CN114916444B - 一种姜荷花种子愈伤组织的诱导方法 - Google Patents

一种姜荷花种子愈伤组织的诱导方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种姜荷花种子愈伤组织的诱导方法，该方法以姜荷花种子为外植体，于MS培养基+1.0 mg/L 2,4‑D和0.5 mg/L KT诱导姜荷花种子产生愈伤组织，并于MS培养基＋0.5 mg/L 2,4‑D和0.5 mg/L KT中继代增殖生长。本发明提供了一种适合姜荷花种子诱导产生愈伤组织的培养条件，建立了姜荷花种子愈伤诱导体系和增殖体系，为姜荷花新种质创制和育种研究提供了技术支持。

Description

一种姜荷花种子愈伤组织的诱导方法
技术领域
本发明属于姜荷花育种领域，具体其涉及一种姜荷花种子愈伤组织的诱导方法。
背景技术
姜荷花(Curcuma alismatifolia)是新兴的热带球根花卉，广泛应用于盆栽、切花以及园林应用等，市场价值高，发展前景广阔。姜荷花为国外引进品种，国内具有自主知识产权的新品种极少，因此姜荷花新品种培育十分重要。愈伤是植物生产研究重要的研究对象，可作为快速繁殖以及转基因等应用研究的重要中间材料，因此愈伤组织的诱导以及继代增殖，是植物新品种培育的重要途径之一。姜荷花种子作为杂交产生的材料，具有较高的育种价值，以姜荷花种子作为外植体诱导愈伤组织，不仅可以获得正常倍性的愈伤组织，还有可能获得多倍体愈伤组织，这对于姜荷花新品种的培育以及基因功能的研究具有十分重要的意义。目前已报道的研究中，尚未见姜荷花种子诱导愈伤的报道。
本发明为姜荷花新种质创制和新品种培育提供了重要的理论支持。
发明内容
本发明的目的在于提供一种姜荷花种子愈伤组织的诱导方法，为姜荷花新品种培育提供重要的技术支持。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种姜荷花种子愈伤组织的诱导方法，包括如下步骤：
1)采收姜荷花成熟种子，将种子假种皮除去，然后将清理干净的姜荷花种子放进体积为100mL的三角瓶内，在紫外线灭菌后的超净工作台上先用75％乙醇消毒7-10min后，用无菌水冲洗1次；再用2％次氯酸钠溶液浸泡15-16min，浸泡过程中轻微振荡三角瓶，使其种子消毒彻底，最后用无菌水冲洗2-3次；
2)把姜荷花种子放在有无菌滤纸的培养皿里，待种子晾干后，接种到诱导培养基中，然后将接种好的姜荷花种子放入25℃±1℃，光照3000-5000LX条件下进行培养；
所述诱导培养基由基础培养基和植物生长调节剂组成，其制备方法为：在MS培养基中添加30g·L-1蔗糖和8g·L-1琼脂，得到基础培养基，然后在基础培养基中添加1mg·L-12,4-D和0.5mg·L-1KT，最后将培养基的酸碱度调节至5.8；
3)在紫外线灭菌后的超净工作台上，用消毒后的镊子将诱导的愈伤继代到继代增殖培养基中，放入25℃±1℃，光照3000-5000LX条件下进行增殖培养；
所述继代增殖培养基由基础培养基和植物生长调节剂组成，其制备方法为：在MS培养基中添加30g·L-1蔗糖和8g·L-1琼脂，得到基础培养基，然后在基础培养基中添加0.5mg·L-1 2,4-D和0.5mg·L-1KT，最后将培养基的酸碱度调节至5.8。
本发明的有益效果如下：
1.在MS培养基+1.0mg/L 2,4-D和0.5mg/L KT诱导培养基中，姜荷花种子愈伤诱导率最高，为64.55％。
2.姜荷花种子愈伤适宜在MS培养基+0.5mg/L 2,4-D和0.5mg/L KT中继代增殖，愈伤疏松，大部分呈白色。
附图说明
图1为姜荷花种子诱导产生的愈伤组织。
具体实施方式
实施例1诱导培养基的选择
本实施例考察了植物生长调节剂浓度组合对姜荷花种子愈伤组织诱导的影响，其中，基础培养基为：MS培养基+蔗糖30g L-1+琼脂8g L-1。
表1不同植物生长调节剂浓度组合对诱导种子愈伤的影响
Figure BDA0003694930200000021
本实施例中,各组培养基均能诱导出愈伤。在2,4-D浓度从0.6mg L-1升到1.0mg L-1时，种子愈伤的诱导率从46.62％提高到64.55％，在诱导过程中，由于种子存在差异，部分种子丧失萌发或形成愈伤的能力，有些种子产生愈伤后仍能萌发，有些则直接产生愈伤，不再萌发(图1)，说明种子产生愈伤的来源或存在区别，较高的植物生长调节剂浓度有利于种子愈伤组织诱导，但对种子的萌发具有负面影响。
实施例2
继代增殖培养基的选择
本实施例考察了不同培养基对姜荷花愈伤组织继代增殖的影响。其中，基础培养基为：MS培养基+蔗糖30g L-1+琼脂8g L-1。
表2不同培养基对不同品种的愈伤继代增殖的生长情况
培养基植物生长调节剂含量 愈伤状态
不含植物生长调节剂 生长缓慢，褐化直至死亡
0.4mg·L<sup>-1</sup> 2,4-D+0.5mg·L<sup>-1</sup>KT 愈伤疏松。大部分呈白色，有褐化现象。
0.5mg·L<sup>-1</sup> 2,4-D+0.5mg·L<sup>-1</sup>KT 愈伤疏松，大部分呈白色。
本实施例中，在不含植物生长调节剂的培养基中，姜荷花愈伤不能正常生长，利用降低2,4-D浓度对姜荷花愈伤组织进行继代增殖，在KT浓度同为0.5mg L-1的培养基中，含有0.4mg L-1的2,4-D培养基继代的姜荷花愈伤可以正常增殖，但存在褐化的现象，而在含有0.5mg L-1的2,4-D培养基继代的姜荷花愈伤组织疏松，状态良好，未发现褐化的现象。
在确定了诱导培养基和继代增殖培养基后，以下通过实施例3-5进一步详细说明本发明提供的一种姜荷花种子愈伤组织的诱导方法。
实施例3
一种姜荷花种子愈伤组织的诱导方法，包括如下步骤：
1)采收姜荷花成熟种子，将种子假种皮除去，然后将清理干净的姜荷花种子放进体积为100mL的三角瓶内，在紫外线灭菌后的超净工作台上先用75％乙醇消毒7min，用无菌水冲洗1次；再用2％次氯酸钠溶液浸泡15min，浸泡过程中轻微振荡三角瓶，使其种子消毒彻底，最后用无菌水冲洗2次；
2)把姜荷花种子放在有无菌滤纸的培养皿里，待种子晾干后，接种到诱导培养基中，然后将接种好的姜荷花种子放入25℃，光照3000LX条件下进行培养；
所述诱导培养基由基础培养基和植物生长调节剂组成，其制备方法为：在MS培养基中添加30g·L-1蔗糖和8g·L-1琼脂，得到基础培养基，然后在基础培养基中添加1mg·L-12,4-D和0.5mg·L-1KT，最后将培养基的酸碱度调节至5.8；
3)在紫外线灭菌后的超净工作台上，用消毒后的镊子将诱导的愈伤继代到继代增殖培养基中，放入25℃，光照3000LX条件下进行增殖培养；
所述继代增殖培养基由基础培养基和植物生长调节剂组成，其制备方法为：在MS培养基中添加30g·L-1蔗糖和8g·L-1琼脂，然后添加0.5mg·L-1 2,4-D和0.5mg·L-1KT，最后将培养基的酸碱度调节至5.8。
实施例4
一种姜荷花种子愈伤组织的诱导方法，包括如下步骤：
1)采收姜荷花成熟种子，将种子假种皮除去，然后将清理干净的姜荷花种子放进体积为100mL的三角瓶内，在紫外线灭菌后的超净工作台上先用75％乙醇消毒10min，用无菌水冲洗1次；再用2％次氯酸钠溶液浸泡16min，浸泡过程中轻微振荡三角瓶，使其种子消毒彻底，最后用无菌水冲洗3次；
2)把姜荷花种子放在有无菌滤纸的培养皿里，待种子晾干后，接种到诱导培养基中，然后将接种好的姜荷花种子放入26℃，光照5000LX条件下进行培养；
所述诱导培养基由基础培养基和植物生长调节剂组成，其制备方法为：在MS培养基中添加30g·L-1蔗糖和8g·L-1琼脂，得到基础培养基，然后在基础培养基中添加1mg·L-12,4-D和0.5mg·L-1KT，最后将培养基的酸碱度调节至5.8；
3)在紫外线灭菌后的超净工作台上，用消毒后的镊子将诱导的愈伤继代到继代增殖培养基中，放入26℃，光照5000LX条件下进行增殖培养；
所述继代增殖培养基由基础培养基和植物生长调节剂组成，其制备方法为：在MS培养基中添加30g·L-1蔗糖和8g·L-1琼脂，然后添加0.5mg·L-1 2,4-D和0.5mg·L-1KT，最后将培养基的酸碱度调节至5.8。
实施例5
一种姜荷花种子愈伤组织的诱导方法，包括如下步骤：
1)采收姜荷花成熟种子，将种子假种皮除去，然后将清理干净的姜荷花种子放进体积为100mL的三角瓶内，在紫外线灭菌后的超净工作台上先用75％乙醇消毒8min后，用无菌水冲洗1次；再用2％次氯酸钠溶液浸泡15min，浸泡过程中轻微振荡三角瓶，使其种子消毒彻底，最后用无菌水冲洗3次；
2)把姜荷花种子放在有无菌滤纸的培养皿里，待种子晾干后，接种到诱导培养基中，然后将接种好的姜荷花种子放入25℃，光照4000LX条件下进行培养；
所述诱导培养基由基础培养基和植物生长调节剂组成，其制备方法为：在MS培养基中添加30g·L-1蔗糖和8g·L-1琼脂，得到基础培养基，然后在基础培养基中添加1mg·L-12,4-D和0.5mg·L-1KT，最后将培养基的酸碱度调节至5.8；
3)在紫外线灭菌后的超净工作台上，用消毒后的镊子将诱导的愈伤继代到继代增殖培养基中，放入25℃，光照4000LX条件下进行增殖培养。
所述继代增殖培养基由基础培养基和植物生长调节剂组成，其制备方法为：在MS培养基中添加30g·L-1蔗糖和8g·L-1琼脂，然后添加0.5mg·L-1 2,4-D和0.5mg·L-1KT，最后将培养基的酸碱度调节至5.8。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (2)

1.一种姜荷花种子愈伤组织的诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）采收姜荷花成熟种子，将种子假种皮除去，然后将清理干净的姜荷花种子放进三角瓶内，在紫外线灭菌后的超净工作台上先用75%乙醇消毒7-10min后，用无菌水冲洗1次；再用2%次氯酸钠溶液浸泡15-16 min，最后用无菌水冲洗2-3次；
2）把姜荷花种子放在有无菌滤纸的培养皿里，待种子晾干后，接种到诱导培养基中，然后将接种好的姜荷花种子放入25℃±1℃，光照3000-5000LX条件下进行培养；
所述诱导培养基由MS培养基、蔗糖、琼脂、2,4-D 和 KT组成，制备方法如下：在MS培养基中添加30 g·L-1蔗糖和8g·L-1琼脂，得到基础培养基，然后在基础培养基中添加1 mg·L-1 2,4-D 和 0.5 mg·L-1 KT，最后将培养基的酸碱度调节至5.8；
3）在紫外线灭菌后的超净工作台上，用消毒后的镊子将诱导的愈伤继代到继代增殖培养基中，放入25℃±1℃，光照3000-5000LX条件下进行增殖培养；
所述继代增殖培养基由MS培养基、蔗糖、琼脂、2,4-D 和KT组成，制备方法如下：在MS培养基中添加 30 g•L-1蔗糖和8 g•L-1琼脂，得到基础培养基，然后在基础培养基中添加0.5mg •L-1 2,4-D 和 0.5 mg•L-1 KT，最后将培养基的酸碱度调节至5.8。
2.根据权利要求1所述的一种姜荷花种子愈伤组织的诱导方法，其特征在于，步骤1）中，次氯酸钠溶液浸泡过程中，轻微振荡三角瓶，使种子消毒彻底。
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