JP2022548397A - 植物ゲノムを改変させずに植物特徴を改変させるための組成物および方法 - Google Patents

植物ゲノムを改変させずに植物特徴を改変させるための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、１つまたは複数の植物ホルモン遺伝子と少なくとも１つの目的ポリヌクレオチドとを含む１つまたは複数の細胞を使用して、植物のゲノムを改変させずに植物の特徴を改変する方法および組成物であって、１つまたは複数の植物ホルモン遺伝子および少なくとも１つの目的ポリヌクレオチドが１つまたは複数の細胞中で発現される、方法および組成物に関する。【選択図】図１

Description

配列表の電子出願に関する記述
米国特許法施行規則第１．８２１条の下で提出された、題名１５５４－３ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、１２６，４４６バイトのサイズであり、２０２０年９月１７日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された、ＡＳＣＩＩテキスト形式の配列表を、紙コピーの代わりに提供する。この配列表は、これにより、その開示のために本明細書中に参考として組み込まれている。
優先権の記述
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下、その内容全体が本明細書中に参考として組み込まれている２０１９年９月２０日に出願の米国仮出願第６２／９０３，１８３号の優先権を主張するものである。
本発明は、宿主植物のゲノムを改変させずに宿主植物の特徴を改変させるために使用することができる、１つまたは複数の植物ホルモン遺伝子をコードしているポリヌクレオチドと少なくとも１つの目的ポリヌクレオチドとを含む、共生生物形成接種材料および共生生物に関する。
アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の細菌は、根頭癌腫病を引き起こす植物病原体として数十年間にわたって研究されている。この病害は、植物上のアグロバクテリウム属の種による感染部位で成長する植物塊（または虫こぶ）の形成をもたらす。成熟植物で発生する虫こぶは、病原体および宿主の遺伝子型ならびに感染した宿主の年齢に応じて、表現型の応答または植物成長に対する影響をわずかにしか、または全くもたらさない場合がある。しかし、より若い植物上の虫こぶは、植物の成長および他の特徴に有害な影響を重大に与える場合がある。虫こぶの形成は、植物の創傷部位中に入り、ＤＮＡの一部分（Ｔ－ＤＮＡ、または転移ＤＮＡと呼ばれ、Ｔｉ－プラスミドアグロバクテリウム属の種のプラスミド上に位置する）を近隣の植物細胞に転移させる、細菌の能力の結果として誘導される。植物細胞内に入った後、Ｔ－ＤＮＡは核に向けられ、ここで植物のゲノム中に挿入される。
アグロバクテリウム属の種がＤＮＡを植物ゲノム内に転移させることが知られる前の１９４０年代に、研究者らは、この細菌が、植物細胞が安定に変更され「不死」となり植物ホルモンを必要とせずにｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物中で成長することを可能にすることを発見した。現在では、腫瘍形成は、植物細胞ゲノム内に挿入された際に発現される、植物ホルモン合成の遺伝子を含有するＴ－ＤＮＡの結果であることが知られている。続いて生成される植物ホルモンは、植物細胞が、もはや植物に生成された細胞分裂シグナルの制御下ではなくなった細胞分裂を開始することを引き起こす。
１９８０年代以降、アグロバクテリウム属の種は、Ｔ－ＤＮＡを標的植物のゲノム内に挿入するその能力の故に、植物全体を形質転換させるための研究および応用において使用されてきた。そのようなＴ－ＤＮＡは、所望の形質を標的植物に与える遺伝子を送達するように操作することができる。形質転換を達成するために、虫こぶを形成せず、したがって、生じる植物が、所望の表現型を生じさせるために送達した目的遺伝子の直接効果のみを実現する、アグロバクテリウム属の種の「安全化した」株を開発した。
しかし、いくつかの理由で、遺伝子導入および形質転換植物は必ずしも望ましいわけではない。第１に、植物形質転換は手間のかかるプロセスであり、植物生殖系列組織の形質転換の成功頻度は低い。植物におけるトランスジェニック遺伝子発現の成功は、近隣遺伝子の発現および植物ゲノム内への導入遺伝子挿入物のコピー数によって影響を受け得る。第２に、遺伝子導入の従来のプロセスは、環境ストレス、有害生物、または病原体に対するリアルタイム応答を容易にしない。その代わりに、このプロセスは研究室設定において行われ、したがって、時間的刺激に対する動的応答として使用することができない。第３に、異種ＤＮＡを有する形質転換させたゲノムが植物からの収穫物質中（たとえば収穫した果実または野菜中）に存在する場合があり、ほとんどの市場において、生じた食用食品中にはそのような形質転換させたＤＮＡが存在しないという要求がある。さらに、トランスジェニック植物からの花粉を環境中に存在させないという要求がある。
したがって、異種ＤＮＡを植物全体内に導入せずに、標的植物に１つまたは複数の所望の形質を与えることができる方法の必要性がある。
本発明の一態様は、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと目的ポリヌクレオチドとを含む共生生物形成接種材料であって、植物ホルモン生合成酵素が少なくとも１つのサイトカイン生合成酵素および／またはオーキシン生合成酵素である、共生生物形成接種材料を提供する。
第２の態様は、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと目的ポリヌクレオチドとを含みそれを発現する植物細胞を含む共生生物であって、植物ホルモン生合成酵素が少なくとも１つのサイトカイニン生合成酵素および／またはオーキシン生合成酵素であり、共生生物の植物細胞が自律的に分裂する、共生生物を提供する。一部の態様では、植物細胞は少なくとも２個の細胞を含む。
本発明の第３の態様は、細胞内に、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと目的ポリヌクレオチドとを導入するステップ、または、目的ポリヌクレオチドを含むトランスジェニック細胞内に植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドを導入するステップを含む、共生生物形成接種材料を生成する方法であって、植物ホルモン生合成酵素が少なくとも１つのサイトカイニン生合成酵素および／またはオーキシン生合成酵素であり、それによって共生生物形成接種材料を生成する方法を提供する。
本発明の第４の態様は、共生生物形成接種材料を生成する方法であって、（ａ）（ｉ）植物（もしくはその一部（たとえば外植片））上の少なくとも１つの部位（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくはそれより多く）内／上に、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと目的ポリヌクレオチド配列とを導入する、またはそれ（たとえば植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと目的ポリヌクレオチド配列と）を含む植物細胞／細菌細胞を、植物（もしくはその一部）上の少なくとも１つの部位上に移植／接種する、あるいは、（ｉｉ）植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドを、植物（もしくはその一部）上の少なくとも１つの部位内／上に導入する、またはそれを含む植物細胞／細菌細胞を、植物（もしくはその一部）上の少なくとも１つの部位上に移植／接種するステップであって、（ｉｉ）の植物（またはその一部）が目的ポリヌクレオチド配列を含み、（ａ）の植物ホルモン生合成酵素が少なくとも１つのサイトカイニン生合成酵素および／またはオーキシン生合成酵素であり、それによって、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと目的ポリヌクレオチド配列とを含む植物（またはその一部）上の共生生物を生成するステップと、（ｂ）１つまたは複数の細胞（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個、またはそれより多くの細胞）を植物上の共生生物から選択して、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと目的ポリヌクレオチド配列とを含む１つまたは複数の細胞を提供し、それによって共生生物形成接種材料を生成するステップとを含む方法を提供する。
本発明の第５の態様は、宿主植物ゲノムを改変させずに宿主植物特徴を改変させる方法であって、本発明の共生生物形成接種材料または本発明の共生生物を宿主植物上の少なくとも１つの部位（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０箇所、またはそれより多くの部位）上に移植するステップと、共生生物形成接種材料または共生生物を宿主植物の少なくとも１つの部位で培養して、共生生物を宿主植物上の少なくとも１つの部位で形成させるステップとを含み、目的ポリヌクレオチドが宿主植物上の共生生物中で発現され、目的ポリヌクレオチドの発現産物および／または目的ポリヌクレオチドの発現産物を使用して作られた生成物が宿主植物内に輸送され、それによって宿主植物特徴を改変させる、方法を提供する。
本発明の第６の態様は、生体分子または生物活性分子を生成する方法であって、目的ポリヌクレオチドが生物活性分子をコードしている本発明の共生生物を提供し、共生生物によって生成された生物活性分子を収集するステップ、ならびに／または目的ポリヌクレオチドが生物活性分子をコードしている本発明の宿主植物を提供し、共生生物および宿主植物中で生成された生物活性分子を収集するステップを含む方法を提供する。
本発明の第７の態様は、目的化合物を宿主植物に送達する方法であって、宿主植物上の少なくとも１つの部位（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０箇所、またはそれより多くの部位）上に、本発明の共生生物形成接種材料または本発明の共生生物を移植するステップと、共生生物形成接種材料または共生生物を宿主植物の少なくとも１つの部位で培養して、共生生物を宿主植物上の少なくとも１つの部位で形成させるステップとを含み、目的ポリヌクレオチドが共生生物中で発現され、目的ポリヌクレオチドの発現産物および／または目的ポリヌクレオチドの発現産物を使用して作られた生成物が宿主植物内に輸送され、それによって目的化合物が植物に送達される方法を提供する。
本発明の第８の態様は、宿主植物の遺伝子型を改変させずに改変された特徴（複数可）を含む宿主植物を生成する方法であって、宿主植物上の少なくとも１つの部位（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０箇所、またはそれより多くの部位）上に、本発明の共生生物形成接種材料または本発明の共生生物を移植するステップと、共生生物形成接種材料または共生生物を宿主植物の少なくとも１つの部位で培養して、共生生物を宿主植物上の少なくとも１つの部位で形成させるステップとを含み、目的ポリヌクレオチドが共生生物中で発現され、目的ポリヌクレオチドの発現産物および／または目的ポリヌクレオチドの発現産物を使用して作られた生成物が宿主植物内に輸送され、それによって、改変された遺伝子型を含まない、改変された表現型を含む植物を生じる、方法を提供する。
本発明の方法によって生成した共生生物形成接種材料、共生生物、宿主植物、植物や細胞および／またはプロトプラスト、ならびに、本方法を実施するための、それを含む核酸、発現カセット、およびベクターをさらに提供する。
本発明のこれらおよび他の態様を、以下の本発明の説明においてより詳細に記載する。
同時接種および単一株接種（アグロバクテリウム属）を使用した共生生物の形成、ならびに植物ホルモン生成（ＰＨ）および目的ポリヌクレオチド（ＰＯＩ）をコードしている遺伝子を植物細胞内に送達する遺伝子銃方法を実証する図である。 少なくとも１つの植物ホルモンポリペプチド（植物成長調節物質（ＰＧＲ）発現カセット）および目的ポリヌクレオチド（ＰＯＩ）をコードしているプラスミドマップ（「ｐＳＹＭ」）の例を示す図である。ＡｓｃＩ、ＸｍａＩ、およびＳｐｅＩは制限部位であり、ＮｏｓＴはノパリン合成酵素ターミネーターであり、Ｋａｎはカナマイシン選択マーカーを表す。 共生生物を作製するための様々な経路の例の説明図である。ＤＮＡ送達は、たとえば、細菌、照射、電気穿孔、ウィスカー、プロトプラスト融合などの任意の方法を使用して行うことができる。「活性組織」は、植物ホルモン（ＰＨ）遺伝子を用いて不死化された組織であり、「混合培養物」は、様々な異なる遺伝子挿入物および発現を有する細胞のコレクションであり、「共生生物形成接種材料」は、植物上に共生生物を形成させるために使用し得る接種材料であり（たとえば、ＤＮＡ、細菌細胞、植物細胞など）、共生生物は、ＰＨ遺伝子（複数可）および目的ポリヌクレオチド（複数可）（ＰＯＩ）を両方有する、任意選択で植物上に位置する植物組織（たとえば１つまたは複数の植物細胞）である。 接種後６０日後の、柑橘類上の共生生物の形成を示す図である。パネルＡおよびＢは、同時接種（たとえば複数のアグロバクテリウム属の株）を使用して形成された共生生物を示す。パネルＣおよびＤは、単一株接種を使用して形成された共生生物を示す。 アグロバクテリウム属の種を用いた接種技法の例を示す図である。パネルＡは、ミカン属（Ｃｉｔｒｕｓ）に対するピンセットの使用を示す。パネルＢおよびＣは、トマト植物に対して２種類の針の例、すなわち入れ墨針（パネルＢ）および皮下注射針（パネルＣ）の使用を示す。 様々な作物種上の共生生物の例を示す図である。パネルＡ、ペカン。パネルＢ、トマト。パネルＣ、ミカン属。パネルＤ、タバコ（ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ））。 高レベルのｍＣｈｅｒｒｙ生成を示す、固体培地上で成長中の共生生物形成接種材料（植物カルス組織の形態）を示す図である。 固体培地（パネルＡおよびＢ）ならびに液体培地（パネルＣおよびＤ）上で成長させた、様々な種類の共生生物形成接種材料の例を示す図である。トマト（パネルＡおよびＣ）ならびにミカン属（パネルＢおよびＤ）である。 ミカン属上の１週間および６週間での共生生物移植物（パネルＡおよびＢ）ならびにトマト上の２週間および６週間での共生生物移植物（パネルＤおよびＥ）の例を示す図である。パネルＣおよびＦは、移植した柑橘類共生生物の維管束新生（Ｃ）および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の生成（パネルＦ）を例示する。シリコンテープ（パネルＡ）またはパラフィルム（パネルＤ）を、移植部位での湿度を制御するために最初に使用する。 目的生成物（複数可）をコードしている複数の（たとえば「スタッキングした」）目的ポリヌクレオチド（ＰＯＩ）を有するプラスミドの例のプラスミドマップを示す図である。 共生生物スタッキングおよびＰＯＩスタッキングの例を示す図である。トマト上の複数の個々の小さなＧＦＰ ｐＳＹＭの自己蛍光（パネルＡ）およびＧＦＰ蛍光（パネルＢ）である。パネルＣ～Ｅは、単一の植物上の、異なる目的ポリヌクレオチド（ＰＯＩ）を有する２つのｐＳＹＭプラスミドのスタッキングを示す：自己蛍光（パネルＣ）、ｍＣｈｅｒｒｙ（パネルＤ）、およびＧＦＰ（パネルＥ）。パネルＦ～Ｈは、単一のｐＳＹＭ中の複数の目的ポリヌクレオチド（ＰＯＩ）のスタッキングを示す：自己蛍光（パネルＦ）、ｍＣｈｅｒｒｙ（パネルＧ）、ＧＦＰ（パネルＨ）。 高レベルの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するトマトおよび柑橘類の共生生物を示す図である。パネルＡ。トマトの共生生物中のＧＦＰタンパク質の蓄積は、裸眼で見ることができるようなレベルである。パネルＢおよびＣは、単一株接種（アグロバクテリウム属の種）で確立した柑橘類の共生生物の断面を示す。矢印は、共生生物内の高いＧＦＰの蓄積の領域を示す。 ウエスタンブロット検出方法を使用した、トマト上に単一株接種（アグロバクテリウム属の種）を使用して形成した共生生物中で生成されたｍＣｈｅｒｒｙの免疫検出を示す図である。ｍＣｈｅｒｒｙは元のタンパク質抽出物の１０－７希釈まで検出可能であった。 トマト植物上の、ｍＣｈｅｒｒｙ開花（ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｔ）タンパク質をコードしている目的ポリヌクレオチドを含有する共生生物の顕微鏡図である。パネルＡは、共生生物組織内に伸び始めている成長中の植物維管束組織のＵＶ自己蛍光を示す。パネルＢは、共生生物内でのＲｅｄ ｍＣｈｅｒｒｙの生成および蓄積ならびに共生生物組織内へと成長した維管束組織中の蓄積を示す。パネルＣは、共生生物中で発生中の維管束組織を示す。パネルＤは、共生生物外のｍＣｈｅｒｒｙタンパク質の輸出を実証する、茎維管束組織中のｍＣｈｅｒｒｙ蛍光検出を示す。 ＰＯＩ生成物の輸出を例示する、トマト茎のＧＦＰを発現する共生生物の１～２ｃｍ上を示す断面である。矢印はＧＦＰの蓄積を示す。 どちらもｍＣｈｅｒｒｙタンパク質生成をコードしているポリヌクレオチドを含有する２つの付着した共生生物を有するトマト宿主植物の、様々な部分におけるｍＣｈｅｒｒｙの検出を示す図である。パネルＡ：共生生物１、パネルＢ：共生生物１の上の茎、パネルＣ：共生生物２、パネルＤ：共生生物２の上の茎、パネルＥ：共生生物１の下、パネルＦ：共生生物２の下、パネルＧ：対照。 共生生物のみが遺伝学的に形質転換していることを例示する、共生生物（「Ｓｙｍ」）対トマト宿主植物の茎における、目的ポリヌクレオチド（ＧＦＰ、ＧＦＰ＋）のＰＣＲ検出を示す図である。「ＧＦＰ＋」は、分泌経路標的化配列（小胞体（ＥＲ）標的化配列）と連結させたＧＦＰである。 トマトの共生生物における柑橘類ＦＬＯＷＥＲ ＬＯＣＵＳ Ｔ遺伝子（ＦＴ３）の発現は、野生型アグロバクテリウム属の種のみを接種したトマト（パネルＢ）と比較して、宿主植物（パネルＡ）の矮化を誘導する。 カンキツグリーニングの病因であるカンジダタス・リベリバクター・アシアティカス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ ａｓｉａｔｉｃｕｓ）に感染したシトロン植物を示す図である。パネルＡ、Ｃ、およびＥは、抗微生物ペプチドを生成する共生生物を有するシトロンを例示する。パネルＢ、Ｄ、およびＦは、対照として野生型アグロバクテリウム属の種を有するシトロンである。 同時接種によって４カ月齢の共生生物が宿主柑橘類植物上に形成された（図１９を参照）、オンコシンがＥＲ標的化配列に作動可能に連結して（オンコシン＋）抗微生物ペプチドのオンコシンを発現する柑橘類の葉における、野生型アグロバクテリウム属の種を接種した柑橘類と比較したカンジダタス・リベリバクター・アシアティカス（ＣＬａｓ）のパーセント相対的低下を示す図である。 カンジダタス・リベリバクター・アシアティカス（ＣＬａｓ）に対する目的生成物の発現の有効性を例示するグラフである。野生型アグロバクテリウム属の種を接種した組織と比較した、シグナル配列を有する（＋）および有さない、抗微生物ペプチド（オンコシンまたはＴＭＯＦ）を発現する共生生物組織中におけるＣＬａｓのパーセント相対的低下を示す。ＧＦＰ＋は、シグナル配列を有する、抗微生物ペプチドを有さない、緑色開花（ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｔ）タンパク質を発現する組織である。ＴＭＯＦ＝トリプシン変調卵形成阻害因子。 ベンサミアナタバコにおいてエフェクターによって始動される免疫を誘導することが以前に示されている細菌エフェクタータンパク質をコードしている目的ポリヌクレオチドを含む共生生物形成接種材料を同時接種した、タバコ（ベンサミアナタバコ）を示す図である。パネルＡ、接種前の健康な植物。パネルＢ、接種の１週間後であり、下の矢印が接種部位を示す。パネルＣ。接種の２週間後の植物の死。
本明細書中では以降、本発明の実施形態を示す添付の図面および実施例を参照して本発明を説明する。この説明は、本発明を実行し得るあらゆる様々な方法、または本発明に付加し得るあらゆる特長の詳細なカタログであることを意図しない。たとえば、１つの実施形態に関して例示した特長を他の実施形態に取り込んでもよく、特定の実施形態に関して例示した特長をその実施形態から削除してもよい。したがって、本発明の一部の実施形態では、本発明は、本明細書中に記載の任意の特長または特長の組合せを排除または省略することができることを企図する。さらに、本明細書中で示唆した様々な実施形態の数々の変形およびそれへの付加は、本開示に鑑みて当業者には明らかであろうし、本発明から逸脱しない。したがって、以下の説明は一部の特定の本発明の実施形態を例示することを意図し、そのすべての順列、組合せ、および変形を網羅的に指定するものではない。
本明細書中で使用する単語「例示的な」とは、「例、事例、または例示として役割を果たす」ことを意味する。本明細書中に記載した実施形態は限定するものではなく、むしろ例示的でしかない。記載した実施形態は、必ずしも他の実施形態を越えて好ましいまたは有利であるとして解釈されるべきでないことを理解されたい。さらに、用語「本発明の実施形態」、「実施形態」、または「発明」は、本発明のすべての実施形態が記述した特長、利点、または操作様式を含むことを必要としない。
別段に定義しない限りは、本明細書中で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の技術者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中の本発明の説明において使用する用語は、特定の実施形態を説明する目的のみのためであり、本発明を限定することを意図しない。
本明細書中で引用したすべての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参考文献が提示されている文および／または段落に関連する教示のために、その全体で参考として組み込まれている。
本公開中における商品名または商品の言及は、具体的な情報を提供する目的のみのためであり、米国農務省による推奨または保証を暗示しない。
内容によりそうでないと指示されない限りは、本明細書中に記載の本発明の様々な特長を任意の組合せで使用することができることが具体的に意図される。さらに、本発明の一部の実施形態では、本発明は、本明細書中に記載の任意の特長または特長の組合せを排除または省略することができることも企図する。例示すると、明細書が、組成物が構成成分Ａ、Ｂ、およびＣを含むと記述している場合、Ａ、Ｂ、もしくはＣのうちの任意のもの、またはその組合せを省略し、単独でまたは任意の組合せで拒否できることが具体的に意図される。
本発明の説明および添付の特許請求の範囲中で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、内容によりそうでないと明白に指示されない限りは複数形も含むことを意図する。
また、本明細書中で使用する「および／または」とは、関連する列挙した事項のうちの１つまたは複数の任意かつすべての可能な組合せ、また、代替（「または」）で解釈した場合は組合せの欠如をいい、それを包含する。
本明細書中で使用する用語「約」とは、量または濃度などの測定可能な値に言及する場合、指定した値の±１０％、±５％、±１％、±０．５％、またはさらには±０．１％の変形、および指定した値を包含することを意味する。たとえば、Ｘが測定可能な値である場合の「約Ｘ」とは、Ｘ、およびＸの±１０％、±５％、±１％、±０．５％、またはさらには±０．１％の変形を含むことを意味する。測定可能な値について本明細書中で提供した範囲は、任意の他の範囲および／またはそれ中の個々の値を含み得る。
「Ｘ～Ｙ」および「約Ｘ～Ｙ」などの本明細書中で使用する語句は、ＸおよびＹを含むと解釈されるべきである。「約Ｘ～Ｙ」などの本明細書中で使用する語句は「約Ｘ～約Ｙ」を意味し、「約Ｘ～Ｙ」などの語句は「約Ｘ～約Ｙ」を意味する。
本明細書中の値の範囲の列挙は、本明細書中で別段に指定しない限りは、単に、範囲内にあるそれぞれの別個の値に個々に言及することの略式方法として役割を果たすことを意図し、それぞれの別個の値は、本明細書中に個々に列挙されているかのように、明細書に組み込まれている。たとえば、範囲１０～１５が開示されている場合、１１、１２、１３、および１４も開示されている。
本明細書中で使用する用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記述した特長、整数、ステップ、操作、要素、および／または構成成分の存在を指定するが、１つまたは複数の他の特長、整数、ステップ、操作、要素、構成成分、および／またはその群の存在または追加を除外しない。
本明細書中で使用する移行句「から本質的になる」とは、特許請求の範囲の範囲が、特許請求の範囲中に列挙した指定した材料またはステップ、および特許請求した発明の基本特長および新規特徴（複数可）に実質的な影響を与えないものを包含すると解釈されるべきであることを意味する。したがって、本発明の特許請求の範囲において使用した場合、用語「から本質的になる」は、「含むこと」と等価であると解釈されることを意図しない。
「任意選択の」または「任意選択で」とは、続いて記載した事象または状況が起こっても起こらなくてもよく、また、説明は前記事象または状況が起こる事例および起こらない事例を含むことを意味する。たとえば、語句「Ｘを任意選択で含むこと」とは、組成物がＸを含有していても含有していなくてもよいことを意味する。
本明細書中で使用する用語「増加する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」、「増加すること（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ）」、「増加した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」、「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ）」、「増強した（ｅｎｈａｎｃｅｄ）」、「増強すること（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ）」、および「増強」（ならびにその文法上の変形）は、対照と比較した、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれより高い上昇を説明する。たとえば、改変された特徴を有する宿主植物は、害虫に対して増加した耐容を示す、または耐性が増加していてよく、増加した耐容または耐性は、対照植物と比較して約５％～約５００％増加している。
本明細書中で使用する用語「低下する（ｒｅｄｕｃｅ）」、「低下した（ｒｅｄｕｃｅｄ）」、「低下すること（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）」、「低下」、「減弱する（ｄｉｍｉｎｉｓｈ）」、および「減少する（減少ｅ）」（ならびにその文法上の変形）は、たとえば、対照と比較した、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％の減少を説明する。特定の実施形態では、低下は、検出可能な活性または量が存在しないまたは本質的に存在しないこと（すなわち有意でない量、たとえば約１０％未満、またはさらには５％未満）をもたらす場合がある。
核酸分子および／またはヌクレオチド配列（たとえばＲＮＡまたはＤＮＡ）に関して本明細書中で使用する用語「発現する（ｅｘｐｒｅｓｓ）」、「発現する（ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ）」、「発現された（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）」、または「発現」などは、核酸分子および／またはヌクレオチド配列が転写され、任意選択で翻訳されていることを示す。したがって、核酸分子および／またはヌクレオチド配列は、目的ポリペプチド、またはたとえば機能的な非翻訳のＲＮＡを発現し得る。
「異種」または「組換え」ヌクレオチド配列とは、それが内部に導入される宿主細胞と天然で関連していないヌクレオチド配列であり、天然に存在するヌクレオチド配列の、天然に存在しない複数コピーを含む。したがって、本明細書中で使用する用語「異種」とは、外来種に由来する、または、もし同じ種由来の場合は、意図的な人の介入によって組成および／もしくはゲノム座位がそのネイティブ形態から実質的に改変されている、ヌクレオチド／ポリペプチドをいう。一例として、異種ポリヌクレオチドは、生物に固有であるが、異種プロモーターと作動可能に連結しているヌクレオチド配列をコードしていてよく、それによって異種ポリヌクレオチドが提供される。
「ネイティブ」または「野生型」の核酸、ヌクレオチド配列、ポリペプチド、またはアミノ酸配列とは、天然に存在するまたは内在性の核酸、ヌクレオチド配列、ポリペプチド、またはアミノ酸配列をいう。
本明細書中で使用する用語「核酸」、「核酸分子」、「ヌクレオチド配列」、および「ポリヌクレオチド」とは、直鎖状もしくは分枝状、一本鎖もしくは二本鎖、またはそのハイブリッドである、ＲＮＡまたはＤＮＡをいう。この用語はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドも包含する。ｄｓＲＮＡを合成生成する際、イノシン、５－メチルシトシン、６－メチルアデニン、ヒポキサンチンなどのあまり一般的でない塩基もアンチセンス、ｄｓＲＮＡ、およびリボザイムの対合に使用することができる。たとえば、ウリジンおよびシチジンのＣ－５プロピン類似体を含有するポリヌクレオチドは、高い親和性でＲＮＡと結合すること、および遺伝子発現の強力なアンチセンス阻害剤であることが示されている。リン酸ジエステル主鎖またはＲＮＡのリボース糖基中の２’－ヒドロキシへの修飾などの、他の修飾も行うことができる。
本明細書中で使用する用語「ヌクレオチド配列」とは、核酸分子の５’から３’末端へのヌクレオチドのヘテロポリマーまたはこれらのヌクレオチドの配列をいい、いずれも一本鎖または二本鎖であることができる、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ断片または一部分、ゲノムＤＮＡ、合成（たとえば化学合成）ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびアンチセンスＲＮＡを含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含む。用語「ヌクレオチド配列」、「核酸」、「核酸分子」、「核酸構築体」、「オリゴヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」も、ヌクレオチドのヘテロポリマーをいうために本明細書中で互換性があるように使用される。本明細書中に提供する核酸分子および／またはヌクレオチド配列は、５’から３’の方向で、左から右に本明細書中で提示し、米国配列規則、米国特許法施行規則第１．８２１～１．８２５条、および世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５に記載されているように、ヌクレオチド文字を表すための標準コードを使用して表されている。本明細書中で使用する「５’領域」とは、ポリヌクレオチドの５’末端に最も近いポリヌクレオチド領域を意味することができる。したがって、たとえば、ポリヌクレオチドの５’領域中の要素は、ポリヌクレオチドの５’末端に位置する最初のヌクレオチドから、ポリヌクレオチドの半ばに位置するヌクレオチドまでのいずれかの場所に位置することができる。本明細書中で使用する「３’領域」とは、ポリヌクレオチドに３’末端に最も近いポリヌクレオチド領域を意味することができる。したがって、たとえば、ポリヌクレオチドの３’領域中の要素は、ポリヌクレオチドの３’末端に位置する最初のヌクレオチドからポリヌクレオチドの半ばに位置するヌクレオチドまでのいずれかの場所に位置することができる。
核酸に関して本明細書中で使用する用語「断片」または「一部分」とは、参照核酸に対して長さが減って（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、もしくは９００個、またはそれより多くのヌクレオチド、あるいはそれ中の任意の範囲または値が減って）おり、参照核酸の対応する一部分と同一またはほぼ同一（たとえば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一）である連続的なヌクレオチドヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、および／またはそれからなる、核酸をいう。そのような核酸断片は、適切な場合は、構成要素であるより大きなポリヌクレオチド中に含め得る。
ポリペプチドに関して本明細書中で使用する用語「断片」または「一部分」とは、参照ポリペプチドに対して長さが減っており、参照ポリペプチドの対応する一部分と同一またはほぼ同一（たとえば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一）である連続的なアミノ酸のアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、および／またはそれからなる、ポリペプチドをいい得る。そのようなポリペプチド断片は、適切な場合は、構成要素であるより大きなポリペプチド中に含め得る。一部の実施形態では、ポリペプチド断片は、参照ポリペプチドの少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０個、またはそれより多くの連続したアミノ酸を含む、それから本質的になる、またはからなる。以下、以下の実施例を参照して本発明を記載する。これらの実施例は、本発明の特許請求の範囲の範囲を限定することを意図せず、むしろ、特定の実施形態の例示的なものであることを意図することを理解されたい。当業者が思い浮かぶ、例示した方法の任意の変形が本発明の範囲内にあることを意図する。
核酸に関して本明細書中で使用する用語「機能的断片」とは、ポリペプチドの機能的断片をコードしている核酸をいう。
本明細書中で使用する用語「遺伝子」とは、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、抗マイクロＲＮＡアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＡＭＯ）などを生成するために使用することができる核酸分子をいう。遺伝子は、機能的なタンパク質または遺伝子産物を産生するために使用することができる場合も、できない場合もある。遺伝子は、コードおよび非コード領域の両方（たとえば、イントロン、調節要素、プロモーター、エンハンサー、終止配列、ならびに／または５’および３’非翻訳領域）を含むことができる。遺伝子は「単離」されていてよく、これは、その天然の状態において通常は核酸に関連して見つかる構成成分を実質的または本質的に含まない核酸を意味する。そのような構成成分としては、他の細胞物質、組換え生成からの培養培地、および／または核酸の化学合成において使用する様々な化学薬品が挙げられる。
用語「突然変異」とは、点突然変異（たとえば、ミスセンスもしくはナンセンス、またはフレームシフトをもたらす単一塩基対の挿入もしくは欠失）、挿入、欠失、および／あるいは切断をいう。突然変異が、アミノ酸配列内の残基の別の残基での置換、または配列内の１つもしくは複数の残基の欠失もしくは挿入である場合、突然変異は、典型的には、元の残基を同定すること、次いで配列内の残基の位置、次いで新しく置換された残基が何であるかによって記載する。切断は、ポリペプチドのＣ末端またはポリペプチドのＮ末端での切断を含むことができる。ポリペプチドの切断は、ポリペプチドをコードしている遺伝子の対応する５’末端または３’末端の欠失の結果であることができる。フレームシフト突然変異は、１つまたは複数の塩基対の欠失または挿入が遺伝子内に導入された場合に起こることができる。遺伝子中のフレームシフト突然変異は、遺伝子の突然変異させた領域の後で最初のストップコドンがいつ生じるかに応じて、野生型ポリペプチドよりも長い、短い、またはそれと同じ長さであるポリペプチドの生成をもたらす場合がある。欠失は、プロモーターなどの遺伝子の非コード部分中の突然変異を引き起こす場合がある。
本明細書中で使用する用語「相補的」または「相補性」とは、許容的な塩および温度の条件下における、塩基対合によるポリヌクレオチドの天然の結合をいう。たとえば、配列「Ａ－Ｇ－Ｔ」（５’から３’）は相補的配列「Ｔ－Ｃ－Ａ」（３’から５’）と結合する。２つの一本鎖分子間の相補性は、ヌクレオチドの一部のみが結合する「部分的」であってよい、または一本鎖分子間に完全な相補性が存在する場合は完全であってよい。核酸鎖間の相補性の度合は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に対して顕著な影響を与える。
本明細書中で使用する「相補する」とは、比較ヌクレオチド配列との１００％の相補性を意味することができる、または、比較ヌクレオチド配列に対して１００％未満の相補性（たとえば、約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％などの相補性）を意味することができる。
相同性を有する様々な核酸またはタンパク質が本明細書中で「相同体」と呼ばれる。用語、相同体は、同じ種および他の種由来の相同配列、ならびに同じ種および他の種由来のオーソロガス配列を含む。「相同性」とは、位置的同一性のパーセント（すなわち配列類似度または同一性）に関する、２つ以上の核酸および／またはアミノ酸配列間の類似度のレベルをいう。相同性とは、様々な核酸またはタンパク質間の類似の機能的特性の概念もいう。したがって、本発明の組成物および方法は、本発明のヌクレオチド配列およびポリペプチド配列に対する相同体をさらに含む。本明細書中で使用する「オーソロガス」とは、共通の先祖遺伝子から種分化中に生じた、異なる種中における相同的なヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列をいう。本発明のヌクレオチド配列の相同体は、本発明の前記ヌクレオチド配列に対して実質的な配列同一性（たとえば、少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）を有する。
本明細書中で使用する「配列同一性」とは、２つの最適にアラインメントされたポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が、構成成分、たとえばヌクレオチドまたはアミノ酸のアラインメントウィンドウ全体にわたって不変である程度をいう。「同一性」は、それだけには限定されないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）、ならびにＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載されているものを含む、既知の方法によって容易に計算することができる。
本明細書中で使用する用語「パーセント配列同一性」または「パーセント同一性」とは、２つの配列が最適にアラインメントされている場合に、参照（「クエリー」）ポリヌクレオチド分子の直鎖状ポリヌクレオチド配列（またはその相補鎖）中の、試験（「対象」）ポリヌクレオチド分子（または相補鎖）と比較した同一ヌクレオチドの百分率をいう。一部の実施形態では、「パーセント配列同一性」とは、参照ポリペプチドと比較した、アミノ酸配列中の同一アミノ酸の百分率をいうことができる。
２つの核酸分子、ヌクレオチド配列、またはポリペプチド配列、のコンテキストにおいて本明細書中で使用する語句「実質的に同一」または「実質的な同一性」とは、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用してまたは目視検査によって測定して、比較および最大一致についてアラインメントした場合に、少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有する、２つ以上の配列または部分配列をいう。本発明の一部の実施形態では、実質的な同一性は、長さが約１０個のヌクレオチド～約２０個のヌクレオチド、約１０個のヌクレオチド～約２５個のヌクレオチド、約１０個のヌクレオチド～約３０個のヌクレオチド、約１５個のヌクレオチド～約２５個のヌクレオチド、約３０個のヌクレオチド～約４０個のヌクレオチド、約５０個のヌクレオチド～約６０個のヌクレオチド、約７０個のヌクレオチド～約８０個のヌクレオチド、約９０個のヌクレオチド～約１００個のヌクレオチド、約１００個のヌクレオチド～約２００個のヌクレオチド、約１００個のヌクレオチド～約３００個のヌクレオチド、約１００個のヌクレオチド～約４００個のヌクレオチド、約１００個のヌクレオチド～約５００個のヌクレオチド、約１００個のヌクレオチド～約６００個のヌクレオチド、約１００個のヌクレオチド～約８００個のヌクレオチド、約１００個のヌクレオチド～約９００個のヌクレオチド、もしくはそれより多い、または配列の完全長までのそれ中の任意の範囲である、本発明のヌクレオチド配列の連続したヌクレオチドの領域にわたって存在する。
配列比較では、典型的には、一方の配列が、試験配列をそれに対して比較する参照配列としての役割を務める。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要な場合は部分配列の座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。その後、指定したプログラムパラメータに基づいて、配列比較アルゴリズムが、参照配列に対する試験配列（複数可）のパーセント配列同一性を計算する。
比較ウィンドウをアラインメントするための配列の最適アラインメントは当業者に周知であり、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性アラインメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似度検索方法などのツールによって、ならびに、任意選択で、ＧＣＧ（登録商標）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（登録商標）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）の一部として利用可能なＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡなどの、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行によって実施し得る。試験配列および参照配列のアラインメントされたセグメントの「同一性分率」とは、２つのアラインメントされた配列によって共有される同一構成成分の数を、参照配列セグメント、たとえば、参照配列全体または参照配列のより小さな定義された部分中の構成成分の総数で除算したものである。パーセント配列同一性は、同一性分率に１００を乗算したものとして表される。１つまたは複数のポリヌクレオチド配列の比較は、完全長ポリヌクレオチド配列もしくはその一部分に対するもの、またはより長いポリヌクレオチド配列に対するものであり得る。本発明の目的のために、「パーセント同一性」は、翻訳されたヌクレオチド配列にはＢＬＡＳＴＸバージョン２．０、ポリヌクレオチド配列にはＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を使用しても決定し得る。
２つのヌクレオチド配列はまた、２つの配列がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズする場合に、実質的に相補的であるとみなし得る。一部の実施形態では、２つのヌクレオチド配列は、高度にストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズする場合に、実質的に相補的であるとみなされる。
サザンおよびノーザンハイブリダイゼーションなどの核酸ハイブリダイゼーション実験のコンテキストにおける「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存的であり、様々な環境パラメータの下で異なる。核酸のハイブリダイゼーションの幅広いガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ ｐａｒｔ Ｉ ｃｈａｐｔｅｒ ２「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ」Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）中に見つかる。一般に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、特定の配列について、定義されたイオン強度およびｐＨにおいて熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。
Ｔｍとは、標的配列の５０％が完全に一致したプローブとハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度およびｐＨ下のもの）である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブについてＴｍと等しくなるように選択される。サザンまたはノーザンブロットにおいてフィルター上に１００個を超える相補的残基を有する相補的ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、１ｍｇのヘパリンを有する５０％のホルムアミドで４２℃であり、ハイブリダイゼーションを終夜実施する。高度にストリンジェントな洗浄条件の一例は、０．１５ＭのＮａＣｌを７２℃で約１５分間である。ストリンジェントな洗浄条件の一例は、０．２×ＳＳＣ洗浄を６５℃で１５分間である（ＳＳＣ緩衝液の説明にはＳａｍｂｒｏｏｋ、上記を参照）。しばしば、バックグラウンドプローブシグナルを除去するために、高ストリンジェンシーの洗浄に先行して低ストリンジェンシーの洗浄を行う。たとえば１００個を超えるヌクレオチドの二重鎖中程度ストリンジェンシーの洗浄の一例は、１×ＳＳＣを４５℃で１５分間である。たとえば１００個を超えるヌクレオチドの二重鎖低ストリンジェンシーの洗浄の一例は、４～６×ＳＳＣを４０℃で１５分間である。短いプローブ（たとえば約１０～５０個のヌクレオチド）には、ストリンジェントな条件は、典型的には、約１．０Ｍ未満のＮａイオンの塩濃度、典型的には約０．０１～１．０ＭのＮａイオン濃度（または他の塩）、ｐＨ７．０～８．３を含み、温度は典型的には少なくとも約３０℃である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加を用いて達成することもできる。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて非関連のプローブについて観察されるものよりも２倍の（またはそれより高い）信号対雑音比が、特異的ハイブリダイゼーションの検出を示す。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしないヌクレオチド配列は、それらがコードしているタンパク質が実質的に同一である場合は、依然として実質的に同一である。これは、たとえば、遺伝暗号によって許容される最大のコドン縮重を使用してヌクレオチド配列のコピーを作製する場合に起こることがある。
本発明の任意のポリヌクレオチドおよび／または組換え核酸分子は、任意の目的の種中での発現に最適化されたコドンであることができる。コドン最適化は当技術分野で周知であり、種特異的なコドン使用頻度表を使用した、コドン使用頻度バイアスのためのヌクレオチド配列の改変を含む。コドン使用頻度表は、目的の種について最も高度に発現される遺伝子の配列解析に基づいて作成される。ヌクレオチド配列を核中で発現させる場合、コドン使用頻度表は、目的の種について高度に発現される核遺伝子の配列解析に基づいて作成される。ヌクレオチド配列の改変は、種特異的コドン使用頻度表をネイティブポリヌクレオチド配列中に存在するコドンと比較することによって決定される。当技術分野において理解されるように、ヌクレオチド配列のコドン最適化は、ネイティブヌクレオチド配列と１００％未満の同一性（たとえば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％など）を有するが、それでも元のネイティブヌクレオチド配列によってコードされているものと同じ機能を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列をもたらす。したがって、本発明の一部の実施形態では、目的ポリヌクレオチドおよび／または植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび／またはそれを含む核酸構築体は、特定の目的の種における発現についてコドン最適化することができる。
一部の実施形態では、本発明の組換え核酸分子、ヌクレオチド配列、およびポリペプチドは「単離」されている。「単離された」核酸分子、「単離された」ヌクレオチド配列、または「単離された」ポリペプチドは、人の手によってそのネイティブ環境から離れて存在し、したがって天然の産物ではない、核酸分子、ヌクレオチド配列、またはポリペプチドである。単離された核酸分子、ヌクレオチド配列、またはポリペプチドは、天然に存在する生物またはウイルスの他の構成成分の少なくとも一部、たとえば、細胞もしくはウイルスの構造的構成成分、またはポリヌクレオチドと関連して一般的に見つかる他のポリペプチドもしくは核酸から少なくとも部分的に分離されている、精製形態で存在し得る。一部の実施形態では、単離された核酸分子、単離されたヌクレオチド配列、および／または単離されたポリペプチドは、少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれより高く純粋である。
一部の実施形態では、単離された核酸分子、ヌクレオチド配列、またはポリペプチドは、たとえば組換え宿主細胞などの非ネイティブ環境中に存在し得る。したがって、たとえば、ヌクレオチド配列に関して、用語「単離された」とは、それが天然に存在する染色体および／または細胞から分離されていることを意味する。ポリヌクレオチドはまた、それが天然に存在する染色体および／または細胞から分離されており、その後、それが天然に存在しない遺伝学的コンテキスト、染色体、および／または細胞（たとえば、自然で見つかるものとは異なる宿主細胞、異なる調節配列、および／または異なるゲノム中の位置）内に挿入されている場合にも、単離されている。したがって、組換え核酸構築体、ポリヌクレオチド、およびそれがコードしているポリペプチドは、人の手によってそのネイティブ環境から離れて存在し、したがって天然の産物ではない点で「単離」されているが、一部の実施形態では、これらは、組換え宿主細胞内に導入し、それ中において存在することができる。
本明細書中に記載した実施形態のうちの任意のものにおいて、本発明のポリヌクレオチドまたは核酸構築体は、植物および／または植物細胞中での発現のための様々なプロモーターおよび／または他の調節要素と作動可能に関連していてよい。したがって、一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドまたは核酸構築体は、１つまたは複数のヌクレオチド配列と作動可能に連結した１つまたは複数のプロモーター、イントロン、エンハンサー、および／またはターミネーターをさらに含み得る。
ポリヌクレオチドを参照して本明細書中で使用する「作動可能に連結した」または「作動可能に関連した」とは、示した要素が互いに機能的に関連しており、また一般に物理的にも関連していることを意味する。したがって、本明細書中で使用する用語「作動可能に連結した」または「作動可能に関連した」とは、機能的に関連している、単一の核酸分子上のヌクレオチド配列をいう。したがって、第２のヌクレオチド配列と作動可能に連結した第１のヌクレオチド配列とは、第１のヌクレオチド配列が第２のヌクレオチド配列と機能的関係に置かれている状況を意味する。たとえば、プロモーターがヌクレオチド配列の転写または発現をもたらす場合に、プロモーターは前記ヌクレオチド配列と作動可能に関連している。当業者には、制御配列（たとえばプロモーター）は、ヌクレオチド配列の発現を指示するよう機能する限りは、それが作動可能に関連しているヌクレオチド配列と必ずしも連続的である必要はないことが理解されよう。したがって、たとえば、介在する翻訳されないが転写される核酸配列がプロモーターとヌクレオチド配列との間に存在することができ、プロモーターはそれでもヌクレオチド配列と「作動可能に連結している」とみなすことができる。
ポリペプチドを参照して本明細書中で使用する用語「連結した」とは、１つのポリペプチドと別のものとの付着をいう。ポリペプチドは、別のポリペプチドと直接（たとえばペプチド結合を介して）またはリンカーを通じて、（Ｎ末端および／またはＣ末端で）連結していてよい。一例として、ポリペプチドは、標的化配列と、任意選択でＮ末端もしくはＣ末端または両方で連結していてよい。本明細書中で使用する「リンカー」とは、２つの分子または部分を連結させる化学基または分子をいい得る。
「プロモーター」とは、プロモーターと作動可能に関連したヌクレオチド配列（たとえばコード配列）の転写を制御または調節するヌクレオチド配列である。プロモーターによって制御または調節されるコード配列は、ポリペプチドおよび／または機能的ＲＮＡをコードしていていよい。典型的には、「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合部位を含有し、転写の開始を指示するヌクレオチド配列をいう。一般に、プロモーターは、対応するコード配列のコード領域の開始に対して５’側または上流に見つかる。プロモーターは、遺伝子発現の調節因子として役割を務める他の要素、たとえばプロモーター領域を含み得る。これらは、ＴＡＴＡボックスコンセンサス配列、およびしばしばＣＡＡＴボックスコンセンサス配列を含む（ＢｒｅａｔｈｎａｃｈおよびＣｈａｍｂｏｎ、（１９８１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５０：３４９）。植物では、ＣＡＡＴボックスはＡＧＧＡボックスによって置換されていてよい（Ｍｅｓｓｉｎｇら（１９８３）、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ、Ｔ．Ｋｏｓｕｇｅ、Ｃ．Ｍｅｒｅｄｉｔｈ、およびＡ．Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、ｐｐ．２１１～２２７）。
本発明で有用なプロモーターとしては、たとえば、組換え核酸分子、たとえば「合成核酸構築体」または「タンパク質－ＲＮＡ複合体」の調製において使用するための、構成的、誘導性、時間的に調節される、発達的に調節される、化学的に調節されるプロモーターを挙げることができる。これらの様々な種類のプロモーターは当技術分野で知られている。
プロモーターの選択肢は、発現のための時間的および空間的要件に応じて変動する場合があり、形質転換させる宿主細胞に基づいて変動する場合もある。多数の様々な生物のためのプロモーターは当技術分野で周知である。当技術分野において存在する幅広い知識に基づいて、適切なプロモーターを特定の目的宿主生物について選択することができる。したがって、たとえば、モデル生物中の高度に構成的に発現される遺伝子の上流にあるプロモーターに関して多くのことが知られており、必要に応じてそのような知識に容易にアクセスして、他の系において実行することができる。
一部の実施形態では、植物中で機能的なプロモーターを本発明の構築体で使用し得る。植物中で発現を駆動するために有用なプロモーターの非限定的な例としては、ＲｕｂｉｓＣｏ小サブユニット遺伝子１のプロモーター（ＰｒｂｃＳ１）、アクチン遺伝子のプロモーター（Ｐａｃｔｉｎ）、硝酸還元酵素遺伝子のプロモーター（Ｐｎｒ）、および重複炭酸脱水酵素遺伝子１のプロモーター（Ｐｄｃａ１）が挙げられる（Ｗａｌｋｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．、２３：７２７～７３５（２００５）、Ｌｉら、Ｇｅｎｅ、４０３：１３２～１４２（２００７）、Ｌｉら、Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．、３７：１１４３～１１５４（２０１０）を参照）。ＰｒｂｃＳ１およびＰａｃｔｉｎは構成的プロモーターであり、ＰｎｒおよびＰｄｃａ１は誘導性プロモーターである。Ｐｎｒはナイトレートによって誘導され、アンモニウムによって抑制され（Ｌｉら、Ｇｅｎｅ、４０３：１３２～１４２（２００７））、Ｐｄｃａ１は塩によって誘導される（Ｌｉら、Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．、３７：１１４３～１１５４（２０１０））。一部の実施形態では、本発明で有用なプロモーターはＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）プロモーターである。一部の実施形態では、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）由来のＵ６プロモーターまたは７ＳＬプロモーターが本発明の構築体で有用であり得る。一部の実施形態では、トウモロコシ由来のＵ６ｃプロモーターおよび／または７ＳＬプロモーターは、ガイド核酸の発現を駆動するために有用であり得る。一部の実施形態では、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）由来のＵ６ｃプロモーター、Ｕ６ｉプロモーター、および／または７ＳＬプロモーターが本発明の構築体で有用であり得る。一部の実施形態では、ダイズ由来のＵ６ｃプロモーター、Ｕ６ｉプロモーター、および／または７ＳＬプロモーターは、ガイド核酸の発現を駆動するために有用であり得る。
植物に有用な構成的プロモーターの例としては、それだけには限定されないが、ケストルム属（Ｃｅｓｔｒｕｍ）ウイルスプロモーター（ｃｍｐ）（米国特許第７，１６６，７７０号）、イネアクチン１プロモーター（Ｗａｎｇら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１２：３３９９～３４０６および米国特許第５，６４１，８７６号）、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ、３１３：８１０～８１２）、ＣａＭＶ １９Ｓプロモーター（Ｌａｗｔｏｎら（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、９：３１５～３２４）、ｎｏｓプロモーター（Ｅｂｅｒｔら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、８４：５７４５～５７４９）、Ａｄｈプロモーター（Ｗａｌｋｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：６６２４～６６２９）、スクロース合成酵素プロモーター（ＹａｎｇおよびＲｕｓｓｅｌｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：４１４４～４１４８）、ならびにユビキチンプロモーターが挙げられる。ユビキチンに由来する構成的プロモーターは多くの細胞種中に蓄積する。ユビキチンプロモーターは、トランスジェニック植物において使用するためにいくつかの植物種からクローニングされており、たとえば、ヒマワリ（Ｂｉｎｅｔら、１９９１．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ、７９：８７～９４）、トウモロコシ（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、１９８９．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、１２：６１９～６３２）、およびシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）（Ｎｏｒｒｉｓら、１９９３．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、２１：８９５～９０６）である。トウモロコシユビキチンプロモーター（ＵｂｉＰ）がトランスジェニック単子葉植物系において開発されており、単子葉植物の形質転換のために構築されたその配列およびベクターは特許公開ＥＰ０ ３４２ ９２６号に開示されている。ユビキチンプロモーターは、トランスジェニック植物、特に単子葉植物中における本発明のヌクレオチド配列の発現に適している。さらに、プロモーター発現カセットはＭｃＥｌｒｏｙら（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３１：１５０～１６０（１９９１））によって記載されており、本発明のヌクレオチド配列の発現のために容易に改変することができ、単子葉宿主における使用に特に適している。
さらに、葉緑体において機能的なプロモーターを使用することができる。そのようなプロモーターの非限定的な例としては、米国特許第７，５７９，５１６号に開示されているバクテリオファージＴ３遺伝子９ ５’ＵＴＲおよび他のプロモーターが挙げられる。本発明で有用な他のプロモーターとしては、それだけには限定されないが、Ｓ－Ｅ９小サブユニットＲｕＢＰカルボキシラーゼプロモーターおよびクニッツトリプシン阻害剤遺伝子プロモーター（Ｋｔｉ３）が挙げられる。
本発明で有用な追加の調節要素としては、それだけには限定されないが、イントロン、エンハンサー、終止配列、ならびに／または５’および３’非翻訳領域が挙げられる。
本発明で有用なイントロンは、植物において同定され、それから単離され、その後、植物の形質転換において使用するために発現カセット内に挿入したイントロンであることができる。当業者には理解されるように、イントロンは、自己切除に必要な配列を含むことができ、核酸構築体／発現カセット内にインフレームで取り込まれている。イントロンは、核酸構築体中の複数のタンパク質コード配列を隔てるためのスペーサーとして使用することができる、または、イントロンは、１つのタンパク質コード配列内で、たとえばｍＲＮＡを安定化するために使用することができる。これらをタンパク質コード配列内で使用する場合、切除部位を含んで「インフレーム」で挿入される。イントロンは、発現を改善または改変するためにプロモーターと関連させてもよい。
本発明で有用なイントロンの非限定的な例としては、ＡＤＨＩ遺伝子（たとえばＡｄｈ１－Ｓイントロン１、２、および６）、ユビキチン遺伝子（Ｕｂｉ１）、ＲｕＢｉｓＣＯ小サブユニット（ｒｂｃＳ）遺伝子、ＲｕＢｉｓＣＯ大サブユニット（ｒｂｃＬ）遺伝子、アクチン遺伝子（たとえばアクチン－１イントロン）、ピルビン酸脱水素酵素キナーゼ遺伝子（ｐｄｋ）、硝酸還元酵素遺伝子（ｎｒ）、重複炭酸脱水酵素遺伝子１（Ｔｄｃａ１）、ｐｓｂＡ遺伝子、ａｔｐＡ遺伝子由来のイントロン、またはその任意の組合せが挙げられる。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドおよび／または核酸構築体は、「発現カセット」であることができる、または発現カセット内に含まれることができる。発現カセットおよび／またはベクターは、本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドおよび／または核酸構築体を含み得る。複数のポリヌクレオチドおよび／または核酸構築体が発現カセットまたはベクター中に含まれる場合、複数のポリヌクレオチドおよび／または核酸構築体は、発現カセット／核酸構築体中に「スタッキングした」とみなし得る。一部の実施形態では、宿主植物は、発現カセット（複数可）の発現産物を宿主植物に任意の組合せで送達する複数の共生生物が付着していてもよく、「スタッキングした」ともみなされ得る。これらは、１つまたは複数の発現産物を生じるために使用する１つまたは複数のポリヌクレオチドおよび／または核酸構築体を有する発現カセットを、宿主植物に、スタッキングした立体配置（複数可）の任意の組合せで使用することを含むことができる。
本明細書中で使用する「発現カセット」とは、目的ヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子（たとえば本発明の核酸構築体（たとえば、合成ｔｒａｃｒ核酸構築体、合成ＣＲＩＳＰＲ核酸構築体、合成ＣＲＩＳＰＲアレイ、キメラ核酸構築体、目的ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列、ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードしているヌクレオチド配列））を意味し、前記ヌクレオチド配列は、少なくとも制御配列（たとえばプロモーター）と作動可能に関連している。したがって、本発明の一部の態様は、本発明のヌクレオチド配列を発現するように設計された発現カセットを提供する。
目的ヌクレオチド配列を含む発現カセットはキメラであってよく、これは、その構成成分のうちの少なくとも１つが、その他の構成成分のうちの少なくとも１つに対して異種であることを意味する。発現カセットは、天然に存在するが、異種発現に有用な組換え形態で得られたものであってもよい。
発現カセットは、選択した宿主細胞において機能的な転写および／または翻訳終止領域（すなわち終止領域）も任意選択で含むことができる。様々な転写ターミネーターが発現カセットにおいて使用するために利用可能であり、目的の異種ヌクレオチド配列を越える転写の終止および正しいｍＲＮＡポリアデニル化を司っている。終止領域は、転写開始領域にネイティブのものであり得る、作動可能に連結した目的のヌクレオチド配列にネイティブのものであり得る、宿主細胞にネイティブのものであり得る、または別の供給源に由来し得る（すなわち、プロモーター、目的ヌクレオチド配列、宿主、もしくはその任意の組合せに対して外来もしくは異種であり得る）。
発現カセットは、形質転換した宿主細胞を選択するために使用することができる選択マーカーのヌクレオチド配列も含むことができる。本明細書中で使用する「選択マーカー」とは、発現された際にマーカーを発現する宿主細胞に明確に異なる表現型を与え、したがって、そのような形質転換細胞をマーカーを有さないものから識別することを可能にする、ヌクレオチド配列を意味する。そのようなヌクレオチド配列は、マーカーが、選択剤（たとえば抗生物質など）を使用することによるなどの化学的手段によって選択することができる形質を与えるのか、または、マーカーが単に、スクリーニング（たとえば蛍光）によるなどの観察もしくは試験を通じて同定することができる形質であるのかに応じて、選択可能またはスクリーニング可能なマーカーのどちらかをコードしていてよい。もちろん、適切な選択マーカーの多数の例が当技術分野で知られており、本明細書中に記載の発現カセットにおいて使用することができる。
発現カセットに加えて、本明細書中に記載の核酸分子およびヌクレオチド配列は、ベクターに関連して使用することができる。用語「ベクター」とは、核酸（または複数の核酸）を細胞内に移す、送達する、または導入するための組成物をいう。ベクターは、移す、送達する、または導入するヌクレオチド配列（複数可）を含む核酸分子を含む。宿主生物の形質転換において使用するためのベクターは当技術分野で周知である。ベクターの一般的クラスの非限定的な例としては、それだけには限定されないが、二本鎖または一本鎖の直鎖状または環状形態であり、自己感染性もしくは可動性であってもなくてもよい、ウイルスベクター、プラスミドベクター、ファージベクター、ファージミドベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、バクテリオファージ、人工染色体、またはアグロバクテリウム属の種のバイナリーベクターが挙げられる。本明細書中で定義するベクターは、細胞ゲノム内への組込み、または染色体外に存在すること（たとえば複製起点を有する自律複製プラスミド）のいずれかによって、原核または真核宿主を形質転換させることができる。また、天然にまたは設計によって、放線菌類ならびに関連する種、細菌、および真核（たとえば、高等植物、哺乳動物、酵母、または真菌の細胞）から選択され得る２つの異なる宿主生物中での複製が可能なＤＮＡビヒクルを意味するシャトルベクターがさらに含まれる。一部の代表的な実施形態では、ベクター中の核酸は、宿主細胞中での転写のための適切なプロモーターまたは他の調節要素の制御下にあり、それと作動可能に連結している。ベクターは、複数の宿主中において機能する二機能性発現ベクターであり得る。ゲノムＤＮＡの場合、これはそれ自身のプロモーターまたは他の調節要素を含有してよく、ｃＤＮＡの場合、これは宿主細胞中での発現のための適切なプロモーターまたは他の調節要素の制御下にあってよい。したがって、本発明の核酸分子および／または発現カセットを、本明細書中に記載のようにかつ当技術分野で知られているように、ベクター中に含ませることができる。
宿主植物を参照して本明細書中で使用する「改変すること」または「改変」およびその文法上の変形とは、宿主植物ゲノムまたは遺伝子型の同時変化を伴わない、少なくとも１つの宿主植物特徴の変化を意味する。
本明細書中で使用する用語「接種する」、「接種すること」、「接種した」、およびその文法上の変形とは、生物学的実体（すなわち植物）を生物活性を有する組成物（たとえば共生生物形成接種材料）と接触させる行動をいう。生物活性を有する組成物は接種材料（たとえば共生生物形成接種材料）と呼び得る。
本明細書中で使用する「接触」、「接触させる」、「接触させた」、およびその文法上の変形とは、所望の反応の構成成分を、所望の反応を実施するために適した条件下で一緒に置くことをいう（たとえば、接種、導入、形質転換、形質移入、移植など）。
ポリヌクレオチドのコンテキストにおいて（たとえば、植物ホルモン生合成遺伝子をコードしているポリヌクレオチド、目的ポリヌクレオチド）「導入すること」、「導入する」、「導入した」（およびその文法上の変形）とは、ポリヌクレオチドが細胞の内部に接近するような様式で、ポリヌクレオチドを宿主生物または前記生物の細胞（たとえば宿主細胞）に提示することを意味する。複数のポリヌクレオチドの導入する場合、これらのポリヌクレオチドは、単一のポリヌクレオチドもしくは核酸構築体の一部として、または別個のポリヌクレオチドもしくは核酸構築体としてアセンブルすることができ、同じまたは異なる発現構築体または形質転換ベクター上に置くことができる。したがって、これらのポリヌクレオチドは、単一の形質転換事象で、もしくは別個の形質転換／形質移入事象で細胞内に導入することができる、または、たとえば、これらは慣例の育種プロトコルによって生物内に取り込ませることができる。したがって、本発明の一部の態様では、本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドまたは核酸構築体（たとえば植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび／または目的ポリヌクレオチド）を、共生生物を生じるための共生生物形成接種材料として使用するために、細菌細胞または植物細胞内に導入することができる。
本明細書中で使用する用語「移植」、「移植すること」、または「移植」（およびその文法上の変形）とは、宿主植物上の少なくとも１つの部位内／上に、少なくとも１つの植物ホルモン生合成酵素をコードしている１つまたは複数のポリヌクレオチドおよび１つまたは複数の目的ポリヌクレオチドを含む少なくとも１個の植物細胞（たとえば、１、２、３、４、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、５０００、１０，０００、１０００００個、またはそれより多くの細胞）を挿入するプロセスを意味する。
本明細書中で使用する用語「形質転換」または「形質移入」とは、異種核酸の細胞内への導入をいう。細胞の形質転換は安定または一過性であり得る。したがって、一部の実施形態では、宿主細胞または宿主生物を本発明の核酸分子で安定に形質転換させる。他の実施形態では、宿主細胞または宿主生物を本発明の組換え核酸分子で一過的に形質転換させる。
ポリヌクレオチドのコンテキストにおける「一過性形質転換」とは、ポリヌクレオチドを細胞内に導入し、細胞のゲノム内に組み込まれないことを意味する。
細胞内に導入したポリヌクレオチドのコンテキストにおける「安定に導入すること」または「安定に導入した」とは、導入したポリヌクレオチドが細胞のゲノム内に安定に取り込まれ、したがって細胞がポリヌクレオチドで安定に形質転換されることを意図する。
本明細書中で使用する「安定形質転換」または「安定に形質転換させた」とは、核酸分子を細胞内に導入し、細胞のゲノム内に組み込まれることを意味する。したがって、組み込まれた核酸分子は、その子孫によって、より具体的には複数の続く世代の子孫によって受け継がれることができる。本明細書中で使用する「ゲノム」は核および色素体のゲノムも含み、したがって、たとえば葉緑体またはミトコンドリアのゲノム内への核酸の組込みも含む。本明細書中で使用する安定形質転換は、たとえばミニ染色体またはプラスミドとして染色体外に維持される導入遺伝子もいうことができる。
一過性形質転換は、たとえば、生物内に導入した１つまたは複数の導入遺伝子によってコードされているペプチドまたはポリペプチドの存在を検出することができる、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）もしくはウエスタンブロット、または質量分析によって検出し得る。細胞の安定形質転換は、たとえば、生物（たとえば、植物、哺乳動物、昆虫、古細菌、細菌など）内に導入した導入遺伝子のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする核酸配列を用いた、細胞のゲノムＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションアッセイによって検出することができる。細胞の安定形質転換は、たとえば、植物または他の生物内に導入した導入遺伝子のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする核酸配列を用いた、細胞のＲＮＡのノーザンブロットハイブリダイゼーションアッセイによって検出することができる。細胞の安定形質転換は、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または当技術分野で周知の他の増幅反応によって、導入遺伝子の標的配列（複数可）とハイブリダイズする特異的プライマー配列を用いて検出することもでき、これは、標準方法に従って検出することができる導入遺伝子配列の増幅をもたらす。形質転換は、当技術分野で周知の直接シーケンシングおよび／またはハイブリダイゼーションプロトコルによっても検出することができる。
本明細書中に記載のように、本発明のポリヌクレオチド、核酸構築体、発現カセットは、共生生物または共生生物形成接種材料の細胞のゲノム内に安定に取り込まれる。
本発明の組換え核酸分子／ポリヌクレオチドは、当業者に知られている任意の方法によって細胞内に導入することができる。本発明の方法は、１つまたは複数のヌクレオチド配列を生物内に導入するための特定の方法に依存せず、これらが生物の少なくとも１つの細胞の内部に接近することにのみ依存する。
本発明の一部の実施形態では、細胞の形質転換は核形質転換を含む。他の実施形態では、細胞の形質転換は色素体形質転換（たとえば葉緑体形質転換）を含む。
植物および細菌細胞を含む原核および真核生物の両方を形質転換させる手順は、当技術分野において周知かつルーチン的であり、文献全体にわたって記載されている（たとえば、Ｊｉａｎｇら、２０１３．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３１：２３３～２３９、Ｒａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、８：２２８１～２３０８（２０１３）を参照）。形質転換方法の非限定的な例としては、細菌媒介性核酸送達（たとえばアグロバクテリウム属を介するもの）、ウイルス媒介性核酸送達、炭化ケイ素または核酸ウィスカー媒介性核酸送達、リポソーム媒介性核酸送達、微量注入、マイクロ微粒子照射、リン酸カルシウム媒介性形質転換、シクロデキストリン媒介性形質転換、電気穿孔、ナノ粒子媒介性形質転換、超音波処理、浸潤、ＰＥＧ媒介性の核酸取り込み、ならびに、その任意の組合せを含む、核酸の植物細胞内への導入をもたらす、任意の他の電気的、化学的、物理的（機械的）および／または生物学的機構を介した形質転換が挙げられる。当技術分野で知られている様々な植物形質転換方法の一般的なガイドとしては、Ｍｉｋｉら（「Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｆｏｒｅｉｇｎ ＤＮＡ ｉｎｔｏ Ｐｌａｎｔｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｇｌｉｃｋ，Ｂ．Ｒ．およびＴｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．編、（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、１９９３）、ページ６７～８８）ならびにＲａｋｏｗｏｃｚｙ－Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋａ（Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．７：８４９～８５８（２００２））が挙げられる。酵母の形質転換の一般的なガイドとしてはＧｕｔｈｒｉｅおよびＦｉｎｋ（１９９１）（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｙｅａｓｔ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）１９４：１～９３２）が挙げられ、細菌の形質転換に関する方法のガイドとしてはＡｕｎｅおよびＡａｃｈｍａｎｎ（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、８５：１３０１～１３１３（２０１０））が挙げられる。
複数のポリヌクレオチドを導入する場合、これらは、単一の核酸構築体の一部として、または別個の核酸構築体としてアセンブルすることができ、同じまたは異なる核酸構築体上に位置することができる。したがって、ヌクレオチド配列は、単一の形質転換事象で、もしくは別個の形質転換事象で目的細胞内に導入することができる、あるいは、関連する場合は、ヌクレオチド配列は、育種プロトコルの一部として植物内に取り込ませることができる。
本発明における用語「Ｔ－ＤＮＡ」とは、転移ＤＮＡ、アグロバクテリウム属によって感染させた植物のゲノムに移される（植物内に形質転換される）ものとして当技術分野で周知のアグロバクテリウム属の種中のＤＮＡセグメントをいう。
本明細書中で使用する用語「単一株接種」とは、単一の細菌株を用いた植物細胞の接種をいい、植物細胞を形質転換させるために所望される、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと少なくとも１つの目的ポリヌクレオチドとが単一の細菌株中に存在する。
本明細書中で使用する用語「同時接種」とは、少なくとも２つの細菌株を用いた植物細胞の接種をいい、１つの株が植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドを保有しており、別の株が植物細胞を形質転換させるために必要な少なくとも１つの目的ポリヌクレオチドを保有している。
本明細書中で使用する「共生生物形成接種材料」とは、宿主植物に接種して、本明細書中に記載の共生生物を生成するために使用し得る組成物をいう。一部の実施形態では、「共生生物形成接種材料」は、本明細書中に記載の植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと本明細書中に記載の目的ポリヌクレオチドとを含む核酸構築体を含み得る。一部の実施形態では、「共生生物形成接種材料」は、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと目的ポリヌクレオチドとを含む細胞（たとえば細菌細胞または植物細胞）を含み得る。一部の実施形態では、「共生生物形成接種材料」は共生生物から採取してよく、共生生物の単一の細胞もしくは複数の細胞（たとえば、共生生物の一部分、たとえば、約０．００５マイクログラム～約１グラムの共生生物、たとえば、約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００マイクログラム～約１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００ミリグラム、またはそれ中の任意の範囲もしくは値）を含み得る。
「植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチド」とは、１つまたは複数の植物ホルモン生合成酵素（たとえば、１、２、３、４、５個、またはそれより多く）をコードしている１つまたは複数のポリヌクレオチド（たとえば、１、２、３、４、５個、またはそれより多く）をいい、１つまたは複数の植物ホルモン生合成酵素は、本明細書中に記載の任意のサイトカイニン生合成酵素および／またはオーキシン生合成酵素であり得る。一部の実施形態では、植物ホルモン生合成酵素またはそれをコードしているポリヌクレオチドは、細菌種、たとえば、細菌オーキシン生合成酵素または細菌サイトカイニン生合成酵素（たとえば、アグロバクテリウム属の種（たとえば、エー・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、エー・ファブルム（Ａ．ｆａｂｒｕｍ）、エー・リゾゲネス（Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、エー・ビティス（Ａ．ｖｉｔｉｓ））、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の種（アール・ツメリゲネス（Ｒ．ｔｕｍｅｒｉｇｅｎｅｓ）、アール・スキールニーウィセンス（Ｒ．ｓｋｉｅｒｎｉｅｗｉｃｅｎｓｅ）、アール・ルシタナム（Ｒ．ｌｕｓｉｔａｎｕｍ））、シュードモナス・サバスタノイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｖａｓｔａｎｏｉ））由来であり得る。一部の実施形態では、植物ホルモン生合成酵素またはそれをコードしているポリヌクレオチドは、植物種、たとえば植物オーキシン生合成酵素または植物サイトカイニン生合成酵素（たとえば、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、トウモロコシ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ））由来であり得る。一部の実施形態では、植物ホルモン生合成酵素またはそれをコードしているポリヌクレオチドは、昆虫種由来であり得る、または植物ホルモンの類似体であり得る。植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドの例としては、それだけには限定されないが、配列番号１、３、５、もしくは２１のヌクレオチド配列のうちの任意の１つ、またはそれと少なくとも約８０％の同一性を有するヌクレオチド配列（たとえば、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性）が挙げられる。一部の実施形態では、本発明で有用な、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６～２０、２２、もしくは２３アミノ酸配列のうちの任意の１つ、またはそれと少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列（たとえば、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性）をコードしている。本発明で有用な植物ホルモン生合成ポリペプチドの例としては、それだけには限定されないが、配列番号２、４、６～２０、２２、もしくは２３アミノ酸配列のうちの任意の１つ、またはそれと少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列（たとえば、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性）が挙げられる。一部の実施形態では、植物ホルモン生合成酵素はオーキシン生合成酵素である。本発明で有用なオーキシン生合成酵素としては、それだけには限定されないが、インドール－３－アセトアミド加水分解酵素（たとえば、ｉａａＨ、ＴＭＳ２、ＡＵＸ２）（Ｅ．Ｃ．番号：ＥＣ３．５．１．４）、アミダーゼ１（たとえばＡｔＡＭＩ１）（ＥＣ３．５．１．４）、トリプトファン２－モノオキシゲナーゼ（たとえば、ｉａａＭ、ＴＭＳ１、ＡＵＸ１）（ＥＣ１．１３．１２．３）、インドール－３－乳酸合成酵素（ＥＣ１．１．１．１１０）、Ｌ－トリプトファン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ１（たとえば、ＴＡＡ１、ＴＩＲ２、ＣＫＲＣ１、ＳＡＶ３、ＷＥＩ８）（ＥＣ２．６．１．９９）、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ関連タンパク質１（たとえばＴＡＲ１）（ＥＣ２．６．１．２７）、インドール－３－アセトアルデヒドオキシダーゼ（たとえば、ＩＡＡオキシダーゼ、ＡＯ１、Ａｏ－１、ＡｔＡＯ－１、ＺｍＡＯ１、ＮｔＡＯ１、ＡｔＡＯ１）（ＥＣ１．２．３．７）、および／またはトリプトファン脱炭酸酵素１（ＴＤＣ１）／トリプトファン脱炭酸酵素２（ＴＤＣ２）（ＥＣ４．１．１．１０５）が挙げられる。一部の実施形態では、植物ホルモン生合成酵素はサイトカイニン生合成酵素である。本発明で有用なサイトカイニン生合成酵素としては、それだけには限定されないが、イソペンテニルトランスフェラーゼ（Ｉｐｔ）（別名：アデノシンリン酸－イソペンテニルトランスフェラーゼ、アデニル酸ジメチルアリルトランスフェラーゼ、（ジメチルアリル）アデノシンｔＲＮＡメチルチオトランスフェラーゼ）（Ｅ．Ｃ．番号：２．５．１．２７もしくは２．５．１．７５もしくは２．５．１．１１２）、および／またはＴｚｓ（別名：ジメチルトランスフェラーゼ、イソペンテニルトランスフェラーゼ、トランス－ゼアチン生成タンパク質、アデニル酸ジメチルアリルトランスフェラーゼ）（ＥＣ２．５．１．２７）が挙げられる。植物細胞の自律分裂を開始させて本明細書中に記載の共生生物形成接種材料および共生生物を形成することができる、植物ホルモン生合成酵素の任意の組合せを使用し得る。一部の実施形態では、本発明で利用し得る植物ホルモン生合成酵素の組合せとしては、それだけには限定されないが、配列番号１／２と配列番号３／４と任意選択で配列番号５／６、配列番号８と配列番号９、配列番号１０と配列番号１１、および／または配列番号１２と配列番号１３が挙げられる。植物細胞中において自律複製を開始させることができる、オーキシン植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドおよびサイトカイニン植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドの任意の組合せを使用して、本明細書中に記載の共生生物および共生生物形成接種材料を作製し得る。
「目的ポリヌクレオチド」とは、共生生物中における発現のための分子（たとえば、１つまたは複数のポリペプチド、ペプチド、コードＲＮＡ、または非コードＲＮＡ、たとえば生物活性分子）をコードしており、任意選択で、共生生物から、共生生物が１つまたは複数の部位で固定されている宿主植物内へ輸送される、ポリヌクレオチドをいう。一部の実施形態では、目的ポリヌクレオチドは、生物活性分子をコードしていてよい、または生物活性分子のための生合成酵素（たとえば生物活性分子の生合成に関与しているポリペプチド）をコードしていてよい。
本明細書中で使用する「宿主植物特徴を改変すること」とは、宿主植物の少なくとも１つの態様または応答を、宿主植物上の本発明の共生生物の成長によって変更することを意味する。そのような態様は、そうでなければ宿主植物中では見つからないまたは宿主植物中で低下した量で見つかる（たとえば共生生物を含まない宿主植物中では見つからないまたは低下した量で存在する）生体分子（共生生物中で生成され、宿主植物に輸送されたもの）の存在を含むことができ、それだけには限定されないが、殺昆虫生体分子、抗微生物生体分子（抗細菌、抗真菌）、殺線虫生体分子、抗ウイルス生体分子、除草生体分子、除草剤耐性／耐容を与える生体分子、病害耐性／耐容を与える生体分子、非生物的ストレス耐性／耐容を与える生体分子、植物構造および成長／形態学（たとえば、成長／形態学に影響を与えるポリペプチドおよび他の因子（たとえば非コード核酸）をコードしている核酸、植物ホルモンなど）を改変する生体分子、生物刺激剤、ＲＮＡ、アプタマー、ならびに／または医薬品が挙げられる。一部の実施形態では、「改変された宿主植物特徴」は、宿主植物中に通常見つかり得る量よりも増加した（たとえば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００％増加した）量の生体分子を含む。一部の実施形態では、「改変された宿主植物特徴」は、たとえば、昆虫、除草剤、植物病原体（たとえば、植物病原性細菌、真菌、および／またはウイルス）、線虫、環境因子（たとえば、熱、冷気、塩分など）に対する応答の変更を含む。一部の実施形態では、改変された特徴を有する宿主植物は、除草剤を生成して宿主植物に輸送し、それによって宿主植物を死滅させる共生生物を含み得る。したがって、一部の実施形態では、改変された宿主植物特徴は、除草生体分子の存在および宿主植物の死であり得る。一部の実施形態では、「宿主植物特徴を改変させること」は、宿主植物の２つ以上の特徴（たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれより多くの特徴）を改変することを含むことができる。したがって、本発明の共生生物を含む宿主植物の改変された特徴は、本発明の共生生物を含まない宿主植物において、そうでなければ存在しない（もしくは低下した量で存在する）２つ以上の生体分子（たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、もしくはそれより多く）の存在であり得る、ならびに／または、本発明の共生生物を含む宿主植物の改変された特徴は、そうでなければ本発明の共生生物を含まない宿主植物において観察されない、２つ以上の変更されたもしくは改変された応答を含み得る。本発明の共生生物を含む宿主植物において２つ以上の改変された特徴（たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個、またはそれより多くの改変された特徴）を得るために、植物上の共生生物は２つ以上のＰＯＩを含んでいてよい、および／あるいは、共生生物は２つ以上の共生生物（たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個、またはそれより多くの共生生物）を含んでいてよく、２つ以上の共生生物のうちの少なくとも２つは、それぞれ、別の共生生物中に含まれるＰＯＩとは異なる少なくとも１つのＰＯＩを含む。
本明細書中で使用する「共生生物」とは、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチド（たとえば１つまたは複数の植物ホルモン生合成酵素をコードしている少なくとも１つ（ｏｎ）のポリヌクレオチド）と目的ポリヌクレオチドとを含む植物細胞または複数の植物細胞をいい、１つまたは複数の植物ホルモン生合成酵素はサイトカイニン生合成酵素および／またはオーキシン生合成酵素であり、共生生物は宿主植物上で成長している。「共生生物」の細胞（複数可）は、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドの発現が原因で自律的に分裂する。「共生生物」は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、もしくは１０，０００個、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、もしくは１００，０００個、またはそれより多くの細胞を含み得る。したがって、一部の実施形態では、共生生物は、少なくとも１つのｐＳＹＭ、１つまたは複数（たとえば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個、またはそれより多く）の植物ホルモン生合成酵素をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチド（たとえば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個、またはそれより多くのポリヌクレオチド）と少なくとも１つ（たとえば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個、またはそれより多く）の目的ポリヌクレオチド（ＰＯＩ）とを含むプラスミドを含む単一の植物細胞であり得る、あるいは、それぞれが少なくとも１つのｐＳＹＭ、１つまたは複数の植物ホルモン生合成酵素をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドと少なくとも１つの目的ポリヌクレオチド（ＰＯＩ）とを含むプラスミドを含む、２個以上の細胞を含み得る。共生生物の細胞は自律的に分裂し、これは植物上に未分化の多細胞構造を形成する。一部の実施形態では、形成される未分化の多細胞構造（たとえば共生生物）は、たとえば、節こぶ、植物栄養体（ｐｌａｎｔ ｆｏｏｄ ｂｏｄｙ）、共生生物の住処、花外蜜腺、小結節、植物新生物、または虫こぶと視覚的に類似していてよいが、少なくとも共生生物中で発現される導入遺伝子によって生化学的／遺伝学的に明確に異なるものである。
一部の実施形態では、共生生物を元の宿主植物から取り出し、研究室設定で培養し、および／または別の植物上に移植し得る（たとえば共生生物形成接種材料として使用し得る）。共生生物または共生生物からの少なくとも１つの細胞を培養する場合、時間と共に形成され、宿主植物から取り出した元の材料から増殖した新しい共生生物材料をいうために、「子共生生物材料」を使用し得る。
本発明は、宿主植物のゲノム改変させずに少なくとも１つの改変された特徴を含む宿主植物に向けられている。本発明は、宿主植物のゲノム改変させずに少なくとも１つの改変された特徴を含む宿主植物を作製するための方法および組成物にさらに向けられている。
本発明は、オーキシンおよびサイトカイニン遺伝子が、植物細胞中で発現された場合に、植物細胞が自律的に分裂して未分化の多細胞構造を形成することを引き起こすという理解を活用する。自然では、そのような構造としては、たとえば、アグロバクテリウム属の種による植物の感染によって開始される虫こぶが挙げられる。自律的に分裂する細胞を作製するこの能力は、本発明者らによって、ＰＯＩ（複数可）の発現を通じて生成物を生成する未分化の多細胞構造（共生生物）を作製するための、自律的に分裂する細胞中での目的ポリヌクレオチド（ＰＯＩ）の発現と共に利用される。そのような未分化の多細胞構造を宿主植物上で成長させ得ることを理解して、本発明者らは、ＰＯＩを発現する本発明の未分化の多細胞構造（本発明の共生生物）を、生成物を宿主植物に送達するため、および宿主植物のゲノム改変させずに宿主植物の特徴（複数可）を改変させるために使用し得ることを今回独自に示した。そのような植物（たとえば宿主植物）ならびに関連生成物（共生生物および共生生物形成接種材料）は、本明細書中に記載の方法および組成物の様々な実施形態、ならびに、本開示に鑑みて当業者には明らかとなり、本発明から逸脱しない、本明細書中に提供する様々な実施形態への数々の変形および付加を使用して生成される。
一部の実施形態では、本発明は、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと目的ポリヌクレオチドとを含む共生生物形成接種材料であって、植物ホルモン生合成酵素が少なくとも１つのサイトカイニン生合成酵素および／またはオーキシン生合成酵素である、共生生物形成接種材料を提供する。
一部の実施形態では、共生生物形成接種材料は、宿主植物に送達して本明細書中に記載の共生生物を生成し得る、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと目的ポリヌクレオチドとを含む核酸組成物（たとえばｐＳＹＭ）であり得る。一部の実施形態では、共生生物形成接種材料は、植物（たとえば宿主植物）の少なくとも１つの部位上に移植して本明細書中に記載の共生生物を生成し得る、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと目的ポリヌクレオチドとを含む（たとえばｐＳＹＭを含む）細胞（たとえば細菌細胞または植物細胞）であり得る。
一部の実施形態では、本発明の核酸構築体は、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと少なくとも１つの目的ポリヌクレオチドとを含み、植物ホルモン生合成酵素はサイトカイニン生合成酵素および／またはオーキシン生合成酵素である。本明細書中に記載のように、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドは、１つまたは複数の植物ホルモン生合成酵素をコードしていてよい。一部の実施形態では、１つまたは複数の植物ホルモン生合成酵素は複数のポリヌクレオチドによってコードされていてよい。すなわち、複数の植物ホルモン生合成酵素が１つの核酸構築体中に含まれる場合、これは同じポリヌクレオチドまたは別個のポリヌクレオチドにコードされていてよい。
本発明の共生生物形成接種材料で有用な植物ホルモン生合成酵素は、植物細胞中で発現させて、自律的に分裂または複製する植物細胞を生成し、任意選択でカルス培養物、懸濁培養、および／または未分化の多細胞構造を生成することができる、任意のオーキシンまたはサイトカイニン生合成酵素であり得る。一部の実施形態では、植物ホルモン生合成酵素またはそれをコードしているポリヌクレオチドは、細菌種、たとえば細菌オーキシン生合成酵素または細菌サイトカイニン生合成酵素由来であり得る。一部の実施形態では、植物ホルモン生合成酵素またはそれをコードしているポリヌクレオチドは、植物種、たとえば、植物オーキシン生合成酵素または植物サイトカイニン生合成酵素由来であり得る。本発明で有用な植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドの例としては、それだけには限定されないが、配列番号１、３、５、もしくは２１のヌクレオチド配列のうちの任意の１つ、またはそれと少なくとも約８０％の同一性を有するヌクレオチド配列（たとえば、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性）が挙げられる。一部の実施形態では、本発明で有用な植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６～２０、２２、もしくは２３アミノ酸配列のうちの任意の１つ、またはそれと少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列（たとえば、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性）をコードしている。本発明で有用な植物ホルモン生合成ポリペプチドの例としては、それだけには限定されないが、配列番号２、４、６～２０、２２、もしくは２３アミノ酸配列のうちの任意の１つ、またはそれと少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列（たとえば、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性）が挙げられる。一部の実施形態では、植物ホルモン生合成酵素はオーキシン生合成酵素である。本発明で有用なオーキシン生合成酵素としては、それだけには限定されないが、インドール－３－アセトアミド加水分解酵素（ｉａａＨ）（Ｅ．Ｃ．番号：ＥＣ３．５．１．４）、アミダーゼ１（ＥＣ３．５．１．４）、トリプトファン２－モノオキシゲナーゼ（ＩａａＭ）（ＥＣ１．１３．１２．３）、インドール－３－乳酸合成酵素（ＥＣ１．１．１．１１０）、Ｌ－トリプトファン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ１（ＥＣ２．６．１．９９）、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ関連タンパク質１（ＥＣ２．６．１．２７）、インドール－３－アセトアルデヒドオキシダーゼ（ＥＣ１．２．３．７）、および／またはトリプトファン脱炭酸酵素１／トリプトファン脱炭酸酵素２（ＥＣ４．１．１．１０５）が挙げられる。一部の実施形態では、植物ホルモン生合成酵素はサイトカイニン生合成酵素である。本発明で有用なサイトカイニン生合成酵素としては、それだけには限定されないが、イソペンテニルトランスフェラーゼ（Ｉｐｔ）（別名：アデノシンリン酸－イソペンテニルトランスフェラーゼ、アデニル酸ジメチルアリルトランスフェラーゼ、（ジメチルアリル）アデノシンｔＲＮＡメチルチオトランスフェラーゼ）（Ｅ．Ｃ．番号：２．５．１．２７もしくは２．５．１．７５もしくは２．５．１．１１２）、および／またはＴｚｓ（別名：ジメチルトランスフェラーゼ、イソペンテニルトランスフェラーゼ、トランス－ゼアチン生成タンパク質、アデニル酸ジメチルアリルトランスフェラーゼ）（ＥＣ２．５．１．２７）が挙げられる。
一部の実施形態では、インドール－３－アセトアミド加水分解酵素（たとえば、ｉａａＨ、Ａｕｘ２、Ｔｍｓ２）をコードしているポリヌクレオチド（Ｅ．Ｃ．番号：ＥＣ３．５．１．４）としては、それだけには限定されないが、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列が挙げられる。一部の実施形態では、本発明で有用なインドール－３－アセトアミド加水分解酵素ポリヌクレオチドは、配列番号２、７、９、１１、または１３のうちのいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードしていてよい。一部の実施形態では、インドール－３－アセトアミド加水分解酵素は、配列番号２、７、９、１１、または１３のアミノ酸配列のうちのいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。本発明の実施形態で有用なさらなる例示的なインドール－３－アセトアミド加水分解酵素（およびそれをコードしているポリヌクレオチド）の受託番号（ＵｎｉＰｒｏｔ／ＮＣＢＩ）としては、それだけには限定されないが、Ｐ０６６１８、ＡＡＤ３０４８８．１、ＷＰ＿０１０９７４８２３．１、ＷＰ＿１７２６９１４４８．１、ＷＰ＿１７２６９０８９７．１、ＷＰ＿１０８９１４６２．１、ＷＰ＿１７２６９１１１８．１、ＮＳＺ８７８７１．１、ＢＡＡ７６３４５．１、ＣＡＡ３９６４９．１、ＷＰ＿０７０１６７５４３．１、Ｐ２５０１６．１、ＷＰ＿１５６５３６３４７．１、ＮＳＹ７２４７０．１、ＷＰ＿１５６５３６３４７．１、ＷＰ＿１５６６３８７１１．１、ＷＰ＿０４５２３１６９８．１、ＷＰ＿１７４１８３１７８．１、および／またはＡＡＢ４１８６８．１が挙げられる。
一部の実施形態では、アミダーゼ１（たとえば、ＡＭＩ１、ＡｔＡＭＩ１）（ＥＣ３．５．１．４）は、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列（Ａｔ１ＧＯ８９８０）を含み得る。一部の実施形態では、本発明で有用なアミダーゼ１ポリヌクレオチドは、配列番号１４と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードしている。
一部の実施形態では、トリプトファン２－モノオキシゲナーゼ（たとえば、ＩａａＭ、Ｔｍｓ１、Ａｕｘ１）（ＥＣ１．１３．１２．３）をコードしているポリヌクレオチドとしては、それだけには限定されないが、配列番号３のヌクレオチド配列または配列番号３と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列が挙げられる。一部の実施形態では、本発明で有用なトリプトファン２－モノオキシゲナーゼポリヌクレオチドは、配列番号４、８、１０、または１２のうちのいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードしていてよい。一部の実施形態では、本発明で有用なトリプトファン２－モノオキシゲナーゼは、配列番号４、８、１０、または１２のアミノ酸配列のうちのいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。さらなる例示的なトリプトファン２－モノオキシゲナーゼ（およびそれをコードしているポリヌクレオチド）の受託番号（ＵｎｉＰｒｏｔ／ＮＣＢＩ）としては、それだけには限定されないが、Ｐ２５０１７、ＡＡＤ３０４８９．１、ＢＡＡ７６３４６．１、ＡＹＭ０９５９８．１、ＡＹＭ１４９５４．１、ＡＹＭ６１１２９．１ ＣＡＢ４４６４０．１、ＣＵＸ７１２８７．１、ＷＰ＿０４０１３２２３０．１、ＡＡＦ７７１２３．１、ＷＰ＿１０４６８０３２３．１、Ｐ２５０１７．１、Ｐ０Ａ３Ｖ２．１、ＭＢＢ３９４７４１０．１、ＷＰ＿１６２１６３０８７．１、ＮＳＹ９９４１６．１、ＡＫＣ１０８８０．１、ＡＶＨ４５１９７．１、および／またはＡＹＤＯ４９１３．１が挙げられる。
一部の実施形態では、インドール－３－乳酸合成酵素（ＥＣ１．１．１．１１０）は、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、本発明で有用なインドール－３－乳酸合成酵素ポリヌクレオチドは、配列番号５のヌクレオチド配列または配列番号５と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列であることができる。一部の実施形態では、インドール－３－乳酸合成酵素ポリヌクレオチドは、配列番号６と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードしている。本発明で有用なさらなる例示的なインドール－３－乳酸合成酵素の受託番号（ＵｎｉＰｒｏｔ）としては、それだけには限定されないが、ＷＰ＿０５２６７５６３０．１、ＷＰ＿０８３２１２５７９．１、ＷＰ＿１７２６９１４４７．１、および／またはＷＰ＿０１０８９１４６３．１が挙げられる
一部の実施形態では、本発明で有用なＬ－トリプトファン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ１（たとえば、ＴＡＡ１、ＴＩＲ２、ＣＫＲＣ１、ＳＡＶ３、ＷＥＩ８）（ＥＣ２．６．１．９９）は、配列番号１５（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ９２７Ｎ２）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、Ｌ－トリプトファン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ１ポリヌクレオチドは、配列番号１５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードしている。
一部の実施形態では、本発明で有用なトリプトファンアミノトランスフェラーゼ関連タンパク質１（たとえばＴＡＲ１）（ＥＣ２．６．１．２７）は、配列番号１６（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ９ＬＲ２９）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、リプトファンアミノトランスフェラーゼ関連タンパク質１ポリヌクレオチドは、配列番号１６と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードしている。
一部の実施形態では、本発明で有用なインドール－３－アセトアルデヒドオキシダーゼ（たとえば、ＩＡＡオキシダーゼ、ＡＯ－１、ＡＯ１、ｚｍＡＯ１、ＮｔＡＯ１、ＡｔＡＯ１、ＡｔＡＯ－１）（ＥＣ１．２．３．７）は、配列番号１７（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｏ２３８８７）および／または配列番号１８（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ７Ｇ１９３）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、インドール－３－アセトアルデヒドオキシダーゼポリヌクレオチドは、配列番号１７および／または配列番号１８と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードしている。
一部の実施形態では、トリプトファン脱炭酸酵素１（たとえばＴＤＣ１）および／またはトリプトファン脱炭酸酵素２（たとえばＴＤＣ２）（ＥＣ４．１．１．１０５）は、本発明で植物細胞において自律的細胞分裂を開始させるために使用し得る。本発明で有用なトリプトファン脱炭酸酵素１としては、それだけには限定されないが、配列番号１９（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ６ＺＪＫ７）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むものを挙げることができる。一部の実施形態では、トリプトファン脱炭酸酵素１ポリヌクレオチドは、配列番号１９と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードしている。一部の実施形態では、トリプトファン脱炭酸酵素２（たとえばＴＤＣ２）（ＥＣ４．１．１．１０５）としては、それだけには限定されないが、配列番号２０（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ７ＸＨＬ３）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むものを挙げることができる。一部の実施形態では、トリプトファン脱炭酸酵素２ポリヌクレオチドは、配列番号２０と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードしている。
植物細胞において自律的細胞分裂を開始させるために有用なサイトカイニン生合成酵素としては、それだけには限定されないが、イソペンテニルトランスフェラーゼ（Ｉｐｔ）と呼ばれるサイトカイニン生合成酵素が挙げられる。Ｉｐｔ酵素の別名としては、アデノシンリン酸－イソペンテニルトランスフェラーゼ、アデニル酸ジメチルアリルトランスフェラーゼ、（ジメチルアリル）アデノシンｔＲＮＡメチルチオトランスフェラーゼ）（Ｅ．Ｃ．番号：２．５．１．２７、２．５．１．７５、または２．５．１．１１２）が挙げられる。一部の実施形態では、Ｉｐｔをコードしているポリヌクレオチドは、配列番号２１のヌクレオチド配列または配列番号２１と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、本発明で有用なＩｐｔポリヌクレオチドは、配列番号２２のうちのいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードしていてよい。一部の実施形態では、本発明で有用なＩｐｔは、配列番号２２と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。さらなる例示的なＩｐｔポリペプチドの受託番号（ＵｎｉＰｒｏｔ／ＮＣＢＩ）としては、それだけには限定されないが、ＷＰ＿０１０８９１４６０．１、ＮＺ８７８７３．１、ＷＰ＿１７２６９０５９２．１、ＣＡＢ４４６４１．１、ＷＰ＿１７２６９０７２２．１、ＢＡＡ７６３４４．１、ＷＰ＿１５６６３８７２０．１、ＷＰ＿１０４６８０３２４．１、ＮＴＡ５６７６２．１、ＷＰ＿０１０８９２３６５．１、ＡＡＢ４１８７０．１、ＷＰ＿０３２４８８３１２．１、ＷＰ＿１５６５３６３４８．１、ＷＰ＿０６５６５７５２２．１、ＷＰ＿０３２４４８８２６８．１、ＡＡＺ５０３９９．１、ＷＰ＿０８０８３０６６５．１、ＡＹＭ２０３５３．１、ＷＰ＿１７４００５３３１．１、ＷＰ＿１７３９９４９３０．１、ＷＰ＿１１１２２１７２６．１、ＷＰ０３２４８９５８２．１、ＷＰ＿１７４１５６２１５．１、ＷＰ＿１７４０４５２２．５．１、ＷＰ＿０７０１６７５４２．１、ＷＰ＿１７２６９１２０５．１、および／またはＣＡＡ５４５４０．１が挙げられる。
さらなるサイトカイニン生合成酵素としては、アデニル酸ジメチルアリルトランスフェラーゼ酵素（たとえばｔｚｓ）（ＥＣ２．５．１．２７）が挙げられる。Ｔｚｓ酵素の別名としては、ジメチルトランスフェラーゼ、イソペンテニルトランスフェラーゼ、トランス－ゼアチン生成タンパク質、およびアデニル酸ジメチルアリルトランスフェラーゼが挙げられる。本発明で有用なＴｚｓポリペプチドとしては、それだけには限定されないが、配列番号２３（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ１４０１１）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むものを挙げることができる。一部の実施形態では、Ｔｚｓポリヌクレオチドは、配列番号２３と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードしている。
本明細書中に記載のものなどの、オーキシンおよびサイトカイニン生合成酵素ならびに／またはオーキシンおよびサイトカイニン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドの任意の組合せを、共生生物および／または共生生物形成接種材料の生成に使用し得る。一部の実施形態では、本発明の核酸構築体中にコードされている植物ホルモン生合成酵素は、インドール－３－アセトアミド加水分解酵素（ｉａａＨ）、トリプトファン２－モノオキシゲナーゼ（ＩａａＭ）、および／またはイソペンテニルトランスフェラーゼ（Ｉｐｔ）であり得る。一部の実施形態では、本発明の核酸構築体は、インドール－３－乳酸合成酵素である植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドをさらに含み得る。
本発明者らにより、本明細書中に記載の植物細胞中における植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドの発現が、ペカン、柑橘類、ジャガイモ、トマト、およびベンサミアナタバコなどの植物上において、未分化細胞の成長および共生生物の形成を誘導する場合があることが示されている。根頭癌腫病および他の同様の障害に関連する文献から、増加したレベルのサイトカイニンおよびオーキシンが植物ホルモン生合成酵素（たとえば、ＩａａＨ、ＩａａＭ、およびＩｐｔ）を含有するＴ－ＤＮＡの植物ゲノム組込みから生じること、ならびにＴ－ＤＮＡで形質転換させた細胞によるオーキシンおよびサイトカイニンの生成の上昇が細胞分裂を促進することが理解される。本発明者らは、この知識を活用して本発明の開発し、したがって、本発明の共生生物および共生生物形成接種材料ならびにそのゲノム中に改変をもたずに改変された特徴を有する宿主植物を生成した。未分化カルスの成長は、オーキシンおよびサイトカイニンレベルの上昇ならびに比較的高いサイトカイニン対オーキシン比の維持の両方の結果である。サイトカイニンおよびオーキシンの上昇は、非腫瘍原性組織において観察されるものよりも、典型的には２倍から１００倍を超えて高い。たとえば、タバコ細胞では、観察されるサイトカイニン対オーキシンの比は約４０：１である。一般に、サイトカイニン対オーキシンの配給は、自律的分裂の開始および未分化成長の形成では約５：１～約５０：１の範囲である。当技術分野で知られているように、未分化成長を生成するために必要なサイトカイニン対オーキシンの比は、植物種および様々な植物ホルモンレベルを検出するために使用する分析方法に基づいて変動する場合がある。
一部の実施形態では、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチド（植物ホルモン生合成酵素がサイトカイニン生合成酵素およびオーキシン生合成酵素である）を含むが本明細書中に記載の目的ポリヌクレオチドを含まない、本発明の核酸構築体を含む植物細胞は、「活性細胞」と呼び得る。したがって、本明細書中で使用する「活性細胞」とは、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドを含む植物細胞であって、植物ホルモン生合成酵素がサイトカイニン生合成酵素およびオーキシン生合成酵素であり、自律的に複製する植物細胞をいう。そのような活性細胞を使用して「活性組織」を作製し得る。目的ポリヌクレオチドを活性細胞または活性組織の細胞内に導入した後、活性植物細胞または組織を共生生物形成接種材料と呼び得る。共生生物は、共生生物形成接種材料を宿主植物の少なくとも１つの部位上に移植することによって生成する。細胞（１つまたは複数の細胞（たとえば組織））を様々な目的で共生生物から採取し得るため、これらの細胞（または組織）を共生生物自体と呼び得るか、または宿主植物上の少なくとも１つの部位上に移植した場合は共生生物形成接種材料とみなし得る。
一部の実施形態では、自然に形成された虫こぶ、節こぶ、植物栄養体、共生生物の住処、花外蜜腺、小結節、植物新生物、および／または自律的に複製する胚乳由来の細胞を使用して、共生生物形成接種材料を作製し得る。植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドを自然に含む、これらのような構造からの細胞は、自律的に複製する。そのような細胞を使用して、細胞（複数可）を少なくとも１つのＰＯＩで形質転換させることによって共生生物形成接種材料を作製することができ、ここで、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと少なくとも１つのＰＯＩとを有する細胞を含む共生生物形成接種材料が生成される。他の共生生物形成接種材料と同様、この様式で作製した共生生物形成接種材料も、宿主植物上に共生生物を生成するために使用し得る。
本発明の共生生物形成接種材料で有用な目的ポリヌクレオチドとは、共生生物中における発現のための本明細書中に記載の分子（たとえば、１つまたは複数のポリペプチド、ペプチド、コードＲＮＡ、または非コードＲＮＡ、たとえば生物活性分子）をコードしており、任意選択で、共生生物から、共生生物が１つまたは複数の部位で固定されている宿主植物内へ輸送され、任意選択で、宿主植物内に輸送される場合、分子が宿主植物の遺伝子型またはゲノムを変更させずに宿主植物に新しい特徴を与えることができる、ポリヌクレオチドをいう。一部の実施形態では、目的ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載のように、生体分子および／もしくは生物活性分子をコードしていてよい、ならびに／または生体分子および／もしくは生物活性分子のための生合成酵素（たとえば生体分子および／もしくは生物活性分子の生合成に関与しているポリペプチド）をコードしていてよい。共生生物形成接種材料中に含まれる「目的ポリヌクレオチド」は、１つの目的ポリヌクレオチドであり得る、または２つ以上の目的ポリヌクレオチドであり得る。２つ以上の目的ポリヌクレオチドが共生生物形成接種材料中に含まれる場合、共生生物形成接種材料は「スタッキングした」共生生物形成接種材料と呼び得る。スタッキングした共生生物形成接種材料を使用して、宿主植物上に１つまたは複数のスタッキングした共生生物を形成し得る。スタッキングのさらなる例として、共生生物形成接種材料が細菌細胞を含む場合、細菌細胞は、１つのプラスミドまたは少なくとも２つの異なるプラスミド上に少なくとも２つの異なるＰＯＩを含み得る。
一部の実施形態では、本発明の核酸構築体は、プラストポリペプチド（たとえば可塑性ポリペプチド）をコードしているポリヌクレオチドをさらに含み得る。本発明で有用なプラストポリペプチドは、本発明の核酸構築体を使用して形成される共生生物の形態学および構造に利益を与えることができる、現在知られているまたは後に発見される任意のプラストポリペプチドであることができる（たとえばＬｅｏｎ Ｏｔｔｅｎ、Ｃｕｒｒ Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ、４１８：３７５～４１９（２０１８）を参照）。本発明の核酸構築体で有用なプラストポリペプチドの例としては、それだけには限定されないが、表１中に提供するものが挙げられる。一部の実施形態では、プラストポリペプチドは、６ｂ、ｒｏｌＢ、ｒｏｌＣ、および／またはｏｒｆ１３であり得る。一部の実施形態では、プラストポリペプチドをコードしている複数のポリヌクレオチドは本発明の核酸構築体中に含まれ得る。
一部の実施形態では、共生生物形成接種材料の植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび／または目的ポリヌクレオチドは、それだけには限定されないが、プロモーター配列、ターミネーター配列、および／またはイントロンを含む調節要素と作動可能に連結していてよい。一部の実施形態では、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび／または目的ポリヌクレオチドがどちらもプロモーターと作動可能に連結している場合、これらはそれぞれ、任意の組合せで同じプロモーターまたは別個のプロモーターと作動可能に連結していてよい。一部の実施形態では、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび／または目的ポリヌクレオチドがどちらもターミネーター配列と作動可能に連結している場合、これらはそれぞれ、任意の組合せで同じターミネーターまたは別個のターミネーターと作動可能に連結していてよい。
植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドを含む本発明の核酸構築体は、植物ホルモン生合成酵素以上のものをコードしていてよい。一部の実施形態では、コードされている複数の植物ホルモン生合成酵素は、任意の組合せで単一のプロモーターとまたは別個のプロモーターと作動可能に連結していてよい。一例として、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドが、インドール－３－アセトアミド加水分解酵素（ｉａａＨ）をコードしているポリヌクレオチド、トリプトファン２－モノオキシゲナーゼ（ＩａａＭ）をコードしているポリヌクレオチド、およびイソペンテニルトランスフェラーゼ（Ｉｐｔ）をコードしているポリヌクレオチドをコードしている場合、ｉａａＨをコードしているポリヌクレオチド、ＩａａＭをコードしているポリヌクレオチド、Ｉｐｔをコードしているポリヌクレオチド（および／またはインドール－３－乳酸合成酵素をコードしているポリヌクレオチド）ならびに目的ポリヌクレオチドは、それぞれ、任意の組合せで単一のプロモーターとまたは少なくとも２つの別個のプロモーターと作動可能に連結していてよい。一部の実施形態では、ｉａａＨをコードしているポリヌクレオチド、ＩａａＭをコードしているポリヌクレオチド、およびＩｐｔをコードしているポリヌクレオチド（ならびに／またはインドール－３－乳酸合成酵素をコードしているポリヌクレオチド）が単一のプロモーターと作動可能に連結していてよく、少なくとも１つの目的ポリヌクレオチドが別個のプロモーターと作動可能に連結していてよい。一部の実施形態では、インドール－３－乳酸合成酵素をコードしているポリヌクレオチドは、任意の他の植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチド（たとえば、ｉａａＨ、ＩａａＭ、および／またはＩｐｔをコードしているポリヌクレオチド）と作動可能に連結したプロモーターと同じプロモーター、またはそれとは別個のプロモーターであってよいプロモーターと作動可能に連結していてよい。
一部の実施形態では、本発明の核酸構築体は、プロモーターと作動可能に連結していてよい、プラストポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドをさらに含んでいてよく、プロモーターは、植物ホルモン生合成酵素（たとえば、ｉａａＨ、ＩａａＭ、および／もしくはＩｐｔをコードしているポリヌクレオチド、またはインドール－３－乳酸合成酵素をコードしているポリヌクレオチド）と作動可能に連結したポリヌクレオチドと作動可能に連結したプロモーターと同じプロモーター、またはそれとは別個のプロモーターであってよい。当業者には理解されるように、本明細書中に記載の任意のポリヌクレオチドの組合せを、それだけには限定されないがプロモーターおよび／またはターミネーターを含む１つまたは複数の調節要素（別個のまたは同じ調節要素の任意の組合せ）の制御下に置き得る（それと作動可能に連結させ得る）。
一部の実施形態では、調節要素（たとえば、プロモーター、ターミネーター、イントロン）は、それが作動可能に連結しているポリヌクレオチドまたは共生生物もしくは共生生物形成接種材料の細胞（複数可）に対して内在性であり得る。一部の実施形態では、調節要素（たとえば、プロモーター、ターミネーター、イントロン）は、それが作動可能に連結しているポリヌクレオチドまたは共生生物もしくは共生生物形成接種材料の細胞（複数可）に対して異種（たとえば、組換え、キメラ）であり得る。
植物細胞中で所望の発現レベルおよび発現位置を提供する、植物中で機能的な任意のプロモーターを本発明で使用し得る。したがって、たとえば、プロモーターは構成的プロモーターであり得る。一部の実施形態では、プロモーターは誘導性プロモーターであり得る。一部の実施形態では、誘導性であるプロモーターは、プログラム細胞死について誘導性であり得る。プロモーターの例としては、それだけには限定されないが、ＣａＭＶ３５ｓプロモーターまたは植物ユビキチンプロモーター（Ｕｂｉ、たとえばＵｂｉ－１）が挙げられる。さらなるプロモーターは上記開示されている。
一部の実施形態では、共生生物形成接種材料において使用するために、目的ポリヌクレオチドは、ポリペプチドが発現の際に共生生物から移動して出て宿主植物内に入り得る、および／または宿主植物の所望の部分に配置され得るように、標的化配列と作動可能に連結しているポリペプチドをコードしていてよい。標的化配列の選択は、目的ポリヌクレオチドによってコードされているポリペプチドの所望の位置に依存する。一部の実施形態では、標的化配列は、タンパク質を膜、細胞内位置、または細胞外位置に標的化するために使用し得る。一部の実施形態では、標的化配列は、小胞体標的化配列、ミトコンドリア標的化配列、葉緑体標的化配列、核標的化（核移行）配列、液胞標的化配列、ペルオキシソーム標的化配列、リソソーム標的化配列、膜標的化配列、または植物ウイルス移動タンパク質である。一部の実施形態では、目的ポリヌクレオチドは、ポリペプチドが発現の際に共生生物から移動して出得る、および／またはたとえば宿主植物中の複数の位置に配置され得るように、複数（たとえば、１、２、３、４、５個、またはそれより多く）の標的化配列と作動可能に連結しているポリペプチドをコードしていてよい。
一部の実施形態では、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび目的ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の核酸構築体（たとえば１つまたは複数の発現カセット）中に、任意の組合せで、一緒にまたは別々に含まれる。一部の実施形態では、少なくとも１つのプラストポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは核酸構築体中に含まれていてよく、任意選択で、少なくとも１つのプラストポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび／または目的ポリヌクレオチドと同じまたは別個の核酸構築体（たとえば発現カセット）中に含まれる。本発明の核酸構築体は、発現カセット中に含まれていてよい、または発現カセットであり得る。一部の実施形態では、本発明の発現カセットはベクター中に含まれていてよい。核酸構築体を細胞内に導入するために適切な任意のベクターを使用し得る。一例として、ベクターとしては、それだけには限定されないが、プラスミド、Ｔ－ＤＮＡ、細菌人工染色体、ウイルスベクター、またはバイナリー－細菌人工染色体を挙げ得る。
一部の実施形態では、本発明の核酸構築体ならびに／またはそれを含む発現カセットおよび／もしくはベクターを、細胞、任意選択で植物細胞または細菌細胞中に含め得る。したがって、本発明の共生生物形成接種材料は、細胞中に植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと目的ポリヌクレオチドとを含んでいてよく、植物ホルモン生合成酵素は少なくとも１つのサイトカイニン生合成酵素および少なくとも１つのオーキシン生合成酵素を含み、任意選択で細胞は植物細胞または細菌細胞である。
一部の実施形態では、共生生物形成接種材料は、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと目的ポリヌクレオチドとを含む細胞を含み、細胞は、細菌細胞、任意選択でＩＶ型分泌系（Ｔ４ＳＳ、たとえば、Ｔ４ＡＳＳ（たとえばＶｉｒＢ／Ｄ４システム）、Ｔ４ＢＳＳ）またはＩＩＩ型分泌系（Ｔ３ＳＳ）を含む細菌細胞であり得る。一部の実施形態では、細菌細胞は、アグロバクテリウム属の種、リゾビウム属の種、メソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の種、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の種、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の種、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の種、オクロバクトラム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）の種、アゾバクター属（Ａｚｏｂａｃｔｅｒ）の種、クロステリウム属（Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ）の種、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）の種、ロドスピリルム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）の種、またはキサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）の種の細胞であり得る。一部の実施形態では、アグロバクテリウム属の種の細胞は、エー・ツメファシエンス（たとえば次亜種１）、エー・リゾゲネス（たとえば次亜種２）、エー・ビティス（たとえば次亜種３）、またはエー・ファブルム（たとえばＣ５８株）の細胞であり得る。一部の実施形態では、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の種の細胞は、ピー・サバスタノイｐｖ．サバスタノイ（Ｐ．ｓａｖａｓｔａｎｏｉ ｐｖ．Ｓａｖａｓｔａｎｏｉ）の細胞であり得る。
ＤＮＡを植物細胞に転移させる細菌の能力は、天然設定（たとえば根頭癌腫病）および人工的なもの（植物形質転換）の両方において周知である。世界中の研究者が、ＤＮＡを植物細胞に転移させるアグロバクテリウム属の種の天然の能力を活用しており、これを使用して、細菌の天然宿主域をはるかに越えて拡大させている。植物病および植物ＤＮＡ転移の分野の技術者には知られているように、アグロバクテリウム属の種の天然宿主域は非常に幅広い。しかし、少なくとも１９８０年代初期から、人の介入を通じて、ＤＮＡを植物に転移させるこれらの細菌の能力は天然宿主ではない多数の他の種へとさらに拡張されている。アグロバクテリウム属の種の天然宿主である植物、およびアグロバクテリウム属の種を使用して形質転換されることができることが示されている多数のものの例示的なリストを、表２に提供する。これらおよび他の植物の属および種を宿主植物として使用して、または本明細書中に記載の共生生物形成接種材料を作製し得る。一部の実施形態では、宿主植物として使用し得る、および共生生物形成接種材料をそれから作製し得る、植物の属および種としては、それだけには限定されないが、表４、または以下の実施例セクションの前の段落中に提供する植物リスト中に提供するものが挙げられる。
一部の実施形態では、共生生物形成接種材料は、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと目的ポリヌクレオチドとを含む細胞を含み、細胞は植物細胞であってよく、任意選択で、植物細胞は、それだけには限定されないが、被子植物（たとえば双子葉植物もしくは単子葉植物）、裸子植物、藻類（たとえば大型藻類、たとえば、紅藻植物門（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）（紅藻）、褐藻植物門（Ｐｈａｅｏｐｈｙｔａ）（褐藻類）、および緑藻植物門（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）（緑藻類）、黄金色藻綱（Ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｃｅａｅ）（黄金藻類））、蘚苔類、シダ類、ならびに／またはシダ様植物（ｆｅｒｎ ａｌｌｙ）（すなわち羊歯植物）を含む任意の植物由来であり得る。
植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと目的ポリヌクレオチドとを含む共生生物形成接種材料は、植物細胞中に含まれる場合は、植物カルスまたはカルス培養物または懸濁培養の形態であり得る。
本発明は、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと目的ポリヌクレオチドとを含みそれを発現する植物細胞を含む共生生物であって、植物ホルモン生合成酵素が少なくとも１つのサイトカイニン生合成酵素および／またはオーキシン生合成酵素であり、共生生物の植物細胞が自律的に分裂する、共生生物をさらに提供する。一部の実施形態では、植物細胞は少なくとも２個の植物細胞（たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個、またはそれより多くの細胞）を含む。複数の細胞を含む共生生物は、植物カルスまたはカルス培養物または懸濁培養を形成し得る。複数の植物細胞を含む共生生物は、未分化の多細胞構造を形成し得る。
本発明の共生生物で有用な目的ポリヌクレオチドは、共生生物中での発現のための、本明細書中に記載の分子（たとえば、１つまたは複数のポリペプチド、ペプチド、コードＲＮＡ、または非コードＲＮＡ、たとえば、生体分子、生物活性分子）をコードしているポリヌクレオチドであって、任意選択で、共生生物から、共生生物が１つまたは複数の部位で固定されている宿主植物内へ輸送され、任意選択で、宿主植物内に輸送される場合、分子が宿主植物の遺伝子型またはゲノムを変更させずに宿主植物に新しい特徴を与えることができる、ポリヌクレオチドをいう。一部の実施形態では、目的ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載のように、生体分子および／もしくは生物活性分子をコードしていてよい、ならびに／または生体分子および／もしくは生物活性分子のための生合成酵素（たとえば生物活性分子の生合成に関与しているポリペプチド）をコードしていてよい。共生生物中に含まれる「目的ポリヌクレオチド」は、１つの目的ポリヌクレオチドであり得る、あるいは２つ以上（たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５個、またはそれより多く）の目的ポリヌクレオチドであり得る。２つ以上の目的ポリヌクレオチドが１つの共生生物中に含まれる場合、共生生物は、「スタッキングした」共生生物と呼び得る。さらに、宿主植物上に形成された１つまたは複数の共生生物であって、共生生物のうちの少なくとも２つが異なるＰＯＩを含む共生生物は、「スタッキングした共生生物」と呼び得る。スタッキングは、１つまたは複数の共生生物を宿主植物上に形成することであって、すべての共生生物が同じＰＯＩ（複数可）を含むことも含み得る。
一部の実施形態では、共生生物中に含まれる植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドは、１つまたは複数の植物ホルモン生合成酵素をコードしていてよい。一部の実施形態では、１つまたは複数の植物ホルモン生合成酵素は、１つまたは複数のポリヌクレオチドによってコードされていてよい。すなわち、共生生物が、複数の植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドを含む場合、複数の植物ホルモン生合成酵素は、別の植物ホルモン生合成酵素と同じポリヌクレオチド上または別個のポリヌクレオチド上に、任意の組合せでコードされていてよい。
本発明の共生生物で有用な植物ホルモン生合成酵素は、植物細胞中で発現させて、自律的に分裂または複製する植物細胞を生成し、任意選択で未分化の多細胞構造を生成することができる、任意のオーキシンまたはサイトカイニン生合成酵素であり得る。これらは上に詳述されており、それだけには限定されないが、インドール－３－アセトアミド加水分解酵素（ｉａａＨ）（Ｅ．Ｃ．番号：ＥＣ３．５．１．４）、アミダーゼ１（ＥＣ３．５．１．４）、トリプトファン２－モノオキシゲナーゼ（ＩａａＭ）（ＥＣ１．１３．１２．３）、インドール－３－乳酸合成酵素（ＥＣ１．１．１．１１０）、Ｌ－トリプトファン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ１（ＥＣ２．６．１．９９）、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ関連タンパク質１（ＥＣ２．６．１．２７）、インドール－３－アセトアルデヒドオキシダーゼ（ＥＣ１．２．３．７）、および／またはトリプトファン脱炭酸酵素１／トリプトファン脱炭酸酵素２（ＥＣ４．１．１．１０５）を含むオーキシン生合成酵素が挙げられる。一部の実施形態では、植物ホルモン生合成酵素はサイトカイニン生合成酵素であり、それだけには限定されないが、イソペンテニルトランスフェラーゼ（Ｉｐｔ）（別名：アデノシンリン酸－イソペンテニルトランスフェラーゼ、アデニル酸ジメチルアリルトランスフェラーゼ、（ジメチルアリル）アデノシンｔＲＮＡメチルチオトランスフェラーゼ）（Ｅ．Ｃ．番号：２．５．１．２７もしくは２．５．１．７５もしくは２．５．１．１１２）、および／またはＴｚｓ（別名：ジメチルトランスフェラーゼ、イソペンテニルトランスフェラーゼ、トランス－ゼアチン生成タンパク質、アデニル酸ジメチルアリルトランスフェラーゼ）（ＥＣ２．５．１．２７）を挙げることができる。一部の実施形態では、植物ホルモン生合成酵素は、インドール－３－アセトアミド加水分解酵素（ｉａａＨ）、トリプトファン２－モノオキシゲナーゼ（ＩａａＭ）、および／またはイソペンテニルトランスフェラーゼ（Ｉｐｔ）であり得る。一部の実施形態では、本発明の共生生物は、インドール－３－乳酸合成酵素である植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドをさらに含み得る。
一部の実施形態では、本発明の共生生物は、プラストポリペプチド（たとえば可塑性ポリペプチド）をコードしているポリヌクレオチドをさらに含み得る。本発明で有用なプラストポリペプチドは、本発明の核酸構築体を使用して形成される共生生物の構造に利益を与えることができる、現在知られているまたは後に発見される任意のプラストポリペプチドであることができる。本発明の共生生物で有用なプラストポリペプチドの例としては、それだけには限定されないが、表１中に提供するものが挙げられる。一部の実施形態では、プラストポリペプチドは、６ｂ、ｒｏｌＢ、ｒｏｌＣ、および／またはｏｒｆ１３であり得る。一部の実施形態では、プラストポリペプチドをコードしている複数のポリヌクレオチドは本発明の共生生物中に含まれ得る。
共生生物の細胞中での発現のために、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび／または目的ポリヌクレオチドは、それだけには限定されないが、プロモーター配列、ターミネーター配列、および／またはイントロンを含む調節要素と作動可能に連結していてよい。一部の実施形態では、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび／または目的ポリヌクレオチドがどちらもプロモーターと作動可能に連結している場合、これらはそれぞれ、任意の組合せで同じプロモーターまたは別個のプロモーターと作動可能に連結していてよい。一部の実施形態では、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび／または目的ポリヌクレオチドがどちらもターミネーター配列と作動可能に連結している場合、これらはそれぞれ、任意の組合せで同じターミネーターまたは別個のターミネーターと作動可能に連結していてよい。
一例として、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドが、インドール－３－アセトアミド加水分解酵素（ｉａａＨ）をコードしているポリヌクレオチド、トリプトファン２－モノオキシゲナーゼ（ＩａａＭ）をコードしているポリヌクレオチド、およびイソペンテニルトランスフェラーゼ（Ｉｐｔ）をコードしているポリヌクレオチドをコードしている場合、ｉａａＨをコードしているポリヌクレオチド、ＩａａＭをコードしているポリヌクレオチド、Ｉｐｔをコードしているポリヌクレオチド、および目的ポリヌクレオチドは、任意の組合せで、単一のプロモーターと作動可能に連結していてよい、または少なくとも２つの別個のプロモーターと作動可能に連結していてよい。一部の実施形態では、ｉａａＨをコードしているポリヌクレオチド、ＩａａＭをコードしているポリヌクレオチド、およびＩｐｔをコードしているポリヌクレオチドは、単一のプロモーターと作動可能に連結していてよく、少なくとも１つの目的ポリヌクレオチドは別個のプロモーターと作動可能に連結していてよい。一部の実施形態では、インドール－３－乳酸合成酵素をコードしているポリヌクレオチドは、植物ホルモン生合成酵素（たとえば、ｉａａＨ、ＩａａＭ、および／またはＩｐｔをコードしているポリヌクレオチド）と作動可能に連結した任意の他のポリヌクレオチドと作動可能に連結したプロモーターと同じプロモーター、またはそれとは別個のプロモーターであってよいプロモーターと作動可能に連結していてよい。一部の実施形態では、プラストポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、植物ホルモン生合成酵素（たとえば、ｉａａＨ、ＩａａＭ、および／もしくはＩｐｔをコードしているポリヌクレオチド、またはインドール－３－乳酸合成酵素をコードしているポリヌクレオチド）と作動可能に連結したポリヌクレオチドと作動可能に連結したプロモーターと同じプロモーター、またはそれとは別個のプロモーターであってよいプロモーターと作動可能に連結していてよい。当業者には理解されるように、本明細書中に記載の任意のポリヌクレオチドの組合せを、それだけには限定されないがプロモーターおよび／またはターミネーターを含む１つまたは複数の調節要素（別個のまたは同じ調節要素の任意の組合せ）の制御下に置き得る（それと作動可能に連結させ得る）。
一部の実施形態では、調節要素（たとえば、プロモーター、ターミネーター、イントロン）は、それが作動可能に連結しているポリヌクレオチドに対して、または共生生物の１つもしくは複数の植物細胞に対して内在性または異種（たとえば組換え）であり得る。
植物細胞中で所望の発現レベルおよび発現位置を提供する、植物中で機能的な任意のプロモーターを本発明で使用し得る。したがって、たとえば、プロモーターは構成的プロモーターであり得る。一部の実施形態では、プロモーターは誘導性プロモーターであり得る。一部の実施形態では、誘導性であるプロモーターは、プログラム細胞死について誘導性であり得る。プロモーターの例としては、それだけには限定されないが、ＣａＭＶ３５ｓプロモーターまたは植物ユビキチンプロモーター（Ｕｂｉ、たとえばＵｂｉ－１）が挙げられる。プロモーターを含むさらなる調節要素は上記開示したとおりである。
一部の実施形態では、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび目的ポリヌクレオチドは、一緒にまたは別々に、１つまたは複数の核酸構築体（たとえば１つまたは複数の発現カセット）中に、任意の組合せで含まれる。一部の実施形態では、少なくとも１つのプラストポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは核酸構築体中に含まれていてよく、任意選択で、少なくとも１つのプラストポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび／または目的ポリヌクレオチドと同じまたは別個の核酸構築体（たとえば発現カセット）中に含まれる。本発明の核酸構築体は、発現カセット中に含まれていてよい、または発現カセットであり得る。一部の実施形態では、本発明の発現カセットはベクター中に含まれていてよい。核酸構築体を細胞内に導入するために適切な任意のベクターを使用し得る。一例として、ベクターとしては、それだけには限定されないが、プラスミド、Ｔ－ＤＮＡ、細菌人工染色体、ウイルスベクター、またはバイナリー－細菌人工染色体を挙げ得る。
一部の実施形態では、目的ポリヌクレオチドは、ポリペプチドが共生生物中での発現の際に宿主植物の所望の部分に配置され得るように、標的化配列と作動可能に連結しているポリペプチドをコードしていてよい。標的化配列の選択は、目的ポリヌクレオチドによってコードされているポリペプチドの所望の位置に依存する。一部の実施形態では、標的化配列は、タンパク質を膜、細胞内位置、または細胞外位置に標的化するために使用し得る。一部の実施形態では、標的化配列は、小胞体標的化配列、ミトコンドリア標的化配列、葉緑体標的化配列、核標的化（核移行）配列、液胞標的化配列、ペルオキシソーム標的化配列、リソソーム標的化配列、または植物ウイルス移動タンパク質である。一部の実施形態では、目的ポリヌクレオチドは、ポリペプチドが発現の際に宿主植物の複数の所望の部分に配置され得るように、複数（たとえば、１、２、３、４、５個、またはそれより多く）の標的化配列と作動可能に連結しているポリペプチドをコードしていてよい。一部の実施形態では、ポリペプチドを複数の標的化配列と作動可能に連結させることによって、ポリペプチドを逐次的に複数の位置に向け得る。たとえば、葉緑体標的化配列および膜標的化配列と作動可能に連結したポリペプチドを、まず葉緑体に標的化し、その後、膜に標的化させ得る。一部の実施形態では、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチド（たとえば、ｉａａＨをコードしている、ＩａａＭをコードしているポリヌクレオチド、および／もしくはＩｐｔをコードしているポリヌクレオチド、および／またはインドール－３－乳酸合成酵素）、ならびに／あるいは少なくとも１つのプラストポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、核標的化配列と作動可能に連結していてよい。
一部の実施形態では、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチド（たとえば、ｉａａＨをコードしている、ＩａａＭをコードしているポリヌクレオチド、および／もしくはＩｐｔをコードしているポリヌクレオチド、および／またはインドール－３－乳酸合成酵素）を含む共生生物、ならびに／あるいは少なくとも１つのプラストポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、植物ホルモン生合成酵素、および／またはプラストポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、核標的化配列と作動可能に連結している。
一部の実施形態では、共生生物は、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチド（たとえば、ｉａａＨをコードしている、ＩａａＭをコードしているポリヌクレオチド、Ｉｐｔをコードしているポリヌクレオチド）と目的ポリヌクレオチドとを含んでいてよく、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび目的ポリヌクレオチドは、任意の組合せで単一のプロモーターとまたは少なくとも２つの別個のプロモーターと作動可能に連結している。一部の実施形態では、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドがｉａａＨ、ＩａａＭ、およびＩｐｔをコードしている場合、ｉａａＨ、ＩａａＭ、およびＩｐｔをコードしているポリヌクレオチド（複数可）は単一のプロモーターと作動可能に連結しており、目的ポリヌクレオチドは別個のプロモーターと作動可能に連結している。
一部の実施形態では、共生生物は、プロモーターと作動可能に連結した少なくとも１つのプラストポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含んでいてよく、任意選択で、少なくとも１つのプラストポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび／または目的ポリヌクレオチドと同じプロモーターまたはそれとは別個のプロモーターと作動可能に連結している。一部の実施形態では、プロモーター、単一のプロモーター、別個のプロモーター、および／または２つ以上の別個のプロモーターは、共生生物の細胞に対して内在性である。一部の実施形態では、プロモーター、単一のプロモーター、別個のプロモーター、および／または２つ以上の別個のプロモーターは、共生生物の細胞に対して異種である。一部の実施形態では、プロモーター、単一のプロモーター、別個のプロモーター、および／または２つ以上の別個のプロモーターのうちの１つまたは複数は、共生生物の細胞に対して内在性であってよく、他方で、プロモーター、単一のプロモーター、別個のプロモーター、および／または２つ以上の別個のプロモーターのうちの少なくとも１つは、共生生物の細胞に対して異種である。一部の実施形態では、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドは、共生生物の植物細胞に対して異種であり得る。一部の実施形態では、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドは、共生生物の植物細胞に対して内在性であり得る。一部の実施形態では、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドは、異種プロモーター（たとえば植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび／もしくは共生生物の植物細胞に対して異種）または内在性プロモーター（たとえば植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドもしくは植物細胞共生生物に対して内在性）と作動可能に連結していてよい。
本発明の共生生物として使用するための植物細胞（たとえば植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと目的ポリヌクレオチドとを含む植物細胞）は、任意の植物細胞であることができ、それだけには限定されないが、被子植物細胞（たとえば双子葉植物もしくは単子葉植物）、裸子植物細胞、藻細胞（たとえば大型藻類、たとえば、紅藻植物門（紅藻）、褐藻植物門（褐藻類）、および緑藻植物門（緑藻類）、黄金色藻綱（黄金藻類））、蘚苔類細胞、シダ類および／またはシダ様植物細胞（すなわち羊歯植物）が挙げられる。一部の実施形態では、本発明で有用な植物細胞としては、それだけには限定されないが、表２もしくは表４、または以下の実施例セクションの前の段落中に提供する植物リスト中に列挙したものが挙げられる。一部の実施形態では、植物細胞としては、それだけには限定されないが、柑橘類細胞、トマト細胞、トウモロコシ細胞、ペカン細胞、およびタバコ細胞が挙げられる。
共生生物は、植物（たとえば宿主植物）に、植物上の１つまたは複数の位置で移植し得る。したがって、本発明は、少なくとも１つの本発明の共生生物を含む宿主植物であって、共生生物が植物上の少なくとも１つの部位（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０箇所、またはそれより多くの部位）に位置する宿主植物をさらに提供する。本発明の植物（たとえば宿主植物）は、植物または宿主植物の様々な部位に位置する複数の共生生物を含み得る。本明細書中で使用する植物上の「部位」は、共生生物を成長させるための、植物上の任意の位置または任意の植物部分であることができる。共生生物のための部位または位置の例としては、それだけには限定されないが、外植片、胚、葉、苗条、茎、枝、穀粒、穂、穂軸、穀皮、柄、表皮組織、頂端分裂組織、花の組織（たとえば、花粉、雌蕊、胚珠、葯、雄蕊、花冠、萼片、花弁、花床、花糸、花柱、柱頭など）、果実、種子、鞘、さく果、子葉、胚軸、葉柄、塊茎、球茎、根、根端、共生生物、節こぶ、植物栄養体、共生生物の住処、花外蜜腺、小結節、植物新生物、または虫こぶが挙げられる。
一部の実施形態では、共生生物が宿主植物上の少なくとも１つの部位上に含まれる場合、共生生物中に含まれる目的ポリヌクレオチドが共生生物中で発現され、目的ポリヌクレオチドの発現産物および／または目的ポリヌクレオチドの発現産物を使用して作られた生成物が宿主植物内に輸送される。宿主植物は、任意の年齢または大きさの野生型植物（たとえば、実生、幼若植物、または成熟植物）であり得る。宿主植物としては、それだけには限定されないが、本明細書中に記載のように、被子植物（たとえば双子葉植物もしくは単子葉植物）、裸子植物、大型藻類（たとえば、紅藻植物門（紅藻）、褐藻植物門（褐藻類）、および緑藻植物門（緑藻類）、黄金色藻綱（黄金藻類））、蘚苔類、ならびに／またはシダ類および／またはシダ様植物（すなわち羊歯植物）が挙げられる。一部の実施形態では、本発明で有用な植物としては、それだけには限定されないが、表２および／もしくは表４、ならびに／または以下の実施例セクションの前の段落中に提供する植物リスト中に列挙したものが挙げられる。一部の実施形態では、本発明で有用な植物の例としては、柑橘類植物（たとえば、グレープフルーツ、オレンジ、レモン、ライムなど）、トマト植物、トウモロコシ植物、ペカン植物、およびタバコ植物が挙げられる。
一部の実施形態では、共生生物を宿主植物から収穫してよく、生体分子（複数可）および／または生物活性分子（複数可）を含む生成物を収穫した共生生物から単離／収集してよい。本明細書中に記載のものなどの任意の生体分子または生物活性分子を本発明の共生生物中で生成させ、それから収集／単離し得る。共生生物および共生生物を含む宿主植物から収集された生成物は、生成物が適した任意の目的のために使用し得る。そのような使用の非限定的な例としては、特殊化学薬品、医薬品、化粧品、潤滑剤、色素／顔料、燃料、食品、および／または栄養製品などが挙げられる。
本発明は、本発明の共生生物形成接種材料、共生生物、および共生生物を含む宿主植物を含む、本発明の組成物を作製するための方法をさらに提供する。本発明の共生生物形成接種材料は、少なくとも１つの目的ポリヌクレオチドと少なくとも１つの植物ホルモン生合成酵素をコードしている（たとえば、１つまたは複数のポリヌクレオチド（たとえば、１、２、３、４、５個、またはそれより多く）をコードしている、１つまたは複数の植物ホルモン生合成酵素（たとえば、１、２、３、４、５個、またはそれより多く）をコードしている）ポリヌクレオチドとを含む、１つまたは複数の核酸構築体（たとえば、１、２、３、４、５個、またはそれより多く）を含む組成物であることができ、生合成酵素（複数可）はオーキシン生合成酵素および／またはサイトカイニン生合成酵素を含む。一部の実施形態では、本発明の共生生物形成接種材料は、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドを含む１つまたは複数の核酸構築体であって、生合成酵素がオーキシン生合成酵素および／またはサイトカイニン生合成酵素を含む核酸構築体と、目的ポリヌクレオチドとを含む、１つまたは複数の細胞（たとえば、１、２、３、４、５、６、７，８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００個、またはそれより多くの細胞）を含むことができる。一部の実施形態では、細胞は植物細胞である。一部の実施形態では、細胞は細菌細胞である。
したがって、細胞内に、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと目的ポリヌクレオチドとを導入する、または、目的ポリヌクレオチドを含むトランスジェニック細胞内に植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドを導入するステップを含む、共生生物形成接種材料を生成する方法であって、植物ホルモン生合成酵素が少なくとも１つのサイトカイニン生合成酵素および／またはオーキシン生合成酵素であり、それによって共生生物形成接種材料を生成する方法を提供する。一部の実施形態では、共生生物形成接種材料を生成する方法は、細胞を培養して、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと目的ポリヌクレオチドとを含む細胞の集団を生成するステップをさらに含む。
本発明は、共生生物形成接種材料を生成する方法であって、（ａ）（ｉ）植物（もしくはその一部（たとえば外植片、茎など））上の少なくとも１つの部位（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０箇所、もしくはそれより多くの部位）内／上に、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと目的ポリヌクレオチド配列を導入する、またはそれを含む植物細胞（たとえば、植物ホルモンコード酵素をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む活性植物細胞）を移植する、またはそれを含む細菌細胞（たとえば、植物ホルモンコード酵素をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチド）を植物（もしくはその一部）上の少なくとも１つの部位上に接種するステップ、あるいは、（ｉｉ）植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドを、目的ポリヌクレオチド配列を含む植物（もしくはその一部（たとえば外植片、茎など））上の少なくとも１つの部位（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０箇所、もしくはそれより多くの部位）内／上に導入する、またはそれを含む植物細胞を移植する、またはそれを含む細菌細胞を植物（もしくはその一部）上の少なくとも１つの部位上に接種するステップであって、植物ホルモン生合成酵素が少なくとも１つのサイトカイニン生合成酵素および／またはオーキシン生合成酵素であり、それによって、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと目的ポリヌクレオチド配列とを含む植物（またはその一部）上の共生生物を生成するステップと、（ｂ）１つまたは複数の細胞（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、２５００、５０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００個、またはそれより多くの細胞、たとえば、共生生物からの組織の一部分、たとえば約０．００５μｇ～約１ｇまたはそれより多く）を植物上の共生生物から選択して、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと目的ポリヌクレオチド配列とを含む１つまたは複数の細胞を提供し、それによって共生生物形成接種材料を生成するステップとを含む方法をさらに提供する。一部の実施形態では、共生生物形成接種材料を生成する方法が、共生生物を植物上の少なくとも部位上で生成することを最初に含む場合、植物上の少なくとも１つの部位は植物の地上部分にある。一部の実施形態では、植物上の少なくとも１つの部位は植物の地下部分にある。一部の実施形態では、共生生物形成接種材料を生成する方法は、（ｃ）（ｂ）からの１つまたは複数の細胞を培養して、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと目的ポリヌクレオチド配列とを含む植物細胞の集団（たとえば、カルス、カルス培養物、および／または懸濁培養）を生成するステップをさらに含み得る。
細胞を植物もしくはその一部上に移植することによって、共生生物形成接種材料を生成するために植物細胞を使用する場合、または細菌細胞を植物もしくはその一部上に接種することによって、共生生物形成接種材料を生成するために細菌細胞を使用する場合、細胞は、単一の細胞であり得る、あるいは２個またはそれより多くの細胞（たとえば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の細胞～約１００，０００個の細胞、もしくはそれより多く）であり得る。細胞が植物細胞であり、共生生物形成接種材料を生成するために使用する植物細胞が、植物ホルモン酵素をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチド（たとえば、オーキシン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドおよびサイトカイニン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチド）を含むが、宿主植物ゲノムを改変させずに宿主植物特徴を改変させることにおいて使用するための目的ポリヌクレオチドを含まない場合に、植物細胞を「活性」植物細胞と呼び得る。活性植物細胞を、細胞が自律的に繁殖することを可能にする植物ホルモン酵素をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドで改変し、それにより、活性細胞が植物またはその一部上に移植された際に、未分化構造（虫こぶ様構造）を形成することを可能にする。活性植物細胞が自律的に分裂して組織を形成する場合に、組織を「活性組織」と呼ぶことができる。細胞または組織が宿主植物ゲノムを改変させずに宿主植物特徴を改変させることにおいて使用するための目的ポリヌクレオチドを含む場合にのみ、共生生物形成接種材料が活性植物細胞または活性組織から作製される。
本発明の共生生物形成接種材料、共生生物、および共生生物を含む宿主植物を含む、本発明の組成物を作製するための本発明の方法において有用な目的ポリヌクレオチドとしては、宿主植物特徴を改変させるために有用であり得る、または共生生物および／もしくは少なくとも１つの共生生物を含む宿主植物中における／による生体分子の生成において有用であり得る、任意の目的ポリヌクレオチドが挙げられる。生体分子とは、生きた生物および／またはその一部（たとえば細胞または無細胞系））によって生成される任意の分子である。
目的ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載の任意の分子（たとえば、１つまたは複数のポリペプチド、ペプチド、コードＲＮＡ、または非コードＲＮＡ、たとえば生物活性分子）をコードしていてよく、分子は、共生生物中で発現されてよく、任意選択で、共生生物から、共生生物が１つまたは複数の部位で固定されている宿主植物内へ輸送され、任意選択で、宿主植物内に輸送される場合、宿主植物の遺伝子型またはゲノムを変更させずに宿主植物に新しい特徴を与えることができる。一部の実施形態では、目的ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載のように、生体分子および／もしくは生物活性分子をコードしていてよい、ならびに／または生体分子および／もしくは生物活性分子のための生合成酵素（たとえば生物活性分子の生合成に関与しているポリペプチド）をコードしていてよい。本明細書中に記載のように、本明細書中に記載の共生生物形成接種材料の作製において使用するための「目的ポリヌクレオチド」は、１つの目的ポリヌクレオチドであり得る、あるいは２つ以上（たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５個、またはそれより多く）の目的ポリヌクレオチドであり得る。２つ以上の目的ポリヌクレオチドが共生生物形成接種材料中に含まれる場合、共生生物形成接種材料は、「スタッキングした」共生生物形成接種材料と呼び得る。スタッキングした共生生物形成接種材料を使用して宿主植物上に１つまたは複数の共生生物を形成させてよく、これはスタッキングした共生生物（複数可）と呼び得る。スタッキングのさらなる例として、共生生物形成接種材料が細菌細胞を含む場合、細菌細胞は、少なくとも２つの異なるＰＯＩを１つのプラスミドまたは少なくとも２つの異なるプラスミド上に含み得る。
本明細書中に記載のように、本明細書中に記載のように植物細胞中で発現させて自律的に分裂または複製する植物細胞を生成することができる任意のオーキシン生合成酵素またはサイトカイニン生合成酵素を使用して、共生生物形成接種材料を作製し得る。例示的なオーキシンおよびサイトカイニン生合成酵素ならびにそれをコードしているポリヌクレオチドは上に詳述されており、それだけには限定されないが、インドール－３－アセトアミド加水分解酵素（ｉａａＨ）（Ｅ．Ｃ．番号：ＥＣ３．５．１．４）、アミダーゼ１（ＥＣ３．５．１．４）、トリプトファン２－モノオキシゲナーゼ（ＩａａＭ）（ＥＣ１．１３．１２．３）、インドール－３－乳酸合成酵素（ＥＣ１．１．１．１１０）、Ｌ－トリプトファン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ１（ＥＣ２．６．１．９９）、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ関連タンパク質１（ＥＣ２．６．１．２７）、インドール－３－アセトアルデヒドオキシダーゼ（ＥＣ１．２．３．７）、および／またはトリプトファン脱炭酸酵素１／トリプトファン脱炭酸酵素２（ＥＣ４．１．１．１０５）を含むオーキシン生合成酵素が挙げられる。一部の実施形態では、植物ホルモン生合成酵素はサイトカイニン生合成酵素である。本発明で有用なサイトカイニン生合成酵素としては、それだけには限定されないが、イソペンテニルトランスフェラーゼ（Ｉｐｔ）（別名：アデノシンリン酸－イソペンテニルトランスフェラーゼ、アデニル酸ジメチルアリルトランスフェラーゼ、（ジメチルアリル）アデノシンｔＲＮＡメチルチオトランスフェラーゼ）（Ｅ．Ｃ．番号：２．５．１．２７もしくは２．５．１．７５もしくは２．５．１．１１２）、および／またはＴｚｓ（別名：ジメチルトランスフェラーゼ、イソペンテニルトランスフェラーゼ、トランス－ゼアチン生成タンパク質、アデニル酸ジメチルアリルトランスフェラーゼ）（ＥＣ２．５．１．２７）が挙げられる。一部の実施形態では、植物ホルモン生合成酵素は、インドール－３－アセトアミド加水分解酵素（ｉａａＨ）、トリプトファン２－モノオキシゲナーゼ（ＩａａＭ）、および／またはイソペンテニルトランスフェラーゼ（Ｉｐｔ）であってよく、任意選択で、インドール－３－乳酸合成酵素、およびその任意の組合せを挙げ得る。
一部の実施形態では、共生生物形成接種材料を生成する方法は、細胞内または植物上の少なくとも１つの部位に、少なくとも１つのプラストポリペプチド（たとえば可塑性ポリペプチド）をコードしているポリヌクレオチドを導入するステップであって、任意選択で、プラストポリペプチドが、それだけには限定されないが表１中に提供するプラストポリペプチドを含むステップをさらに含み得る。一部の実施形態では、プラストポリペプチドは、６ｂ、ｒｏｌＢ、ｒｏｌＣ、および／またはｏｒｆ１３である。
細胞内に導入するための、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび目的ポリヌクレオチドを、一緒にまたは別々に、１つまたは複数の核酸構築体（たとえば、１つまたは複数の発現カセットおよび／またはベクター）（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれより多くの構築体）中に含め得る。一部の実施形態では、プラストポリペプチド（たとえば少なくとも１つのプラストポリペプチド、たとえば、１、２、３、４、５、６個、またはそれより多く）をコードしているポリヌクレオチドを、１つまたは複数の核酸構築体（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれより多くの構築体）中に含めてよく、任意選択で、少なくとも１つのプラストポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび／または目的ポリヌクレオチドと同じまたは別個の核酸構築体（たとえば発現カセット）中にある。一部の実施形態では、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチド、目的ポリヌクレオチド、および／またはプラストポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む核酸構築体は、同じまたは別個の発現カセットであり得る発現カセット中に含め得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の核酸構築体（またはそれを含む発現カセット）は、１つまたは複数のベクター（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８個、またはそれより多く）中に含め得る。ポリヌクレオチドを細胞に移すために有用な任意のベクターを本発明の核酸構築体で使用し得る。一部の実施形態では、ベクターは、本発明のポリヌクレオチド、核酸構築体、および／または発現カセットで使用するための、プラスミド、Ｔ－ＤＮＡ、細菌人工染色体、ウイルスベクター、もしくはバイナリー－細菌人工染色体、またはその任意の組合せであり得る。
一部の実施形態では、本発明の方法に従って細胞内に導入した目的ポリヌクレオチドは、標的化配列と作動可能に連結したポリペプチドをコードすることができる。一部の実施形態では、標的化配列はタンパク質を膜、細胞内位置、または細胞外位置に位置付ける。一部の実施形態では、標的化配列は、それだけには限定されないが、膜標的化配列、小胞体標的化配列、ミトコンドリア標的化配列、葉緑体標的化配列、または植物ウイルス移動タンパク質であることができる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドを核に標的化させ得る。したがって、本明細書中に記載の植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび／または本明細書中に記載のプラストポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、細胞の核に標的化させるための核移行配列と作動可能に連結していてよい。
一部の実施形態では、植物ホルモン生合成遺伝子をコードしているポリヌクレオチドおよび／または目的ポリヌクレオチドは、それだけには限定されないが、プロモーター配列、ターミネーター配列、および／またはイントロンを含む調節要素と作動可能に連結していてよい。一部の実施形態では、植物ホルモン生合成遺伝子をコードしているポリヌクレオチドおよび／または目的ポリヌクレオチドがどちらもプロモーターと作動可能に連結している場合、それぞれが同じプロモーターまたは別個のプロモーターと任意の組合せで作動可能に連結していてよい。一部の実施形態では、植物ホルモン生合成遺伝子をコードしているポリヌクレオチドおよび／または目的ポリヌクレオチドがどちらもターミネーター配列と作動可能に連結している場合、それぞれが同じターミネーターまたは別個のターミネーターと任意の組合せで作動可能に連結していてよい。一部の実施形態では、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび目的ポリヌクレオチドは、それぞれ単一のプロモーターと作動可能に連結している。一部の実施形態では、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび目的ポリヌクレオチドは、少なくとも２つの別個のプロモーターと任意の組合せで作動可能に連結している。一部の実施形態では、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドが２つ以上の植物ホルモン生合成酵素（たとえば、ｉａａＨ、ＩａａＭ、およびＩｐｔ）をコードしている場合、２つ以上の植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチド（複数可）は単一のプロモーターと作動可能に連結しており、目的ポリヌクレオチドは別個のプロモーターと作動可能に連結している。
一部の実施形態では、複数の植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドを導入する場合（たとえば、ｉａａＨをコードしているポリヌクレオチド、ＩａａＭをコードしているポリヌクレオチド、Ｉｐｔをコードしているポリヌクレオチド、および／またはインドール－３－乳酸合成酵素をコードしているポリヌクレオチド）、複数の植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドは、目的ポリヌクレオチドと作動可能に連結したプロモーター同じまたは別個のプロモーターであり得る、同じまたは別個のプロモーターと作動可能に連結していてよい。一部の実施形態では、ｉａａＨをコードしているポリヌクレオチド、ＩａａＭをコードしているポリヌクレオチド、およびＩｐｔをコードしているポリヌクレオチドは単一のプロモーターと作動可能に連結しており、目的ポリヌクレオチドは別個のプロモーターと作動可能に連結している。一部の実施形態では、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチド（たとえば、ｉａａＨ、ＩａａＭ、およびＩｐｔ、ならびに／またはインドール－３－乳酸合成酵素）は単一のプロモーターと作動可能に連結しており、目的ポリヌクレオチドは同じプロモーターと作動可能に連結している。
一部の実施形態では、少なくとも１つのプラストポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、プロモーターと作動可能に連結していてよい。一部の実施形態では、少なくとも１つのプラストポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび／または目的ポリヌクレオチドと作動可能に連結しているものと同じプロモーターと作動可能に連結している。一部の実施形態では、少なくとも１つのプラストポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび／または目的ポリヌクレオチドと作動可能に連結しているプロモーターとは別個のプロモーターと作動可能に連結している。
植物ホルモン酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび／または目的ポリヌクレオチドが発現されることを可能にする任意のプロモーターを使用し得る。本明細書中に記載のように、プロモーターの選択は、発現のための時間的および空間的要件に応じて変動する場合があり、形質転換させる宿主細胞に基づいて変動する場合もある。多数の様々な生物のための様々な発現パターンを有するプロモーターは当技術分野で周知である。共生生物形成接種材料の作製において有用なプロモーターは、共生生物形成接種材料の１つもしくは複数の細胞に対して内在性であり得る、または共生生物形成接種材料の１つもしくは複数の細胞に対して異種であり得る、あるいはその任意の組合せである。一部の実施形態では、プロモーターは、プロモーターが作動可能に連結しているポリヌクレオチドに対して内在性または異種であり得る。
一部の実施形態では、共生生物形成接種材料の作製において有用なプロモーターは構成的プロモーターである。一部の実施形態では、共生生物形成接種材料の作製において有用なプロモーターは誘導性プロモーターである。
共生生物形成接種材料を生成するために有用な細菌細胞は、ＩＶ型分泌系（Ｔ４ＳＳ、たとえば、Ｔ４ＡＳＳ（たとえばＶｉｒＢ／Ｄ４システム）、（Ｔ４ＢＳＳ）またはＩＩＩ型分泌系（Ｔ３ＳＳ）を含む任意の細菌細胞であり得る。そのような細菌系は当技術分野で周知であり、それだけには限定されないが、アグロバクテリウム属の種（たとえば、エー・ツメファシエンス（たとえば次亜種１）、エー・リゾゲネス（たとえば次亜種２）、エー・ビティス（たとえば次亜種３）、エー・ファブルム（たとえばＣ５８株）、リゾビウム属の種、メソリゾビウム属の種、シノリゾビウム属の種、ブラディリゾビウム属の種、シュードモナス属の種（たとえばピー・サバスタノイｐｖ．サバスタノイ）、フィロバクテリウム属の種、オクロバクトラム属の種、アゾバクター属の種、クロステリウム属の種、クレブシエラ属の種、ロドスピリルム属の種、またはキサントモナス属の種のものが挙げられる。
その後に植物上に共生生物を形成するために使用し得る任意の植物細胞を使用して、共生生物形成接種材料を生成し得る。そのような植物細胞としては、それだけには限定されないが、被子植物（たとえば双子葉植物もしくは単子葉植物）、裸子植物、藻類（たとえば大型藻類、たとえば、紅藻植物門（紅藻）、褐藻植物門（褐藻類）、および緑藻植物門（緑藻類）、黄金色藻綱（黄金藻類））、蘚苔類、シダ類および／またはシダ様植物（すなわち羊歯植物）に由来するのものが挙げられる。細胞は、任意の年齢または大きさの野生型植物またはトランスジェニック植物（たとえば、実生、幼若植物、または成熟植物）に由来し得る。一部の実施形態では、本発明で有用な植物細胞としては、それだけには限定されないが、表２、表４、または以下の実施例セクションの前の段落中に提供する植物リスト中に列挙したものが挙げられる。一部の実施形態では、本発明で有用な植物細胞の例としては、柑橘類細胞（たとえば、グレープフルーツ、オレンジ、レモン、ライムなど）、トマト細胞、トウモロコシ細胞、ペカン細胞、およびタバコ細胞が挙げられる。
共生生物形成接種材料を生成するために有用な植物細胞は、それだけには限定されないが、植物細胞培養物（カルス、カルス培養物、もしくは懸濁培養）、プロトプラスト、実生、外植片、胚、葉、苗条、茎、枝、穀粒、穂、穂軸、穀皮、柄、表皮組織、頂端分裂組織、花の組織（たとえば、花粉、雌蕊、胚珠、葯、雄蕊、花冠、萼片、花弁、花床、花糸、花柱、柱頭など）、果実、種子、鞘、さく果、子葉、胚軸、葉柄、塊茎、球茎、根、根端、共生生物、節こぶ、植物栄養体、共生生物の住処、花外蜜腺、小結節、虫こぶ、または植物新生物を含む、任意の植物部分に由来することができる。
本明細書中に記載のように、一部の実施形態では、植物細胞を使用して共生生物形成接種材料を生成する場合、植物上の少なくとも１つの部位は、それだけには限定されないが、外植片、胚、葉、苗条、茎、枝、穀粒、穂、穂軸、穀皮、柄、表皮組織、頂端分裂組織、花の組織（たとえば、花粉、雌蕊、胚珠、葯、雄蕊、花冠、萼片、花弁、花床、花糸、花柱、柱頭など）、果実、種子、鞘、さく果、子葉、胚軸、葉柄、塊茎、球茎、根、根端、共生生物、節こぶ、植物栄養体、共生生物の住処、花外蜜腺、小結節、植物新生物、または虫こぶを含む、植物上の任意の部位であることができる。
核酸構築体（たとえば、ポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクター）は、任意の方法、既知の方法を介して細胞内に導入し得る。植物を含む原核および真核生物をどちらも形質転換させるための手順は、当技術分野において周知かつルーチン的であり、文献全体にわたって記載されている。一部の実施形態では、本発明の核酸構築体（たとえば、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチド、目的ポリヌクレオチド、ならびに／またはそれを含む発現カセットおよび／もしくはベクター）は、それだけには限定されないが、細菌媒介性形質転換、アグロ浸潤、ウイルス媒介性形質転換、粒子照射（微粒子銃）、電気穿孔、微量注入、リポフェクション（リポソーム媒介性形質転換）、超音波処理、シリコン繊維媒介性形質転換、化学刺激したＤＮＡの取り込み（たとえばポリフェクション、たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介性形質転換）および／またはレーザーマイクロビーム（ＵＶ）誘導性形質転換を含む方法を介して、細胞内に導入し得る。
一部の実施形態では、（ｉ）植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと目的ポリヌクレオチド配列または（ｉｉ）植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドが少なくとも１個の植物細胞中に含まれる場合、少なくとも１個の植物細胞は、植物上の少なくとも１つの部位（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０箇所、またはそれより多くの部位）上に移植し得る。一部の実施形態では、少なくとも１つの部位に移植された１つまたは複数の細胞（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個、またはそれより多くの細胞）をその部位で培養して、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと目的ポリヌクレオチド配列とを含む植物細胞集団を生成し、共生生物を形成し、ここで、植物上の共生生物からの１つまたは複数の細胞を選択して植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと目的ポリヌクレオチド配列とを含む１つまたは複数の細胞を提供し、それによって共生生物形成接種材料を生成する。
一部の実施形態では、植物を使用して共生生物形成接種材料を生成する場合、植物上の少なくとも１つの部位を、植物上の少なくとも１つの部位（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０箇所、またはそれより多くの部位）に導入するステップの前に、それと同時に、またはその後に、接種部位で傷つけ得る。同様に、共生生物を宿主植物上の少なくとも１つの部位上に移植する場合、宿主植物の少なくとも１つの部位を、移植するステップの前に、それと同時に、またはその後に傷つけ得る。導入または移植のために傷つけることは、導入または移植が起ころうとする部位での、植物またはその一部の外表面（表皮、クチクラ、樹皮）の割れをもたらす任意の様式で実施することができる。そのようなツールとしては、それだけには限定されないが、ピンセットもしくは鉗子、ナイフ、針たとえば（たとえば、皮下用、解剖用、入れ墨用、裁縫用など）、爪楊枝、および／またはシリンジを挙げることができる。さらに、任意の標準の移植ツールを、本明細書中に記載のように導入または移植するために使用し得る。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（たとえば植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチド（たとえば少なくとも１つの植物ホルモン生合成酵素をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチド）、目的ポリヌクレオチド、それを含む発現カセット（複数可）またはベクター（複数可））を植物細胞、植物、またはその一部内に導入することは、細菌媒介性形質転換を介して実施し、植物細胞もしくは植物（またはその一部、たとえば外植片）を、少なくとも１つの細菌種または株（たとえば、１、２、３，４、５個、またはそれより多く）の細胞と共に同時培養することを含み、細菌細胞は、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチド、目的ポリヌクレオチド、および／または少なくとも１つのプラストポリペプチドコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドのうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、植物（またはその一部、たとえば外植片）を、少なくとも１つの細菌株の細胞との同時培養の前またはその間に、接種部位で傷つけ得る。一部の実施形態では、少なくとも１つの細菌種または株の細胞は少なくとも２つの細菌種または株の細胞を含み、植物ホルモン酵素をコードしているポリヌクレオチドは、少なくとも１つの目的ポリヌクレオチドを含む細菌株とは別個の細菌株中に含まれる（たとえば二重細菌形質転換）。本明細書中に記載のように、共生生物形成接種材料を生成するために有用な細菌細胞は、ＩＶ型分泌系（Ｔ４ＳＳ、たとえば、Ｔ４ＡＳＳ（たとえばＶｉｒＢ／Ｄ４システム）、Ｔ４ＢＳＳ）またはＩＩＩ型分泌系（Ｔ３ＳＳ）を含む任意の細菌細胞であってよく、それだけには限定されないが、アグロバクテリウム属の種（たとえば、エー・ツメファシエンス（たとえば次亜種１）、エー・リゾゲネス（たとえば次亜種２）、エー・ビティス（たとえば次亜種３）、エー・ファブルム（たとえばＣ５８株）、リゾビウム属の種、メソリゾビウム属の種、シノリゾビウム属の種、ブラディリゾビウム属の種、シュードモナス属の種、フィロバクテリウム属の種、オクロバクトラム属の種、アゾバクター属の種、クロステリウム属の種、クレブシエラ属の種、ロドスピリルム属の種、またはキサントモナス属の種のものを挙げることができる。一部の実施形態では、シュードモナス属の種（たとえばピー・サバスタノイｐｖ．サバスタノイ）。一部の実施形態では、細菌細胞は、シュードモナス・サバスタノイｐｖ．サバスタノイ細胞であり得る。この方法を適用し得る植物種は限定されない。上述のように、少なくとも１９８０年代初期から、人の介入を通じて、ＤＮＡを植物に転移させる細菌の能力は、細菌によって天然に感染されるものを越えて多数の種へと拡張されている。アグロバクテリウム属の種の天然宿主である植物、および天然宿主ではないがアグロバクテリウム属の種を使用して形質転換されることができることが示されている一部の植物の非限定的な例を、表２に提供する。当業者には容易に理解されるであろうように、表２中に記載の植物の属および種、ならびに任意の他の植物の属および種は、宿主植物として、または本明細書中に記載の共生生物形成接種材料を作製するために使用し得る。一部の実施形態では、宿主植物として使用し得る、および共生生物形成接種材料をそれから作製し得る、植物の属および種としては、それだけには限定されないが、表４、または以下の実施例セクションの前の段落中に提供する植物リスト中に提供するものが挙げられる。
一部の実施形態では、共生生物形成接種材料を生成する方法は、共生生物形成接種材料の少なくとも１つの細胞中の少なくとも１つの核酸を編集して、共生生物形成接種材料中に少なくとも１つの編集された核酸を生成するステップをさらに含み得る。それだけには限定されないが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ技術、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）技術、転写活性化剤様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）技術、および操作したメガヌクレアーゼ技術を含む、それだけには限定されないがヌクレアーゼに基づく編集系を含む任意の既知の遺伝子編集技術を使用し得る。一部の実施形態では、少なくとも１つの編集された核酸は発現が改変されている。一部の実施形態では、改変された発現は、同じ改変を含まない同じ核酸と比較して増加した発現を含む。一部の実施形態では、改変された発現は、同じ改変を含まない同じ核酸と比較して減少した発現を含む。
本発明は、本発明の方法によって生成した共生生物形成接種材料をさらに提供する。一部の実施形態では、共生生物形成接種材料は、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチド（たとえば１つまたは複数（たとえば、１、２、３、４、５個、またはそれより多く）の植物ホルモン生合成酵素をコードしている１つまたは複数（たとえば、１、２、３、４、５個、またはそれより多く）のポリヌクレオチド）と目的ポリヌクレオチド（たとえば少なくとも１つの目的ポリヌクレオチド（たとえば、１、２、３、４、５個、またはそれより多く））とを含む、細菌培養物である。一部の実施形態では、共生生物形成接種材料は、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチド（たとえば１つまたは複数の植物ホルモン生合成酵素をコードしている１つまたは複数のポリヌクレオチド）と目的ポリヌクレオチド（たとえば少なくとも１つの目的ポリヌクレオチド）とを含む、植物細胞培養物（たとえばカルスまたは細胞懸濁液）の形態の２個以上の細胞を含む。
一部の実施形態では、本発明は、本発明の共生生物形成接種材料に由来する細胞またはプロトプラストを提供し、細胞またはプロトプラストは、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと目的ポリヌクレオチドとを含む。
本発明の共生生物形成接種材料または本発明の共生生物を宿主植物上の少なくとも１つの部位（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０箇所、またはそれより多くの部位）に移植するステップと、共生生物形成接種材料を宿主植物の少なくとも１つの部位で培養して、共生生物を宿主植物上の少なくとも１つの部位で形成させるステップであって、目的ポリヌクレオチドが宿主植物上の共生生物中で発現され、目的ポリヌクレオチドの発現産物および／または目的ポリヌクレオチドの発現産物を使用して作られた生成物が宿主植物内に輸送され、それによって宿主植物特徴を改変させるステップとを含む、植物ゲノムを改変させずに宿主植物特徴を改変させる方法をさらに提供する。「植物ゲノムを改変させずに宿主植物特徴を改変させること」とは、宿主植物の遺伝子型を変化させない、宿主植物の形態学、代謝、生化学、および／または生理学の変化をいう。
植物宿主特徴させるために本発明の共生生物で有用な目的ポリヌクレオチドとしては、１つまたは複数の部位で宿主植物上に固定されている共生生物中における発現のための本明細書中に記載の分子（たとえば、１つまたは複数のポリペプチド、ペプチド、コードＲＮＡ、または非コードＲＮＡ、たとえば、生体分子、生物活性分子）をコードしているポリヌクレオチドを挙げることができ、分子は、宿主植物内に輸送される場合、分子が宿主植物の遺伝子型またはゲノムを変更させずに宿主植物に新しい特徴を与えることができる。一部の実施形態では、目的ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載のように、生体分子もしくは生物活性分子をコードしていてよい、または生体分子および／もしくは生物活性分子のための生合成酵素（たとえば生体分子もしくは生物活性分子の生合成に関与しているポリペプチド）をコードしていてよい。本明細書中に記載のように、宿主植物上に形成された共生生物中に含まれる「目的ポリヌクレオチド」は、１つの目的ポリヌクレオチドであり得る、あるいは２つ以上（たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５個、またはそれより多く）の目的ポリヌクレオチドであり得る。２つ以上の目的ポリヌクレオチドが共生生物中に含まれる場合、共生生物は、「スタッキングした」共生生物と呼び得る。さらに、宿主植物上に形成された１つまたは複数の共生生物であって、共生生物のうちの少なくとも２つが異なるＰＯＩを含む共生生物は、「スタッキングした共生生物」と呼び得る。スタッキングは、１つまたは複数の共生生物を宿主植物上に形成することであって、すべての共生生物が同じＰＯＩ（複数可）を含むことも含み得る。
一部の実施形態では、改変された宿主植物特徴を与えるために使用する、共生生物中に含まれる植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドは、１つまたは複数の植物ホルモン生合成酵素をコードしていてよい。一部の実施形態では、１つまたは複数の植物ホルモン生合成酵素は、１つまたは複数のポリヌクレオチドによってコードされていてよい。すなわち、共生生物が、複数の植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドを含む場合、複数の植物ホルモン生合成酵素は、別の植物ホルモン生合成酵素と同じポリヌクレオチド上または別個のポリヌクレオチド上に、任意の組合せでコードされていてよい。
本発明の共生生物中で発現させる植物ホルモン生合成酵素は、植物細胞中で発現させて、自律的に分裂または複製する植物細胞を生成し、任意選択で未分化の多細胞構造を生成することができる、任意のオーキシンまたはサイトカイニン生合成酵素であり得る。本明細書中に記載のように、本明細書中に記載のように植物細胞中で発現させて自律的に分裂または複製する植物細胞を生成することができる任意のオーキシン生合成酵素またはサイトカイニン生合成酵素を使用して、共生生物形成接種材料を作製し得る。例示的なオーキシンおよびサイトカイニン生合成酵素ならびにそれをコードしているポリヌクレオチドは上に詳述されており、それだけには限定されないが、インドール－３－アセトアミド加水分解酵素（ｉａａＨ）（Ｅ．Ｃ．番号：ＥＣ３．５．１．４）、アミダーゼ１（ＥＣ３．５．１．４）、トリプトファン２－モノオキシゲナーゼ（ＩａａＭ）（ＥＣ１．１３．１２．３）、インドール－３－乳酸合成酵素（ＥＣ１．１．１．１１０）、Ｌ－トリプトファン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ１（ＥＣ２．６．１．９９）、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ関連タンパク質１（ＥＣ２．６．１．２７）、インドール－３－アセトアルデヒドオキシダーゼ（ＥＣ１．２．３．７）、および／またはトリプトファン脱炭酸酵素１／トリプトファン脱炭酸酵素２（ＥＣ４．１．１．１０５）を含むオーキシン生合成酵素が挙げられる。一部の実施形態では、植物ホルモン生合成酵素はサイトカイニン生合成酵素である。本発明で有用なサイトカイニン生合成酵素としては、それだけには限定されないが、イソペンテニルトランスフェラーゼ（Ｉｐｔ）（別名：アデノシンリン酸－イソペンテニルトランスフェラーゼ、アデニル酸ジメチルアリルトランスフェラーゼ、（ジメチルアリル）アデノシンｔＲＮＡメチルチオトランスフェラーゼ）（Ｅ．Ｃ．番号：２．５．１．２７もしくは２．５．１．７５もしくは２．５．１．１１２）、および／またはＴｚｓ（別名：ジメチルトランスフェラーゼ、イソペンテニルトランスフェラーゼ、トランス－ゼアチン生成タンパク質、アデニル酸ジメチルアリルトランスフェラーゼ）（ＥＣ２．５．１．２７）が挙げられる。一部の実施形態では、植物ホルモン生合成酵素は、インドール－３－アセトアミド加水分解酵素（ｉａａＨ）、トリプトファン２－モノオキシゲナーゼ（ＩａａＭ）、および／またはイソペンテニルトランスフェラーゼ（Ｉｐｔ）であってよく、任意選択で、インドール－３－乳酸合成酵素、およびその任意の組合せを挙げ得る。一部の実施形態では、植物ホルモン生合成酵素は、任意の組合せで、インドール－３－アセトアミド加水分解酵素（ｉａａＨ）、トリプトファン２－モノオキシゲナーゼ（ＩａａＭ）、および／またはイソペンテニルトランスフェラーゼ（Ｉｐｔ）であってよい。一部の実施形態では、本発明の共生生物は、インドール－３－乳酸合成酵素である植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドをさらに含み得る。
一部の実施形態では、本発明の共生生物は、プラストポリペプチド（たとえば可塑性ポリペプチド）をコードしているポリヌクレオチドをさらに含み、それを発現し得る。本発明で有用なプラストポリペプチドは、本発明の核酸構築体を使用して形成される共生生物の構造に利益を与えることができる、現在知られているまたは後に発見される任意のプラストポリペプチドであることができる。本発明の共生生物に有用なプラストポリペプチドの例としては、それだけには限定されないが、表１中に提供するものが挙げられる。一部の実施形態では、プラストポリペプチドは、６ｂ、ｒｏｌＢ、ｒｏｌＣ、および／またはｏｒｆ１３であり得る。一部の実施形態では、プラストポリペプチドをコードしている複数のポリヌクレオチドは本発明の共生生物中に含まれ得る。
一部の実施形態では、共生生物形成接種材料の培養は、宿主植物上の細菌細胞中に含まれる場合は、約１０μＭ～約２００μＭの範囲、またはそれ中の任意の範囲もしくは値（たとえば、約１０、１５、２０、２５、３０、３５０ ４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、もしくは１５０μＭ、またはそれ中の任意の範囲もしくは値）（たとえば、約５０μＭ～約１５０μＭ、約７５μＭ～約１２５μＭ、約８５μＭ～約１００μＭ）の濃度のアセトシリンゴンの存在下で培養することをさらに含むことができる。一部の実施形態では、アセトシリンゴンの存在下で培養する場合、アセトシリンゴンは約１００μＭの濃度で存在する。
一部の実施形態では、細菌細胞を含む共生生物形成接種材料は、宿主植物ゲノムを改変させずに宿主植物特徴を改変させるために使用し得る。一部の実施形態では、アグロバクテリウム属の種を含有する共生生物形成接種材料を、たとえば第１の植物に送達し得る。アグロバクテリウム属の種は１つまたは複数の株の形態であってよく、少なくとも１つの株が、共生生物の形成を誘導する少なくとも１つの植物ホルモン生合成酵素をコードしている核酸（これは、たとえばＴ－ＤＮＡ中で提供され得る）を含有し、少なくとも１つの株が、宿主植物に与える所望の形質をコードしている、目的ポリヌクレオチドを含む核酸（これは、たとえばＴ－ＤＮＡ中で提供され得る）を含有する。したがって、接種材料の送達は、１つまたは複数（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれより多く）の共生生物が第１の植物上に形成されることを引き起こす場合があり、共生生物は、アグロバクテリウム属の種によって送達される核酸を発現し得る。共生生物は、共生生物組織中の維管束新生が増加しており、それ自体が、迅速な成長、より迅速な代謝、および有効な輸出経路、ならびに最終的には植物全体にわたる所望の分子の全身性移動を支持する。一部の実施形態では、その後、共生生物は、第１の植物から取り出され、第２の植物（たとえば宿主植物）上へと付加／移植されて、宿主植物と機能的情報交換するようになり、したがって、宿主植物に所望の形質を供給するが、宿主植物のゲノムを形質転換させずにもしくは変更せずに、または異種もしくは生体異物ＤＮＡを宿主植物内に導入せずに、植物組織を形成し得る。一部の実施形態では、宿主植物への移植の前に、取り出された共生生物は共生生物形成接種材料となり、これを、アグロバクテリウム属の種を使用せずに培養して無細菌共生生物形成接種材料を形成してよく、その後、共生生物形成接種材料を宿主植物に移植し得る。
本発明において使用するアグロバクテリウム属の種の株（複数可）の選択肢に関して、様々な単一株またはその組合せが、所望の結果を達成するために使用可能である。一実施形態によれば、接種材料は、使用する少なくとも１つの株が少なくとも１つの植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドを含む「活性株」（野生型基準株など）であり、少なくとも１つの他の株が活性株ではないが（たとえば「安全化した」「形質誘導性」株）所望の形質を与える核酸（たとえばＴ－ＤＮＡ）（目的ポリヌクレオチド）を含む、少なくとも２つの株を、宿主植物中に含む。野生型アグロバクテリウム属の種は虫こぶを形成することが知られているため、活性株は、本明細書中に記載のＦＬ－Ｆ５４株など、自然から単離されていてよい。所望の形質は、たとえば、抗微生物もしくは抗昆虫特性を有すること、植物生理学の変化、または他のものであり得る。形質は、形質誘導性アグロバクテリウム属の種中の核酸（たとえばＴ－ＤＮＡ）によってコードされている分子などの、１つまたは複数の分子（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれより多くの分子）によって発現または達成され得る。これらの分子は、所望に応じて、小分子、大分子、タンパク質、ポリマー、または他のものであり得る。特定の応用の所望に応じて、複数の活性株および／または複数の形質誘導性株を使用し得る。あるいは、共生生物の形成を誘導し、また共生生物が付加されている宿主植物において宿主植物ゲノムを改変させずに所望の形質も誘導する、単一の株を使用し得る。この方法を適用し得る植物種は限定されない。今日では、アグロバクテリウム属および他の細菌種を使用してＤＮＡを植物に転移させることはルーチン的である。アグロバクテリウム属の種の天然宿主である植物、および天然宿主ではないがアグロバクテリウム属の種を使用して形質転換されることができることが示されている一部の植物の非限定的な例を、表２に提供する。この表中に列挙した植物は、双子葉植物および単子葉植物をどちらも含む多数の様々な植物の科に由来しており、この方法を使用し得る植物の種類が限定されないことを実証している。一部の実施形態では、この方法で使用し得る植物の属および種としては、それだけには限定されないが、表４、または以下の実施例セクションの前の段落中に提供する植物リスト中に提供するものが挙げられる。
接種材料は、担体に加えて、上述の１つまたは複数のアグロバクテリウム属の種の株（複数可）（たとえば、１、２、３、４、５個、またはそれより多くの株）、および所望に応じて他の成分を含有し得る。複数の株を使用する場合、所望に応じて様々な株比、たとえば、１：１０の活性株対形質誘導性株の比を使用し得る。アグロバクテリウム属の種の送達接種材料は当技術分野で周知であり、特定の応用における所望の結果に基づいて適切なものを選択することができる。たとえば、接種材料は、ＭＥＳ（２－エタンスルホン酸）、Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）、もしくはＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）などの塩に基づく緩衝液等の緩衝剤水溶液、塩化マグネシウムなどの１つもしくは複数の塩、病原性を増強させることができるアセトシリンゴンもしくは他のフェノール類などの形質転換エンハンサー、ならびに／またはそれだけには限定されないが、それだけには限定されないが陰イオン性、陽イオン性、および非イオン性海面活性剤を含めた湿潤剤／浸透増強界面活性剤を含むアジュバントを含有し得る。接種材料の送達は、針、穿刺創傷、または他の直接送達系、すなわちドリルもしくはエアブラストの使用を介するものなどの、任意の既知の方法によって達成してよく、自動または手動であってよい。
共生生物の形成は眼で観察することができ、共生生物の大きさは、化学制御（すなわちＧＡＬＬＥＸ（登録商標）（ＡｇＢｉｏＣｈｅｍ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州Ｌｏｓ Ｍｏｌｉｎｏｓ））などの既知の手段を介して任意選択で制御することができる。共生生物の形成は、使用する宿主植物種および植物年齢に応じて様々な期間がかかり得る。たとえば、十分な共生生物の形成は、発達するまでに数日間から数カ月間がかかり得る。一部の実施形態では、共生生物または共生生物組織を第１の植物から収集し、その後、体積の増加または貯蔵目的のために培養することができる。一部の実施形態では、共生生物を第１の植物から第２の植物（たとえば宿主植物）へと、培養せずに直接移行させ得る。しかし、（ａ）自然減もしくは能動的な滅菌などによって残留細菌を除去する、または（ｂ）共生生物形成接種材料が所望の形質（複数可）を発現することを決定するために、共生生物形成接種材料を最初に培養することが望ましい場合がある。残留アグロバクテリウム属の種の除去は、細菌を支持しない培養物を供給し、したがってそれが死に絶えていくことによるものなどの自然減によって経時的に、あるいは、漂白剤および／もしくは抗生物質の施用を用いた滅菌または細菌培養物を能動的に死滅させる他の方法などの能動的手段によって、起こり得る。共生生物通知（ｉｎｆｏｒｍｉｎｇ）接種材料または共生生物が所望の形質を発現するかどうかの決定は、形質が表現型的に可視（色など）である場合は単純な観察によって、または共生生物もしくは共生生物形成接種材料によって生成される標的化合物（複数可）について培養培地／宿主植物を分析することによって、あるいは任意の他の既知の手段によって達成し得る。
任意の既知かつ適用可能な手段によって、共生生物を植物から取り出し、第２の植物（たとえば宿主植物）に付加（移植）させるための共生生物形成接種材料として使用し得る。共生生物形成接種材料として使用するための、取り出した共生生物の全体が、必ずしも所望の結果を達成しない場合があることに注意されたい。たとえば、共生生物由来の一部の安定材料のみ（たとえば１つまたは複数の細胞）を取り出して、宿主植物に付加／移植させるために使用し得る。そのような方法では、取り出して培養する単一の共生生物の細胞を増殖して、複数の宿主植物（たとえば共生生物形成接種材料として）上に移植するための材料を提供し得る。１つの植物または共生生物もしくは共生生物形成接種材料などの植物部分を別の植物（たとえば宿主植物）上に移植するための技法は当技術分野で周知であり、本発明において使用することができる。優先的に、共生生物形成接種材料は、形成される共生生物が宿主植物の維管束系と機能的情報交換しているように、または宿主植物の維管束系との機能的情報交換が達成可能であるように、宿主植物に付加させ得る。移植方法は、共生生物組織が移植後に必要な維管束の接続を発生することを、これらの接続が移植と同時に確立されないとしても、可能にし得る。このようにして、共生生物によって生成された所望の形質／化合物は、第２の植物の維管束系を通って移動し得る。一部の実施形態では、共生生物によって生成された所望の形質／化合物は、アポプラストおよび／またはシンプラストを介して宿主植物に輸送され得る。一部の実施形態では、共生生物によって生成された所望の形質／化合物は、アポプラスト、シンプラスト、もしくは宿主植物と共生生物との間に発生する維管束系を介して、またはその任意の組合せを介して、宿主植物に輸送され得る。
第１（共生生物をそれ上に成長させるまたはそれから発生させる元の植物）および第２の植物（たとえば、共生生物形成接種材料をそれ上に移植し得る宿主植物）は、異なる種間の植物材料の特異的相互操作性（すなわち移植適合性）に応じて、同じ種または異なる種のものであり得る。
一部の実施形態では、活性細胞／組織を、上述のように植物をアグロバクテリウム属の種の少なくとも１つの活性株で接種することによって形成させてよく、活性細胞／組織を第１の植物から取り出し、その後、少なくとも１つの形質誘導性アグロバクテリウム属の種の株を含有する溶液中で培養してよい。形質誘導性株からの核酸（たとえばＴ－ＤＮＡ）の十分な取り込みの後、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチド（複数可）および形質誘導性核酸（ＰＯＩ）（たとえば共生生物形成接種材料）をどちらも含有する植物細胞が培養物中に存在し得る。これらの細胞（たとえば、共生生物形成細胞または接種材料）は、既知の方法によって選択し、その後、所望に応じて使用し得る。たとえば、細胞を選択し、取り出し、培養して、目的の形質を有する共生生物形成接種材料（たとえば、２個以上の細胞を含む細菌細胞集団、カルス組織、および／または懸濁培養）をより多く作製し得る。その代わりに、またはそれに加えて、その後、共生生物形成接種材料の選択された細胞を上述のように使用し得る（すなわち、滅菌し、第２の植物（たとえば宿主植物など）上に移植する。
一部の実施形態では、少なくとも１つのｐＳＹＭ（たとえば、少なくとも１つの植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび少なくとも１つのＰＯＩ）を含む細菌（たとえば少なくとも１つのｐＳＹＭを含む１つまたは複数のアグロバクテリウム属の種の細胞）を宿主植物に直接送達し得る（それ上に接種し得る）。一部の実施形態では、共生生物形成接種材料は、上述のように１つのアグロバクテリウム属の種の株または複数のアグロバクテリウム属の種の株を含み得る（たとえば、１つの株が少なくとも１つの植物ホルモン生合成酵素をコードしている１つまたは複数のポリヌクレオチドを含み、１つの株がＰＯＩを含む、または、単一の株が少なくとも１つの植物ホルモン生合成酵素をコードしている１つまたは複数のポリヌクレオチドおよびＰＯＩをどちらも含む）。このようにして、宿主植物上に形成されて生じた共生生物組織は、宿主植物を形質転換させる必要性なしに、所望の分子（複数可）に関して、宿主植物のためのまたは宿主植物上の有益なバイオファクトリーとして役割を務めるであろう。一部の実施形態によれば、接種した株の一部または全部は、有用な共生生物（すなわち、維管束過剰増生を有しており、所望の形質のための所望の分子を生成する共生生物）が植物上に形成された後、細菌が死に絶え、もはや共生生物中に存在しなくなるように、低い生命力となるように操作し得る。
一部の実施形態では、共生生物形成接種材料を宿主植物上で培養することは、湿度を増加させる条件下で培養することをさらに含むことができる。たとえば、共生生物形成接種材料と接触させるまたは共生生物をそれ上に移植する、宿主植物上の部位は、共生生物または共生生物形成接種材料の隣接領域における湿度を増加させるために覆い得る。宿主植物上に移植された共生生物または共生生物形成接種材料を取り囲む領域中の湿度を保持する、任意の種類の覆いを使用し得る。一例として、宿主植物上の部位に位置する共生生物または共生生物形成接種材料をフィルムで包むまたは覆って、湿度を保持し得る。一部の実施形態では、フィルムとしては、それだけには限定されないが、プラスチックフィルム、シリコンテープ、および／またはパラフィルムを挙げることができる。一部の実施形態では、共生生物または共生生物形成接種材料の領域における湿度を増加させるために、移植の後（たとえば、直後または約１５分間以内～５時間後）に、約１時間～約７２時間もしくはそれより長く、約１時間～約４８時間もしくはそれより長く、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０時間から約１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６時間もしくはそれより長く、あるいはそれ中の任意の範囲もしくは値の間、宿主植物上の共生生物または共生生物形成接種材料を覆い得る。一部の実施形態では、共生生物または共生生物形成接種材料の領域における湿度を増加させるために、移植（宿主植物）または接種（接種材料形成）の後に、約１０時間～約３０時間（たとえば、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０時間）の間、任意選択で約２４時間の間、宿主植物上の共生生物または共生生物形成接種材料を覆い得る。
一部の実施形態では、宿主植物上の少なくとも１つの部位の移植の前にまたはそれと同時に、宿主植物を少なくとも１つの部位で傷つけ得る。傷つけは、任意の様式で、共生生物または共生生物形成接種材料を移植する部位で植物または植物部分の外表面（表皮、クチクラ、樹皮）に割れつくるために有用な任意のツールを使用して実施することができる。そのようなツールとしては、それだけには限定されないが、ピンセットもしくは鉗子、ナイフ、針たとえば（たとえば、皮下用、解剖用、入れ墨用、裁縫用など）、爪楊枝、および／またはシリンジを挙げることができる。さらに、任意の標準の移植ツールを、本明細書中に記載のように導入または移植するために使用し得る。
一部の実施形態では、宿主植物上の少なくとも１つの部位は、宿主植物の地上部分上および／または宿主植物の地下部分上にあることができる。
一部の実施形態では、共生生物は少なくとも２回宿主植物上に移植する。一部の実施形態では、共生生物形成接種材料は少なくとも２回宿主植物上に移植する。一部の実施形態では、共生生物および／または共生生物形成接種材料は、宿主植物上の少なくとも２つの部位上に移植する。
一部の実施形態では、目的ポリヌクレオチドの発現産物は、転写産物もしくは翻訳産物、またはその改変体であり得る。一例として、目的ポリヌクレオチドの発現産物は転写産物のメチル化であり得る。一部の実施形態では、目的ポリヌクレオチドの発現産物は、たとえば翻訳産物グリコシル化であり得る。翻訳産物はタンパク質（ポリペプチド）またはペプチドであり得る。転写産物はリボ核酸（ＲＮＡ）である。一部の実施形態では、ＲＮＡはコードＲＮＡ（たとえばｍＲＮＡ）である。一部の実施形態では、ＲＮＡは、それだけには限定されないが、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、および／または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む、非コードＲＮＡである。
一部の実施形態では、目的ポリヌクレオチドの発現産物は、それだけには限定されないが化学物質、タンパク質（ポリペプチド／ペプチド）、またはポリヌクレオチドを含むことができる別の生成物を作製するために使用し得る、生合成酵素であり得る。
改変された宿主植物特徴としては、それだけには限定されないが、宿主植物の代謝の変化、宿主植物の構造（たとえば形態学）の変化、ならびに／または宿主植物の代謝、生化学、および／もしくは生理学の変化を含む、任意の植物特徴の改変が挙げられ得る。一部の実施形態では、改変された宿主植物特徴は、たとえば、たとえば真菌、細菌、ウイルス、および／または原虫などの病害を引き起こす生物に対する植物の応答の変化であることができる。したがって、一部の実施形態では、改変された宿主植物特徴は、共生生物を含まない植物と比較した、病害を引き起こす生物に対する耐容／耐性の増加をもたらすことができる。病害を引き起こす生物としては、それだけには限定されないが、真菌、細菌、ウイルス、および／または原虫を挙げることができる。一部の実施形態では、改変された宿主植物特徴は、植物防御遺伝子の増加した（誘導された）発現であり、それによって、増加した病害耐性を有する宿主植物がもたらされる。一部の実施形態では、増加させることができる植物防御遺伝子としては「Ｗボックス」防御遺伝子が挙げられる。Ｗボックス防御遺伝子としては、それだけには限定されないが、ＣＡＤ１、ＮＰＲ１、および／またはＰＲ２を挙げることができる。一部の実施形態では、植物防御遺伝子は、共生生物を介して、宿主植物に輸送され、宿主植物において全身性の獲得耐性応答を刺激する化学物質などの、共生生物中における化学物質の生成を通じて、宿主植物において増加させることができる。一部の実施形態では、植物防御遺伝子は、宿主植物中における、宿主植物において全身性の獲得耐性応答を刺激する化学物質の生成を通じて、宿主植物において増加させることができ、宿主植物中で化学物質を生成する生化学的経路は、宿主植物に輸送される、共生生物中の目的ポリヌクレオチドの産物によって改変されている。
一部の実施形態では、改変された宿主植物特徴は、たとえば昆虫または線虫に対する植物の応答の変化であることができる。したがって、一部の実施形態では、改変された宿主植物特徴は、共生生物を含まない植物と比較した昆虫耐容／耐性の増加である。それに対する耐容または耐性を増加させることができる昆虫としては、それだけには限定されないが、鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ）、鞘翅目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａｎ）、半翅類（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ）、総翅目（Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａ）、および双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）の目の昆虫が挙げられる。一部の実施形態では、改変された宿主植物特徴は、共生生物を含まない植物と比較した線虫耐容／耐性の増加である。それに対する耐容または耐性を増加させることができる線虫としては、それだけには限定されないが、根瘤線虫（メロイドギネ属（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ）の種）、シストセンチュウ（ヘテロデラ属（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ）の種およびグロボデラ属（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ）の種）、ネグサレセンチュウ（ネグサレセンチュウ属（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）の種）、穿孔線虫（バナナネモグリセンチュウ（Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ ｓｉｍｉｌｉｓ））、レニフォーム線虫（ロチレンクルス・レニフォルミス（Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ））、ブドウ線虫（ブドウオオハリセンチュウ（Ｘｉｐｈｉｎｅｍａ ｉｎｄｅｘ））、ならびに柑橘類線虫（チレンクルス・セミペネトランス（Ｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ ｓｅｍｉｐｅｎｅｔｒａｎｓ））が挙げられる。
一部の実施形態では、改変された宿主植物特徴は、細菌性有害生物に対する植物の応答の変化であることができる。したがって、一部の実施形態では、改変された宿主植物特徴は、共生生物を含まない植物と比較した、細菌性有害生物に対する耐容／耐性の増加である。本発明は、それだけには限定されないが、かいよう病菌（Ｘａｎｔｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ）、キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、火傷病菌（Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ）、軟腐病菌（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、カンジダタス・リベリバクター・アシアティカス、カンジダタス・リベリバクター・ソラナセアラム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）、シリンゲ菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）、ピアス病菌（Ｘｙｌｅｌｌａ ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ）、ディケヤ・ソラニ（Ｄｉｃｋｅｙａ ｓｏｌａｎｉ）、ディケヤ・ダダンチイ（Ｄｉｃｋｅｙａ ｄａｄａｎｔｉｉ）、ペクトバクテリウム・カロトボラム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）、および／または青枯病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）を含む多数の細菌性有害生物に対する耐性または耐容を増加させることができる、方法および組成物を提供する。
一部の実施形態では、改変された宿主植物特徴は、除草剤に対する植物の応答の変化であることができる。したがって、一部の実施形態では、改変された宿主植物特徴は、共生生物を含まない植物と比較した除草剤耐容／耐性の増加である。それに対して耐性または耐容を有するように宿主植物特徴を改変し得る除草剤の例としては、それだけには限定されないが、グリホサート、トリアジン、ジカンバ、２，４－Ｄ、クロピラリド、フルミオキサジン、カルフェントロゾン（ｃａｒｆｅｎｔｒｏｚｏｎｅ）－エチル、スルフェントロゾン（ｓｕｌｆｅｎｔｒｏｚｏｎ）、ラクトフェン、ホメサフェン、アシフルオルフェン、メソトリオン、スルコトリオン、テンボトリオン、トプラメゾン、ピコリナフェン、クロマゾン、イソキサフルトール、メフェナセット、フルフェナセット、イマザモックス、イマザピル、イマゼタピル、リムスルフロン、トリベヌロン－メチル、トリアスルフロン、ニコスルフロン、スルホスルフロン、スルホメツロン－メチル、メソスルフロン－メチル、アジムスルフロン、アミドスルフロン、シクロスルファムロン、フルメツラム、メトスラム、フロラスラム、ジクロスラム、および／またはチエンカルバゾン－メチルが挙げられる。したがって、一部の実施形態では、改変された宿主植物特徴は、共生生物を含まない植物と比較した除草剤耐容／耐性の増加である。宿主植物における増加した除草剤耐容／耐性は、１つの除草剤に対するものであり得る、または２つ以上の異なる除草剤に対するものであり得る。
一部の実施形態では、改変された宿主植物特徴は、非生物的ストレスに対する植物の応答の変化であることができる。一部の実施形態では、改変された宿主植物特徴は、本発明の共生生物を含まない植物と比較した、非生物的ストレスに対する耐容である。一部の実施形態では、宿主植物は、複数の非生物的ストレス耐容（たとえば、１、２、３、４、５個、またはそれより多くの非生物的ストレス）に対して増加した耐容を示し得る。本明細書中で使用する用語「非生物的ストレス」とは、植物に対して有害な効果を引き起こす場合がある、外部の非生物の要因をいう。したがって、本明細書中で使用する非生物的ストレスとしては、それだけには限定されないが、凍結をもたらす低温、冷え、熱もしくは高温、渇水、水分過剰、高い光強度、低い光強度、高い紫外線、塩分、オゾン、および／またはその組合せが挙げられる。非生物的ストレス要因のパラメータは種特異的であり、さらには変種特異的であり、したがって、非生物的ストレスに曝される種／変種に従って広く変動する。したがって、１つの種は２３℃の高温によって重大な影響を受け得る一方で、別の種は少なくとも３０℃などまで影響を受けない可能性がある。３０℃を超える温度は、ほとんどの重要な作物の収量に劇的な低下をもたらす。これは、およそ２０～２５℃で始まる光合成の低下、およびより高温で成長する作物の炭水化物要求の増加が原因である。臨界温度は絶対的ではなく、一般的な環境条件に対する作物の気候順化などの要因に応じて変動する。さらに、ほとんどの作物は一度に複数の非生物的ストレスに曝されるため、ストレス間の相互作用が植物の応答に影響を与える。たとえば、過剰光からの損傷は、温度が光合成の最適を越えて上昇するため、より低い強度で起こる。水でストレスを与えた植物は、低下した蒸散が原因で過熱した組織を冷却する能力がより低く、過剰な（高い）熱および／または過剰な（高い）光強度の影響をさらに増悪させる。したがって、作物の生産性に影響を与える、高い／低い温度、光強度、渇水などの特定のパラメータは、種、変種、気候順化の度合、および環境条件の組合せへの曝露に伴って変動する。
本明細書中で使用する「非生物的ストレスに対する耐容の増加」とは、非生物的ストレスに曝されている本発明の共生生物を含む植物またはその一部の、対照植物またはその一部（すなわち、同じ非生物的ストレスに曝されており、共生生物を含まない植物またはその一部）よりも良好に所定の非生物的ストレスに耐える能力をいう。非生物的ストレスに対する耐容の増加は、それだけには限定されないが、植物またはその部分などの大きさおよび数（たとえば果実の数および大きさ）、細胞分裂のレベルまたは量、花の発育不全の量、日焼け損傷の量、作物収量等を含む、様々なパラメータを使用して測定することができる。したがって、本発明の一部の実施形態では、本発明の共生生物を含み、非生物的ストレスに対して増加した耐容を有する植物またはその一部は、たとえば、同じストレスに曝されているが共生生物を含まない植物またはその一部と比較して、低下した花の発育不全を有するであろう。したがって、一部の実施形態では、共生生物における目的ポリヌクレオチドの発現は、宿主植物に増加した非生物的ストレス耐容を与えることができる。一部の実施形態では、共生生物によって生成され、宿主植物に輸送された生体分子および／または生物活性分子の存在は、宿主植物に増加した非生物的ストレス耐容を与えることができ、それによって宿主植物特徴を改変させる。
一部の実施形態では、改変された宿主植物特徴は宿主植物形態学の改変である。目的ポリヌクレオチドを含みそれを発現する本明細書中に記載の共生生物を利用して、それだけには限定されないが、葉、茎、花、根、蕾、種子、分裂組織、果実、塊茎などを含む任意の植物構造を変更し得る。一部の実施形態では、改変された形態学は、それだけには限定されないが、共生生物を含まない植物と比較して、節間部の短縮、側方分枝の増加、および／または開花の増加を含む。
一部の実施形態では、改変された宿主植物特徴は、生体分子、生物活性分子、ならびに／または生体分子および／もしくは生物活性分子の生合成に関与しているポリペプチドの存在であり、生体分子、生物活性分子、ならびに／または生体分子および／もしくは生物活性分子の生合成に関与しているポリペプチドは、その後に宿主植物内に輸送され、それによって宿主植物特徴を改変させることができる、目的ポリヌクレオチドによってコードされている、または目的ポリヌクレオチドの発現に由来しており（たとえば、目的ポリヌクレオチドは、植物中における生物活性分子の生成に影響を与えるポリペプチドまたは調節核酸をコードしている）、改変された宿主特徴は、生体分子および／もしくは生物活性分子の存在を含むことができる、ならびに／または生体分子および／もしくは生物活性分子の存在の結果であることができる。本明細書中に記載のように、植物上に形成された共生生物は、宿主植物のそれと接続する維管束系を発生する。一部の実施形態では、共生生物中で生成された（たとえば目的ポリヌクレオチドによって発現された）生体分子および／または生物活性分子は、接続された維管束系または組織を介して宿主植物に輸送され得る。一部の実施形態では、共生生物から宿主植物への生体分子および／または生物活性分子の輸送は全身性輸送であり得る。一部の実施形態では、共生生物中で生成された生体分子および／または生物活性分子は、共生生物と宿主植物との間の接続された組織のアポプラストおよび／またはシンプラストを介して宿主植物に輸送され得る。一部の実施形態では、共生生物から宿主植物への生体分子および／または生物活性分子の輸送は、共生生物および宿主植物の接続された維管束系、アポプラスト経路および／またはシンプラスト経路の任意の組合せを介したものであり得る。
したがって、一部の実施形態では、生体分子および／または生物活性分子をコードしている目的ポリヌクレオチドが、宿主植物上に移植する本発明の共生生物中に含まれ、目的ポリヌクレオチドは共生生物中で発現され、生体分子および／または生物活性分子は宿主植物に輸送される。
一部の実施形態では、生体分子および／または生物活性分子としては、それだけには限定されないが、医薬品、生物刺激剤、生物殺真菌剤、生物除草剤、殺昆虫タンパク質／ペプチド、トリプシン変調卵形成阻害因子（ＴＭＯＦ）、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）毒素、植物性殺昆虫タンパク質（Ｖｉｐ）、栄養素、植物成長調節物質、ＲＮＡｉ、植物抗体、スタイレットシース阻害タンパク質、リボザイム、バクテリオシン、植物脂質、植物脂肪酸、植物油、抗微生物ペプチド、アプタマー、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムポリペプチドおよび対応するＣＲＩＳＰＲガイド核酸、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化剤様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ならびに／または操作したメガヌクレアーゼを挙げることができる。「生体分子」とは、生きた生物および／またはその一部（たとえば細胞または無細胞系））によって生成される任意の分子である。したがって、生体分子としては、共生生物中に含まれ発現される目的ポリヌクレオチドに直接または間接的に由来し、共生生物が付加または付着されている宿主植物に任意選択で輸送される、共生生物によって生成された任意の分子が挙げられる。また、生体分子は、ＰＯＩから共生生物中で発現される、異なる生体分子（たとえば第１の生体分子）（たとえば、ＰＯＩは、生体分子の生合成に関与している酵素をコードしていてよく、生体分子はその後、その生合成酵素を利用して宿主植物中で生成される）の宿主植物内への輸送の結果として宿主植物中で生成された生体分子（たとえば第２の生体分子）もいい得る。「生体分子」としては、それだけには限定されないが「生物活性分子」が挙げられる。生物活性分子としては、生物活性を含む任意の生体分子が挙げられ、その多数の非限定的な例が本明細書中に記載されている。
本明細書中で使用する「医薬品」としては、それだけには限定されないが、治療用タンパク質、治療用ポリヌクレオチド、および／または治療用化学物質が挙げられる。一部の実施形態では、医薬品としては、それだけには限定されないが、ワクチン、抗体、組換え抗体、抗体断片、融合タンパク質、抗体融合タンパク質、ヒト血清アルブミン、胃リパーゼ、インスリン、グルコセレブロシダーゼ、成長因子、サイトカイン、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ））、Ａｐｏ－Ａ１、アルファ－ガラクトシダーゼ（ＰＲＸ－１０２）、アルファ－ガラクトシダーゼ（ＰＲＸ－１０２）、アセチルコリンエステラーゼ（ＰＲＸ－１０５）、抗腫瘍壊死因子（Ｐｒ－抗ＴＮＦ）、ＩｇＧ、インターフェロン－アルファ、プラスミン、ラクトフェリン、リゾチーム、および／またはコラーゲンを挙げることができる。
目的ポリヌクレオチド中にコードされていてよいバクテリオシンの例としては、それだけには限定されないが、アシドシン、アクタガルジン、アグロシン、アルベイシン、アウレオシン、アウレオシンＡ５３、アウレオシンＡ７０、ビシン、カルノシン、カルノシクリン、カゼイシン、セレイン、サーキュラリンＡ、コリシン、クルバチシン、ジベルシン、デュラマイシン、エンテロシン、エンテロリシン、エピダーミン／ガリダーミン、エルウィニオシン、ガルジマイシン、ガセリシンＡ、グリシネシン、ハロシン、ハロデュラシン、クレビシン、ラクトシンＳ、ラクトコッシン、ラクチシン、ロイコッシン（ｌｅｕｃｏｃｃｉｎ）、リゾスタフィン、マセドシン、メルサシジン、メセンテリシン、ミクロビスポリシン、ミクロシンＳ、ムタシン、ナイシン、パエニバシリン、プラノスポリシン、ペディオシン、ペントシン、プラノスポリシン、ニューモシクリシン（ｐｎｅｕｍｏｃｙｃｌｉｃｉｎ）、ピオシン、ロイテリシン６、サカシン、サリバリシン、スブランシン、サブチリン、スルホロビシン、タスマンシン（ｔａｓｍａｎｃｉｎ）、ツリシン１７、トリフォリトキシン、バリアシン、ビブリオシン、ワルネリシン、および／またはワルネリン（ｗａｒｎｅｒｉｎ）を挙げることができる。
目的ポリヌクレオチドによってコードされていてよい本発明で有用な追加の抗微生物ペプチドとしては、グラミシジン（ＡＶＧＡＬＡＶＶＶＷＬＷＬＷＬＷ 配列番号３５）、マガイニン２（ＧＩＧＫＦＬＨＳＡＫＫＦＧＫＡＦＶＧＥＩＭＮＳ 配列番号３６）、ＬＬ－３７（カテリシジン）（ＬＧＤＦＦＲＫＳＫＥＫＩＧＫＥＦＫＲＩＶＱＲＩＫＦＬＲＮＬＶＰＲＴＥＳ 配列番号３７）、ピロホコリシン（ＰｒＡＭＰ）（ＶＤＫＧＳＹＬＰＲＰＴＰＰＲＰＩＹＮＲＮ 配列番号３８）、ナイシンＡ（ランチビオティック）（ＩＴＳＩＳＬＣＴＰＧＣＫＴＧＡＬＭＧＣＮＭＫＴＡＴＣＨＣＳＩＨＶＳＫ 配列番号３９）、ＨＮＰ１（α－デフェンシン）（ＡＣＹＣＲＩＰＡＣＩＡＧＥＲＲＹＧＴＣＩＹＱＧＲＬＷＡＦＣＣ 配列番号４０）、ＴＡＰ（β－デフェンシン）ＮＰＶＳＣＶＲＮＫ（ＧＩＣＶＰＩＲＣＰＧＳＭＫＱＩＧＴＣＶＧＲＡＶＫＣＣＲＫＫ 配列番号４１）、プレクタシン（ＧＦＧＣＮＧＰＷＤＥＤＤＭＱＣＨＮＨＣＫＳＩＫＧＹＫＧＧＹＣＡＫＧＧＦＶＣＫＣＹ 配列番号４２）、コリスチン（ＸＴＸＸＫＬＬＸＸＴ 配列番号４３）（Ｘ＝２，４－ジアミノブタン酸）、ダプトマイシン（ＷＮＤＴＧＫＤＡＤＧＳＥＹ 配列番号４４）、ミクロシンＪ２５（ＶＧＩＧＴＰＩＦＳＹＧＧＧＡＧＨＶＰＥＹＦ 配列番号４５）、アラメチシン（ペプタイボール）（ＰＢＡＢＡＱＢＶＢＧＬＢＰＶＢＢＥＱ 配列番号４６）（Ｂ＝α－アミノイソ酪酸）、グラミシジン（ＳＶＫＬＦＰＶＫＬＦＰ 配列番号４７）、サブチロシンＡ（ＮＫＧＣＡＴＣＳＩＧＡＡＣＬＶＤＧＰＩＰＤＦＥＩＡＧＡＴＧＬＦＧＬＷＧ 配列番号４８）、カラタ（Ｋａｌａｔａ）Ｂ１（シクロチド）（ＧＬＰＶＣＧＥＴＣＶＧＧＴＣＮＴＰＧＣＴＣＳＷＰＶＣＴＲＮ 配列番号４９）、アカゲザルΘ－デフェンシン１（ＲＴＤ－１）（）（ＧＦＣＲＣＬＣＲＲＧＶＣＲＣＩＣＴＲ 配列番号５０）が挙げられる。
目的ポリヌクレオチドによってコードされていてよい生物殺虫剤の例としては、ジャブレトックス（たとえば、配列番号２４、ポリペプチド配列番号２５）、トリプシン変調卵形成阻害因子（ＴＭＯＦ）（たとえば、配列番号２６、ポリペプチド配列番号２７、２８）、バチルス・チューリンゲンシス毒素（たとえばδ内毒素、たとえばＣｒｙ（結晶）毒素、Ｃｙｔ（細胞毒性）毒素）（たとえば、配列番号３３、ポリペプチド配列番号３４）、スタイレットシース阻害タンパク質（たとえば、フィシン（たとえば配列番号５１）、ブロメライン）、および／または植物性殺昆虫タンパク質（Ｖｉｐ）が挙げられる。これらは周知のポリペプチドである。バチルス・チューリンゲンシス毒素としては、たとえば、Ｃｒｙ（結晶）毒素（たとえば、Ｃｒｙ Ｉ、Ｃｒｙ ＩＩ、Ｃｒｙ ＩＩＩ、Ｃｒｙ ＩＶ）、Ｃｙｔ（細胞毒性）毒素、植物性殺昆虫タンパク質（Ｖｉｐ）（これらは、そのアミノ酸類似度の度合に従って４つのファミリー、すなわちＶｉｐ１、Ｖｉｐ２、Ｖｉｐ３、およびＶｉｐ４へと分類される）、ならびに分泌殺昆虫タンパク質（Ｓｉｐ）毒素が挙げられる。これらのタンパク質としては、幅広いまたは狭い（たとえば特定の昆虫群に対してのみ毒性がある）場合がある変動する範囲の毒性を有する毒素が挙げられる。
一部の実施形態では、目的ポリヌクレオチドによってコードされている生物活性分子は、ジャブレトックス（ペプチドＪＢＴＸ）、トリプシン変調卵形成阻害因子（ＴＭＯＦ）、ビー・チューリンゲンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）δ内毒素、Ｃｒｙ毒素、Ｃｙｔ毒素、レグヘモグロビン、ニトロゲナーゼ、フィシン、ブロメライン、バクテリオシン、ナイシン、オンコシン、および／またはオンコシン類似体（たとえば、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２）である。
一部の実施形態では、改変された宿主植物特徴は、生物活性分子（たとえば殺生物分子）の存在、および共生生物を含まない植物と比較した植物病原体に対する耐性／耐容の増加、ならびに共生生物から植物内に輸送された生物活性分子の存在である。一部の実施形態では、殺生物剤はバクテリオシンまたは抗微生物ペプチドであり、植物病原体は細菌である。一部の実施形態では、バクテリオシンまたは抗微生物ペプチドはオンコシンおよび／またはナイシンである。
一部の実施形態では、改変された宿主植物特徴は、殺昆虫タンパク質（たとえば生物殺虫剤）の存在および共生生物を含まない植物と比較した昆虫耐容または耐性の増加、ならびに共生生物から植物内に輸送された殺昆虫タンパク質の存在である。一部の実施形態では、殺昆虫タンパク質は、ジャブレトックス、トリプシン変調卵形成阻害因子（ＴＭＯＦ）、バチルス・チューリンゲンシス毒素（たとえばδ内毒素）、任意選択でＣｒｙ（結晶）毒素、Ｃｙｔ（細胞毒性）毒素、植物性殺昆虫タンパク質（Ｖｉｐ）もしくは分泌殺昆虫タンパク質（Ｓｉｐ）毒素、および／またはスタイレットシース阻害タンパク質、任意選択でフィシンおよび／またはブロメラインである。
一部の実施形態では、スタイレットシース阻害タンパク質は、本発明の共生生物中において目的ポリヌクレオチドによって発現され得る。そのような阻害ペプチドは、米国特許出願第２０１８／０１９９５７７号中に例示されるように知られている。共生生物中での発現に有用なスタイレットシース阻害ペプチドの例としては、それだけには限定されないが表３中に列挙したものが挙げられる。
表４は、植物ならびに植物が脆弱な病害または有害生物（たとえば昆虫および／または線虫有害生物）の例の例示的なリストを提供する。一部の実施形態では、本発明は、これらの病害および有害生物に対する、植物における耐容／耐性の増加を提供するために使用し得る。
一部の実施形態では、改変された宿主植物特徴は、植物脂質、植物脂肪酸、および／または植物油の生成の存在または増加もしくは減少である。
一部の実施形態では、改変された宿主植物特徴は、植物成長調節物質（たとえば、オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、エチレン、成長阻害剤／遅延剤）の生成の存在または増加もしくは減少および改変された成長である。一部の実施形態では、改変された成長は、宿主植物中における成長調節物質の生成の増加または減少（たとえば植物ホルモン生合成酵素）をもたらす、共生生物から宿主植物内への成長調節物質の輸送の結果として、または共生生物から宿主植物内への生物活性分子の輸送の結果としての、宿主植物の生長の増加もしくは成長の減少および／または宿主植物の一部の成長の増加もしくは減少であり得る。植物成長調節物質の生成の増加または減少および改変された成長は、対照植物と比較したものである（たとえば共生生物を含まない植物および植物成長調節物質の存在ならびに／または共生生物を含まない植物および植物成長調節物質の生成の増加または減少）。
一部の実施形態では、改変された宿主植物特徴は、ＲＮＡの生成の存在または増加およびポリヌクレオチド、ペプチド、またはポリペプチドの生成の増加／減少である。本発明で有用なＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に使用される任意のＲＮＡなど、植物特徴を改変させるために使用し得る任意のＲＮＡであり得る。一部の実施形態では、ＲＮＡとしては、それだけには限定されないが、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／またはｓｈＲＮＡを挙げることができる。例示的なＲＮＡとしては、ｄｖｓｎｆ７、ｃｃｏｍｔ、ｄＣＳ、ａｓｎ１、ｐｈＬ、ＲＩ、ＰＧＡＳ、および／またはｐｐｏ５が挙げられる。
本発明は、本発明の方法によって生成された改変された特徴を有する宿主植物をさらに提供する。
生体分子または生物活性分子を生成する方法であって、目的ポリヌクレオチドが生体分子および／もしくは生物活性分子をコードしている本発明の共生生物を提供し、共生生物もしくは共生生物形成接種材料中で生成された生体分子および／もしくは生物活性分子を収集するステップ、ならびに／または目的ポリヌクレオチドが生体分子および／もしくは生物活性分子をコードしている本発明の宿主植物を提供し、共生生物形成接種材料および／もしくは共生生物および／もしくは宿主植物中で生成された生体分子および／もしくは生物活性分子を収集するステップを含む方法も、本明細書中に提供する。
目的化合物を宿主植物に送達する方法であって、本発明の共生生物形成接種材料または本発明の共生生物を宿主植物上の少なくとも１つの部位（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０箇所、またはそれより多くの部位）上に移植するステップと、共生生物形成接種材料または共生生物を宿主植物の少なくとも１つの部位で培養して、共生生物を宿主植物上の少なくとも１つの部位で形成させるステップとを含み、目的ポリヌクレオチドが共生生物中で発現され、目的ポリヌクレオチドの発現産物および／または目的ポリヌクレオチドの発現産物を使用して作製された生成物が宿主植物内に輸送され、それによって目的化合物が植物に送達される方法を、さらに提供する。
植物の遺伝子型を改変させずに改変された特徴を含む植物を生成する方法であって、本発明の共生生物形成接種材料または本発明の共生生物を宿主植物上の少なくとも１つの部位（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０箇所、またはそれより多くの部位）上に移植するステップと、共生生物形成接種材料または共生生物を宿主植物の少なくとも１つの部位で培養して、共生生物を宿主植物上の少なくとも１つの部位で形成させるステップとを含み、目的ポリヌクレオチドが共生生物中で発現され、目的ポリヌクレオチドの発現産物および／または目的ポリヌクレオチドの発現産物を使用して作られた生成物が宿主植物内に輸送され、それによって、改変された遺伝子型を含まない、改変された表現型を含む植物を生じる方法も提供する。本発明の方法によって生成された植物も提供する。
本明細書中に記載のように、本発明のポリヌクレオチドによってコードされているポリペプチド（たとえば、目的ポリヌクレオチドによってコードされているポリペプチド、植物ホルモン生合成酵素）は、標的化配列と作動可能に連結していてよい。一部の実施形態では、ポリペプチドは、そのＮ末端もしくはそのＣ末端または両方で標的化配列と連結していてよい。本発明で有用な標的化配列は、ポリペプチドまたはペプチドを特定のオルガネラまたは植物部分へと指示する／位置付けることができる任意の標的化配列であり得る。標的化配列は、ポリヌクレオチドまたは核酸分子のＮまたはＣ末端で作動可能に連結していてよく、任意選択で、ポリヌクレオチドまたは核酸分子は標的化配列に対して異種である。標的化（もしくはシグナル）配列または標的化ペプチド（およびそれらをコードしているヌクレオチド配列）は当技術分野で周知であり、「Ｓｉｇｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｗｅｂｓｉｔｅ：Ａｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｉｇｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．」（ｗｗｗ．ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ．ｄｅ）、「Ｓｉｇｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｄａｔａｂａｓｅ」（ｐｒｏｌｉｎｅ．ｂｉｃ．ｎｕｓ．ｅｄｕ．ｓｇ／ｓｐｄｂ／ｉｎｄｅｘ）（Ｃｈｏｏら、ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、６：２４９（２００５）（ｂｉｏｍｅｄｃｅｎｔｒａｌ．ｃｏｍ／１４７１－２１０５／６／２４９／ａｂｓｔｒａｃｔで利用可能）、ＣｈｌｏｒｏＰ（ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＣｈｌｏｒｏＰ／、タンパク質配列中の葉緑体輸送ペプチド（ｃＴＰ）の存在および潜在的なｃＴＰ切断部位の位置を予測する）、ＬｉｐｏＰ（ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＬｉｐｏＰ／、グラム陰性細菌中のリポタンパク質およびシグナルペプチドを予測する）、ＭＩＴＯＰＲＯＴ（ｉｈｇ２．ｈｅｌｍｈｏｌｔｚ－ｍｕｅｎｃｈｅｎ．ｄｅ／ｉｈｇ／ｍｉｔｏｐｒｏｔ、ミトコンドリア標的化配列を予測する）、ＰｌａｓＭｉｔ（ｇｅｃｃｏ．ｏｒｇ．ｃｈｅｍｉｅ．ｕｎｉ－ｆｒａｎｋｆｕｒｔ．ｄｅ／ｐｌａｓｍｉｔ／ｉｎｄｅｘ、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）中のミトコンドリア輸送ペプチドを予測する）、Ｐｒｅｄｏｔａｒ（ｕｒｇｉ．ｖｅｒｓａｉｌｌｅｓ．ｉｎｒａ．ｆｒ／ｐｒｅｄｏｔａｒ／ｐｒｅｄｏｔａｒ．ｈｔｍｌ、ミトコンドリアおよび色素体標的化配列を予測する）、ＰＴＳ１（ｍｅｎｄｅｌ．ｉｍｐ．ａｃ．ａｔ／ｍｅｎｄｅｌｊｓｐ／ｓａｔ／ｐｔｓ１／ＰＴＳ１ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ．ｊｓｐ、ペルオキシソーム標的化シグナル１含有タンパク質を予測する）、ＳｉｇｎａｌＰ（ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／、様々な生物、すなわち、グラム陽性原核生物、グラム陰性原核生物、および真核生物由来のアミノ酸配列中のシグナルペプチド切断部位の存在および位置を予測する）などの、公開データベース中に見つけることができる。ＳｉｇｎａｌＰ方法は、いくつかの人工神経回路網および隠れマルコフモデルの組合せに基づいて、切断部位の予測およびシグナルペプチド／非シグナルペプチドの予測を組み込み、ＴａｒｇｅｔＰ（ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴａｒｇｅｔＰ／）は、真核タンパク質の細胞内位置を予測し、位置の割当ては、Ｎ末端プレ配列、すなわち、葉緑体輸送ペプチド（ｃＴＰ）、ミトコンドリア標的化ペプチド（ｍＴＰ）、または分泌経路シグナルペプチド（ＳＰ）のうちの任意のものの予測される存在に基づく）。（ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ、１３３（１）１７～２１（１９８３）、Ｍａｒｔｏｇｌｉｏら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、８（１０）：４１０～５（１９９８）、Ｈｅｇｄｅら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ、３１（１０）：５６３～７１（２００６）、Ｄｕｌｔｚら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２８３（１５）：９９６６～７６（２００８）、Ｅｍａｎｕｅｌｓｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２（４）９５３～９７１（２００７）、Ｚｕｅｇｇｅら、２８０（１～２）：１９～２６（２００１）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、３２８（３）：５６７～７９（２００３）、およびＮｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、３２８（３）：５８１～９２（２００３）も参照）。本明細書中に記載のようにポリペプチドを標的化するために有用な標的化配列の例としては、それだけには限定されないが表５中に提供するものが挙げられる。一部の実施形態では、ＰＯＩによってコードされているポリペプチドは、分泌系を標的とする配列（たとえば小胞体（ＥＲ）、たとえばＥＲ標的化配列）と作動可能に連結していてよい。
本明細書中に記載のように、本発明の実施形態で有用な植物、植物部分、または植物細胞は、それだけには限定されないが、被子植物（たとえば双子葉植物もしくは単子葉植物）、裸子植物、藻類（たとえば大型藻類、たとえば、紅藻植物門（紅藻）、褐藻植物門（褐藻類）、および緑藻植物門（緑藻類）、黄金色藻綱（黄金藻類））、蘚苔類、シダ類および／またはシダ様植物（すなわち羊歯植物）を含む、任意の植物であり得るまたは任意の植物に由来し得る。
本発明で有用な植物（たとえば、本明細書中に記載の共生生物形成接種材料、共生生物、植物、または宿主植物のために）としては、それだけには限定されないが、アベリア属（Ａｂｅｌｉａ）の種（アベリア）、トロロアオイ属（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ）の種（オクラ）、モミ属（Ａｂｉｅｓ）の種（モミ）、アカシア属（Ａｃａｃｉａ）の種（アカシア）、アカリファ属（Ａｃａｌｙｐｈａ）の種（シェニール）、アッカ属（Ａｃｃａ）の種（フェイジョア、パイナップルグアバ、グアバスティーン）、カエデ属（Ａｃｅｒ）の種（カエデ）、ノコギリソウ属（Ａｃｈｉｌｌｅａ）の種（ノコギリソウ）、アクリス属（Ａｃｈｌｙｓ）の種（メギ）、アクメラ属（Ａｃｍｅｌｌａ）の種（オランダセンニチ）、アコエロールハフェ属（Ａｃｏｅｌｏｒｒｈａｐｈｅ）の種（ヤシ）、ショウブ属（Ａｃｏｒｕｓ）の種（ショウブ）、アクロニキア属（Ａｃｒｏｎｙｃｈｉａ）の種（アスペン）、アクロスティクム属（Ａｃｒｏｓｔｉｃｈｕｍ）の種（シダ）、アクロトリッシュ属（Ａｃｒｏｔｒｉｃｈｅ）の種（スグリ）、マタタビ属（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ）の種（キウイフルーツ）、バオバブ属（Ａｄａｎｓｏｎｉａ）の種（バオバブ）、アジアンタム属（Ａｄｉａｎｔｕｍ）の種（ホウライシダ）、アドニディア属（Ａｄｏｎｉｄｉａ）の種（ヤシ）、エクメア属（Ａｅｃｈｍｅａ）の種（アナナス）、アエグレ属（Ａｅｇｌｅ）の種（ベルノキ）、トチノキ属（Ａｅｓｃｕｌｕｓ）の種（セイヨウトチノキ、マロニエ）、アフラモムム属（Ａｆｒａｍｏｍｕｍ）の種（偽カルダモン）、アガパンサス属（Ａｇａｐａｎｔｈｕｓ）の種（アガパンサス）、ハラタケ属（Ａｇａｒｉｃｕｓ）の種（キノコ）、カワミドリ属（Ａｇａｓｔａｃｈｅ）の種（アニス）、アガトスマ属（Ａｇａｔｈｏｓｍａ）の種（ブッコノキ）、リュウゼツラン属（Ａｇａｖｅ）の種（リュウゼツラン）、カッコウアザミ属（Ａｇｅｒａｔｕｍ）の種（ホワイトウィード）、アグラオネマ属（Ａｇｌａｏｎｅｍａ）の種（緑竹）、キンミズヒキ属（Ａｇｒｉｍｏｎｉａ）の種（キンミズヒキ）、ニワウルシ属（Ａｉｌａｎｔｈｕｓ）の種（ニワウルシ）、キランソウ属（Ａｊｕｇａ）の種（ヨウシュジュウニヒトエ）、ネムノキ属（Ａｌｂｉｚｉａ）の種（ネムノキ）、ハゴロムグサ属（Ａｌｃｈｅｍｉｌｌａ）の種（ハゴロモグサ）、アブラギリ属（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ）の種（ククイノキ）、アラマンダ属（Ａｌｌａｍａｎｄａ）の種（アラマンダ）、ネギ属（Ａｌｌｉｕｍ）の種（チャイブ、ニンニク、リーキ、タマネギ、シャロット）、ハンノキ属（Ａｌｎｕｓ）の種（ハンノキ）、クワズイモ属（Ａｌｏｃａｓｉａ）の種（タロイモ）、アロエ属（Ａｌｏｅ）の種（アロエ）、コウスイボク属（Ａｌｏｙｓｉａ）の種（レモンバーベナ）、ハナミョウガ属（Ａｌｐｉｎｉａ）の種（キフゲットウ）、ツルノゲイトウ属（Ａｌｔｅｒｎａｎｔｈｅｒａ）の種（ジョイウィード）、タチアオイ属（Ａｌｔｈａｅａ）の種（ウスベニタチアオイ）、ヒユ属（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ）の種（アマランス）、ザイフリボク属（Ａｍｅｌａｎｃｈｉｅｒ）の種（ジューンベリー、サービスベリー）、アモムム属（Ａｍｏｍｕｍ）の種（カルダモン）、アンフィテクナ属（Ａｍｐｈｉｔｅｃｎａ）の種（ブラックカラバッシュ）、カシューナットノキ属（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ）の種（カシュー）、アナナス属（Ａｎａｎａｓ）の種（パイナップル）、ヤマハハコ属（Ａｎａｐｈａｌｉｓ）の種（ヤマハハコ）、アンドログラフィス属（Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ）の種（偽ミズヤナギ）、ヒメシャクナゲ属（Ａｎｄｒｏｍｅｄａ）の種（ヒメシャクナゲ）、イノンド属（Ａｎｅｔｈｕｍ）の種（ディル）、シシウド属（Ａｎｇｅｌｉｃａ）の種（アンゼリカ）、アンゲロニア属（Ａｎｇｅｌｏｎｉａ）の種（アンゲロニア）、アンゴスチュラ属（Ａｎｇｏｓｔｕｒａ）の種（アンゴスチュラ）、バンレイシ属（Ａｎｎｏｎａ）の種（チェリモヤ、バンレイシ（ｓｗｅｅｔｓｏｐ、ｓｕｇａｒ－ａｐｐｌｅ）、トゲバンレイシ）、アノゲイサス属（Ａｎｏｇｅｉｓｓｕｓ）の種（アクセルウッド）、カミツレ属（Ａｎｔｈｅｍｉｓ）の種（カモミール）、ハルガヤ属（Ａｎｔｈｏｘａｎｔｈｕｍ）の種（グラス（Ｇｒａｓｓ））、シャク属（Ａｎｔｈｒｉｓｃｕｓ）の種（チャービル）、アンスリウム属（Ａｎｔｈｕｒｉｕｍ）の種（テイルフラワー）、ヤマヒハツ属（Ａｎｔｉｄｅｓｍａ）の種（ビグネイ（Ｂｉｇｎａｙ））、アサヒカズラ属（Ａｎｔｉｇｏｎｏｎ）の種（アサヒカズラ）、キンギョソウ属（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ）の種（キンギョソウ）、オランダミツバ属（Ａｐｉｕｍ）の種（セロリ）、オダマキ属（Ａｑｕｉｌｅｇｉａ）の種（オダマキ）、シロイヌナズナ属の種（シロイヌナズナ、マウスノミミクレス（Ｍｏｕｓｅ－ｅａｒ Ｃｒｅｓｓ））、タラノキ属（Ａｒａｌｉａ）の種（ウォーキングスティック、ウド）、ナンヨウスギ属（Ａｒａｕｃａｒｉａ）の種（マツ）、イチゴノキ属（Ａｒｂｕｔｕｓ）の種（マドロナ、イチゴノキ）、ゴボウ属（Ａｒｃｔｉｕｍ）の種（ゴボウ）、ウラシマツツジ属（Ａｒｃｔｏｓｔａｐｈｙｌｏｓ）の種（クマコケモモ、ウラシマツツジ）、ヤブコウジ属（Ａｒｄｉｓｉａ）の種（ヤブコウジ）、アルメリア属（Ａｒｍｅｒｉａ）の種（ハマカンザシ）、セイヨウワサビ属（Ａｒｍｏｒａｃｉａ）の種（西洋ワサビ）、アロニア属（Ａｒｏｎｉａ）の種（海棠）、アラカチャ属（Ａｒｒａｃａｃｉａ）の種（アラカチャ）、ヨモギ属（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ）の種（ヨモギ）、パンノキ属（Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ）の種（パンノキ、ジャックフルーツ、モンキーフルーツ）、ヤマブキショウマ属（Ａｒｕｎｃｕｓ）の種（ヤマブキショウマ）、アズマザサ属（Ａｒｕｎｄｉｎａｒｉａ）の種（タケ）、アサルム属（Ａｓａｒｕｍ）の種（ショウガ）、トウワタ属（Ａｓｃｌｅｐｉａｓ）の種（トウワタ）、アスコフィルム属（Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の種（フィーマインブイ（Ｆｅａｍａｉｎｎ Ｂｈｕｉ）、ロックウィード、ノルウェーケルプ、結びケルプ、結びラック（ｋｎｏｔｔｅｄ ｗｒａｃｋ）、エッグラック（Ｅｇｇ ｗｒａｃｋ））、ポポー属（Ａｓｉｍｉｎａ）の種（ポポー）、アスパラトゥス属（Ａｓｐａｌａｔｈｕｓ）の種（ルイボス）、クサギカズラ属（Ａｓｐａｒａｇｕｓ）の種（アスパラガス、シノブボウキ）、ハラン属（Ａｓｐｉｄｉｓｔｒａ）の種（ハラン）、アスピドスペルマ属（Ａｓｐｉｄｏｓｐｅｒｍａ）の種（ケブラコ）、チャセンシダ属（Ａｓｐｌｅｎｉｕｍ）の種（巣シダ）、シオン属（Ａｓｔｅｒ）の種（アスター）、ゲンゲ属（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ）の種（レンゲ）、アシスタシア属（Ａｓｙｓｔａｓｉａ）の種（アシスタシア）、メシダ属（Ａｔｈｙｒｉｕｍ）の種（メシダ）、ハマアカザ属（Ａｔｒｉｐｌｅｘ）の種（ヤマホウレンソウ）、キクラゲ属（Ａｕｒｉｃｕｌａｒｉ）の種（食用真菌）、カラスムギ属（Ａｖｅｎａ）の種（オートムギ）、アベロア属（Ａｖｅｒｒｈｏａ）の種（スターフルーツ）、ランバイ属（Ｂａｃｃａｕｒｅａ）の種（ロクトン（Ｌｏｔｋｏｎ））、バッカリス属（Ｂａｃｃｈａｒｉｓ）の種（ソルトブッシュ）、バックホウシア属（Ｂａｃｋｈｏｕｓｉａ）の種（アイアンウッド）、バクトリス属（Ｂａｃｔｒｉｓ）の種（モモヤシ）、バラニテス属（Ｂａｌａｎｉｔｅｓ）の種（たいまつ用材となる木）、バレリア属（Ｂａｌｅｒｉａ）の種（スミレ）、バンブーサ属（Ｂａｍｂｕｓａ）の種（タケ）、ムラサキセンダイハギ属（Ｂａｐｔｉｓｉａ）の種（インディゴ）、ヤマガラシ属（Ｂａｒｂａｒｅａ）の種（カラシナ）、ツルムラサキ属（Ｂａｓｅｌｌａ）の種（ホウレンソウ）、ハマカズラ属（Ｂａｕｈｉｎｉａ）の種（フイリソンシカ）、トックリラン属（Ｂｅａｕｃａｒｎｅａ）の種（ヤシ）、ベゴニア属（Ｂｅｇｏｎｉａ）の種（ベゴニア）、アヤメ属（Ｂｅｌａｍｃａｎｄａ）の種（ユリ）、トウガン属（Ｂｅｎｉｎｃａｓａ）の種（トウガン）、メギ属（Ｂｅｒｂｅｒｉｓ）の種（メギ）、ブラジルナッツ属（Ｂｅｒｔｈｏｌｌｅｔｉａ）の種（ブラジルナッツ）、フダンソウ属（Ｂｅｔａ）の種（ビート、フダンソウ）、カバノキ属（Ｂｅｔｕｌａ）の種（カバノキ）、センダングサ属（Ｂｉｄｅｎｓ）の種（ひっつきむし（Ｂｅｇｇａｒｔｉｃｋｓ））、ビラルディエラ属（Ｂｉｌｌａｒｄｉｅｒａ）の種（アップルベリー）、アカギ属（Ｂｉｓｃｈｏｆｉａ）の種（ビショップウッド）、ビスマルキア属（Ｂｉｓｍａｒｃｋｉａ）の種（ヤシ）、ベニノキ属（Ｂｉｘａ）の種（ベニノキ）、アキー属（Ｂｌｉｇｈｉａ）の種（アキー）、ボウセンベルギア属（Ｂｏｅｓｅｎｂｅｒｇｉａ）の種（フィンガールート）、ルリヂサ属（Ｂｏｒａｇｏ）の種（ルリヂサ）、パルミラヤシ属（Ｂｏｒａｓｓｕｓ）の種（ヤシ）、ボロホア属（Ｂｏｒｏｊｏａ）の種（ボロホ）、ボリキア属（Ｂｏｒｒｉｃｈｉａ）の種（シーオックスアイ）、ボスキア属（Ｂｏｓｃｉａ）の種（ハンザ（Ｈａｎｚａ））、ボスウェリア属（Ｂｏｓｗｅｌｌｉａ）の種（乳香）、アカタネノキ属（Ｂｏｕｅａ）の種（プラムマンゴー）、ブラヘア属（Ｂｒａｈｅａ）の種（ヤシ）、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種（ブロッコリー、フダンソウ、キャベツ、カリフラワー、サイシン、ケール、マスタード、カラシナの葉、ナタネ、ルタバガ、芽キャベツ）、タカサゴコバンノキ属（Ｂｒｅｙｎｉａ）の種（スノーブッシュ）、ブロシムム属（Ｂｒｏｓｉｍｕｍ）の種（パンナッツ）、ルリマガリバナ属（Ｂｒｏｗａｌｌｉａ）の種（アメジストフラワー）、バンマツリ属（Ｂｒｕｎｆｅｌｓｉａ）の種（アメリカネム）、ウミソヤ属（Ｂｕｃｈａｎａｎｉａ）の種（チラウリナッツ）、ブシダ属（Ｂｕｃｉｄａ）の種（バラタノキ）、ブメリア属（Ｂｕｍｅｌｉａ）の種（チッタムウッド）、ブンコシア属（Ｂｕｎｃｈｏｓｉａ）の種（ピーナッツバターフルーツ）、ブルセラ属（Ｂｕｒｓｅｒａ）の種（リンボー）、ブテア属（Ｂｕｔｉａ）の種（ブラジルヤシ）、ツゲ属（Ｂｕｘｕｓ）の種（ツゲ）、ビルソニマ属（Ｂｙｒｓｏｎｉｍａ）の種（ローカストベリー）、ジャケツイバラ属（Ｃａｅｓａｌｐｉｎｉａ）の種（ジャケツイバラ）、キマメ属（Ｃａｊａｎｕｓ）の種（キマメ）、カラジウム属（Ｃａｌａｄｉｕｍ）の種（カラジウム）、ノガリヤス属（Ｃａｌａｍａｇｒｏｓｔｉｓ）の種（アシ、スモールウィード）、カラテア属（Ｃａｌａｔｈｅａ）の種（カラテア、ヒョウモンヨウショウ、レレン）、カレンデュラ属（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ）の種（マリーゴールド）、ベニゴウガン属（Ｃａｌｌｉａｎｄｒａ）の種（オオベニゴウカン、フェアリーダスター）、ムラサキシキブ属（Ｃａｌｌｉｃａｒｐａ）の種（ムラサキシキブ）、ブラシノキ属（Ｃａｌｌｉｓｔｅｍｏｎ）の種（ブラシノキ）、ショウナンボク属（Ｃａｌｏｃｅｄｒｕｓ）の種（オニヒバ）、テリハボク属（Ｃａｌｏｐｈｙｌｌｕｍ）の種（テリハボク）、クロバナロウバイ属（Ｃａｌｙｃａｎｔｈｕｓ）の種（クロバナウバイ）、カリプトランテス属（Ｃａｌｙｐｔｒａｎｔｈｅｓ）の種（リッドフラワー、スパイスウッド、マウンテンベイ）、カマッシア属（Ｃａｍａｓｓｉａ）の種（カマス、ワイルドヒヤシンス）、アマナズナ属（Ｃａｍｅｌｉｎａ）の種（偽アマ、ツバキ）、ホタルブクロ属（Ｃａｍｐａｎｕｌａ）の種（ホタルブクロ）、カムポマネシア属（Ｃａｍｐｏｍａｎｅｓｉａ）の種（グアビローバ）、ノウゼンカズラ属（Ｃａｍｐｓｉｓ）の種（トランペットクリーパー、ハミングバードバイン）、カナリウム属（Ｃａｎａｒｉｕｍ）の種（パシフィックアーモンド）、ナタマメ属（Ｃａｎａｖａｌｉａ）の種（タチナタマメ）、カネラ属（Ｃａｎｅｌｌａ）の種（桂皮）、カンナ属（Ｃａｎｎａ）の種（カンナリリー、カンナ）、カンナビス属（Ｃａｎｎａｂｉｓ）の種（カンナビス）、フウチョウボク属（Ｃａｐｐａｒｉｓ）の種（ケッパー）、ナズナ属（Ｃａｐｓｅｌｌａ）の種（ナズナ）、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）の種（アマトウガラシ（ｂｅｌｌ ｐｅｐｐｅｒ）、カイエンヌペッパー、チリ、ハラペ
ーニョ、コショウ）、スゲ属（Ｃａｒｅｘ）の種（スゲ）、カリカ属（Ｃａｒｉｃａ）の種（パパイヤ）、カリッサ属（Ｃａｒｉｓｓａ）の種（オオバナカリッサ、ヌムヌム）、カルネギア属（Ｃａｒｎｅｇｉｅａ）の種（ベンケイチュウ）、カーペンタリア属（Ｃａｒｐｅｎｔａｒｉａ）の種（カーペンタリアヤシ）、クマシデ属（Ｃａｒｐｉｎｕｓ）の種（シデ）、カルポブローツス属（Ｃａｒｐｏｂｒｏｔｕｓ）の種（ピッグフェイス、アイスプラント、サワーフィグ、バクヤギク）、ベニバナ属（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ）の種（ベニバナ）、ヒメウイキョウ属（Ｃａｒｕｍ）の種（ヒメウイキョウ）、ペカン属（Ｃａｒｙａ）の種（ヒッコリーの実、ペカン）、カリオカル属（Ｃａｒｙｏｃａｒ）の種（ペキー、スーアリナット）、クジャクヤシ属（Ｃａｒｙｏｔａ）の種（カリオタ）、カサシア属（Ｃａｓａｓｉａ）の種（カサシア、７年リンゴ）、シロサポテ属（Ｃａｓｉｍｉｒｏａ）の種（サポテ）、カッシア属（Ｃａｓｓｉａ）の種（カッシア）、クリ属（Ｃａｓｔａｎｅａ）の種（クリ、チンカンピングリ）、モクマオウ属（Ｃａｓｕａｒｉｎａ）の種（モクマオウ）、モクマオウ科（Ｃａｓｕａｒｉｎａｃｅａｅ）の種（モクマオウ）、キササゲ属（Ｃａｔａｌｐａ）の種（キササゲ、カトーバ）、ニチニチソウ属（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ）の種（ツルニチニチソウ）、セアノサス属（Ｃｅａｎｏｔｈｕｓ）の種（ソリチャ、バックブラシ、ソープブッシュ）、ヒマラヤスギ属（Ｃｅｄｒｕｓ）の種（スギ）、セイバ属（Ｃｅｉｂａ）の種（トックリキワタ）、ケイトウ属（Ｃｅｌｏｓｉａ）の種（ケイトウ、ウールフラワー）、エノキ属（Ｃｅｌｔｉｓ）の種（エノキの実、エノキ）、ベニバナセンブリ属（Ｃｅｎｔａｕｒｉｕｍ）の種（シマセンブリ）、ツボクサ属（Ｃｅｎｔｅｌｌａ）の種（ツボクサ）、ケントラセルム属（Ｃｅｎｔｒａｔｈｅｒｕｍ）の種（ブラジルボタンフラワー、ラークデイジー）、セファランツス属（Ｃｅｐｈａｌａｎｔｈｕｓ）の種（アメリカヤマタアガサ）、ミミナグサ属（Ｃｅｒａｓｔｉｕｍ）の種（ミナミグサ）、イナゴマメ属（Ｃｅｒａｔｏｎｉａ）の種（イナゴマメ）、カツラ属（Ｃｅｒｃｉｄｉｐｈｙｌｌｕｍ）の種（カツラ（Ｋａｔｓｕｒａ））、ハナズオウ属（Ｃｅｒｃｉｓ）の種（アメリカハナズオウ）、ボケ属（Ｃｈａｅｎｏｍｅｌｅｓ）の種（マルメロ）、カエロフィルム属（Ｃｈａｅｒｏｐｈｙｌｌｕｍ）の種（チャービル）、ヒノキ属（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ）の種（偽イトスギ）、チャメドレア属（Ｃｈａｍａｅｄｏｒｅａ）の種（タケヤシ、テーブルヤシ）、カマエメルム属（Ｃｈａｍａｅｍｅｌｕｍ）の種（カモミール）、チャボトウジュロ属（Ｃｈａｍａｅｒｏｐｓ）の種（ヨーロッパファンヤシ）、クサノオウ属（Ｃｈｅｌｉｄｏｎｉｕｍ）の種（クサノオウ）、アカザ属（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ）の種（アカザ）、キロプシス属（Ｃｈｉｌｏｐｓｉｓ）の種（デザートウィロウ）、ウメガサソウ属（Ｃｈｉｍａｐｈｉｌａ）の種（オオウメガサソウ）、カンチク属（Ｃｈｉｍｏｎｏｂａｍｂｕｓａ）の種（タケ）、キオコッカ属（Ｃｈｉｏｃｏｃｃａ）の種（ミルクベリー、セッコウボク）、ヒトツバタゴ属（Ｃｈｉｏｎａｎｔｈｕｓ）の種（ヒトツバタゴ）、キク属（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ）の種（キク）、クリソバラヌス属（Ｃｈｒｙｓｏｂａｌａｎｕｓ）の種（イカコ）、オーガストノキ属（Ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｌｌｕｍ）の種（カイニット、サテンリーフ）、ヒヨコマメ属（Ｃｉｃｅｒ）の種（ヒヨコマメ）、キクニガナ属（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ）の種（チコリ、エンダイブ、キクヂシャ）、キナノキ属（Ｃｉｎｃｈｏｎａ）の種（キナ）、ニッケイ属（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ）の種（シナモン、クスノキ、カッシア）、アザミ属（Ｃｉｒｓｉｕｍ）の種（アザミ）、キタレクシルム属（Ｃｉｔｈａｒｅｘｙｌｕｍ）の種（クマツヅラ、ジターウッド（ｚｉｔｈｅｒｗｏｏｄ））、スイカ属（Ｃｉｔｒｉｌｌｕｓ）の種（スイカ）、ミカン属の種（ミカン属、グレープフルーツ、レモン、ライム、オレンジ、プメロ、タンジェリン）、フジキ属（Ｃｌａｄｒａｓｔｉｓ）の種（イエローウッド）、サンジソウ属（Ｃｌａｒｋｉａ）の種（ゴデチア）、ワンピ属（Ｃｌａｕｓｅｎａ）の種（ワンピ）、クレイトニア属（Ｃｌａｙｔｏｎｉａ）の種（スベリヒユ）、フウチョウソウ属（Ｃｌｅｏｍｅ）の種（スパイダープラント、ビープラント、キャットウィスカー）、クサギ属（Ｃｌｅｒｏｄｅｎｄｒｏｎ）の種（ゲンペイクサギ、ゲンペイカズラ、ケマンソウ）、トウバナ属（Ｃｌｉｎｏｐｏｄｉｕｍ）の種（カラミント）、クルシアロゼア（Ｃｌｕｓｉａｒｏｓｅａ）の種（クルシア、ピッチアップル）、コッコロバ属（Ｃｏｃｃｏｌｏｂａ）の種（ハマベブドウ）、コッコリナックス属（Ｃｏｃｃｏｔｈｒｉｎａｘ）の種（シルバーパーム）、ココス属（Ｃｏｃｏｓ）の種（ココナツ）、コーヒーノキ属（Ｃｏｆｆｅａ）の種（コーヒー）、コリウス属（Ｃｏｌｅｕｓ）の種（コリウス）、サトイモ属（Ｃｏｌｏｃａｓｉａ）の種（タロイモ）、コルブリナ属（Ｃｏｌｕｂｒｉｎａ）の種（ネイキッドウッド、スネークウッド、リョクシンボク、ホグプラム）、シクンジ属（Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ）の種（ブッシュウィロウ、コンブレツム）、ミルラノキ属（Ｃｏｍｍｉｐｈｏｒａ）の種（ミルラ）、コノカルプス属（Ｃｏｎｏｃａｒｐｕｓ）の種（スズカケノキ）、コンラディナ属（Ｃｏｎｒａｄｉｎａ）の種（偽ローズマリー）、ナタネハナザオ属（Ｃｏｎｒｉｎｇｉａ）の種（ウサギノミミマスタード（Ｈａｒｅ’ｓ ｅａｒ Ｍｕｓｔａｒｄ））、スズラン属（Ｃｏｎｖａｌｌａｒｉａ）の種（スズラン）、コパイフェラ属（Ｃｏｐａｉｆｅｒａ）の種（コパイバ）、オウレン属（Ｃｏｐｔｉｓ）の種（オウレン）、ツナソ属（Ｃｏｒｃｈｏｒｕｓ）の種（ジュート）、カキバチシャノキ属（Ｃｏｒｄｉａ）の種（マンジャク、ボコテ）、コルディリネ属（Ｃｏｒｄｙｌｉｎｅ）の種（Ｔｉプラント、ヤシユリ）、ハルシャギク属（Ｃｏｒｅｏｐｓｉｓ）の種（クジャクソウ、ひっつきむし（ｔｉｃｋｓｅｅｄ））、コエンドロ属（Ｃｏｒｉａｎｄｒｕｍ）の種（コリアンダー、シラントロ）、ミズキ属（Ｃｏｒｎｕｓ）の種（ハナミズキ）、コロニラ属（Ｃｏｒｏｎｉｌｌａ）の種（オオゴンハギ）、キケマン属（Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ）の種（キケマン）、ハシバミ属（Ｃｏｒｙｌｕｓ）の種（ハジバミ、ヘーゼル、ヘーゼルナッツ）、コスモス属（Ｃｏｓｍｏｓ）の種（コスモス、メキシカンアスター、ケニキル）、コスタス属（Ｃｏｓｔｕｓ）の種（らせん型ショウガ）、ハグマノキ属（Ｃｏｔｉｎｕｓ）の種（ハグマノキ）、クランベ属（Ｃｒａｍｂｅ）の種（ハマナ）、ベニバナボロギク属（Ｃｒａｓｓｏｃｅｐｈａｌｕｍ）の種（ラグリーフ、シックヘッド（ｔｈｉｃｋｈｅａｄ）、ボロギ（ｂｏｌｏｇｉ）、エボロ（Ｅｂｏｌｏ））、クラッスラ属（Ｃｒａｓｓｕｌａ）の種（クラッスラ、ピグミーウィード（ｐｙｇｍｙｗｅｅｄ））、サンザシ属（Ｃｒａｔａｅｇｕｓ）の種（サンザシ、セイヨウサンザシ、チョウセンアサガオ、メイツリー、ハウベリー）、クレセンティア属（Ｃｒｅｓｃｅｎｔｉａ）の種（ヒョウタンノキ、フインゴ（ｈｕｉｎｇｏ）、クラバシ（ｋｒａｂａｓｉ）、カレバス（ｋａｌｅｂａｓ））、ハマオモト属（Ｃｒｉｎｕｍ）の種（ハマユウ、ハマオモト）、クロッカス属（Ｃｒｏｃｕｓ）の種（サフラン）、タヌキマメ属（Ｃｒｏｔａｌａｒｉａ）の種（チピリン）、ミツバ属（Ｃｒｙｐｔｏｔａｅｎｉａ）の種（ミツバ、日本スギ）、キュウリ属（Ｃｕｃｕｍｉｓ）の種（カンタループ、キュウリ、メロン、ガーキン、マスクメロン、ハニーデュー）、カボチャ属（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）の種（パンプキン、夏カボチャ、冬カボチャ）、クミン属（Ｃｕｍｉｎｕｍ）の種（クミン）、コウヨウザン属（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｉａ）の種（コウヨウザン、チャイニーズモミ）、クパニオプシス属（Ｃｕｐａｎｉｏｐｓｉｓ）の種（タッケルー、ムクロジ）、クフェア属（Ｃｕｐｈｅａ）の種（クフェア、シガープラント、ヘザー）、イトスギ属（Ｃｕｐｒｅｓｓｏｃｙｐａｒｉｓ）の種（レイランドヒノキ、レイランドイトスギ）、ホソイトスギ属（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ）の種（イトスギ）、ウコン属（Ｃｕｒｃｕｍａ）の種（ターメリック）、クラスタマメ属（Ｃｙａｍｏｐｓｉｓ）の種（グアル）、ソテツ属（Ｃｙｃａｓ）の種（ソテツ）、シクロピア属（Ｃｙｃｌｏｐｉａ）の種（ハニーブッシュ）、マルメロ属（Ｃｙｄｏｎｉａ）の種（マルメロ）、オガルカヤ属（Ｃｙｍｂｏｐｏｇｏｎ）の種（レモングラス）、チョウセンアザミ属（Ｃｙｎａｒａ）の種（カルドン、アーティチョーク、アザミ）、カヤツリグサ属（Ｃｙｐｅｒｕｓ）の種（ショクヨウカヤツリ、カミガヤツリ、メリケンガヤツリ、カヤツリグサ（ｎｕｔｓｅｄｇｅ、ｕｍｂｒｅｌｌａ－ｓｅｄｇｅ、ｇａｌｉｎｇａｌｅ））、ダリア属（Ｄａｈｌｉａ）の種（ダリア）、ツルサイカチ属（Ｄａｌｂｅｒｇｉａ）の種（キングウッド、インディアンローズウッド、アフリカンブラックウッド、ユリノキ）、ニンジン属（Ｄａｕｃｕｓ）の種（ニンジン）、デビッドソニア属（Ｄａｖｉｄｓｏｎｉａ）の種（ウーレイ（Ｏｏｒａｙ））、ホウオウボク属（Ｄｅｌｏｎｉｘ）の種（ホウオウボク）、キク属（Ｄｅｎｄｒａｎｔｈｅｍａ）の種（キク）、デンドロカラムス属（Ｄｅｎｄｒｏｃａｌａｍｕｓ）の種（タケ）、シケシダ属（Ｄｅｐａｒｉａ）の種（シダ）、デルマトフィルム属（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｌｌｕｍ）の種（メスカルビーン（Ｍｅｓｃａｌｂｅａｎ））、コメススキ属（Ｄｅｓｃｈａｍｐｓｉａ）の種（コメススキ、タソックグラス）、ディアリウム属（Ｄｉａｌｉｕｍ）の種（タマリンド）、ナデシコ属（Ｄｉａｎｔｈｕｓ）の種（カーネーション、ピンク、アメリカナデシコ、ナデシコ）、コマクサ属（Ｄｉｃｅｎｔｒａ）の種（ケマンソウ）、キヌガサタケ属（Ｄｉｃｔｙｏｐｈｏｒａ）の種（スッポンタケ）、ディエテス属（Ｄｉｅｔｅｓ）の種（ウッドアイリス、フォートナイトリリー、アフリカアヤメ、日本アヤメ、バタフライアイリス）、リュウガン属（Ｄｉｍｏｃａｒｐｕｓ）の種（リュウガン）、ヤマノイモ属（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ）の種（ヤムイモ）、カキノキ属（Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓ）の種（カキ、ブラックサポテ）、ノコギリシダ属（Ｄｉｐｌａｚｉｕｍ）の種（シダ）、エダウチナズナ属（Ｄｉｐｌｏｔａｘｉｓ）の種（ロボウガラシ）、ディジゴセカ属（Ｄｉｚｙｇｏｔｈｅｃａ）の種（偽アラリア、ディジゴセカ）、ハウチワノキ属（Ｄｏｄｏｎａｅａ）の種（ハウチワノキ）、ドエリンゲリア属（Ｄｏｅｌｌｉｎｇｅｒｉａ）の種（チャムチ（Ｃｈａｍ－ｃｈｗｉ））、ドムベヤ属（Ｄｏｍｂｅｙａ）の種（ドムベヤ、ディクバス（ｄｉｋｂａｓ）、ピンクボール（Ｐｉｎｋｂａｌｌ））、ドヴヤリス属（Ｄｏｖｙａｌｉｓ）の種（グーズベリー、ケイアップル）、ドラセナ属（Ｄｒａｃａｅｎａ）の種（リュウケツジュ、ドラセナ）、オシダ属（Ｄｒｙｏｐｔｅｒｉｓ）の種（シダ）、ドリアン属（Ｄｕｒｉｏ）の種（ドリアン）、ヒメタケヤシ属（Ｄｙｐｓｉｓ）の種（アレカヤシ）、ディスコリステ属（Ｄｙｓｃｈｏｒｉｓｔｅ）の種（スネークハーブ）、ディスファニア属（Ｄｙｓｐｈａｎｉａ）の種（アリタソウ）、ムラサキバレンギク属（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ）の種（ムラサキバレンギク、コーンフラワー）、シャゼンムラサキ属（Ｅｃｈｉｕｍ）の種（シャゼンムラサキ）、カジメ属（Ｅｃｋｌｏｎｉａ）の種（カジメ）、グミ属（Ｅｌａｅａｇｎｕｓ）の種（ギンヨウグミ、グミ）、ホルトノキ属（Ｅｌａｅｏｃａｒｐｕｓ）の種（セイロンオリーブ）、ショウズク属（Ｅｌｅｔｔａｒｉａ）の種（カルダモン）、エルウェンディア属（Ｅｌｗｅｎｄｉａ）の種（ブラッククミン）、エゾムギ属（Ｅｌｙｍｕｓ）の種（シバムギ、エゾムギ、カモジグサ）、アカバナ属（Ｅｐｉｌｏｂｉｕｍ）の種（アカバナ）、イカリソウ属（Ｅｐｉｍｅｄｉｕｍ）の種（イカリソウ）、ハブカズラ属（Ｅｐｉｐｒｅｍｎｕｍ）の種（ポトス（Ｃｅｎｔｉｐｅｄｅ
ｔｏｎｇａｖｉｎｅ、ｐｏｔｈｏｓ、ｄｅｖｉｌ’ｓ ｉｖｙ））、エレモシトラス属（Ｅｒｅｍｏｃｉｔｒｕｓ）の種（デザートライム）、ムカシヨモギ属（Ｅｒｉｇｅｒｏｎ）の種（ノミヨケ草、ムカシヨモギ）、ビワ属（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ）の種（ビワ）、エリオディクティオン属（Ｅｒｉｏｄｉｃｔｙｏｎ）の種（サンタ草）、エルノデア属（Ｅｒｎｏｄｅａ）の種（ビーチ（Ｂｅｅｃｈ）クリーパー、コフブッシュ（ｃｏｕｇｈｂｕｓｈ））、キバナスズシロ属（Ｅｒｕｃａ）の種（ルッコラ）、エリンギウム属（Ｅｒｙｎｇｉｕｍ）の種（エリンゴ、エリンギウム、クラントロ）、エリスリナ属（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ）の種（デイゴ、ゴウシュウアオギリ、ブカレ、カファーブーム（ｋａｆｆｅｒｂｏｏｍ））、ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）の種（ガム、ユーカリノキ、マリー）、ユーチャリス属（Ｅｕｃｈａｒｉｓ）の種（アマゾンユリ）、トチュウ属（Ｅｕｃｏｍｍｉａ）の種（チャイニーズゴムの木）、ユーゲニア属（Ｅｕｇｅｎｉａ）の種（砂丘ギンバイカ（Ｄｕｎｅ ｍｙｒｔｌｅ）、熱帯雨林プラム、ヤマザクラ、ピタンガ、アラザ）、ゴシュユ属（Ｅｕｏｄｉａ）の種（ゴシュユ）、ヒヨドリバナ属（Ｅｕｐａｔｏｒｉｕｍ）の種（ヒヨドリバナ、フジバカマ、スネークルート）、トウダイグサ属（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ）の種（トウダイグサ）、ユリオプス属（Ｅｕｒｙｏｐｓ）の種（ユリオプス）、ユーストマ属（Ｅｕｓｔｏｍａ）の種（リシアンサス、プレーリーゲンチアン）、ユーテルペ属（Ｅｕｔｅｒｐｅ）の種（アサイヤシ）、ベニヒメリンドウ属（Ｅｘａｃｕｍ）の種（ペルシャスミレ）、ソバ属（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ）の種（ソバ）、ブナ属（Ｆａｇｕｓ）の種（ブナノキ）、ファツヘデラ属（Ｆａｔｓｈｅｄｅｒａ）の種（ツリーアイビー、アラリアアイビー）、オオウイキョウ属（Ｆｅｒｕｌａ）の種（フェンネル、麝香木、カンショウ）、ウシノケグサ属（Ｆｅｓｔｕｃａ）の種（ウシノケグサ）、フィカリア属（Ｆｉｃａｒｉａ）の種（クサノオウ）、イチジク属（Ｆｉｃｕｓ）の種（イチジク）、シモツケソウ属（Ｆｉｌｉｐｅｎｄｕｌａ）の種（シモツケソウ）、アオギリ属（Ｆｉｒｍｉａｎａ）の種（アオギリ）、フラコウルティア属（Ｆｌａｃｏｕｒｔｉａ）の種（バトコプラム）、エノキタケ属（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）の種（えのきだけ）、ウイキョウ属（Ｆｏｅｎｉｃｕｌｕｍ）の種（フェンネル）、フォレスティエラ属（Ｆｏｒｅｓｔｉｅｒａ）の種（スワンププリベット）、キンカン属（Ｆｏｒｔｕｎｅｌｌａ）の種（キンカン）、フォッサギラ属（Ｆｏｔｈｅｒｇｉｌｌａ）の種（ハンノキモドキ）、オランダイチゴ属（Ｆｒａｇａｒｉａ）の種（イチゴ）、フラングラ属（Ｆｒａｎｇｕｌａ）の種（カスカラ）、フランクリニア属（Ｆｒａｎｋｌｉｎｉａ）の種（フランクリンツリー）、トリネコ属（Ｆｒａｘｉｎｕｓ）の種（トリネコ）、バイモ属（Ｆｒｉｔｉｌｌａｒｉａ）の種（バイモ）、ヒバマタ属（Ｆｕｃｕｓ）の種（岩藻）、カラクサケマン属（Ｆｕｍａｒｉａ）の種（カラクサケマン）、テンニンギク属（Ｇａｉｌｌａｒｄｉａ）の種（テンニンギク）、ヤマムグラ属（Ｇａｌｉｕｍ）の種（クルマバソウ）、マンネンタケ属（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ）の種（霊芝キノコ）、ガルベリア属（Ｇａｒｂｅｒｉａ）の種（ガルベリア（Ｇａｒｂｅｒｉａ、Ｇａｒｂｅｒ’ｓ ｓｃｒｕｂ ｓｔａｒｔｓ））、フクギ属（Ｇａｒｃｉｎｉａ）の種（マンゴスチン、サップツリー、ガルシニア）、クチナシ属（Ｇａｒｄｅｎｉａ）の種（クチナシ）、シラタマノキ属（Ｇａｕｌｔｈｅｒｉａ）の種（ウィンターグリーン、ヤマモモ、セッコウボク、シャロン）、ゲイルサシア属（Ｇａｙｌｕｓｓａｃｉａ）の種（ハックルベリー）、ガザニア属（Ｇａｚａｎｉａ）の種（ガザニア、トレイリング（ｔｒａｉｌｉｎｇ）ガザニア、クランピング（ｃｌｕｍｐｉｎｇ）ガザニア）、ゲイイェラ属（Ｇｅｉｊｅｒａ）の種（ゲイイェラ、ウィルガ、オイルブッシュ、シープブッシュ）、ジェニパ属（Ｇｅｎｉｐａ）の種（ジェニップ（Ｇｅｎｉｐ））、リンドウ属（Ｇｅｎｔｉａｎａ）の種（リンドウ）、ゼラニウム属（Ｇｅｒａｎｉｕｍ）の種（ゼラニウム、クレインズビル）、ギガントクロア属（Ｇｉｇａｎｔｏｃｈｌｏａ）の種（タケ）、イチョウ属（Ｇｉｎｋｇｏ）の種（イチョウ（Ｇｉｎｋｇｏ、ｍａｉｄｅｎｈａｉｒ ｔｒｅｅ））、シュンギク属（Ｇｌｅｂｉｏｎｉｓ）の種（キク、アラゲシュンギク、シュンギク）、サイカチ属（Ｇｌｅｄｉｔｓｉａ）の種（アメリカサイカチ）、グリヌス属（Ｇｌｉｎｕｓ）の種（スイートジュース）、グリシン属（Ｇｌｙｃｉｎｅ）の種（ダイズ）、センニチコウ属（Ｇｏｍｐｈｒｅｎａ）の種（センニチコウ）、シュスラン属（Ｇｏｏｄｙｅｒａ）の種（シュスラン、ジェードオーキッド、ネジバナ）、ゴルドニア属（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）の種（ゴルドニア、ロブロリーベイ（ｌｏｂｌｏｌｌｙ－ｂａｙ））、ワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）の種（綿実）、グレビレア属（Ｇｒｅｖｉｌｌｅａ）の種（グレビレア、スパイダーフラワー、シノブノキ、歯ブラシプラント（ｔｏｏｔｈｂｒｕｓｈ ｐｌａｎｔ））、グレウィア属（Ｇｒｅｗｉａ）の種（ファルサ）、グリフォラ属（Ｇｒｉｆｏｌａ）の種（マイタケ）、グリンデリア属（Ｇｒｉｎｄｅｌｉａ）の種（グリンデリア）、ユソウボク属（Ｇｕａｉａｃｕｍ）の種（グアヤク）、キバナタカサブロウ属（Ｇｕｉｚｏｔｉａ）の種（ニガー種子）、ギムネマ属（Ｇｙｍｎｅｍａ）の種（ギムネマ）、ウサギシダ属（Ｇｙｍｎｏｃａｒｐｉｕｍ）の種（ウサギシダ）、ギムノクラヅス属（Ｇｙｍｎｏｃｌａｄｕｓ）の種（コーヒーノキ、ソープツリー）、ウラハグサ属（Ｈａｋｏｎｅｃｈｌｏａ）の種（箱根草、ウラハグサ）、ハレーシア属（Ｈａｌｅｓｉａ）の種（シルバーベル、スノードロップツリー）、マンサク属（Ｈａｍａｍｅｌｉｓ）の種（マンサク）、ハメリア属（Ｈａｍｅｌｉａ）の種（ファイヤーブッシュ、ハミングバードブッシュ、スカーレットブッシュ、レッドヘッド）、ハンコルニア属（Ｈａｎｃｏｒｎｉａ）の種（マンガバ）、ハルペフィルム属（Ｈａｒｐｅｐｈｙｌｌｕｍ）の種（カフィアプラム）、ヘディキウム属（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ）の種（シュクシャ、ジンジャーユリ、カヒリジンジャー）、ヒマワリ属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）の種（ヒマワリ、キクイモ）、ムギワラギク属（Ｈｅｌｉｃｈｒｙｓｕｍ）の種（カレープラント）、ヘリコニア属（Ｈｅｌｉｃｏｎｉａ）の種（ロブスタークロウ、トウカンビーク（ｔｏｕｃａｎ ｂｅａｋ）、ワイルドプランテーン、偽ゴクラクチョウカ（ｆａｌｓｅ ｂｉｒｄ－ｏｆ－ｐａｒａｄｉｓｅ））、ヘリクトトリコン属（Ｈｅｌｉｃｔｏｔｒｉｃｈｏｎ）の種（ブルーオートグラス（ｂｌｕｅ ｏａｔ ｇｒａｓｓ））、ワスレグサ属（Ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ）の種（デイイリー）、ハナウド属（Ｈｅｒａｃｌｅｕｍ）の種（ホグウィード、ハナウド）、ヘリシウム属（Ｈｅｒｉｃｉｕｍ）の種（ポンポン（Ｐｏｍ Ｐｏｍ）、食用キノコ）、ハナダイコン属（Ｈｅｓｐｅｒｉｓ）の種（ハナダイコン）、ツボサンゴ属（Ｈｅｕｃｈｅｒａ）の種（ツボサンゴ（ｃｏｒａｌ ｂｅｌｌ、ａｌｕｍｒｏｏｔ））、ハイビスカス属（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ）の種（ハイビスカス、フヨウ、ムクゲ）、コウボウ属（Ｈｉｅｒｏｃｈｌｏｅ）の種（グラス）、ヒッペアストルム属（Ｈｉｐｐｅａｓｔｒｕｍ）の種（アマリリス）、ヒッポファエ属（Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ）の種（シーバックソーン）、ホロディスクス属（Ｈｏｌｏｄｉｓｃｕｓ）の種（オーシャンスプレー、クリームブッシュ）、オオムギ属（Ｈｏｒｄｅｕｍ）の種（オオムギ）、ギボウシ属（Ｈｏｓｔａ）の種（ギボウシ、ギボシ、プランテーンリリー）、ドクダミ属（Ｈｏｕｔｔｕｙｎｉａ）の種（ドクダミ）、ケンポナシ属（Ｈｏｖｅｎｉａ）の種（ケンポナシ）、ハウエア属（Ｈｏｗｅａ）の種（ヒロハケンチャヤシ、ヤネフキヤシ、ベルモアホエア）、ホヤ属（Ｈｏｙａ）の種（ワックスプラント、ワックスバイン、ワックスフラワー、ホヤ）、ハイブリッド属（Ｈｙｂｒｉｄ）の種（アスティルベ）、アジサイ属（Ｈｙｄｒａｎｇｅａ）の種（アジサイ、西洋アジサイ）、ハイドオフィルム属（Ｈｙｄｒｏｐｈｙｌｌｕｍ）の種（ハゼリソウ）、ヒロセレウス属（Ｈｙｌｏｃｅｒｅｕｓ）の種（ドラゴンフルーツ、ピタハヤ）、ヒメナエ属（Ｈｙｍｅｎａｅａ）の種（コウリルバリル）、ヒメノカリス属（Ｈｙｍｅｎｏｃａｌｌｉｓ）の種（ヒガンバナ）、オトギリソウ属（Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ）の種（オトギリソウ、ゴートウィード）、ドームヤシ属（Ｈｙｐｈａｅｎｅ）の種（ドームヤシ）、ヒプシジグス属（Ｈｙｐｓｉｚｙｇｕｓ）の種（ブナシメジ）、ヒソップ属（Ｈｙｓｓｏｐｕｓ）の種（ハーブヒソップ）、モチノキ属（Ｉｌｅｘ）の種（ホリー、モチノキ）、シキミ属（Ｉｌｌｉｃｉｕｍ）の種（スターアニス、アニスツリー）、インパチェンス属（Ｉｍｐａｔｉｅｎｓ）の種（インパチェンス、ジュエルウィード、ホウセンカ、スナップウィード、パチエンス（ｐａｔｉｅｎｃｅ）、バルサム、アフリカホウセンカ）、チガヤ属（Ｉｍｐｅｒａｔａ）の種（チガヤ草）、コマツナギ属（Ｉｎｄｉｇｏｆｅｒａ）の種（インディゴ）、インガ属（Ｉｎｇａ）の種（インガ）、イポメア属（Ｉｐｏｍｏｅａ）の種（サツマイモ、アサガオ、空心菜、カンクン（ｋａｎｇｋｕｎｇ）、ヒルガオ、ヨルガオ、ヤラブ）、アヤメ属（Ｉｒｉｓ）の種（アヤメ）、イルヴィンギア属（Ｉｒｖｉｎｇｉａ）の種（ディーカ）、イヴァ属（Ｉｖａ）の種（セイヨウニワトコ）、イクソラ属（Ｉｘｏｒａ）の種（ウエストインディアンジャスミン、ヴィルチ（ｖｉｒｕｃｈｉ）、ランガン（ｒａｎｇａｎ）、ケーム（ｋｈｅｍｅ）、ポンナ（ｐｏｎｎａ）、チャンタネア（ｃｈａｎｎ ｔａｎｅａ）、テチ（ｔｅｃｈｉ）、パン（ｐａｎ）、シアンタン（ｓｉａｎｔａｎ）、ジャルムジャルム（ｊａｒｕｍ－ｊａｒｕｍ）、ジェジャルム（ｊｅｊａｒｕｍ）、ジャングルフレーム、ジャングルゼラニウム、クルスデマルタ（ｃｒｕｚ ｄｅ Ｍａｌｔａ））、ジャカランダ属（Ｊａｃａｒａｎｄａ）の種（ジャカランダ）、ヤスミヌム属（Ｊａｓｍｉｎｕｍ）の種（ジャスミン）、ナンヨウアブラギリ属（Ｊａｔｒｏｐｈａ）の種（ナンヨウアブラギリ、ネトルスパージ（ｎｅｔｔｌｅｓｐｕｒｇｅ））、ユバエア属（Ｊｕｂａｅａ）の種（ヤシ）、クルミ属（Ｊｕｇｌａｎｓ）の種（クルミ）、イグサ属（Ｊｕｎｃｕｓ）の種（ラッシュ（Ｒｕｓｈ））、ビャクシン属（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ）の種（ビャクシン）、キツネノマゴ属（Ｊｕｓｔｉｃｉａ）の種（キツネノマゴ、コエビソウ、マラバーナット（Ｍａｌａｂａｒ ｎｕｔ））、カランコエ属（Ｋａｌａｎｃｈｏｅ）の種（カランコエ、パンダプラント、マザーオブサウザンド（ｍｏｔｈｅｒ ｏｆ ｔｈｏｕｓａｎｄｓ）、フェルトプラント）、カリメリス属（Ｋａｌｉｍｅｒｉｓ）の種（インディアンアスター、カリメリスアスター）、カルミア属（Ｋａｌｍｉａ）の種（ナガバハナガサ（Ｓｈｅｅｐ－ｌａｕｒｅｌ、ｌａｍｂ－ｋｉｌｌ、ｃａｌｆ－ｋｉｌｌ、ｋｉｌｌ－ｋｉｄ、ｓｈｅｅｐ－ｐｏｉｓｏｎ）、スプーンウッド）、ハリギリ属（Ｋａｌｏｐａｎａｘ）の種（キャスターアラリア、ツリーアラリア、プリックリーキャスターオイルツリー）、クニフォフィア属（Ｋｎｉｐｈｏｆｉａ）の種（トリトマ、レッドホットポーカー、トーチリリー、ノフラー（ｋｎｏｆｆｌｅｒ）、ポーカープラント）、モクゲンジ属（Ｋｏｅｌｒｅｕｔｅｒｉａ）の種（モクゲンジ、フレームゴールド、チャイニーズフレームツリー）、クンゼア属（Ｋｕｎｚｅａ）の種（クンゼア、カヌカ、ギョリュウバイ、ムントリー）、ラブラブ属（Ｌａｂｌａｂ）の種（フジマメ、ラブラブビーン、バタウ（ｂａｔａｗ）、インディアンビーン）、キングサリ属（Ｌａｂｕｒｎｕｍ）の種（キングサリ、モクゲンジ、ラバーナム）、アキノノゲシ属（Ｌａｃｔｕｃａ）の種（レタス、セルタス）、ユウガオ属（Ｌａｇｅｎａｒｉａ）の種（ヒョウタンノキ、ヒョウタンの実）、
サルスベリ属（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｅｍｉａ）の種（サルスベリ）、コンブ属（Ｌａｍｉｎａｒｉａ）の種（ケルプ、コンブ）、ランシウム属（Ｌａｎｓｉｕｍ）の種（ランソネス、ランサット）、ラタニア属（Ｌａｔａｎｉａ）の種（ラタンヤシ、ラタニアヤシ）、ラウネア属（Ｌａｕｎａｅａ）の種（ラウネア）、ゲッケイジュ属（Ｌａｕｒｕｓ）の種（月桂樹、スイートベイ）、ラバンヅラ属（Ｌａｖａｎｄｕｌａ）の種（ラベンダー）、レキティス属（Ｌｅｃｙｔｈｉｓ）の種（パラダイスナット、モンキーポット、クリームナット、サプカイアナット）、ウドノキ属（Ｌｅｅａ）の種（ウドノキ、タリアンタン（Ｔａｌｙａｎｔａｎ））、ヒラマメ属（Ｌｅｎｓ）の種（レンズマメ）、シイタケ属（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ）の種（シイタケ）、メハジキ属（Ｌｅｏｎｕｒｕｓ）の種（マザーウォート）、レピジウム属（Ｌｅｐｉｄｉｕｍ）の種（ペッパークレス、ペッパーグラス、ペッパーウォート、タンブルウィード）、ムラサキシメジ属（Ｌｅｐｉｓｔａ）の種（オオムラサキシメシ、キノコ形成真菌）、ハギ属（Ｌｅｓｐｅｄｅｚａ）の種（ハギ、ヤハズソウ）、レスケレラ属（Ｌｅｓｑｕｅｒｅｌｌａ）の種（ガスライトブラダーポッド）、レッセルティア属（Ｌｅｓｓｅｒｔｉａ）の種（バルーンピー）、ギンネム属（Ｌｅｕｃａｅｎａ）の種（ギンネム）、フランスギク属（Ｌｅｕｃａｎｔｈｅｍｕｍ）の種（マックスキク、アメリカハマグルマ、フランスギク、シャスターデージー）、イワナンテン属（Ｌｅｕｃｏｔｈｏｅ）の種（イワナンテン、スイートベル、ドッグホブル、ブラックローレル）、ロイコスリナックス属（Ｌｅｕｃｏｔｈｒｉｎａｘ）の種（ヤシ）、レヴィスティクム属（Ｌｅｖｉｓｔｉｃｕｍ）の種（ラビッジ）、レウィシア属（Ｌｅｗｉｓｉａ）の種（レウィシア）、リアトリス属（Ｌｉａｔｒｉｓ）の種（ブレイジングスター）、リカニア属（Ｌｉｃａｎｉａ）の種（ゴファーアップル、サンサポテ、メアキュア（ｍｅｒｅｃｕｒｅ）、オイシチカ）、イボタノキ属（Ｌｉｇｕｓｔｒｕｍ）の種（イボタノキ）、ユリ属（Ｌｉｌｉｕｍ）の種（真のユリ、ユリ）、リムナンテス属（Ｌｉｍｎａｎｔｈｅｓ）の種（メドウフォーム）、シソクサ属（Ｌｉｍｎｏｐｈｉｌａ）の種（マーシュウィード）、リモニア属（Ｌｉｍｏｎｉａ）の種（ウッドアップル）、イソマツ属（Ｌｉｍｏｎｉｕｍの種（イソマツ、スターチス、カスピア、マーシュローズマリー）、クロモジ属（Ｌｉｎｄｅｒａ）の種（スパイスウッド、スパイスブッシュ、ベンジャミンブッシュ）、リンネソウ属（Ｌｉｎｎａｅａ）の種（ビューティーブッシュ、リンネソウ）、アマ属（Ｌｉｎｕｍ）の種（アマ）、リッピア属（Ｌｉｐｐｉａ）の種（リッピア、メキシカンオレガノ、カンゾウ、バーベナ）、フウ属（Ｌｉｑｕｉｄａｍｂａｒ）の種（アメリカンストラックス、サテンクルミ、レッドゴム、モミジバフウ、スターゴム）、ユリノキ属（Ｌｉｒｉｏｄｅｎｄｒｏｎ）の種（チューリップツリー、ユリノキ、イエローポプラ）、ヤブラン属（Ｌｉｒｉｏｐｅ）の種（ヤブラン、モンキーグラス、スパイダーグラス）、レイシ属（Ｌｉｔｃｈｉ）の種（ライチ）、リビストナ属（Ｌｉｖｉｓｔｏｎａ）の種（トウビロウ）、ミゾカクシ属（Ｌｏｂｅｌｉａ）の種（ロベリア）、ニワナズナ属（Ｌｏｂｕｌａｒｉａ）の種（ニワナズナ）、スイカズラ属（Ｌｏｎｉｃｅｒａ）の種（スイカズラ）、トキワマンサク属（Ｌｏｒｏｐｅｔａｌｕｍ）の種（トキワマンサク、チャイニーズフリンジフラワー）、ミヤコグサ属（Ｌｏｔｕｓ）の種（ハス、ディアヴェッチ（ｄｅｅｒｖｅｔｃｈ）、ミヤコグサ、三葉）、ヘチマ属（Ｌｕｆｆａ）の種（ヒョウタン、ヘチマ）、ゴウダソウ属（Ｌｕｎａｒｉａ）の種（ギンセンソウ）、ルピナス属（Ｌｕｐｉｎｕｓ）の種（ルピン、ルパイン）、センノウ属（Ｌｙｃｈｎｉｓ）の種（センノウ、ムシトリナデシコ）、クコ属（Ｌｙｃｉｕｍ）の種（ゴジベリー、クコ、デザートソーン）、トマト属（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）の種（トマト、ワイルドトマト）、シロネ属（Ｌｙｃｏｐｕｓ）の種（ジプシーウォート、キランソウ、シロネ）、ネジキ属（Ｌｙｏｎｉａ）の種（スタガーブッシュ、プアグラブ（Ｐｏｏｒ－ｇｒｕｂ）、メイルベリー、ヒーハックルベリー、フラーブッシュ（Ｈｕｒｒａｈｂｕｓｈ））、ミズバショウ属（Ｌｙｓｉｃｈｉｔｏｎ）の種（スカンクキャベツ、スワンプランタン）、リシロマ属（Ｌｙｓｉｌｏｍａ）の種（偽タマリンド、サビク）、オカトラノオ属（Ｌｙｓｉｍａｃｈｉａ）の種（ルースストライフ）、イヌエンジュ属（Ｍａａｃｋｉａ）の種（イヌエンジュ）、マカダミア属（Ｍａｃａｄａｍｉａ）の種（マカダミア）、ハリグワ属（Ｍａｃｌｕｒａ）の種（コックスパーソーン、オセージオレンジ、ダイヤーズマルベリー（Ｄｙｅｒ’ｓ ｍｕｌｂｅｒｒｙ）、マンダリンメロンベリー．Ｃｈｅ）、マクロシスティス属（Ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ）の種（ジャイアントケルプ、ジャイアントブラダーケルプ）、モクレン属（Ｍａｇｎｏｌｉａ）の種（マグノリア）、ヒイラギナンテン属（Ｍａｈｏｎｉａ）の種（ヒイラギナンテン、フリモントマホニア、アガリータ、シャパラルベリー）、マイズルソウ属（Ｍａｉａｎｔｈｅｍｕｍ）の種（ユキザサ）、マルコルミア属（Ｍａｌｃｏｌｍｉａ）の種（ヒメアラセイトウ、アフリカマスタード）、マロトニア属（Ｍａｌｌｏｔｏｎｉａ）の種（シーラベンダー）、マルピギア属（Ｍａｌｐｉｇｈｉａ）の種（アセロラ、バルバドスサクランボ、ドワーフホリー）、リンゴ属（Ｍａｌｕｓ）の種（リンゴ、クラブアップル、クラブツリー、ワイルドアップル）、マンメア属（Ｍａｍｍｅａ）の種（マミーアップル、トロピカルアプリコット、サラピー）、マンデビラ属（Ｍａｎｄｅｖｉｌｌａ）の種（ロックトランペット、アラマンダ）、マンギフェラ属（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ）の種（マンゴー、ホワイトマンゴー、ジャック、パフタン、パホ）、マニホット属（Ｍａｎｉｈｏｔ）の種（キャッサバ）、マニルカラ属（Ｍａｎｉｌｋａｒａ）の種（サポジラ、マッサランズーバ、チクル、サポタ）、マランタ属（Ｍａｒａｎｔａ）の種（ヒョウモンヨウショウ、ハナトラノオ、マランタ）、マルリエレア属（Ｍａｒｌｉｅｒｅａ）の種（ベルクイロ）、マルビウム・ブルガレ（Ｍａｒｒｕｂｉｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）（ホアハウンド）、マチシア属（Ｍａｔｉｓｉａ）の種（モリニージョ、チュパチュパ）、シカギク属（Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ）の種（ジャーマンカモミール、カミツレモドキ）、マッテウシア属（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉａ）の種（クサソテツ、ゼンマイ、シャトルコックシダ）、アラセイトウ属（Ｍａｔｔｈｉｏｌａ）の種（ストック、アラセイトウ）、ウマゴヤシ属（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）の種（アルファルファ、メディック、ウマゴヤシ）、メラレウカ属（Ｍｅｌａｌｅｕｃａ）の種（ペーパーバーク、コバノブラッシノキ、ティーツリー）、メランポジウム属（Ｍｅｌａｍｐｏｄｉｕｍ）の種（ブラックフット）、センダン属（Ｍｅｌｉａ）の種（センダン、ペルシアハシドイ）、メリコッカス属（Ｍｅｌｉｃｏｃｃｕｓ）の種（メリコッカノキ、モトヨエ（Ｍｏｔｏｙｏｅ）、クエネパ）、シナガワハギ属（Ｍｅｌｉｌｏｔｕｓ）の種（シナガワハギ、スイートクローバー、クモニガ）、コウスイハッカ属（Ｍｅｌｉｓｓａ）の種（レモンバーム）、ハッカ属（Ｍｅｎｔｈａ）の種（ミント）、メリリア属（Ｍｅｒｒｉｌｌｉａ）の種（フラワーメリリア、カチンガ（ｋａｔｉｎｇａ）、マレーレモン）、メセンブリアンテムム属（Ｍｅｓｅｍｂｒｙａｎｔｈｅｍｕｍ）の種（アイスプラント）、セイヨウカリン属（Ｍｅｓｐｉｌｕｓ）の種（セイヨウカリン）、メタセコイア属（Ｍｅｔａｓｅｑｕｏｉａ）の種（アケボノスギ）、オガタマノキ属（Ｍｉｃｈｅｌｉａ）の種（オガタマノキ、ホワイトチャンパカ、キンコウボク、ダンディー、トウオガタマ）、ミクロシトラス属（Ｍｉｃｒｏｃｉｔｒｕｓ）の種（ライム）、ミクロメリア属（Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉａ）の種（イェルバブエナ、ホワイトミクロメリア、ホワイトリーフセイバリー、ミクロメリア）、ミリキア属（Ｍｉｌｉｃｉａ）の種（イロコ、アフリカチーク、オダム）、ミレッティア属（Ｍｉｌｌｅｔｔｉａ）の種（ポンガミア）、ミゾホオズキ属（Ｍｉｍｕｌｕｓ）の種（ミズホオズキ）、ススキ属（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）の種（ススキ（Ｓｉｌｖｅｒｇｒａｓｓ、Ｍａｉｄｅｎ ｇｒａｓｓ））、ツルアリドオシ属（Ｍｉｔｃｈｅｌｌａ）の種（ツルアリドウシ）、ツルレイシ属（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ）の種（苦瓜、ナンバンカラスウリ、スパインゴード、カントラ、ツルレイシ）、ヤグルマハッカ属（Ｍｏｎａｒｄａ）の種（セイヨウヤマハッカ、ホースミント、タイマツバナ、ベルガモット）、モンステラ属（Ｍｏｎｓｔｅｒａ）の種（ホウライショウ、シングルプラント（ｓｈｉｎｇｌｅ ｐｌａｎｔ）、ファイブホールプラント（ｆｉｖｅ ｈｏｌｅｓ ｐｌａｎｔ）、モンステラ）、モンティア属（Ｍｏｎｔｉａ）の種（マイナーズレタス、ヌマハコベ、冬スベリヒユ）、アミガサタケ属（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ）の種（アミガサタケ）、ヤエヤマアオキ属（Ｍｏｒｉｎｄａ）の種（ノニ、インディアンマルベリー、スイートモリンダ、レッドガル（ｒｅｄｇａｌ）、ヤウウェード（ｙａｗｗｅｅｄ）、チーズシュラブ（ｃｈｅｅｓｅ ｓｈｒｕｂ））、クワ属（Ｍｏｒｕｓ）の種（マルベリー）、トビカズラ属（Ｍｕｃｕｎａ）の種（鹿の眼豆、ロバの眼豆、雄牛の眼豆、ハンバーガー豆）、ネズミガヤ属（Ｍｕｈｌｅｎｂｅｒｇｉａ）の種（ムーリー（Ｍｕｈｌｙ））、ムンチンギア属（Ｍｕｎｔｉｎｇｉａ）の種（ジャマイカサクランボ）、ゲッキツ属（Ｍｕｒｒａｙａ）の種（カレーツリー、オレンジジャスミン、チャイナボックス）、バショウ属（Ｍｕｓａ）の種（バナナ、プランテイン）、ミルシアンテス属（Ｍｙｒｃｉａｎｔｈｅｓ）の種（ルクミロ（Ｌｕｃｕｍｉｌｌｏ）、ツインベリー、アラヤン（ａｒｒａｙａｎ）、グアビユ（Ｇｕａｂｉｙｕ））、ミルキアリア属（Ｍｙｒｃｉａｒｉａ）の種（ジャボチカバ、グアバベリー、ヒバプル（ｈｉｖａｐｕｒｕ）、サバラ（ｓａｂａｒａ）、イバプル（ｙｂａｐｕｒｕ））、ヤマモモ属（Ｍｙｒｉｃａ）の種（ヤマモモ、ベーラムノキ、キャンドルベリー、ヤチヤナギ、ワックスマートル）、ニクズク属（Ｍｙｒｉｓｔｉｃａ）の種（ナツメグ、メース、クムパング（Ｋｕｍｐａｎｇ）、マカッサルナツメグ、シルバーナツメグ）、バルサムノキ属（Ｍｙｒｏｘｙｌｏｎ）の種（バルサム）、ミリス属（Ｍｙｒｒｈｉｓ）の種（シサリー、ミルラ、スイートチャービル）、ツルマンリョウ属（Ｍｙｒｓｉｎｅ）の種（コリックウッド（Ｃｏｌｉｃｗｏｏｄ）、コーレア、マチポ）、ギンバイカ属（Ｍｙｒｔｕｓ）の種（ギンバイカ）、ナンテン属（Ｎａｎｄｉｎａ）の種（ナンテン（Ｎａｎｄｉｎａ、ｈｅａｖｅｎｌｙ ｂａｍｂｏｏ、ｓａｃｒｅｄ ｂａｍｂｏｏ））、スイセン属（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ）の種（ラッパズイセン、スイセン、キズイセン）、ナスタチウム属（Ｎａｓｔｕｒｔｉｕｍ）の種（ミズガラシ、イヌガラシ）、ナスツス属（Ｎａｓｔｕｓ）の種（タケ）、ハス属（Ｎｅｌｕｍｂｏ）の種（ハス）、ネオマリカ属（Ｎｅｏｍａｒｉｃａ）の種（アメリカシャガ、アポストルアヤメ（ａｐｏｓｔｌｅ’ｓ ｉｒｉｓ）、ネオマリカ）、イヌハッカ属（Ｎｅｐｅｔａ）の種（イヌハッカ（ｃａｔｎｉｐ、ｃａｔｍｉｎｔ、ｃａｔｓｗｏｒｔ））、ネフェリウム属（Ｎｅｐｈｅｌｉｕｍ）の種（ランブータン、コーラン、プラサン）、タマシダ属（Ｎｅｐｈｒｏｌｅｐｉｓ）の種（マッチョシダ、タマシダ）、キョウチクトウ属（Ｎｅｒｉｕｍ）の種（セイヨウキョウチクトウ、キョウチクトウ）、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）の種（タバコ）、クロタネソウ属（Ｎｉｇｅｌｌａ）の種（ブラックヒメウイキョウ、クロタネソウ（ｎｉｇｅｌｌａ、ｄｅｖｉｌ－ｉｎ－ａ－ｂｕｓｈ、ｌｏｖｅ－ｉｎ－ａ－ｍｉｓｔ））、ノロニア属（Ｎｏｒｏｎｈｉａ）の種（マダガスカルオリーブ）、スイレン属（Ｎｙｍｐｈａｅａ）の種（ス
イレン）、ヌマミズキ属（Ｎｙｓｓａ）の種（ニッサ、ヌマミズキ）、オクロシア属（Ｏｃｈｒｏｓｉａ）の種（エリプティック（Ｅｌｌｉｐｔｉｃ）イエローウッド、ブラッドホーン、コプシア、カウアイイエローウッド、サザンオクロシア）、メボウキ属（Ｏｃｉｍｕｍ）の種（バジル、レモンバジル、スイートバジル、カミメボウキ）、オドントネマ属（Ｏｄｏｎｔｏｎｅｍａ）の種（トゥーストスレッド（Ｔｈｏｏｔｈｅｄｔｈｒｅａｄｓ））、オエノカルプス属（Ｏｅｎｏｃａｒｐｕｓ）の種（トゥルパーム（Ｔｕｒｕ ｐａｌｍ）、パルマミルペソス（ｐａｌｍａ ｍｉｌｐｅｓｏｓ）、バカバ、パタワ（Ｐａｔａｗａ））、マツヨイグサ属（Ｏｅｎｏｔｈｅｒａ）の種（サクラソウ、マツヨイグサ、サンカップ、サンドロップ）、オリーブ属（Ｏｌｅａ）の種（オリーブ、ブラックアイアンウッド、アイアンウッド、東アフリカオリーブ、エルゴンチーク）、オノブリキス属（Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ）の種（イガマメ）、ハリブキ属（Ｏｐｌｏｐａｎａｘ）の種（ハリブキ、アラスカニンジン）、オプンティア属（Ｏｐｕｎｔｉａ）の種（ヒラウチワサボテン、ツナサボテン、ノパルサボテン）、ハナハッカ属（Ｏｒｉｇａｎｕｍ）の種（オレガノ、マヨラナ、クレタディタニー（Ｃｒｅｔａｎ ｄｉｔｔａｎｙ）、バイブルヒソップ（ｂｉｂｌｅ ｈｙｓｓｏｐ））、イネ属（Ｏｒｙｚａ）の種（コメ、マコモ、アフリカイネ、ロングスタメン（ｌｏｎｇｓｔａｍｅｎ）ライス、レッドライス、アジアンライス）、モクセイ属（Ｏｓｍａｎｔｈｕｓ）の種（モクセイ、ヒイラギ）、ゼンマイ属（Ｏｓｍｕｎｄａ）の種（レガリスゼンマイ、フラワーゼンマイ（Ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ ｆｅｒｎ））、ヤマドリゼンマイ属（Ｏｓｍｕｎｄａｓｔｒｕｍ）の種（ヤマドリゼンマイ）、アサダ属（Ｏｓｔｒｙａ）の種（アサダ）、カタバミ属（Ｏｘａｌｉｓ）の種（カタバミ、オキザリス、イモカタバミ、偽シャムロック、サワーグラス、オキサリセ（ｏｘａｌｉｓｅ））、オキシデンドラム属（Ｏｘｙｄｅｎｄｒｕｍ）の種（サワーウッド、サワーノキ）、パキラ属（Ｐａｃｈｉｒａ）の種（ギアナクリ、マネーツリー、マラバルクリ、フレンチピーナッツ、プロヴィジョンツリー、サバナット、モングバ、ポチョテ）、クズイモ属（Ｐａｃｈｙｒｈｉｚｕｓ）の種（クズイモ、ヤムビーン、ヌープ、アヒパ）、パキスタキス属（Ｐａｃｈｙｓｔａｃｈｙｓ）の種（カージナルスガード、ロリポッププラント、ゴールデンシュリンププラント）、ボタン属（Ｐａｅｏｎｉａ）の種（シャクヤク、ポーリッシュローズ）、トチバニンジン属（Ｐａｎａｘ）の種（朝鮮人参、中国人参、サンシチニンジン、マウンテンプラント、ヒマラヤニンジン）、タコノキ属（Ｐａｎｄａｎｕｓ）の種（パンダン、スクリューパーム、タコノキ、ニコバルパンノキ、カルカ）、パンドレア属（Ｐａｎｄｏｒｅａ）の種（ソケイノウゼン（Ｗｏｎｇａ ｖｉｎｅ、Ｂｏｗｅｒ ｏｆ ｂｅａｕｔｙ）、パンドラバイン、ボートバイン）、キビ属（Ｐａｎｉｃｕｍ）の種（パニックグラス、アワ、キビ類、ハナクサキビ、タンブルウィード、メイデンケーン）、ケシ属（Ｐａｐａｖｅｒ）の種（ポピー）、パルキア属（Ｐａｒｋｉａ）の種（ビタービーン、アフリカイナゴマメ）、パーキンソニア属（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉａ）の種（パロヴェルデ、ブレア、ヴェルデオリヴォ）、パロチア属（Ｐａｒｒｏｔｉａ）の種（ペルシャアイアンウッド、チャイニーズアイアンウッド）、パルテノキッサス属（Ｐａｒｔｈｅｎｏｃｉｓｓｕｓ）の種（バージニアヅタ、ニオイエンドウ、セブンリーフクリーパー、ボストンアイビー）、トケイソウ属（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ）の種（パッションフルーツ、トケイソウ、トケイソウつる、チャボトケイソウ、クダモノトケイソウ）、アメリカボウフウ属（Ｐａｓｔｉｎａｃａ）の種（パースニップ）、ガラナ属（Ｐａｕｌｌｉｎｉａ）の種（ガラナ、ヨコ）、キリ属（Ｐａｕｌｏｗｎｉａ）の種（プリンセスツリー、キリ、韓国キリ、リュウケツジュ）、パキスチマ属（Ｐａｘｉｓｔｉｍａ）の種（オレゴンボックスリーフ、キャンビイズマウンテンラブ）、テンジクアオイ属（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ）の種（ゼラニウム、オランダフウロ、テンジクアオイ）、ペルトフォルム属（Ｐｅｌｔｏｐｈｏｒｕｍ）の種（ウィーピングワトル、カッパーポッド、イエローフランボヤン、コウエンボク、キバナホウオウボク）、チカラシバ属（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）の種（ファウンテングラス、トウジンビエ、キクユグラス、フェザートップグラス）、イワブクロ属（Ｐｅｎｓｔｅｍｏｎ）の種（イワブクロ）、ペンタリノン属（Ｐｅｎｔａｌｉｎｏｎ）の種（野生アラマンダ）、ペンタス属（Ｐｅｎｔａｓ）の種（ペンタス、ペンタ）、ペペロミア属（Ｐｅｐｅｒｏｍｉａ）の種（ラジエータープラント、ペペロミア）、シソ属（Ｐｅｒｉｌｌａ）の種（エゴマ、シソ）、ペルセア属（Ｐｅｒｓｅａ）の種（アボカド、ゲッケイジュ、コヨ、レッドベイ、スワンプベイ）、イヌタデ属（Ｐｅｒｓｉｃａｒｉａ）の種（ヤナギタデ、タデ、スマートウィード、ホットミント）、フキ属（Ｐｅｔａｓｉｔｅｓ）の種（バターバー、フキタンポポ）、オランダゼリ属（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ）の種（パセリ）、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ）の種（ペチュニア）、ピューセダヌム属（Ｐｅｕｃｅｄａｎｕｍ）の種（ハナウド）、ピュームス属（Ｐｅｕｍｕｓ）の種（ボルドー）、インゲンマメ属（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）の種（マメ、ワイルドビーン）、フェロデンドロン属（Ｐｈｅｌｌｏｄｅｎｄｒｏｎ）の種（コルクガシ、オウバク）、バイカウツギ属（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｕｓ）の種（バイカウツギ）、フィロデンドロン属（Ｐｈｉｌｏｄｅｎｄｒｏｎ）の種（フィロデンドロン、ラスカガルガンタ（ｒａｓｃａｇａｒｇａｎｔａ）、バイルバイン（ｖｉｌｅｖｉｎｅ）、ツリーラバー（ｔｒｅｅｌｏｖｅｒ））、フウロックス属（Ｐｈｌｏｘ）の種（フロックス、ワイルドスイートウィリアム）、フェニックス属（Ｐｈｏｅｎｉｘ）の種（ナツメヤシ、デーツ）、スギタケ属（Ｐｈｏｌｉｏｔａ）の種（ナメコ、キノコ）、カナメモチ属（Ｐｈｏｔｉｎｉａ）の種（カナメモチ）、フィランサス属（Ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ）の種（グーズベリー、リーフフラワー、スクラビースパージ（ｓｃｒｕｂｂｙ ｓｐｕｒｇｅ）、レッドルートフローター、サンドレベルコニア（ｓａｎｄ ｒｅｖｅｒｃｈｏｎｉａ）、グライプウィード（ｇｒｉｐｅｗｅｅｄ）、シャッターストーン（ｓｈａｔｔｅｒｓｔｏｎｅ））、マダケ属（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ）の種（ゴールデンバンブー、フィッシュポールバンブー、イエローグルーヴバンブー、マダケ、ティンバーバンブー、孟宗竹）、ホオズキ属（Ｐｈｙｓａｌｉｓ）の種（ホオズキ、オオブドウホオズキ、ハスクトマト、インカベリー、ポハベリー、ゴールデンベリー、シマホオズキ）、フィソカルプス属（Ｐｈｙｓｏｃａｒｐｕｓ）の種（ナインバーク）、トウヒ属（Ｐｉｃｅａ）の種（トウヒ）、ピレア属（Ｐｉｌｅａ）の種（アサバソウ、コメバコケミズ、シルバースプリンクル、フレンドシッププラント、クリーピングチャーリー）、ピメンタ属（Ｐｉｍｅｎｔａ）の種（オールスパイス、ベーラムノキ、シリメント（ｃｉｌｉｍｅｎｔ））、ミツバグサ属（Ｐｉｍｐｉｎｅｌｌａ）の種（アニス、アニス実、ミツバグサ、チャムナムル、ユキノシタ）、ピンクネヤ属（Ｐｉｎｃｋｎｅｙａ）の種（ジョージアバーク、ピンクネヤ）、マツ属（Ｐｉｎｕｓ）の種（マツ）、コショウ属（Ｐｉｐｅｒ）の種（コショウ、パリパロバ、メキシカンペッパーリーフ、キンマつる）、ピプツルス属（Ｐｉｐｔｕｒｕｓ）の種（ママキ）、カイノキ属（Ｐｉｓｔａｃｉａ）の種（ピスタチオ、マスチック）、エンドウ属（Ｐｉｓｕｍ）の種（エンドウマメ）、ピテセロビウム属（Ｐｉｔｈｅｃｅｌｌｏｂｉｕｍ）の種（マドラスソーン）、トベラ属（Ｐｉｔｔｏｓｐｏｒｕｍ）の種（トベラ、石油ナッツ、チーズウッド）、オオバコ属（Ｐｌａｎｔａｇｏ）の種（プランテイン）、プラタヌス属（Ｐｌａｔａｎｕｓ）の種（プラタナス、スズカケノキ）、プラトニア属（Ｐｌａｔｏｎｉａ）の種（バキュリー（Ｂａｃｕｒｙ））、コノテガシワ属（Ｐｌａｔｙｃｌａｄｕｓ）の種（コノテガシワ、ビオータ（ｂｉｏｔａ））、キキョウ属（Ｐｌａｔｙｃｏｄｏｎ）の種（キキョウ）、プレクトラサンス属（Ｐｌｅｃｔｒａｎｔｈｕｓ）の種（スパーフラワー）、ヒラタケ属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）の種（ヒラタケ）、ジャボチカバ属（Ｐｌｉｎｉａ）の種（ブラジリアングレープツリー、ジャボチカバ、カンブカ）、ルリマツリ属（Ｐｌｕｍｂａｇｏ）の種（ルリマツリ（Ｐｌｕｍｂａｇｏ、ｌｅａｄｗｏｒｔ））、プルメリア属（Ｐｌｕｍｅｒｉａ）の種（プルメリア、インドソケイ）、マキ属（Ｐｏｄｏｃａｒｐｕｓ）の種（イエローウッド、マツ、イラワラプラム）、アマドコロ属（Ｐｏｌｙｇｏｎａｔｕｍ）の種（アマドコロ）、ポリポディウム属（Ｐｏｌｙｐｏｄｉｕｍ）の種（エゾデンダ、ロックキャップシダ）、ポリシャス属（Ｐｏｌｙｓｃｉａｓ）の種（ミングアラリア、オヘ（’ｏｈｅ））、ポリスティクム属（Ｐｏｌｙｓｔｉｃｈｕｍ）の種（シダ）、カラタチ属（Ｐｏｎｃｉｒｕｓ）の種（カラタチ）、ポンテデリア属（Ｐｏｎｔｅｄｅｒｉａ）の種（ラテンミズアオイ）、ポプルス属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）の種（ポプラ、アスペン、ハコヤナギ）、ポロフィルム属（Ｐｏｒｏｐｈｙｌｌｕｍ）の種（コリアンダー）、スベリヒユ属（Ｐｏｒｔｕｌａｃａ）の種（スベリヒユ）、キジムシロ属（Ｐｏｔｅｎｔｉｌｌａ）の種（キジムシロ、タチキジムシロ、ヤセイチゴ）、ポウテリア属（Ｐｏｕｔｅｒｉａ）の種（アビウ、カニステル、ルクマ、サポテ）、サクラソウ属（Ｐｒｉｍｕｌａ）の種（サクラソウ）、ツノゴマ属（Ｐｒｏｂｏｓｃｉｄｅａ）の種（ツノゴマ）、プロソピス属（Ｐｒｏｓｏｐｉｓ）の種（メスキート）、プロスタンテラ属（Ｐｒｏｓｔａｎｔｈｅｒａ）の種（ミントブッシュ）、ウツボグサ属（Ｐｒｕｎｅｌｌａ）の種（万薬草）、サクラ属（Ｐｒｕｎｕｓ）の種（アーモンド、アプリコット、サクランボ、チョークチェリー、ネクタリン、モモ、プラム、プラムコット、プルーン、スロー）、シューダナモミス属（Ｐｓｅｕｄａｎａｍｏｍｉｓ）の種（モノスプラム（Ｍｏｎｏｓ ｐｌｕｍ））、イヌカラマツ属（Ｐｓｅｕｄｏｌａｒｉｘ）の種（ゴールデンカラマツ）、トガサワラ属（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ）の種（ベイマツ）、プシジウム属（Ｐｓｉｄｉｕｍ）の種（グアバ）、ポチョウジ属（Ｐｓｙｃｈｏｔｒｉａ）の種（ワイルドコーヒー）、プテレエ属（Ｐｔｅｌｅａ）の種（ホップノキ）、ワラビ属（Ｐｔｅｒｉｄｉｕｍ）の種（シダ）、プテロカルプス属（Ｐｔｅｒｏｃａｒｐｕｓ）の種（サウンダース（Ｓａｕｎｄｅｒｓ））、サワグルミ属（Ｐｔｅｒｏｃａｒｙａ）の種（サワグルミ）、アサガラ属（Ｐｔｅｒｏｓｔｙｒａｘ）の種（オオバアサガラ）、プティコスペルマ（Ｐｔｙｃｈｏｓｐｅｒｍａ）の種（キャベツヤシ）、クズ属（Ｐｕｅｒａｒｉａ）の種（クズ）、ザクロ属（Ｐｕｎｉｃａ）の種（ザクロ）、ピクナンテムム属（Ｐｙｃｎａｎｔｈｅｍｕｍ）の種（マウンテンミント）、プリステグラ属（Ｐｙｒｏｓｔｅｇｉａ））の種（カエンカズラ）、ナシ属（Ｐｙｒｕｓ）の種（西洋ナシ）、クアラリベア属（Ｑｕａｒａｒｉｂｅａ）の種（グアヤビロ（Ｇｕａｙａｂｉｌｌｏ））、カッシア属（Ｑｕａｓｓｉａ）の種（アマルゴ）、コナラ属（Ｑｕｅｒｃｕｓ）の種（オーク）、シャボンノキ属（Ｑｕｉｌｌａｊａ）の種（セッケンボク）、ミサオノキ属（Ｒａｎｄｉａ）の種（インディゴベリー）、ダイコン属（Ｒａｐｈａｎｕｓ）の種（ダイコン、ラディッシュ）、ラフィア属（Ｒａｐｈｉａ）の種（チリヤシ）、ラベナラ億（Ｒａｖｅｎａｌａ）の種（タビビトノキ）、アカヤジオウ属（Ｒｅｈｍａｎｎｉａ）の種（ジオウ）、クロウメモドキ属（Ｒｈａｍｎｕｓ）の種（クロウメモドキ）、シュロチク属（Ｒｈａｐｉｓ）の種（シュロチク）、ダイオウ属（Ｒｈｅｕｍ）の種（ダイオウ）、オオバヒ
ルギ属（Ｒｈｉｚｏｐｈｏｒａ）の種（真のマングローブ）、ツツジ属（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ）の種（ツツジ、ラブラドルチャ、シャクナゲ）、ウルシ属（Ｒｈｕｓ）の種（ウルシ）、スグリ属（Ｒｉｂｅｓ）の種（スグリ、グーズベリー、ジョスタベリー）、リシノデンドロン属（Ｒｉｃｉｎｏｄｅｎｄｒｏｎ）の種（アフリカンナッツ）、ヒマ属（Ｒｉｃｉｎｕｓ）の種（ヒマシ油）、ハリエンジュ属（Ｒｏｂｉｎｉａ）の種（ハリエンジュ）、イヌガラシ属（Ｒｏｒｉｐｐａ）の種（カラシナ）、バラ属Ｒｏｓａ）の種（バラ）、マンネンロウ属（Ｒｏｓｅｍａｒｉｎｕｓ）の種（ローズマリー）、ダイオウヤシ属（Ｒｏｙｓｔｏｎｅａ）の種（ダイオウヤシ）、キイチゴ属（Ｒｕｂｕｓ）の種（ラズベリー、ブラックベリー、クラウドベリー、テイベリー、ヤングベリー）、ルドベッキア属（Ｒｕｄｂｅｃｋｉａ）の種（コーンフラワー、アラゲハンゴンソウ）、ルエリア属（Ｒｕｅｌｌｉａ）の種（野生ペチュニア）、スイバ属（Ｒｕｍｅｘ）の種（スイバ、ギンギシ）、ヘンルーダ属（Ｒｕｔａ）の種（ヘンルーダ）、サバル属（Ｓａｂａｌ）の種（パルメット、サバル）、オオダカ属（Ｓａｇｉｔｔａｒｉａ）の種（クワイ）、サラカヤシ属（Ｓａｌａｃｃａ）の種（サラクヤシ）、ヤナギ属（Ｓａｌｉｘ）の種（ヤナギ）、アキギリ属（Ｓａｌｖｉａ）の種（セージ、サルビア、ローズマリー、チーア）、ニワトコ属（Ｓａｍｂｕｃｕｓ）の種（ニワトコ実、ニワトコ）、サンドリクム属（Ｓａｎｄｏｒｉｃｕｍ）の種（サントール）、ワレモコウ属（Ｓａｎｇｕｉｓｏｒｂａ）の種（ワレモコウ）、ビャクダン属（Ｓａｎｔａｌｕｍ）の種（ゴウシュウビャクダン）、ジャノメギク属（Ｓａｎｖｉｔａｌｉａ）の種（ジャノメギク）、ホンダワラ属（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ）の種（ホンダワラ、エリンギウム）、サッサフラス属（Ｓａｓｓａｆｒａｓ）の種（サッサフラス）、サツレヤ属（Ｓａｔｕｒｅｊａ）の種（セイバリー）、サビア属（Ｓａｖｉａ）の種（サビア）、マツムシソウ属（Ｓｃａｂｉｏｓａ）の種（マツムシソウ）、クサトベラ属（Ｓｃａｅｖｏｌａ）の種（クサトベラ、ファンフラワー、ハーフフラワー、ナウパカ、ガルフィード（ｇｕｌｌｆｅｅｄ））、サンショウモドキ属（Ｓｃｈｉｎｕｓ）の種（コショウボク）、シンジオフィトン属（Ｓｃｈｉｎｚｉｏｐｈｙｔｏｎ）の種（モンゴンゴ）、マツブサ属（Ｓｃｈｉｓａｎｄｒａ）の種（マグノリアベリー）、シゾネペタ属（Ｓｃｈｉｚｏｎｅｐｅｔａ）の種（ケイガイ）、キバナノアザミ属（Ｓｃｏｌｙｍｕｓ）の種（キバナアザミ）、フタナミソウ属（Ｓｃｏｒｚｏｎｅｒａ）の種（スコルツォネッラ）、ライムギ属（Ｓｅｃａｌｅ）の種（ライムギ）、セキウム属（Ｓｅｃｈｉｕｍ）の種（ハヤトウリ）、マンネングサ属（Ｓｅｄｕｍ）の種（マンネングサ）、センネシオ属（Ｓｅｎｅｃｉｏ）の種（サワギク、ノボロギク）、セネガリア属（Ｓｅｎｅｇａｌｉａ）の種（アラビアガム、カテキュ）、センナ属（Ｓｅｎｎａ）の種（キャンドルブッシュ、アヴァルム（Ａｖａｒｕｍ））、セコイア属（Ｓｅｑｕｏｉａ）の種（セコイア）、セコイアデンドロン属（Ｓｅｑｕｏｉａｄｅｎｄｒｏｎ）の種（セコイアオスギ）、ノコギリヤシ属（Ｓｅｒｅｎｏａ）の種（ノコギリパルメット）、ゴマ属（Ｓｅｓａｍｕｍ）の種（ゴマ）、セスヴィウム属（Ｓｅｓｕｖｉｕｍ）の種（ハマハコベ）、セフェリディア属（Ｓｈｅｐｈｅｒｄｉａ）の種（バッファローグミ）、シダルケア属（Ｓｉｄａｌｃｅａ）の種（チェッカーマロー）、シリブム属（Ｓｉｌｙｂｕｍ）の種（オオアザミ）、シマルバ属（Ｓｉｍａｒｏｕｂａ）の種（シマルバ）、シモンジア属（Ｓｉｍｍｏｎｄｓｉａ）の種（ホホバ）、シナピス属（Ｓｉｎａｐｉｓ）の種（アブラナ）、ニワゼキショウ属（Ｓｉｓｙｒｉｎｃｈｉｕｍ）の種（ニワゼキショウ）、ムカゴニンジン属（Ｓｉｕｍ）の種（ムカゴニンジン、ウォーターパルニップ）、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ）の種（トマト、ジャガイモ、ココナ、サンベリー、ペピーノ、ナランジラ、ガーデンハックルベリー、ナス）、アキノキリンソウ属（Ｓｏｌｉｄａｇｏ）の種（アカノキリンソウ）、ソフォラ属（Ｓｏｐｈｏｒａ）の種（ハネミエンジュ）、ナナカマド属（Ｓｏｒｂｕｓ）の種（ナナカマド、サービスベリー）、ソルガストラム属（Ｓｏｒｇｈａｓｔｒｕｍ）の種（インディアングラス）、モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）の種（ソルガム）、スパルティナ属（Ｓｐａｒｔｉｎａ）の種（コードグラス）、スパティフィルム属（Ｓｐａｔｈｉｐｈｙｌｌｕｍ）の種（スパス（Ｓｐａｔｈ）、ピースリリー）、カエンボク属（Ｓｐａｔｈｏｄｅａ）の種（カエンボク）、スフェロプテリス属（Ｓｐｈａｅｒｏｐｔｅｒｉｓ）の種（木生シダ）、ホウレンソウ属（Ｓｐｉｎａｃｉａ）の種（ホウレンソウ）、シモツケ属（Ｓｐｉｒａｅａ）の種（シモツケ）、スポンジアス属（Ｓｐｏｎｄｉａｓ）の種（モンビン）、イヌゴマ属（Ｓｔａｃｈｙｓ）の種（カッコウチョロギ、ヘッジネトル）、ヅタキタルフェタ属（Ｓｔａｃｈｙｔａｒｐｈｅｔａ）の種（ナガボソウ）、ステノクラエナ属（Ｓｔｅｎｏｃｈｌａｅｎａ）の種（シダ）、ステルクリア属（Ｓｔｅｒｃｕｌｉａ）の種（トロピカルチェストナッツ）、ステビア属（Ｓｔｅｖｉａ）の種（ステビア）、ナツツバキ属（Ｓｔｅｗａｒｔｉａ）の種（ナツツバキ）、ストケシア属（Ｓｔｏｋｅｓｉａ）の種（ストケンシア）、ゴクラクチョウカ属（Ｓｔｒｅｌｉｔｚｉａ）の種（ゴクラクチョウカ）、モエギタケ属（Ｓｔｒｏｐｈａｒｉａ）の種（キノコ）、ストルチオプテリス属（Ｓｔｒｕｔｈｉｏｐｔｅｒｉｓ）の種（シカシダ（Ｄｅｅｒ ｆｅｒｎ））、スチフォノロビウム属（Ｓｔｙｐｈｎｏｌｏｂｉｕｍ）の種（ネックレスポッド）、エゴノキ属（Ｓｔｙｒａｘ）の種（スノーベル）、スリアナ属（Ｓｕｒｉａｎａ）の種（ベイシダー）、ステラ属（Ｓｕｔｅｒａ）の種（ステラ）、マホガニー属（Ｓｗｉｅｔｅｎｉａ）の種（マホガニー）、シアグルス属（Ｓｙａｇｒｕｓ）の種（オーバートップヤシ、リクリヤシ、ジョオウヤシ）、シンフォリカルポス属（Ｓｙｍｐｈｏｒｉｃａｒｐｏｓ）の種（セッコウボク）、シンセパルム属（Ｓｙｎｓｅｐａｌｕｍ）の種（ミラクルフルーツ）、ハシドイ属（Ｓｙｒｉｎｇａ）の種（ライラック）、フトモモ属（Ｓｙｚｙｇｉｕｍ）の種（ブラッシュチェリー、ウォーターベリー、チョウジ）、タベブイア属（Ｔａｂｅｂｕｉａ）の種（ヤツデグワ）、タベルナエモンタナ属（Ｔａｂｅｒｎａｅｍｏｎｔａｎａ）の種（ミルクウッド）、タゲテス属（Ｔａｇｅｔｅｓ）の種（マリーゴールド）、ハゼラン属（Ｔａｌｉｎｕｍ）の種（ハゼラン）、タマリンド属（Ｔａｍａｒｉｎｄｕｓ）の種（タマリンド）、ヨモギギク属（Ｔａｎａｃｅｔｕｍ）の種（ヨモギギク）、タンポポ属（Ｔａｒａｘａｃｕｍ）の種（タンポポ）、タスマニア属（Ｔａｓｍａｎｎｉａ）の種（ペッパーブッシュ）、ヌマスギ属（Ｔａｘｏｄｉｕｍ）の種（ヌマスギ（Ｂａｌｄｃｙｐｒｅｓｓ、Ｐｏｎｄｃｙｐｒｅｓｓ））、イチイ属（Ｔａｘｕｓ）の種（イチイ）、テコマ属（Ｔｅｃｏｍａ）の種（トランペットブッシュ）、テリマ属（Ｔｅｌｌｉｍａ）の種（フリンジカップ）、モモタマナ属（Ｔｅｒｍｉｎａｌｉａ）の種（モモタマナ、ターミナリア、カカドゥプラム）、モッコク属（Ｔｅｒｎｓｔｒｏｅｍｉａ）の種（モッコク）、テトラゴナイ属（Ｔｅｔｒａｇｏｎａｉ）の種（ホウレンソウ）、テトラジギア属（Ｔｅｔｒａｚｙｇｉａ）の種（クローバーアッシュ）、ニガクサ属（Ｔｅｕｃｒｉｕｍ）の種（ニガクサ）、カカオ属（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）の種（カカオ）、グンバイナズナ属（Ｔｈｌａｓｐｉ）の種（グンバイナズナ）、クロベ属（Ｔｈｕｊａ）の種（ニオイヒバ、クロベ、スギ）、タイム属（Ｔｈｙｍｕｓ）の種（タイム）、マダケ属（Ｔｈｙｒｓｏｓｔａｃｈｙｓ）の種（タケ）、ズダヤクシュ属（Ｔｉａｒｅｌｌａ）の種（フォームフラワー）、シコンノボタン属（Ｔｉｂｏｕｃｈｉｎａ）の種（シコンノボタン）、シナノキ属（Ｔｉｌｉａ）の種（リンデン）、トルミエア属（Ｔｏｌｍｉｅａ）の種（トルミエラ）、トゥーナ属（Ｔｏｏｎａ）の種（レッドシダー）、カヤ属（Ｔｏｒｒｅｙａ）の種（ナツメグイチイ、カヤ）、トラキカルプス属（Ｔｒａｃｈｙｃａｒｐｕｓ）の種（ヤシ）、トラキスペルムム属（Ｔｒａｃｈｙｓｐｅｒｍｕｍ）の種（アジョワン）、ムラサキツユクサ属（Ｔｒａｄｅｓｃａｎｔｉａ）の種（ムラサキツユクサ）、バラモンジン属（Ｔｒａｇｏｐｏｇｏｎ）の種（バラモンジン）、シロキクラゲ属（Ｔｒｅｍｅｌｌａ）の種（真菌）、ナンキンハゼ億（Ｔｒｉａｄｉｃａ）の種（ナンキンハゼ）、ハマビシ属（Ｔｒｉｂｕｌｕｓ）の種（ハマビシ）、キシメジ属（Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ）の種（真菌）、ツマトリソウ属（Ｔｒｉｅｎｔａｌｉｓ）の種（スターフラワー）、シャクジソウ属（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ）の種（クローバー）、フェヌグリーク属（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ）の種（フェヌグリーク）、エンレイソウ属（Ｔｒｉｌｌｉｕｍ）の種（エンレイソウ）、トリチクム属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）の種（コムギ）、トロパエオルム属（Ｔｒｏｐａｅｏｌｕｍ）の種（キンレンカ）、ツガ属（Ｔｓｕｇａ）の種（ヘムロックツリー）、セイヨウショウロ属（Ｔｕｂｅｒ）の種（フランスショウロ）、ツルビナリア属（Ｔｕｒｂｉｎａｒｉａ）の種（ディスクサンゴ、スクロールサンゴ、カップサンゴ、花瓶サンゴ、パゴダサンゴ、ラッフルリッジサンゴ）、ターネラ属（Ｔｕｒｎｅｒａ）の種（ダミアナ）、ガマ属（Ｔｙｐｈａ）の種（ガマ、フトイ、ガマ、アシ、パンク（ｐｕｎｋ）、ヒメガマ）、ウアパカ属（Ｕａｐａｃａ）の種（シュガープラム）、ウグニ属（Ｕｇｎｉ）の種（ウグニ）、ニレ属（Ｕｌｍｕｓ）の種（ニレ）、カギカズラ属（Ｕｎｃａｒｉａ）の種（キャッツクロ―、ガンビール）、ウングナディア属（Ｕｎｇｎａｄｉａ）の種（メキシカンバックアイ）、ユニオラ属（Ｕｎｉｏｌａ）の種（ウミムギ）、イラクサ属（Ｕｒｔｉｃａ）の種（イラクサ）、スノキ属（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ）の種（ブルーベリー、クランベリー、ハックルベリー、コケモモ）、ノヂシャ属（Ｖａｌｅｒｉａｎｅｌｌａ）の種（ノヂシャ）、バンクーベリア属（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒｉａ）の種（インサイドアウトフラワー）、ヴァングエリア属（Ｖａｎｇｕｅｒｉａ」）の種（スパニッシュタマリンド）、バニラ属（Ｖａｎｉｌｌａ）の種（バニラ）、ヴァスコンセレア属（Ｖａｓｃｏｎｃｅｌｌｅａ）の種（マウンテンパパイヤ、ババコ）、モウズイカ属（Ｖｅｒｂａｓｃｕｍ）の種（モウズイカ）、バーベナ属（Ｖｅｒｂｅｎａ）の種（バーベナ）、ベルノニア属（Ｖｅｒｎｏｎｉａ）の種（アイアンウィード）、クワガタソウ属（Ｖｅｒｏｎｉｃａ）の種（クワガタソウ）、ガマズミ属（Ｖｉｂｕｒｎｕｍ）の種（クランベリー、ガマズミ）、ソラマメ属（Ｖｉｃｉａ）の種（カラスノエンドウ）、ササゲ属（Ｖｉｇｎａ）の種（マメ）、スミレ属（Ｖｉｏｌａ）の種（パンジー、スミレ）、ハマゴウ属（Ｖｉｔｅｘ）の種（プラム、テイソウボク）、ブドウ属（Ｖｉｔｉｓ）の種（ブドウ）、フクロタケ属（Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ）の種（キノコ）、ワシントンヤシ属（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎｉａ）の種（ヤシ）、ウェデリア属（Ｗｅｄｅｌｉａ）の種（アメリカハグルマ）、フジ属（Ｗｉｓｔｅｒｉａ）の種（フジ）、ウィサニア属（Ｗｉｔｈａｎｉａ）の種（アシュワガンダ）、キサントセラス属（Ｘａｎｔｈｏｃｅｒａｓ）の種（イエローホーン）、キサントソマ属（Ｘａｎｔｈｏｓｏｍａ）の種（アメリカサトイモ）、キシメニア属（Ｘｉｍｅｎｉａ）の種（タローウッド（Ｔａｌｌｏｗｗｏｏｄ））、クシロピア属（Ｘｙｌｏｐｉａ）の種（グレインオブセリム）、ユッカ属（Ｙｕｃｃａ）の種（ユッカ）、ザミア属（Ｚａｍｉａ）の種（ソテツ）、サンショウ属（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ）の種（コショウ）、トウモロコシ属（Ｚｅａ）の種（トウモロコシ、ブタモロコシ）、ケヤキ属（Ｚｅｌｋｏｖａ）の種（ケヤキ）、ゼフィランテス属（Ｚｅｐｈｙｒａｎ
ｔｈｅｓ）の種（ユリ）、ショウガ属（Ｚｉｎｇｉｂｅｒ）の種（ショウガ）、ヒャクニチソウ属（Ｚｉｎｎｉａ）の種（ヒャクニチソウ）、マコモ属（Ｚｉｚａｎｉａ）の種（マコモ）、および／またはナツメ属（Ｚｉｚｉｐｈｕｓ）の種（ナツメ（Ｊｕｊｕｂｅ、Ｚｉｚａｆｕｎ））由来の任意の植物を挙げることができる。
一部の実施形態では、本発明で有用な植物としては、それだけには限定されないが、表２もしくは表４、または上記段落中に提供したリスト中に列挙したものが挙げられる。一部の実施形態では、本発明で有用な植物の例としては、柑橘類植物（たとえば、グレープフルーツ、オレンジ、レモン、ライムなど）、トマト植物、トウモロコシ植物、ペカン植物、およびタバコ植物が挙げられる。
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以下、本発明を、以下の実施例を参照して記載する。これらの実施例は、本発明の特許請求の範囲の範囲を制限することを意図せず、むしろ特定の実施形態の例示的なものであることを意図することを理解されたい。当業者が思いつく、例示した方法の任意の変形が本発明の範囲内にあることを意図する。
共生生物形成接種材料および共生生物の接種／作製
共生生物形成接種材料および共生生物は、図１に例示するように、ｉ）同時接種、ｉｉ）単一接種、およびｉｉｉ）直接ＤＮＡ接種を含む、いくつかの異なる方法を使用して作製することができる。
ｉ．同時接種方法では２つのアグロバクテリウム属の種の株を用いる。１つの株は、目的ポリヌクレオチド（ＰＯＩ）を発現させるために使用するバイナリーベクター（たとえばエー・ツメファシエンス株ＥＨＡ１０５株）を含有する安全化したアグロバクテリウム属の種であり、第２の野生型（ＷＴ）アグロバクテリウム属の株は、植物ホルモン遺伝子（ＰＨＧ）を植物細胞に転移させるために使用する。ＰＯＩおよびＰＨ遺伝子（ＰＨＧ）をどちらも有する、この様式で同時接種する植物細胞は、意図する使用に応じて共生生物形成接種材料または共生生物と呼ぶことができる。一部の事例では、細胞は、宿主植物上に共生生物を形成するための共生生物形成接種材料として使用することができる、または、植物（もしくはその一部）上に位置する細胞をこの様式で細菌細胞と共に接種する場合、これらは共生生物を植物上に直接形成することができる。
バイナリーベクターを保有する安全化したアグロバクテリウム属の株、本実施例ではエー・ツメファシエンスＥＨＡ１０５株、およびＷＴ株を、当技術分野において一般的な手順を使用して成長させ、その後、それぞれの株を遠心分離して細菌ペレットを回収し、その後、接種緩衝液（１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＭＥＳ［ｐＨ５．６］、１００μＭのアセトシリンゴン）中に再懸濁させて、それぞれＯＤ６００で１および０．１の最終濃度とした。その後、これらを室温で１～３時間保ち、その後、一緒に混合した後に植物組織に接種し、続いて共生生物形成接種材料または共生生物が形成された。
ｉｉ．単一接種方法では、単一のアグロバクテリウム属の種のみを使用して植物細胞または植物（たとえば宿主植物）に接種する。本実施例では、ＰＯＩおよびＰＨＧをどちらも含むバイナリーベクター（たとえばｐＳＹＭプラスミド、図２を参照）を保有する安全化したアグロバクテリウム・ツメファシエンスＥＨＡ１０５株を使用して、植物細胞に接種した。ｐＳＹＭプラスミドは、およそ７．５Ｋｂの植物成長調節物質（インドール－３－アセトアミド加水分解酵素、トリプトファン２－モノオキシゲナーゼ、イソペンテニルトランスフェラーゼ、インドール－３－乳酸合成酵素）および構成的または誘導性プロモーターと作動可能に連結したＰＯＩのカセットを含有する。また、ｐＳＹＭプラスミドを保有するアグロバクテリウム属の種の細胞の選択を可能にするために、ｐＳＹＭプラスミドは選択マーカー遺伝子（カナマイシン）も含有していた。植物組織にｐＳＹＭを含有するアグロバクテリウム属の種の懸濁液を接種して、共生生物形成接種材料または共生生物を形成する。
ｉｉｉ．直接ＤＮＡ接種では、微粒子銃送達系を使用して、ＤＮＡを植物細胞または組織内に送達することができる。これは、アグロバクテリウム属の種を遺伝子（複数可）ベクターとして使用せずに、宿主植物細胞内に直接推進させる、ＰＯＩおよびＰＨＧ遺伝子でコーティングした金属粒子を使用して行う。その後、細胞はＰＯＩおよびＰＨＧ遺伝子をゲノム内に取り込み、その後、植物組織は共生生物形成接種材料または共生生物のどちらかを形成することができる。たとえば、電気穿孔、微量注入、リポフェクション（リポソーム媒介性形質転換）、超音波処理、シリコン繊維媒介性形質転換、化学刺激したＤＮＡの取り込み（たとえばポリフェクション、たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介性形質転換）および／またはレーザーマイクロビーム（ＵＶ）誘導性形質転換を含む、直接ＤＮＡ送達の多数の他の方法が知られており、微粒子銃の代わりに使用して同じように成功することができる。
ＤＮＡが宿主植物細胞ゲノム内に送達された後、ＰＨＧの発現は、植物組織を誘導および刺激して、ＰＯＩおよびＰＨＧの様々な遺伝子挿入物および発現レベルを有する細胞のコレクションを有する混合培養共生生物（図３を参照）を成長させる。混合培養共生生物は自律的に成長することができ、師部および木質部の一方または両方と接続することによる維管束新生を介して宿主植物と接続し、ここでＰＯＩ産物が宿主植物に輸送され得る。共生生物によって生成されたＰＯＩ産物は、宿主植物全体にわたる分散のために、共生生物由来のアポプラストおよび／もしくはシンプラストを介してならびに／または師部および／もしくは木質部を通じて移行され得る。
混合培養共生生物を続いて切除し、望ましい形質および発現レベルを有する細胞を選択することができる、ホルモンを含まない培養物中で成長させることができ、そうすることで、均一な共生生物形成接種材料（複数可）の単離が可能となる。純粋培養共生生物形成接種材料（複数可）の選択としては、それだけには限定されないが、抗生物質選択の使用（たとえば形質転換細胞（すなわちＰＯＩおよびＰＨＧを有する細胞）のみの成長を許可する抗生物質耐性マーカーＰＯＩの使用）、培養物の段階希釈／分裂を挙げることができ、または、単離して純粋培養に成長させることができるプロトプラストおよび単一プロトプラスト細胞に変換し得る。共生生物形成接種材料（複数可）は、ＰＯＩおよびＰＨＧの発現に加えて、望ましい特質を発現するものについて選択することができる。
さらに、アグロバクテリウム属を共生生物形成プロセスにおいて使用する場合、抗生物質を使用するプロセスは、アグロバクテリウム属の細胞を混合培養共生生物形成接種材料から排除するためにも使用することができる。
最終手順は、植物内およびまたは全体にわたる分散のために、選択された共生生物形成接種材料（複数可）を宿主植物上に移植することを含み、ここでこれは付着し、ＰＯＩ発現産物またはＰＯＩ発現産物の生成物（たとえば、ＰＯＩ発現産物は、共生生物中の生成物の生合成に関与している酵素であることができ、共生生物を出て宿主植物内に輸送されるのはこの生成物である）を提供することができる。共生生物形成接種材料（複数可）が植物宿主に付着した後、これは共生生物（複数可）と呼ばれるものを形成する。共生生物の一例を図４に示し、パネルＡおよびＢは、同時接種方法を使用して接種後６０日後に形成された柑橘類共生生物を示す。パネルＣおよびＤは、単一株接種方法を使用して柑橘類上に形成された共生生物を示す（たとえば、同時接種および単一株接種のグラフ表示には図１を参照）。
本実施例では、ｐＳＹＭを保有するアグロバクテリウム属の種を使用して植物宿主に接種し、共生生物の形成を誘導した。これを行うために、アグロバクテリウム属の種を、適切な抗生物質（５０μｇのカナマイシン）を添加した１０ｍＬのルリアベルターニブロス中、２８℃で終夜成長させた。両方の株を遠心分離して細菌細胞のペレットを回収し、その後、これを接種緩衝液（既に記載したもの）に再懸濁させた。様々な技法を使用して宿主植物に接種し得る。たとえば、茎に堅い表面構造を有する柑橘類などの木本植物は、木質茎組織を突き刺して植物内に貫通するための方法を必要とする。ここでは、アグロバクテリウム属の種の接種溶液に漬けた柑橘類用の歯付ピンセット（図５パネルＡを参照）を使用して柑橘類樹皮組織を突き刺して、溶液を植物に送達し得る。柔軟な茎を有するトマトなどの草本植物（図５パネルＢおよび図５パネルＣ）は、本実施例では、入れ墨針（図５パネルＢ）またはシリンジ針（図５パネルＣ）を使用し、単に針をアグロバクテリウム属の種の溶液に漬けて組織を突き刺すことによって、アグロバクテリウム属の種の溶液を植物組織内に注入または通して接種した。
共生生物組織は、様々な範囲の宿主植物の種類上で成長させることができる。図６に、ペカン（図６パネルＡ）、トマト（図６パネルＢ）、柑橘類（図６パネルＣ）、およびベンサミアナタバコ（図６パネルＤ）上での共生生物の形成および成長を例示する。これらの共生生物は、上述の方法のうちの１つを使用した接種によって形成された。
共生生物形成接種材料のＩｎ ｖｉｔｒｏ培養物
共生生物形成接種材料（たとえば図７）を作製し、さらなる宿主植物に接種するために使用することができる。本実施例は、アグロバクテリウム属の種または共生生物を作製するために使用する他の細菌、および寒天または液体培地を汚染し得る任意の微生物不純物の除去を含む、共生生物組織から微生物汚染を清掃するためのプロセスを記載する（たとえば図８）。このプロセスは、共生生物形成接種材料のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物の作製および維持を可能にする。
共生生物が宿主植物で発生した後、これを使用して共生生物形成接種材料を作製することができる（図７および図８）。この目的のために、共生生物組織を宿主植物から取り出し、流水道水で約３０分間ですすいだ。その後、すすいだ組織をエタノールで洗浄した。続いて、組織を１０％の漂白剤溶液で洗浄し、次いで滅菌水の溶液で洗浄した。滅菌ステップは、細菌または真菌の外部汚染を回避するために、無菌技法を使用して、無菌的条件下で、層流フードにおいて行う。
滅菌ステップの後、組織を無菌紙の上に置いて乾かし（たとえば無菌濾紙）、その後、トマトおよび柑橘類の両方についてムラシゲおよびスクーグ（ＭＳ）に基づく固体寒天培地上に置いた（図８パネルＡおよびＢ）、またはトマトおよび柑橘類の両方について液体寒天培地中に入れた（図８パネルＣおよびＤ）。
アグロバクテリウム属の種の細胞を除去し、共生生物形成接種材料の細胞のみを提供するために、抗生物質を含む成長培地を細胞培養において使用した。培地上での複数の組織培養分裂および継代の後、図７に示すようにＰＯＩの均質発現が提供される。図７は、選択培地上のｍＣｈｅｒｒｙを発現する共生生物形成接種材料を示し、ＵＶ光およびｍＣｈｅｒｒｙフィルター下で示されるように蛍光マーカーの高い発現を有する。
共生生物形成接種材料の宿主植物上への移植
共生生物組織（図６）を様々な作物から単離し、選択的寒天培地上で成長させ、実施例２に記載のように細菌を除去し、培養培地上に共生生物形成接種材料を生成した。ｍＣｈｅｒｒｙ（図７）または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で形質転換させた共生生物形成接種材料組織を使用して、ＵＶランプを用いてｍＣｈｅｒｒｙ／ＧＦＰフィルターを使用して蛍光強度をスクリーニングすることによって、および蛍光細胞のみを新しい選択寒天培地に複数回移すことによって、組織選択を最適化した（実施例２に記載）。トマトおよび柑橘類由来の共生生物形成接種材料組織は、選択的固体寒天培地条件下（図８パネルＡ（トマト）、図８パネルＢ（柑橘類））ならびに選択的液体寒天培地条件下（図８パネルＣ（トマト）および（図８パネルＤ（柑橘類））で成長させた。
移植の準備ができた共生生物形成接種材料組織を培養培地から取り出し、その後、植物ホルモンを含有する移植溶液（オーキシンおよびサイトカイニンを含む無菌蒸留水）中で洗浄した。移植溶液は共生生物形成接種材料の移植有効性および宿主植物相互作用を補助するために使用する。洗浄後、移植溶液中の共生生物形成接種材料、柑橘類由来の組織を、柑橘類植物の茎に、茎の表皮層を事前に取り除いた位置で施用した。共生生物を形成するための共生生物形成接種材料の移植／接木の接着を確実にするために、シリコンテープを共生生物形成接種材料／共生生物組織および茎の周りにしっかりと貼り付けた（図９パネルＡ）。十分に理解されるように、共生生物形成接種材料／共生生物組織を宿主植物上の位置に保つための他の方法をシリコンテープの代わりに使用し得る。約６週間後、シリコンテープを共生生物から取り外し（図９パネルＢ）、組織を切除して接着、維管束新生（図９パネルＣ）、ＧＦＰ発現（図９パネルＦ）を評価し、これらのそれぞれが観察された。
トマトでは、トマトから調製した共生生物形成接種材料組織を最初に植物ホルモン（オーキシンおよびサイトカイニン）を含有する移植溶液で洗浄した。トマト由来の共生生物形成接種材料組織を、トマト植物の茎に、茎の表皮層を取り除いて施用した。柑橘類の例と同様、共生生物組織の茎への接着を確実にするために、湿度および共生生物形成接種材料と茎との間の接触の維持を援助するためにプラスチックラップ（たとえばＰａｒａｆｉｌｍ（登録商標）Ｍ）を貼り付けた（図９パネルＤ）。６週間後、共生生物組織はトマト宿主植物と統合しており、大きさが増加しており（図９パネルＥ）、移植の成功が実証された。
共生生物の多用途性
共生生物細胞は、１つまたは２つ以上のステップ（たとえば１回または２回以上の接種（たとえば１つまたは複数のアグロバクテリウム属の株）、ＤＮＡを送達するために知られている任意のシステムを使用した１つまたは複数の導入で細胞に提供することができる、１つまたは２つ以上のベクター／発現カセットを使用して導入した１つまたは２つ以上のＰＯＩを発現することができる。そのような方法は図１に例示されている。様々な共生生物の種類を１つの宿主植物上に移植すること（すなわち、１種類のＰＯＩを有する１つの共生生物および１つまたは複数の異なるＰＯＩを含む１つまたは複数の追加の共生生物）に加えて、複数の目的ポリヌクレオチドを同じベクター／発現カセット／Ｔ－ＤＮＡ領域上に有するｐＳＹＭプラスミドを作製し、複数のＰＯＩを、送達する単一のｐＳＹＭ上に有効に「スタッキング」して共生生物を形成することも可能である（実施例１～３に既に記載されている）。そのようなＰＯＩは、それぞれが特異的プロモーターによって調節されることができる（図１０）、または同じプロモーターもしくは異なるプロモーターであり得る別個のプロモーターによって調節され得る。また、それぞれ１つのみのＰＯＩを有するユニークなｐＳＹＭをそれぞれが保有する、異なるアグロバクテリウム属の種（または他の生存可能な細菌系）を使用することも可能である（図２）。複数のＰＯＩを有するｐＳＹＭは「遺伝子スタッキング」の一例であり（図１０）、やはり用いることができる。異なる共生生物形成接種材料（同じまたは異なるＰＯＩを有するもの）を同じ宿主植物上に使用する事例は、１つの植物あたり複数のＰＯＩの利益を植物に与えるための「共生生物スタッキング」の一例である。
本実施例では、本発明者らは、一方がＧＦＰをコードしているユニークなｐＳＹＭプラスミドを有し、他方がｍＣｈｅｒｒｙをコードしているｐＳＹＭプラスミドを有する、別個のアグロバクテリウム属の共生生物形成接種材料の同時接種を用いたアグロバクテリウム属媒介性形質転換を使用した。ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｒｙの蓄積の検出は蛍光顕微鏡観察検査によって行った（図１１）。共生生物の生細胞を使用してタンパク質の局在化および動態学を追跡し、共生生物の切片を顕微鏡下で分析して、ＧＦＰを発現する細胞、ｍＣｈｅｒｒｙを発現する細胞、ならびにＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙの両方の発現を有する細胞を検出した。本実施例により、異なる細胞中でユニークなＰＯＩを発現する（図１１パネルＢ～Ｅ）または同じ細胞中で複数のＰＯＩを発現する（図１１パネルＧ～Ｈ）共生生物細胞の多用途性、ならびに同じ宿主植物上に支持されるその能力が実証された。
ＰＯＩ産物の生成および輸出
共生生物は、大量の所望のＰＯＩ産物を生成および蓄積することができる（たとえばタンパク質、図１２）。予備評価は、３０％までの共生生物組織がＰＯＩ産物であり得ることを示唆している（図１３）。アグロバクテリウム属の種の単一接種（たとえば単一株）を使用して、ＧＦＰを発現する共生生物をトマトおよび柑橘類の宿主植物上に作製した（図１２）。ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙをどちらも組み合わせることで、ウエスタンブロットを使用して蛍光強度およびタンパク質蓄積を測定することによって遺伝子発現の可視化および定量が可能となった（図１３）。全タンパク質を共生生物から抽出するために、１ｇの共生生物材料を使用し、液体窒素を用いた凍結および組織の微粉砕によって粉末に変えた。その後、これをタンパク質抽出緩衝液（たとえば、１５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ－６３０、および１％（体積／体積）のプロテアーゼ阻害剤混合物１錠剤１００ｍＬ）に懸濁させた。抽出には、緩衝液を２ｍＬ／１ｇの組織粉末で加えた。試料を４℃で２０分間の遠心分離によって清澄にした。上清を収集し、いくつかの希釈を行ってインプット用の１０－７希釈を作製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上の還元条件下で分析した。その後、試料をニトロセルロース膜上にブロットし、製造者のプロトコル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標））に従って抗体と共にインキュベートした。化学発光基質を使用して膜をインキュベートし、イメージングおよびデータを獲得した（図１３）。
共生生物は、導水管および同化産物輸送篩要素からなる、宿主植物との洗練された維管束網接続の形成を誘導することができる（図１４パネルＡおよびＢ）。共生生物細胞は機能する原形質連絡によって密に接続されている。師部中に見つかる細胞は一次細胞壁のみを有する一方で、木質部中に見つかる細胞は一次および二次細胞壁をどちらも有するため、トルイジンブルーを使用して師部および木質部の細胞を識別した（図１４パネルＣ）。共生生物細胞中の高レベルのＰＯＩ発現と高い量の維管束新生組織とが相まって、宿主植物維管束組織内へのＰＯＩの移動を促進する。蛍光タンパク質ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙを使用して、蛍光顕微鏡を使用してトマト植物におけるタンパク質の蓄積および共生生物細胞から植物維管束系への移動を検出およびモニタリングした。共生生物の１～２ｃｍ上の宿主植物組織を縦断面（図１４パネルＤ）および横断面（図１５）で収集して、ＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙの移動を確認した（蛍光顕微鏡観察による）。ウエスタンブロット技法も使用して共生生物中および植物宿主の茎中におけるタンパク質の蓄積を検出および分析し、顕微鏡観察分析からの結果が確認された（図１６）。
共生生物の生成物が共生生物を出て宿主植物に輸送されるのと同じように、溶質は、宿主植物のそれと接続されており同化産物の輸送のための師部ならびに水および鉱物のための木質部からなる維管束組織を介して共生生物に入る。生成物は共生生物細胞から宿主植物へと移動することができるが、共生生物から宿主植物細胞への遺伝物質の移動はない。本発明者らは、ＰＯＩに対する特異的プライマーを使用したＰＣＲ検出を使用することによって、ＰＯＩのＤＮＡが共生生物に制限されていることを確認し、共生生物および近隣の茎部分を検査した。共生生物および宿主植物組織のＰＣＲ分析により、共生生物細胞のみがＰＯＩで遺伝学的に形質転換されていることが示され（図１７）、これは宿主植物がＰＯＩで形質転換されないことを示している。これは、宿主植物に新しい特徴を提供するが、遺伝的改変を与えない。
宿主植物に対するＰＯＩの効果
共生生物組織は非常に多用途であり、多数の様々な機能または活性に適応するまたは適応させることができる。たとえば、ＦＬＯＷＥＲＩＮＧ ＬＯＣＵＳ Ｔ（ＦＴ３）タンパク質は葉中で合成され、接木接着部を通って移動して、植物において開花を制御し、その過剰発現はしばしば植物の矮化に関連づけられている。本発明者らは、本発明者らは、ＰＨＧおよびＦＴ３の産物を植物に送達するためにｐＳＹＭを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスを使用してトマト植物上に共生生物を作製し（図１８パネルＡ）、また、対照として野生型アグロバクテリウム・ツメファシエンス（すなわちｐＳＹＭを欠く）を使用してトマト上に共生生物を作製した（図１８パネルＢ）。
ＦＴ３を発現する共生生物を有するトマト植物はふさふさしており、対照と比較して多数の枝および葉が茂った構造を有していた（図１８パネルＡおよびＢを比較）。ＦＴ３を発現する共生生物は枝の数が増加しており（図１８パネルＡ）、対照トマト植物に示される、１枚の葉のみがそれぞれの節に存在し、植物の中心茎が他の側茎よりも優性であるトマトの葉序が改変される（図１８パネルＢ）。
共生生物は、植物の表現型を改変および変調するためにも使用して、防御機構を改善するために特定の病原体に対する耐性を増強させ、植物の適応度を高めることができる。図１９は、特定の病原体に対する植物の耐性を増強させる一例を示す。ここでは、ＰＨＧおよびオンコシン（抗微生物ペプチド）を有するｐＳＹＭを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスを使用して、共生生物を柑橘類上に作製し、それによって、ＰＨＧおよびオンコシンを含む共生生物を作製した（図１９パネルＡ）。対照として、「オンコシンなし」の対照として野生型エー・ツメファシエンスを用いて共生生物を柑橘類上に作製した（図１９Ｂ）。オンコシンを生成する共生生物は、オンコシンを転移させてカンジダタス・リベリバクター・アシアティカス（ＣＬａｓ）を処理する／死滅させるように設計されている。ＣＬａｓは、世界中で柑橘類の壊滅的な収量損失を引きおこす黄龍病（別名カンキツグリーニング病）の病因である。現在までに、この病害に確立された治癒は存在しない。本発明者らは、高度に維管束新生した共生生物の構造を活用して、この抗菌ペプチドを生成して宿主植物およびＣＬａｓ細菌に対してに送達した。ペプチドの輸出を改善させるために、これをシグナル／標的配列ペプチド（ＳＳまたは＋）と融合させた。シグナル配列は、たとえば小胞体に標的化されているタンパク質中に見つかり、最終的には細胞外に分泌される運命にある。「オンコシン」および「オンコシン＋」を発現する共生生物はどちらも、ｑＰＣＲによって決定してＣＬａｓ力価を経時的に低下させ（図２０）、対照（図１９パネルＤおよびＦ）と比較した痣様斑点の低下を含めて、典型的なＨＬＢ植物症状の低下によって示されるように植物の健康も改善された（図１９パネルＣおよびＥ）。
示すように、共生生物は、感染症を直接妨害するまたは宿主植物中に存在する病原体を死滅させるための生成物を発現および移動させるために使用することができる。オンコシンおよびオンコシン＋を発現する共生生物は、柑橘類の健康を改善させ、ＣＬａｓ細菌の力価を低下させるとして既に同定されている（記載どおり、図１９および図２０）。このことをさらに調査するために、本発明者らは、様々なＰＯＩ（ＧＦＰ＋、ＴＭＯＦ、ＴＭＯＦ＋、オンコシン、およびオンコシン＋）を発現する様々な共生生物を有するＣＬａｓ陽性柑橘類宿主植物を研究し、これらの様々なＰＯＩのＣＬａｓ力価および有効性をＣＬａｓ力価効果のｑＰＣＲ分析によってモニタリングした（図２１）。「ＧＦＰ＋」（シグナル配列を有するＧＦＰ）を発現する共生生物を対照として使用した。結果により、ＴＭＯＦ、ＴＭＯＦ＋、オンコシン、およびオンコシン＋はどちらも、その力価を低下させることによってＣＬａｓに対して抗細菌効果を有することが示された（図２１）。
示したように、本発明の共生生物の多用途性は、宿主植物特徴を改善させ、植物有害生物を制御する能力を提供する。別の例として、共生生物を使用して、たとえば植物過敏応答および細胞死を始動させることによって除草剤として使用することができる、有害な植物効果を生じさせることができる。一例として、ベンサミアナタバコに、植物ヌクレオチド結合ロイシンリッチ反復（ＮＬＲ）免疫受容体によって認識される、ＣＬａｓ由来のエフェクタータンパク質のＰＯＩを有する共生生物形成接種材料を注入し、細胞死プロセスの活性化をもたらして宿主植物を死滅させる活性酸素種（ＲＯＳ）の過剰生成が引きおこされた（図２２）。
前述のものは本発明の例示的なものであり、それを限定するものとして解釈されるべきでない。上述の実施形態のさらなる変形が当業者によって理解されるであろう。したがって、上述の実施形態は制限的ではなく、むしろ例示的なものとしてみなされるべきである。したがって、以下の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲から逸脱せずに、これらの実施形態に対する変形を当業者によって行うことができ、特許請求の範囲の等価物がそれに含まれることが理解されよう。

Claims (120)

  1. 植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと目的ポリヌクレオチドとを含む共生生物形成接種材料であって、植物ホルモン生合成酵素が少なくとも１つのサイトカイニン生合成酵素および／またはオーキシン生合成酵素である、共生生物形成接種材料。
  2. 植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと目的ポリヌクレオチドとが細胞中に含まれ、任意選択で細胞が植物細胞または細菌細胞である、請求項１に記載の共生生物形成接種材料。
  3. 植物ホルモン生合成酵素が細菌種および／または植物種に由来する、請求項１または請求項２に記載の共生生物形成接種材料。
  4. 植物ホルモン生合成酵素が、インドール－３－アセトアミド加水分解酵素（ｉａａＨ）（Ｅ．Ｃ．番号：ＥＣ３．５．１．４）、アミダーゼ１（ＥＣ３．５．１．４）、トリプトファン２－モノオキシゲナーゼ（ＩａａＭ）（ＥＣ１．１３．１２．３）、インドール－３－乳酸合成酵素（ＥＣ１．１．１．１１０）、Ｌ－トリプトファン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ１（ＥＣ２．６．１．９９）、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ関連タンパク質１（ＥＣ２．６．１．２７）、インドール－３－アセトアルデヒドオキシダーゼ（ＥＣ１．２．３．７）、トリプトファン脱炭酸酵素１／トリプトファン脱炭酸酵素２（ＥＣ４．１．１．１０５）、イソペンテニルトランスフェラーゼ（Ｉｐｔ）、および／またはＴｚｓ（ＥＣ２．５．１．２７）である、請求項１から３のいずれか一項に記載の共生生物形成接種材料。
  5. 植物ホルモン生合成酵素が、インドール－３－アセトアミド加水分解酵素（ｉａａＨ）、トリプトファン２－モノオキシゲナーゼ（ＩａａＭ）、および／またはイソペンテニルトランスフェラーゼ（Ｉｐｔ）である、請求項１から４のいずれか一項に記載の共生生物形成接種材料。
  6. 植物ホルモン生合成酵素がインドール－３－乳酸合成酵素である、請求項１から５のいずれか一項に記載の共生生物形成接種材料。
  7. プラストポリペプチド（たとえば可塑性ポリペプチド）をコードしているポリヌクレオチドをさらに含み、任意選択でプラストポリペプチドが６ｂ、ｒｏｌＢ、ｒｏｌＣ、および／またはｏｒｆ１３である、請求項１から６のいずれか一項に記載の共生生物形成接種材料。
  8. 植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと目的ポリヌクレオチドとが単一の核酸構築体中または２つ以上の核酸構築体（たとえば１つもしくは複数の発現カセット）中に含まれる、請求項１から７のいずれか一項に記載の共生生物形成接種材料。
  9. プラストポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが１つの核酸構築体中に含まれ、任意選択で、プラストポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび／または目的ポリヌクレオチドと同じまたはそれとは別個の核酸構築体（たとえば発現カセット）中にある、請求項７または請求項８に記載の共生生物形成接種材料。
  10. １つまたは複数の核酸構築体が１つまたは複数のベクター中に含まれる、請求項８または請求項９のいずれか一項に記載の共生生物形成接種材料。
  11. １つまたは複数のベクターが、プラスミド、Ｔ－ＤＮＡ、細菌人工染色体、ウイルスベクター、またはバイナリー－細菌人工染色体である、請求項１０に記載の共生生物形成接種材料。
  12. 目的ポリヌクレオチドが、生物活性分子の生合成に関与している生体分子、生物活性分子、および／またはポリペプチドをコードしている、請求項１から１１のいずれか一項に記載の共生生物形成接種材料。
  13. 目的ポリヌクレオチドの発現が、非生物的ストレス耐性（たとえば、高塩耐容、高熱耐容、重金属耐容、冷耐容、渇水耐容、過剰水耐容、ＵＶ照射耐容）の増加、病原体（たとえば、ウイルス、真菌、細菌）もしくは有害生物（たとえば、昆虫、線虫）に対する耐性もしくは耐容の増加、または除草剤に対する耐容の増加を与える、請求項１２に記載の共生生物形成接種材料。
  14. 生物活性分子が、生物刺激剤、生物殺真菌剤、生物除草剤、殺昆虫タンパク質／ペプチド（たとえば生物殺虫剤、たとえば、ジャブレトックス（ペプチドＪＢＴＸ、ナタマメ（タチナタマメ（Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ）の種子）に由来する生物殺虫剤）、クモ毒液由来の殺昆虫ペプチド（たとえばハドロニケ・ヴェルスタ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）由来）、トリプシン変調卵形成阻害因子（ＴＭＯＦ）、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）毒素（δ内毒素、たとえば、Ｃｒｙ毒素、Ｃｙｔ毒素）、植物性殺昆虫タンパク質（Ｖｉｐ））、栄養素（たとえば窒素、たとえば、レグヘモグロビン、ニトロゲナーゼ）、植物成長調節物質（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、エチレン、成長阻害剤／遅延剤）、植物脂質、植物脂肪酸、植物油、ＲＮＡ（たとえば、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）、植物抗体、スタイレットシース阻害タンパク質（たとえば、フィシン、ブロメライン）、リボザイム、バクテリオシン、抗微生物ペプチド（たとえばオンコシン）、アプタマー、ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化剤様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ならびに／または操作したメガヌクレアーゼである、請求項１２または請求項１３に記載の共生生物形成接種材料。
  15. 目的ポリヌクレオチドが標的化配列と作動可能に連結したポリペプチドをコードしており、任意選択で、標的化配列がタンパク質を膜、細胞内位置、または細胞外位置に位置付ける、請求項１から１３のいずれか一項に記載の共生生物形成接種材料。
  16. 標的化配列が、膜標的化配列、小胞体標的化配列、ミトコンドリア標的化配列、葉緑体標的化配列、核標的化配列、液胞標的化配列、ペルオキシソーム標的化配列、リソソーム標的化配列、または植物ウイルス移動タンパク質である、請求項１４に記載の共生生物形成接種材料。
  17. 植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチド（たとえば、ｉａａＨをコードしているポリヌクレオチド、ＩａａＭをコードしているポリヌクレオチド、および／もしくはイソペンテニルトランスフェラーゼ（Ｉｐｔ）をコードしているポリヌクレオチド、および／もしくはインドール－３－乳酸合成酵素をコードしているポリヌクレオチド）ならびに／またはプラストポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが核標的化（核移行）配列と作動可能に連結している、請求項１から１５のいずれか一項に記載の共生生物形成接種材料。
  18. 植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび目的ポリヌクレオチドが、それぞれ任意の組合せで単一のプロモーターとまたは少なくとも２つの別個のプロモーターと作動可能に連結している、請求項１から１６のいずれか一項に記載の共生生物形成接種材料。
  19. 植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドがｉａａＨ、ＩａａＭ、およびＩｐｔをコードしている場合、ｉａａＨ、ＩａａＭ、およびＩｐｔをコードしているポリヌクレオチド（複数可）が単一のプロモーターと作動可能に連結しており、目的ポリヌクレオチドが単一のプロモーターまたは別個のプロモーターと作動可能に連結している、請求項１から１７のいずれか一項に記載の共生生物形成接種材料。
  20. プラストポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドがプロモーターと作動可能に連結しており、任意選択で、プラストポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび／または目的ポリヌクレオチドと作動可能に連結しているものと同じプロモーターまたは別個のプロモーターと作動可能に連結している、請求項７から１８のいずれか一項に記載の共生生物形成接種材料。
  21. 単一のプロモーター、別個のプロモーター、および／または２つ以上の別個のプロモーターが、それぞれ任意の組合せで構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターである、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の共生生物形成接種材料。
  22. 目的ポリヌクレオチドが共生生物形成接種材料中で発現される、請求項１から２０のいずれか一項に記載の共生生物形成接種材料。
  23. 細菌細胞が、ＩＶ型分泌系（Ｔ４ＳＳ、たとえば、Ｔ４ＡＳＳ（たとえばＶｉｒＢ／Ｄ４システム）、Ｔ４ＢＳＳ）またはＩＩＩ型分泌系（Ｔ３ＳＳ）を含む、請求項２から２１のいずれか一項に記載の共生生物形成接種材料。
  24. 細菌細胞が、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の種（たとえば、エー・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）（たとえば次亜種１）、エー・リゾゲネス（Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）（たとえば次亜種２）、エー・ビティス（Ａ．ｖｉｔｉｓ）（たとえば次亜種３）、エー・ファブルム（Ａ．ｆａｂｒｕｍ）（たとえばＣ５８株）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の種、メソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の種、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の種、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の種、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の種（たとえばピー・サバスタノイｐｖ．サバスタノイ（Ｐ．ｓａｖａｓｔａｎｏｉ ｐｖ．Ｓａｖａｓｔａｎｏｉ））、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の種、オクロバクトラム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）の種、アゾバクター属（Ａｚｏｂａｃｔｅｒ）の種、クロステリウム属（Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ）の種、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）の種、ロドスピリルム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）の種、またはキサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）の種の細菌属に由来する、請求項２から２２のいずれか一項に記載の共生生物形成接種材料。
  25. 細胞中に含まれる共生生物形成接種材料が、細胞培養物、植物カルス、カルス培養物、および／または懸濁培養の形態の２個以上の細胞を含む、請求項２から２１のいずれか一項に記載の共生生物形成接種材料。
  26. 植物細胞が、大型藻類、被子植物、裸子植物、または羊歯植物に由来する、請求項２から２１または２４のいずれか一項に記載の共生生物形成接種材料。
  27. 植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと目的ポリヌクレオチドとを含みそれを発現する植物細胞を含む共生生物であって、植物ホルモン生合成酵素が、少なくとも１つのサイトカイニン生合成酵素および／または少なくとも１つのオーキシン生合成酵素であり、共生生物の植物細胞が自律的に分裂する、共生生物。
  28. 植物細胞が複数の植物細胞を含み、植物またはその一部上に移植された際に未分化の多細胞構造を形成する、請求項２６に記載の共生生物。
  29. 植物ホルモン生合成酵素が細菌種および／または植物種に由来する、請求項２６または請求項２７に記載の共生生物。
  30. 植物ホルモン生合成酵素が、インドール－３－アセトアミド加水分解酵素（ｉａａＨ）（Ｅ．Ｃ．番号：ＥＣ３．５．１．４）、アミダーゼ１（ＥＣ３．５．１．４）、トリプトファン２－モノオキシゲナーゼ（ＩａａＭ）（ＥＣ１．１３．１２．３）、インドール－３－乳酸合成酵素（ＥＣ１．１．１．１１０）、Ｌ－トリプトファン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ１（ＥＣ２．６．１．９９）、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ関連タンパク質１（ＥＣ２．６．１．２７）、インドール－３－アセトアルデヒドオキシダーゼ（ＥＣ１．２．３．７）、トリプトファン脱炭酸酵素１／トリプトファン脱炭酸酵素２（ＥＣ４．１．１．１０５）、イソペンテニルトランスフェラーゼ（Ｉｐｔ）、および／またはＴｚｓ（ＥＣ２．５．１．２７）である、請求項２６から２８のいずれか一項に記載の共生生物。
  31. 植物ホルモン生合成酵素が、インドール－３－アセトアミド加水分解酵素（ｉａａＨ）、トリプトファン２－モノオキシゲナーゼ（ＩａａＭ）、および／またはイソペンテニルトランスフェラーゼ（Ｉｐｔ）を含み、任意選択で、植物ホルモン生合成酵素がインドール－３－乳酸合成酵素を含む、請求項２６から２９のいずれか一項に記載の共生生物。
  32. プラストポリペプチド（たとえば可塑性ポリペプチド）をコードしているポリヌクレオチドをさらに含み、任意選択でプラストポリペプチドが６ｂ、ｒｏｌＢ、ｒｏｌＣ、および／またはｏｒｆ１３である、請求項２６から３０のいずれか一項に記載の共生生物。
  33. 植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび目的ポリヌクレオチドが、単一の核酸構築体中または２つ以上の核酸構築体（たとえば１つもしくは複数の発現カセット）中に含まれる、請求項２６から３１のいずれか一項に記載の共生生物。
  34. プラストポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが１つの核酸構築体中に含まれ、任意選択で、プラストポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび／または目的ポリヌクレオチドと同じまたは別個の核酸構築体中にある、請求項３１または請求項３２に記載の共生生物。
  35. 目的ポリヌクレオチドが、生物活性分子の生合成に関与している生体分子、生物活性分子、および／またはポリペプチドをコードしている、請求項２６から３３のいずれか一項に記載の共生生物。
  36. 目的ポリヌクレオチドの発現が、非生物的ストレス耐性（たとえば、高塩耐容、高熱耐容、重金属耐容、冷耐容、渇水耐容、過剰水耐容、ＵＶ照射耐容）の増加、病原体（たとえば、ウイルス、真菌、細菌）もしくは有害生物（たとえば、昆虫、線虫）に対する耐性もしくは耐容の増加、または除草剤に対する耐容の増加を与える、請求項３４に記載の共生生物。
  37. 生物活性分子が、医薬品、生物刺激剤、生物殺真菌剤、生物除草剤、殺昆虫タンパク質／ペプチド（たとえば生物殺虫剤、たとえば、ジャブレトックス（ペプチドＪＢＴＸ）、クモ毒液由来の殺昆虫ペプチド（たとえばハドロニケ・ヴェルスタ由来）、トリプシン変調卵形成阻害因子（ＴＭＯＦ）、バチルス・チューリンゲンシス毒素（δ内毒素、たとえば、Ｃｒｙ毒素、Ｃｙｔ毒素）、植物性殺昆虫タンパク質（Ｖｉｐ））、栄養素（たとえば窒素、たとえば、レグヘモグロビン、ニトロゲナーゼ）、植物成長調節物質（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、エチレン、成長阻害剤／遅延剤）、ＲＮＡ（たとえば、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）、植物抗体、スタイレットシース阻害タンパク質（たとえば、フィシン、ブロメライン）、リボザイム、バクテリオシン、植物脂質、植物脂肪酸、植物油、抗微生物ペプチド（たとえばオンコシン）、アプタマー、ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化剤様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ならびに／または操作したメガヌクレアーゼである、請求項３４または請求項３５に記載の共生生物。
  38. 目的ポリヌクレオチドが標的化配列と作動可能に連結したポリペプチドをコードしており、任意選択で、標的化配列がポリペプチドを膜、細胞内位置、または細胞外位置に位置付ける、請求項２６から３６のいずれか一項に記載の共生生物。
  39. 標的化配列が、膜標的化配列、小胞体標的化配列、ミトコンドリア標的化配列、葉緑体標的化配列、または植物ウイルス移動タンパク質である、請求項３７に記載の共生生物。
  40. 植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチド（たとえば、ｉａａＨをコードしているポリヌクレオチド、ＩａａＭをコードしているポリヌクレオチド、イソペンテニルトランスフェラーゼ（Ｉｐｔ）をコードしているポリヌクレオチド、および／もしくはインドール－３－乳酸合成酵素をコードしているポリヌクレオチド）ならびに／またはプラストポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが核標的化配列と作動可能に連結している、請求項２６から３８のいずれか一項に記載の共生生物。
  41. 植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび目的ポリヌクレオチドが、任意の組合せで単一のプロモーターとまたは少なくとも２つの別個のプロモーターと作動可能に連結している、請求項２６から３９のいずれか一項に記載の共生生物。
  42. 植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドがｉａａＨ、ＩａａＭ、およびＩｐｔをコードしている場合、ｉａａＨ、ＩａａＭ、およびＩｐｔをコードしているポリヌクレオチド（複数可）が単一のプロモーターと作動可能に連結しており、目的ポリヌクレオチドが同じプロモーターまたは別個のプロモーターと作動可能に連結している、請求項２６から４０のいずれか一項に記載の共生生物。
  43. プラストポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドがプロモーターと作動可能に連結しており、任意選択で、プラストポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび／または目的ポリヌクレオチドと作動可能に連結しているものと同じプロモーターまたは別個のプロモーターと作動可能に連結している、請求項２６から４１のいずれか一項に記載の共生生物。
  44. 植物細胞が、大型藻類、被子植物、裸子植物、または羊歯植物に由来する、請求項２６から４２のいずれか一項に記載の共生生物。
  45. 少なくとも１つの共生生物が宿主植物上の少なくとも１つの部位上に位置する、請求項２６から４２のいずれか一項に記載の少なくとも１つの共生生物を含む宿主植物。
  46. 宿主植物の少なくとも１つの部位が、外植片、胚、葉、苗条、茎、枝、穀粒、穂、穂軸、穀皮、柄、表皮組織、頂端分裂組織、花の組織（たとえば、花粉、雌蕊、胚珠、葯、雄蕊、花冠、萼片、花弁、花床、花糸、花柱、柱頭など）、果実、種子、鞘、さく果、子葉、胚軸、葉柄、塊茎、球茎、根、根端、共生生物、節こぶ、植物栄養体、共生生物の住処、花外蜜腺、小結節、植物新生物、または虫こぶ上にある、請求項４３に記載の宿主植物。
  47. 目的ポリヌクレオチドが共生生物中で発現され、目的ポリヌクレオチドの発現産物および／または目的ポリヌクレオチドの発現産物を使用して作られた生成物が宿主植物内に輸送される、請求項４３または請求項４４のいずれか一項に記載の宿主植物。
  48. 宿主植物が、任意の年齢または大きさの野生型植物（たとえば、実生、幼若植物、または成熟植物）に由来する、請求項４３から４５のいずれか一項に記載の宿主植物。
  49. 宿主植物が、大型藻類、被子植物、裸子植物、または羊歯植物に由来する、請求項４３から４６のいずれか一項に記載の宿主植物。
  50. 細胞内に、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと目的ポリヌクレオチドとを導入する、または、目的ポリヌクレオチドを含むトランスジェニック細胞内に植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドを導入するステップを含む、共生生物形成接種材料を生成する方法であって、植物ホルモン生合成酵素が少なくとも１つのサイトカイニン生合成酵素および／またはオーキシン生合成酵素であり、それによって共生生物形成接種材料を生成し、任意選択で、細胞が植物細胞または細菌細胞である、方法。
  51. 細胞を培養して、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと目的ポリヌクレオチドとを含む細胞の集団を生成するステップをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
  52. （ａ）（ｉ）植物（もしくはその一部（たとえば外植片））上の少なくとも１つの部位内／上に、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと目的ポリヌクレオチド配列とを導入する、またはそれを含む植物細胞を移植する、またはそれを含む細菌細胞を植物（もしくはその一部）上の少なくとも１つの部位上に接種する、あるいは
    （ｉｉ）植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドを導入する、またはそれを含む植物細胞を移植する、またはそれを含む細菌細胞を植物（もしくはその一部）上の少なくとも１つの部位内／上に接種し、（ｉｉ）の植物（またはその一部）が目的ポリヌクレオチド配列を含むステップであって、
    植物ホルモン生合成酵素が少なくとも１つのサイトカイニン生合成酵素および／またはオーキシン生合成酵素であり、それによって、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと目的ポリヌクレオチド配列とを含む植物（またはその一部）上の共生生物を生成するステップと、
    （ｂ）１つまたは複数の細胞を植物上の共生生物から選択して、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと目的ポリヌクレオチド配列とを含む１つまたは複数の細胞を提供し、それによって共生生物形成接種材料を生成するステップと
    を含む、共生生物形成接種材料を生成する方法。
  53. （ｃ）（ｂ）からの１つまたは複数の細胞を培養して、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと目的ポリヌクレオチド配列とを含む植物細胞集団（たとえばカルス培養物および／または懸濁培養）を生成するステップをさらに含む、請求項５０に記載の方法。
  54. 植物ホルモン生合成酵素が細菌種および／または植物種に由来する、請求項５０または請求項５１に記載の方法。
  55. 植物ホルモン生合成酵素が、インドール－３－アセトアミド加水分解酵素（ｉａａＨ）（Ｅ．Ｃ．番号：ＥＣ３．５．１．４）、アミダーゼ１（ＥＣ３．５．１．４）、トリプトファン２－モノオキシゲナーゼ（ＩａａＭ）（ＥＣ１．１３．１２．３）、インドール－３－乳酸合成酵素（ＥＣ１．１．１．１１０）、Ｌ－トリプトファン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ１（ＥＣ２．６．１．９９）、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ関連タンパク質１（ＥＣ２．６．１．２７）、インドール－３－アセトアルデヒドオキシダーゼ（ＥＣ１．２．３．７）、トリプトファン脱炭酸酵素１／トリプトファン脱炭酸酵素２（ＥＣ４．１．１．１０５）、イソペンテニルトランスフェラーゼ（Ｉｐｔ）、および／またはＴｚｓ（ＥＣ２．５．１．２７）である、請求項５０から５２のいずれか一項に記載の方法。
  56. 植物ホルモン生合成酵素が、インドール－３－アセトアミド加水分解酵素（ｉａａＨ）、トリプトファン２－モノオキシゲナーゼ（ＩａａＭ）、および／もしくはイソペンテニルトランスフェラーゼ（Ｉｐｔ）を含む、ならびに／または任意選択でインドール－３－乳酸合成酵素を含む、請求項５０から５３のいずれか一項に記載の方法。
  57. 植物上の少なくとも１つの部位が植物の地上部分および／または植物の地下部分にある、請求項５０から５４のいずれか一項に記載の方法。
  58. 細胞内または植物上の少なくとも１つの部位に、プラストポリペプチド（たとえば可塑性ポリペプチド）をコードしているポリヌクレオチドを導入するステップであって、任意選択でプラストポリペプチドが６ｂ、ｒｏｌＢ、ｒｏｌＣ、および／またはｏｒｆ１３であるステップをさらに含む、請求項５０から５５のいずれか一項に記載の方法。
  59. 植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび目的ポリヌクレオチドを、単一の核酸構築体中、または２つ以上の核酸構築体（たとえば１つもしくは複数の発現カセット）中で別個に導入する、請求項５０から５６のいずれか一項に記載の方法。
  60. プラストポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが１つの核酸構築体中に含まれ、任意選択で、プラストポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび／または目的ポリヌクレオチドと同じまたは別個の核酸構築体中で導入する、請求項５６または請求項５７に記載の方法。
  61. ２つ以上の核酸構築体が１つまたは複数のベクター中に含まれ、任意選択で、ベクターが、プラスミド、Ｔ－ＤＮＡ、細菌人工染色体、ウイルスベクター、またはバイナリー－細菌人工染色体である、請求項５７または請求項５８に記載の方法。
  62. 目的ポリヌクレオチドが、生物活性分子の生合成に関与している生体分子、生物活性分子、および／またはポリペプチドをコードしている、請求項５０から５９のいずれか一項に記載の方法。
  63. 目的ポリヌクレオチドの発現が、非生物的ストレス耐性（たとえば、高塩耐容、高熱耐容、重金属耐容、冷耐容、渇水耐容、過剰水耐容、ＵＶ照射耐容）の増加、病原体（たとえば、ウイルス、真菌、細菌）もしくは有害生物（たとえば、昆虫、線虫）に対する耐性もしくは耐容の増加、および／または除草剤に対する耐容の増加を与える、請求項６０に記載の方法。
  64. 生物活性分子が、生物刺激剤、生物殺真菌剤、生物除草剤、殺昆虫タンパク質／ペプチド（たとえば生物殺虫剤、たとえば、ジャブレトックス（ペプチドＪＢＴＸ、ナタマメ（タチナタマメの種子）に由来する生物殺虫剤）、クモ毒液由来の殺昆虫ペプチド（たとえばハドロニケ・ヴェルスタ由来）、トリプシン変調卵形成阻害因子（ＴＭＯＦ）、バチルス・チューリンゲンシス毒素（δ内毒素、たとえば、Ｃｒｙ毒素、Ｃｙｔ毒素）、植物性殺昆虫タンパク質（Ｖｉｐ））、栄養素（たとえば窒素、たとえば、レグヘモグロビン、ニトロゲナーゼ）、植物成長調節物質（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、エチレン、成長阻害剤／遅延剤）、ＲＮＡ（たとえば、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）、植物抗体、スタイレットシース阻害タンパク質（たとえば、フィシン、ブロメライン）、リボザイム、バクテリオシン、抗微生物ペプチド（たとえばオンコシン）、植物脂質、植物脂肪酸、植物油、アプタマー、ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化剤様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ならびに／または操作したメガヌクレアーゼである、請求項６０または請求項６１に記載の方法。
  65. 目的ポリヌクレオチドが標的化配列と作動可能に連結したポリペプチドをコードしており、任意選択で、標的化配列がタンパク質を膜、細胞内位置、または細胞外位置に位置付け、任意選択で、標的化配列が、膜標的化配列、小胞体標的化配列、ミトコンドリア標的化配列、葉緑体標的化配列、または植物ウイルス移動タンパク質である、請求項５０から６２のいずれか一項に記載の方法。
  66. 植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび／またはプラストポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが核標的化配列と作動可能に連結している、請求項５０から６３のいずれか一項に記載の方法。
  67. 植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび目的ポリヌクレオチドが、それぞれ任意の組合せで単一のプロモーターとまたは少なくとも２つの別個のプロモーターと作動可能に連結している、請求項５０から６４のいずれか一項に記載の方法。
  68. 植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドがｉａａＨ、ＩａａＭ、およびＩｐｔをコードしている場合、ｉａａＨ、ＩａａＭ、およびＩｐｔをコードしているポリヌクレオチド（複数可）が単一のプロモーターと作動可能に連結しており、目的ポリヌクレオチドが単一のプロモーターまたは別個のプロモーターと作動可能に連結している、請求項５０から６５のいずれか一項に記載の方法。
  69. 植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドが、ｉａａＨをコードしているポリヌクレオチド、ＩａａＭをコードしているポリヌクレオチド、およびＩｐｔをコードしているポリヌクレオチドを含む場合、ｉａａＨをコードしているポリヌクレオチド、ＩａａＭをコードしているポリヌクレオチド、およびＩｐｔをコードしているポリヌクレオチドが、それぞれ少なくとも２つの別個のプロモーターと作動可能に連結しており、目的ポリヌクレオチドが、前記少なくとも２つの別個のプロモーターとは別個のプロモーターと作動可能に連結している、または前記少なくとも２つの別個のプロモーターのうちの少なくとも１つと連結している、請求項５０から６６のいずれか一項に記載の方法。
  70. プラストポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドがプロモーターと作動可能に連結しており、任意選択で、プラストポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドおよび／または目的ポリヌクレオチドと作動可能に連結しているものと同じプロモーターまたは別個のプロモーターと作動可能に連結している、請求項５６から６７のいずれか一項に記載の方法。
  71. プロモーター、単一のプロモーター、および／または２つ以上の別個のプロモーターが構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターである、請求項６５から６８のいずれか一項に記載の方法。
  72. 細菌細胞が、ＩＶ型分泌系（Ｔ４ＳＳ、たとえば、Ｔ４ＡＳＳ（たとえばＶｉｒＢ／Ｄ４システム）、Ｔ４ＢＳＳ）またはＩＩＩ型分泌系（Ｔ３ＳＳ）を含む、請求項４８から５４または５６から６９のいずれか一項に記載の方法。
  73. 細菌細胞が、アグロバクテリウム属の種（たとえば、エー・ツメファシエンス（たとえば次亜種１）、エー・リゾゲネス（たとえば次亜種２）、エー・ビティス（たとえば次亜種３）、エー・ファブルム（たとえばＣ５８株）、リゾビウム属の種、メソリゾビウム属の種、シノリゾビウム属の種、ブラディリゾビウム属の種、シュードモナス属の種（たとえばピー・サバスタノイｐｖ．サバスタノイ）、フィロバクテリウム属の種、オクロバクトラム属の種、アゾバクター属の種、クロステリウム属の種、クレブシエラ属の種、ロドスピリルム属の種、またはキサントモナス属の種の細菌属に由来する、請求項４８から５４または５６から６９のいずれか一項に記載の方法。
  74. 植物、植物部分、または植物細胞が、任意の年齢または大きさの野生型植物またはトランスジェニック植物（たとえば、実生、幼若植物、または成熟植物）に由来する、請求項５０から６９のいずれか一項に記載の方法。
  75. 植物、植物部分、または植物細胞が、大型藻類、被子植物、裸子植物、または羊歯植物に由来する、請求項５０から６９または７２のいずれか一項に記載の方法。
  76. 植物細胞が、植物細胞培養物（カルス培養物もしくは懸濁培養）、プロトプラスト、実生、外植片、胚、葉、苗条、茎、枝、穀粒、穂、穂軸、穀皮、柄、表皮組織、頂端分裂組織、花の組織（たとえば、花粉、雌蕊、胚珠、葯、雄蕊、花冠、萼片、花弁、花床、花糸、花柱、柱頭など）、果実、種子、鞘、さく果、子葉、胚軸、葉柄、塊茎、球茎、根、根端、共生生物、節こぶ、植物栄養体、共生生物の住処、花外蜜腺、小結節、虫こぶ、または植物新生物に由来する、請求項５０から６９、７２、または７３のいずれか一項に記載の方法。
  77. 植物上の少なくとも１つの部位が、外植片、胚、葉、苗条、茎、枝、穀粒、穂、穂軸、穀皮、柄、表皮組織、頂端分裂組織、花の組織（たとえば、花粉、雌蕊、胚珠、葯、雄蕊、花冠、萼片、花弁、花床、花糸、花柱、柱頭など）、果実、種子、鞘、さく果、子葉、胚軸、葉柄、塊茎、球茎、根、根端、共生生物、節こぶ、植物栄養体、共生生物の住処、花外蜜腺、小結節、植物新生物、または虫こぶである、請求項５０から６９または７２から７４のいずれか一項に記載の方法。
  78. 導入が、細菌媒介性形質転換、アグロ浸潤、ウイルス媒介性形質転換、粒子照射（微粒子銃）、電気穿孔、微量注入、リポフェクション（リポソーム媒介性形質転換）、超音波処理、シリコン繊維媒介性形質転換、化学刺激したＤＮＡの取り込み（たとえばポリフェクション、たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介性形質転換）および／またはレーザーマイクロビーム（ＵＶ）誘導性形質転換を介するものである、請求項５０から７５のいずれか一項に記載の方法。
  79. （ｉ）植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと目的ポリヌクレオチド配列または（ｉｉ）植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドが少なくとも１個の植物細胞中に含まれ、少なくとも１個の植物細胞が、植物上の少なくとも１つの部位上に移植される、請求項５０から６９または７２から７６のいずれか一項に記載の方法。
  80. 少なくとも１個の植物細胞を植物上の少なくとも１つの部位に移植する前またはその間に、植物を少なくとも１つの部位で傷つける、請求項７７に記載の方法。
  81. 導入が細菌媒介性形質転換を介するものであり、植物細胞もしくは植物（またはその一部、たとえば外植片）を少なくとも１つの細菌種または株の細胞と共に同時培養することを含み、細菌細胞が、植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチド、目的ポリヌクレオチド、および／または少なくとも１つのプラストポリペプチドコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチドのうちの１つまたは複数を含む、請求項７６に記載の方法。
  82. 少なくとも１つの細菌株の細胞との同時培養の前またはその間に、植物（またはその一部、たとえば外植片）を少なくとも１つの部位で傷つける、請求項７９に記載の方法。
  83. 少なくとも１つの細菌種または株の細胞が少なくとも２つの細菌種または株の細胞を含み、少なくとも１つの植物ホルモン酵素をコードしているポリヌクレオチドが、少なくとも１つの目的ポリヌクレオチドを含む細菌株とは別個の細菌株中に含まれる（たとえば二重細菌形質転換）、請求項７９または請求項８０に記載の方法。
  84. 少なくとも１つの細菌株もしくは種および／または少なくとも２つの細菌株もしくは種が、ＩＶ型分泌系（Ｔ４ＳＳ、たとえば、Ｔ４ＡＳＳ（たとえばＶｉｒＢ／Ｄ４システム）、Ｔ４ＢＳＳ）またはＩＩＩ型分泌系（Ｔ３ＳＳ）を含む細菌細胞である、請求項７９から８１のいずれか一項に記載の方法。
  85. 細菌細胞が、アグロバクテリウム属の種の細胞（たとえば、エー・ツメファシエンス（たとえば次亜種１）、エー・リゾゲネス（たとえば次亜種２）、エー・ビティス（たとえば次亜種３）、エー・ファブルム（たとえばＣ５８株）、リゾビウム属の種の細胞、メソリゾビウム属の種の細胞、シノリゾビウム属の種の細胞、ブラディリゾビウム属の種の細胞、シュードモナス属の種の細胞（たとえばピー・サバスタノイｐｖ．サバスタノイ）、フィロバクテリウム属の種の細胞、オクロバクトラム属の種細胞、アゾバクター属の種の細胞、クロステリウム属の種の細胞、クレブシエラ属の種の細胞、ロドスピリルム属の種の細胞、またはキサントモナス属の種の細胞である、請求項８２に記載の方法。
  86. 共生生物形成接種材料の少なくとも１つの細胞中の少なくとも１つの核酸を編集して、少なくとも１つの編集された核酸を生成するステップであって、任意選択で編集を遺伝子編集ヌクレアーゼを用いて実施するステップをさらに含む、請求項４８から８３のいずれか一項に記載の方法。
  87. 少なくとも１つの編集された核酸が、発現が改変されている（たとえばそのように改変されていない同じ核酸と比較して発現が増加または減少している）、請求項８４に記載の方法。
  88. 請求項４８から８５のいずれか一項に記載の方法によって生成される共生生物形成接種材料。
  89. 接種材料が、細菌細胞、細菌培養物、植物細胞、または植物細胞培養物（たとえばカルスもしくは細胞懸濁液）を含む、請求項８６に記載の共生生物形成接種材料。
  90. 細胞またはプロトプラストが植物ホルモン生合成酵素をコードしているポリヌクレオチドと目的ポリヌクレオチドとを含む、請求項８６または請求項８７に記載の共生生物形成接種材料に由来する細胞またはプロトプラスト。
  91. 請求項８６もしくは請求項８７に記載の共生生物形成接種材料、または請求項８８に記載の細胞、または請求項２６から４２のいずれか一項に記載の共生生物を宿主植物上の少なくとも１つの部位に移植するステップと、
    共生生物形成接種材料または共生生物を宿主植物の少なくとも１つの部位で培養して、共生生物を宿主植物上の少なくとも１つの部位で形成させるステップであって、目的ポリヌクレオチドが宿主植物上の共生生物中で発現され、目的ポリヌクレオチドの発現産物および／または目的ポリヌクレオチドの発現産物を使用して作られた生成物が宿主植物内に輸送され、それによって改変された特徴を有する宿主植物が生成されるステップと
    を含む、植物ゲノムを改変させずに宿主植物特徴を改変させる方法。
  92. 目的ポリヌクレオチドが、生物活性分子の生合成に関与している生体分子、生物活性分子、および／またはポリペプチドをコードしている、請求項８９に記載の方法。
  93. 目的ポリヌクレオチドの発現が、非生物的ストレス耐性（たとえば、高塩耐容、高熱耐容、重金属耐容、冷耐容、渇水耐容、過剰水耐容、ＵＶ照射耐容）の増加、病原体（たとえば、ウイルス、真菌、細菌）もしくは有害生物（たとえば、昆虫、線虫）に対する耐性もしくは耐容の増加、または除草剤に対する耐容の増加を与える、請求項９０に記載の方法。
  94. 生物活性分子が、医薬品（たとえば、治療用タンパク質、治療用ポリヌクレオチド、治療用化学物質、たとえば、ワクチン、抗体、組換え抗体、抗体断片、融合タンパク質、抗体融合タンパク質、ヒト血清アルブミン、胃リパーゼ、インスリン、グルコセレブロシダーゼ、成長因子、サイトカイン、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ））、Ａｐｏ－Ａ１、アルファ－ガラクトシダーゼ（ＰＲＸ－１０２）、アルファ－ガラクトシダーゼ（ＰＲＸ－１０２）、アセチルコリンエステラーゼ（ＰＲＸ－１０５）、抗腫瘍壊死因子（Ｐｒ－抗ＴＮＦ）、ＩｇＧ、インターフェロン－アルファ、プラスミン、ラクトフェリン、リゾチーム、およびコラーゲン）、生物刺激剤、生物殺真菌剤、生物除草剤、殺昆虫タンパク質／ペプチド（たとえば生物殺虫剤、たとえば、ジャブレトックス（ペプチドＪＢＴＸ、ナタマメ（タチナタマメの種子）に由来する生物殺虫剤、クモ毒液由来の殺昆虫ペプチド（たとえばハドロニケ・ヴェルスタ由来）、トリプシン変調卵形成阻害因子（ＴＭＯＦ）、バチルス・チューリンゲンシス毒素（δ内毒素、たとえば、Ｃｒｙ毒素、Ｃｙｔ毒素）、植物性殺昆虫タンパク質（Ｖｉｐ）、栄養素（たとえば窒素、たとえば、レグヘモグロビン、ニトロゲナーゼ）、植物成長調節物質（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、エチレン、成長阻害剤／遅延剤）、ＲＮＡ（たとえば、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）、植物抗体、植物脂質、植物脂肪酸、植物油、スタイレットシース阻害タンパク質（たとえば、フィシン、ブロメライン）、リボザイム、バクテリオシン、抗微生物ペプチド（たとえばオンコシン）、アプタマー、ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化剤様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ならびに／または操作したメガヌクレアーゼである、請求項９０または請求項９１に記載の方法。
  95. 宿主植物上の少なくとも１つの部位が宿主植物の地上部分上および／または宿主植物の地下部分上にある、請求項８９から９２に記載の方法。
  96. 共生生物または共生生物形成接種材料を、宿主植物に少なくとも２回、および／または宿主植物上の少なくとも２つの部位に移植する、請求項８９から９１のいずれか一項に記載の方法。
  97. 発現産物が転写産物もしくは翻訳産物、またはその改変体である、請求項８９から９４のいずれか一項に記載の方法。
  98. ポリヌクレオチドの発現産物を使用して作製された生成物が、化学物質、タンパク質（ポリペプチド／ペプチド）、またはポリヌクレオチドである、請求項８９から９５のいずれか一項に記載の方法。
  99. 改変された宿主植物特徴が病害を引き起こす生物（たとえば、真菌、細菌、ウイルス）に対する耐容／耐性の増加である、請求項８９から９６のいずれか一項に記載の方法。
  100. 改変された宿主植物特徴が植物防御遺伝子の増加した（誘導された）発現である、請求項８９から９７のいずれか一項に記載の方法。
  101. 改変された宿主植物特徴が増加した昆虫耐容／耐性である、請求項８９から９８のいずれか一項に記載の方法。
  102. 改変された宿主植物特徴が増加した線虫耐容／耐性である、請求項８９から９９のいずれか一項に記載の方法。
  103. 改変された宿主植物特徴が改変された形態学である、請求項８９から１００のいずれか一項に記載の方法。
  104. 改変された形態学が、節間部の短縮、側方分枝の増加、および／または開花の増加を含む、請求項１０１に記載の方法。
  105. 改変された宿主植物特徴が、生物活性分子の生合成に関与している生体分子、生物活性分子、および／またはポリペプチドの存在である、請求項８９から１０２のいずれか一項に記載の方法。
  106. 生物活性分子が、医薬品（たとえば、治療用タンパク質、治療用ポリヌクレオチド、治療用化学物質）、生物刺激剤、生物殺真菌剤、生物除草剤、殺昆虫タンパク質／ペプチド、トリプシン変調卵形成阻害因子（ＴＭＯＦ）、バチルス・チューリンゲンシス毒素、植物性殺昆虫タンパク質（Ｖｉｐ）、栄養素、植物成長調節物質、ＲＮＡ、植物抗体、スタイレットシース阻害タンパク質、リボザイム、バクテリオシン、抗微生物ペプチド、植物脂質、植物脂肪酸、植物油、アプタマー、ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化剤様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ならびに／または操作したメガヌクレアーゼである、請求項１０３に記載の方法。
  107. 生物活性分子が、ジャブレトックス（ペプチドＪＢＴＸ）、δ内毒素、Ｃｒｙ毒素、Ｃｙｔ毒素、レグヘモグロビン、ニトロゲナーゼ、フィシン、ブロメライン、バクテリオシン、ナイシン、および／またはオンコシン）である、請求項１０３または１０４に記載の方法。
  108. 改変された宿主植物特徴が、宿主植物中における生物活性分子（たとえば殺生物分子）の存在および植物病原体に対する耐性／耐容の増加である、請求項８９から１０５のいずれか一項に記載の方法。
  109. 生物活性分子がバクテリオシンまたは抗微生物ペプチドであり、植物病原体が細菌である、請求項１０６に記載の方法。
  110. バクテリオシンまたは抗微生物ペプチドがオンコシンおよび／またはナイシンである、請求項１０７に記載の方法。
  111. 改変された宿主植物特徴が、殺昆虫タンパク質（たとえば生物殺虫剤）の存在および増加した昆虫耐容または耐性である、請求項８９から１０５のいずれか一項に記載の方法。
  112. 殺昆虫タンパク質が、ジャブレトックス、トリプシン変調卵形成阻害因子（ＴＭＯＦ）、バチルス・チューリンゲンシス毒素（たとえばδ内毒素、たとえばＣｒｙ毒素、Ｃｙｔ毒素）、スタイレットシース阻害タンパク質（たとえば、フィシン、ブロメライン）、および／または植物性殺昆虫タンパク質（Ｖｉｐ）である、請求項１０９に記載の方法。
  113. 改変された宿主植物特徴が、植物成長調節物質（たとえば、オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、エチレン、成長阻害剤／遅延剤）の生成の存在または増加もしくは減少および改変された成長である、請求項８９から１０４のいずれか一項に記載の方法。
  114. 改変された宿主植物特徴が、ＲＮＡの生成の存在または増加およびポリヌクレオチド、ペプチド、またはポリペプチドの生成の増加／減少である、請求項８９から１０４のいずれか一項に記載の方法。
  115. ＲＮＡが、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡ、任意選択でｄｖｓｎｆ７、ｃｃｏｍｔ、ｄＣＳ、ａｓｎ１、ｐｈＬ、ＲＩ、ＰＧＡＳ、および／またはｐｐｏ５である、請求項１１２に記載の方法。
  116. 請求項８９から１１３のいずれか一項に記載の方法によって生成された、改変された特徴を有する宿主植物。
  117. 請求項２６から４２のいずれか一項に記載の共生生物を提供するステップであって、目的ポリヌクレオチドが生体分子および／もしくは生物活性分子をコードしており、共生生物中で生成された生体分子および／もしくは生物活性分子を収集するステップ、ならびに／または
    請求項４３から４７のいずれか一項に記載の宿主植物を提供するステップであって、目的ポリヌクレオチドが生体分子および／もしくは生物活性分子をコードしており、共生生物および宿主植物中で生成された生体分子および／もしくは生物活性分子を収集するステップ
    を含む、生体分子および／または生物活性分子を生成する方法。
  118. 請求項１から２５、８６、もしくは８７のいずれか一項に記載の共生生物形成接種材料、または請求項８８に記載の細胞、または請求項２６から４２のいずれか一項に記載の共生生物を宿主植物上の少なくとも１つの部位上に移植するステップと、
    共生生物形成接種材料または共生生物を宿主植物の少なくとも１つの部位で培養して、共生生物を宿主植物上の少なくとも１つの部位で形成させるステップであって、目的ポリヌクレオチドが共生生物中で発現され、目的ポリヌクレオチドの発現産物および／または目的ポリヌクレオチドの発現産物を使用して作られた生成物が宿主植物内に輸送され、それによって目的化合物が植物に送達されるステップと
    を含む、目的化合物を宿主植物に送達する方法。
  119. 請求項１から２５、８６、もしくは８７のいずれか一項に記載の共生生物形成接種材料、または請求項８８に記載の細胞、または請求項２６から４２のいずれか一項に記載の共生生物を宿主植物上の少なくとも１つの部位上に移植するステップと、
    共生生物形成接種材料または共生生物を宿主植物の少なくとも１つの部位で培養して、共生生物を宿主植物上の少なくとも１つの部位で形成させるステップであって、目的ポリヌクレオチドが共生生物中で発現され、目的ポリヌクレオチドの発現産物および／または目的ポリヌクレオチドの発現産物を使用して作られた生成物が宿主植物内に輸送され、それによって、改変された遺伝子型を有さない、改変された特徴を含む植物が生成されるステップと
    を含む、植物の遺伝子型を改変させずに改変された特徴を含む植物を生成する方法。
  120. 請求項１１７に記載の方法によって生成された植物。
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