CN114885842B - 一种君迁子种子消毒及再生培养的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种君迁子种子消毒及再生培养的方法。包括种子消毒、胚轴诱导不定芽、叶片诱导不定芽等过程。本发明具有萌发率高，繁殖速率快，诱导效果显著的优点，不仅为快速繁殖优良君迁子无菌苗提供了一条途径，而且为君迁子的工厂化育苗及以后转基因技术提供可能。

Description

一种君迁子种子消毒及再生培养的方法

技术领域

本发明属于君迁子组织培养领域，具体涉及一种君迁子种子消毒及再生培养的方法。

背景技术

君迁子(Diospyros lotus L.)为柿树科(Ebenaceae柿属(Diospyros L.)植物的一个种，别名黑枣、软枣、牛奶枣、丁香柿、高加索柿等。落叶乔木，树干挺直，树冠圆整，适应性强，亦可作园林绿化用。原产于亚洲西南部，欧洲东南部，目前分布于从东亚到地中海西部各国的广大区域。在我国的分布仅次于柿，除广东、广西、福建、新疆、青海、宁夏、内蒙、吉林、黑龙江等9省外，均有生长，垂直分布达海拔2 200m以上，是我国柿属植物中分布最高和最耐寒的一种。君迁子主要用做柿品种的砧木，抗寒、耐旱性强，与大多数柿品种亲和性强。君迁子的种子可以入药，能消渴去热。果实去涩生食或酿酒、制醋，也可提取供医用。因此，君迁子的价值越来越被人们所重视。君迁子在自然环境下生长缓慢，主要通过直接播种来种植，生长周期较长，因此通过组织培养来缩短育苗时长。在组织培养过程中存在种子萌发率低，愈伤组织诱导率低等问题，至今还未得到有效的解决。近年来，随着全球气温升高、气候变化大及降雨量的不均衡，致使柿属植物对于抗逆性砧木的需求增加，目前，抗逆砧木主要是通过实生繁殖，通过无性繁殖及分子育种途径获得抗逆砧木还在起步阶段，以君迁子种子为外植体的组培体系及叶片与茎段直接产生不定芽的研究尚未出现。君迁子组织培养中还存在诸多问题，比如：外植体褐化严重、无菌苗叶片生长弱、再生效率差及生根培养效果不佳等关键问题，严重限制了君迁子遗传转化的相关研究。本文通过研究不同消毒方法、基础培养基及植物生长调节剂等对君迁子组培苗生长的影响，成功建立了君迁子组织培养再生体系。

发明内容

本发明的首要目的是针对目前君迁子种子萌发率低，通过组织培养获得再生植株技术存在不足的问题，提供一种君迁子种子萌发的方法。君迁子组织培养方面的研究较少，与之前的相关研究对比分析，该方法萌发率高、生长效果好，明显缩短了君迁子种子的生长周期，愈伤组织及不定芽诱导率高，根系生长健壮，受材料限制小，为以后工厂化育苗及转基因技术提高可能性。

本发明的首要目的是通过以下方式实现的。

一种君迁子种子消毒的方法，包括以下步骤：

(1)种子的获得：以君迁子种子为外植体材料；

(2)外植体的处理:将种子外果肉去除干净，晾干后，在清水中浸泡洗净种子表面的一层白色薄膜；

(3)外植体的消毒：将君迁子种子用75％乙醇消毒4min后，用0.1％HgCl₂溶液中浸泡7-9min，优选8min，浸泡过程中要不时摇动，保证HgCl₂对种子的充分消毒，最后用无菌水冲洗3-5次。

本发明通过多次实验尝试，最终得到了效果显著的消毒方法，为以后的种子萌发、愈伤组织诱导等过程奠定了基础。

一种君迁子种子再生培养的方法，包括以下步骤：

(1)接种前预处理：将消毒后的君迁子种子置于45-55℃水浴锅处理2-6h，优选50℃处理4h；然后用1g/L GA₃浸泡13-16h，优选浸泡15h；

优选上述本发明消毒方法获得的种子作为外植体。

(2)初代培养：将消毒好的君迁子种子接种到1/2MS+0.8-1.2mg/L GA₃的培养基中光照条件下进行培养；

(3)胚轴或者叶片愈伤组织及不定芽诱导：将种子萌发培养出的健壮幼苗的胚轴切成5mm长的小段接种到1/2MS+2.5-3.5mg/L TDZ+0.4-0.6mg/L NAA+0.9-1.0mg/LZT的培养基中进行愈伤组织及不定芽的诱导，暗培养后转光照继续培养；或者将种子萌发培养出的健壮幼苗的叶片切至5mm*5mm接种到1/2MS+2.5-3.5mg/L TDZ+0.4-0.6mg/L NAA+0.9-1.0mg/LZT的培养基中进行愈伤组织诱导持续暗培养后转光照继续培养；

(4)生根培养：将胚轴及叶片诱导的不定芽接种到1/2MS+1.0mg/L IBA+0.5mg/LNAA+蔗糖20g/L的培养基中进行生根培养。

步骤(2)中诱导培养时使用的培养基优选为1/2MS+1.0mg/L GA₃。

步骤(3)中胚轴及愈伤组织及不定芽诱导时使用的培养基优选均为1/2MS+3.0mg/L TDZ+0.5mg/L NAA+1.0mg/LZT。

步骤(2)中种子萌发时，光照条件下培养的是15天。

步骤(3)中暗培养时间均是15天；然后转到光照条件下培养10天。

步骤(2)中培养温度为30℃，光照培养强度为50-60μmolm^-2/s¹，光照培养时间12-14h/d。

步骤(3)中培养温度为30℃，光照培养强度为50-60μmolm^-2/s¹，光照培养时间10-12h/d。

步骤(4)中生根培养时，暗培养3d后转光照培养，光照培养温度为28±1℃，光照培养强度50-60μmolm^-2/s¹，光照培养时间为14-16h/d。

种子萌发诱导培养基附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH调至5.5-5.7；胚轴愈伤组织及不定芽诱导培养基附加蔗糖40g/L，琼脂7g/L，pH调至5.5-5.7；叶片愈伤组织及不定芽诱导培养基附加蔗糖40g/L，琼脂7g/L，pH调至5.5-5.7。

此外，以君迁子种子为外植体的组织培养的研究比较少见。

已研究的内容与本发明的区别及优势总结如下:

1、材料无季节限制，君迁子新旧种子皆可用做外植体；

2、君迁子种子由于外种皮过硬无法作为进行组织培养的外植体，严重制约以君迁子种子为外植体的组培体系产生，本发明通过消毒后密封材料，水浴锅预处理后解决了此问题；

3、种子萌发平均时间只有5.8d萌发成壮苗只要20d；

4、叶片及胚轴均可直接诱导不定芽，培养周期短；

5、叶片及胚轴诱导不定芽均在25d以内；

6、不受材料限制，现阶段君迁子愈伤组织及不定芽的诱导，主要使用无菌苗顶部四片叶，本发明中，种子培育出的无菌苗，胚轴及所有叶片均可诱导愈伤组织及不定芽；

7、经诱导的不定芽长势较强，不需壮苗培养；

8、从种子消毒到产生不定芽只需要45d，再生效率极高，不定芽系数为5.5，10个种子在45的内即可获得200个以上的不定芽。

附图说明

图1为30℃水浴锅预处理后种子萌发后生长状况；

图2为40℃水浴锅预处理后种子萌发后生长状况；

图3为50℃水浴锅预处理后种子萌发后生长状况；

图4为60℃水浴锅预处理后种子萌发后生长状况；

图5为胚轴接入诱导培养基中5d的照片；

图6为胚轴接入诱导培养基中15d后长出不定芽的照片；

图7为胚轴诱导的不定芽生长20d的照片；

图8为胚轴诱导的不定芽生长30d的照片；

图9为叶片接入诱导培养基中5d的照片；

图10为叶片接入诱导培养基中15d后长出不定芽的照片；

图11为叶片诱导的不定芽生长20d的照片；

图12为叶片诱导的不定芽生长30d的照片；

图13为不定芽生根培养40d的照片；

图14为不定芽生根培养40d的根部照片。

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1

依次进行以下操作:

1、外植体的处理:将君迁子种子外果肉去除干净，晾干后，在清水中浸泡洗净种子表面的一层白色薄膜；

外植体消毒处理：将君迁子种子用75％乙醇消毒3min、4min、5min后，分别按以下2种处理进行消毒：①用5％NaClO继续消毒8min、10min、12min，在浸泡过程中不断摇动，保证NaClO对种子的充分消毒，再用无菌水冲洗3-5次。②用0.1％HgCl₂溶液中浸泡7min、8min、9min，浸泡过程中要不时摇动，保证HgCl₂对种子的充分消毒，最后用无菌水冲洗3-5次，接种到含有2.0mg/L6-BA和0.5mg/LNAA培养基中。培养温度为30℃，光照培养强度为55μmolm^-2/s¹，光照培养时间14h/d。为防止外植体交叉污染，每个处理10瓶，每瓶接种1个种子，重复3次；

表1不同外消毒方法对种子萌发的影响

最终确认本发明优选的消毒方法如为：将君迁子的种子，用75％酒精消毒4min后，再用0.1％的升汞消毒8min，最后用无菌水冲洗3-5次。

2.水浴锅预处理：将消毒好的种子分别按以下4种处理进行预处理：①置于30℃水浴锅处理2h、4h、6h，然后用1g/L GA₃浸泡15h。②置于40℃水浴锅处理2h、4h、6h，然后用1g/L GA₃浸泡15h。③置于50℃水浴锅处理2h、4h、6h，然后用1g/L GA₃浸泡15h。④置于60℃水浴锅处理2h、4h、6h，接种到含有2.0mg/L6-BA和0.5mg/LNAA培养基中。

表2不同外植体预处理对胚萌发的影响

最终确认本发明优选的预处理方法为：在50℃水浴锅处理4h。

3.不同基础培养基及植物生长调节剂对种子萌发的影响：君迁子种子萌发所采用基本培养基有MS、1/2MS、WPM、(1/2N)MS。分别加入①1.0mg/L GA₃；②2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA；培养温度为30℃，光照培养强度为55μmolm^-2/s¹，光照培养时间14h/d。培养20d后统计种子萌发情况，每种培养基配方配制10瓶，每个培养基中接入2个种子，进行三次重复实验。

表3不同基础培养基及植物生长调节剂对种子萌发的影响

可以得出，诱导君迁子种子萌发，同时提高种子萌发率的最适培养基为1/2MS+1.0mg/L GA₃。

4.胚轴愈伤组织及不定芽的诱导：将种子萌发后生长健壮的无菌苗的胚轴切下切成5mm长的小段，接种到1/2MS培养基中，设置不同的浓度梯度，暗培养15d后转光照培养，培养温度为30℃，光照培养强度为55μmolm^-2/s¹，光照培养时间14h/d；培养40天后进行观察统计。

表4：不同激素组合对君迁子胚轴诱导愈伤组织及不定芽的影响

由此可得出，对君迁子无菌苗的胚轴进行愈伤组织及不定芽的诱导时的最适培养基为1/2MS+3.0mg/L TDZ+0.5mg/L NAA+1.0mg/LZT。

5.叶片愈伤组织及不定芽诱导：将君迁子为发育成熟种子萌发后的生长健壮的无菌苗的叶片切成5mm*5mm大小均匀的材料后接种到1/2MS培养基中进行诱导培养，培养基中的激素按照一定的浓度梯度设置，暗培养15天后转到光照条件下，培养温度为30℃，光照培养强度为55μmolm^-2/s¹，光照培养时间14h/d；20天后进行观察、统计数据并拍照。

表5：不同激素组合对君迁子叶片诱导愈伤组织及不定芽的影响

最终得出，对君迁子的无菌苗叶片进行愈伤组织及不定芽的诱导中过程中的最适培养基为1/2MS+3.0mg/L TDZ+0.5mg/L NAA+1.0mg/LZT，本发明在此步骤中最大的优势在于本发明过程中使用的叶片不受材料限制，整个无菌苗植株上的叶片均可用于愈伤组织及不定芽的诱导，这在削弱材料限制的同时也减少了成本的损耗，明显提高了材料的利用率。

6.生根培养：将君迁子下胚轴及叶片直接诱导的不定芽分别接种在含有IBA(0.5、1.0、1.5mg/L)，NAA浓度为(0.5、1.0mg/L)的1/2MS培养基中，蔗糖浓度为20、30、40g/L，暗培养3d后，光照培养，温度为28±1℃，光照培养强度为55μmolm^-2/s¹，光照培养时间为14h/d。40d后统计平均不定根数、生根率及观察材料的生长情况。

表6不同基础培养基及激素对君迁子生根培养的影响

本发明优选的生根培养基为1/2MS+1.0mg/L IBA+0.5mg/L NAA。

Claims (5)

1.一种君迁子种子再生培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）接种前预处理：将消毒后的君迁子种子置于50℃处理4h；然后用1g/L GA₃浸泡15h；

（2）初代培养：将消毒好的君迁子种子接种到1/2MS+1.0mg/L GA₃的培养基中光照条件下进行培养；

（3）胚轴或者叶片愈伤组织及不定芽诱导：将种子萌发培养出的健壮幼苗的胚轴切下接种到1/2 MS+ 3.0mg/L TDZ+ 0.5mg/L NAA+1.0 mg/LZT的培养基中进行愈伤组织及不定芽的诱导，持续暗培养后转光照继续培养；或者将种子萌发培养出的健壮幼苗的叶片切下接种到1/2 MS+ 3.0mg/L TDZ+ 0.5mg/L NAA+1.0 mg/LZT的培养基中进行愈伤组织诱导，持续暗培养后转光照继续培养；

（4）生根培养：将胚轴及叶片诱导的不定芽接种到1/2MS+ 1.0mg/L IBA+0.5mg/L NAA+蔗糖20 g/L的培养基中进行生根培养；

步骤（2）中种子萌发时，光照条件下培养的是15天以上；

步骤（3）中暗培养时间均是15天；然后转到光照条件下培养10天以上；

步骤（4）中生根培养时，暗培养3d后转光照培养；

所述的君迁子种子消毒的方法，包括以下步骤：

1）种子的获得：以君迁子种子为外植体材料；

2）外植体的处理:将种子外果肉去除干净，晾干后，在清水中浸泡洗净种子表面的一层白色薄膜；

3）外植体的消毒：将君迁子种子用75%乙醇消毒4 min后，用0.1% HgCl₂溶液中浸泡8min，浸泡过程中要不时摇动，保证HgCl₂对种子的充分消毒，最后用无菌水冲洗3-5次。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中培养温度为30℃，光照培养强度为50-60μmolm^-2/s¹，光照培养时间12-14 h/d。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中培养温度为30℃，光照培养强度为50-60μmolm^-2/s¹，光照培养时间12-14 h/d。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中光照培养温度为28±1℃，光照培养强度为50-60μmolm^-2/s¹，光照培养时间为14-16h/d。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，种子萌发诱导培养基附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH调至5.7-5.8；胚轴愈伤组织及不定芽诱导培养基附加蔗糖40g/L，琼脂7g/L，pH调至5.5-5.7；叶片愈伤组织及不定芽诱导培养基附加蔗糖40g/L，琼脂7g/L，pH调至5.5-5.7；不定芽生根培养基附加琼脂7g/L，pH调至5.5-5.7。