CN113455400B - 一种龙船花花药愈伤组织的诱导方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种龙船花花药愈伤组织的诱导方法，该方法是将处于单核期龙船花花蕾于4℃进行低温预处理，用乙醇浸泡、次氯酸钠溶液浸泡、无菌水冲洗后，将花药剥出后接种于诱导培养基中，用封口膜密封好放入27℃±1℃条件下的培养箱中进行暗培养；其中，所述诱导培养基是由基础培养基和植物生长调节剂组成，基础培养基是在MS培养基中添加蔗糖、活性炭、琼脂，植物生长剂为2,4‑D和KT。本发明将龙船花花药经过4℃低温预处理后，在MS培养基+4 mg L‑12,4‑D+2 mg L‑1 KT诱导培养，有利于提高龙船花花药愈伤组织的诱导率，为龙船花花药培养以及育种提供参考。

Description

一种龙船花花药愈伤组织的诱导方法
技术领域
本发明涉及龙船花育种领域，具体其涉及一种龙船花花药愈伤组织的诱导方法。
背景技术
龙船花(Ixora chinensis Lam)又名白日红、仙丹花、山丹花等，是茜草科(Rubiaceae)、龙船花属(Ixora Linn.)植物，龙船花花色艳丽、植株较矮，应用广泛。花药培养在植物育种中具有重要的用途，研究龙船花花药诱导愈伤的培养条件，建立龙船花花药诱导愈伤培养体系，为获得龙船花单倍体材料以及双单倍体材料积累基础，有利于培育龙船花新品种，以及开展相应分子机理研究。茜草科龙船花属植物世界上约有400种，其中大多数品种分布在热带地区，而我国主要分布在云南省和福建省等大部分地区，约有19种。龙船花花期比较长，花期从3月至12月份，可用于鲜切花和园林景观应用。龙船花属植物在药理特性方面、生理研究及栽培和应用等方面均有相关研究，而关于龙船花花药诱导愈伤组织尚未见报道。花药愈伤诱导培养基的各种生长调节剂浓度组合、植物材料的基因类型、花蕾的生长发育时期、植物材料的预处理方法差异等培养条件都会对花药愈伤组织的诱导产生不一样的影响。
发明内容
本发明的目的在于提供一种龙船花花药愈伤组织的诱导方法，建立高效的龙船花花药愈伤诱导体系，为龙船花花药培养以及育种提供参考。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种龙船花花药愈伤组织的诱导方法如下：
1)花穗取材一般在晴朗的早晨9点至11点摘取，选取单核中晚期、外观品质正常、无病虫害的龙船花花蕾，用枝剪将一整枝花团剪下；
2)配制诱导培养基，基础培养基为MS培养基+蔗糖30g L-1+活性炭0.5g L-1+琼脂8g L-1，添加植物生长调节剂，分别是浓度为4mg L-1 2,4-D和2mg L-1KT，培养基的酸碱度调节至5.8；
3)将4℃预处理24-72h的花蕾摘下来放进体积为100mL的三角瓶里面，在紫外线灭菌后的超净工作台上先用75％乙醇浸泡30±2s后，用无菌水冲洗1次；再用2％次氯酸钠溶液浸泡10-12min后，浸泡过程中轻微振荡三角瓶，使其花蕾消毒彻底，最后用无菌水冲洗2-3次；
4)把花蕾放在有无菌滤纸的培养皿里，选择处于单核期的个头饱满的、无破损的花药以备接种，在接种过程中，用灭菌后的镊子和解剖刀将花药轻轻剥开，然后接种到诱导培养基中；
5)将接种好花药的培养皿用封口膜密封好放入27℃±1条件下的培养箱进行暗培养，培养时间为20-40天。
本发明采用以上技术方案，其有益效果在于：
1.龙船花花药培养15d即开始生长愈伤组织。
2.在MS培养基+4mg L-1 2,4-D+2mg L-1KT诱导培养基中，培养20d，30d和40d时龙船花花药愈伤诱导率均为最高，且40d时龙船花花药愈伤诱导率达到最高73.06％。
3.龙船花花药经过4℃低温分别预处理0h，24h、48h、72h后，花药均能诱导长出愈伤组织。预处理24h的效果最佳，培养30d和40d的诱导率分别为67.78％和75.00％。
具体实施方式
一种龙船花花药愈伤组织的诱导方法，包括以下步骤：
1)在晴朗的早晨9点至11点摘取，选取单核中晚期、外观品质正常、无病虫害的龙船花花蕾，用枝剪将一整枝花团剪下；
2)配制诱导培养基，基础培养基为MS培养基+蔗糖30g L-1+活性炭0.5g L-1+琼脂8g L-1，添加植物生长调节剂，分别是浓度为4mg L-1 2,4-D和2mg L-1KT，培养基的酸碱度调节至5.8；
3)将4℃预处理24-72h的花蕾摘下来放进体积为100mL的三角瓶里面，在紫外线灭菌后的超净工作台上先用75％乙醇浸泡30±2s后，用无菌水冲洗1次；再用2％次氯酸钠溶液浸泡10-12min后，浸泡过程中轻微振荡三角瓶，使其花蕾消毒彻底，最后用无菌水冲洗2-3次；
4)把花蕾放在有无菌滤纸的培养皿里，选择处于单核期的个头饱满的、无破损的花药以备接种，在接种过程中，用灭菌后的镊子和解剖刀将花药轻轻剥开，然后接种到诱导培养基中；
5)将接种好花药的培养皿用封口膜密封好放入27℃±1条件下的培养箱进行暗培养，培养时间为20-40天。
实施例1
培养基中，不同植物生长调节剂浓度组合对花药培养的影响，MS培养基+蔗糖30gL-1+活性炭0.5g L-1+琼脂8g L-1。
表1不同植物生长调节剂浓度组合对花药培养的影响
Figure BDA0003222813320000031
Figure BDA0003222813320000041
Figure BDA0003222813320000051
注：不同小写字母表示差异显著(p<0.05)；不同大写字母表示差异极显著(p<0.01)
由表1可知，在KT含量为0mg L-1时，龙船花花药愈伤诱导率随着2,4-D浓度的升高整体呈上升趋势，在培养基加入KT后，龙船花花药愈伤组织的诱导率有一定的促进作用，且仅在植物生长调节剂浓度为4mg L-1 2,4-D+0.2mg L-1KT时为71.1％，但诱导率低于4mg L-12,4-D和2mg L-1KT的植物生长调节剂组合(诱导率为73.06％)。
实施例2
4℃低温预处理对花药培养愈伤组织诱导的影响。
表2 4℃低温预处理对花药培养愈伤组织诱导的影响
Figure BDA0003222813320000052
Figure BDA0003222813320000061
由表2可知，在4℃低温预处理48h和72h时，在培养40d后，对龙船花愈伤诱导率分别为63.47％和64％，高于4℃低温预处理0h的诱导率(47.80％)，但低于4℃低温预处理24h的诱导率(75.00％)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (4)

1.一种龙船花花药愈伤组织的诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将处于单核期龙船花花蕾于4℃进行低温预处理后，用75%乙醇浸泡30±2 s后，用无菌水冲洗1次；再用2%次氯酸钠溶液浸泡10-12 min，最后用无菌水冲洗2-3次；
2）将花药剥出后接种于诱导培养基中，用封口膜密封好放入27℃±1℃条件下的培养箱中进行暗培养；
所述诱导培养基的制备方法如下；在MS培养基中添加30 g· L-1蔗糖、0.5 g· L-1活性炭、8 g· L-1琼脂，然后添加4 mg· L-1 2,4-D 和 2 mg· L-1 KT，将酸碱度调节至5.8。
2.根据权利要求1所述的一种龙船花花药愈伤组织的诱导方法，其特征在于，所述龙船花花蕾的取材方法如下：在晴朗的早晨9点至11点，选取单核中晚期、外观品质正常、无病虫害的龙船花花蕾。
3.根据权利要求1所述的一种龙船花花药愈伤组织的诱导方法，其特征在于，花蕾于4℃进行低温预处理的时间为24-72 h 。
4.根据权利要求1所述的一种龙船花花药愈伤组织的诱导方法，其特征在于，步骤2）的培养时间为20-40天。
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