CN108575740A

CN108575740A - 一种杨树体胚发生与植株建成的方法

Info

Publication number: CN108575740A
Application number: CN201810162059.9A
Authority: CN
Inventors: 林金星; 崔亚宁; 王鑫伟; 付春祥; 曹英萍; 吴振映
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2018-02-26
Filing date: 2018-02-26
Publication date: 2018-09-28
Anticipated expiration: 2038-02-26
Also published as: CN108575740B

Abstract

本发明公开了一种杨树高效体胚发生与植株建成的方法。本发明提供了杨树的组织培养方法，包括：1)将取自于杨树的外植体接种于诱导培养基(含1.0‑2.0mg/L 2,4‑D和0.1mg/L KT)上进行培养，获得愈伤组织；2)将所述愈伤组织接种于分化培养基上进行培养，得到不定芽；3)将所述不定芽接种于生根培养基上进行培养，得到生根的幼苗。本发明所提供的杨树的组织培养方法具有以下优点：培养周期短、重复性高；设置不同的激素组合，提高杨树体胚的发生；可获得大量的再生植株。本发明为深入研究植物细胞分化、发育等提供了理想的实验体系，为杨树的细胞工程、基因工程以及杨树遗传改良等相关研究提供重要平台。

Description

一种杨树体胚发生与植株建成的方法

技术领域

本发明属于植物组织培养领域，涉及一种杨树体胚发生与植株建成的方法。

背景技术

杨树是世界上广泛被栽培的重要树种之一，由于其具有生长快、产量高、实用性强等特点，被很好的用于城市绿化、木材生产和生态建设中。传统的杨树育苗主要通过扦插、嫁接、根繁等方法，而这些方法通常存在繁殖速度慢、受外界环境影响大、成活率低、劳动强度大等缺点。

近年来，随着植物生理学和分子生物学等学科的飞速发展，杨树组织培养技术日趋成熟。杨树作为林木遗传育种中的模式植物，对研究林木的胜利及遗传特性具有特殊的意义。杨树再生体系的建立，可应用于其他种质资源的保存、繁殖及遗传改良的研究，以弥补以往人们采用传统模式改良杨树种质的不足。

杨树全基因组测序的完成，是林木生物学研究的一个开端，势必将促进林木功能基因组学快速发展。杨树体细胞胚胎的建立，将更有利于杨树的生物学功能的研究，对杨树抗性改良以及抗逆新品种选育具有一定的理论和实践意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种杨树的组织培养的方法。

本发明所提供的杨树的组织培养方法，包括如下步骤：

(a1)将取自于杨树的外植体接种于诱导培养基上进行培养，获得愈伤组织。

(a2)将所述愈伤组织接种于分化培养基上进行培养，获得不定芽。

(a3)将所述不定芽接种于生根培养基上进行培养，得到生根的幼苗。

步骤(a1)中，所述诱导培养基中含有浓度为1.0-2.0mg/L的2,4-D和浓度为0.1mg/L的KT。

进一步地，所述诱导培养基中含有浓度为1.0mg/L的2,4-D和浓度为0.1mg/L的KT。

步骤(a2)中，所述分化培养基中含有浓度为0.05-0.1mg/L的NAA和浓度为0.5-1.0mg/L的6-BA。

进一步地，所述分化培养基中含有浓度为0.05mg/L的NAA和浓度为0.5mg/L的6-BA。

更加具体的，所述诱导培养基是在WPM培养基中加入MES、蔗糖、凝固剂、2,4-D和KT后得到的培养基；所述诱导培养基中MES的终浓度为0.5g/L、蔗糖的终浓度为20g/L、2,4-D的终浓度为1.0-2.0mg/L(如1.0mg/L)、KT的终浓度为0.1mg/L。其中，所述凝固剂可为琼脂或植物凝胶。琼脂在所述诱导培养基中的终浓度可为7.8g/L。植物凝胶在所述诱导培养基中的终浓度可为4.5g/L。

更加具体的，所述分化培养基是在WPM培养基中加入MES、蔗糖、凝固剂、NAA和6-BA后得到的培养基；所述分化培养基中MES的终浓度为0.5g/L、蔗糖的终浓度为20g/L、NAA的终浓度为0.05-0.1mg/L(如0.05mg/L)、6-BA的终浓度为0.5-1.0mg/L(如0.5mg/L)。其中，所述凝固剂可为琼脂或植物凝胶。琼脂在所述分化培养基中的终浓度可为7.8g/L。植物凝胶在所述分化培养基中的终浓度可为4.5g/L。

更加具体的，所述生根培养基是在WPM培养基中加入MES、蔗糖和凝固剂后得到的培养基；所述生根培养基中MES的终浓度为0.5g/L、蔗糖的终浓度为20g/L。其中，所述凝固剂可为琼脂或植物凝胶。琼脂在所述生根培养基中的终浓度可为7.8g/L。植物凝胶在所述生根培养基中的终浓度可为4.5g/L。

在本发明中，所述外植体具体为叶片。

进一步地，所取的所述外植体应该是生长状态良好，新鲜幼嫩的叶片，以便有更好的分裂能力。

在步骤(a1)中，将所述外植体接种于所述诱导培养基上进行培养时的培养条件可为：24-25℃(如25℃)、黑暗培养，该条件有利于外植体活性恢复，培养时间约1个月。

步骤(a2)中，将所述愈伤组织接种于所述分化培养基上进行培养时的培养条件可为：24-25℃(如25℃)、每天光照时间为14-16h(如16h)，培养时间约1个月。

步骤(a3)中，将所述不定芽接种于所述生根培养基上进行培养时的培养条件可为：24-25℃(如25℃)、每天光照时间为14-16h(如16h)，培养时间约1个月。

步骤(a3)中，接种于所述生根培养基上的所述不定芽长度应大于1cm。

在步骤(a1)中，将所述外植体接种于所述诱导培养基上之前还可包括按照如下方法对所述外植体进行消毒的步骤：将所述外植体置于75％乙醇(乙醇的体积百分含量为75％，余量为水)中消毒30s。

更加具体的，所述消毒的具体操作为：用自来水初步冲洗约10min，随后用75％乙醇进行消毒，消毒时间约为30s，然后用无菌水冲洗4-5遍，最后用无菌滤纸吸干表面水分。

本发明还包括一种获得杨树再生植株的方法。

本发明所提供的获得杨树再生植株的方法，包括前文任一所述方法中的步骤(a1)-(a3)以及如下步骤(a4)：

(a4)将所述生根的幼苗移栽到温室中；所采用的移栽基质是营养土和蛭石的混合基质，其中营养土和蛭石体积比为2:1。

移栽后，将杨树苗用竹签或者枪头固定住，为了保持湿度使用保鲜膜将其包裹，包裹时间约为半个月左右。半个月后在保鲜膜上进行打洞使其透气，5-7d后可去除保鲜膜，使其自然生长。

另外，本发明还要求保护如下培养基或成套培养基。

所述培养基为前文任一所述的诱导培养基；

所述成套培养基由前文任一所述的诱导培养基、前文任一所述的分化培养基和前文任一所述的生根培养基组成。

所述培养基或所述成套培养基在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：

(b1)杨树组织培养；

(b2)获得杨树再生植株；

(b3)制备杨树体细胞胚胎；

(b4)杨树的遗传转化。

本发明所提供的“杨树的组织培养方法”和“获得杨树再生植株的方法”在杨树的遗传转化中的应用也属于本发明的保护范围。

在本发明的一个实施例中，所述杨树为84K杨、毛白杨或南林895杨。

在本发明中，所述WPM培养基的溶剂为水；溶质及浓度如下：

(1)大量元素：

K₂SO₄ 990mg/L；MgSO₄·7H₂O 370mg/L；KH₂PO₄ 170mg/L；NH₄NO₃ 400mg/L；

(2)微量元素：

MnSO₄·H₂O 22.3mg/L；ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L；H₃BO₃ 6.2mg/L；CuSO₄·5H₂O0.25mg/L；Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L；

(3)钙盐：

Ca(NO₃)₂·4H₂O 556mg/L；CaCl₂·2H₂O 96mg/L；葡萄糖酸钙65mg/L；

(4)铁盐：

FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L；Na₂EDTA 37.3mg/L；

(5)有机：

肌醇100mg/L；甘氨酸2.0mg/L；VB1 1.0mg/L；VB6 0.5mg/L；VB3 0.5mg/L。

本发明所提供的杨树的组织培养方法具有以下优点：1)培养周期短、重复性高；2)设置不同的激素组合，提高杨树体胚的发生；3)可获得大量的再生植株。本发明为深入研究植物细胞分化、发育等提供了理想的实验体系，为杨树的细胞工程、基因工程以及杨树遗传改良等相关研究提供重要平台。

附图说明

图1为以杨树叶片为外植体获得再生植株的过程，其中，A为实生苗；B为叶片；C为诱导培养；D为愈伤组织；E为分化培养；F为生根培养；G和H为植株建成。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用到的WPM培养基的具体配方如表1所示。

表1 WPM培养基

注：*此处的含量为最终WPM培养基中的含量

下面以84K杨树为例，进一步说明本发明所提供的杨树再生体系的建立方法。

实施例1、84K杨树再生体系的建立

1、供试材料为试验田的84K杨树，取材时选取生长旺盛，幼嫩的叶片，将其放到预冻好的冰盒中，用湿润的纱布包裹防止失水。

2、取回的实验材料首先用自来水冲洗表明的污物，随后进行消毒，整个实验中用了四种不同的消毒液对材料进行消毒，实验结果见表2。实验结果展示，乙醇的消毒效果较好，并且材料上残留的乙醇易挥发，容易去除，对植物没有危害；次氯酸钠消毒效果好，但是具有一定的腐蚀性；氯化汞消毒效果最好，但是实验材料上的氯化汞较难去除，并且氯化汞有剧毒；过氧化氢的效果也较好，但是也有一定的危害。因此，综上所述，乙醇的消毒效果最佳。

表2不同消毒液对杨树叶片的影响

试剂	浓度	时间	效果	消毒液去除难易	危害
						乙醇	75％	30s	较好	易	无
次氯酸钠	5％	5min	好	较易	腐蚀性
						氯化汞	0.2％	5min	最好	难	剧毒
过氧化氢	10％	12min	较好	最易	低毒

注：表中“浓度”一栏中的％表示体积百分含量，余量为水。

3、将消毒后的叶片转接到不同诱导培养基上以诱导产生愈伤组织，25℃、黑暗培养(该条件有利于外植体活性恢复)，培养时间约1个月。诱导培养基是在WPM培养基中加入MES、蔗糖、植物凝胶和不同浓度激素后得到的培养基；所述诱导培养基中MES的终浓度为0.5g/L、蔗糖的终浓度为20g/L、植物凝胶的终浓度为4.5g/L，所含激素的种类及浓度见表3。

从表3可以看出，各种培养基上诱导愈伤组织的能力差别比较大，当6-BA浓度为0.5mg/L或者1mg/L时，附加2,4-D在培养基中，均可以诱导愈伤组织的发生，但是结果不理想，生长状况也较差；当2,4-D浓度为1mg/L或者2mg/L时，附加KT在培养基中，均可以高效诱导愈伤组织的发生，但相比较而言，2,4-D浓度为1mg/L，KT浓度为0.1mg/L的效果最佳；当IAA浓度为1mg/L或者2mg/L时，附加6-BA在培养基中，诱导愈伤组织的效率均不高。因此，综合分析，84K杨最适合的诱导培养基为：WPM培养基+1mg/L 2,4-D+0.1mg/L KT+0.5g/L MES+20g/L蔗糖+4.5g/L植物凝胶。

表3不同浓度激素对杨树叶片诱导愈伤的影响

4、将诱导的愈伤组织转移到分化培养基上以分化产生不定芽，25℃、每天光照时间为16h，黑暗时间为8h，培养时间约1个月。分化培养基是在WPM培养基中加入MES、蔗糖、植物凝胶和不同浓度激素后得到的培养基；所述分化培养基中MES的终浓度为0.5g/L、蔗糖的终浓度为20g/L、植物凝胶的终浓度为4.5g/L，所含激素的种类及浓度见表4。

从表4可以看出，在只附加TDZ的培养基上，愈伤组织虽然也可以分化，但是分化效率低，植株生长状态差；当NAA浓度为0.05mg/L或者0.1mg/L时，附加6-BA在培养基中，均可以提高愈伤组织的分化能力，并且植物生长状态较好，但相比较而言NAA浓度为0.05mg/L，6-BA浓度为0.05mg/L时效果最佳；当ZT浓度为2mg/L时，附加NAA在培养基中，虽然也均可以诱导愈伤组织的分化能力，但植物的生长状态较差。因此，综合分析，84K杨最适合的分化培养基为：WPM培养基+0.05mg/LNAA+0.5mg/L 6-BA+0.5g/L MES+20g/L蔗糖+4.5g/L植物凝胶。

表4不同浓度激素对杨树叶片诱导分化的影响

5、将在愈伤组织基部长出的长度约1cm的不定芽切下，转移到生根培养基上进行生根培养。生根培养基为：WPM培养基+0.5g/L MES+20g/L蔗糖+4.5g/L植物凝胶。培养条件为：培养条件为24-25℃、光照时间14-16h/d，培养时间约为1个月。

6、将已生根的小苗移栽于移栽基质中，移栽基质是营养土和蛭石的混合基质，两者的体积比为2:1。首先，用竹签或者蓝色枪头将杨树小苗固定住，然后用保鲜膜将小苗包裹使其保持湿度，大约包裹半个月后，在保鲜膜上进行打洞使其透气，5-7d后将保鲜膜去除。获得的杨树小苗，在温室中生长良好，成为与一株与自然生长相一致的再生植株。

Claims

1.一种杨树的组织培养方法，包括如下步骤：

(a1)将取自于杨树的外植体接种于诱导培养基上进行培养，获得愈伤组织；所述诱导培养基中含有浓度为1.0-2.0mg/L的2,4-D和浓度为0.1mg/L的KT；

(a2)将所述愈伤组织接种于分化培养基上进行培养，得到不定芽；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述分化培养基中含有浓度为0.05-0.1mg/L的NAA和浓度为0.5-1.0mg/L的6-BA。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述诱导培养基是在WPM培养基中加入MES、蔗糖、凝固剂、2,4-D和KT后得到的培养基；所述诱导培养基中MES的终浓度为0.5g/L、蔗糖的终浓度为20g/L、2,4-D的终浓度为1.0-2.0mg/L、KT的终浓度为0.1mg/L；

和/或

所述分化培养基是在WPM培养基中加入MES、蔗糖、凝固剂、NAA和6-BA后得到的培养基；所述分化培养基中MES的终浓度为0.5g/L、蔗糖的终浓度为20g/L、NAA的终浓度为0.05-0.1mg/L、6-BA的终浓度为0.5-1.0mg/L；

和/或

所述生根培养基是在WPM培养基中加入MES、蔗糖和凝固剂后得到的培养基；所述生根培养基中MES的终浓度为0.5g/L、蔗糖的终浓度为20g/L。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述外植体为叶片。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：步骤(a1)中，将所述外植体接种于所述诱导培养基上进行培养时的培养条件为：24-25℃、黑暗培养；

和/或

步骤(a2)中，将所述愈伤组织接种于所述分化培养基上进行培养时的培养条件为：24-25℃、每天光照时间为14-16h；

和/或

步骤(a3)中，将所述不定芽接种于所述生根培养基上进行培养时的培养条件为：24-25℃、每天光照时间为14-16h。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：步骤(a1)中，将所述外植体接种于所述诱导培养基上之前还包括按照如下方法对所述外植体进行消毒的步骤：将所述外植体置于75％乙醇中消毒30s。

7.一种获得杨树再生植株的方法，包括权利要求1-6中任一所述方法中的步骤(a1)-(a3)以及如下步骤(a4)：

8.培养基或成套培养基，其特征在于：

所述培养基为权利要求1-3任一中所述的诱导培养基；

所述成套培养基由权利要求1-3任一中所述的诱导培养基、权利要求1-3任一中所述的分化培养基和权利要求1-3任一中所述的生根培养基组成。

9.权利要求8所述的培养基或成套培养基在如下任一中的应用：

(b1)杨树组织培养；

(b2)获得杨树再生植株；

(b3)制备杨树体细胞胚胎；

(b4)杨树的遗传转化。

10.权利要求1-7中任一所述方法在杨树的遗传转化中的应用。