CN115428734A - 一种诱导杨树叶片愈伤组织大量增殖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于组织培养领域，提供了一种诱导杨树叶片愈伤组织大量增殖的方法，包括以下步骤：材料获取；外植体准备；预处理：在无菌条件下，将得到的外植体置于无菌的细胞壁酶解液中预处理1小时，之后用滤纸吸干外植体上残留的酶解液；诱导愈伤组织：将叶片背面朝上，平铺在愈伤组织诱导培养基上，在温度为22℃的温室进行暗培养，12天后可形成肉眼可见的愈伤组织，16天后在外植体伤口和叶脉处产生大量淡黄色愈伤组织。本发明通过在培养前用细胞壁酶解液处理外植体，可以在短时间内获得大量杨树愈伤组织。
Description
技术领域
本发明属于组织培养领域，尤其涉及一种诱导杨树叶片愈伤组织大量增殖的方法。
背景技术
杨树是我国重要的造林树种，因其适应性强、材质好、生长快等特点而成为我国最为主要的速生丰产工业用材树种，在生态环境治理和解决木材短缺等方面占有重要位置。
杨树是杨属植物的通称，分为胡杨派、白杨派、黑杨派、青杨派和大叶杨派五派。84K杨是银白杨×腺毛杨(Populus alba×Populus glandulosa)的杂种无性系，具有生根容易、生长快、材质好、抗风能力及抗性强、适应性广等优点，在改善生态环境和城市绿化上，发挥着重要的作用。
此外，杨树作为林木基因工程的模式物种，已广泛应用于林木分子育种和分子生物学研究，因此愈伤组织的培养和其再生体系的建立对于林木基因编辑工程及培育优良品质树种具有重要价值。
植物组织培养是运用细胞重编程原理，对植物细胞、组织等进行离体培养的技术。植物器官的再生过程通常需要先产生由多能性细胞组成的愈伤组织，然后愈伤组织在高浓度细胞分裂素或高浓度生长素的培养下长出不定芽或不定根，因此愈伤组织具有器官再生潜能。此外，愈伤组织还可以作为培养悬浮细胞和原生质体的材料。组织培养是树木快速扩繁的基本手段之一，也是基因功能研究和遗传改良工程的重要基础。
对愈伤组织诱导条件改良的传统做法是通过改变外植体类型、植物激素种类和比例以及环境条件等，以实现愈伤组织形成效率的提升，但是愈伤组织多在外植体伤口附近产生，效率较低。
因此，针对以上现状，迫切需要开发一种诱导杨树叶片愈伤组织大量增殖的方法，通过细胞壁酶解液预先处理杨树叶片外植体，促进了愈伤组织的大量增殖，使愈伤组织不仅在叶片伤口附近产生，而且在远离伤口附近的叶脉上也产生了大量愈伤组织，解决了愈伤组织形成效率低的问题，为树木的再生和基因编辑奠定了基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种诱导杨树叶片愈伤组织大量增殖的方法，旨在解决杨树愈伤组织诱导率低的问题。
本发明是这样实现的，一种诱导杨树叶片愈伤组织大量增殖的方法，包括以下步骤：
步骤一、材料获取：
选择培养1个月且生长状态良好的84K杨无菌组培苗为材料，使用组培剪刀剪取顶芽和茎段，长度为1～1.5cm，然后置于1/2MS生根培养基中，在温度为22℃，光周期为16小时光照和8小时黑暗的温室进行培养1个月，获得用于组织培养实验的扩繁苗；
步骤二、外植体准备：
将步骤一得到的扩繁苗，在无菌超净台中，剪取生长状态良好的叶片，并使用手术刀在叶片背面垂直主叶脉的方向上将叶片切成两段；
步骤三、预处理：
在无菌条件下，将步骤二得到的外植体置于无菌的细胞壁酶解液中预处理1小时，之后用滤纸吸干外植体上残留的酶解液；
步骤四、诱导愈伤组织：
将叶片背面朝上，平铺在愈伤组织诱导培养基上，在温度为22℃的温室进行暗培养，12天后可形成肉眼可见的愈伤组织，16天后在外植体伤口和叶脉处产生大量淡黄色愈伤组织。
进一步的技术方案，在步骤一中，1/2MS生根培养基，包括以下配比的原料：MS粉2.215g/L，蔗糖30g/L，琼脂粉7.8g/L。
进一步的技术方案，在步骤二中，剪取生长状态良好的叶片时，取从上到下第3～4叶序位置的叶片；使用手术刀在叶片背面垂直主叶脉的方向上将叶片切成两段后，还切去叶尖增加伤口。
进一步的技术方案，在步骤三中，细胞壁酶解液，包括以下配比的原料：MES·H2O4.26g/L，D-甘露醇72.86g/L，KCl 1.5g/L，CaCl2·2H2O 1.5g/L，牛血清蛋白Ⅴ1g/L，果胶酶10g/L，纤维素酶10g/L。
进一步的技术方案，所述细胞壁酶解液还需要用KOH(氢氧化钾)调节pH至5.7，并用0.22μm微孔滤膜过滤。
进一步的技术方案，在步骤四中，愈伤组织诱导培养基，包括以下配比的原料：MS粉4.43g/L，肌醇0.1g/L，蔗糖20g/L，MES·H2O 0.5g/L，D-葡萄糖酸钙·H2O 0.65g/L，琼脂粉7.8g/L，2，4-D1mg/L，Kinetin 0.1mg/L。
进一步的技术方案，所述1/2MS生根培养基和愈伤组织诱导培养基还需要用NaOH(氢氧化钠)调节pH至5.8，并在121℃下高温高压灭菌20min。
本发明提供的一种诱导杨树叶片愈伤组织大量增殖的方法，操作简便，通过细胞壁酶解液预先处理杨树叶片外植体，促进了愈伤组织的大量增殖，即采用细胞壁酶解预处理的方式刺激愈伤组织形成，使愈伤组织不仅在叶片伤口附近产生，而且在远离伤口附近的叶脉上也产生了大量愈伤组织，解决了愈伤组织形成效率低的问题，为树木的再生和基因编辑奠定了基础。
附图说明
图1为外植体在CIM培养前状况，上方对照组和下方处理组(采用细胞壁酶解液处理1小时)示意图。
图2为外植体在CIM培养16天后状况，上方对照组和下方处理组(采用细胞壁酶解液处理1小时)示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
实施例1
如图1-2所示，为本发明一个实施例提供的一种诱导杨树叶片愈伤组织大量增殖的方法，包括以下步骤：
步骤一、材料获取：
选择培养1个月左右且生长状态良好的84K杨无菌组培苗为材料，使用组培剪刀剪取顶芽和茎段，长度为1cm，然后置于1/2MS生根培养基中，在温度为22℃，光周期为16小时光照和8小时黑暗的温室进行培养；经过1周左右的时间，肉眼可以观察到外植体长出了根，继续温室培养1个月，便可以获得用于组织培养实验的扩繁苗(即对84K杨无菌组培苗进行扩繁)；
步骤二、外植体准备：
将步骤一得到的扩繁苗，在无菌超净台中，剪取生长状态良好的叶片，一般取从上到下第3叶序位置的叶片，并使用手术刀在叶片背面垂直主叶脉的方向上将叶片切成两段；
步骤三、预处理：
在无菌条件下，将切好的外植体置于无菌的细胞壁酶解液中预处理1小时，之后用滤纸吸干外植体上残留的酶解液；
步骤四、诱导愈伤组织：
将叶片背面朝上，平铺在愈伤组织诱导培养基(CIM)上，在温度为22℃的温室进行暗培养，12天后可形成肉眼可见的愈伤组织，16天后在外植体伤口和叶脉处产生大量淡黄色愈伤组织。
作为本发明的一种优选实施例，在步骤一中，1/2MS生根培养基，包括以下配比的原料：MS粉(Duchefa Biochemie)2.215g/L，蔗糖(国药)30g/L，琼脂粉(BAIGEN)7.8g/L。
在步骤二中，使用手术刀在叶片背面垂直主叶脉的方向上将叶片切成两段，同时切去叶尖以增加伤口。
在步骤三中，细胞壁酶解液，包括以下配比的原料：MES·H2O(Solarbio#M8010)4.26g/L，D-甘露醇(Solarbio#M8140)72.86g/L，KCl(国药)1.5g/L，CaCl2·2H2O(国药)1.5g/L，牛血清蛋白Ⅴ(Solarbio#A8020)1g/L，果胶酶(Solarbio#P8181)10g/L，纤维素酶(Solarbio#C8270)10g/L。所述细胞壁酶解液还需要用KOH调节pH至5.7，并用0.22μm微孔滤膜过滤。
在步骤四中，愈伤组织诱导培养基，包括以下配比的原料：MS粉(DuchefaBiochemie)4.43g/L，肌醇(国药)0.1g/L，蔗糖(国药)20g/L，MES·H2O(Solarbio#M8010)0.5g/L，D-葡萄糖酸钙·H2O(国药)0.65g/L，琼脂粉(BAIGEN)7.8g/L，2，4-D(PhytoTech)1mg/L，Kinetin(PhytoTech)0.1mg/L。
另外，所述1/2MS生根培养基和愈伤组织诱导培养基还需要用NaOH调节pH至5.8，并在121℃下高温高压灭菌20min。
实施例2
如图1-2所示，为本发明一个实施例提供的一种诱导杨树叶片愈伤组织大量增殖的方法，包括以下步骤：
步骤一、材料获取：
选择培养1个月左右且生长状态良好的84K杨无菌组培苗为材料，使用组培剪刀剪取顶芽和茎段，长度为1.5cm，然后置于1/2MS生根培养基中，在温度为22℃，光周期为16小时光照和8小时黑暗的温室进行培养；经过1周左右的时间，肉眼可以观察到外植体长出了根，继续温室培养1个月，便可以获得用于组织培养实验的扩繁苗；
步骤二、外植体准备：
将步骤一得到的扩繁苗，在无菌超净台中，剪取生长状态良好的叶片，一般取从上到下第4叶序位置的叶片，并使用手术刀在叶片背面垂直主叶脉的方向上将叶片切成两段；
步骤三、预处理：
在无菌条件下，将切好的外植体置于无菌的细胞壁酶解液中预处理1小时，之后用滤纸吸干外植体上残留的酶解液；
步骤四、诱导愈伤组织：
将叶片背面朝上，平铺在愈伤组织诱导培养基(CIM)上，在温度为22℃的温室进行暗培养，12天后可形成肉眼可见的愈伤组织，16天后在外植体伤口和叶脉处产生大量淡黄色愈伤组织。
作为本发明的一种优选实施例，在步骤一中，1/2MS生根培养基，包括以下配比的原料：MS粉(Duchefa Biochemie)2.215g/L，蔗糖(国药)30g/L，琼脂粉(BAIGEN)7.8g/L。
在步骤二中，使用手术刀在叶片背面垂直主叶脉的方向上将叶片切成两段，同时切去叶尖以增加伤口。
在步骤三中，细胞壁酶解液，包括以下配比的原料：MES·H2O(Solarbio#M8010)4.26g/L，D-甘露醇(Solarbio#M8140)72.86g/L，KCl(国药)1.5g/L，CaCl2·2H2O(国药)1.5g/L，牛血清蛋白Ⅴ(Solarbio#A8020)1g/L，果胶酶(Solarbio#P8181)10g/L，纤维素酶(Solarbio#C8270)10g/L。所述细胞壁酶解液还需要用KOH调节pH至5.7，并用0.22μm微孔滤膜过滤。
在步骤四中，愈伤组织诱导培养基，包括以下配比的原料：MS粉(DuchefaBiochemie)4.43g/L，肌醇(国药)0.1g/L，蔗糖(国药)20g/L，MES·H2O(Solarbio#M8010)0.5g/L，D-葡萄糖酸钙·H2O(国药)0.65g/L，琼脂粉(BAIGEN)7.8g/L，2，4-D(PhytoTech)1mg/L，Kinetin(PhytoTech)0.1mg/L。
另外，所述1/2MS生根培养基和愈伤组织诱导培养基还需要用NaOH调节pH至5.8，并在121℃下高温高压灭菌20min。
实施例3
如图1-2所示，为本发明一个实施例提供的一种诱导杨树叶片愈伤组织大量增殖的方法，包括以下步骤：
步骤一、材料获取：
选择培养1个月左右且生长状态良好的84K杨无菌组培苗为材料，使用组培剪刀剪取顶芽和茎段，长度为1.3cm，然后置于1/2MS生根培养基中，在温度为22℃，光周期为16小时光照和8小时黑暗的温室进行培养；经过1周左右的时间，肉眼可以观察到外植体长出了根，继续温室培养1个月，便可以获得用于组织培养实验的扩繁苗；
步骤二、外植体准备：
将步骤一得到的扩繁苗，在无菌超净台中，剪取生长状态良好的叶片，一般取从上到下第3叶序位置的叶片，并使用手术刀在叶片背面垂直主叶脉的方向上将叶片切成两段；
步骤三、预处理：
在无菌条件下，将切好的外植体置于无菌的细胞壁酶解液中预处理1小时，之后用滤纸吸干外植体上残留的酶解液；
步骤四、诱导愈伤组织：
将叶片背面朝上，平铺在愈伤组织诱导培养基(CIM)上，在温度为22℃的温室进行暗培养，12天后可形成愈伤组织，16天后在外植体伤口和叶脉处产生大量淡黄色愈伤组织。
作为本发明的一种优选实施例，在步骤一中，1/2MS生根培养基，包括以下配比的原料：MS粉(Duchefa Biochemie)2.215g/L，蔗糖(国药)30g/L，琼脂粉(BAIGEN)7.8g/L。
在步骤二中，使用手术刀在叶片背面垂直主叶脉的方向上将叶片切成两段，同时切去叶尖以增加伤口。
在步骤三中，细胞壁酶解液，包括以下配比的原料：MES·H2O(Solarbio#M8010)4.26g/L，D-甘露醇(Solarbio#M8140)72.86g/L，KCl(国药)1.5g/L，CaCl2·2H2O(国药)1.5g/L，牛血清蛋白Ⅴ(Solarbio#A8020)1g/L，果胶酶(Solarbio#P8181)10g/L，纤维素酶(Solarbio#C8270)10g/L。所述细胞壁酶解液还需要用KOH调节pH至5.7，并用0.22μm微孔滤膜过滤。
在步骤四中，愈伤组织诱导培养基，包括以下配比的原料：MS粉(DuchefaBiochemie)4.43g/L，肌醇(国药)0.1g/L，蔗糖(国药)20g/L，MES·H2O(Solarbio#M8010)0.5g/L，D-葡萄糖酸钙·H2O(国药)0.65g/L，琼脂粉(BAIGEN)7.8g/L，2，4-D(PhytoTech)1mg/L，Kinetin(PhytoTech)0.1mg/L。
另外，所述1/2MS生根培养基和愈伤组织诱导培养基还需要用NaOH调节pH至5.8，并在121℃下高温高压灭菌20min。
实验案例
在验证实验时，具体工作流程如下：
一、材料获取：选择培养1个月左右且生长状态良好的84K杨无菌组培苗为材料，使用组培剪刀剪取顶芽和茎段，长度大约为1～1.5cm，然后置于1/2MS生根培养基中，在温度为22℃，光周期为16小时光照和8小时黑暗的温室进行培养。经过1周左右的时间，肉眼可以观察到外植体长出了根，继续温室培养一个月，便可以获得用于组织培养实验的扩繁苗；
二、外植体准备：将上述一得到的扩繁苗，在无菌超净台中，剪取生长状态良好的叶片，一般取从上到下第3～4叶序位置的叶片，并使用手术刀在叶片背面垂直主叶脉的方向上将叶片切成两段；
三、预处理：在无菌条件下，将切好的外植体置于无菌的细胞壁酶解液中预处理1小时，之后用滤纸吸干外植体上残留的酶解液；同时另一部分外植体置于不添加酶的缓冲液中作为对照，处理1小时后，用滤纸吸干外植体表面缓冲液；
四、诱导愈伤组织：将对照和处理过的叶片背面朝上，平铺在愈伤组织诱导培养基(CIM)上，在温度为22℃的温室进行暗培养。培养12天后，对照和处理过的叶片开始形成肉眼可见的愈伤组织。16天后，对照外植体在边缘伤口处形成愈伤组织，而处理过的外植体在伤口处和叶脉处均产生大量愈伤组织。
上述实验中，针对部分步骤进行详细的解释：
1/2MS生根培养基，包括以下配比的原料：MS粉(Duchefa Biochemie)2.215g/L，蔗糖(国药)30g/L，琼脂粉(BAIGEN)7.8g/L，用NaOH调节pH至5.8，高温高压灭菌。
细胞壁酶解液，包括以下配比的原料：MES·H2O(Solarbio#M8010)4.26g/L，D-甘露醇(Solarbio#M8140)72.86g/L，KCl(国药)1.5g/L，CaCl2·2H2O(国药)1.5g/L，牛血清蛋白Ⅴ(Solarbio#A8020)1g/L，果胶酶(Solarbio#P8181)10g/L，纤维素酶(Solarbio#C8270)10g/L，用KOH调节pH至5.7，并用0.22μm微孔滤膜过滤。
不添加酶的缓冲液，包括以下配比的原料：MES·H2O(Solarbio#M8010)4.26g/L，D-甘露醇(Solarbio#M8140)72.86g/L，KCl(国药)1.5g/L，CaCl2·2H2O(国药)1.5g/L，牛血清蛋白Ⅴ(Solarbio#A8020)1g/L，用KOH调节pH至5.7，并用0.22μm微孔滤膜过滤。
愈伤组织诱导培养基，包括以下配比的原料：MS粉(Duchefa Biochemie)4.43g/L，肌醇(国药)0.1g/L，蔗糖(国药)20g/L，MES·H2O(Solarbio#M8010)0.5g/L，D-葡萄糖酸钙·H2O(国药)0.65g/L，琼脂粉(BAIGEN)7.8g/L，2，4-D(PhytoTech)1mg/L，Kinetin(PhytoTech)0.1mg/L，用NaOH调节pH至5.8，高温高压灭菌。
该诱导杨树叶片愈伤组织大量增殖的方法，操作简便，通过细胞壁酶解液预先处理杨树叶片外植体，促进了愈伤组织的大量增殖，即采用细胞壁酶解预处理的方式刺激愈伤组织形成，使愈伤组织不仅在叶片伤口附近产生，而且在远离伤口附近的叶脉上也产生了大量愈伤组织，解决了愈伤组织形成效率低的问题，为树木的再生和基因编辑奠定了基础。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (7)
1.一种诱导杨树叶片愈伤组织大量增殖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、材料获取：
选择培养1个月且生长状态良好的84K杨无菌组培苗为材料，使用组培剪刀剪取顶芽和茎段，长度为1～1.5cm，然后置于1/2MS生根培养基中，在温度为22℃，光周期为16小时光照和8小时黑暗的温室进行培养1个月，获得用于组织培养实验的扩繁苗；
步骤二、外植体准备：
将步骤一得到的扩繁苗，在无菌超净台中，剪取生长状态良好的叶片，并使用手术刀在叶片背面垂直主叶脉的方向上将叶片切成两段；
步骤三、预处理：
在无菌条件下，将步骤二得到的外植体置于无菌的细胞壁酶解液中预处理1小时，之后用滤纸吸干外植体上残留的酶解液；
步骤四、诱导愈伤组织：
将叶片背面朝上，平铺在愈伤组织诱导培养基(CIM)上，在温度为22℃的温室进行暗培养，12天后可形成肉眼可见的愈伤组织，16天后在外植体伤口和叶脉处产生大量淡黄色愈伤组织。
2.根据权利要求1所述的诱导杨树叶片愈伤组织大量增殖的方法，其特征在于，在步骤一中，1/2MS生根培养基，包括以下配比的原料：MS粉2.215g/L，蔗糖30g/L，琼脂粉7.8g/L。
3.根据权利要求1所述的诱导杨树叶片愈伤组织大量增殖的方法，其特征在于，在步骤二中，剪取生长状态良好的叶片时，取从上到下第3～4叶序位置的叶片；
使用手术刀在叶片背面垂直主叶脉的方向上将叶片切成两段后，还切去叶尖增加伤口。
4.根据权利要求1所述的诱导杨树叶片愈伤组织大量增殖的方法，其特征在于，在步骤三中，细胞壁酶解液，包括以下配比的原料：MES·H2O 4.26g/L，D-甘露醇72.86g/L，KCl1.5g/L，CaCl2·2H2O 1.5g/L，牛血清蛋白Ⅴ 1g/L，果胶酶10g/L，纤维素酶10g/L。
5.根据权利要求4所述的诱导杨树叶片愈伤组织大量增殖的方法，其特征在于，所述细胞壁酶解液还需要用KOH调节pH至5.7，并用0.22μm微孔滤膜过滤。
6.根据权利要求2所述的诱导杨树叶片愈伤组织大量增殖的方法，其特征在于，在步骤四中，愈伤组织诱导培养基，包括以下配比的原料：MS粉4.43g/L，肌醇0.1g/L，蔗糖20g/L，MES·H2O 0.5g/L，D-葡萄糖酸钙·H2O 0.65g/L，琼脂粉7.8g/L，2，4-D 1mg/L，Kinetin0.1mg/L。
7.根据权利要求6所述的诱导杨树叶片愈伤组织大量增殖的方法，其特征在于，所述1/2MS生根培养基和愈伤组织诱导培养基还需要用NaOH调节pH至5.8，并在121℃下高温高压灭菌20min。
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