の数およびさやの数であった。これらのパラメータは、全ての処置における各植物についで評価された。花粉評価を示す代表的顕微鏡写真を撮影した。花粉不稔に関するデータ収集は、花が第２節を表した際にはじめた。花粉不稔評価に関して各植物から３つの花がアットランダムに選ばれた。花からの雄ずいを毛抜きを用いてスライドガラスに移した。アセトカーミン染料−滴を雄すいに配置しカバースリップで覆った。カバースリップを緩やかにとめ、雄ずいを顕微鏡で観察し、次のとおり試験された染色性について評価した。評価ｌ＝花粉なし評価３＝存在花粉の５％未満染色。評価５＝存在花粉の５〜９５％染色。評価７＝存在花粉の９５〜１００％染色。これらの評価を適格にする朽および花粉の代表的写真評価が進むように写した。花粉染色性に関する顕微鏡評価を種まき１２０日後に終了し、ついで植物の高さ、開花節の数およびさやの数を測定した。６．１１．１．８．データの統計的分析データを任意抽ａブロックデザインとして分析した。統計分析プログラムである統計分析システム（ＳＡＳ）を分析に用いた。分散の分析（Ｆ統計量）を用いて８処置における統計的に著しい相違に関してテストした。有意性の確率Ｐの値０．０１以下は、処置効果を支持する強力な証拠とみなした。平均分離をダンカン並列範囲テストを用いて行なった。処置平均は、臨界範囲値を用いて比較された。６．１１．２．結果および議論６、　１１．　２．　１．統計的分析８処置（４つの対照を含む）のうち１つを８グループのポットに移された植物の１つに任意に与えた。各グループは、各ポットにおいて２つの植物を有する６ポツトを含んでいた。処置は、個々に各植物上に噴霧された。このデザインを６度複製した。上記の実験デザインは、８処置が処理主要効果がらなり複製がブロックを構成する普通の任意抽出ブロックデザインである。第ＸＸＩＸ表は、この調査において測定された各４つの対応変数まの全ての平均、すなわち、花評価、植物の高さ、花節の数およびさやの数を含む。第ＸＸＩＸ表応答変数に関する処置平均処　置　花評価　植物の高さ　花節の数　種子ざやの数Ｂｌ　５．８０５０３　５２．８３４０　２１．４５２８　ＬＬ、１８３７Ｂ２　５．０Ｌ３８９　４９．７４７９　２２．６６６７　８．６９７７Ｂ３　５．５８２０９　５９．９７８４　２１．８８２４　１２．９５６５Ｂ４　４．９ＬＯ２６５１，２０７７２１，５０００９，１６２８Ｂ５　５．６０８１９　４８．４８６０　２１．６４９１　１２．２６４２８６　４．５７Ｂ９２　５４．６０００　２３．６７３１　１１．２０００Ｂ７　５．４３９０２　４９．９７３２　２１．６５８５　９．８３７８Ｂ８　４．５４１６７　４７．４９５８　２１．９１６７　９．５７４５各処置の組合せおよび複製に関する花の評価、植物の高さ、花節の数およびさやの数の応答変数の平均を以下の第ＸＸＸ表、第ｘｘｘｍ表、第ＸＸＸＶＩ表および第ＸＸＸＩＸ表に示す。６、　１１．　２．　１．　１．花粉評価の分析（第ｘｘｘ−ｘｘｘｎ表）３つの別々の花を各植物から選択し、花粉生殖性について評価した。これら３つの評価の平均を各植物につい計算しく第ＸＸＸ表）、分析の応答変数として用いた。分散結果の分析（第ＸＸＸＩ表）は、著しい処置結果があったことを示した（Ｐｏ、０００１未満）。実際は処置効果がない際に処置効果があるという解釈による判断における誤りをする可能性は、０．０１パーセントまたは１０．０００分の１である。これは、平均孔評価が生殖不能処置の範囲によって影響されるという強い証拠である。ダンカン並列範囲テストは、０．０５レベルで行なわれ、対の処置平均の対の相違のパターンまたは程度を概説した。第ｘｘｘｎ表は、ダンカン並列範囲テストの結果を示す。第ｘｘｘｎ表に示されるとおり、同一グループに属する全平均は、０．０５レベルにて著しく相違しなかったが、グループ間のいずれか２つの処置平均の比較は、著しいとみなすことができる。すなわち、処置２に関する花評価が処置３に関する花評価と著しく相違するという解釈による判断において誤りをする可能性は、５パーセントまたは約２０分の１以下である。ソース１．２．３および４ＡＭＳ／ベクター（各々Ｂ６、Ｂ８、Ｂ２およびＢ４）の処置平均は、緩衝液のみおよびアルファルファ抽出物（ＡＭＳ／ベクターなし）での処置および未処置植物の平均（各々、Ｂ１、Ｂ３およびＢ５）と著しく相違した（第ｘｘｘｎ表）。６、　１１．　２．　１．　２．植物の高さの分析（第ｘｘｘｎ表〜第ＸＸＸＩＶ表）分散結果の分析は、実験における大豆植物の高さに対する著しい処置の結果がなかったことを示した（第ＸＸＸｍ表および第ＸＸＸＩＶ表）。著しい処置効果があったという誤った解釈をする可能性は、約１８パーセントである（第ＸＸＸＩＶ表）。再び、ダンカン配列範囲テストを行って処置平均間の相違の待遇（ｐａｉ　ｒｗｉ　ｓｅ）のパターンおよび程度を評価した。第ｘｘｘｖ表は、このテスト結果を示し、処置平均の可能な２８相違対のうち９が著しく相違すると断言できることを示す。この状態が妥当でないという可能性は、５パーセントまたは２０分の１以下である。従って、全ての植物の高さに対する処置の主要効果は、著しくないらしい。６．１１．２．１．３．開花節の数の分析（第ＸＸＸＶＩ表および第ＸＸＸ■表）分散結果の分析は、処置効果に関する証拠がなかったことを示した（第ｘｘｘｖｒ表および第ＸＸＸ■表）。花部の数が本研究に用いられる処置によって著しく影響されるという解釈による判断において誤りを犯す可能性は、はぼ９０パーセントであった（第ＸＸＸ■表）。ダンカン並列範囲もまた、処置平均の間の著しい待遇相違を示さなかった（第ＸＸＸ■表）。６、　１１．　２．４．　さやの数の分析（第ＸＸＸＩＸ表〜第ＸＬＩ表）分析結果の分析は、１植物に対するさやの数が生殖不能処理のいずれかによっても著しく影響されるという証拠を示さなかった（第ＸＸＸＩＸ表〜第ＸＬ表）。さやの数が不稔処理により著しく影響されるという誤った解釈をする可能性は、朽３０パーセントまたは１０分の３であった（第ＸＬ表）。ダンカン並列範囲テストは、処置Ｂ２（ソース３ＡＭＳ／ベクター）と処置Ｂ３（アルファルファ抽出物、ＡＭＳ／ベクターなし）の平均の間の相違のみが５％のみの誤った可能性で著しいと断言され得ることを示した（第ＸＬ１表）。６、　１１．　２．　１．　５処置相違の統計的顕著性の要約フタ−での処置（各々、Ｂ６、Ｂ８、Ｂ２およびＢ４）に処置相違は、分散データの分析に基づく花粉不稔の顕微鏡評価に関して極めて顕著であった（Ｐ　Ｏ，０００１未満）。対の処置の間の相違の度合を検討するために行われたダンカン並列範囲テストは、ソース１．２．３および４の処置（［乏均（各々、Ｂ６、Ｂ８、Ｂ２およびＢ４）が緩衝液のみ、アルファルファ抽圧物（ＡＭＳ／ベクターなし）および未処置植物の処置平均（各々、Ｂ１、Ｂ３、およびＢ５）と著しく相違することを表した。分散結果の分析は、大豆植物の高さに対する著しい処置効果がないことを示した。しなしながら、ダンカン並列範囲テストは、処置Ｂ６（ソースＩＡＭｓ／ベクター）およびＢ６（アルファルファ抽出物、ＡＭＳ／ベクターなし）の平均が処ｕｔＢ８　（ソース３、ＡＭＳ／ベクター）およびＢ５（未処置）の平均と著しく相違したことを表した。分散の分析またはダンカン並列範囲テストによる開花節／植物に対する著しい処置効果がなかった。また、分散テストの分析からさやの数がいずれの処置によっても影響されるという証拠がなかった。しかしながら、タンカン並列範囲テストは、処置Ｂ２（ソース３、ＡＭＳ／ベクター）とＢ３（アルファルファ抽出物、ＡＭＳ／ベクターなし）の平均の間の相違を表した。６．１１．２．２．不稔の特徴の説明雄性不稔植物は、ソース１，２．３および４ＡＭＳ／べ関して観察された。大豆抽出物（ＡＭＳ／ベクターなし）による処置（Ｂ７）において、４１植物のうち１つのみが雄性不稔であった。緩衝液のみおよびアルファルファ抽出物（ＡＭＳ／ベクターなし）による処置および未処置植物（各々、Ｂ１、Ｂ３およびＢ５）は、雄性不稔植物を示さなかった（第ＸＬｎ表）。第）（Ｌ　Ｉｆ表６複製実験にわたる大豆−全不稔一覧表処　置　検査植物　不稔植物”　授精可能植物Ｂｌ　５３　０”’（０％’）　５３　（１００％）８２　４８　Ｂ（１２％）　４２（８８％）Ｂ３５１　０（０％）　５１　（１００％）８４　５２　Ｂ　（１２％）　４Ｂ（８８％）Ｂ５５７　０（０％）　５７　（１００％）８６　５２　１２（２３％）　４０（７７％）Ｂ７４Ｌ　ｌ（２％）　４０（９８％）８８　４８　１０（２１％＞　３８（７９％）本植物は、大部分が１を評価（花粉なし）され少数（５％未満の花粉が染色された（評価３）と評価された花を有した。不稔植物は、さやを有さなかった。木本植物の実際の数、かっこ内はパーセンテージ。処置された植物からの顕微鏡評価の際に観察された不稔の代表的パターン（第７〜１３図）は、３つの別個のパターンを表した。第１のパターンは、寸法と形状が均一であり（第７図）かつアセトカーミンで染色された（第８図）豊富な花粉粒子を有する朽をもった花を示した。このような花の柱頭表面は、それに付着された花粉粒子の塊を有した（第９図）。大豆は、自己授精種であり、第７〜９図は、正常な大豆の花に見ることができる特徴を示す。第２のパターンは、正常な杓の外観を示すが朽含有物が染色不稔の異常な形状の花粉粒子と正常花粉の混合物である花によって特徴づけられた（第１０図）。異常な花粉は、不均一形状であり、染色不能でかつ著しく空胞化されていた（第１１図）。正常と異常との割合は、このパターンにおいて花ごとに変化した。第３のパターンは、正常の外観の朽を示すが、朽が花粉およびその表面の柱頭毛を欠いた花によって特徴づけられた（第１２図）。このような花の柱頭は、花粉およびそ表面の柱頭毛を欠いた。このような朽は、破壊された後でさえも、これらの内部の花粉粒子を表さなかった（第１３任意抽出ブロツクデザインを、上記の節における花評価、植物の高さ、花部の数およびさやの数に関する基礎とじて用いた。他に、データは、完全に任意抽出されたデザインを一方向区分（Ｏｎｅ −Ｗａｙ）として示されることができた。後者のアプローチはブロック（複製）の間に著しい相違があり、また処置間の相違が１つのブロックから他に一定である（すなわち、ブロック−バイ−処置相互作用は、著しくない）ことを仮定した場合に妥当である。しかしながら、より以前の節に存在する結果は、この場合でない。各４依存変数に関する分散結果の分析は、この効果が他の応答変数より花評価に関して弱かった（Ｐ＝０．０８５）が著しいブロック−トウーブロック変位（Ｐｏ、０５未満）を示した。ブロックおよび残りの２乗の和によるブロック−バイ−処置による効果をプールし、後者を処置効果に関して「正当な」用語として用いることによって、処置効果を決定する力を減少する。これは、著しいブロック−トウーブロック変化がある場合および／または著しいブロック−バイ−処置相互作用がある場合に真実である。ブロック（複製）５および６が後に種まきされたのでブロック５および６がブロック１および２と異なるとみなし得る。従って、これらのブロックにおける植物は、ブロック１〜４における植物より実験の終了時の発展がより早いの段階にある。されゆえに、ブロック５および６を除いた花評価データの再分析を行った（第ＸＬＩＩＩ表）。再び、分散結果の分析は、強い処置効果を示した（ｐ−０，００３）。すなわち、処置効果があるという誤った解釈の可能性は、約０．３パーセントまはた約１０００分の１である。さらにまた、ブロック−トウーブロック変位（Ｐ＝ＣＬ　４７）またはブロック−バイ−処置相互作用（Ｐ＝０．４８）でないようだ。ブロック５および６が早期分析において著しいブロック効果に対して応答性であるらしい。第ＸＬＴＶ表は、ブロック５および６を除いた花評価の新たな分析に関するダンカン並列範囲テストである。 “＝第ＸＬ■表しかしながら、もとの分析（第ｘｘｘｎ表）は、推論に関して第ＸＬＶ表より正確であるとみなすべきである。ブロック５および６がふくまれている際にブロック−トウーブロック変化があっても、この効果は、早期分析において説明され全データを用いる研究者に処置効果を評価させる。事実、処置効果は、ブロック５および６がこの分析に含まれる際により強い。６．１２．）ウモロコシの次世代におけるＡＭＳ／ベクター誘導雄性不稔の遺伝形質の証明本節に記載される研究は、）・ウモロコシの次世代へのＡＭＳ／ベクター誘導雄性不稔の遺伝形質を示す。この実験は、ワイマナロー、ハウイ（Ｗａｉｍａｎａｌｏ、Ｈａｗａｉｌ）における研究所でのフィールド部位で行われた。４組のトウモロコシを種まきした（第ＸＬＶ表）。第１および４組は、トウモロコシの次世代におけるヘリトウモロコシ種子ソース０１　ＡＭＳ／ベクター処置同系交配系からの生殖不能植物×未処置同種同系系の交雑からの種子。２　ＡＭＳ／ベクター処置同系交配系からの受精可能植物の自己交雑からの種子。３　ＡＭＳ／ベクター処置同系交配系×非同種同系系未処置同系交配系の交雑からの種子。４　Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４およびＳ５世代からの同系交配置。２および４の種子。。＊より詳細な説明に関しては前記第６．　１１．　１．節を参第ＸＬＶＩ表トウモロコシの系に関する同系交配コードコード　種子群変種コード同系交配Ｉ　Ａ３３２Ｈｔ、ロット９５０、第Ｆ級同系交配２　Ｂ７３ｆ（ｔ　、ロット４５５１ＳＴ、第２３〜２１Ｆ級同系交配３　１１９５１１ｔ　、ロット１５０．　第ＭＦ級同系交配４　Ｍｏ１７ｔｌｔ、　ロット０５５．　第ＭＦ級タビリティーを特定に評価するためにテストされた。第２組材料をテストする目的は、不稔がＡＭＳ／ベクター処置に対して不稔にはじめは転換できなかった自己授精トウモロコシ植物の次世代に発現されたかどうか決定することであった。第３組テストにおいて、目的は、ＡＭＳ／ベクター同系交配系×非同種同系未処置同系交配誘導Ｆ１種子がいずれかの不稔を発現するかどうかを決定することであった。第１組におけるデータからの結果は、トウモロコシにおけるＡＭＳ／ベクター誘導雄性不稔がトウモロコシの次世代に受け継がれたことをした。同系交配２および４は、このテストにおいて８０％以上雄性不稔を示した。第２組において、不稔は、同系交配置　（１，７％生殖不能）および同系交配３　（３，４％生殖不能）のうち少数の植物において発現された。第３組において、雄性不稔は、発現されなかった。第４組において、同系交配置、２および４は、９０％以上の雄性不稔を示した。授精可能を評価された雄花の穂は、一般に全ての朽が十分に裂開されていた。雄の穂が裂開放出花粉である１つの小穂につき１／１０朽のみを発生した第１組における同系交配２および４の授精不能植物が２つの例外であった。残りの雄花の雄は、小穂内に包まれており裂開しなかった。生殖不能植物の雄花の穂は、朽の裂開を示さずほとんどの部分に関して小穂に包まれていた。顕微鏡観察は、授精可能を評価された雄花の穂からの杓が円形の染色可能の穂を有し、一方、不稔であることを評価された雄花の穂からの朽は、不規則的な形状の染色不能の異常花粉を有したことを表わした。授粉可能であると評価されほんの少しの朽を裂開させた雄花の穂において、異常な花粉か未裂開巧に豊富にあり、一方正常花粉は、裂開朽に豊富にあった。開花に先立って前述の第６．９節に記載の実験における全ての４つの遺伝子型のトウモロコシ植物の穂をシュートチンプ　パック（ｓｈｏｏｔ　ｔｉｐ　ｂａｇｓ）で田った。３つの型の交雑を穂が開花した後に行った。３つの交雑パターンから誘導され種子は、本実験の第１〜３組に関する種子を構成した。これら３組および補足的組の特徴は、次のとおりてあった。第１組：いずれかの雄性不稔が各同系交配株に関して同定された後、シュート　チップ　パックを除き不稔植物の穂の花は、別々にフィールド内に種まきされた未処置同種同系交配遺伝子型から導かれた花粉を散布された。穂を、成熟した際に収穫した。種子を、穂軸から離し、水分が１５％になるまて乾燥した。この種子（合成１またはＳｌという）を第１組と呼んだ。第２組二種子を産生じたＡＭＳ／ベクター処置植物（授精可能）を自己授精した。このような自己交雑から誘導された種子を第２組と呼んだ。第３組：　ＡＭＳ／ベクター処置雄性不稔同系交配系と非同種同系未処置同系交配系との交雑を行った。交雑は次のとおりであった。処置同系交配２×未処置同系交配３、処置同系交配２×未処置同系交配４および処置同系交配４×未処置同系交配２゜このような交雑から誘導された種子を第３組と呼んだ。第４組：未処置同種同系系に交雑された各３つのＡＭＳ／ベクター処置雄性不稔同系交配（１，２および４）の４世代からなる種子を発生した。８２〜Ｓ５からなるこの種子を第４組と呼んだ。第１〜３組に関して、各穂からの種子を殻から出し、種子籾に包んだ。各種子の包みは、種子の起源に相当する処置名を与えられた。例えば、第１および２組に関して、■Ｉ　ＲＩ　Ｂ８の処置名は、第６．９０節に記載された実験の複製１からのＡＭＳ／ベクター処置Ｂ１で処置された同系交配置を意味した。第３組に関する処置名の例として、ＴＩＩ　Ｂ１　ｘＵＴ　Ｉ３は、ＡＭＳ／ベクター処置（Ｂ＋処置）同系交配置と未処置同系交配３との交配に相当する。第４組処置名の例としては、Ｉ、Ｓ＋　または１２　Ｂ４は、各々、同系交配置のＳ２世代または同系交配２の８４世代に相当する。第１〜３組を２つの複製で種まきした穂の列に関して準備した。第４組も並列の穂であるが１複製としてのみ種ま第１〜３組に関して、各穂から誘導された種子を、各々３２種ｒの２０ツトに算入し、各ロットを複製において種まきした。単一の穂が３２種子以上産生じない例において、１つのみの複製を種まきした。種子を、湿潤殺菌剤キャブタン（Ｃａｐｔａｎ）　［ドラボンケミカル　コーポレーション、ローアノーク、バージニア（Ｄｒａｇｏｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｒｏａｎｏｋｅ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ）コで覆った。キャブタンを水と混合して、薄いペーストを作成した。キャブタン大さじ４杯を水１リットルに混合し、溶液をマクネテックスラーラーで攪拌しつづけた。各包みからの３２種子をキャブタン水混合物に浸された茶こしに移した。過剰キャブタンを濾別し、種子を紙タオルに配置し、表面の過剰水分を除き２時間乾燥した。ついで、キャブタン成田種子を予め好適な処置番号で標識された紙袋で包んだ。種子を注意深く包み、ハワイまで手で運んだ（ｈａｎｄ　ｃａミツイールド位は、ハワイにあるワイマナロービレッジ（Ｗａｉｍａｎａｌｓ　Ｖｉｌｌａｇｅ）内のワイマナロー研究所であった。この研究所は、海抜約２０メートルの北緯２１の太平洋から３マイルの場所に位置する。土壌は、サンゴおよび溶岩貫入から導かれたバッチイックバブルストール（Ｖｅｒｔｉｃ　Ｈａｐｌｕｓｔｏｌ　ｌ）であり、主要農地とみなされている。土壌のｐＨは、平均６．０である。研究所における平均気温は、月々２２〜２７℃の範囲で２４℃である。平均年間降雨量は、１３２０１１１ｍであるが、月々１０〜１８０１１１の範囲である。雨は、冬期により顕発する。日照時間は、１０゜８〜１３゜２時間の範囲である。風量は、大部分連続して緩かで８〜１５ｋｍ／ｈｒであるが時には２５〜３０ｋｌｌ／ｈｒに達する。入射光値は、５４０　ｃａｌ　／ｃ＋Ｊ／日を越えるがくもった冬期では２２０ｃａｌ／ｃ♂／日であり得る。６．１２．１．４．　フィールド準備および管理フィールド部位１０５フイート ×１２０フイートを耕し、ハローでならし移転耕耘した。１５０　：　９０　：　６０ｋｇ／ｈａの比てＮＳＫ　（窒素−リン−カリウム）からなる基礎肥料を、肥料塗布器を用いて適用した。さらに８０ｋｇＮ／ｈａを発生４週間後に服用した。フィールドを月曜口、水曜日または金曜日に必要ベースとして湿らした。６．１２．１．５．実験デザインデザインは、第１．２および３組に関して２複製においてなされた穂の並列に種まきを有する任意抽出完全プロツクデザインであった。第４組もまた並列の穂であったが複製においてのみ種まきされた。各ブロックまたは複製において処置（穂の並列化）は、完全に任意抽出であった。各処置を各複製において１０フイート並として種まきした。１列につき各種子間を約４インチはなして３２種子をまいた。各ブロックにおける種まきは、各段について２０列の段になされた。各役向において、列を３フイート離して分離した。各段における間の距離は、２フイート、４フイート２フイート、４フイート、４フイート、２フイート等に変えられた。２つの段が４フイート離された場合、パイオニア（Ｐｆｏｎｎｅｒ）ハイブリッド３０４Ｃを、交差列として種まきした。２段間の距離が２フイートの場合種まきを行な１つの種子包みを命名されたラフダム番号に従って各列に関して与えた。種まきは、押出種まき機（ｐｕｓｈ　ｐｌａｎｔｅｒ）を用いて行った。各々１つの栽培者である６名は、与えられた時間、種まきに参加した。各々配列後、栽培者は、他の並に移動する前に手で清掃して泥等を除去した。種まきを段ごとに行い、例えば第２段において２１〜４０列に移る前に第１段において１〜２０列をまず種まきをした。第１組の複製における列を第１組の複製２より前に種まきした。第２組の種まきは、第１組の終了後のみに開始した。同様に第３組は、第２組の終了後に種まきした。第４組は、１２段のうち１段に種まきし、処置をこれらに役向で任意抽出した。第１〜４組の種まきの終了後、未処置同系交配置〜４を各列が長さ１００フイートの列（各列に１つの同系交配）に種まきして交雑用花粉ソースとして提供した。実験ポットの３側面に、６列の境界に、パイオニア３０４Ｃを種まきした。第４の側面に、トウモロコシを４週間後に種まきした。草木計算（Ｓｔａｎｄ　Ｃｏｕｎｔ）をトウモロコシ植物の発生１週間後に行った。著しく生長不足であるおよび／またはウィルスまたは疾病にて冒された植物および死亡植物を評価前に捨てた。残りの植物を計算し花粉授精可能または生殖不能に関して評価した。雄の穂が葉状葉から発生した後（および穂が開花し始めた後）黒色の厚紙を雄花の穂の下に配置し、後者をゆすった。雄花の穂が黒紙上に花粉を落とした場合、雄花の穂を授精可能と評価した。黒紙上に目視できる花を示さない雄花の尾を生殖不能と評価した。授精可能な雄花の穂は、赤色のひもをさげ、生殖不能なものは、黄色のひもをさげた。それらの花粉落下が擬わしいと思われる雄花の穂は、評価されず、黄色および赤色の両方のひもを下げた。花粉評価を毎日午前８時〜午後１２時３０分まで行い、３週間つづけた。全４組を毎日目視評価して、全雄花の穂をチェックしてそれらの前日の評価を再確認した。黄色および赤色の両方の下げひもを有する雄花の穂は、評価基準が明らかに合致した際に授精可能または不稔を評価した。黄色下げひもを何する同系交配置および２の雄花の穂に対するフィールド観察を各々、第１４〜１５図に示す。評価期間の終了時に、黄色下げひもを有する植物（生殖不能）および赤色下げひもを有する植物（授精可能）および植物の総数を各列において計算した。６．１２．１．７．２．Ｆおよび花粉特徴の顕微鏡観察各間系交配に関する授精可能および不稔の代表的例をフィールドから回収した。朽を雄花の穂から切断してアセトカーミンで染色した。朽および花粉の形態学的特徴を各代表的例に関して注目した。６、　１２．　１゜７．３．植物の高さ、穂たけおよび７５％開花までの日数植物の高さ、穂たけおよび７５％開花までの日数を各列に関して記録した。植物の高さを一列内の一平均的植物に対して測定した。植物の高さを土地から雄花の穂の頂部までの高さとしてインチで測定した。穂たけを土地から穂の根元までインチで測定した。穂たけを一列内の一平均植物に対して測定した。−列の植物の７５％が穂に花を示した際にその特定の日の月日を書きとめた。種まきから一列の７５％開花するまでの日数は、７５％開花までの日数である。６、　１２．　１．　８．交雑の方法第１〜４組の植物の全種を穂が視覚されて直ちに穂が開花を示す前に白色透明シュートチツブバ・ツクで覆った。各棟の花は、交雑する前の日にはさみで切断した。交雑する際に、シュートチップバッグの頂部を引きはがし花粉を花に振りかけた。穂（なお穂に付着するシュートチ・ンブノく・ノブを残す）を授粉バッグで覆った。該ツク・ングを同系交配番号、花粉ソースおよび交雑をなした日および交雑者名で標識した。第１〜４組になされた交雑の特徴を第ＸＬ■表（こ要約する。第ＸＬ■表第１〜４組になされた交雑組　−一−−−−３Ｌ−−−−−隻一−−−−−−−−一−−−１　ｉ）同系交配系の不稔植物Ｘ非ＡＭＳ／ベクター同種同系系ｉｉ）少数の授精可能植物の自己交雑２　ｉ）同系交配系の不稔植物Ｘ非ＡＭＳ／ベクター同種同系系ｉｉ）少数の授精可能植物の自己交雑３　ｉ）少数の自己交雑４１）同系交配系の不稔植物Ｘ非ＡＭＳ／ベクター同種同系系ｉＤ少数の授精可能植物の自己交雑６．１２．１．９．データ収集および統計的分析各処置列に関して、総植物数、総評価植物数、授精可能植物数、植物の高さ、穂たけおよび７５％開花までの日数を記録した。統計的分析は、第１組に関して完全に任意抽出されたブロックデザインに従って行なわれた。第２〜４組に関しては、相加平均および標準偏差を各処理に与えた。トウモロコシの次世代へのＡＭＳ／ベクター誘導雄性不稔の遺伝の評価を第１および第４組について検査する。６、１２．２−１．１．第１組種子は、未処置同種同系遺伝子型からの花粉で交雑された雄性不稔植物（ＡＭＳ／ベクターにより誘導）から導かれた。ＡＭＳ／ベクター誘導雄生殖の遺伝形質は、同系交配２および４において明らかであり、８０％以上の植物が不稔であった（第ＸＬ■表、第ＸＬＩＸ表）。同系交配置においては総植物の１７％のみが雄性不稔であった。第）（Ｌ　ＩＸ表各依存変数に関する区分別は変数同系交配に対する生殖不能　同系交配２　同系交配４　同系交配置パーセント　（９５，４＞　（８５，３）　（１６，８）植物の高さ　同系交配置　同系交配２　同系交配４（６９，４）　（６３，４）　（６１，９）穂たけ　同系交配２　同系交配置　同系交配４（２３，８）　（２１，５）　（２１，１）７５％開花　同系交配２　同系交配４　同系交配置までの日数　（７４，２）　（７３，９）　（６９，４）ａ　同一のボールラインでアンダーラインされた値は、ｐｏ、０５以下で著しく相違しなかった（第１組）６、１２．２．１．２．第４組雄性不稔の遺伝を第４組の同系交配置、２および４における４世代（Ｓ２　、Ｓ：ｌ　、Ｓ４およびＳ５　）について示す。９０％以上の各世代からの植物は、雄性不稔であった（第り表）。６、１２．２．１．３．第２組第２組において、不稔は同系交配置の少数の植物（１゜７％不稔）および同系交配３の少数の植物（３，４％不稔）において発現された（第ＬＩ表）。この組における種子は、Ａ　ＭＳ　／ベクターにおいて不稔にもともと転換できなかった自己授精から誘導された。６、１２．２．１．４．第３組ＡＭＳベクター処置同系交配遺伝子型と非同種同系未処置同系交配系との交雑から導かれたハイブリッドにおいて雄性不稔は、発現されなかった（第し■表）。６、　１２．２．　１．　５．未処置対照同系交配の非ＡＭＳベクター（未処置対照）植物において、雄性不稔は、観察されなかった（第Ｌｍ表）。６、　１２．　２．　２．花粉授精可能および不稔の雄の穂の形態の目視観察を各同系交配の代表的授精可能および不稔植物において行った（第１６〜１７図）。６、１２．２．２．１．第１組第１組において、同系交配２および４は、３つの異なる型の雄花の穂を形成した。第１の型において、朽は、小穂から発生せず、雄の穂は、これをゆすった際に花粉落下を示さなかった。このような雄花の穂は、不稔と評価された。第２の型において、１〜１０のみの朽が雄花の穂から発生し、裂開しそして花粉を落下した。これらを授精可能と評価した。第３の型において、雄花の穂における全ての駒が小穂に発生し、裂開し、そしてたくさんの花粉を落下した。これらもまた、授精可能と評価した。後者のカテゴリーに属す第１組において、各同系交配２および４の２つの雄花の穂のみがあった。同系交配置において、不稔であると評価された植物は、雄花の穂に目視可能な朽を有さす、花粉落下がなかった。授精可能であると評価された植物は、小穂に発生した朽を有し、朽からの豊富な花粉落下を示した。花粉落下は、同系交配置の数値物においておくれ、数例において評価の修正を必要とした。授精可能であると評価されたこの組における全ての同系交配に属する植物は、杓を有する雄花の穂を有し、花粉を裂開し豊富に落下した。不稔であると評価されたものは、全ての朽が小穂内に封じられ、花粉落下を示さなかった。６、１２．２．２．１．３．第３組第３組における全ての植物は、花粉を豊富に落下する裂開朽を有する雄花の穂を有した。６、１２．２．２．１．４．第４組不稔であることを評価された雄花の穂は、小穂に発生するあるいは花粉を落下する朽を有さなかった。授精可能であることを評価されたものは十分に裂開された朽を有し豊富な花粉を落下した。６、　１２．　２．　２．　１．　５．未処置対照全ての雄花の穂は、十分に朽を裂開し、豊富な花粉落下授粉可能または不稔であることを評価された雄花の穂の代表的例の朽をアセトカーミンで染色し調製物を朽および花粉の特徴の相違に関して検査した（第１８〜２２図）。６、１２．２．２．１．第１組朽が十分に裂開され花粉を十分に落とす雄花の穂は、典型的に巨大な、丸い、正常にみえるアセトカーミンで濃厚に染色される細胞形質を有する花粉を示した。１〜１０のみの朽が小穂から発生しかつ裂開する雄花の穂は、発生し裂開した朽においてのみ濃厚な細胞形質を有する正常にみえる円型の花粉粒子を示した。同一の穂において、小穂に残りかつ裂開しなかった朽は、はとんど染色不能な細胞形質を有する異常でかつ不規則な形状を示した。未裂開朽の少しは、中央でふくれ、このふくれは、正常にみえる花粉粒子で満たされ、一方、残りの朽は、異常な花粉を示した。同系交配置および２において、不稔であると評価された雄花の雄は、異常花粉を含む未裂開朽を示した。朽をガラス棒で破壊すると花粉粒子の朽からの放出を促進した。しかしながら、同系交配４においては、釣内に花粉粒子が見られなかった。したがって、全３つの同系交配において雄性不稔と関連するブロックは、胞子形成細胞の相違のレベルであるらしい。朽の裂開の欠如と異常花粉の存在または花粉の不存在との良好な相関関係もあった。６、１２．２．２．２．２．第２組顕微鏡観察は、授粉可能と評価された全ての雄花の穂が濃厚に染色された細胞形質を有する巨大で、円形の花粉粒子を示すことを表わした。不稔と評価された雄花の穂からの朽は、裂開せず、異常で、不規則的な形状の染色不能花粉を示した。６、１２．２．２．２．３．第３組第３組からの全ての雄花の穂は、授精可能を評価された。朽は、裂開し、花粉粒子は、丸く濃厚に染色された細胞形質を有した。６、１２．２．２．２．４．　’：ｊｚ　４組授精可能と評価された雄花の穂は、濃厚に染色された細胞形質を有する正常で、丸い花粉を示す朽を有していた。不稔であると評価されたものは、裂開朽を有さす異常な花粉を含んだ。６、　１２．　２．　２．　２．　５＝未処置対照全４同系交配の未処置対照植物からの花粉粒子は、アセトカーミンで濃赤色に染色した稠密な細胞形質を有する丸い花粉であった。６．１２．２．３．データの統計的分析６、１２．２．３．１．第１組不稔変数パーセントに関して同系交配の間に極めて著しい相違が注目された。相違はまた、植物の高さ、穂たけ、および７５％開花までの日数特性に関して同系交配間でも注目された。全ての４つの依存変位にわたる複製区画（ブロック）間の効果の緩和が強く観察され（Ｐ＝０．０００１〜０．１２４５）、最小効果は、生殖可能変数パーセントであった（第ＸＬＶＩＩＩ表）。前世代における植物に対して適用されたＡＭＳベクター処置（前記第６．９節のＢ１、Ｂ４、Ｂ５およびＢ６）の著しい効果は、４依存の変数のいずれに関してもこの世代において明らかでなかつた。ダンカン並列範囲テストもまた、同様な傾向を伝えた（第ＸＬＩＶ表）。不稔変数パーセントの平均は、全３の同系交配に関して著しく相違した。同系交配の１の植物の高さは、同系交配２および４と著しく相違した。依存変数開花までの日数に関して、同系交配２および同系交配４は、同系交配置と著しく相違した。６、１２．２．３．２．第２〜３組第２〜３組に関する全依存変数に関して相加平均および標準偏差を計算した。第２組において、同系交配置および３は、各々１．７％および３．４％雄生殖可能を示した。雄性不稔植物は、第３組においては同定されなかった。他の依存変数に関する注目すべき傾向は、明らかでなかった（第ＬＩ表および第ＬＩＩ表）。６、１２．２．３．３．第４組複製なしで、実際の値を、この組に関して一覧表に示した。（第り表）。７、種子の寄託次の種子は、アメリカン　タイプ　カルチャー　コレクション、ロックビレ、メリーランド州（Ａ　Ｔ　ＣＣ）　（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｌｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＨＤ）に寄託されており、以下に示す承認番号を与えられている。種子　説　明　承認番号ＡＭＳＬ、２９　アルファルファＡＭＳ／ベクターソース　４０３５２Ｌ、２（ＩＪ、Ｓ、Ｄ、Ａ−ＰＩ　Ｎｏ、２２３３８６から誘導）と保持体植物との交雑Ｂ７３−ＡＭＳ　ジーア　マイズ（Ｚｅａ　ｗａｙｓ）Ｌ、　４０３５０トウモロコシの雄性不稔８７３Ｈ１変種：　ＡＭＳ／ベクターによる処置により雄性不稔に無性生殖誘導Ｍｏ１７−ＡＭＳ　ジーア　マイズ（Ｚｅａ　ｗａｙｓ）Ｌ、　４０３５１トウモロコシの雄性不稔Ｍｏ１７Ｈｔ変種；　ＡＭＳ／ベクターによる処置により雄性不稔に無性生殖誘導Ａ６３２−Ａ１４Ｓ　ジーア　マイズ（Ｚｅａ　ｗａｙｓ）Ｌ、　４０３４９トウモロコシの雄性不稔Ａ６３２１１を変種：　ＡＭＳ／ベクターによる処置により雄性不稔に無性生殖誘導寄託された実施態様は、本発明の一つの態様を単に説明するつもりであり、官能的に等量のいずれの種子も本発明の範囲内であるので、本発明は、寄託された特別の種子によって範囲を限定されるものではない。事実、本明細書に示されかつ記載されたものに加えて本発明の種々の変更は、先の記載および添附図面から当業者に明らかであろう。このような変更は、添附の請求の範囲の範囲内に入る。ＦＪＧ、６ＯＣｅＦＩＧ、　２２ＣＦＩＧ、２２Ｄ国際調査報告ｐｃＴ１０５８８１０２５７３ＰＣＴ／ＵＳ８８１０２５７３

Claims

【特許請求の範囲】

１．宿主植物から誘導される（ａ）受領植物における遺伝性雄性不稔を誘導することができ、（ｂ）ひきつづき受領植物から無性生殖的に誘導可能であり、かつ（ｃ）宿主植物または受領植物の抽出物（抽出物は分子量約１×１０６ダルトンの核酸および約４０〜１１０ナノメートルの粒子からなる）に存在する細胞形質因子からなるＡＭＳ／ベクター。
２．宿主植物がアルファルファ植物である請求の範囲第１項に記載のＡＭＳ／ベクター。
３．アルファルファ植物がＵ．Ｓ．Ｄ．Ａ植物提出番号１７２４２９を有する請求の範囲第２項に記載のＡＭＳ／ベクター。
４．アルファルファ植物がＵ．Ｓ．Ｄ．Ａ植物提出番号１７３７３３を有する請求の範囲第２項に記載のＡＭＳ／ベクター。
５．アルファルファ植物がＵ．Ｓ．Ｄ．Ａ植物提出番号２２１４６９を有する請求の範囲第２項に記載のＡＭＳ／ベクター。
６．アルファルファ植物がＵ．Ｓ．Ｄ．Ａ植物提出番号２２３３８６を有する請求の範囲第２項に記載のＡＭＳ／ベクター。
７．アルファルファ植物がＵ．Ｓ．Ｄ．Ａ植物提出番号２４３２２４を有する請求の範囲第２項に記載のＡＭＳ／ベクター。
８．アルファルファ植物がＡＴＣＣに寄託され承認番号４０３５２を与えられた植物ＡＭＳ１．２９からなる請求の範囲第２項に記載のＡＭＳ／ベクター。
９．宿主植物がトウモロコシ植物である請求の範囲第１項に記載のＡＭＳ／ベクター。
１０．宿主植物が大豆植物である請求の範囲第１項に記載のＡＭＳ／ベクター。
１１．宿主植物がモロコシ植物である請求の範囲第１項に記載のＡＭＳ／ベクター。
１２．宿主植物がヒマワリ植物である請求の範囲第１項に記載のＡＭＳ／ベクター。
１３．宿主植物がアワ植物である請求の範囲第１項に記載のＡＭＳ／ベクター。
１４．宿主植物がトマト植物である請求の範囲第１項に記載のＡＭＳ／ベクター。
１５．非致命的緩衝液および宿主植物から誘導される（ａ）受領植物における遺伝性雄性不稔を誘導することができ、（ｂ）ひきつづき受領植物から無性生殖的に誘導可能であり、かつ（ｃ）宿主植物または受領植物の抽出物（抽出物は分子最約１×１０６ダルトンの核酸および約４０〜１１０ナノメートルの粒子からなる）に存在する細胞形質因子からなる植物における雄性不稔を誘導することのできる植物抽出物。
１６．宿主植物がアルファルファ植物である請求の範囲第１５項に記載の抽出物。
１７．宿主植物がトウモロコシ植物である請求の範囲第１項に記載の抽出物。
１８．宿主植物が大豆植物である請求の範囲第１項に記載の抽出物。
１９．宿主植物がモロコシ植物である請求の範囲第１項に記載の抽出物。
２０．宿主植物がヒマワリ植物である請求の範囲第１項に記載の抽出物。
２１．宿主植物がアワ植物である請求の範囲第１項に記載の抽出物。
２２．宿主植物がトマト植物である請求の範囲第１項に記載の抽出物。
２３．請求の範囲第１項に記載されたＡＭＳ／ベクターによって遺伝性雄性不稔に無性生殖的に誘導された植物からなる雄性不稔植物。
２４．請求の範囲第２項に記載されたＡＭＳ／ベクターによって遺伝性雄性不稔に無性生殖的に誘導された植物からなる雄性不稔植物。
２５．請求の範囲第３項、第４項、第５項、第６項、第７項または第８項に記載されたＡＭＳ／ベクターによって遺伝性雄性不稔に無性生殖的に誘導された植物からなる雄性不穏植物。
２６．アルファルファ植物である請求の範囲第２３項に記載の植物。
２７．トウモロコシ植物である請求の範囲第２３項に記載の植物。
２８．ＡＴＣＣに寄託され承認番号４０３２９を与えられたＢ７３−ＡＭＳからなる請求の範囲第２７項に記載のトウモロコシ植物。
２９．ＡＴＣＣに寄託され承認番号４０３５１を与えられたＭｏ１７−ＡＭＳからなる請求の範囲第２７項に記載のトウモロコシ植物。
３０．ＡＴＣＣに寄託され承認番号４０３４９を与えられたＡ６３２−ＡＭＳからなる請求の範囲第２７項に記載のトウモロコシ植物。
３１．大豆植物である請求の範囲第２３項に記載の植物。
３２．モロコシ植物である請求の範囲第２３項に記載の植物。
３３．ヒマワリ植物である請求の範囲第２３項に記載の植物。
３４．アワ植物である請求の範囲第２３項に記載の植物。
３５．トマト植物である請求の範囲第２３項に記載の植物。
３６．小麦植物である請求の範囲第２３項に記載の植物。
３７．綿植物である請求の範囲第２３項に記載の植物。
３８．米植物である請求の範囲第２３項に記載の植物。
３９．請求の範囲第２３項、第２４項、第２６項、第２７項、第２８項、第２９項、第３０項、第３１項、第３２項、第３３項、第３４項、第３５項、第３６項または第３７項に記載の植物の無性生殖増殖によって得られる子孫植物。
４０．増殖が細胞培養法によるものである請求の範囲第３９項に記載の子孫植物。
４１．増殖が植物生長である請求の範囲第３９項に記載の子孫植物。
４２．請求の範囲第２３項または第２４項に記載の植物と保持体植物との交雑により得られる種子。
４３．請求の範囲第２５に記載の植物と保持体植物との交雑により得られる種子。
４４．請求の範囲第２６項、第２７項、第２８項、第２９項、第３０項、第３１項、第３２項、第３３項、第３４項、第３５項、第３６項、第３７項または第３８項に記載の植物と保持体植物との交雑により得られる種子。
４５．請求の範囲第４２項に記載の種子より産生される子孫植物。
４６．請求の範囲第４３項に記載の種子より産生される子孫植物。
４７．請求の範囲第４４項に記載の種子より産生される子孫植物。
４８．請求の範囲第１項に記載のＡＭＳ／ベクターを受領植物に適用することからなる受領植物における雄性不稔を無性生殖誘導する方法。
４９．請求の範囲第２項に記載のＡＭＳ／ベクターを受領植物に適用することからなる受領植物における雄性不稔を無性生殖誘導する方法。
５０．請求の範囲第８項に記載のＡＭＳ／ベクターを受領植物に適用することからなる受領植物における雄性不稔を無性生殖誘導する方法。
５１．請求の範囲第１５項に記載のＡＭＳ／ベクターを受領植物に適用することからなる受領植物における雄性不稔を無性生殖誘導する方法。
５２．適用が接種によるものである請求の範囲第４８項、第４９項、第５０項または第５１項に記載の方法。
５３．適用が噴霧によるものである請求の範囲第４８項、第４９項、第５０項または第５１項に記載の方法。
５４．適用が組織培養の使用によるものである請求の範囲第４８項、第４９項、第５０項または第５１項に記載の方法。
５５．適用がエレクトロポーレーションによるものである請求の範囲第４８項、第４９項、第５０項または第５１項に記載の方法。
５６．受領植物がアルファルファ植物である請求の範囲第４８項、第４９項、第５０項または第５１項に記載の方法。
５７．受領植物がトウモロコシ植物である請求の範囲第４８項、第４９項、第５０項または第５１項に記載の方法。
５８．受領植物が大豆植物である請求の範囲第４８項、第４９項、第５０項または第５１項に記載の方法。
５９．受領植物がモロコシ植物である請求の範囲第４８項、第４９項、第５０項または第５１項に記載の方法。
６０．受領植物がヒマワリ植物である請求の範囲第４８項、第４９項、第５０項または第５１項に記載の方法。
６１．受領植物がアワ植物である請求の範囲第４８項、第４９項、第５０項または第５１項に記載の方法。
６２．受領植物がトマト植物である請求の範囲第４８項、第４９項、第５０項または第５１項に記載の方法。
６３．受領植物が小麦植物である請求の範囲第４８項、第４９項、第５０項または第５１項に記載の方法。
６４．受領植物が綿植物である請求の範囲第４８項、第４９項、第５０項または第５１項に記載の方法。
６５．受領植物が稲植物である請求の範囲第４８項、第４９項、第５０項または第５１項に記載の方法。
６６．父系植物を母系植物として請求の範囲第２３項または第２４項に記載の植物で交雑することによりＦ１ハイブリッドを作成する方法。
６７．父系植物を母系植物として請求の範囲第２５項に記載の植物で交雑することによりＦ１ハイブリッドを作成する方法。
６８．父系植物を母系植物として請求の範囲第４５項に記載の植物で交雑することによりＦ１ハイブリッドを作成する方法。
６９．父系植物を母系植物として請求の範囲第４６項に記載の植物で交雑することによりＦ１ハイブリッドを作成する方法。
７０．父系植物を母系植物として請求の範囲第４７項に記載の植物で交雑することによりＦ１ハイブリッドを作成する方法。
７１．請求の範囲第６６項に記載の方法に従って作成されたＦ１ハイブリッド。
７２．請求の範囲第６７項に記載の方法に従って作成されたＦ１ハイブリッド。
７３．請求の範囲第６８項に記載の方法に従って作成されたＦ１ハイブリッド。
７４．請求の範囲第６９項に記載の方法に従って作成されたＦ１ハイブリッド。
７５．請求の範囲第７０項に記載の方法に従って作成されたＦ１ハイブリッド。
７６．雄性不稔である請求の範囲第７１項に記載のＦ１ハイブリッド。
７７．雄性不稔である請求の範囲第７２項に記載のＦ１ハイブリッド。
７８．雄性不稔である請求の範囲第７３項に記載のＦ１ハイブリッド。
７９．雄性不稔である請求の範囲第７４項に記載のＦ１ハイブリッド。
８０．雄性不稔である請求の範囲第７５項に記載のＦ１ハイブリッド。
８１．雄授精可能である請求の範囲第７１項に記載のＦ１ハイブリッド。
８２．雄授精可能である請求の範囲第７２項に記載のＦ１ハイブリッド。
８３．雄授精可能である請求の範囲第７３項に記載のＦ１ハイブリッド。
８４．雄授精可能である請求の範囲第７４項に記載のＦ１ハイブリッド。
８５．雄授精可能である請求の範囲第７５項に記載のＦ１ハイブリッド。
８６．請求の範囲第７１項に記載のＦ１ハイブリッドの種子。
８７．請求の範囲第７２項に記載のＦ１ハイブリッドの種子。
８８．請求の範囲第７３項に記載のＦ１ハイブリッドの種子。
８９．請求の範囲第７４項に記載のＦ１ハイブリッドの種子。
９０．請求の範囲第７５項に記載のＦ１ハイブリッドの種子。
９１．請求の範囲第７６項に記載のＦ１ハイブリッドの種子。
９２．請求の範囲第７７項に記載のＦ１ハイブリッドの種子。
９３．請求の範囲第７８項に記載のＦ１ハイブリッドの種子。
９４．請求の範囲第７９項に記載のＦ１ハイブリッドの種子。
９５．請求の範囲第８０項に記載のＦ１ハイブリッドの種子。
９６．請求の範囲第８１項に記載のＦ１ハイブリッドの種子。
９７．請求の範囲第８２項に記載のＦ１ハイブリッドの種子。
９８．請求の範囲第８３項に記載のＦ１ハイブリッドの種子。
９９．請求の範囲第８４項に記載のＦ１ハイブリッドの種子。
１００．請求の範囲第８５項に記載のＦ１ハイブリッドの種子。
１０１．有効量の請求の範囲第１項に記載のＡＭＳ／ベクターを受領植物に適用することからなる受領植物における単為生殖を誘導する方法。
１０２．有効量の請求の範囲第２項に記載のＡＭＳ／ベクターを受領植物に適用することからなる受領植物における単為生殖を誘導する方法。
１０３．有効量の請求の範囲第８項に記載のＡＭＳ／ベクターを受領植物に適用することからなる受領植物における単為生殖を誘導する方法。
１０４．有効量の請求の範囲第１５項に記載のＡＭＳ／ベクターを受領植物に適用することからなる受領植物における単為生殖を誘導する方法。
１０５．適用が接種によるものである請求の範囲第１０１項、第１０２項、第１０３項または第１０４項に記載の方法。
１０６．適用が噴霧によるものである請求の範囲第１０１項、第１０２項、第１０３項または第１０４項に記載の方法。
１０７．適用が組織培養の使用によるものである請求の範囲第１０１項、第１０２項、第１０３項または第１０４項に記載の方法。
１０８．適用がエレクトロポーレーションによるものである請求の範囲第１０１項、第１０２項、第１０３項または第１０４項に記載の方法。
１０９．受領植物がアルファルファ植物である請求の範囲第１０１項、第１０２項、第１０３項または第１０４項に記載の方法。
１１０．受領植物がトウモロコシ植物である請求の範囲第１０１項、第１０２項、第１０３項または第１０４項に記載の方法。
１１１．受領植物がモロコシ植物である請求の範囲第１０１項、第１０２項、第１０３項または第１０４項に記載の方法。
１１２．受領植物がヒマワリ植物である請求の範囲第１０１項、第１０２項、第１０３項または第１０４項に記載の方法。
１１３．受領植物がアワ植物である請求の範囲第１０１項、第１０２項、第１０３項または第１０４項に記載の方法。
１１４．受領植物がトマト植物である請求の範囲第１０１項、第１０２項、第１０３項または第１０４項に記載の方法。
１１５．受領植物が小麦植物である請求の範囲第１０１項、第１０２項、第１０３項または第１０４項に記載の方法。
１１６．受領植物が綿植物である請求の範囲第１０１項、第１０２項、第１０３項または第１０４項に記載の方法。
１１７．受領植物が稲植物である請求の範囲第１０１項、第１０２項、第１０３項または第１０４項に記載の方法。
１１８．有効量の請求の範囲第１項に記載のＡＭＳベクターでハイブリッドの第１母体植物系を処置し、ついで該第１母体系を第２母体植物系で交雑してハイブリッド種子を得ることからなる単為生殖ハイブリッドの作成方法。
１１９．さらにハイブリッド種子を生長させて成熟植物を産生させ、ついで単為生殖性を示す植物を同定する段階を含む請求の範囲第１１８項に記載の方法。
１２０．さらに同定植物からハイブリッド種子を得る段階を含む請求の範囲第１１８項に記載の方法。
１２１．植物がアルファルファ植物である請求の範囲第１１８項、第１１９項または第１２０項に記載の方法。
１２２．植物がトウモロコシ植物である請求の範囲第１１８項、第１１９項または第１２０項に記載の方法。
１２３．植物が大豆植物である請求の範囲第１１８項、第１１９項または第１２０項に記載の方法。
１２４．植物がモロコシ植物である請求の範囲第１１８項、第１１９項または第１２０項に記載の方法。
１２５．植物がヒマワリ植物である請求の範囲第１１８項、第１１９項または第１２０項に記載の方法。
１２６．植物がアワ植物である請求の範囲第１１８項、第１１９項または第１２０項に記載の方法。
１２７．植物がトマト植物である請求の範囲第１１８項、第１１９項または第１２０項に記載の方法。
１２８．植物が小麦植物である請求の範囲第１１８項、第１１９項または第１２０項に記載の方法。
１２９．植物が綿植物である請求の範囲第１１８項、第１１９項または第１２０項に記載の方法。
１３０．植物が稲植物である請求の範囲第１１８項、第１１９項または第１２０項に記載の方法。
１３１．請求の範囲第１１８項に記載の方法によって産生されるハイブリッド種子。
１３２．請求の範囲第１２０項に記載の方法によって産生されるハイブリッド種子。
１３３．請求の範囲第１１９項に記載の方法によって産生されるハイブリッド種子およびその直接の子孫。
１３４．植物がトウモロコシ、アルファルファ、大豆、モロコシ、ヒマワリ、アワ、トマト、小麦、綿および米からなる群から選択される請求の範囲第１３１項に記載の種子。
１３５．植物がトウモロコシ、アルファルファ、大豆、モロコシ、ヒマワリ、アワ、トマト、小麦、綿および米からなる群から選択される請求の範囲第１３２項に記載の種子。
１３６．植物がトウモロコシ、アルファルファ、大豆、モロコシ、ヒマワリ、アワ、トマト、小麦、綿および米からなる群から選択される請求の範囲第１３３項に記載の植物。
１３７．請求の範囲第１項に記載のＡＭＳ／ベクターと結合する約４０〜１１０ナノメートルの生体活性分子を含有する粒子を適用することからなる生体活性分子を細胞内デリバリーする方法。
１３８．Ｕ．Ｓ．Ｄ．Ａ植物提出番号１７２４２９、１７３７３３、２２１４６９、２２３３８６および２４３２２３を有する植物からなる群から選択されるアルファルファ植物から誘導可能な約４０〜１１０ナトメートル粒子からなる植物デリバリーシステム。
１３９．請求の範囲第１項に記載の約１×１０６ダルトン核酸であって植物に発現され得る異質性遺伝子配列からなる核酸を適用することからなる植物における異質遺伝子配列を発現させる方法。
１４０．植物提出番号１７２４２９、１７３７３３、２２１４６９、２２３３８６および２４３２２３からなる群から選択されるアルファルファ植物から誘導可能な約１×１０６ダルトン分子量の核酸からなる植物発現ベクター。
１４１．請求の範囲第１０８項に記載の発現ベクターの突然変異体、誘導体またはフラグメント。