KR20220062516A - 식물 게놈을 변형시키지 않으면서 식물 특징을 변형시키기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

식물 게놈을 변형시키지 않으면서 식물 특징을 변형시키기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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로버트 쥐. 쉐터스
에디 더블유. 스토버
랜들 피. 니에즈
미쉘 엘. 헥
마르코 피티노
마갈리 페라리 그란도
조셉 크리스텔
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더 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카 애즈 레프리젠티드 바이 더 세크러테리 오브 애그리컬춰
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Abstract

본 발명은 1종 이상의 식물호르몬 유전자 및 적어도 1종의 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 1개 이상의 세포를 사용하여 식물의 게놈을 변형시키지 않으면서 식물의 특징을 변형시키기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이며, 1종 이상의 식물호르몬 유전자 및 적어도 1종의 관심의 폴리뉴클레오티드는 1개 이상의 세포에서 발현된다.

Description

식물 게놈을 변형시키지 않으면서 식물 특징을 변형시키기 위한 조성물 및 방법
서열 목록의 전자적 출원에 관한 진술
2020년 9월 17일에 생성되고 EFS-웹을 통해 출원된, 126,446 바이트의 크기의 1554-3WO_ST25.txt라는 명칭의 37 C.F.R. § 1.821 하에 제출된 ASCII 텍스트 형식의 서열 목록은 종이 사본 대신 제공된다. 이 서열 목록은 그의 개시내용에 대해 본 명세서에 참조로 포함된다.
우선권의 진술
본 출원은 2019년 9월 20일에 출원된 미국 가출원 번호 62/903,183의 35 U.S.C. § 119 (e) 하의 우선권을 주장하며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 숙주 식물의 게놈을 변형시키지 않으면서 숙주 식물의 특징을 변형시키는데 사용될 수 있는 1종 이상의 식물호르몬 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 적어도 1종의 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 공생체 형성 접종물 및 공생체에 관한 것이다.
아그로박테리움(Agrobacterium) 속 중의 박테리아는 수십 년 동안 근두 암종 질환을 유발하는 식물 병원체로서 연구되었다. 질환은 아그로박테리움 종에 의한 감염의 부위에서 식물 상에 성장하는 식물 덩어리 (또는 벌레혹)의 형성을 발생시킨다. 성숙한 식물 상에 발생하는 벌레혹은 병원체 및 숙주 유전자형 및 감염시 숙주의 연령에 따라 표현형적 반응 또는 식물 성장에 대한 효과를 거의 또는 전혀 발생시키지 않을 수 있다. 그러나, 보다 어린 식물 상의 벌레혹은 식물의 성장 및 다른 특징에 심각하게 유해하게 영향을 미칠 수 있다. 벌레혹 형성은 식물에서 상처입은 부위에 들어가고 DNA (Ti-플라스미드로 지칭되는 아그로박테리움 종 플라스미드 상에 위치하는 T-DNA, 또는 운반 DNA로 지칭됨)의 부분을 이웃하는 식물 세포에 전달하는 박테리아의 능력의 결과로서 유도된다. 식물 세포 내부로 들어오면, T-DNA는 핵을 향하고, 여기서 그것은 식물의 게놈에 삽입된다.
1940년대에, 아그로박테리움 종이 DNA를 식물 게놈 내로 전달하는 것으로 공지되기 전에, 연구자들은 박테리아가 식물 세포를 안정하게 변경시켜 "불멸"이 되게 하고, 식물 호르몬에 대한 필요와 독립적으로 시험관내 배양에서 성장할 수 있음을 발견하였다. 현재, 종양 형성은 식물 세포 게놈 내로 삽입되는 경우 발현되는 식물호르몬 합성을 위한 유전자를 함유하는 T-DNA의 결과인 것으로 공지되어 있다. 이어서 생산된 식물호르몬은 식물 세포가 식물-생산 세포 분열 신호의 제어 하에서 더 이상 세포 분열을 개시하지 않는 것을 유발한다.
1980년대 이래로, 아그로박테리움 종은 표적화된 식물의 게놈 내로 T-DNA를 삽입하는 그의 능력으로 인해 전체 식물을 형질전환시키기 위한 연구 및 적용에 사용되었다. 이러한 T-DNA는 목적하는 소질을 표적 식물 내로 부여하는 유전자를 전달하도록 조작될 수 있다. 형질전환을 달성하기 위해, 벌레혹을 형성하지 않고 따라서 생성된 식물이 단지 목적하는 표현형을 생산하도록 전달되는 관심의 유전자의 직접적 효과를 실현하는 아그로박테리움 종의 "디스아암드" 균주가 개발되었다.
그러나, 유전자이식 및 형질전환된 식물은 몇몇 이유로 항상 바람직한 것은 아니다. 첫째, 식물 형질전환은 낮은 빈도의 성공적인 식물 배선 조직의 형질전환을 갖는 수고로운 프로세스이다. 식물에서의 성공적인 트랜스제닉 유전자 발현은 이웃하는 유전자의 발현 및 식물 게놈 내로의 트랜스진 삽입의 카피 수에 의해 영향을 받을 수 있다. 둘째, 유전자이식의 전통적인 프로세스는 환경적 스트레스, 해충, 또는 병원체에 대한 실시간 반응을 용이하게 하지 않는다. 대신, 프로세스는 실험실 환경에서 수행되며, 따라서, 시간적 자극에 대한 동적 반응으로서 사용될 수 없다. 셋째, 이질성 DNA를 갖는 형질전환된 게놈은 식물로부터의 수확된 물질에 (예를 들어, 수확된 과실 또는 식물에) 존재할 수 있으며, 대부분의 시장에서는 생성된 식용 식품에 존재하는 이러한 형질전환된 DNA를 갖지 않도록 해야 할 요망이 있다. 또한, 환경에서 트랜스제닉 식물로부터의 화분을 갖지 않도록 해야 할 요망이 있다.
따라서, 이질성 DNA를 전체 식물 내로 도입하지 않으면서 하나 이상의 목적하는 소질을 표적 식물 내로 부여할 수 있는 방법에 대한 필요가 있다.
발명의 요약
본 발명의 한 측면은 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 식물호르몬 생합성 효소는 적어도 1종의 시토키닌 생합성 효소 및/또는 옥신 생합성 효소인 공생체 형성 접종물을 제공한다.
제2 측면은 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함하고 발현하는 식물 세포를 포함하고, 여기서 식물호르몬 생합성 효소는 적어도 1종의 시토키닌 생합성 효소 및/또는 옥신 생합성 효소이고, 공생체의 식물 세포는 자율적으로 분열하는 것인 공생체를 제공한다. 일부 측면에서, 식물 세포는 적어도 2개의 세포를 포함한다.
본 발명의 제3 측면은 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하거나, 또는 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 트랜스제닉 세포 내로 도입하고, 여기서 식물호르몬 생합성 효소는 적어도 1종의 시토키닌 생합성 효소 및/또는 옥신 생합성 효소이고, 그에 의해 공생체 형성 접종물을 생산하는 단계를 포함하는, 공생체 형성 접종물을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 제4 측면은 (a) (i) 식물 (또는 그의 부분 (예를 들어, 외식편)) 상의 적어도 1개의 부위 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 초과) 내로/상으로 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드 서열을 도입하거나, 식물 세포를 이식하거나, 또는 이 (예를 들어, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드 서열)를 포함하는 박테리아 세포를 식물 (또는 그의 부분) 상의 적어도 1개의 부위 상으로 접종하거나, 또는 (ii) 식물 (또는 그의 부분) 상의 적어도 1개의 부위 내로/상으로 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하거나, 식물 세포를 이식하거나, 또는 이를 포함하는 박테리아 세포를 식물 (또는 그의 부분) 상의 적어도 1개의 부위 상으로 접종하고, 여기서 (ii)의 식물 (또는 그의 부분)은 관심의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, (a)의 식물호르몬 생합성 효소는 적어도 1종의 시토키닌 생합성 효소 및/또는 옥신 생합성 효소이고, 그에 의해 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물 (또는 그의 부분) 상의 공생체를 생산하는 단계; 및 (b) 식물 상의 공생체로부터 1개 이상의 세포 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 또는 그 초과의 세포)를 선택하여, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 1개 이상의 세포를 제공하고, 그에 의해 공생체 형성 접종물을 생산하는 단계를 포함하는, 공생체 형성 접종물을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 제5 측면은 본 발명의 공생체 형성 접종물 또는 본 발명의 공생체를 숙주 식물 상의 적어도 1개의 부위 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 부위) 상으로 이식하는 단계; 및 공생체 형성 접종물 또는 공생체를 숙주 식물 상의 적어도 1개의 부위에서 배양하여 적어도 1개의 부위에서 숙주 식물 상의 공생체를 형성하고, 여기서 관심의 폴리뉴클레오티드는 숙주 식물 상의 공생체에서 발현되고, 관심의 폴리뉴클레오티드의 발현 생성물 및/또는 관심의 폴리뉴클레오티드의 발현 생성물을 사용하여 제조된 생성물은 숙주 식물 내로 수송되고, 그에 의해 숙주 식물 특징을 변형시키는 단계를 포함하는, 숙주 식물 게놈을 변형시키지 않으면서 숙주 식물 특징을 변형시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 제6 측면은 본 발명의 공생체를 제공하고, 여기서 관심의 폴리뉴클레오티드는 생물활성 분자를 코딩하고, 공생체에 의해 생산된 생물활성 분자를 수집하는 단계; 및/또는 본 발명의 숙주 식물을 제공하고, 여기서 관심의 폴리뉴클레오티드는 생물활성 분자를 코딩하고, 공생체 및 숙주 식물에서 생산된 생물활성 분자를 수집하는 단계를 포함하는, 생체분자 또는 생물활성 분자를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 제7 측면은 본 발명의 공생체 형성 접종물 또는 본 발명의 공생체를 숙주 식물 상의 적어도 1개의 부위 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 부위) 상으로 이식하는 단계, 및 공생체 형성 접종물 또는 공생체를 숙주 식물 상의 적어도 1개의 부위에서 배양하여 적어도 1개의 부위에서 숙주 식물 상의 공생체를 형성하고, 여기서 관심의 폴리뉴클레오티드는 공생체에서 발현되고, 관심의 폴리뉴클레오티드의 발현 생성물 및/또는 관심의 폴리뉴클레오티드의 발현 생성물을 사용하여 제조된 생성물은 숙주 식물 내로 수송되고, 그에 의해 관심의 화합물을 식물에 전달하는 단계를 포함하는, 관심의 화합물을 숙주 식물에 전달하는 방법을 제공한다.
본 발명의 제8 측면은 본 발명의 공생체 형성 접종물 또는 본 발명의 공생체를 숙주 식물 상의 적어도 1개의 부위 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 부위) 상으로 이식하는 단계; 및 공생체 형성 접종물 또는 공생체를 숙주 식물 상의 적어도 1개의 부위에서 배양하여 적어도 1개의 부위에서 숙주 식물 상의 공생체를 형성하고, 여기서 관심의 폴리뉴클레오티드는 공생체에서 발현되고, 관심의 폴리뉴클레오티드의 발현 생성물 및/또는 관심의 폴리뉴클레오티드의 발현 생성물을 사용하여 제조된 생성물은 숙주 식물 내로 수송되고, 그에 의해 변형된 유전자형을 갖지 않는 변형된 표현형을 포함하는 식물을 생산하는 단계를 포함하는, 숙주 식물의 유전자형을 변형시키지 않으면서 변형된 특징(들)을 포함하는 숙주 식물을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 의해 생산된 공생체 형성 접종물, 공생체, 숙주 식물, 식물 및 세포 및/또는 원형질체 뿐만 아니라 방법을 수행하기 위한 이를 포함하는 핵산, 발현 카세트 및 벡터가 또한 제공된다.
본 발명의 이들 및 다른 측면은 하기 발명의 설명에서 보다 상세하게 제시된다.
도 1. 공동-접종 및 단일-균주 접종 (아그로박테리움), 및 식물호르몬 생산 (PH)을 코딩하는 유전자 및 관심의 폴리뉴클레오티드 (POI)를 식물 세포 내로 전달하는 유전자 총 방법을 사용한 공생체 형성의 입증.
도 2. 적어도 1종의 식물호르몬 폴리펩티드 (식물 성장 조절제 (PGR) 발현 카세트) 및 관심의 폴리뉴클레오티드 (POI)를 코딩하는 플라스미드 지도 ("pSYM")의 예. AscI, XmaI 및 SpeI은 제한 부위이고, NosT는 노팔린 신타제 종결자이고, Kan은 카나마이신 선택 마커를 나타낸다.
도 3. 공생체를 생성하기 위한 상이한 예시 경로의 예시. DNA 전달은 임의의 방법, 예를 들어, 박테리아, 포격, 전기천공, 위스커, 원형질체 융합 등을 사용하여 수행될 수 있다. "활성화된 조직"은 식물호르몬 (PH) 유전자로 불멸화된 조직이고; "혼합된 배양물"은 다양한 상이한 유전자 삽입 및 발현을 갖는 세포의 집합이고; "공생체 형성 접종물"은 식물 상의 공생체 (예를 들어, DNA, 박테리아 세포, 식물 세포 등)를 형성하는데 사용될 수 있는 접종물이고; 공생체는 임의로 식물 상에 위치한 PH 유전자(들) 및 관심의 폴리뉴클레오티드(들) (POI)) 둘 다를 갖는 식물 조직 (예를 들어, 1개 이상의 식물 세포)이다.
도 4. 접종 후 60일 후에 시트러스 상의 공생체 형성. 패널 A 및 B는 공동-접종 (예를 들어, 1종 초과의 아그로박테리움 균주)을 사용하여 형성된 공생체를 나타낸다. 패널 C 및 D는 단일-균주 접종을 사용하여 형성된 공생체를 나타낸다.
도 5. 아그로박테리움 종으로의 접종 기술의 예. 패널 A는 시트러스 상의 핀셋의 사용을 나타낸다. 패널 B 및 C는 토마토 식물 상의 2가지 예시 바늘 유형, 즉, 문신 바늘 (패널 B) 및 피하 바늘 (패널 C)의 사용을 나타낸다.
도 6. 상이한 작물 유형 상의 공생체의 예. 패널 A. 피칸; 패널 B. 토마토; 패널 C. 시트러스; 패널 D. 담배 (니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)).
도 7. 높은 수준의 엠체리(mCherry) 생산을 나타내는 고체 배지 상에서 성장하는 공생체 형성 접종물 (식물 캘러스 조직의 형태로).
도 8. 고체 배지 (패널 A 및 B) 및 액체 배지 (패널 C 및 D) 상에서 성장된 공생체 형성 접종물의 상이한 유형의 예. 토마토 (패널 A 및 C) 및 시트러스 (패널 B 및 D).
도 9. 1 및 6주 (패널 A 및 B)에서의 시트러스; 및 2 및 6주 (패널 D 및 E)에서의 토마토 상의 공생체 이식의 예. 패널 C 및 F는 이식된 시트러스 공생체의 맥관형성 (C) 및 녹색 형광 단백질 (GFP) 생산 (패널 F)을 예시한다. 규소 테이프 (패널 A) 또는 파라필름 (패널 D)은 이식 부위에서 습도를 제어하기 위해 초기에 사용된다.
도 10. 관심의 생성물(들)을 코딩하는 다수의 (예를 들어, "스태킹된") 관심의 폴리뉴클레오티드 (POI)를 갖는 예시 pSYM 플라스미드의 플라스미드 지도.
도 11. 공생체 스태킹 및 POI 스태킹의 예. 토마토 상의 다수의 개별적 작은 GFP pSYM의 자가형광 (패널 A) 및 GFP 형광 (패널 B). 패널 C 내지 E는 단일 식물 상의 상이한 관심의 폴리뉴클레오티드 (POI)를 갖는 2개의 pSYM 플라스미드의 스태킹을 나타낸다: 자가형광 (패널 C), 엠체리 (패널 D) 및 GFP (패널 E). 패널 F 내지 H는 단일 pSYM 자가형광 (패널 F), 엠체리 (패널 G), GFP (패널 H)에서의 다수의 관심의 폴리뉴클레오티드 (POI)의 스태킹을 나타낸다.
도 12. 높은 수준의 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 토마토 및 시트러스 공생체. 패널 A. 그것이 맨눈으로 볼 수 있을 수준에서의 토마토 공생체에서의 GFP 단백질 축적. 패널 B 및 C는 단일-균주 접종 (아그로박테리움 종)으로 확립된 시트러스 공생체의 횡단면을 나타낸다. 화살표는 공생체 내부의 GFP의 높은 축적을 갖는 영역을 지시한다.
도 13. 웨스턴 블롯 검출 방법을 사용한 토마토 상의 단일-균주 접종 (아그로박테리움 종)을 사용하여 형성된 공생체에서 생산된 엠체리의 면역검출. 엠체리는 원래 단백질 추출물의 10-7 희석까지 검출가능하였다.
도 14. 토마토 식물 상의 엠체리 형광 단백질을 코딩하는 관심의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 공생체의 현미경적 소견. 패널 A는 공생체 조직 내로 연장하기 시작하는 성장하는 식물 맥관 조직의 UV 자가형광을 나타낸다. 패널 B는 레드 엠체리 생산 및 공생체 내부의 축적 뿐만 아니라 공생체 조직 내로 성장한 맥관 조직에서의 축적을 나타낸다. 패널 C는 공생체에서 발달하는 맥관 조직을 나타낸다. 패널 D는 공생체 외부의 엠체리 단백질의 이출을 입증하는 줄기 맥관 조직에서의 엠체리 형광 검출을 나타낸다.
도 15. POI 생성물의 이출을 예시하는 GFP를 발현하는 공생체 위의 1 내지 2 cm의 토마토 줄기의 횡단면. 화살표는 GFP 축적을 지시한다.
도 16. 둘 다 엠체리 단백질 생산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 2가지 부착된 공생체를 갖는 토마토 숙주 식물의 상이한 부분에서의 엠체리의 검출. 패널 A: 공생체 1; 패널 B: 공생체 1 위의 줄기; 패널 C: 공생체 2; 패널 D: 공생체 2 위의 줄기; 패널 E: 공생체 1 아래; 패널 F: 공생체 2 아래; 패널 G: 대조군.
도 17. 단지 공생체가 유전적으로 형질전환된 "GFP+"가 분비 경로 표적화 서열 (세포질 세망 (ER) 표적화 서열)에 GFP 연결됨을 예시하는 공생체 ("Sym") 대 토마토 숙주 식물 줄기에서의 관심의 폴리뉴클레오티드 (GFP, GFP+)의 PCR 검출.
도 18. 토마토 공생체에서의 시트러스 플라워 로커스(FLOWER LOCUS) T 유전자 (FT3)의 발현은 단지 야생형 아그로박테리움 종으로 접종된 토마토 (패널 B)에 비해 숙주 식물 (패널 A)에서 왜소증을 유도한다.
도 19. 시트러스 녹화병의 원인적 작용제인 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스(Candidatus Liberibacter asiaticus)로 감염된 시트론 식물. 패널 A, C 및 E는 항미생물 펩티드를 생산하는 공생체를 갖는 시트론을 예시한다. 패널 B, D 및 F는 대조군으로서 야생형 아그로박테리움 종을 갖는 시트론이다.
도 20. 공동-접종에 의해 숙주 시트러스 식물 상에 형성된 4개월령 공생체를 갖는 (도 19 참조) 및 야생형 아그로박테리움 종으로 접종된 시트러스에 비해, ER 표적화 서열에 작동가능하게 연결된 온코신 (온코신+)을 갖는 항미생물 펩티드 온코신을 발현하는 시트러스의 잎에서의 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스 (CLas)의 퍼센트 상대 감소.
도 21. 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스 (CLas)에 대한 관심의 생성물의 발현의 효능을 예시하는 그래프. 야생형 아그로박테리움 종으로 접종된 조직에 비해 신호 서열을 갖는 (+) 및 갖지 않는 항미생물 펩티드 (온코신 또는 TMOF)를 발현하는 공생체 조직에서의 CLas의 퍼센트 상대 감소. GFP+는 항미생물 펩티드를 갖지 않는 신호 서열을 갖는 녹색 형광 단백질을 발현하는 조직이다. TMOF=트립신 조정 오스타틱 인자.
도 22. 엔. 벤타미아나에서 이펙터 촉발된 면역을 유도하는 것으로 이전에 나타난 박테리아 이펙터 단백질을 코딩하는 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 공생체 형성 접종물로 공동-접종된 담배 (니코티아나 벤타미아나). 패널 A. 접종 전 건강한 식물. 패널 B. 접종 후 1-주, 하부 화살표는 접종 부위를 지시한다; 패널 C. 접종 후 2-주에 식물 사멸.
본 발명은 이제 본 발명의 실시양태가 나타내어진 첨부된 도면 및 실시예를 참고로 이하 설명될 것이다. 이 설명은 본 발명이 실행될 수 있는 모든 상이한 방식, 또는 본 발명에 첨가될 수 있는 모든 특색의 상세한 목록인 것으로 의도되지 않는다. 예를 들어, 한 실시양태에 관하여 예시된 특색은 다른 실시양태에 포함될 수 있으며, 특정 실시양태에 관하여 예시된 특색은 그 실시양태로부터 삭제될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 일부 실시양태에서, 본원에 제시된 임의의 특색 또는 특색의 조합이 배제되거나 생략될 수 있음을 고려한다. 또한, 본원에 제시된 다양한 실시양태에 대한 다수의 변동 및 첨가는 본 발명으로부터 벗어나지 않는 본 개시내용의 관점에서 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 따라서, 하기 설명은 본 발명의 일부 특정 실시양태를 예시하는 것으로 의도되며, 그의 모든 순열, 조합 및 변동을 철저하게 명시하는 것으로 의도되지 않는다.
본원에 사용된 단어 "예시적인"은 "예, 경우 또는 예시로서 역할을 하는" 것을 의미한다. 본원에 기재된 실시양태는 제한적이 아니며, 오히려 단지 예시적이다. 기재된 실시양태는 반드시 다른 실시양태에 비해 바람직하거나 유리한 것으로 해석되지는 않음이 이해되어야 한다. 더욱이, 용어 "본 발명의 실시양태", "실시양태" 또는 "발명"은 본 발명의 모든 실시양태가 논의된 특색, 이점 또는 작동의 방식을 포함할 것을 요구하지는 않는다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 발명의 설명에 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 설명하는 목적을 위한 것이며, 본 발명의 제한인 것으로 의도되지 않는다.
본원에 인용된 모든 공보, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 참고문헌이 제시된 문장 및/또는 단락에 관한 교시사항에 대해 그 전문이 참조로 포함된다.
본 공보에서 상표명 또는 상업적 제품의 언급은 단지 구체적인 정보를 제공하는 목적을 위한 것이며, 미국 농업부에 의한 권고 또는 보증을 암시하지는 않는다.
맥락이 달리 지시하지 않는 한, 본원에 기재된 본 발명의 다양한 특색은 임의의 조합으로 사용될 수 있음이 구체적으로 의도된다. 더욱이, 본 발명은 또한 본 발명의 일부 실시양태에서, 본원에 제시된 임의의 특색 또는 특색의 조합이 배제되거나 생략될 수 있음을 고려한다. 예시하기 위해, 본 명세서가 조성물이 성분 A, B 및 C를 포함한다고 진술하는 경우, 임의의 A, B 또는 C, 또는 이들의 조합이 단독으로 또는 임의의 조합으로 생략되고 청구배제될 수 있음이 구체적으로 의도된다.
발명의 설명 및 첨부된 청구항에 사용된 단수 형태는 맥락이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 복수 형태를 또한 포함하는 것으로 의도된다.
또한 본원에 사용된 "및/또는"은 연관된 열거된 항목 중 하나 이상의 임의의 및 모든 가능한 조합, 뿐만 아니라 대안 ("또는")으로 해석되는 경우 조합의 결여를 지칭하고 포괄한다.
측정가능한 값, 예컨대 양 또는 농도 등을 지칭하는 경우 본원에 사용된 용어 "약"은 명시된 값의 ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0.5%, 또는 심지어 ± 0.1%의 변동 뿐만 아니라 명시된 값을 포괄하는 것으로 의미된다. 예를 들어, X가 측정가능한 값인 경우 "약 X"는 X 뿐만 아니라 X의 ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0.5%, 또는 심지어 ± 0.1%의 변동을 포함하는 것으로 의미된다. 측정가능한 값에 대해 본원에서 제공된 범위는 임의의 다른 범위 및/또는 그 안의 개별적 값을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "X 내지 Y" 및 "약 X 내지 Y"와 같은 어구는 X 및 Y를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에 사용된 "약 X 내지 Y"와 같은 어구는 "약 X 내지 약 Y"를 의미하고, "약 X 내지 Y"와 같은 어구는 "약 X 내지 약 Y"를 의미한다.
본원에서 값의 범위의 나열은 본원에서 달리 지시되지 않는 한, 단지 범위 내에 해당하는 각각의 별개의 값을 개별적으로 지칭하는 약칭 방법으로서 역할을 하는 것으로 의도되고, 각각의 별개의 값은 그것이 본원에 개별적으로 나열된 것처럼 본 명세서에 포함된다. 예를 들어, 범위 10 내지 15가 개시되는 경우, 11, 12, 13, 및 14가 또한 개시된다.
본원에 사용된 용어 "포함하다(comprise)", "포함하다(comprises)" 및 "포함하는"은 언급된 특색, 정수, 단계, 작동, 요소, 및/또는 성분의 존재를 명시하지만, 하나 이상의 다른 특색, 정수, 단계, 작동, 요소, 성분, 및/또는 그의 군의 존재 또는 첨가를 불가능하게 하지 않는다.
본원에 사용된 전이적 어구 "본질적으로 이루어진"은 청구항의 범위가 청구항에 나열된 명시된 물질 또는 단계 및 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특징(들)에 본질적으로 영향을 미치지 않는 것들을 포괄하는 것으로 해석되어야 함을 의미한다. 따라서, 본 발명의 청구항에 사용되는 경우 용어 "본질적으로 이루어진"은 "포함하는"과 등가인 것으로 해석되는 것으로 의도되지 않는다.
"임의적" 또는 "임의로"는 후속하여 기재된 사건 또는 상황이 일어날 수 있거나 일어나지 않을 수 있음, 및 설명이 상기 사건 또는 상황이 일어나는 경우 및 그것이 일어나지 않는 경우를 포함함을 의미한다. 예를 들어, 어구 "임의로 X를 포함하는"은 조성물이 X를 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있음을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "증가시키다", "증가하는", "증가된", "증진시키다", "증진된", "증진하는" 및 "증진" (및 그의 문법적 파생어)은 대조군과 비교하여 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 초과의 상승을 기재한다. 예를 들어, 변형된 특징을 갖는 숙주 식물은 곤충 해충에 대한 증가된 내성 또는 증가된 저항성을 나타낼 수 있으며, 여기서 증가된 내성 또는 저항성은 대조군 식물과 비교하여 약 5% 내지 약 500% 증가된다.
본원에 사용된 용어 "감소시키다(reduce)", "감소된", "감소하는", "감소(reduction)", "감소시키다(diminish)" 및 "감소(decrease)" (및 그의 문법적 파생어)는 예를 들어, 대조군과 비교하여 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 35%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 또는 100%의 감소를 기재한다. 특정 실시양태에서, 감소는 검출가능한 활성 또는 양을 발생시키지 않거나 본질적으로 발생시키지 않을 수 있다 (즉, 비유의한 양, 예를 들어, 약 10% 또는 심지어 5% 미만).
핵산 분자 및/또는 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, RNA 또는 DNA)에 관하여 본원에 사용된 용어 "발현하다(express)", "발현하다(expresses)", "발현된" 또는 "발현" 등은 핵산 분자 및/또는 뉴클레오티드 서열이 전사되고, 임의로, 번역됨을 지시한다. 따라서, 핵산 분자 및/또는 뉴클레오티드 서열은 관심의 폴리펩티드, 예를 들어, 기능적 비번역된 RNA를 발현할 수 있다.
"이종" 또는 "재조합" 뉴클레오티드 서열은 천연 발생 뉴클레오티드 서열의 비-천연 발성 다중 카피를 포함한, 그것이 그 내로 도입되는 숙주 세포와 자연적으로 연관되지 않는 뉴클레오티드 서열이다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "이종"은 외래 종으로부터 기원한, 또는, 동일한 종으로부터의 것인 경우, 고의적 인간 개입에 의해 조성 및/또는 게놈 유전자좌에 있어서 그의 천연 형태로부터 실질적으로 변형된 뉴클레오티드/폴리펩티드를 지칭한다. 예로서, 이종 폴리뉴클레오티드는 유기체에 대해 천연인 뉴클레오티드 서열을 코딩할 수 있지만, 뉴클레오티드 서열은 이종 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 그에 의해 이종 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
"천연" 또는 "야생형" 핵산, 뉴클레오티드 서열, 폴리펩티드 또는 아미노산 서열은 천연 발생 또는 내인성 핵산, 뉴클레오티드 서열, 폴리펩티드 또는 아미노산 서열을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "핵산", "핵산 분자", "뉴클레오티드 서열" 및 "폴리뉴클레오티드"는 선형 또는 분지형, 단일 또는 이중-가닥인 RNA 또는 DNA, 또는 그의 하이브리드를 지칭한다. 상기 용어는 RNA/DNA 하이브리드를 포괄한다. dsRNA가 합성적으로 생산되는 경우, 덜 통상적인 염기, 예컨대 이노신, 5-메틸시토신, 6-메틸아데닌, 히포크산틴 및 다른 것들은 또한 안티센스, dsRNA, 및 리보자임 쌍형성에 사용될 수 있다. 예를 들어, 우리딘 및 시티딘의 C-5 프로핀 유사체를 함유하는 폴리뉴클레오티드는 높은 친화도로 RNA에 결합하고 유전자 발현의 강력한 안티센스 억제제인 것으로 나타났다. 다른 변형, 예컨대 포스포디에스테르 백본, 또는 RNA의 리보스 당 기에서 2'-히드록시에 대한 변형은 또한 이루어질 수 있다.
본원에 사용된 용어 "뉴클레오티드 서열"은 핵산 분자의 5'에서 3' 단부로 뉴클레오티드의 이종중합체 또는 이들 뉴클레오티드의 서열을 지칭하고, cDNA, DNA 단편 또는 부분, 게놈 DNA, 합성 (예를 들어, 화학적으로 합성된) DNA, 플라스미드 DNA, mRNA, 및 안티-센스 RNA를 포함한 DNA 또는 RNA 분자를 포함하며, 이들 중 임의의 것은 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 용어 "뉴클레오티드 서열", "핵산", "핵산 분자", "핵산 구축물", "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 또한 뉴클레오티드의 이종중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 본원에서 제공된 핵산 분자 및/또는 뉴클레오티드 서열은 본원에서 5'에서 3' 방향으로, 좌측에서 우측으로 제시되며, 미국 서열 규칙, 37 CFR §§1.821 내지 1.825 및 세계 지식 재산권 기구 (WIPO) 표준 ST.25에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 문자를 나타내기 위한 표준 부호를 사용하여 나타내어진다. 본원에 사용된 "5' 영역"은 폴리뉴클레오티드의 5' 단부에 가장 가까운 폴리뉴클레오티드의 영역을 의미할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드의 5' 영역에 있는 요소는 폴리뉴클레오티드의 5' 단부에 위치한 제1 뉴클레오티드로부터 폴리뉴클레오티드를 통해 중간에 위치한 뉴클레오티드까지 어디에나 위치할 수 있다. 본원에 사용된 "3' 영역"은 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 가장 가까운 폴리뉴클레오티드의 영역을 의미할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드의 3' 영역에 있는 요소는 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 위치한 제1 뉴클레오티드로부터 폴리뉴클레오티드를 통해 중간에 위치한 뉴클레오티드까지 어디에나 위치할 수 있다.
핵산에 관하여 본원에 사용된 용어 "단편" 또는 "부분"은 참조 핵산에 비해 길이에 있어서 감소되고 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 20, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 또는 900개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값만큼 감소되고), 참조 핵산의 상응하는 부분과 동일하거나 거의 동일한 (예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한) 인접한 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나, 이로 본질적으로 이루어지고/거나 이로 이루어진 핵산을 지칭한다. 이러한 핵산 단편은 적절한 경우, 그것이 구성요소인 보다 큰 폴리뉴클레오티드에 포함될 수 있다.
폴리펩티드에 관하여 본원에 사용된 용어 "단편" 또는 "부분"은 참조 폴리펩티드에 비해 길이에 있어서 감소되고, 참조 폴리펩티드의 상응하는 부분과 동일하거나 거의 동일한 (예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한) 인접한 아미노산의 아미노산 서열을 포함하고/거나, 이로 본질적으로 이루어지고/거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. 이러한 폴리펩티드 단편은 적절한 경우, 그것이 구성요소인 보다 큰 폴리펩티드에 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 단편은 참조 폴리펩티드의 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 260, 270, 280, 290개, 또는 그 초과의 연속적 아미노산을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어진다. 본 발명은 이제 하기 실시예를 참고로 설명될 것이다. 이들 실시예는 본 발명에 대한 청구항의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 오히려 특정 실시양태의 예시인 것으로 의도됨이 이해되어야 한다. 통상의 기술자에게 일어나는 예시화된 방법의 임의의 변동은 본 발명의 범위 내에 해당하는 것으로 의도된다.
핵산에 관하여 본원에 사용된 용어 "기능적 단편"은 폴리펩티드의 기능적 단편을 코딩하는 핵산을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "유전자"는 mRNA, 안티센스 RNA, miRNA, 항-마이크로RNA 안티센스 올리고데옥시리보뉴클레오티드 (AMO) 등을 생산하는데 사용될 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 유전자는 기능적 단백질 또는 유전자 생성물을 생산하는데 사용될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 유전자는 코딩 및 비-코딩 영역 (예를 들어, 인트론, 조절 요소, 프로모터, 인핸서, 종결 서열 및/또는 5' 및 3' 비번역된 영역) 둘 다를 포함할 수 있다. 유전자는 "단리될" 수 있으며, 이는 그의 자연적 상태에서의 핵산과 연관되어 정상적으로 발견되는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 핵산을 의미한다. 이러한 성분은 다른 세포 물질, 재조합 생산으로부터의 배양 배지, 및/또는 핵산을 화학적으로 합성하는데 사용되는 다양한 화학물질을 포함한다.
용어 "돌연변이"는 점 돌연변이 (예를 들어, 미스센스, 또는 넌센스, 또는 프레임 쉬프트를 발생시키는 단일 염기 쌍의 삽입 또는 결실), 삽입, 결실, 및/또는 말단절단을 지칭한다. 돌연변이가 아미노산 서열 내의 잔기의 또 다른 잔기로의 치환, 또는 서열 내의 1개 이상의 잔기의 결실 또는 삽입인 경우, 돌연변이는 전형적으로 원래 잔기에 이어서, 서열 내의 잔기의 위치 및 새롭게 치환된 잔기의 신원을 확인함으로써 기재된다. 말단절단은 폴리펩티드의 C-말단 단부에서의 또는 폴리펩티드의 N-말단 단부에서의 말단절단을 포함할 수 있다. 폴리펩티드의 말단절단은 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 상응하는 5' 단부 또는 3' 단부의 결실의 결과일 수 있다. 프레임쉬프트 돌연변이는 1개 이상의 염기 쌍의 결실 또는 삽입이 유전자 내로 도입되는 경우 발생할 수 있다. 유전자에서의 프레임쉬프트 돌연변이는 제1 정지 코돈이 유전자의 돌연변이된 영역 뒤에 발생하는 시기에 따라 야생형 폴리펩티드보다 더 긴, 더 짧은 또는 동일한 길이인 폴리펩티드의 생산을 발생시킬 수 있다. 결실은 유전자의 비-코딩 부분, 예컨대 프로모터에서의 돌연변이를 유발할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "상보적" 또는 "상보성"은 염기-쌍형성에 의한 허용적인 염 및 온도 조건 하에서의 폴리뉴클레오티드의 자연적 결합을 지칭한다. 예를 들어, 서열 "A-G-T" (5'에서 3'로)는 상보적 서열 "T-C-A" (3'에서 5'로)에 결합한다. 2개의 단일-가닥 분자 사이의 상보성은 뉴클레오티드의 단지 일부가 결합하는 "부분적"일 수 있거나, 또는 이는 단일-가닥 분자 사이에 전체적 상보성이 존재하는 경우 완전할 수 있다. 핵산 가닥 사이의 상보성의 정도는 핵산 가닥 사이의 혼성화의 효율 및 강도에 대한 유의한 효과를 갖는다.
본원에 사용된 "상보체"는 비교자 뉴클레오티드 서열과의 100% 상보성을 의미할 수 있거나, 또는 이는 비교자 뉴클레오티드 서열과 100% 미만의 상보성 (예를 들어, 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 등의 상보성)을 의미할 수 있다.
상동성을 갖는 상이한 핵산 또는 단백질은 본원에서 "동족체"로 지칭된다. 용어 동족체는 동일한 것으로부터의 및 다른 종으로부터의 상동 서열 및 동일한 및 다른 종으로부터의 이종상동 서열을 포함한다. "상동성"은 위치적 동일성의 퍼센트 (즉, 서열 유사성 또는 동일성)의 관점에서 2개 이상의 핵산 및/또는 아미노산 서열 사이의 유사성의 수준을 지칭한다. 상동성은 또한 상이한 핵산 또는 단백질 중에서의 유사한 기능적 특성의 개념을 지칭한다. 따라서, 본 발명의 조성물 및 방법은 본 발명의 뉴클레오티드 서열 및 폴리펩티드 서열에 대한 동족체를 추가로 포함한다. 본원에 사용된 "이종상동"은 종분화 동안 공통 조상 유전자로부터 발생한 상이한 종에서의 상동 뉴클레오티드 서열 및/또는 아미노산 서열을 지칭한다. 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 동족체는 본 발명의 상기 뉴클레오티드 서열과 실질적 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%)을 갖는다.
본원에 사용된 "서열 동일성"은 2개의 최적으로 정렬된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 성분, 예를 들어, 뉴클레오티드 또는 아미노산의 정렬의 창 전반에 걸쳐 불변하는 정도를 지칭한다. "동일성"은 문헌 [Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, New York (1988)]; [Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, New York (1993)]; [Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, New Jersey (1994)]; [Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987)]; 및 [Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, New York (1991)]에 기재된 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는 공지된 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "퍼센트 서열 동일성" 또는 "퍼센트 동일성"은 2개의 서열이 최적으로 정렬되는 경우 시험 ("대상") 폴리뉴클레오티드 분자 (또는 그의 상보적 가닥)와 비교하여 참조 ("의문") 폴리뉴클레오티드 분자 (또는 그의 상보적 가닥)의 선형 폴리뉴클레오티드 서열에서 동일한 뉴클레오티드의 백분율을 지칭한다. 일부 실시양태에서, "퍼센트 서열 동일성"은 참조 폴리펩티드와 비교하여 아미노산 서열에서 동일한 아미노산의 백분율을 지칭할 수 있다.
2개의 핵산 분자, 뉴클레오티드 서열, 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서 본원에 사용된 어구 "실질적으로 동일한", 또는 "실질적 동일성"은 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하여 또는 육안 검사에 의해 측정된 바로, 최대 상응성에 대해 비교되고 정렬되는 경우, 적어도 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 동일성을 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 실질적 동일성은 약 10개의 뉴클레오티드 내지 약 20개의 뉴클레오티드, 약 10개의 뉴클레오티드 내지 약 25개의 뉴클레오티드, 약 10개의 뉴클레오티드 내지 약 30개의 뉴클레오티드, 약 15개의 뉴클레오티드 내지 약 25개의 뉴클레오티드, 약 30개의 뉴클레오티드 내지 약 40개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 60개의 뉴클레오티드, 약 70개의 뉴클레오티드 내지 약 80개의 뉴클레오티드, 약 90개의 뉴클레오티드 내지 약 100개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 200개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 300개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 400개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 500개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 600개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 800개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 내지 약 900개의 뉴클레오티드, 또는 그 초과의 길이, 또는 그 안의 임의의 범위, 최대 서열의 전장인 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 연속적 뉴클레오티드의 영역에 걸쳐 존재한다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 한 서열은 시험 서열이 비교되는 참조 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 및 참조 서열이 컴퓨터 내로 들어가고, 필요할 경우 하위서열 좌표가 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 이어서 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 파라미터에 기반하여 참조 서열에 비해 시험 서열(들)에 대한 퍼센트 서열 동일성을 계산한다.
비교 창을 정렬하기 위한 서열의 최적 정렬은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 스미스 및 워터만(Smith and Waterman)의 국소 상동성 알고리즘, 니들만 및 운쉬(Needleman and Wunsch)의 상동성 정렬 알고리즘, 피어슨 및 리프만(Pearson and Lipman)의 유사성 방법을 위한 검색과 같은 도구에 의해, 및 임의로 이들 알고리즘의 컴퓨터화 실행, 예컨대 GCG® 위스콘신 패키지(Wisconsin Package)® (액설리스 인크.(Accelrys Inc.), 미국 캘리포니아주 샌 디에고)의 일부로서 이용가능한 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA에 의해 수행될 수 있다. 시험 서열 및 참조 서열의 정렬된 절편에 대한 "동일성 분율"은 2개의 정렬된 서열에 의해 공유된 동일한 성분의 수 나누기 참조 서열 절편, 예를 들어, 전체 참조 서열 또는 참조 서열의 보다 작은 한정된 부분에서의 성분의 총 수이다. 퍼센트 서열 동일성은 동일성 분율 곱하기 100으로서 나타내어진다. 1개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열의 비교는 전장 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분에 대한, 또는 보다 긴 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 것일 수 있다. 본 발명의 목적상, "퍼센트 동일성"은 또한 번역된 뉴클레오티드 서열에 대해 BLASTX 버전 2.0 및 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 BLASTN 버전 2.0을 사용하여 결정될 수 있다.
2개의 뉴클레오티드 서열은 또한 2개의 서열이 엄격한 조건 하에서 서로에 혼성화하는 경우 실질적으로 상보적인 것으로 간주될 수 있다. 일부 실시양태에서, 2개의 뉴클레오티드 서열은 매우 엄격한 조건 하에서 서로에 실질적으로 상보적 혼성화하는 것으로 간주된다.
핵산 혼성화 실험, 예컨대 서던 및 노던 혼성화의 맥락에서 "엄격한 혼성화 조건" 및 "엄격한 혼성화 세척 조건"은 서열 의존적이며, 상이한 환경적 파라미터 하에서 상이하다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 지침은 문헌 [Tijssen Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" Elsevier, New York (1993)]에서 발견된다. 일반적으로, 매우 엄격한 혼성화 및 세척 조건은 한정된 이온 강도 및 pH에서 특이적 서열에 대한 열 융점 (Tm)보다 약 5℃ 더 낮도록 선택된다.
Tm은 표적 서열의 50%가 완벽하게 매칭된 프로브에 혼성화하는 온도 (한정된 이온 강도 및 pH 하에서)이다. 매우 엄격한 조건은 특정 프로브에 대한 Tm과 동등하도록 선택된다. 서던 또는 노던 블롯에서 필터 상의 100개 초과의 상보적 잔기를 갖는 상보적 뉴클레오티드 서열의 혼성화를 위한 엄격한 혼성화 조건의 예는 42℃에서 1 mg의 헤파린을 갖는 50% 포름아미드이며, 혼성화는 밤새 수행된다. 매우 엄격한 세척 조건의 예는 72℃에서 약 15분 동안 0.1 5M NaCl이다. 엄격한 세척 조건의 예는 65℃에서 15분 동안 0.2x SSC이다 (SSC 완충제의 설명에 대해서는, 하기 문헌 [Sambrook] 참조). 종종, 배경 프로브 신호를 제거하기 위해 낮은 엄격성 세척이 높은 엄격성 세척보다 선행한다. 예를 들어, 100개 초과의 뉴클레오티드의 듀플렉스에 대한 중간 엄격성 세척의 예는 45℃에서 15분 동안 1x SSC이다. 예를 들어, 100개 초과의 뉴클레오티드의 듀플렉스에 대한 낮은 엄격성 세척의 예는 40℃에서 15분 동안 4 내지 6x SSC이다. 짧은 프로브 (예를 들어, 약 10 내지 50개의 뉴클레오티드)에 대해, 엄격한 조건은 전형적으로 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0 M 미만의 Na 이온, 전형적으로 약 0.01 내지 1.0 M Na 이온 농도 (또는 다른 염)의 염 농도를 수반하고, 온도는 전형적으로 적어도 약 30℃이다. 엄격한 조건은 또한 탈안정화제, 예컨대 포름아미드의 첨가로 달성될 수 있다. 일반적으로, 특정 혼성화 검정에서 비관련된 프로브에 대해 관찰되는 것보다 2x의 (또는 더 높은) 신호 대 잡음 비는 특이적 혼성화의 검출을 지시한다. 엄격한 조건 하에서 서로에 혼성화하지 않는 뉴클레오티드 서열은 그들이 코딩하는 단백질이 실질적으로 동일한 경우 여전히 실질적으로 동일하다. 이는 예를 들어, 뉴클레오티드 서열의 카피가 유전 암호에 의해 허용되는 최대 코돈 축퇴성을 사용하여 생성되는 경우 일어날 수 있다.
본 발명의 임의의 폴리뉴클레오티드 및/또는 재조합 핵산 분자는 관심의 임의의 종에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 코돈 최적화는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 종 특이적 코돈 용법 표를 사용한 코돈 용법 편향에 대한 뉴클레오티드 서열의 변형을 수반한다. 코돈 용법 표는 관심의 종에 대한 가장 고도로 발현된 유전자의 서열 분석에 기반하여 생성된다. 뉴클레오티드 서열이 핵에서 발현되어야 하는 경우, 코돈 용법 표는 관심의 종에 대한 고도로 발현된 핵 유전자의 서열 분석에 기반하여 생성된다. 뉴클레오티드 서열의 변형은 종 특이적 코돈 용법 표를 천연 폴리뉴클레오티드 서열에 존재하는 코돈과 비교함으로써 결정된다. 관련 기술분야에 이해되어 있는 바와 같이, 뉴클레오티드 서열의 코돈 최적화는 천연 뉴클레오티드 서열과 100% 미만의 동일성 (예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 등)을 갖지만, 원래 천연 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 것과 동일한 기능을 갖는 폴리펩티드를 여전히 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발생시킨다. 따라서, 본 발명의 일부 실시양태에서, 관심의 폴리뉴클레오티드 및/또는 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 이를 포함하는 핵산 구축물은 관심의 특정 종에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 재조합 핵산 분자, 뉴클레오티드 서열 및 폴리펩티드는 "단리된다". "단리된" 핵산 분자, "단리된" 뉴클레오티드 서열 또는 "단리된" 폴리펩티드는 인간의 손에 의해, 그의 천연 환경으로부터 떨어져 존재하고 따라서 자연의 생성물이 아닌 핵산 분자, 뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드이다. 단리된 핵산 분자, 뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드는 천연 발생 유기체 또는 바이러스의 다른 성분의 적어도 일부, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드와 연관되어 통상적으로 발견되는 세포 또는 바이러스 구조적 성분 또는 다른 폴리펩티드 또는 핵산으로부터 적어도 부분적으로 분리된 정제된 형태로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산 분자, 단리된 뉴클레오티드 서열 및/또는 단리된 폴리펩티드는 적어도 약 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 그 초과 순수하다.
일부 실시양태에서, 단리된 핵산 분자, 뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드는 비-천연 환경, 예컨대, 예를 들어, 재조합 숙주 세포에 존재할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 뉴클레오티드 서열에 관하여, 용어 "단리된"은 그것이 천연적으로 발생하는 염색체 및/또는 세포로부터 그것이 분리됨을 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 또한 그것이 유전자 맥락에서 천연적으로 발생하고, 이어서 그 내로 삽입되는 염색체 및/또는 세포, 그것이 천연적으로 발생하지 않는 염색체 및/또는 세포 (예를 들어, 상이한 숙주 세포, 상이한 조절 서열, 및/또는 자연에서 발견되는 것과 상이한 게놈에서의 위치)로부터 그것이 분리되는 경우 단리된다. 따라서, 재조합 핵산 구축물, 폴리뉴클레오티드 및 그들의 코딩된 폴리펩티드는 인간의 손에 의해, 그들이 그들의 천연 환경으로부터 떨어져 존재하고 따라서 자연의 생성물이 아닌 점에서 "단리된"이지만, 일부 실시양태에서, 이들은 재조합 숙주 세포 내로 도입되고 그에 존재할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 구축물은 식물 및/또는 식물의 세포에서의 발현을 위한 다양한 프로모터 및/또는 다른 조절 요소와 작동적으로 연관될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 구축물은 1개 이상의 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 1개 이상의 프로모터, 인트론, 인핸서, 및/또는 종결자를 추가로 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오티드에 관하여 본원에 사용된 "작동가능하게 연결된" 또는 "작동가능하게 연관된"이란, 지시된 요소가 서로에 기능적으로 관련되고, 또한 일반적으로 물리적으로 관련됨을 의미한다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "작동가능하게 연결된" 또는 "작동가능하게 연관된"은 기능적으로 연관된 단일 핵산 분자 상의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 따라서, 제2 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 제1 뉴클레오티드 서열은 제1 뉴클레오티드 서열이 제2 뉴클레오티드 서열과 기능적 관계에 놓인 상황을 의미한다. 예를 들어, 프로모터는 프로모터가 뉴클레오티드 서열의 전사 또는 발현을 실행하는 경우 상기 뉴클레오티드 서열과 작동가능하게 연관된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 제어 서열이 그의 발현을 지정하도록 기능하는 한, 제어 서열 (예를 들어, 프로모터)이 그것이 작동가능하게 연관된 뉴클레오티드 서열과 인접할 필요는 없음을 이해할 것이다. 따라서, 예를 들어, 개재하는 비번역된, 그러나 전사된 핵산 서열은 프로모터 및 뉴클레오티드 서열 사이에 존재할 수 있고, 프로모터는 여전히 뉴클레오티드 서열에 "작동가능하게 연결된" 것으로 간주될 수 있다.
폴리펩티드에 관하여 본원에 사용된 용어 "연결된"은 한 폴리펩티드의 또 다른 것에의 부착을 지칭한다. 폴리펩티드는 직접적으로 (예를 들어, 펩티드 결합을 통해) 또는 링커를 통해 또 다른 폴리펩티드에 연결될 수 있다 (N-말단 및/또는 C-말단에서). 예로서, 폴리펩티드는 임의로 N-말단 또는 C-말단 또는 둘 다에서 표적화 서열에 연결될 수 있다. 본원에 사용된 "링커"는 2개의 분자 또는 모이어티를 연결하는 화학기 또는 분자를 지칭할 수 있다.
"프로모터"는 프로모터와 작동가능하게 연관된 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 코딩 서열)의 전사를 제어하거나 조절하는 뉴클레오티드 서열이다. 프로모터에 의해 제어되거나 조절되는 코딩 서열은 폴리펩티드 및/또는 기능적 RNA를 코딩할 수 있다. 전형적으로, "프로모터"는 RNA 폴리머라제 II에 대한 결합 부위를 함유하고 전사의 개시를 지정하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 일반적으로, 프로모터는 상응하는 코딩 서열의 코딩 영역의 시작부에 비해 5', 또는 상류에서 발견된다. 프로모터는 유전자 발현의 조절제로서 작용하는 다른 요소; 예를 들어, 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 이들은 TATA 박스 컨센서스 서열, 및 종종 CAAT 박스 컨센서스 서열을 포함한다 (Breathnach and Chambon, (1981) Ann. Rev. Biochem. 50:349). 식물에서, CAAT 박스는 AGGA 박스에 의해 치환될 수 있다 (Messing et al., (1983) in Genetic Engineering of Plants, T. Kosuge, C. Meredith and A. Hollaender (eds.), Plenum Press, pp. 211-227).
본 발명에 유용한 프로모터는 예를 들어, 재조합 핵산 분자, 예를 들어, "합성 핵산 구축물" 또는 "단백질-RNA 복합체"의 제조에 사용하기 위한 구성적, 유도성, 시간적으로 조절된, 발달적으로 조절된, 화학적으로 조절된 프로모터를 포함할 수 있다. 이들 다양한 유형의 프로모터는 관련 기술분야에 공지되어 있다.
프로모터의 선택은 발현을 위한 시간적 및 공간적 요건에 따라 다양할 수 있으며, 또한 형질전환되는 숙주 세포에 기반하여 다양할 수 있다. 많은 상이한 유기체에 대한 프로모터는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 관련 기술분야에 존재하는 광범위한 지식에 기반하여, 적절한 프로모터가 관심의 특정 숙주 유기체에 대해 선택될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 모델 유기체에서 고도로 구성적으로 발현된 유전자의 상류의 프로모터에 관하여 많은 것이 공지되어 있으며, 이러한 지식은 용이하게 접근되고, 적절한 경우 다른 시스템에서 실행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 식물에서 기능적인 프로모터는 본 발명의 구축물에 사용될 수 있다. 식물에서 발현을 유도하는데 유용한 프로모터의 비-제한적 예는 루비스코(RubisCo) 소형 서브유닛 유전자 1의 프로모터 (PrbcS1), 액틴 유전자의 프로모터 (P액틴(Pactin)), 니트레이트 리덕타제 유전자의 프로모터 (Pnr) 및 중복된 카르보닉 안히드라제 유전자 1의 프로모터 (Pdca1)를 포함한다 (문헌 [Walker et al. Plant Cell Rep. 23:727-735 (2005)]; [Li et al. Gene 403:132-142 (2007)]; [Li et al. Mol Biol. Rep. 37:1143-1154 (2010)] 참조). PrbcS1 및 P액틴은 구성적 프로모터이고, Pnr 및 Pdca1은 유도성 프로모터이다. Pnr은 니트레이트에 의해 유도되고 암모늄에 의해 억제되고 (Li et al. Gene 403:132-142 (2007)), Pdca1은 염에 의해 유도된다 (Li et al. Mol Biol. Rep. 37:1143-1154 (2010)). 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 프로모터는 RNA 폴리머라제 II (Pol II) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제아 메이스(Zea mays)로부터의 U6 프로모터 또는 7SL 프로모터는 본 발명의 구축물에 유용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제아 메이스로부터의 U6c 프로모터 및/또는 7SL 프로모터는 가이드 핵산의 발현을 유도하는데 유용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 글리시네 막스(Glycine max)로부터의 U6c 프로모터, U6i 프로모터 및/또는 7SL 프로모터는 본 발명의 구축물에 유용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 글리시네 막스로부터의 U6c 프로모터, U6i 프로모터 및/또는 7SL 프로모터는 가이드 핵산의 발현을 유도하는데 유용할 수 있다.
식물에 유용한 구성적 프로모터의 예는 세스트룸(Cestrum) 바이러스 프로모터 (cmp) (미국 특허 번호 7,166,770), 벼 액틴 1 프로모터 (Wang et al. (1992) Mol. Cell. Biol. 12:3399-3406; 뿐만 아니라 미국 특허 번호 5,641,876), CaMV 35S 프로모터 (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812), CaMV 19S 프로모터 (Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-324), nos 프로모터 (Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:5745-5749), Adh 프로모터 (Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6624-6629), 수크로스 신타제 프로모터 (Yang & Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-4148), 및 유비퀴틴 프로모터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 유비퀴틴으로부터 유래된 구성적 프로모터는 많은 세포 유형에서 축적된다. 유비퀴틴 프로모터는 트랜스제닉 식물, 예를 들어, 해바라기 (Binet et al., 1991. Plant Science 79: 87-94), 메이즈 (Christensen et al., 1989. Plant Molec. Biol. 12: 619-632), 및 아라비돕시스(Arabidopsis) (Norris et al. 1993. Plant Molec. Biol. 21:895-906)에서 사용하기 위한 몇몇 식물 종으로부터 클로닝되었다. 메이즈 유비퀴틴 프로모터 (UbiP)는 트랜스제닉 단자엽 시스템에서 개발되었으며, 그의 서열 및 단자엽 형질전환을 위해 구축된 벡터는 특허 공개 EP 0 342 926에 개시되어 있다. 유비퀴틴 프로모터는 트랜스제닉 식물, 특히 단자엽식물에서의 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 발현에 적합하다. 또한, 문헌 [McElroy et al. (Mol. Gen. Genet. 231: 150-160 (1991))]에 의해 기재된 프로모터 발현 카세트는 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 발현을 위해 용이하게 변형될 수 있으며, 단자엽 숙주에 사용하는데 특히 적합하다.
또한, 엽록체에서 기능적인 프로모터가 사용될 수 있다. 이러한 프로모터의 비-제한적 예는 박테리오파지 T3 유전자 9 5' UTR 및 미국 특허 번호 7,579,516에 개시된 다른 프로모터를 포함한다. 본 발명에 유용한 다른 프로모터는 S-E9 소형 서브유닛 RuBP 카르복실라제 프로모터 및 쿠니츠(Kunitz) 트립신 억제제 유전자 프로모터 (Kti3)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 유용한 추가의 조절 요소는 인트론, 인핸서, 종결 서열 및/또는 5' 및 3' 비번역된 영역을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 유용한 인트론은 식물에서 확인되고 그로부터 단리되고, 이어서 식물의 형질전환에 사용되도록 발현 카세트 내로 삽입된 인트론일 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것인 바와 같이, 인트론은 자기-절제에 필요한 서열을 포함할 수 있고, 프레임 내에서 핵산 구축물/발현 카세트 내로 혼입된다. 인트론은 하나의 핵산 구축물에서 다수의 단백질-코딩 서열을 분리하기 위한 스페이서로서 사용될 수 있거나, 또는 인트론은 예를 들어, mRNA를 안정화시키기 위해 하나의 단백질-코딩 서열 내부에서 사용될 수 있다. 이들이 단백질-코딩 서열 내에서 사용되는 경우, 이들은 포함된 삭제 부위와 "프레임 내에서" 삽입된다. 인트론은 또한 발현을 개선시키거나 변형시키기 위해 프로모터와 회합될 수 있다.
본 발명에 유용한 인트론의 비-제한적 예는 ADHI 유전자 (예를 들어, Adh1-S 인트론 1, 2 및 6), 유비퀴틴 유전자 (Ubi1), 루비스코 소형 서브유닛 (rbcS) 유전자, 루비스코 대형 서브유닛 (rbcL) 유전자, 액틴 유전자 (예를 들어, 액틴-1 인트론), 피루베이트 데히드로게나제 키나제 유전자 (pdk), 니트레이트 리덕타제 유전자 (nr), 중복된 카르보닉 안히드라제 유전자 1 (Tdca1), psbA 유전자, atpA 유전자, 또는 이들의 임의의 조합으로부터의 인트론을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 핵산 구축물은 "발현 카세트"일 수 있거나, 또는 발현 카세트 내에 포함될 수 있다. 발현 카세트 및/또는 벡터는 본 발명의 1종 또는 1종 초과의 폴리뉴클레오티드 및/또는 핵산 구축물을 포함할 수 있다. 1종 초과의 폴리뉴클레오티드 및/또는 핵산 구축물이 발현 카세트 또는 벡터에 포함되는 경우, 1종 초과의 폴리뉴클레오티드 및/또는 핵산 구축물은 발현 카세트/핵산 구축물에서 "스태킹된" 것으로 간주될 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 식물은 또한 발현 카세트(들)의 발현 생성물을 임의의 조합으로 숙주 식물에 전달하는 부착된 다수의 공생체를 가질 수 있으며, 또한 "스태킹된" 것으로 간주될 수 있다. 이들은 스태킹된 형태(들)의 임의의 조합으로 숙주 식물에 대한 1종 이상의 발현 생성물을 생성하는데 사용되는 1종 이상의 폴리뉴클레오티드 및/또는 핵산 구축물을 갖는 발현 카세트의 사용을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "발현 카세트"는 관심의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자 (예를 들어, 본 발명의 핵산 구축물 (예를 들어, 합성 tracr 핵산 구축물, 합성 CRISPR 핵산 구축물, 합성 CRISPR 어레이, 키메라 핵산 구축물; 관심의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, cas9 뉴클레아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열))를 의미하고, 여기서 상기 뉴클레오티드 서열은 적어도 제어 서열 (예를 들어, 프로모터)과 작동가능하게 연관된다. 따라서, 본 발명의 일부 측면은 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 발현하도록 디자인된 발현 카세트를 제공한다.
관심의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트는 키메라일 수 있으며, 이는 그의 성분 중 적어도 하나가 그의 다른 성분 중 적어도 하나에 관하여 이종임을 의미한다. 발현 카세트는 또한 천연 발생이지만 이종 발현에 유용한 재조합 형태로 얻어진 것일 수 있다.
발현 카세트는 또한 선택된 숙주 세포에서 기능적인 전사 및/또는 번역 종결 영역 (즉, 종결 영역)을 임의로 포함할 수 있다. 다양한 전사 종결자는 발현 카세트에 사용하기 위해 이용가능하며, 관심의 이종 뉴클레오티드 서열을 지나 전사의 종결 및 정확한 mRNA 폴리아데닐화를 담당한다. 종결 영역은 전사 개시 영역에 대해 천연일 수 있거나, 작동가능하게 연결된 관심의 뉴클레오티드 서열에 대해 천연일 수 있거나, 숙주 세포에 대해 천연일 수 있거나, 또는 또 다른 공급원으로부터 유래될 수 있다 (즉, 프로모터에 대해, 관심의 뉴클레오티드 서열에 대해, 숙주에 대해 외래 또는 이종, 또는 이들의 임의의 조합).
발현 카세트는 또한 형질전환된 숙주 세포를 선택하는데 사용될 수 있는 선택가능한 마커에 대한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "선택가능한 마커"는 발현되는 경우 마커를 발현하는 숙주 세포에 대해 별개의 표현형을 부여하고 따라서 이러한 형질전환된 세포가 마커를 갖지 않는 것들로부터 구별되는 것을 허용하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 이러한 뉴클레오티드 서열은 마커가 화학적 수단에 의해, 예컨대 선택적 작용제 (예를 들어, 항생제 등)를 사용함으로써 선택될 수 있는 소질을 부여하는지 여부, 또는 마커가 단순히 관찰 또는 시험을 통해, 예컨대 스크리닝 (예를 들어, 형광)에 의해 확인할 수 있는 소질인지 여부에 따라, 선택가능한 또는 스크리닝가능한 마커를 코딩할 수 있다. 물론, 적합한 선택가능한 마커의 많은 예는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 본원에 기재된 발현 카세트에 사용될 수 있다.
발현 카세트 외에도, 본원에 기재된 핵산 분자 및 뉴클레오티드 서열은 벡터와 관련하여 사용될 수 있다. 용어 "벡터"는 핵산 (또는 핵산들)을 세포 내로 이송하거나, 전달하거나 도입하기 위한 조성물을 지칭한다. 벡터는 이송되거나, 전달되거나 도입되어야 하는 뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 숙주 유기체의 형질전환에 사용하기 위한 벡터는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 벡터의 일반적 부류의 비-제한적 예는 자기 전파가능하거나 동원가능할 수 있거나 그렇지 않을 수 있는 이중- 또는 단일-가닥 선형 또는 원형 형태의 바이러스 벡터, 플라스미드 벡터, 파지 벡터, 파지미드 벡터, 코스미드 벡터, 포스미드 벡터, 박테리오파지, 인공 염색체, 또는 아그로박테리움 종 이원성 벡터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에 정의된 바와 같은 벡터는 세포 게놈 내로의 통합에 의해 원핵생물 또는 진핵생물 숙주를 형질전환시키거나 염색체외로 존재할 수 있다 (예를 들어 복제 원점을 갖는 자율 복제 플라스미드). 추가적으로 포함되는 것은 셔틀 벡터이며, 이는 자연적으로 또는 디자인에 의해, 방선균 및 관련된 종, 박테리아 및 진핵생물 (예를 들어 고등 식물, 포유동물, 효모 또는 진균 세포)로부터 선택될 수 있는 2가지 상이한 숙주 유기체에서 복제가 가능한 DNA 비히클을 의미한다. 일부 대표적인 실시양태에서, 벡터 중의 핵산은 숙주 세포에서의 전사를 위해 적절한 프로모터 또는 다른 조절 요소의 제어 하에 있고, 그에 작동가능하게 연결된다. 벡터는 다수의 숙주에서 기능하는 이중-기능적 발현 벡터일 수 있다. 게놈 DNA의 경우, 이는 그 자신의 프로모터 또는 다른 조절 요소를 함유할 수 있고, cDNA의 경우, 이는 숙주 세포에서의 발현을 위해 적절한 프로모터 또는 다른 조절 요소의 제어 하에 있을 수 있다. 따라서, 본 발명의 핵산 분자 및/또는 발현 카세트는 본원에 기재된 바와 같은 및 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 벡터에 포함될 수 있다.
숙주 식물에 관하여 본원에 사용된 "변형시키는" 또는 "변형" 및 그의 문법적 파생어는 숙주 식물 게놈 또는 유전자형의 공동 변화 없는 적어도 1종의 숙주 식물 특징의 변화를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "접종하다", "접종하는", "접종된" 및 그의 문법적 파생어는 생물학적 실체 (즉, 식물)를 생물학적 활성을 갖는 조성물 (예를 들어, 공생체 형성 접종물)에 접촉시키는 작용을 지칭한다. 생물학적 활성을 갖는 조성물은 접종물 (예를 들어, 공생체 형성 접종물)로 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 "접촉시키다", "접촉시키는", "접촉된" 및 그의 문법적 파생어는 목적하는 반응 (예를 들어, 접종, 도입, 형질전환, 형질감염, 이식 등)을 수행하는데 적합한 조건 하에서 함께 목적하는 반응의 성분을 놓는 것을 지칭한다.
폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 식물호르몬 생합성 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 관심의 폴리뉴클레오티드)의 맥락에서 "도입하는", "도입하다", "도입된" (및 그의 문법적 파생어)은 폴리뉴클레오티드가 세포의 내부에의 접근을 얻도록 하는 방식으로 폴리뉴클레오티드를 숙주 유기체 또는 상기 유기체의 세포 (예를 들어, 숙주 세포)에 제시하는 것을 의미한다. 1종 초과의 폴리뉴클레오티드가 도입되는 경우, 이들 폴리뉴클레오티드는 단일 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 구축물의 일부로서, 또는 별개의 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 구축물로서 어셈블리될 수 있고, 동일한 또는 상이한 발현 구축물 또는 형질전환 벡터 상에 위치할 수 있다. 따라서, 이들 폴리뉴클레오티드는 단일 형질전환 사건에서, 별개의 형질전환/형질감염 사건에서 세포 내로 도입될 수 있거나, 또는, 예를 들어, 이들은 통상적인 육종 프로토콜에 의해 유기체 내로 혼입될 수 있다. 따라서, 본 발명의 일부 측면에서, 본 발명의 1종 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 구축물 (예를 들어, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 관심의 폴리뉴클레오티드)은 공생체를 생성하기 위한 공생체 형성 접종물로서 사용하기 위해 박테리아 세포 또는 식물 세포 내로 도입될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "이식하다", "이식하는", 또는 "이식" (및 그의 문법적 파생어)은 적어도 1종의 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 1종 이상의 폴리뉴클레오티드 및 1종 이상의 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 1개의 식물 세포 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 5000, 10,000, 100000개 또는 그 초과의 세포)를 숙주 식물 상의 적어도 1개의 부위 내로/상으로 삽입하는 프로세스를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "형질전환" 또는 "형질감염"은 세포 내로의 이종 핵산의 도입을 지칭한다. 세포의 형질전환은 안정하거나 일시적일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 숙주 세포 또는 숙주 유기체는 본 발명의 핵산 분자로 안정하게 형질전환된다. 다른 실시양태에서, 숙주 세포 또는 숙주 유기체는 본 발명의 재조합 핵산 분자로 일시적으로 형질전환된다.
폴리뉴클레오티드의 맥락에서 "일시적 형질전환"은 폴리뉴클레오티드가 세포 내로 도입되고, 세포의 게놈 내로 통합되지 않는 것을 의미한다.
세포 내로 도입된 폴리뉴클레오티드의 맥락에서 "안정하게 도입하는" 또는 "안정하게 도입된"이란 도입된 폴리뉴클레오티드가 세포의 게놈 내로 안정하게 혼입되고, 따라서 세포가 폴리뉴클레오티드로 안정하게 형질전환되는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 "안정한 형질전환" 또는 "안정하게 형질전환된"은 핵산 분자가 세포 내로 도입되고, 세포의 게놈 내로 통합되는 것을 의미한다. 따라서, 통합된 핵산 분자는 그의 자손에 의해, 보다 특히, 다수의 연속적 세대의 자손에 의해 유전될 수 있다. 본원에 사용된 "게놈"은 또한 핵 및 플라스티드 게놈을 포함하고, 따라서 예를 들어, 엽록체 또는 미토콘드리아 게놈 내로의 핵산의 통합을 포함한다. 본원에 사용된 안정한 형질전환은 또한 염색체외적으로, 예를 들어, 미니염색체 또는 플라스미드로서 유지되는 트랜스진을 지칭할 수 있다.
일시적 형질전환은 예를 들어, 유기체 내로 도입된 1종 이상의 트랜스진에 의해 코딩되는 펩티드 또는 폴리펩티드의 존재를 검출할 수 있는 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA) 또는 웨스턴 블롯, 또는 질량 분광분석법에 의해 검출될 수 있다. 세포의 안정한 형질전환은 예를 들어, 유기체 (예를 들어, 식물, 포유동물, 곤충, 고세균, 박테리아 등) 내로 도입된 트랜스진의 뉴클레오티드 서열과 특이적으로 혼성화하는 핵산 서열을 갖는 세포의 게놈 DNA의 서던 블롯 혼성화 검정에 의해 검출될 수 있다. 세포의 안정한 형질전환은 예를 들어, 식물 또는 다른 유기체 내로 도입된 트랜스진의 뉴클레오티드 서열과 특이적으로 혼성화하는 핵산 서열을 갖는 세포의 RNA의 노던 블롯 혼성화 검정에 의해 검출될 수 있다. 세포의 안정한 형질전환은 또한 예를 들어, 트랜스진의 표적 서열(들)과 혼성화하는 특이적 프라이머 서열을 채용하여, 표준 방법에 따라 검출될 수 있는 트랜스진 서열의 증폭을 발생시키는 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 또는 다른 증폭 반응에 의해 검출될 수 있다. 형질전환은 또한 관련 기술분야에 널리 공지된 직접 시퀀싱 및/또는 혼성화 프로토콜에 의해 검출될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 핵산 구축물, 발현 카세트는 공생체의 게놈 또는 공생체 형성 접종물의 세포 내로 안정하게 혼입된다.
본 발명의 재조합 핵산 분자/폴리뉴클레오티드는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 본 발명의 방법은 이들이 유기체의 적어도 1개의 세포의 내부에의 접근을 얻는 것을 제외하고는, 1종 이상의 뉴클레오티드 서열을 유기체 내로 도입하기 위한 특정 방법에 의존하지 않는다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 세포의 형질전환은 핵 형질전환을 포함한다. 다른 실시양태에서, 세포의 형질전환은 플라스티드 형질전환 (예를 들어, 엽록체 형질전환)을 포함한다.
식물 및 박테리아 세포를 포함한 원핵생물 및 진핵생물 유기체 둘 다를 형질전환시키기 위한 절차는 널리 공지되어 있고 관련 기술분야에서 통상적이며, 문헌 전반에 걸쳐 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Jiang et al. 2013. Nat. Biotechnol. 31:233-239]; [Ran et al. Nature Protocols 8:2281-2308 (2013)] 참조). 형질전환 방법의 비-제한적 예는 박테리아-매개된 핵산 전달 (예를 들어, 아그로박테리아를 통한), 바이러스-매개된 핵산 전달, 탄화규소 또는 핵산 위스커-매개된 핵산 전달, 리포솜 매개된 핵산 전달, 미세주사, 미세입자 포격, 인산칼슘-매개된 형질전환, 시클로덱스트린-매개된 형질전환, 전기천공, 나노입자-매개된 형질전환, 초음파처리, 침윤, PEG-매개된 핵산 흡수, 뿐만 아니라 식물 세포 내로의 핵산의 도입을 발생시키는 임의의 다른 전기적, 화학적, 물리적 (기계적) 및/또는 생물학적 메커니즘 (이들의 임의의 조합을 포함함)을 통한 형질전환을 포함한다. 관련 기술분야에 공지된 다양한 식물 형질전환 방법에 대한 일반적 지침은 문헌 [Miki et al. ("Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E., Eds. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993), pages 67-88)] 및 [Rakowoczy-Trojanowska (Cell. Mol. Biol. Lett. 7:849-858 (2002))]을 포함한다. 효모의 형질전환에 대한 일반적 지침은 문헌 [Guthrie and Fink (1991) (Guide to yeast genetics and molecular biology. In Methods in Enzymology, (Academic Press, San Diego) 194:1-932)]을 포함하고, 박테리아의 형질전환에 관한 방법에 대한 지침은 문헌 [Aune and Aachmann (Appl. Microbiol Biotechnol 85:1301-1313 (2010))]을 포함한다.
1종 초과의 폴리뉴클레오티드가 도입되는 경우, 이들은 단일 핵산 구축물의 일부로서, 또는 별개의 핵산 구축물로서 어셈블리될 수 있고, 동일한 또는 상이한 핵산 구축물 상에 위치할 수 있다. 따라서, 뉴클레오티드 서열은 단일 형질전환 사건에서, 또는 별개의 형질전환 사건에서 관심의 세포 내로 도입될 수 있거나, 또는, 대안적으로, 관련되는 경우, 뉴클레오티드 서열은 육종 프로토콜의 일부로서 식물 내로 혼입될 수 있다.
본 발명에서 용어 "T-DNA"는 아그로박테리움에 의해 감염된 식물의 (그 내로 형질전환된) 게놈에 전달되는 관련 기술분야에 널리 공지된 아그로박테리움 종에서의 DNA 절편인 운반 DNA를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "단일-균주 접종"은 단일 박테리아 균주로의 식물 세포의 접종을 지칭하고, 여기서 식물 세포를 형질전환시키기 위한 바람직한 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 적어도 1종의 관심의 폴리뉴클레오티드는 단일 박테리아 균주에 존재한다.
본원에 사용된 용어 "공동-접종"은 적어도 2종의 박테리아 균주로의 식물 세포의 접종을 지칭하고, 여기서 한 균주는 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 운반하고, 별개의 균주는 식물 세포를 형질전환시키기 위해 필요한 적어도 1종의 관심의 폴리뉴클레오티드를 운반한다.
본원에 사용된 "공생체 형성 접종물"은 숙주 식물을 접종하여 본원에 기재된 바와 같은 공생체를 생산하는데 사용될 수 있는 조성물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, "공생체 형성 접종물"은 본원에 기재된 바와 같은 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 본원에 기재된 바와 같은 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구축물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, "공생체 형성 접종물"은 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 또는 식물 세포)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, "공생체 형성 접종물"은 공생체로부터 취해질 수 있고, 공생체의 단일 세포 또는 1개 초과의 세포 (예를 들어, 공생체의 부분, 예를 들어, 약 0.005 마이크로그램 내지 약 1 그램의 공생체; 예를 들어, 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 마이크로그램 내지 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000 밀리그램, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값)를 포함할 수 있다.
"식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드"는 1종 또는 1종 초과의 식물호르몬 생합성 효소 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5종 또는 그 초과)를 코딩하는 1종 또는 1종 초과의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5종 또는 그 초과)를 지칭하고, 여기서 1종 또는 1종 초과의 식물호르몬 생합성 효소는 본원에 기재된 바와 같은 임의의 시토키닌 생합성 효소 및/또는 옥신 생합성 효소일 수 있다. 일부 실시양태에서, 식물호르몬 생합성 효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 박테리아 종으로부터의 것, 예를 들어, 박테리아 옥신 생합성 효소 또는 박테리아 시토키닌 생합성 효소 (예를 들어, 아그로박테리움 종 (예를 들어, 에이. 투메파시엔스(A. tumefaciens), 에이. 파브룸(A. fabrum), 에이. 리조게네스(A. rhizogenes), 에이. 비티스(A. vitis)), 리조비움(Rhizobium) 종 (알. 투메리게네스(R. tumerigenes), 알. 스키에르니에위센스(R. skierniewicense), 알. 루시타눔(R. lusitanum)), 슈도모나스 사바스타노이(Pseudomonas savastanoi))일 수 있다. 일부 실시양태에서, 식물호르몬 생합성 효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 식물 종으로부터의 것, 예를 들어, 식물 옥신 생합성 효소 또는 식물 시토키닌 생합성 효소 (예를 들어, 오리자 사비타(Oryza sativa), 제아 메이스, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana))일 수 있다. 일부 실시양태에서, 식물호르몬 생합성 효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 곤충 종으로부터의 것일 수 있거나, 또는 식물호르몬의 유사체일 수 있다. 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 예시 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호(SEQ ID NO):1, 3, 5 또는 21의 뉴클레오티드 서열 또는 이와 적어도 약 80% 동일성 (예를 들어, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성)을 갖는 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호:2, 4, 6 내지 20, 22 또는 23의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 약 80% 동일성 (예를 들어, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성)을 갖는 아미노산 서열 중 어느 하나를 코딩한다. 본 발명에 유용한 예시 식물호르몬 생합성 폴리펩티드는 서열식별번호:2, 4, 6 내지 20, 22 또는 23의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 약 80% 동일성 (예를 들어, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성)을 갖는 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 식물호르몬 생합성 효소는 옥신 생합성 효소이다. 본 발명에 유용한 옥신 생합성 효소는 인돌-3-아세트아미드 히드롤라제 (예를 들어, iaaH, TMS2, AUX2) (E.C. 번호: EC 3.5.1.4), 아미다제 1 (예를 들어, AtAMI1) (EC 3.5.1.4), 트립토판 2-모노옥시게나제 (예를 들어, iaaM, TMS1, AUX1) (EC 1.13.12.3), 인돌-3-락테이트 신타제 (EC 1.1.1.110), L-트립토판--피루베이트 아미노트랜스퍼라제 1 (예를 들어, TAA1, TIR2, CKRC1, SAV3, WEI8) (EC 2.6.1.99), 트립토판 아미노트랜스퍼라제-관련된 단백질 1 (예를 들어, TAR1) (EC 2.6.1.27), 인돌-3-아세트알데히드 옥시다제 (예를 들어, IAA 옥시다제, AO1, Ao-1, AtAO-1, ZmAO1, NtAO1, AtAO1) (EC 1.2.3.7), 및/또는 트립토판 데카르복실라제 1 (TDC1)/트립토판 데카르복실라제 2 (TDC2) (EC4.1.1.105)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 식물호르몬 생합성 효소는 시토키닌 생합성 효소이다. 본 발명에 유용한 시토키닌 생합성 효소는 이소펜테닐 트랜스퍼라제 (Ipt) (동의어: 아데노신 포스페이트-이소펜테닐트랜스퍼라제; 아데닐레이트 디메틸알릴트랜스퍼라제; (디메틸알릴)아데노신 tRNA 메틸티오트랜스퍼라제) (E.C. 번호: 2.5.1.27 또는 2.5.1.75 또는 2.5.1.112) 및/또는 Tzs (동의어: 디메틸 트랜스퍼라제, 이소펜테닐 트랜스퍼라제, 트랜스-제아틴 생산 단백질, 아데닐레이트 디메틸알릴트랜스퍼라제) (EC 2.5.1.27)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 식물 세포의 자율적 분열을 개시하여 본원에 기재된 바와 같은 공생체 형성 접종물 및 공생체를 형성할 수 있는 식물호르몬 생합성 효소의 임의의 조합은 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 이용될 수 있는 식물호르몬 생합성 효소 조합은 서열식별번호:1/2 및 서열식별번호:3/4 및 임의로, 서열식별번호:5/6; 서열식별번호:8 및 서열식별번호:9; 서열식별번호:10 및 서열식별번호:11; 및/또는 서열식별번호:12 및 서열식별번호:13을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 식물 세포에서 자율적 복제를 개시할 수 있는 옥신 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 시토키닌 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 임의의 조합은 본원에 기재된 바와 같은 공생체 및 공생체 형성 접종물을 생성하는데 사용될 수 있다.
"관심의 폴리뉴클레오티드"는 공생체에서의 발현을 위한, 및 임의로 공생체가 1개 또는 1개 초과의 부위에서 부착되는 숙주 식물 내로 공생체로부터 수송된 분자 (예를 들어, 1종 또는 1종 초과의 폴리펩티드, 펩티드, 코딩 RNA 또는 비-코딩 RNA; 예를 들어, 생물활성 분자)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 관심의 폴리뉴클레오티드는 생물활성 분자를 코딩할 수 있거나, 또는 생물활성 분자에 대한 생합성 효소 (예를 들어, 생물활성 분자의 생합성에 관여하는 폴리펩티드)를 코딩할 수 있다.
본원에 사용된 "숙주 식물 특징을 변형시키는"은 숙주 식물 상의 본 발명의 공생체의 성장에 의해 숙주 식물의 적어도 하나의 측면 또는 반응을 변경시키는 것을 의미한다. 이러한 측면은 살곤충 생체분자, 항미생물 생체분자 (항박테리아제, 항진균제), 살선충 생체분자, 항바이러스 생체분자, 제초 생체분자, 제초제 저항성/내성을 부여하는 생체분자, 질환 저항성/내성을 부여하는 생체분자, 비생물적 스트레스 저항성/내성을 부여하는 생체분자, 식물 구조 및 성장/형태학을 변형시키는 생체분자 (예를 들어, 성장/형태학에 영향을 미치는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 및 다른 인자 (예를 들어, 비-코딩 핵산), 식물호르몬 등), 생물자극제, RNA, 압타머, 및/또는 제약을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 그렇지 않다면 숙주 식물에서 발견되지 않거나 또는 숙주 식물에서 감소된 양으로 발견되는 (예를 들어, 공생체를 포함하지 않는 숙주 식물에서 발견되지 않거나 또는 감소된 양으로 존재하는) (공생체에서 생산되고 숙주 식물로 수송된) 생체분자의 존재를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, "변형된 숙주 식물 특징"은 숙주 식물에서 정상적으로 발견될 수 있는 양에 비해 증가된 (예를 들어, 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100% 증가된) 양의 생체분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, "변형된 숙주 식물 특징"은 예를 들어, 곤충, 제초제, 식물 병원체 (예를 들어, 식물 병원성 박테리아, 진균, 및/또는 바이러스), 선충, 환경적 인자 (예를 들어, 열, 추위, 염분 등)에 대한 변경된 반응을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 특징을 갖는 숙주 식물은 숙주 식물을 생산하고 이에 제초제를 수송하고, 그에 의해 숙주 식물을 살해하는 공생체를 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 변형된 숙주 식물 특징은 제초 생체분자의 존재 및 숙주 식물의 사멸일 수 있다. 일부 실시양태에서, "숙주 식물 특징을 변형시키는"은 숙주 식물의 2종 이상의 특징 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10종 또는 그 초과의 특징)을 변형시키는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 공생체를 포함하는 숙주 식물의 변형된 특징은 본 발명의 공생체를 포함하지 않는 숙주 식물에 그렇지 않다면 존재하지 않는 (또는 감소된 양으로 존재하는) 2종 이상의 생체분자 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10종 또는 그 초과)의 존재일 수 있고/거나, 본 발명의 공생체를 포함하는 숙주 식물의 변형된 특징은 본 발명의 공생체를 포함하지 않는 숙주 식물에서 그렇지 않다면 관찰되지 않는 2종 이상의 변경된 또는 변형된 반응을 포함할 수 있다. 본 발명의 공생체를 포함하는 숙주 식물에서 2종 이상의 변형된 특징 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10종 또는 그 초과의 변형된 특징)을 얻기 위해, 식물 상의 공생체는 2종 이상의 POI를 포함할 수 있고/거나, 공생체는 2종 이상의 공생체 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10종 또는 그 초과의 공생체)를 포함할 수 있고, 여기서 2종 이상의 공생체 중 적어도 2종은 각각 또 다른 공생체에 포함되는 POI와는 상이한 적어도 1종의 POI를 포함한다.
본원에 사용된 "공생체"는 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 1종 이상의 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드 상의) 및 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 세포 또는 복수의 식물 세포를 지칭하고, 여기서 1종 이상의 식물호르몬 생합성 효소는 시토키닌 생합성 효소 및/또는 옥신 생합성 효소이고, 공생체는 숙주 식물 상에서 성장하고 있다. "공생체"의 세포(들)는 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현으로 인해 자율적으로 분열한다. "공생체"는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 또는 10,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000 또는 100,000개 또는 그 초과의 세포를 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 공생체는 적어도 1종의 pSYM, 1종 이상의 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10종 또는 그 초과의) 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10종 또는 그 초과의 폴리뉴클레오티드) 및 적어도 1종의 (예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10종 또는 그 초과의) 관심의 폴리뉴클레오티드(들) (POI)를 포함하는 플라스미드를 포함하는 단일 식물 세포일 수 있거나, 또는 이는 각각 적어도 1종의 pSYM, 1종 이상의 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드 및 적어도 1종의 관심의 폴리뉴클레오티드 (POI)를 포함하는 플라스미드를 포함하는 2개 이상의 세포를 포함할 수 있다. 공생체의 세포는 자율적으로 분열하며, 이는 식물 상에 비분화된 다세포 구조를 형성한다. 일부 실시양태에서, 형성되는 비분화된 다세포 구조 (예를 들어, 공생체)는 예를 들어, 마디, 식물 푸드 바디, 도마티아, 꽃밖 꿀샘, 뿌리혹, 식물 신생물 또는 벌레혹과 시각적으로 유사할 수 있지만, 이는 적어도 공생체에서 발현되는 트랜스진에 의해 생화학적으로/유전적으로 별개이다.
일부 실시양태에서, 공생체는 원래 숙주 식물로부터 분리되고/거나, 실험실 환경에서 배양되고/거나, 또 다른 식물 상으로 이식될 수 있다 (예를 들어, 공생체 형성 접종물로서 사용될 수 있음). 공생체 또는 공생체로부터의 적어도 1개의 세포가 배양되는 경우, 시간 경과에 따라 형성되고 숙주 식물로부터 분리된 원래 물질로부터 번식된 새로운 공생체 물질을 지칭하는 "어린 공생체 물질"이 사용될 수 있다.
본 발명은 숙주 식물의 게놈을 변형시키지 않으면서 적어도 1종의 변형된 특징을 포함하는 숙주 식물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 숙주 식물의 게놈을 변형시키지 않으면서 적어도 1종의 변형된 특징을 포함하는 숙주 식물을 제조하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 옥신 및 시토키닌 유전자가 식물 세포에서 발현되는 경우 식물 세포가 자율적으로 분열하는 것을 유발하여 비분화된 다세포 구조를 형성할 수 있다는 이해를 이용한다. 사실, 이러한 구조는 예를 들어, 아그로박테리움 종에 의한 식물의 감염에 의해 개시되는 벌레혹을 포함한다. 자율적으로 분열하는 세포를 생성하는 이 능력은 자율적으로 분열하는 세포에서 관심의 폴리뉴클레오티드 (POI)의 발현과 함께 본 발명자들에 의해 이용되어 POI(들)의 발현을 통해 생성물을 생산하는 비분화된 다세포 구조 (공생체)를 생성한다. 이러한 비분화된 다세포 구조가 숙주 식물에서 성장될 수 있음을 이해하여, 본 발명자들은 이제 POI를 발현하는 본 발명의 비분화된 다세포 구조 (본 발명의 공생체)가 생성물을 숙주 식물에 전달하고 숙주 식물의 게놈을 변형시키지 않으면서 숙주 식물의 특징(들)을 변형시키는데 사용될 수 있음을 고유하게 보였다. 이러한 식물 (예를 들어, 숙주 식물) 및 관련된 생성물 (공생체 및 공생체 형성 접종물)은 본원에 기재된 바와 같은 방법 및 조성물의 다양한 실시양태 및 본 개시내용의 관점에서 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이고 본 발명으로부터 벗어나지 않는 본원에서 제공된 다양한 실시양태에 대한 다수의 변동 및 첨가를 사용하여 생산된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 식물호르몬 생합성 효소는 적어도 1종의 시토키닌 생합성 효소 및/또는 옥신 생합성 효소인 공생체 형성 접종물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 공생체 형성 접종물은 숙주 식물에 전달되어 본원에 기재된 바와 같은 공생체를 생산할 수 있는 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 조성물 (예를 들어, pSYM)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 공생체 형성 접종물은 식물 (예를 들어, 숙주 식물)의 적어도 1개의 부위 상으로 이식되어 본원에 기재된 바와 같은 공생체를 생산할 수 있는 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 (예를 들어, pSYM을 포함하는) 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 또는 식물 세포)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 구축물은 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 적어도 1종의 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 식물호르몬 생합성 효소는 시토키닌 생합성 효소 및/또는 옥신 생합성 효소이다. 본원에 기재된 바와 같이, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 1종 이상의 식물호르몬 생합성 효소를 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 식물호르몬 생합성 효소는 1종 초과의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다. 즉, 1종 초과의 식물호르몬 생합성 효소가 핵산 구축물에 포함되는 경우, 이는 동일한 폴리뉴클레오티드 상에서 또는 별개의 폴리뉴클레오티드 상에서 코딩될 수 있다.
본 발명의 공생체 형성 접종물에 유용한 식물호르몬 생합성 효소는 식물 세포에서 발현되어 자율적으로 분열하거나 복제하는 식물 세포를 생산하고, 임의로 캘러스 배양물, 현탁 배양물 및/또는 비분화된 다세포 구조를 생산할 수 있는 임의의 옥신 또는 시토키닌 생합성 효소일 수 있다. 일부 실시양태에서, 식물호르몬 생합성 효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 박테리아 종으로부터의 것, 예를 들어, 박테리아 옥신 생합성 효소 또는 박테리아 시토키닌 생합성 효소일 수 있다. 일부 실시양태에서, 식물호르몬 생합성 효소 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 식물 종으로부터의 것, 예를 들어, 식물 옥신 생합성 효소 또는 식물 시토키닌 생합성 효소일 수 있다. 본 발명에 유용한 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 예시 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호:1, 3, 5 또는 21의 뉴클레오티드 서열 또는 이와 적어도 약 80% 동일성 (예를 들어, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성)을 갖는 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호:2, 4, 6 내지 20, 22 또는 23의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 약 80% 동일성 (예를 들어, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성)을 갖는 아미노산 서열 중 어느 하나를 코딩한다. 본 발명에 유용한 예시 식물호르몬 생합성 폴리펩티드는 서열식별번호:2, 4, 6 내지 20, 22 또는 23의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 약 80% 동일성 (예를 들어, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성)을 갖는 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 식물호르몬 생합성 효소는 옥신 생합성 효소이다. 본 발명에 유용한 옥신 생합성 효소는 인돌-3-아세트아미드 히드롤라제 (iaaH) (E.C. 번호: EC 3.5.1.4), 아미다제 1 (EC 3.5.1.4), 트립토판 2-모노옥시게나제 (IaaM) (EC 1.13.12.3), 인돌-3-락테이트 신타제 (EC 1.1.1.110), L-트립토판--피루베이트 아미노트랜스퍼라제 1 (EC 2.6.1.99), 트립토판 아미노트랜스퍼라제-관련된 단백질 1 (EC 2.6.1.27), 인돌-3-아세트알데히드 옥시다제 (EC 1.2.3.7), 및/또는 트립토판 데카르복실라제 1/트립토판 데카르복실라제 2 (EC4.1.1.105)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 식물호르몬 생합성 효소는 시토키닌 생합성 효소이다. 본 발명에 유용한 시토키닌 생합성 효소는 이소펜테닐 트랜스퍼라제 (Ipt) (동의어: 아데노신 포스페이트-이소펜테닐트랜스퍼라제; 아데닐레이트 디메틸알릴트랜스퍼라제; (디메틸알릴)아데노신 tRNA 메틸티오트랜스퍼라제) (E.C. 번호: 2.5.1.27 또는 2.5.1.75 또는 2.5.1.112) 및/또는 Tzs (동의어: 디메틸 트랜스퍼라제, 이소펜테닐 트랜스퍼라제, 트랜스-제아틴 생산 단백질, 아데닐레이트 디메틸알릴트랜스퍼라제) (EC 2.5.1.27)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 인돌-3-아세트아미드 히드롤라제 (예를 들어, iaaH, Aux2, Tms2) (E.C. 번호: EC 3.5.1.4)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호:1과 적어도 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 인돌-3-아세트아미드 히드롤라제 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호:2, 7, 9, 11, 또는 13 중 어느 하나와 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인돌-3-아세트아미드 히드롤라제는 서열식별번호:2, 7, 9, 11, 또는 13의 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 실시양태에 유용한 추가의 예시적인 인돌-3-아세트아미드 히드롤라제 (및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드)에 대한 수탁 번호 (유니프롯(UniProt)/NCBI)는 P06618, AAD30488.1, WP_010974823.1, WP_172691448.1, WP_172690897.1, WP_10891462.1, WP_172691118.1, NSZ87871.1, BAA76345.1, CAA39649.1 WP_070167543.1, P25016.1, WP_156536347.1, NSY72470.1, WP_156536347.1, WP_156638711.1, WP_045231698.1, WP_174183178.1, 및/또는 AAB41868.1을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 아미다제 1 (예를 들어, AMI1, AtAMI1) (EC 3.5.1.4)은 서열식별번호:14 (At1GO8980)의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 아미다제 1 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호:14와 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 트립토판 2-모노옥시게나제 (예를 들어, IaaM, Tms1, Aux1) (EC 1.13.12.3)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호:3의 뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호:3과 적어도 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 트립토판 2-모노옥시게나제 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호:4, 8, 10, 또는 12 중 어느 하나와 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 트립토판 2-모노옥시게나제는 서열식별번호:4, 8, 10, 또는 12의 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 추가의 예시적인 트립토판 2-모노옥시게나제 (및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드)에 대한 수탁 번호 (유니프롯/NCBI)는 P25017, AAD30489.1, BAA76346.1, AYM09598.1, AYM14954.1, AYM61129.1 CAB44640.1, CUX71287.1, WP_040132230.1, AAF77123.1, WP_104680323.1, P25017.1, P0A3V2.1, MBB3947410.1, WP_162163087.1, NSY99416.1, AKC10880.1, AVH45197.1, 및/또는 AYDO4913.1을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 인돌-3-락테이트 신타제 (EC 1.1.1.110)는 서열식별번호:6의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 인돌-3-락테이트 신타제 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호:5의 뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호:5와 적어도 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, 인돌-3-락테이트 신타제 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호:6과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩한다. 본 발명에 유용한 추가의 예시적인 인돌-3-락테이트 신타제에 대한 수탁 번호 (유니프롯)는 WP_052675630.1, WP_083212579.1, WP_172691447.1 및/또는 WP_010891463.1을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 L-트립토판--피루베이트 아미노트랜스퍼라제 1 (예를 들어, TAA1, TIR2, CKRC1, SAV3, WEI8) (EC 2.6.1.99)은 서열식별번호:15 (유니프롯 Q927N2)의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, L-트립토판--피루베이트 아미노트랜스퍼라제 1 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호:15와 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 트립토판 아미노트랜스퍼라제-관련된 단백질 1 (예를 들어, TAR1) (EC 2.6.1.27)은 서열식별번호:16 (유니프롯 Q9LR29)의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 트립토판 아미노트랜스퍼라제-관련된 단백질 1 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호:16과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 인돌-3-아세트알데히드 옥시다제 (예를 들어, IAA 옥시다제, AO-1, AO1, zmAO1, NtAO1, AtAO1, AtAO-1) (EC 1.2.3.7)는 서열식별번호:17 (유니프롯 O23887) 및/또는 서열식별번호:18 (유니프롯 Q7G193)의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인돌-3-아세트알데히드 옥시다제 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호:17 및/또는 서열식별번호:18과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 트립토판 데카르복실라제 1 (예를 들어, TDC1) 및/또는 트립토판 데카르복실라제 2 (예를 들어, TDC2) (EC4.1.1.105)는 식물 세포에서 자율적 세포 분열을 개시하기 위해 본 발명에 사용될 수 있다. 본 발명에 유용한 트립토판 데카르복실라제 1은 서열식별번호:19 (유니프롯 Q6ZJK7)의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것들을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 트립토판 데카르복실라제 1 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호:19와 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 트립토판 데카르복실라제 2 (예를 들어, TDC2) (EC4.1.1.105)는 서열식별번호:20 (유니프롯 Q7XHL3)의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것들을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 트립토판 데카르복실라제 2 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호:20과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩한다.
식물 세포에서 자율적 세포 분열을 개시하는데 유용한 시토키닌 생합성 효소는 이소펜테닐 트랜스퍼라제 (Ipt)로 지칭되는 시토키닌 생합성 효소를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. Ipt 효소에 대한 동의어는 아데노신 포스페이트-이소펜테닐트랜스퍼라제; 아데닐레이트 디메틸알릴트랜스퍼라제; (디메틸알릴)아데노신 tRNA 메틸티오트랜스퍼라제) (E.C. 번호: 2.5.1.27, 2.5.1.75 또는 2.5.1.112)를 포함한다. 일부 실시양태에서, Ipt를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호:21의 뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호:21과 적어도 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 Ipt 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호:22 중 어느 하나와 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 Ipt는 서열식별번호:22와 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 추가의 예시적인 Ipt 폴리펩티드에 대한 수탁 번호 (유니프롯/NCBI)는 WP_010891460.1, NZ87873.1; WP_172690592.1; CAB44641.1, WP_172690722.1; BAA76344.1; WP_156638720.1, WP_104680324.1, NTA56762.1, WP_010892365.1, AAB41870.1; WP_032488312.1, WP_156536348.1, WP_065657522.1; WP_0324488268.1; AAZ50399.1, WP_080830665.1; AYM20353.1, WP_174005331.1, WP_173994930.1, WP_111221726.1, WP032489582.1, WP_174156215.1, WP_17404522.5.1, WP_070167542.1, WP_172691205.1 및/또는 CAA54540.1을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
추가의 시토키닌 생합성 효소는 아데닐레이트 디메틸알릴트랜스퍼라제 효소 (예를 들어, tzs) (EC 2.5.1.27)를 포함한다. Tzs 효소에 대한 동의어는 디메틸 트랜스퍼라제, 이소펜테닐 트랜스퍼라제, 트랜스-제아틴 생산 단백질, 및 아데닐레이트 디메틸알릴트랜스퍼라제를 포함한다. 본 발명에 유용한 Tzs 폴리펩티드는 서열식별번호:23 (유니프롯 P14011)의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것들을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, Tzs 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호:23과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩한다.
옥신 및 시토키닌 생합성 효소 및/또는 옥신 및 시토키닌 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 본원에 기재된 것들의 임의의 조합은 공생체 및/또는 공생체 형성 접종물의 생산에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 구축물에서 코딩되는 식물호르몬 생합성 효소는 인돌-3-아세트아미드 히드롤라제 (iaaH), 트립토판 2-모노옥시게나제 (IaaM), 및/또는 이소펜테닐 트랜스퍼라제 (Ipt)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 구축물은 인돌-3-락테이트 신타제인 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명자들은 본원에 기재된 바와 같은 식물 세포에서 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현이 식물, 예컨대 피칸, 시트러스, 감자, 토마토 및 니코티아나 벤타미아나 상의 비분화된 세포 성장 및 공생체 형성을 유도할 수 있음을 보였다. 근두 암종 및 다른 유사한 장애와 관련된 문헌으로부터, 시토키닌 및 옥신의 증가된 수준이 T-DNA 함유 식물호르몬 생합성 효소 (예를 들어, IaaH, IaaM 및 Ipt)의 식물 게놈 통합으로부터 초래되고, T-DNA로 형질전환된 세포에 의한 옥신 및 시토키닌의 상승된 생산이 세포 분열을 촉진시킴이 이해된다. 본 발명자들은 본 발명의 개발 및 따라서 본 발명의 공생체 및 공생체 형성 접종물 뿐만 아니라 그의 게놈에서 변형을 갖지 않는 변형된 특징을 갖는 숙주 식물의 생산에 있어서 이 지식을 이용하였다. 비분화된 캘러스 성장은 상승된 옥신 및 시토키닌 수준 및 상대적으로 높은 시토키닌 대 옥신 비의 유지 모두의 결과이다. 시토키닌 및 옥신의 상승은 전형적으로 비-종양형성성 조직에서 관찰되는 것보다 2배 내지 100배 초과 더 높다. 예를 들어, 담배 세포에서 관찰된 시토키닌 대 옥신 비는 약 40:1이다. 일반적으로, 시토키닌 대 옥신의 비는 자율적 분열의 개시 및 비분화된 성장의 형성을 위해 약 5:1 내지 약 50:1의 범위이다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 비분화된 성장을 생성하는데 필요한 시토키닌 대 옥신의 비는 식물 종 및 상이한 식물호르몬 수준을 검출하는데 사용되는 분석적 방법에 기반하여 다양할 수 있다.
일부 실시양태에서, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 핵산 구축물을 포함하고, 여기서 식물호르몬 생합성 효소는 시토키닌 생합성 효소 및 옥신 생합성 효소이지만, 본원에 기재된 바와 같은 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는 식물 세포는 "활성화된 세포"로 지칭될 수 있다. 따라서, 본원에 사용된 "활성화된 세포"는 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 식물호르몬 생합성 효소는 자율적으로 복제하는 시토키닌 생합성 효소 및 옥신 생합성 효소인 식물 세포를 지칭한다. 이러한 활성화된 세포는 "활성화된 조직"을 생성하는데 사용될 수 있다. 관심의 폴리뉴클레오티드가 활성화된 세포 또는 활성화된 조직의 세포 내로 도입되면, 활성화된 식물 세포 또는 조직은 공생체 형성 접종물로 지칭될 수 있다. 공생체는 공생체 형성 접종물을 숙주 식물의 적어도 1개의 부위 상으로 이식함으로써 생산된다. 세포 (1개 이상의 세포 (예를 들어, 조직))는 다양한 목적을 위해 공생체로부터 취해질 수 있기 때문에, 이들 세포 (또는 조직)는 그 자체가 공생체로 지칭될 수 있거나, 또는 숙주 식물 상의 적어도 1개의 부위 상으로 이식된 경우 공생체 형성 접종물로 간주될 수 있다.
일부 실시양태에서, 자연적으로 형성된 벌레혹, 마디, 식물 푸드 바디, 도마티아, 꽃밖 꿀샘, 뿌리혹, 식물 신생물 및/또는 자율적으로 복제하는 배유로부터의 세포는 공생체 형성 접종물을 생성하는데 사용될 수 있다. 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 자연적으로 포함하는 이들과 같은 구조로부터의 세포는 자율적으로 복제하고 있다. 이러한 세포는 세포(들)를 적어도 1종의 POI로 형질전환시킴으로써 공생체 형성 접종물을 생성하는데 사용될 수 있고, 여기서 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 적어도 1종의 POI를 갖는 세포를 포함하는 공생체 형성 접종물이 생산된다. 다른 공생체 형성 접종물과 유사하게, 이 방식으로 생성된 공생체 형성 접종물은 또한 숙주 식물 상의 공생체를 생산하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 공생체 형성 접종물에 유용한 관심의 폴리뉴클레오티드는 공생체에서의 발현을 위해 본원에 기재된 바와 같은 분자 (예를 들어, 1종 또는 1종 초과의 폴리펩티드, 펩티드, 코딩 RNA 또는 비-코딩 RNA; 예를 들어, 생물활성 분자)를 코딩하고, 임의로 공생체로부터 공생체가 1개 또는 1개 초과의 부위에서 부착되는 숙주 식물 내로 수송되고, 임의로 여기서 숙주 식물 내로 수송되는 경우, 분자는 숙주 식물의 유전자형 또는 게놈을 변경시키지 않으면서 숙주 식물 상으로 새로운 특징을 부여할 수 있는 것인 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 관심의 폴리뉴클레오티드는 생체분자 및/또는 생물활성 분자를 코딩할 수 있고/거나, 본원에 기재된 바와 같은 생체분자 및/또는 생물활성 분자에 대한 생합성 효소 (예를 들어, 생체분자 및/또는 생물활성 분자의 생합성에 관여하는 폴리펩티드)를 코딩할 수 있다. 공생체 형성 접종물에 포함되는 "관심의 폴리뉴클레오티드"는 1종의 관심의 폴리뉴클레오티드일 수 있거나, 또는 2종 이상의 관심의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 2종 이상의 관심의 폴리뉴클레오티드가 공생체 형성 접종물에 포함되는 경우, 공생체 형성 접종물은 "스태킹된" 공생체 형성 접종물로 지칭될 수 있다. 스태킹된 공생체 형성 접종물은 숙주 식물 상의 1종 이상의 스태킹된 공생체를 형성하는데 사용될 수 있다. 스태킹의 추가의 예로서, 공생체 형성 접종물이 박테리아 세포를 포함하는 경우, 박테리아 세포는 1개의 플라스미드 또는 적어도 2개의 상이한 플라스미드 상에 적어도 2종의 상이한 POI를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 구축물은 플라스트 폴리펩티드 (예를 들어, 가소성 폴리펩티드)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 유용한 플라스트 폴리펩티드는 본 발명의 핵산 구축물을 사용하여 형성된 공생체의 형태학 및 구조에 대한 유익을 부여할 수 있는 현재 공지된 또는 나중에 발견될 임의의 플라스트 폴리펩티드일 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Leon Otten, Curr Topics Microbiol Immunol 418:375-419 (2018)] 참조). 본 발명의 핵산 구축물에 유용한 예시 플라스트 폴리펩티드는 표 1에 제공된 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 플라스트 폴리펩티드는 6b, rolB, rolC, 및/또는 orf13일 수 있다. 일부 실시양태에서, 플라스트 폴리펩티드를 코딩하는 1종 초과의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 핵산 구축물에 포함될 수 있다.
일부 실시양태에서, 공생체 형성 접종물의 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 관심의 폴리뉴클레오티드는 프로모터 서열, 종결자 서열 및/또는 인트론을 포함하나 이에 제한되지는 않는 조절 요소에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 관심의 폴리뉴클레오티드가 둘 다 프로모터에 작동가능하게 연결되는 경우, 이들은 각각 동일한 프로모터 또는 별개의 프로모터에 임의의 조합으로 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 관심의 폴리뉴클레오티드가 둘 다 종결자 서열에 작동가능하게 연결되는 경우, 이들은 각각 동일한 종결자 또는 별개의 종결자에 임의의 조합으로 작동가능하게 연결될 수 있다.
식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 핵산 구축물은 1종 초과의 식물호르몬 생합성 효소를 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 코딩되는 1종 초과의 식물호르몬 생합성 효소는 단일 프로모터에 또는 별개의 프로모터에 임의의 조합으로 작동가능하게 연결될 수 있다. 예로서, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 인돌-3-아세트아미드 히드롤라제 (iaaH)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 트립토판 2-모노옥시게나제 (IaaM)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 이소펜테닐 트랜스퍼라제 (Ipt)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 경우, iaaH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, IaaM을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, Ipt를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (및/또는 인돌-3-락테이트 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드) 및 관심의 폴리뉴클레오티드는 각각 단일 프로모터에 또는 적어도 2개의 별개의 프로모터에 임의의 조합으로 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, iaaH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, IaaM을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 Ipt를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (및/또는 인돌-3-락테이트 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드)는 단일 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있고, 적어도 1종의 관심의 폴리뉴클레오티드는 별개의 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인돌-3-락테이트 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 임의의 다른 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, iaaH, IaaM, 및/또는 Ipt를 코딩하는 폴리뉴클레오티드)에 작동가능하게 연결된 프로모터와 동일한 프로모터 또는 별개의 프로모터일 수 있는 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 구축물은 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있는 플라스트 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 프로모터는 식물호르몬 생합성 효소에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, iaaH, IaaM, 및/또는 Ipt를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 인돌-3-락테이트 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드)에 작동가능하게 연결된 프로모터와 동일한 프로모터 또는 별개의 프로모터일 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자가 이해할 것인 바와 같이, 본원에 기재된 바와 같은 임의의 조합 폴리뉴클레오티드는 별개의 또는 동일한 조절 요소의 임의의 조합으로, 프로모터 및/또는 종결자를 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 조절 요소의 제어 하에 놓일 (그에 작동가능하게 연결될) 수 있다.
일부 실시양태에서, 조절 요소 (예를 들어, 프로모터, 종결자, 인트론)는 그것이 작동가능하게 연결되는 폴리뉴클레오티드에 대해 또는 공생체 또는 공생체 형성 접종물의 세포(들)에 대해 내인성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 조절 요소 (예를 들어, 프로모터, 종결자, 인트론)는 그것이 작동가능하게 연결되는 폴리뉴클레오티드에 대해 또는 공생체 또는 공생체 형성 접종물의 세포(들)에 대해 이종 (예를 들어, 재조합; 키메라)일 수 있다.
식물 세포에서 목적하는 발현 수준 및 발현의 위치를 제공하는 식물에서 기능적인 임의의 프로모터는 본 발명에 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 프로모터는 구성적 프로모터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 유도성 프로모터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 유도성 프로모터는 프로그램된 세포 사멸에 대해 유도성일 수 있다. 예시 프로모터는 CaMV 35s 프로모터 또는 식물 유비퀴틴 프로모터 (Ubi, 예를 들어, Ubi-1)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 추가의 프로모터는 상기 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, 공생체 형성 접종물에 사용하기 위해, 관심의 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드가 발현시 공생체로부터 숙주 식물 내로 전위되고/거나 숙주 식물의 목적하는 부분에 위치할 수 있도록 표적화 서열에 작동가능하게 연결된 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 표적화 서열의 선택은 관심의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 목적하는 위치에 의존할 것이다. 일부 실시양태에서, 표적화 서열은 단백질을 막, 세포하 위치 또는 세포외 위치에 표적화하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 서열은 세포질 세망 표적화 서열, 미토콘드리아 표적화 서열, 엽록체 표적화 서열, 핵 표적화 (핵 국재화) 서열, 공포 표적화 서열, 퍼옥시좀 표적화 서열, 리소좀 표적화 서열, 막 표적화 서열, 또는 식물 바이러스 이동 단백질이다. 일부 실시양태에서, 관심의 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드가 공생체로부터 전위되고/거나, 예를 들어, 발현시 숙주 식물에서의 1개 초과의 위치에 위치할 수 있도록 1개 초과의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의) 표적화 서열에 작동가능하게 연결된 폴리펩티드를 코딩할 수 있다.
일부 실시양태에서, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드는 1개 이상의 핵산 구축물 (예를 들어, 1개 이상의 발현 카세트)에 임의의 조합으로 함께 또는 별개로 포함된다. 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 플라스트 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 핵산 구축물에 포함될 수 있고, 임의로 여기서 적어도 1종의 플라스트 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 관심의 폴리뉴클레오티드와 동일한 또는 별개의 핵산 구축물 (예를 들어, 발현 카세트)에 포함된다. 본 발명의 핵산 구축물은 발현 카세트에 포함될 수 있거나, 또는 발현 카세트일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 발현 카세트는 벡터에 포함될 수 있다. 핵산 구축물을 세포 내로 도입하는데 적절한 임의의 벡터가 사용될 수 있다. 예로서, 벡터는 플라스미드, T-DNA, 박테리아 인공 염색체, 바이러스 벡터, 또는 이원성-박테리아 인공 염색체를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 구축물 및/또는 이를 포함하는 발현 카세트 및/또는 벡터는 세포, 임의로 식물 세포 또는 박테리아 세포에 포함될 수 있다. 따라서, 본 발명의 공생체 형성 접종물은 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드를 세포에 포함할 수 있고, 여기서 식물호르몬 생합성 효소는 적어도 1종의 시토키닌 생합성 효소 및 적어도 1종의 옥신 생합성 효소를 포함하고, 임의로 세포는 식물 세포 또는 박테리아 세포이다.
일부 실시양태에서, 공생체 형성 접종물은 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 포함하고, 여기서 세포는 박테리아 세포, 임의로 유형 IV 분비 시스템 (T4SS, 예를 들어, T4ASS, (예를 들어, VirB/D4 시스템), T4BSS) 또는 유형 III 분비 시스템 (T3SS)을 포함하는 박테리아 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 박테리아 세포는 아그로박테리움 종, 리조비움 종, 메소리조비움(Mesorhizobium) 종, 시노리조비움(Sinorhizobium) 종, 브라디리조비움(Bradyrhizobium) 종, 필로박테리움(Phyllobacterium) 종, 오크로박트룸(Ochrobactrum) 종, 아조박터(Azobacter) 종, 클로스테리움(Closterium) 종, 클레브시엘라(Klebsiella) 종, 로도스피릴룸(Rhodospirillum) 종, 또는 크산토모나스(Xanthomonas) 종의 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 아그로박테리움 종 세포는 에이. 투메파시엔스 (예를 들어, 생물변이형 1), 에이. 리조게네스 (예를 들어, 생물변이형 2), 에이. 비티스 (예를 들어, 생물변이형 3) 또는 에이. 파브룸 (예를 들어, 균주 C58)의 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 슈도모나스(Pseudomonas) 종 세포는 피. 사바스타노이(P. savastanoi) 병원체변종 사바스타노이(Savastanoi)의 세포일 수 있다.
DNA를 식물 세포에 전달하는 박테리아의 능력은 자연 환경에서 (예를 들어, 근두 암종) 및 인공적으로 (식물 형질전환) 둘 다 널리 공지되어 있다. 세계의 연구자들은 DNA를 식물 세포에 전달하는 아그로박테리아 종의 자연적 능력을 이용하였으며, 이를 사용하여 박테리아의 자연 숙주 범위 너머로 확장시켰다. 식물 질환 및 식물 DNA 전달의 관련 기술분야의 통상의 기술자가 알고 있는 바와 같이, 아그로박테리움 종의 자연 숙주 범위는 매우 넓다. 그러나, 적어도 1980년대 초기 이래로, 인간 개입을 통해, DNA를 식물에 전달하는 이들 박테리아의 능력은 자연 숙주가 아닌 많은 다른 종으로 훨씬 더 확장되었다. 아그로박테리아 종에 대한 자연 숙주인 식물 및 아그로박테리아 종을 사용하여 형질전환될 수 있는 것으로 나타난 많은 것의 예시적인 목록은 표 2에 제공된다. 이들 및 다른 식물 속 및 종은 숙주 식물로서 또는 본원에 기재된 바와 같은 공생체 형성 접종물을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 식물로서 사용될 수 있는 및 공생체 형성 접종물이 그로부터 제조될 수 있는 식물 속 및 종은 표 4 또는 실시예 섹션 앞의 단락에 하기 제공된 식물의 목록에 제공된 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 공생체 형성 접종물은 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 포함하고, 여기서 세포는 식물 세포일 수 있고, 임의로 식물 세포는 피자식물 (예를 들어, 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물), 나자식물, 조류 (예를 들어, 대형조류, 예를 들어, 로도피타(Rhodophyta) (홍조류), 파에오피타(Phaeophyta) (갈조류) 및 클로로피타(Chlorophyta) (녹조류), 크리소피세아에(Chrysophyceae) (금조류)), 선태류, 양치류 및/또는 양치류 동류 (즉, 양치식물)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 식물로부터의 것일 수 있다.
식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 공생체 형성 접종물은 식물 세포에 포함되는 경우 식물 캘러스 또는 캘러스 배양물 또는 현탁 배양물의 형태일 수 있다.
본 발명은 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함하고 발현하는 식물 세포를 포함하고, 여기서 식물호르몬 생합성 효소는 적어도 1종의 시토키닌 생합성 효소 및/또는 옥신 생합성 효소이고, 공생체의 식물 세포는 자율적으로 분열하는 것인 공생체를 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 식물 세포는 적어도 2개의 식물 세포 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개, 또는 그 초과의 세포)를 포함한다. 1개 초과의 세포를 포함하는 공생체는 식물 캘러스 또는 캘러스 배양물 또는 현탁 배양물을 형성할 수 있다. 1개 초과의 식물 세포를 포함하는 공생체는 비분화된 다세포 구조를 형성할 수 있다.
본 발명의 공생체에 유용한 관심의 폴리뉴클레오티드는 공생체에서의 발현을 위해 본원에 기재된 바와 같은 분자 (예를 들어, 1종 또는 1종 초과의 폴리펩티드, 펩티드, 코딩 RNA 또는 비-코딩 RNA; 예를 들어, 생체분자, 생물활성 분자)를 코딩하고, 임의로 공생체로부터 공생체가 1개 또는 1개 초과의 부위에서 부착되는 숙주 식물 내로 수송되고, 임의로 여기서 숙주 식물 내로 수송되는 경우, 분자는 숙주 식물의 유전자형 또는 게놈을 변경시키지 않으면서 숙주 식물 상으로 새로운 특징을 부여할 수 있는 것인 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 관심의 폴리뉴클레오티드는 생체분자 및/또는 생물활성 분자를 코딩할 수 있고/거나, 생체분자 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 생물활성 분자에 대한 생합성 효소 (예를 들어, 생물활성 분자의 생합성에 관여하는 폴리펩티드)를 코딩할 수 있다. 공생체에 포함되는 "관심의 폴리뉴클레오티드"는 1종의 관심의 폴리뉴클레오티드일 수 있거나, 또는 2종 이상의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15종 또는 그 초과의) 관심의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 2종 이상의 관심의 폴리뉴클레오티드가 공생체에 포함되는 경우, 공생체는 "스태킹된" 공생체로 지칭될 수 있다. 추가적으로, 숙주 식물 상에 형성된 1종 이상의 공생체 (여기서 공생체 중 적어도 2종은 상이한 POI를 포함함)는 "스태킹된 공생체"로 지칭될 수 있다. 스태킹은 또한 숙주 식물 상에 1종 이상의 공생체를 형성하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 모든 공생체는 동일한 POI(들)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 공생체에 포함되는 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 1종 또는 1종 초과의 식물호르몬 생합성 효소를 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1종 또는 1종 초과의 식물호르몬 생합성 효소는 1종 또는 1종 초과의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다. 즉, 공생체가 1종 초과의 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 경우, 1종 초과의 식물호르몬 생합성 효소는 또 다른 식물호르몬 생합성 효소와 동일한 폴리뉴클레오티드 상에서 또는 별개의 폴리뉴클레오티드 상에서 임의의 조합으로 코딩될 수 있다.
본 발명의 공생체에 유용한 식물호르몬 생합성 효소는 식물 세포에서 발현되어 자율적으로 분열하거나 복제하는 식물 세포를 생산하고, 임의로 비분화된 다세포 구조를 생산할 수 있는 임의의 옥신 또는 시토키닌 생합성 효소일 수 있다. 이들은 상기에 상세하게 기재되었으며, 인돌-3-아세트아미드 히드롤라제 (iaaH) (E.C. 번호: EC 3.5.1.4), 아미다제 1 (EC 3.5.1.4), 트립토판 2-모노옥시게나제 (IaaM) (EC 1.13.12.3), 인돌-3-락테이트 신타제 (EC 1.1.1.110), L-트립토판--피루베이트 아미노트랜스퍼라제 1 (EC 2.6.1.99), 트립토판 아미노트랜스퍼라제-관련된 단백질 1 (EC 2.6.1.27), 인돌-3-아세트알데히드 옥시다제 (EC 1.2.3.7), 및/또는 트립토판 데카르복실라제 1/트립토판 데카르복실라제 2 (EC4.1.1.105)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 옥신 생합성 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 식물호르몬 생합성 효소는 이소펜테닐 트랜스퍼라제 (Ipt) (동의어: 아데노신 포스페이트-이소펜테닐트랜스퍼라제; 아데닐레이트 디메틸알릴트랜스퍼라제; (디메틸알릴)아데노신 tRNA 메틸티오트랜스퍼라제) (E.C. 번호: 2.5.1.27 또는 2.5.1.75 또는 2.5.1.112) 및/또는 Tzs (동의어: 디메틸 트랜스퍼라제, 이소펜테닐 트랜스퍼라제, 트랜스-제아틴 생산 단백질, 아데닐레이트 디메틸알릴트랜스퍼라제) (EC 2.5.1.27)를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는 시토키닌 생합성 효소이다. 일부 실시양태에서, 식물호르몬 생합성 효소는 인돌-3-아세트아미드 히드롤라제 (iaaH), 트립토판 2-모노옥시게나제 (IaaM), 및/또는 이소펜테닐 트랜스퍼라제 (Ipt)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 공생체는 인돌-3-락테이트 신타제인 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 공생체는 플라스트 폴리펩티드 (예를 들어, 가소성 폴리펩티드)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 유용한 플라스트 폴리펩티드는 본 발명의 핵산 구축물을 사용하여 형성되는 공생체의 구조에 대한 유익을 부여할 수 있는 현재 공지된 또는 나중에 발견될 임의의 플라스트 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명의 공생체에 유용한 예시 플라스트 폴리펩티드는 표 1에 제공된 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 플라스트 폴리펩티드는 6b, rolB, rolC, 및/또는 orf13일 수 있다. 일부 실시양태에서, 플라스트 폴리펩티드를 코딩하는 1종 초과의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 공생체에 포함될 수 있다.
공생체의 세포에서의 발현을 위해, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 관심의 폴리뉴클레오티드는 프로모터 서열, 종결자 서열 및/또는 인트론을 포함하나 이에 제한되지는 않는 조절 요소에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 관심의 폴리뉴클레오티드가 둘 다 프로모터에 작동가능하게 연결되는 경우, 이들은 각각 동일한 프로모터 또는 별개의 프로모터에 임의의 조합으로 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 관심의 폴리뉴클레오티드가 둘 다 종결자 서열에 작동가능하게 연결되는 경우, 이들은 각각 동일한 종결자 또는 별개의 종결자에 임의의 조합으로 작동가능하게 연결될 수 있다.
예로서, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 인돌-3-아세트아미드 히드롤라제 (iaaH)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 트립토판 2-모노옥시게나제 (IaaM)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 이소펜테닐 트랜스퍼라제 (Ipt)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 경우, iaaH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, IaaM을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, Ipt를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드는 단일 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있거나, 또는 적어도 2개의 별개의 프로모터에 임의의 조합으로 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, iaaH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, IaaM을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 Ipt를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 단일 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있고, 적어도 1종의 관심의 폴리뉴클레오티드는 별개의 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인돌-3-락테이트 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 식물호르몬 생합성 효소에 작동가능하게 연결된 임의의 다른 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, iaaH, IaaM, 및/또는 Ipt를 코딩하는 폴리뉴클레오티드)에 작동가능하게 연결된 프로모터와 동일한 프로모터 또는 별개의 프로모터일 수 있는 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 플라스트 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 식물호르몬 생합성 효소에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, iaaH, IaaM, 및/또는 Ipt를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 인돌-3-락테이트 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드)에 작동가능하게 연결된 프로모터와 동일한 프로모터 또는 별개의 프로모터일 수 있는 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자가 이해할 것인 바와 같이, 본원에 기재된 바와 같은 임의의 조합 폴리뉴클레오티드는 별개의 또는 동일한 조절 요소의 임의의 조합으로, 프로모터 및/또는 종결자를 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 조절 요소의 제어 하에 놓일 (그에 작동가능하게 연결될) 수 있다.
일부 실시양태에서, 조절 요소 (예를 들어, 프로모터, 종결자, 인트론)는 그것이 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드에 대해 또는 공생체의 1개 이상의 식물 세포에 대해 내인성 또는 이종 (예를 들어, 재조합)일 수 있다.
식물 세포에서 목적하는 발현 수준 및 발현의 위치를 제공하는 식물에서 기능적인 임의의 프로모터는 본 발명에 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 프로모터는 구성적 프로모터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 유도성 프로모터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 유도성 프로모터는 프로그램된 세포 사멸에 대해 유도성일 수 있다. 예시 프로모터는 CaMV 35s 프로모터 또는 식물 유비퀴틴 프로모터 (Ubi, 예를 들어, Ubi-1)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 프로모터를 포함한 추가의 조절 요소는 상기 개시된 바와 같다.
일부 실시양태에서, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드는 임의의 조합으로 1개 이상의 핵산 구축물 (예를 들어, 1개 이상의 발현 카세트)에 함께 또는 별개로 포함된다. 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 플라스트 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 핵산 구축물에 포함될 수 있고, 임의로 여기서 적어도 1종의 플라스트 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 관심의 폴리뉴클레오티드와 동일한 또는 별개의 핵산 구축물 (예를 들어, 발현 카세트)에 포함된다. 본 발명의 핵산 구축물은 발현 카세트에 포함될 수 있거나, 또는 발현 카세트일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 발현 카세트는 벡터에 포함될 수 있다. 핵산 구축물을 벡터 내로 도입하는데 적절한 임의의 벡터가 사용될 수 있다. 예로서, 벡터는 플라스미드, T-DNA, 박테리아 인공 염색체, 바이러스 벡터, 또는 이원성-박테리아 인공 염색체를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 관심의 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드가 공생체에서의 발현시 숙주 식물의 목적하는 부분에 위치할 수 있도록 표적화 서열에 작동가능하게 연결된 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 표적화 서열의 선택은 관심의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 목적하는 위치에 의존할 것이다. 일부 실시양태에서, 표적화 서열은 단백질을 막, 세포하 위치 또는 세포외 위치에 표적화하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 서열은 세포질 세망 표적화 서열, 미토콘드리아 표적화 서열, 엽록체 표적화 서열, 핵 표적화 (핵 국재화) 서열, 공포 표적화 서열, 퍼옥시좀 표적화 서열, 리소좀 표적화 서열, 또는 식물 바이러스 이동 단백질이다. 일부 실시양태에서, 관심의 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드가 발현시 숙주 식물의 1개 초과의 목적하는 부분에 위치할 수 있도록 1개 초과의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의) 표적화 서열에 작동가능하게 연결된 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드를 1개 초과의 표적화 서열에 작동가능하게 연결시킴으로써, 폴리펩티드는 1개 초과의 위치에 순차적으로 지정될 수 있다. 예를 들어, 엽록체 표적화 서열에 및 막 표적화 서열에 작동가능하게 연결된 폴리펩티드는 먼저 엽록체에 및 이어서 막에 표적화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, iaaH를 코딩하는, IaaM을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 Ipt, 및/또는 인돌-3-락테이트 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드) 및/또는 적어도 1종의 플라스트 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 핵 표적화 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.
일부 실시양태에서, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, iaaH를 코딩하는, IaaM을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 Ipt, 및/또는 인돌-3-락테이트 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드) 및/또는 적어도 1종의 플라스트 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 식물호르몬 생합성 효소 및/또는 플라스트 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 공생체는 핵 표적화 서열에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시양태에서, 공생체는 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, iaaH를 코딩하는, IaaM을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, Ipt를 코딩하는 폴리뉴클레오티드) 및 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 여기서 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드는 단일 프로모터에 또는 적어도 2개의 별개의 프로모터에 임의의 조합으로 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 iaaH, IaaM, 및 Ipt를 코딩하는 경우, iaaH, IaaM, 및 Ipt를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)는 단일 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 관심의 폴리뉴클레오티드는 별개의 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시양태에서, 공생체는 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 1종의 플라스트 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 임의로 여기서 적어도 1종의 플라스트 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 관심의 폴리뉴클레오티드와 동일한 프로모터 또는 별개의 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 프로모터, 단일 프로모터, 별개의 프로모터 및/또는 2개 이상의 별개의 프로모터는 공생체의 세포에 대해 내인성이다. 일부 실시양태에서, 프로모터, 단일 프로모터, 별개의 프로모터 및/또는 2개 이상의 별개의 프로모터는 공생체의 세포에 대해 이종이다. 일부 실시양태에서, 프로모터, 단일 프로모터, 별개의 프로모터 및/또는 2개 이상의 별개의 프로모터 중 하나 이상은 공생체의 세포에 대해 내인성일 수 있는 반면, 프로모터, 단일 프로모터, 별개의 프로모터 및/또는 2개 이상의 별개의 프로모터 중 적어도 하나는 공생체의 세포에 대해 이종이다. 일부 실시양태에서, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 공생체의 식물 세포에 대해 이종일 수 있다. 일부 실시양태에서, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 공생체의 식물 세포에 대해 내인성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 이종 프로모터 (예를 들어, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대해 및/또는 공생체의 식물 세포에 대해 이종)에 또는 내인성 프로모터 (예를 들어, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대해 또는 식물 세포 공생체에 대해 내인성)에 작동가능하게 연결될 수 있다.
본 발명의 공생체로서 사용하기 위한 식물 세포 (예를 들어, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 세포)는 피자식물 세포 (예를 들어, 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물), 나자식물 세포, 조류 세포 (예를 들어, 대형조류, 예를 들어, 로도피타 (홍조류), 파에오피타 (갈조류) 및 클로로피타 (녹조류), 크리소피세아에 (금조류)), 선태류 세포, 양치류 및/또는 양치류 동류 세포 (즉, 양치식물)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 식물 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 식물 세포는 표 2 또는 표 4 또는 실시예 섹션 전의 단락에 하기 제공된 식물의 목록에 열거된 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 식물 세포는 시트러스 세포, 토마토 세포, 옥수수 세포, 피칸 세포, 및 담배 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
공생체는 식물 상의 1개 이상의 위치에서 식물 (예를 들어 숙주 식물) 상으로 이식될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 적어도 1종의 공생체를 포함하고, 여기서 공생체는 식물 상의 적어도 1개의 부위 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 초과의 부위) 상에 위치한 것인 숙주 식물을 추가로 제공한다. 본 발명의 식물 (예를 들어 숙주 식물)은 식물 또는 숙주 식물의 상이한 부위 상에 위치한 1종 초과의 공생체를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 식물 상의 "부위"는 식물 상의 임의의 위치 또는 공생체를 성장시키기 위한 임의의 식물 부분일 수 있다. 부위 또는 공생체에 대한 위치는 외식편, 배, 잎, 순, 줄기, 가지, 인, 이삭, 대, 껍질, 자루, 표피 조직, 정단 분열 조직, 꽃 조직 (예를 들어, 화분, 암술, 배주, 꽃밥, 수술, 화관, 꽃받침, 꽃잎, 화탁, 화사, 암술대, 암술머리 등), 과실, 종자, 꼬투리, 피막, 자엽, 배축, 엽병, 괴경, 구경, 뿌리, 근단, 공생체, 마디, 식물 푸드 바디, 도마티아, 꽃밖 꿀샘, 뿌리혹, 식물 신생물 또는 벌레혹을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 공생체가 숙주 식물 상의 적어도 1개의 부위 상에 포함되는 경우, 공생체에 포함되는 관심의 폴리뉴클레오티드는 공생체에서 발현되고, 관심의 폴리뉴클레오티드의 발현 생성물 및/또는 관심의 폴리뉴클레오티드의 발현 생성물을 사용하여 제조된 생성물은 숙주 식물 내로 수송된다. 숙주 식물은 임의의 연령 또는 크기 (예를 들어, 묘목, 어린 식물, 또는 성숙한 식물)의 야생형 식물일 수 있다. 숙주 식물은 본원에 기재된 바와 같은 피자식물 (예를 들어, 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물), 나자식물, 대형조류 (예를 들어, 로도피타 (홍조류), 파에오피타 (갈조류) 및 클로로피타 (녹조류), 크리소피세아에 (금조류)), 선태류, 및/또는 양치류 및/또는 양치류 동류 (즉, 양치식물)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 식물은 표 2 및/또는 표 4, 및/또는 실시예 섹션 전의 단락에 하기 제공된 식물의 목록에 열거된 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 예시 식물은 시트러스 식물 (예를 들어, 그레이프프루트, 오렌지, 레몬, 라임 등), 토마토 식물, 옥수수 식물, 피칸 식물, 및 담배 식물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 공생체는 숙주 식물로부터 수확될 수 있고, 생체분자(들) 및/또는 생물활성 분자(들)를 포함한 생성물은 수확된 공생체로부터 단리될/수집될 수 있다. 임의의 생체분자 또는 생물활성 분자, 예컨대 본원에 기재된 것들은 본 발명의 공생체에서 생산되고, 그로부터 수집될/단리될 수 있다. 공생체 및 공생체를 포함하는 숙주 식물로부터 수집된 생성물은 생성물이 적합한 임의의 목적을 위해 사용될 수 있다. 이러한 용도의 비-제한적 예는 특수 화학물질, 제약, 화장품, 윤활제, 염료/안료, 연료, 식품 및/또는 영양 제품 등을 포함한다.
본 발명은 공생체 형성 접종물, 공생체, 및 본 발명의 공생체를 포함하는 숙주 식물을 포함한 본 발명의 조성물을 제조하는 방법을 추가로 제공한다. 본 발명의 공생체 형성 접종물은 적어도 1종의 관심의 폴리뉴클레오티드 및 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 1종 이상의 식물호르몬 생합성 효소 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5종, 또는 그 초과)를 코딩하는 1종 이상의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5종, 또는 그 초과)를 코딩하는)를 포함하는 1개 이상의 핵산 구축물 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 그 초과)을 포함하는 조성물일 수 있고, 여기서 생합성 효소(들)는 옥신 생합성 효소 및/또는 시토키닌 생합성 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 공생체 형성 접종물은 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 1개 이상의 핵산 구축물을 포함하는 1개 이상의 세포 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500개 또는 그 초과의 세포)를 포함할 수 있고, 여기서 생합성 효소는 옥신 생합성 효소 및/또는 시토키닌 생합성 효소, 및 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 식물 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 박테리아 세포이다.
따라서, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하거나, 또는 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 트랜스제닉 세포 내로 도입하고, 여기서 식물호르몬 생합성 효소는 적어도 1종의 시토키닌 생합성 효소 및/또는 옥신 생합성 효소이고, 그에 의해 공생체 형성 접종물을 생산하는 단계를 포함하는, 공생체 형성 접종물을 생산하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 공생체 형성 접종물을 생산하는 방법은 세포를 배양하여 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포의 집단을 생산하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은 (a) (i) 식물 (또는 그의 부분 (예를 들어, 외식편, 줄기, 등)) 상의 적어도 1개의 부위 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 부위) 내로/상으로 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드 서열을 도입하거나, 이를 포함하는 식물 세포 (예를 들어, 식물호르몬 코딩 효소를 코딩하는 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 활성화된 식물 세포)를 이식하거나, 또는 이 (예를 들어, 식물호르몬 코딩 효소를 코딩하는 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 박테리아 세포를 식물 (또는 그의 부분) 상의 적어도 1개의 부위 상으로 접종하거나, 또는 (ii) 식물 (또는 그의 부분 (예를 들어, 외식편, 줄기, 등)) 상의 적어도 1개의 부위 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 부위) 내로/상으로 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하고, 여기서 식물 (또는 그의 부분)은 관심의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이를 포함하는 식물 세포를 이식하거나, 또는 이를 포함하는 박테리아 세포를 식물 (또는 그의 부분) 상의 적어도 1개의 부위 상으로 접종하고, 여기서 식물호르몬 생합성 효소는 적어도 1종의 시토키닌 생합성 효소 및/또는 옥신 생합성 효소이고, 그에 의해 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물 (또는 그의 부분) 상의 공생체를 생산하는 단계; 및 (b) 식물 상의 공생체로부터 1개 이상의 세포 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 2500, 5000, 10,000, 50,000, 100,000개 또는 그 초과의 세포; 예를 들어, 부분, 예를 들어, 약 0.005 μg 내지 약 1g 또는 그 초과의 공생체로부터의 조직)를 선택하여, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 1개 이상의 세포를 제공하고, 그에 의해 공생체 형성 접종물을 생산하는 단계를 포함하는, 공생체 형성 접종물을 생산하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 공생체 형성 접종물을 생산하는 방법이 먼저 식물 상의 적어도 부위 상에 공생체를 생산하는 것을 포함하는 경우, 식물 상의 적어도 1개의 부위는 식물의 지상부 상에 있다. 일부 실시양태에서, 식물 상의 적어도 1개의 부위는 식물의 지하부 상에 있다. 일부 실시양태에서, 공생체 형성 접종물을 생산하는 방법은 (c) (b)로부터의 1개 이상의 세포를 배양하여 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물 세포의 집단 (예를 들어, 캘러스, 캘러스 배양물 및/또는 현탁 배양물)을 생산하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
식물 세포가 세포를 식물 또는 그의 부분 상으로 이식함으로써 공생체 형성 접종물을 생산하는데 사용되는 경우, 또는 박테리아 세포가 박테리아 세포를 식물 또는 그의 부분 상으로 접종함으로써 공생체 형성 접종물을 생산하는데 사용되는 경우, 세포는 단일 세포일 수 있거나, 또는 2개 이상의 세포 (예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 세포 내지 약 100,000개의 세포 또는 그 초과)일 수 있다. 세포가 식물 세포이고, 공생체 형성 접종물을 생산하는데 사용되는 식물 세포가 식물호르몬 효소를 코딩하는 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 옥신 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 시토키닌 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드)를 포함하지만, 숙주 식물 게놈을 변형시키지 않으면서 숙주 식물 특징을 변형시키는데 사용하기 위한 관심의 폴리뉴클레오티드는 포함하지 않는 경우, 식물 세포는 "활성화된" 식물 세포로 지칭될 수 있다. 활성화된 식물 세포는 식물호르몬 효소를 코딩하는 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드로 변형되어 세포가 자율적으로 번식하고, 그에 의해 식물 또는 그의 부분 상으로 이식되는 경우 비분화된 구조 (벌레혹-유사 구조)를 형성할 수 있는 활성화된 세포를 제조하는 것을 허용한다. 활성화된 식물 세포가 자율적으로 분열하여 조직을 형성하는 경우, 조직은 "활성화된 조직"으로 지칭될 수 있다. 공생체 형성 접종물은 세포 또는 조직이 숙주 식물 게놈을 변형시키지 않으면서 숙주 식물 특징을 변형시키는데 사용하기 위한 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 경우에만 활성화된 식물 세포 또는 활성화된 조직으로부터 생성된다.
공생체 형성 접종물, 공생체, 및 본 발명의 공생체를 포함하는 숙주 식물을 포함한 본 발명의 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 방법에 유용한 관심의 폴리뉴클레오티드는 공생체 및/또는 적어도 1종의 공생체를 포함하는 숙주 식물에서/에 의해 숙주 식물 특징을 변형시키는데 유용할 또는 생체분자의 생산에 유용할 수 있는 임의의 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 생체분자는 살아 있는 유기체 및/또는 그의 부분 (예를 들어, 세포 또는 무세포 시스템)에 의해 생산된 임의의 분자이다.
관심의 폴리뉴클레오티드는 공생체에서 발현되고, 임의로 공생체로부터 공생체가 1개 또는 1개 초과의 부위에서 부착되는 숙주 식물 내로 수송될 수 있는 본원에 기재된 바와 같은 임의의 분자 (예를 들어, 1종 또는 1종 초과의 폴리펩티드, 펩티드, 코딩 RNA 또는 비-코딩 RNA; 예를 들어, 생물활성 분자)를 코딩할 수 있고, 임의로 여기서 숙주 식물 내로 수송되는 경우, 분자는 숙주 식물의 유전자형 또는 게놈을 변경시키지 않으면서 숙주 식물 상으로 새로운 특징을 부여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 관심의 폴리뉴클레오티드는 생체분자 및/또는 생물활성 분자를 코딩할 수 있고/거나, 본원에 기재된 바와 같은 생체분자 및/또는 생물활성 분자에 대한 생합성 효소 (예를 들어, 생물활성 분자의 생합성에 관여하는 폴리펩티드)를 코딩할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 본원에 기재된 바와 같은 공생체 형성 접종물을 제조하는데 사용하기 위한 "관심의 폴리뉴클레오티드"는 1종의 관심의 폴리뉴클레오티드일 수 있거나, 또는 2종 이상의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15종 또는 그 초과의) 관심의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 2종 이상의 관심의 폴리뉴클레오티드가 공생체 형성 접종물에 포함되는 경우, 공생체 형성 접종물은 "스태킹된" 공생체 형성 접종물로 지칭될 수 있다. 스태킹된 공생체 형성 접종물은 스태킹된 공생체(들)로 지칭될 수 있는, 숙주 식물 상의 1종 이상의 공생체를 형성하는데 사용될 수 있다. 스태킹의 추가의 예로서, 공생체 형성 접종물이 박테리아 세포를 포함하는 경우, 박테리아 세포는 1개의 플라스미드 또는 적어도 2개의 상이한 플라스미드 상에 적어도 2종의 상이한 POI를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 식물 세포에서 발현되어 본원에 기재된 바와 같은 자율적으로 분열하거나 복제하는 식물 세포를 생산할 수 있는 임의의 옥신 생합성 효소 또는 시토키닌 생합성 효소는 공생체 형성 접종물을 제조하는데 사용될 수 있다. 예시적인 옥신 및 시토키닌 생합성 효소 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 상세하게 기재되어 있으며, 인돌-3-아세트아미드 히드롤라제 (iaaH) (E.C. 번호: EC 3.5.1.4), 아미다제 1 (EC 3.5.1.4), 트립토판 2-모노옥시게나제 (IaaM) (EC 1.13.12.3), 인돌-3-락테이트 신타제 (EC 1.1.1.110), L-트립토판--피루베이트 아미노트랜스퍼라제 1 (EC 2.6.1.99), 트립토판 아미노트랜스퍼라제-관련된 단백질 1 (EC 2.6.1.27), 인돌-3-아세트알데히드 옥시다제 (EC 1.2.3.7), 및/또는 트립토판 데카르복실라제 1/트립토판 데카르복실라제 2 (EC4.1.1.105)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 옥신 생합성 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 식물호르몬 생합성 효소는 시토키닌 생합성 효소이다. 본 발명에 유용한 시토키닌 생합성 효소는 이소펜테닐 트랜스퍼라제 (Ipt) (동의어: 아데노신 포스페이트-이소펜테닐트랜스퍼라제; 아데닐레이트 디메틸알릴트랜스퍼라제; (디메틸알릴)아데노신 tRNA 메틸티오트랜스퍼라제) (E.C. 번호: 2.5.1.27 또는 2.5.1.75 또는 2.5.1.112) 및/또는 Tzs (동의어: 디메틸 트랜스퍼라제, 이소펜테닐 트랜스퍼라제, 트랜스-제아틴 생산 단백질, 아데닐레이트 디메틸알릴트랜스퍼라제) (EC 2.5.1.27)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 식물호르몬 생합성 효소는 인돌-3-아세트아미드 히드롤라제 (iaaH), 트립토판 2-모노옥시게나제 (IaaM), 및/또는 이소펜테닐 트랜스퍼라제 (Ipt)일 수 있고, 임의로 인돌-3-락테이트 신타제, 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 공생체 형성 접종물을 생산하는 방법은 적어도 1종의 플라스트 폴리펩티드 (예를 들어, 가소성 폴리펩티드)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포 또는 식물 상의 적어도 1개의 부위 내로 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 임의로 여기서 플라스트 폴리펩티드는 표 1에 제공된 플라스트 폴리펩티드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 플라스트 폴리펩티드는 6b, rolB, rolC, 및/또는 orf13이다.
세포 내로 도입하기 위한 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드는 1개 이상의 핵산 구축물 (예를 들어, 1개 이상의 발현 카세트 및/또는 벡터) (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 초과의 구축물)에 함께 또는 별개로 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 플라스트 폴리펩티드 (예를 들어, 적어도 1종의 플라스트 폴리펩티드, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6종 또는 그 초과)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 1개 이상의 핵산 구축물 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 초과의 구축물)에 포함될 수 있고, 임의로 여기서 적어도 1종의 플라스트 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 관심의 폴리뉴클레오티드와 동일한 또는 별개의 핵산 구축물 (예를 들어, 발현 카세트)에 있다. 일부 실시양태에서, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 관심의 폴리뉴클레오티드 및/또는 플라스트 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구축물은 동일한 또는 별개의 발현 카세트일 수 있는 발현 카세트에 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 핵산 구축물 (또는 이를 포함하는 발현 카세트)은 1개 이상의 벡터 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 또는 그 초과)에 포함될 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 세포에 전달하는데 유용한 임의의 벡터는 본 발명의 핵산 구축물로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 핵산 구축물, 및/또는 발현 카세트로 사용하기 위한 플라스미드, T-DNA, 박테리아 인공 염색체, 바이러스 벡터 또는 이원성-박테리아 인공 염색체, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법에 따라 세포 내로 도입되는 관심의 폴리뉴클레오티드는 표적화 서열에 작동가능하게 연결된 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 서열은 단백질을 막, 세포하 위치 또는 세포외 위치에 위치시킨다. 일부 실시양태에서, 표적화 서열은 막 표적화 서열, 세포질 세망 표적화 서열, 미토콘드리아 표적화 서열, 엽록체 표적화 서열, 또는 식물 바이러스 이동 단백질일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 핵에 표적화될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같은 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 플라스트 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 세포의 핵에 표적화하기 위해 핵 국재화 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.
일부 실시양태에서, 식물호르몬 생합성 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 관심의 폴리뉴클레오티드는 프로모터 서열, 종결자 서열 및/또는 인트론을 포함하나 이에 제한되지는 않는 조절 요소에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 식물호르몬 생합성 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 관심의 폴리뉴클레오티드가 둘 다 프로모터에 작동가능하게 연결되는 경우, 각각은 동일한 프로모터 또는 별개의 프로모터에 임의의 조합으로 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 식물호르몬 생합성 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 관심의 폴리뉴클레오티드가 둘 다 종결자 서열에 작동가능하게 연결되는 경우, 각각은 동일한 종결자 또는 별개의 종결자에 임의의 조합으로 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드는 각각 단일 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드는 적어도 2개의 별개의 프로모터에 임의의 조합으로 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 2종 이상의 식물호르몬 생합성 효소 (예를 들어, iaaH, IaaM, 및 Ipt)를 코딩하는 경우, 2종 이상의 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)는 단일 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 관심의 폴리뉴클레오티드는 별개의 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시양태에서, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 1종 초과의 폴리뉴클레오티드가 도입되는 경우 (예를 들어, iaaH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, IaaM을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, Ipt를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 인돌-3-락테이트 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드), 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 1종 초과의 폴리뉴클레오티드는 관심의 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터와 동일한 또는 별개의 프로모터일 수 있는 동일한 또는 별개의 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, iaaH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, IaaM을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 Ipt를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 단일 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 관심의 폴리뉴클레오티드는 별개의 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 식물호르몬 생합성 효소 (예를 들어, iaaH, IaaM, 및 Ipt 및/또는 인돌-3-락테이트 신타제)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 단일 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 관심의 폴리뉴클레오티드는 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시양태에서, 적어도 1종의 플라스트 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 플라스트 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 관심의 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것과 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 플라스트 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 관심의 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터와 별개의 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
식물호르몬 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 관심의 폴리뉴클레오티드가 발현되는 것을 허용하는 임의의 프로모터가 사용될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 프로모터의 선택은 발현에 대한 시간적 및 공간적 요건에 따라 다양할 수 있으며, 또한 형질전환되는 숙주 세포에 기반하여 다양할 수 있다. 많은 상이한 유기체에 대한 및 상이한 발현 패턴을 갖는 프로모터는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 공생체 형성 접종물을 제조하는데 유용한 프로모터는 공생체 형성 접종물의 1개 이상의 세포에 대해 내인성일 수 있거나, 또는 공생체 형성 접종물의 1개 이상의 세포에 대해 이종일 수 있거나, 이들의 임의의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 프로모터가 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드에 대해 내인성일 수 있거나 또는 이종일 수 있다.
일부 실시양태에서, 공생체 형성 접종물을 제조하는데 유용한 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 공생체 형성 접종물을 제조하는데 유용한 프로모터는 유도성 프로모터이다.
공생체 형성 접종물을 생산하는데 유용한 박테리아 세포는 유형 IV 분비 시스템 (T4SS, 예를 들어, T4ASS (예를 들어, VirB/D4 시스템), T4BSS) 또는 유형 III 분비 시스템 (T3SS)을 포함하는 임의의 박테리아 세포일 수 있다. 이러한 박테리아 시스템은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 아그로박테리움 종 (예를 들어, 에이. 투메파시엔스 (예를 들어, 생물변이형 1), 에이. 리조게네스 (예를 들어, 생물변이형 2), 에이. 비티스 (예를 들어, 생물변이형 3), 에이. 파브룸 (예를 들어, 균주 C58), 리조비움 종, 메소리조비움 종, 시노리조비움 종, 브라디리조비움 종, 슈도모나스 종 (예를 들어, 피. 사바스타노이 병원체변종 사바스타노이), 필로박테리움 종, 오크로박트룸 종, 아조박터 종, 클로스테리움 종, 클레브시엘라 종, 로도스피릴룸 종, 또는 크산토모나스 종의 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
이어서 식물 상의 공생체를 형성하는데 사용될 수 있는 임의의 식물 세포는 공생체 형성 접종물을 생산하는데 사용될 수 있다. 이러한 식물 세포는 피자식물 (예를 들어, 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물), 나자식물, 조류 (예를 들어, 대형조류, 예를 들어, 로도피타 (홍조류), 파에오피타 (갈조류) 및 클로로피타 (녹조류), 크리소피세아에 (금조류)), 선태류, 양치류 및/또는 양치류 동류 (즉, 양치식물)로부터의 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 세포는 임의의 연령 또는 크기 (예를 들어, 묘목, 어린 식물, 또는 성숙한 식물)의 야생형 식물 또는 트랜스제닉 식물로부터의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 식물 세포는 표 2, 표 4 또는 실시예 섹션 전의 단락에 하기 제공된 식물의 목록에 열거된 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 예시 식물 세포는 시트러스 세포 (예를 들어, 그레이프프루트, 오렌지, 레몬, 라임 등), 토마토 세포, 옥수수 세포, 피칸 세포, 및 담배 세포를 포함한다.
공생체 형성 접종물을 생산하는데 유용한 식물 세포는 식물 세포 배양물 (캘러스, 캘러스 배양물 또는 현탁 배양물), 원형질체, 묘목, 외식편, 배, 잎, 순, 줄기, 가지, 인, 이삭, 대, 껍질, 자루, 표피 조직, 정단 분열 조직, 꽃 조직 (예를 들어, 화분, 암술, 배주, 꽃밥, 수술, 화관, 꽃받침, 꽃잎, 화탁, 화사, 암술대, 암술머리 등), 과실, 종자, 꼬투리, 피막, 자엽, 배축, 엽병, 괴경, 구경, 뿌리, 근단, 공생체, 마디, 식물 푸드 바디, 도마티아, 꽃밖 꿀샘, 뿌리혹, 벌레혹 또는 식물 신생물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 식물 부분으로부터의 것일 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 식물 세포를 사용하여 공생체 형성 접종물을 생산하는 경우, 식물 상의 적어도 1개의 부위는 외식편, 배, 잎, 순, 줄기, 가지, 인, 이삭, 대, 껍질, 자루, 표피 조직, 정단 분열 조직, 꽃 조직 (예를 들어, 화분, 암술, 배주, 꽃밥, 수술, 화관, 꽃받침, 꽃잎, 화탁, 화사, 암술대, 암술머리 등), 과실, 종자, 꼬투리, 피막, 자엽, 배축, 엽병, 괴경, 구경, 뿌리, 근단, 공생체, 마디, 식물 푸드 바디, 도마티아, 꽃밖 꿀샘, 뿌리혹, 식물 신생물 또는 벌레혹을 포함하나 이에 제한되지는 않는 식물 상의 임의의 부위일 수 있다.
핵산 구축물 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트 및/또는 벡터)은 임의의 방법 공지된 방법을 통해 세포 내로 도입될 수 있다. 식물을 포함한 원핵생물 및 진핵생물 유기체 둘 다를 형질전환시키기 위한 절차는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 통상적이며, 문헌 전반에 걸쳐 기재되어 있다. 일부 실시양태에서 본 발명의 핵산 구축물 (예를 들어, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 관심의 폴리뉴클레오티드 및/또는 이를 포함하는 발현 카세트 및/또는 벡터)은 박테리아 매개된 형질전환, 아르고인필트레이션, 바이러스-매개된 형질전환, 입자 포격 (바이오리스틱스), 전기천공, 미세주사, 리포펙션 (리포솜 매개된 형질전환), 초음파처리, 규소 섬유 매개된 형질전환, 화학적으로 자극된 DNA 흡수 (예를 들어, 폴리펙션; 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 매개된 형질전환), 및/또는 레이저 마이크로빔 (UV) 유도된 형질전환을 포함하나 이에 제한되지는 않는 방법을 통해 세포 내로 도입될 수 있다.
일부 실시양태에서, (i) 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 (ii) 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 적어도 1개의 식물 세포에 포함되는 경우, 적어도 1개의 식물 세포는 식물 상의 적어도 1개의 부위 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 부위) 상으로 이식될 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 부위에서 이식된 1개 이상의 세포 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 또는 그 초과의 세포)는 부위에서 배양되어 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물 세포의 집단을 생산하며 공생체를 형성하고, 여기서 식물 상의 공생체로부터의 1개 이상의 세포는 선택되어 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 1개 이상의 세포를 제공하고, 그에 의해 공생체 형성 접종물을 생산한다.
일부 실시양태에서, 식물을 사용하여 공생체 형성 접종물을 생산하는 경우, 식물 상의 적어도 1개의 부위는 식물 상의 적어도 1개의 부위 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 부위)에서 도입하는 단계 전에, 그와 공동으로, 또는 후에 접종의 부위에서 상처입을 수 있다. 유사하게, 공생체가 숙주 식물 상의 적어도 1개의 부위 상으로 이식되는 경우, 숙주 식물 상의 적어도 1개의 부위는 이식 단계 전에, 그와 공동으로, 또는 후에 상처입을 수 있다. 도입 또는 이식을 위한 상처입히기는 도입 또는 이식이 일어나는 부위에서 식물 또는 그의 부분의 외표면 (표피, 각피, 껍질)에서 파괴를 발생시키는 임의의 방식으로 수행될 수 있다. 이러한 도구는 핀셋 또는 포셉, 나이프, 바늘, 예를 들어, (예를 들어, 피하, 절개, 문신, 재봉 등), 이쑤시개, 및/또는 시린지를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 또한, 임의의 표준 그래프팅 도구는 본원에 기재된 바와 같은 도입 또는 이식을 위해 이용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 적어도 1종의 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드), 관심의 폴리뉴클레오티드; 이를 포함하는 발현 카세트(들) 또는 벡터(들))를 식물 세포, 식물 또는 그의 부분 내로 도입하는 것은 박테리아 매개된 형질전환을 통해 수행되고, 식물 세포 또는 식물 (또는 그의 부분, 예를 들어, 외식편)을 적어도 1종의 박테리아 종 또는 균주 (예를 들어, 1, 2, 3,4, 5종, 또는 그 초과)의 세포와 공동-배양하는 것을 포함하며, 여기서 박테리아 세포는 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 관심의 폴리뉴클레오티드, 및/또는 적어도 1종의 플라스트 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드 중 1개 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 식물 (또는 그의 부분; 예를 들어, 외식편)은 적어도 1종의 박테리아 균주의 세포와의 공동-배양 전에 또는 동안에 접종의 부위에서 상처입을 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 박테리아 종 또는 균주의 세포는 적어도 2종의 박테리아 종 또는 균주의 세포를 포함하고, 식물호르몬 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 적어도 1종의 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 박테리아 균주와 별개의 박테리아 균주에 포함된다 (예를 들어, 이중 박테리아 형질전환). 본원에 기재된 바와 같이, 공생체 형성 접종물을 생산하는데 유용한 박테리아 세포는 유형 IV 분비 시스템 (T4SS, 예를 들어, T4ASS, (예를 들어, VirB/D4 시스템), T4BSS) 또는 유형 III 분비 시스템 (T3SS)을 포함하는 임의의 박테리아 세포일 수 있고, 아그로박테리움 종 (예를 들어, 에이. 투메파시엔스 (예를 들어, 생물변이형 1), 에이. 리조게네스 (예를 들어, 생물변이형 2), 에이. 비티스 (예를 들어, 생물변이형 3), 에이. 파브룸 (예를 들어, 균주 C58), 리조비움 종, 메소리조비움 종, 시노리조비움 종, 브라디리조비움 종, 슈도모나스 종, 필로박테리움 종, 오크로박트룸 종, 아조박터 종, 클로스테리움 종, 클레브시엘라 종, 로도스피릴룸 종, 또는 크산토모나스 종의 것들을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 슈도모나스 종 (예를 들어, 피. 사바스타노이 병원체변종 사바스타노이). 일부 실시양태에서, 박테리아 세포는 슈도모나스 사바스타노이 병원체변종 사바스타노이 세포일 수 있다. 본 방법이 적용될 수 있는 식물 종은 제한적이지 않다. 상기 논의된 바와 같이, 적어도 1980년대 초기 이래로, 인간 개입을 통해, DNA를 식물에 전달하는 박테리아의 능력은 박테리아에 의해 자연적으로 감염되는 것들 너머 많은 종으로 연장되었다. 아그로박테리아 종에 대한 자연 숙주인 식물 및 자연 숙주는 아니지만 아그로박테리아 종을 사용하여 형질전환될 수 있는 것으로 나타난 일부 식물의 비-제한적 예는 표 2에 제공된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 이해될 것인 바와 같이, 표 2에 제시된 식물 속 및 종, 뿐만 아니라 임의의 다른 식물 속 및 종은 숙주 식물로서 또는 본원에 기재된 바와 같은 공생체 형성 접종물을 생성하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 식물로서 사용될 수 있고, 공생체 형성 접종물이 그로부터 제조될 수 있는 식물 속 및 종은 표 4 또는 실시예 섹션 전의 단락에 하기 제공된 식물의 목록에 제공된 것들을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 공생체 형성 접종물을 생산하는 방법은 공생체 형성 접종물의 적어도 1개의 세포에서 적어도 1종의 핵산을 편집하여 공생체 형성 접종물에서 적어도 1종의 편집된 핵산을 생산하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. CRISPR-Cas 기술, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 기술; 전사 활성화인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 기술 및 조작된 메가뉴클레아제 기술을 포함하나 이에 제한되지는 않는 뉴클레아제 기반 편집 시스템을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 공지된 유전자 편집 기술이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 편집된 핵산은 변형된 발현을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 발현은 동일한 변형을 포함하지 않는 동일한 핵산과 비교하여 증가된 발현을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 발현은 동일한 변형을 포함하지 않는 동일한 핵산과 비교하여 감소된 발현을 포함한다.
본 발명은 본 발명의 방법에 의해 생산된 공생체 형성 접종물을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 공생체 형성 접종물은 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 1종 이상의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5종, 또는 그 초과의) 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 1종 이상의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5종, 또는 그 초과의) 폴리뉴클레오티드) 및 관심의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 적어도 1종의 관심의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5종, 또는 그 초과))를 포함하는 박테리아 배양물이다. 일부 실시양태에서, 공생체 형성 접종물은 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 1종 이상의 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 1종 이상의 폴리뉴클레오티드) 및 관심의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 적어도 1종의 관심의 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 식물 세포 배양물 (예를 들어, 캘러스 또는 세포 현탁액)의 형태의 2개 이상의 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 공생체 형성 접종물로부터의 세포 또는 원형질체를 제공하고, 여기서 세포 또는 원형질체는 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 공생체 형성 접종물 또는 본 발명의 공생체를 숙주 식물 상의 적어도 1개의 부위 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 부위)에 이식하는 단계; 및 공생체 형성 접종물을 숙주 식물 상의 적어도 1개의 부위에서 배양하여 적어도 1개의 부위에서 숙주 식물 상의 공생체를 형성하고, 여기서 관심의 폴리뉴클레오티드는 숙주 식물 상의 공생체에서 발현되고, 관심의 폴리뉴클레오티드의 발현 생성물 및/또는 관심의 폴리뉴클레오티드의 발현 생성물을 사용하여 제조된 생성물은 숙주 식물 내로 수송되고, 그에 의해 숙주 식물 특징을 변형시키는 단계를 포함하는, 식물 게놈을 변형시키지 않으면서 숙주 식물 특징을 변형시키는 방법이 추가로 제공된다. "식물 게놈을 변형시키지 않으면서 숙주 식물 특징을 변형시키는"은 숙주 식물의 유전자형을 변화시키지 않는 숙주 식물의 형태학, 대사, 생화학, 및/또는 생리학의 변화를 지칭한다.
식물 숙주 특징을 변형시키기 위한 본 발명의 공생체에 유용한 관심의 폴리뉴클레오티드는 숙주 식물 상의 1개 또는 1개 초과의 부위에서 부착된 공생체에서의 발현을 위한 본원에 기재된 바와 같은 분자 (예를 들어, 1종 또는 1종 초과의 폴리펩티드, 펩티드, 코딩 RNA 또는 비-코딩 RNA; 예를 들어, 생체분자, 생물활성 분자)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 분자가 숙주 식물 내로 수송되는 경우, 분자는 숙주 식물의 유전자형 또는 게놈을 변경시키지 않으면서 숙주 식물 상으로 새로운 특징을 부여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 관심의 폴리뉴클레오티드는 생체분자 또는 생물활성 분자를 코딩할 수 있거나, 또는 본원에 기재된 바와 같은 생체분자 및/또는 생물활성 분자에 대한 생합성 효소 (예를 들어, 생체분자 또는 생물활성 분자의 생합성에 관여하는 폴리펩티드)를 코딩할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 숙주 식물 상에 형성된 공생체에 포함되는 "관심의 폴리뉴클레오티드"는 1종의 관심의 폴리뉴클레오티드일 수 있거나, 또는 2종 이상의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15종 또는 그 초과의) 관심의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 2종 이상의 관심의 폴리뉴클레오티드가 공생체에 포함되는 경우, 공생체는 "스태킹된" 공생체로 지칭될 수 있다. 추가적으로, 숙주 식물 상에 형성된 1종 이상의 공생체 (여기서 공생체 중 적어도 2종은 상이한 POI를 포함함)는 "스태킹된 공생체"로 지칭될 수 있다. 스태킹은 또한 숙주 식물 상의 1종 이상의 공생체를 형성하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 모든 공생체는 동일한 POI(들)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된 숙주 식물 특징을 부여하는데 사용되는 공생체에 포함되는 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 1종 또는 1종 초과의 식물호르몬 생합성 효소를 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1종 또는 1종 초과의 식물호르몬 생합성 효소는 1종 또는 1종 초과의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다. 즉, 공생체가 1종 초과의 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 경우, 1종 초과의 식물호르몬 생합성 효소는 또 다른 식물호르몬 생합성 효소와 동일한 폴리뉴클레오티드 상에서 또는 별개의 폴리뉴클레오티드 상에서 임의의 조합으로 코딩될 수 있다.
본 발명의 공생체에서 발현되는 식물호르몬 생합성 효소는 식물 세포에서 발현되어 자율적으로 분열하거나 복제하는 식물 세포를 생산하고, 임의로 비분화된 다세포 구조를 생산할 수 있는 임의의 옥신 또는 시토키닌 생합성 효소일 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 식물 세포에서 발현되어 본원에 기재된 바와 같은 자율적으로 분열하거나 복제하는 식물 세포를 생산할 수 있는 임의의 옥신 생합성 효소 또는 시토키닌 생합성 효소는 공생체 형성 접종물을 제조하는데 사용될 수 있다. 예시적인 옥신 및 시토키닌 생합성 효소 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 상세하게 기재되어 있으며, 인돌-3-아세트아미드 히드롤라제 (iaaH) (E.C. 번호: EC 3.5.1.4), 아미다제 1 (EC 3.5.1.4), 트립토판 2-모노옥시게나제 (IaaM) (EC 1.13.12.3), 인돌-3-락테이트 신타제 (EC 1.1.1.110), L-트립토판--피루베이트 아미노트랜스퍼라제 1 (EC 2.6.1.99), 트립토판 아미노트랜스퍼라제-관련된 단백질 1 (EC 2.6.1.27), 인돌-3-아세트알데히드 옥시다제 (EC 1.2.3.7), 및/또는 트립토판 데카르복실라제 1/트립토판 데카르복실라제 2 (EC4.1.1.105)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 옥신 생합성 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 식물호르몬 생합성 효소는 시토키닌 생합성 효소이다. 본 발명에 유용한 시토키닌 생합성 효소는 이소펜테닐 트랜스퍼라제 (Ipt) (동의어: 아데노신 포스페이트-이소펜테닐트랜스퍼라제; 아데닐레이트 디메틸알릴트랜스퍼라제; (디메틸알릴)아데노신 tRNA 메틸티오트랜스퍼라제) (E.C. 번호: 2.5.1.27 또는 2.5.1.75 또는 2.5.1.112) 및/또는 Tzs (동의어: 디메틸 트랜스퍼라제, 이소펜테닐 트랜스퍼라제, 트랜스-제아틴 생산 단백질, 아데닐레이트 디메틸알릴트랜스퍼라제) (EC 2.5.1.27)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 식물호르몬 생합성 효소는 인돌-3-아세트아미드 히드롤라제 (iaaH), 트립토판 2-모노옥시게나제 (IaaM), 및/또는 이소펜테닐 트랜스퍼라제 (Ipt)일 수 있고, 임의로 인돌-3-락테이트 신타제, 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 식물호르몬 생합성 효소는 임의의 조합으로 인돌-3-아세트아미드 히드롤라제 (iaaH), 트립토판 2-모노옥시게나제 (IaaM), 및/또는 이소펜테닐 트랜스퍼라제 (Ipt)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 공생체는 인돌-3-락테이트 신타제인 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 공생체는 플라스트 폴리펩티드 (예를 들어, 가소성 폴리펩티드)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고 발현할 수 있다. 본 발명에 유용한 플라스트 폴리펩티드는 본 발명의 핵산 구축물을 사용하여 형성되는 공생체의 구조에 대한 유익을 부여할 수 있는 현재 공지된 또는 나중에 발견될 임의의 플라스트 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명의 공생체에 유용한 예시 플라스트 폴리펩티드는 표 1에 제공된 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 플라스트 폴리펩티드는 6b, rolB, rolC, 및/또는 orf13일 수 있다. 일부 실시양태에서, 플라스트 폴리펩티드를 코딩하는 1종 초과의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 공생체에 포함될 수 있다.
일부 실시양태에서, 공생체 형성 접종물을 배양하는 것은, 숙주 식물 상의 박테리아 세포에 포함되는 경우, 약 10 μM 내지 약 200 μM의 범위 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값 (예를 들어, 약 10, 15, 20, 25, 30, 350 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150 μM, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값) (예를 들어, 약 50 μM 내지 약 150 μM, 약 75 μM 내지 약 125 μM, 약 85 μM 내지 약 100 μM)의 농도의 아세토시린곤의 존재 하에서 배양하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아세토시린곤의 존재 하에서 배양하는 경우, 아세토시린곤은 약 100 μM의 농도로 존재한다.
일부 실시양태에서, 박테리아 세포를 포함하는 공생체 형성 접종물은 숙주 식물 게놈을 변형시키지 않으면서 숙주 식물 특징을 변형시키는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 아그로박테리움 종을 함유하는 공생체 형성 접종물은 예를 들어, 제1 식물에 전달될 수 있다. 아그로박테리움 종은 1종 또는 다수의 균주의 형태일 수 있고, 여기서 적어도 1종의 균주는 공생체-형성을 유도하는 (예를 들어, T-DNA에 제공될 수 있는) 적어도 1종의 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 핵산을 함유하고, 적어도 1종의 균주는 숙주 식물에 부여되는 목적하는 소질을 코딩하는 (예를 들어, T-DNA에 제공될 수 있는) 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 함유한다. 따라서 접종물의 전달은 1종 이상의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20종 또는 그 초과의) 공생체가 제1 식물 상에 형성되는 것을 유발할 수 있고, 공생체는 아그로박테리움 종에 의해 전달되는 핵산을 발현할 수 있다. 공생체는 공생체 조직에서 증가된 맥관형성을 가지며, 이는 그 자체가 급속한 성장, 보다 급속한 대사, 및 이출을 위한 효과적인 경로 및 궁극적으로 식물 전반에 걸쳐 목적하는 분자의 전신 이동을 지지한다. 일부 실시양태에서, 공생체는 이어서 제1 식물로부터 분리되고, 숙주 식물과 기능적으로 통신하고, 따라서 목적하는 소질을 갖지만 숙주 식물의 게놈을 형질전환시키거나 변경시키지 않거나, 또는 이질성 또는 생체이물 DNA를 숙주 식물 내로 도입하지 않는 숙주 식물을 공급하는 식물 조직을 형성하도록 제2 식물 (예를 들어, 숙주 식물) 상으로 부착될/이식될 수 있다. 일부 실시양태에서, 분리된 공생체의 숙주 식물에의 이식 전에, 이제 공생체 형성 접종물은 아그로박테리움 종 없이 배양되어 박테리아-무함유 공생체 형성 접종물을 형성할 수 있으며, 그 후 공생체 형성 접종물은 숙주 식물에 이식될 수 있다.
본 발명에 사용되는 아그로박테리움 종 균주(들)의 선택에 관하여, 다양한 단일 균주 또는 이들의 조합은 목적하는 결과를 달성하기 위해 사용가능하다. 한 실시양태에 따르면, 접종물은 적어도 2종의 균주를 포함하고, 여기서 사용되는 적어도 1종의 균주는 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 "활성화된 균주" (예컨대 야생형 균주)이고, 적어도 1종의 다른 균주는 활성화된 균주가 아니지만 (예를 들어, "디스아암드", "소질 유도" 균주), 숙주 식물에서 목적하는 소질 (관심의 폴리뉴클레오티드)을 부여하는 핵산 (예를 들어, T-DNA)을 포함한다. 활성화된 균주는 자연으로부터 단리될 수 있고, 예컨대 야생형 아그로박테리움 종으로서 본원에 기재된 FL-F54 균주는 벌레혹을 형성하는 것으로 공지되어 있다. 목적하는 소질은 예를 들어, 항미생물 또는 항-곤충 특성을 갖는 것, 식물 생리학의 변화, 또는 다른 것들일 수 있다. 소질은 1개 이상의 분자 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 분자), 예컨대 소질-유도 아그로박테리움 종에서 핵산 (예를 들어, T-DNA)에 의해 코딩되는 분자에 의해 발현되거나 실행될 수 있다. 이들 분자는 목적하는 바에 따라 소분자, 대분자, 단백질, 중합체, 또는 다른 것일 수 있다. 다수의 활성화된 균주 및/또는 다수의 소질-유도 균주는 특정 적용을 위해 목적하는 바에 따라 사용될 수 있다. 대안적으로, 둘 다 공생체 형성을 유도하고 또한 공생체가 숙주 식물 게놈을 변형시키지 않으면서 부착되는 숙주 식물에서 목적하는 소질을 유도하는 단일 균주가 사용될 수 있다. 본 방법이 적용될 수 있는 식물 종은 제한되지 않는다. 오늘날, 아그로박테리아 및 다른 박테리아 종을 사용하여 DNA를 식물에 전달하는 것은 통상적이다. 아그로박테리아 종에 대한 자연 숙주인 식물 및 자연 숙주가 아니지만, 아그로박테리아 종을 사용하여 형질전환될 수 있는 것으로 나타난 일부 식물의 비-제한적 예는 표 2에 제공된다. 이 표에 열거된 식물은 쌍자엽 및 단자엽 둘 다를 포함한 많은 상이한 식물 과로부터의 것이며, 본 방법이 사용될 수 있는 식물의 유형은 제한되지 않음을 입증한다. 일부 실시양태에서, 본 방법에 사용될 수 있는 식물 속 및 종은 표 4 또는 실시예 섹션 전의 단락에 하기 제공된 식물의 목록에 제공된 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
접종물은 목적하는 바에 따라 운반체, 및 다른 성분 외에도 상기 기재된 바와 같은 1종 이상의 아그로박테리움 종 균주(들) (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5종, 또는 그 초과의 균주)를 함유할 수 있다. 다수의 균주가 사용되는 경우, 다양한 균주의 비, 예를 들어, 활성화된 균주 대 소질-유도 균주의 1:10의 비가 목적하는 바에 따라 사용될 수 있다. 아그로박테리움 종 전달 접종물은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 적합한 것은 특정 적용에서의 목적하는 결과에 기반하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 접종물은 완충제, 예컨대 MES (2-에탄술폰산), 트리스(Tris) (트리스(히드록시메틸)아미노메탄), HEPES (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산), 또는 염-기반 완충제, 예컨대 PBS (포스페이트-완충 염수)의 수용액; 1종 이상의 염, 예컨대 염화마그네슘, 형질전환 증진제, 예컨대 균력을 증진시킬 수 있는 아세토시린곤 또는 다른 페놀릭 및/또는 음이온성, 양이온성, 및 비이온성 계면활성제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 습윤화/침투 증진 계면활성제 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 아주반트를 함유할 수 있다. 접종물의 전달은 임의의 공지된 방법에 의해, 예컨대 바늘, 구멍 상처, 또는 다른 직접 전달 시스템, 즉, 드릴링 또는 에어 블라스팅의 사용에 의해 달성될 수 있으며, 자동 또는 수동일 수 있다.
공생체 형성은 눈에 의해 관찰될 수 있고, 공생체 크기는 임의로 공지된 수단, 예컨대 화학적 제어 (즉, 갈렉스(GALLEX)® (에이지바이오켐 인크.(AgBioChem Inc.), 미국 캘리포니아주 로스 몰리노스))를 통해 제어될 수 있다. 공생체 형성은 숙주 식물 종 및 사용되는 식물의 연령에 따라 다양한 양의 시간이 걸릴 수 있다. 예를 들어, 충분한 공생체 형성은 개발하기 위해 수 일 내지 수 개월이 걸릴 수 있다. 일부 실시양태에서, 공생체 또는 공생체 조직은 제1 식물로부터 수집되고, 이어서 증가된 부피 또는 저장 목적을 위해 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, 공생체는 배양하지 않고 제1 식물로부터 제2 식물 (예를 들어, 숙주 식물)로 직접적으로 이동될 수 있다. 그러나, 공생체 형성 접종물을 먼저 배양하여 (a) 잔류 박테리아를 예컨대 마멸에 의해 또는 능동적 멸균화에 의해 제거하거나, 또는 (b) 공생체 형성 접종물이 목적하는 소질(들)을 발현하는 것을 결정하는 것이 요망될 수 있다. 잔류 아그로박테리움 종의 제거는 마멸에 의해, 예컨대 박테리아를 지지하지 않고, 따라서 그것이 죽지 않는 배양을 공급함으로써, 또는 능동적 수단에 의해, 예컨대 표백제 및/또는 항생제 또는 박테리아 배양물을 능동적으로 살해하는 다른 방법의 적용으로의 멸균화에 의해 시간 경과에 따라 발생할 수 있다. 공생체 형성 접종물 또는 공생체가 목적하는 소질을 발현하는지 여부의 결정은, 소질이 표현형적으로 가시적인 경우 (예컨대 색상) 단순한 관찰에 의해, 또는 공생체 또는 공생체 형성 접종물에 의해 생산되고 있는 표적 화합물(들)에 대한 배양 배지/숙주 식물의 분석에 의해, 또는 임의의 다른 공지된 수단에 의해 달성될 수 있다.
공생체는 식물로부터 분리되고, 임의의 공지되고 적용가능한 수단에 의해 제2 식물 (예를 들어, 숙주 식물)에 부착시키는 (이식하는) 공생체 형성 접종물로서 사용할 수 있다. 공생체 형성 접종물로서 사용하기 위한 분리된 공생체의 전체는 목적하는 결과를 달성하는데 필수적이지 않을 수 있음이 주목된다. 예를 들어, 공생체로부터의 단지 일부 안정한 물질 (예를 들어, 1개 이상의 세포)은 분리되고, 숙주 식물에 부착시키는데/이식하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법에서, 분리되고 배양물 내로 정치된 단일 공생체의 세포는 번식되어 다수의 숙주 식물 (예를 들어, 공생체 형성 접종물로서) 상으로 이식하는 물질을 제공할 수 있다. 한 식물 또는 식물 부분, 예컨대 공생체 또는 공생체 형성 접종물을 또 다른 식물 (예를 들어, 숙주 식물) 상으로 이식하기 위한 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 본 발명에 사용될 수 있다. 우선적으로, 공생체 형성 접종물은 형성된 공생체가 숙주 식물의 맥관계와 기능적으로 통신하도록, 또는 숙주 식물의 맥관계와의 기능적 통신이 달성가능하도록 숙주 식물에 부착될 수 있다. 이식 방법은 비록 그러한 연결이 이식과 공동으로 확립되지 않는 경우에도, 공생체 조직이 이식 후 필수적인 맥관 연결을 발달시키는 것을 허용할 수 있다. 이렇게 하여, 공생체에 의해 생산된 목적하는 소질/화합물은 제2 식물의 맥관계를 통해 이동할 수 있다. 일부 실시양태에서, 공생체에 의해 생산된 목적하는 소질/화합물은 아포플라스트 및/또는 심플라스트를 통해 숙주 식물에 수송될 수 있다. 일부 실시양태에서, 공생체에 의해 생산된 목적하는 소질/화합물은 숙주 식물 및 공생체 사이에 발달하는 아포플라스트, 심플라스트 또는 맥관계를 통해, 또는 이들의 임의의 조합을 통해 숙주 식물에 수송될 수 있다.
제1 (공생체가 그 상에 또는 그로부터 성장되거나 발달되는 원래 식물) 및 제2 식물 (예를 들어, 공생체 형성 접종물이 그 상으로 이식될 수 있는 숙주 식물)은 상이한 종 사이의 식물 물질의 특이적 상호운용성 (즉, 이식 적합성)에 따라 동일한 종 또는 상이한 종의 것일 수 있다.
일부 실시양태에서, 활성화된 세포/조직은 상기 기재된 바와 같은 아그로박테리움 종의 적어도 1종의 활성화된 균주로의 식물의 접종에 의해 형성될 수 있고, 활성화된 세포/조직은 제1 식물로부터 분리되고 이어서 적어도 1종의 소질-유도 아그로박테리움 종 균주를 함유하는 용액에서 배양될 수 있다. 소질-유도 균주로부터의 핵산 (예를 들어, T-DNA)의 충분한 흡수 후, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들) 및 소질-유도 핵산 (POI) 둘 다를 함유하는 식물 세포 (예를 들어, 공생체 형성 접종물)는 배양물에 존재할 수 있다. 이들 세포 (예를 들어, 공생체 형성 세포 또는 접종물)는 공지된 방법에 의해 선택되고, 이어서 목적하는 바에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포는 관심의 소질을 갖는 보다 많은 공생체 형성 접종물 (예를 들어, 2개 이상의 세포를 포함하는 박테리아 세포 집단, 캘러스 조직 및/또는 현탁 배양물)을 생성하기 위해 선택되고, 분리되고, 배양될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 공생체 형성 접종물의 선택된 세포는 이어서 상기 기재된 바와 같이 사용될 (즉, 멸균될, 제2 식물 (예를 들어, 숙주 식물 등) 상으로 이식될 수 있다.
일부 실시양태에서, 적어도 1종의 pSYM (예를 들어, 적어도 1종의 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 적어도 1종의 POI)을 포함하는 박테리아 (예를 들어, 적어도 1종의 pSYM을 포함하는 1종 이상의 아그로박테리움 종 세포)는 숙주 식물에 직접적으로 전달될 (그 상으로 접종될) 수 있다. 일부 실시양태에서, 공생체 형성 접종물은 상기 기재된 바와 같은 1종의 아그로박테리움 종 균주 또는 1종 초과의 아그로박테리움 종 균주 (예를 들어, 적어도 1종의 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 1종 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 한 균주 및 POI를 포함하는 한 균주 또는 적어도 1종의 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 1종 이상의 폴리뉴클레오티드 및 POI 둘 다를 포함하는 단일 균주)를 포함할 수 있다. 이렇게 하여, 숙주 식물 상에 형성된 생성된 공생체 조직은 숙주 식물을 형질전환시킬 필요 없이 목적하는 분자(들)에 관하여 숙주 식물에 대한 또는 그 상의 유리한 생체공장으로서 작용할 것이다. 일부 실시양태에 따르면, 접종된 균주의 일부 또는 전부는 유용한 공생체 (즉, 과다맥관형성을 갖고 목적하는 소질을 위한 목적하는 분자를 생산하는 공생체)가 식물 상에 형성되면, 박테리아가 죽고 공생체에 더 이상 존재하지 않도록, 낮은 활력의 것이도록 조작될 수 있다.
일부 실시양태에서, 공생체 형성 접종물을 숙주 식물 상에서 배양하는 것은 습도를 증가시키는 조건 하에서 배양하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 공생체 형성 접종물과 접촉되거나 공생체가 그 상으로 이식되는 숙주 식물 상의 부위는 공생체 또는 공생체 형성 접종물의 바로 옆의 영역에서 습도를 증가시키기 위해 커버될 수 있다. 숙주 식물 상으로 이식된 공생체 또는 공생체 형성 접종물을 둘러싼 영역에서 습도를 보유하는 임의의 유형의 커버링이 사용될 수 있다. 예로서, 한 숙주 식물의 부위 상에 위치한 공생체 또는 공생체 형성 접종물은 습도를 보유하는 필름으로 감싸거나 커버될 수 있다. 일부 실시양태에서, 필름은 플라스틱 필름, 규소 테이프, 및/또는 파라필름을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 숙주 식물 상의 공생체 또는 공생체 형성 접종물은 이식 후 (예를 들어, 직후 또는 그 후 약 15분 내지 5시간 내에) 약 1시간 내지 약 72시간 또는 그 초과, 약 1시간 내지 약 48시간 또는 그 초과 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10시간 내지 약 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36시간 또는 그 초과 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값 동안 공생체 또는 공생체 형성 접종물의 영역에서 습도를 증가시키기 위해 커버될 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 식물 상의 공생체 또는 공생체 형성 접종물은 이식 (숙주 식물) 또는 접종 (접종물 형성) 후 약 10시간 내지 약 30시간 (예를 들어, 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30시간) 동안, 임의로 약 24시간 동안 공생체 또는 공생체 형성 접종물의 영역에서 습도를 증가시키기 위해 커버될 수 있다.
일부 실시양태에서, 적어도 1개의 부위에서 숙주 식물을 이식하기 전에 또는 그와 공동으로, 숙주 식물은 적어도 1개의 부위에서 상처입을 수 있다. 상처입히기는 공생체 또는 공생체 형성 접종물이 그 상으로 이식되는 부위에서 식물 또는 식물 부분의 외표면 (표피, 각피, 껍질)을 파괴하는데 유용한 임의의 도구를 사용하여 임의의 방식으로 수행될 수 있다. 이러한 도구는 핀셋 또는 포셉, 나이프, 바늘, 예를 들어 (예를 들어, 피하, 절개, 문신, 재봉 등), 이쑤시개, 및/또는 시린지를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 또한, 임의의 표준 그라프팅 도구는 본원에 기재된 바와 같은 도입 또는 이식을 위해 이용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 숙주 식물 상의 적어도 1개의 부위는 숙주 식물의 지상부 상에 및/또는 숙주 식물의 지하부 상에 있을 수 있다.
일부 실시양태에서, 공생체는 숙주 식물 상으로 적어도 2회 이식된다. 일부 실시양태에서, 공생체 형성 접종물은 숙주 식물 상으로 적어도 2회 이식된다. 일부 실시양태에서, 공생체 및/또는 공생체 형성 접종물은 숙주 식물 상의 적어도 2개의 부위 상으로 이식된다.
일부 실시양태에서, 관심의 폴리뉴클레오티드의 발현 생성물은 전사 생성물 또는 번역 생성물, 또는 그의 변형일 수 있다. 예로서, 관심의 폴리뉴클레오티드의 발현 생성물은 전사 생성물의 메틸화일 수 있다. 일부 실시양태에서, 관심의 폴리뉴클레오티드의 발현 생성물은 예를 들어, 번역 생성물의 글리코실화일 수 있다. 번역 생성물은 단백질 (폴리펩티드) 또는 펩티드일 수 있다. 전사 생성물은 리보핵산 (RNA)이다. 일부 실시양태에서, RNA는 코딩 RNA (예를 들어, mRNA)이다. 일부 실시양태에서, RNA는 운반 RNA (tRNA), 리보솜 RNA (rRNA), 작은 핵 RNA (snRNA), 작은 인 RNA (snoRNA), 피위-상호작용 RNA(piRNA), 마이크로RNA (miRNA), 긴 비-코딩 RNA (lncRNA), 및/또는 작은 간섭 RNA (siRNA)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 비-코딩 RNA이다.
일부 실시양태에서, 관심의 폴리뉴클레오티드의 발현 생성물은 화학물질, 단백질 (폴리펩티드/펩티드) 또는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는 또 다른 생성물을 제조하는데 사용될 수 있는 생합성 효소일 수 있다.
변형된 숙주 식물 특징은 숙주 식물의 대사의 변화, 숙주 식물의 구조 (예를 들어, 형태학)의 변화, 및/또는 숙주 식물의 대사, 생화학 및/또는 생리학의 변화를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 식물 특징의 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 숙주 식물 특징은 예를 들어, 질환 유발 유기체, 예컨대, 예를 들어, 진균, 박테리아, 바이러스 및/또는 원충에 대한 식물의 반응의 변화일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 변형된 숙주 식물 특징은 공생체를 포함하지 않는 식물과 비교하여 질환 유발 유기체에 대한 증가된 내성/저항성을 발생시킬 수 있다. 질환 유발 유기체는 진균, 박테리아, 바이러스 및/또는 원충을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 숙주 식물 특징은 식물 방어 유전자의 증가된 (유도된) 발현이고, 그에 의해 증가된 질환 저항성을 갖는 숙주 식물을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 증가될 수 있는 식물 방어 유전자는 "W-박스" 방어 유전자를 포함한다. W-박스 방어 유전자는 CAD1, NPR1, 및/또는 PR2를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 식물 방어 유전자는 공생체에서의 화학물질, 예컨대 숙주 식물에 수송되고 숙주 식물에서 전신 획득된 저항성 반응을 자극시키는 화학물질의 생산을 통해 공생체를 통해 숙주 식물에서 증가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 식물 방어 유전자는 숙주 식물에서 전신 획득된 저항성 반응을 자극시키는 화학물질의 숙주 식물에서의 생산을 통해 숙주 식물에서 증가될 수 있고, 여기서 숙주 식물에서 화학물질을 생산하는 생화학적 경로는 숙주 식물에 수송되는 공생체에서의 관심의 폴리뉴클레오티드의 생성물에 의해 변형된다.
일부 실시양태에서, 변형된 숙주 식물 특징은 예를 들어, 곤충 또는 선충에 대한 식물의 반응의 변화일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 변형된 숙주 식물 특징은 공생체를 포함하지 않는 식물과 비교하여 증가된 곤충 내성/저항성이다. 내성 또는 저항성이 증가될 수 있는 곤충은 레피도프테라(Lepidopteran), 콜레오프테라(Coleopteran), 헤미프테라(Hemiptera), 티사노프테라(Thysanoptera), 및 디프테라(Diptera) 목의 곤충을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 숙주 식물 특징은 공생체를 포함하지 않는 식물과 비교하여 증가된 선충 내성/저항성이다. 내성 또는 저항성이 증가될 수 있는 선충은 뿌리 혹 선충 (멜로이도기네(Meloidogyne) 종), 포낭 선충 (헤테로데라(Heterodera) 종 및 글로보데라(Globodera) 종), 뿌리 병변 선충 (프라틸렌쿠스(Pratylenchus) 종), 천공 선충 (랍도폴루스 시밀리스(Radopholus similis)), 신장모양 선충 (로틸렌쿨루스 레니포르미스(Rotylenchulus reniformis)), 포도 선충 (크시피네마 인덱스(Xiphinema index)), 및 시트러스 선충 (틸렌쿨루스 세미페네트란스(Tylenchulus semipenetrans))을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 변형된 숙주 식물 특징은 박테리아 해충에 대한 식물의 반응의 변화일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 변형된 숙주 식물 특징은 공생체를 포함하지 않는 식물과 비교하여 박테리아 해충에 대한 증가된 내성/저항성이다. 본 발명은 크산토모나스 악소노포디스(Xanthomonas axonopodis), 크산토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris), 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora), 에르위니아 카로토보라(Erwinia carotovora), 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스, 칸디다투스 리베리박터 솔라나세아룸(Candidatus Liberibacter solanacearum), 슈도모나스 시린가에(Pseudomonas syringae), 크실레라 파스티디오사(Xylella fastidiosa), 디케야 솔라니(Dickeya solani), 디케야 다단티이(Dickeya dadantii), 펙토박테리움 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum) 및/또는 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 많은 박테리아 해충에 대한 저항성 또는 내성을 증가시킬 수 있는 방법 및 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 변형된 숙주 식물 특징은 제초제에 대한 식물의 반응의 변화일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 변형된 숙주 식물 특징은 공생체를 포함하지 않는 식물과 비교하여 증가된 제초제 내성/저항성이다. 숙주 식물 특징이 저항성 또는 내성을 갖도록 변형될 수 있는 제초제의 예는 글리포세이트, 트리아진, 디캄바, 2,4-D, 클로피랄리드, 플루미옥사진, 카르펜트로존-에틸, 술펜트로존, 락토펜, 포메사펜, 아시플루오르펜, 메소트리온, 술코트리온, 템보트리온, 토프라메존, 피콜리나펜, 클로마존, 이속사플루톨, 메페나세트, 플루페나세트, 이마자목스, 이마자피르, 이마제타피르, 림술푸론, 트리베누론-메틸, 트리아술푸론, 니코술푸론, 술포술푸론, 술포메투론-메틸, 메소술푸론-메틸, 아짐술푸론, 아미도술푸론, 시클로술파무론, 플루메트술람, 메토술람, 플로라술람, 디클로술람, 및/또는 티엔카르바존-메틸을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 일부 실시양태에서, 변형된 숙주 식물 특징은 공생체를 포함하지 않는 식물과 비교하여 증가된 제초제 내성/저항성이다. 숙주 식물에서의 증가된 제초제 내성/저항성은 1종의 제초제에 대한 것일 수 있거나, 또는 2종 이상의 상이한 제초제에 대한 것일 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형된 숙주 식물 특징은 비생물적 스트레스에 대한 식물의 반응의 변화일 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 숙주 식물 특징은 본 발명의 공생체를 포함하지 않는 식물과 비교하여 비생물적 스트레스에 대한 증가된 내성이다. 일부 실시양태에서, 숙주 식물은 1종 초과의 비생물적 스트레스 내성 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5종, 또는 그 초과의 비생물적 스트레스)에 대한 증가된 내성을 나타낼 수 있다. 본원에 사용된 용어 "비생물적 스트레스"는 식물에 대한 해로운 효과를 유발할 수 있는 외부의 살아 있지 않은 인자를 지칭한다. 따라서, 본원에 사용된 비생물적 스트레스는 동결, 냉장, 열 또는 고온을 발생시키는 차가운 온도, 가뭄, 과잉수, 높은 광 강도, 낮은 광 강도, 높은 자외광, 염분, 오존, 및/또는 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 비생물적 스트레스 인자에 대한 파라미터는 종 특이적이고, 심지어 변종 특이적이며, 따라서 비생물적 스트레스에 노출된 종/변종에 따라 폭넓게 다양하다. 따라서, 한 종은 23℃의 고온에 의해 심각하게 영향을 받을 수 있는 반면, 또 다른 종은 적어도 30℃까지 영향을 받지 않을 수 있는 등이다. 30℃ 초과의 온도는 대부분의 중요한 작물의 수율의 극적인 감소를 발생시킨다. 이는 대략 20 내지 25℃에서 시작하는 광합성의 감소, 및 보다 높은 온도에서 성장하는 작물의 증가된 탄수화물 요구에 기인한다. 임계 온도는 절대적이지 않지만, 우세한 환경적 조건에 대한 작물의 순화와 같은 인자에 따라 다양하다. 또한, 대부분의 작물은 한 번에 다수의 비생물적 스트레스에 노출되기 때문에, 스트레스 사이의 상호작용은 식물의 반응에 영향을 미친다. 예를 들어, 과량의 광으로부터의 손상은 온도가 광합성 최적치 초과로 증가함에 따라 더 낮은 광 강도에서 발생한다. 물 스트레스를 받은 식물은 감소된 증산으로 인해 과다가열된 조직을 냉각시키는 능력이 적고, 이는 과량의 (높은) 열 및/또는 과량의 (높은) 광 강도의 영향을 추가로 악화시킨다. 따라서, 작물 생산성에 영향을 미치는 고온/저온, 광 강도, 가뭄 등에 대한 특정 파라미터는 종, 변종, 순화의 정도 및 환경적 조건의 조합에의 노출에 따라 다양할 것이다.
본원에 사용된 "비생물적 스트레스에 대한 증가된 내성"은 대조군 식물 또는 그의 부분 (즉, 동일한 비생물적 스트레스에 노출되었고 공생체를 포함하지 않는 식물 또는 그의 부분)보다 주어진 비생물적 스트레스를 더 잘 견디는 비생물적 스트레스에 노출된 본 발명의 공생체를 포함하는 식물 또는 그의 부분의 능력을 지칭한다. 비생물적 스트레스에 대한 증가된 내성은 식물 또는 그의 부분의 크기 및 수 등 (예를 들어, 과실의 수 및 크기), 세포 분열의 수준 또는 양, 불개화의 양, 일광화상 손상의 양, 작물 수율 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 파라미터를 사용하여 측정될 수 있다. 따라서, 본 발명의 일부 실시양태에서, 본 발명의 공생체를 포함하고, 비생물적 스트레스에 대한 증가된 내성을 갖는 식물 또는 그의 부분은 예를 들어, 동일한 스트레스에 노출되지만 공생체를 포함하지 않는 식물 또는 그의 부분과 비교하여 감소된 불개화를 가질 것이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 공생체에서의 관심의 폴리뉴클레오티드의 발현은 숙주 식물에 대한 증가된 비생물적 스트레스 내성을 부여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 공생체에 의해 생산되고 숙주 식물에 수송된 생체분자 및/또는 생물활성 분자의 존재는 숙주 식물에 대한 증가된 비생물적 스트레스 내성을 부여하고, 그에 의해 숙주 식물 특징을 변형시킬 수 있다.
일부 실시양태에서 변형된 숙주 식물 특징은 숙주 식물 형태학의 변형이다. 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함하고 발현하는 본원에 기재된 바와 같은 공생체는 잎, 줄기, 꽃, 뿌리, 봉오리, 종자, 분열조직, 과실, 괴경 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 식물 구조를 변경시키는데 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 형태학은 공생체를 포함하지 않는 식물과 비교하여 단축된 절간, 증가된 곁가지화 및/또는 증가된 개화를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 변형된 숙주 식물 특징은 생체분자, 생물활성 분자 및/또는 생체분자 및/또는 생물활성 분자의 생합성에 관여하는 폴리펩티드의 존재이고, 여기서 생체분자, 생물활성 분자 및/또는 생체분자 및/또는 생물활성 분자의 생합성에 관여하는 폴리펩티드는 관심의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되거나, 또는 관심의 폴리뉴클레오티드의 발현으로부터 초래되며 (예를 들어, 관심의 폴리뉴클레오티드는 식물에서 생물활성 분자의 생산에 영향을 미치는 폴리펩티드 또는 조절 핵산을 코딩함), 이는 이어서 숙주 식물 내로 수송될 수 있고, 그에 의해 숙주 식물 특징을 변형시키고, 여기서 변형된 숙주 특징은 생체분자 및/또는 생물활성 분자의 존재를 포함할 수 있고/거나, 생체분자 및/또는 생물활성 분자의 존재의 결과일 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 식물 상에 형성된 공생체는 숙주 식물의 그것과 연결하는 맥관계를 발달시킨다. 일부 실시양태에서, 공생체에서 생산된 (예를 들어, 관심의 폴리뉴클레오티드에 의해 발현된) 생체분자 및/또는 생물활성 분자는 연결된 맥관계 또는 조직을 통해 숙주 식물에 수송될 수 있다. 일부 실시양태에서, 공생체로부터 숙주 식물로의 생체분자 및/또는 생물활성 분자의 수송은 전신 수송일 수 있다. 일부 실시양태에서, 공생체에서 생산된 생체분자 및/또는 생물활성 분자는 공생체 및 숙주 식물 사이의 연결된 조직의 아포플라스트 및/또는 심플라스트를 통해 숙주 식물에 수송될 수 있다. 일부 실시양태에서, 공생체로부터 숙주 식물로의 생체분자 및/또는 생물활성 분자의 수송은 공생체 및 숙주 식물의 연결된 맥관계, 아포플라스트 경로 및/또는 심플라스트 경로의 임의의 조합을 통해서일 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 생체분자 및/또는 생물활성 분자를 코딩하는 관심의 폴리뉴클레오티드는 숙주 식물 상으로 이식된 본 발명의 공생체에 포함되고, 여기서 관심의 폴리뉴클레오티드는 공생체에서 발현되고, 생체분자 및/또는 생물활성 분자는 숙주 식물에 수송된다.
일부 실시양태에서, 생체분자 및/또는 생물활성 분자는 제약, 생물자극제, 생물살진균제, 생물제초제, 살곤충 단백질/펩티드, 트립신 조정 오스타틱 인자 (TMOF); 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis) 독소, 식물성 살곤충 단백질 (Vip), 영양분, 식물 성장 조절제, RNAi, 식물항체, 스틸렛 쉬스 억제 단백질, 리보자임, 박테리오신, 식물 지질, 식물 지방산, 식물 오일, 항미생물 펩티드, 압타머, CRISPR-Cas 시스템 폴리펩티드 및 상응하는 CRISPR 가이드 핵산, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성화인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 및/또는 조작된 메가뉴클레아제를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. "생체분자"는 살아 있는 유기체 및/또는 그의 부분 (예를 들어, 세포 또는 무세포 시스템))에 의해 생산되는 임의의 분자이다. 따라서, 생체분자는 공생체에 포함되고 그에서 발현되고, 임의로 공생체가 부착되거나 첩부되는 숙주 식물에 수송되는 관심의 폴리뉴클레오티드로부터 직접적으로 또는 간접적으로 초래되는 공생체에 의해 생산되는 임의의 분자를 포함한다. 생체분자는 또한 공생체에서의 POI로부터 발현되는 상이한 생체분자 (예를 들어, 제1 생체분자)의 숙주 식물 내로의 수송의 결과로서 숙주 식물에서 생산되는 생체분자 (예를 들어, 제2 생체분자)를 지칭할 수 있다 (예를 들어, POI는 생체분자의 생합성에 관여하는 효소를 코딩할 수 있고, 이는 이어서 그 생합성 효소를 이용하여 숙주 식물에서 생산된다). "생체분자"는 "생물활성 분자"를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 생물활성 분자는 생물학적 활성을 포함하는 임의의 생체분자를 포함하며, 그의 많은 비-제한적 예는 본원에 기재되어 있다.
본원에 사용된 "제약"은 치료 단백질, 치료 폴리뉴클레오티드, 및/또는 치료 화학물질을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 제약은 백신, 항체, 재조합 항체, 항체 단편, 융합 단백질, 항체 융합 단백질, 인간 혈청 알부민, 위 리파제, 인슐린, 글루코세레브로시다제, 성장 인자, 시토카인, B형 간염 표면 항원 (HBsAg), Apo-A1, 알파-갈락토시다제 (PRX-102), 알파-갈락토시다제 (PRX-102), 아세틸콜린스테라제 (PRX-105), 항종양 괴사 인자 (Pr-항-TNF), IgG, 인터페론-알파, 플라스민, 락토페린, 리소자임, 및/또는 콜라겐을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
관심의 폴리뉴클레오티드에서 코딩될 수 있는 예시 박테리오신은 악시도신, 악타가르딘, 아그로신, 알베이신, 아우레오신, 아우레오신 A53, 아우레오신 A70, 비신, 카르노신, 카르노시클린, 카세이신, 세레인, 시르쿨라린 A, 콜리신, 쿠르바티신, 디베르신, 두라마이신, 엔테로신, 엔테로리신, 에피데르민/갈리데르민, 에르위니오신, 가르디마이신, 가세리신 A, 글리시네신, 할로신, 할로두라신, 클레비신, 락토신 S, 락토코신, 락티신, 류코신, 리소스타핀, 마세도신, 메르사시딘, 메센테리신, 미크로비스포리신, 미크로신 S, 뮤타신, 니신, 파에니바실린, 플라노스포리신, 페디오신, 펜토신, 플란타리신, 뉴모시클리신, 피오신, 류테리신 6, 사카신, 살리바리신, 서브란신, 서브틸린, 술포로비신, 타스만신, 투리신 17, 트리폴리톡신, 바리아신, 비브리오신, 와르네리신, 및/또는 와르네린을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
관심의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있는 본 발명에 유용한 추가의 항미생물 펩티드는 그라미시딘 (AVGALAVVVWLWLWLW 서열식별번호:35), 마가이닌 2 (GIGKFLHSAKKFGKAFVGEIMNS 서열식별번호:36), LL-37 (카텔리시딘) (LGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKFLRNLVPRTES 서열식별번호:37), 피르호코리신 (PrAMP) (VDKGSYLPRPTPPRPIYNRN 서열식별번호:38), 니신 A (란티비오틱) (ITSISLCTPGCKTGALMGCNMKTATCHCSIHVSK 서열식별번호:39), HNP1 (α-데펜신) (ACYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC 서열식별번호:40), TAP (β-데펜신)NPVSCVRNK (GICVPIRCPGSMKQIGTCVGRAVKCCRKK 서열식별번호:41), 플렉타신 (GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY 서열식별번호:42), 콜리스틴 (XTXXKLLXXT 서열식별번호:43)(X = 2,4-디아미노부탄산), 답토마이신 (WNDTGKDADGSEY 서열식별번호:44), 미크로신 J25 (VGIGTPIFSYGGGAGHVPEYF 서열식별번호:45), 알라메티신 (펩타이볼) (PBABAQBVBGLBPVBBEQ 서열식별번호:46)(B = α-아미노이소부티르산), 그라미시딘 (SVKLFPVKLFP 서열식별번호:47), 서브틸로신 A (NKGCATCSIGAACLVDGPIPDFEIAGATGLFGLWG 서열식별번호:48), 칼라타 B1 (시클로티드)(GLPVCGETCVGGTCNTPGCTCSWPVCTRN 서열식별번호:49), 레수스 θ-데펜신 1 (RTD-1) () (GFCRCLCRRGVCRCICTR 서열식별번호:50)을 포함한다.
관심의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있는 예시 생물살곤충제는 자부레톡스 (예를 들어, 서열식별번호:24, 폴리펩티드 서열식별번호:25), 트립신 조정 오스타틱 인자 (TMOF) (예를 들어, 서열식별번호:26; 폴리펩티드 서열식별번호:27, 28), 바실루스 투린기엔시스 독소 (예를 들어, δ 내독소, 예를 들어, Cry (결정) 독소, Cyt (세포독성) 독소) (예를 들어, 서열식별번호:33; 폴리펩티드 서열식별번호:34); 스틸렛 쉬스 억제 단백질 (예를 들어, 피신 (예를 들어, 서열식별번호:51), 브로멜라인), 및/또는 식물성 살곤충 단백질 (Vip)을 포함한다. 이들은 널리 공지된 폴리펩티드이다. 바실루스 투린기엔시스 독소는 예를 들어, Cry (결정) 독소 (예를 들어, Cry I, Cry II, Cry III, Cry IV), Cyt (세포독성) 독소, 그들의 아미노산 유사성의 정도에 따라 4개의 패밀리 Vip1, Vip2, Vip3 및 Vip4로 분류되는 식물성 살곤충 단백질 (Vip), 및 분비된 살곤충 단백질 (Sip) 독소를 포함한다. 이들 단백질은 넓거나 좁을 수 있는 다양한 범위의 독성을 갖는 독소를 포함한다 (예를 들어, 곤충의 특성 군에 대해서만 독성임).
일부 실시양태에서, 관심의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 생물활성 분자는 자부레톡스 (펩티드 JBTX), 트립신 조정 오스타틱 인자 (TMOF), 비. 투린기엔시스 δ 내독소, Cry 독소, Cyt 독소, 레게모글로빈, 니트로게나제, 피신, 브로멜라인, 박테리오신, 니신, 온코신 및/또는 온코신 유사체 (예를 들어, 서열식별번호:29, 서열식별번호:30, 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 32)이다.
일부 실시양태에서, 변형된 숙주 식물 특징 생물활성 분자 (예를 들어, 살생물 분자)의 존재 및 공생체를 포함하지 않는 식물과 비교하여 식물 병원체에 대한 증가된 저항성/내성 및 공생체로부터 식물 내로 수송된 생물활성 분자의 존재이다. 일부 실시양태에서, 살생물제는 박테리오신 또는 항미생물 펩티드이고, 식물 병원체는 박테리아이다. 일부 실시양태에서, 박테리오신 또는 항미생물 펩티드는 온코신 및/또는 니신이다.
일부 실시양태에서, 변형된 숙주 식물 특징은 살곤충 단백질 (예를 들어, 생물살곤충제)의 존재 및 공생체를 포함하지 않는 식물과 비교하여 증가된 곤충 내성 또는 저항성 및 공생체로부터 식물 내로 수송되는 살곤충 단백질의 존재이다. 일부 실시양태에서, 살곤충 단백질은 자부레톡스, 트립신 조정 오스타틱 인자 (TMOF), 바실루스 투린기엔시스 독소 (예를 들어 δ 내독소), 임의로 Cry (결정) 독소, Cyt (세포독성) 독소, 식물성 살곤충 단백질 (Vip) 또는 분비된 살곤충 단백질 (Sip) 독소 및/또는 스틸렛 쉬스 억제 단백질, 임의로 피신 및/또는 브로멜라인이다.
일부 실시양태에서, 스틸렛 쉬스 억제 단백질은 본 발명의 공생체에서 관심의 폴리뉴클레오티드에 의해 발현될 수 있다. 이러한 억제 펩티드는 미국 특허 출원 번호 2018/0199577에 예시된 바와 같이 공지되어 있다. 공생체에서의 발현에 유용한 예시 스틸렛 쉬스 억제 펩티드는 표 3에 열거된 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
표 4는 식물 및 식물이 취약한 예시 질환 또는 해충 (예를 들어, 곤충 및/또는 선충 해충)의 예시적인 목록을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 이들 질환 및 해충에 대한 식물에서의 증가된 내성/저항성을 제공하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형된 숙주 식물 특징은 식물 지질, 식물 지방산, 및/또는 식물 오일의 존재 또는 그의 증가된 또는 감소된 생산이다.
일부 실시양태에서, 변형된 숙주 식물 특징은 식물 성장 조절제 (예를 들어, 옥신, 시토키닌, 지베렐린, 에틸렌; 성장 억제제/지연제)의 존재 또는 그의 증가된 또는 감소된 생산 및 변형된 성장이다. 일부 실시양태에서, 변형된 성장은 숙주 식물에서의 성장 조절제 (예를 들어, 식물호르몬 생합성 효소)의 증가된 또는 감소된 생산을 발생시키는 공생체로부터 숙주 식물 내로의 성장 조절제의 수송의 결과로서, 또는 공생체로부터 숙주 식물 내로의 생물활성 분자의 수송의 결과로서, 숙주 식물의 증가된 성장 또는 감소된 성장 및/또는 숙주 식물의 부분의 증가된 또는 감소된 성장일 수 있다. 식물 성장 조절제의 증가된 또는 감소된 생산 및 변형된 성장은 대조군 식물 (예를 들어, 공생체 및 식물 성장 조절제의 존재를 포함하지 않는 식물 및/또는 공생체 및 식물 성장 조절제의 증가된 또는 감소된 생산을 포함하지 않는 식물)에 비교한 것이다.
일부 실시양태에서, 변형된 숙주 식물 특징은 RNA의 존재 및 그의 증가된 생산 및 폴리뉴클레오티드, 펩티드 또는 폴리펩티드의 증가된/감소된 생산이다. 본 발명에 유용한 RNA는 식물 특징을 변형시키는데 사용될 수 있는 임의의 RNA, 예컨대 RNA 간섭 (RNAi)에 사용되는 임의의 RNA일 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA는 siRNA, dsRNA, miRNA, 및/또는 shRNA를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 RNA는 dvsnf7, ccomt, dCS, asn1, phL, RI, PGAS, 및/또는 ppo5를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 방법에 의해 생산된 변형된 특징을 갖는 숙주 식물을 추가로 제공한다.
본 발명의 공생체를 제공하고, 여기서 관심의 폴리뉴클레오티드는 생체분자 및/또는 생물활성 분자를 코딩하고, 공생체 또는 공생체 형성 접종물에서 생산된 생체분자 및/또는 생물활성 분자를 수집하는 단계; 및/또는 본 발명의 숙주 식물을 제공하고, 여기서 관심의 폴리뉴클레오티드는 생체분자 및/또는 생물활성 분자를 코딩하고, 공생체 형성 접종물 및/또는 공생체 및/또는 숙주 식물에서 생산된 생체분자 및/또는 생물활성 분자를 수집하는 단계를 포함하는, 생체분자 또는 생물활성 분자를 생산하는 방법이 또한 본원에서 제공된다.
본 발명의 공생체 형성 접종물 또는 본 발명의 공생체를 숙주 식물 상의 적어도 1개의 부위 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 부위) 상으로 이식하는 단계; 및 공생체 형성 접종물 또는 공생체를 숙주 식물 상의 적어도 1개의 부위에서 배양하여 적어도 1개의 부위에서 숙주 식물 상의 공생체를 형성하고, 여기서 관심의 폴리뉴클레오티드는 공생체에서 발현되고, 관심의 폴리뉴클레오티드의 발현 생성물 및/또는 관심의 폴리뉴클레오티드의 발현 생성물을 사용하여 제조된 생성물은 숙주 식물 내로 수송되고, 그에 의해 관심의 화합물을 식물에 전달하는 단계를 포함하는, 관심의 화합물을 숙주 식물에 전달하는 방법이 추가적으로 제공된다.
본 발명의 공생체 형성 접종물 또는 본 발명의 공생체를 숙주 식물 상의 적어도 1개의 부위 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 부위) 상으로 이식하는 단계; 및 공생체 형성 접종물 또는 공생체를 숙주 식물 상의 적어도 1개의 부위에서 배양하여 적어도 1개의 부위에서 숙주 식물 상의 공생체를 형성하고, 여기서 관심의 폴리뉴클레오티드는 공생체에서 발현되고, 관심의 폴리뉴클레오티드의 발현 생성물 및/또는 관심의 폴리뉴클레오티드의 발현 생성물을 사용하여 제조된 생성물은 숙주 식물 내로 수송되고, 그에 의해 변형된 유전자형을 갖지 않는 변형된 표현형을 포함하는 식물을 생산하는 단계를 포함하는, 식물의 유전자형을 변형시키지 않으면서 변형된 특징을 포함하는 식물을 생산하는 방법이 또한 제공된다. 본 발명의 방법에 의해 생산된 식물이 또한 제공된다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드 (예를 들어, 관심의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 식물호르몬 생합성 효소)는 표적화 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 그의 N-말단 또는 그의 C-말단 또는 둘 다에서 표적화 서열에 연결될 수 있다. 본 발명에 유용한 표적화 서열은 폴리펩티드 또는 펩티드를 특이적 세포소기관 또는 식물 부분에 지정할/위치시킬 수 있는 임의의 표적화 서열일 수 있다. 표적화 서열은 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자의 N- 또는 C- 말단에서 작동가능하게 연결될 수 있고, 임의로 여기서 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자는 표적화 서열에 대해 이종이다. 표적화 (또는 신호) 서열 또는 표적화 펩티드 (및 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열)는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 공개 데이터베이스, 예컨대 "신호 펩티드 웹사이트: 신호 서열 및 신호 펩티드에 대한 정보 플랫폼" (www.signalpeptide.de); "신호 펩티드 데이터베이스" (proline.bic.nus.edu.sg/spdb/index) (Choo et al., BMC Bioinformatics 6:249 (2005)(biomedcentral.com/1471-2105/6/249/abstract 상에서 이용가능함); 클로로P(ChloroP) (cbs.dtu.dk/services/ChloroP/; 단백질 서열에서의 엽록체 수송 펩티드 (cTP)의 존재 및 잠재적 cTP 절단 부위의 위치를 예측함); LipoP (cbs.dtu.dk/services/LipoP/; 그람 음성 박테리아에서 지질단백질 및 신호 펩티드를 예측함); MITOPROT (ihg2.helmholtz-muenchen.de/ihg/mitoprot; 미토콘드리아 표적화 서열을 예측함); PlasMit (gecco.org.chemie.uni-frankfurt.de/plasmit/index; 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum)에서 미토콘드리아 수송 펩티드를 예측함; 프레도타르(Predotar) (urgi.versailles.inra.fr/predotar/predotar.html; 미토콘드리아 및 플라스티드 표적화 서열을 예측함); PTS1 (mendel.imp.ac.at/mendeljsp/sat/pts1/PTS1predictor.jsp; 퍼옥시좀 표적화 신호 1 함유 단백질을 예측함); 시그널P(SignalP) (cbs.dtu.dk/services/SignalP/; 상이한 유기체: 그람-양성 원핵생물, 그람-음성 원핵생물, 및 진핵생물로부터의 아미노산 서열에서 신호 펩티드 절단 부위의 존재 및 위치를 예측함)에서 발견될 수 있다. 시그널P 방법은 몇몇 인공 신경 네트워크 및 숨겨진 마르코프(Markov) 모델의 조합에 기반하여 절단 부위의 예측 및 신호 펩티드/비-신호 펩티드 예측을 혼입하고; 타겟P(TargetP) (cbs.dtu.dk/services/TargetP/)는 진핵생물 단백질의 세포하 위치를 예측한다 - 위치 할당은 임의의 N-말단 프리서열의 예측된 존재에 기반한다: 엽록체 수송 펩티드 (cTP), 미토콘드리아 표적화 펩티드 (mTP) 또는 분비 경로 신호 펩티드 (SP)). (또한 문헌 [von Heijne, G., Eur J Biochem 133 (1) 17-21 (1983)]; [Martoglio et al. Trends Cell Biol 8 (10):410-5 (1998)]; [Hegde et al. Trends Biochem Sci 31(10):563-71 (2006)]; [Dultz et al. J Biol Chem 283(15):9966-76 (2008)]; [Emanuelsson et al. Nature Protocols 2(4) 953-971(2007)]; [Zuegge et al. 280(1-2):19-26 (2001)]; [Neuberger et al. J Mol Biol. 328(3):567-79 (2003)]; 및 [Neuberger et al. J Mol Biol. 328(3):581-92 (2003)] 참조). 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 표적화하는데 유용한 예시 표적화 서열은 표 5에 제공된 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, POI에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 분비계를 표적화하는 서열 (예를 들어, 세포질 세망 (ER), 예를 들어, ER 표적화 서열)에 작동가능하게 연결될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 실시양태에 유용한 식물, 식물 부분 또는 식물 세포는 피자식물 (예를 들어, 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물), 나자식물, 조류 (예를 들어, 대형조류, 예를 들어, 로도피타 (홍조류), 파에오피타 (갈조류) 및 클로로피타 (녹조류), 크리소피세아에 (금조류)), 선태류 , 양치류 및/또는 양치류 동류 (즉, 양치식물)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 식물이거나 또는 임의의 식물로부터의 것일 수 있다.
본 발명에 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 공생체 형성 접종물, 공생체, 식물, 또는 숙주 식물에) 유용한 식물은 아벨리아(Abelia) 종 (댕강나무), 아벨모스쿠스(Abelmoschus) 종 (오크라), 아비에스(Abies) 종 (전나무), 아카시아(Acacia) 종 (아카시아), 아칼리파(Acalypha) 종 (깨풀나무), 아카(Acca) 종 (페이조아, 파인애플 구아바, 구아바스틴), 아서(Acer) 종 (단풍나무), 아킬레아(Achillea) 종 (서양톱풀), 아클리스(Achlys) 종 (매자나무), 아크멜라(Acmella) 종 (파라크레스), 아코엘로르하페(Acoelorrhaphe) 종 (야자나무), 아코루스(Acorus) 종 (창포), 아크로니키아(Acronychia) 종 (사시나무), 아크로스티쿰(Acrostichum) 종 (양치류), 아크로트리케(Acrotriche) 종 (까치밥나무), 악티니디아(Actinidia) 종 (키위), 아단소니아(Adansonia) 종 (바오밥나무), 아디안툼(Adiantum) 종 (공작고사리), 아도니디아(Adonidia) 종 (야자나무), 아에크메아(Aechmea) 종 (브로멜리아드), 아에글레(Aegle) 종 (바엘), 아에스쿨루스(Aesculus) 종 (칠엽수, 마로니에), 아프라모뭄(Aframomum) 종 (폴스 카르다몬), 아가판투스(Agapanthus) 종 (아가판투스), 아가리쿠스(Agaricus) 종 (양송이), 아가스타케(Agastache) 종 (아니스), 아가토스마(Agathosma) 종 (부쿠나무), 아가베(Agave) 종 (용설란), 아게라툼(Ageratum) 종 (화이트위드), 아글라오네마(Aglaonema) 종 (녹죽), 아그리모니아(Agrimonia) 종 (짚신나물), 아일란투스(Ailanthus) 종 (가죽나무), 아주가(Ajuga) 종 (자난초), 알비지아(Albizia) 종 (자귀나무), 알케밀라(Alchemilla) 종 (레이디스 맨틀), 알류리테스(Aleurites) 종 (쿠쿠이나무), 알라만다(Allamanda) 종 (알라만다), 알리움(Allium) 종 (골파, 마늘, 리크, 양파, 샬롯), 알누스(Alnus) 종 (오리나무), 알로카시아(Alocasia) 종 (코끼리귀), 알로에(Aloe) 종 (알로에), 알로이시아(Aloysia) 종 (비브러쉬), 알피니아(Alpinia) 종 (껍질 생강), 알테르난테라(Alternanthera) 종 (조이위드), 알타에아(Althaea) 종 (마시멜로), 아마란투스(Amaranthus) 종 (아마란스), 아멜란키에르(Amelanchier) 종 (준베리, 서비스베리), 아모뭄(Amomum) 종 (카르다몸), 암피테크나(Amphitecna) 종 (흑조롱박), 아나카르디움(Anacardium) 종 (캐슈), 아나나스(Ananas) 종 (파인애플), 아나팔리스(Anaphalis) 종 (산떡쑥), 안드로그라피스(Andrographis) 종 (쥐꼬리망초), 안드로메다(Andromeda) 종 (각시석남), 아네툼(Anethum) 종 (딜), 안겔리카(Angelica) 종 (안겔리카), 안겔로니아(Angelonia) 종 (안젤로니아), 안고스투라(Angostura) 종 (안고스투라), 안노아(Annona) 종 (체리모야, 번려지, 슈가-애플, 가시여지), 아노게이수스(Anogeissus) 종 (액슬우드), 안테미스(Anthemis) 종 (캐모마일), 안톡산툼(Anthoxanthum) 종 (잔디), 안트리스쿠스(Anthriscus) 종 (처빌), 안투리움(Anthurium) 종 (테일플라워), 안티데스마(Antidesma) 종 (비그네이), 안티고논(Antigonon) 종 (코랄빈), 안티르히눔(Antirrhinum) 종 (금어초), 아피움(Apium) 종 (셀러리), 아퀼레기아(Aquilegia) 종 (매발톱꽃), 아라비돕시스(Arabidopsis) 종 (애기장대, 마우스-이어 크레스), 아랄리아(Aralia) 종 (워킹스틱, 땅두릅), 아라우카리아(Araucaria) 종 (소나무), 아르부투스(Arbutus) 종 (마드론, 딸기 나무), 아르크티움(Arctium) 종 (우엉), 아르크토스타필로스(Arctostaphylos) 종 (월귤나무, 만자니타), 아르디시아(Ardisia) 종 (말베리), 아르메리아(Armeria) 종 (트리프트), 아르모라시아(Armoracia) 종 (서양고추냉이), 아로니아(Aronia) 종 (아로니아), 아라카시아(Arracacia) 종 (아라카차), 아르테미시아(Artemisia) 종 (약쑥), 아르토카르푸스(Artocarpus) 종 (브레드프루트, 잭프루트, 멍키프루트), 아룬쿠스(Aruncus) 종 (쇠채아재비), 아룬디나리아(Arundinaria) 종 (대나무), 아사룸(Asarum) 종 (생강), 아스클레피아스(Asclepias) 종 (박주가리), 아스코필룸(Ascophyllum) 종 (피마인 브후이, 록위드, 노르웨이 켈프, 노티드 켈프, 노티드 랙 또는 에그 랙), 아시미나(Asimina) 종 (파파야), 아스팔라투스(Aspalathus) 종 (루이보스), 아스파라구스(Asparagus) 종 (아스파라거스, 덩굴 아스파라거스), 아스피디스트라(Aspidistra) 종 (엽란), 아스피도스페르마(Aspidosperma) 종 (케브라초), 아스플레니움(Asplenium) 종 (꼬리 고사리), 아스터(Aster) 종 (과꽃), 아스트라갈루스(Astragalus) 종 (자운영), 아시스타시아(Asystasia) 종 (아시스타시아), 아티리움(Athyrium) 종 (참새발 고사리), 아트리플렉스(Atriplex) 종 (갯능쟁이), 아우리쿨라리(Auriculari) 종 (식용 균류), 아베나(Avena) 종 (귀리), 아베르호아(Averrhoa) 종 (스타프루트), 바카우레아(Baccaurea) 종 (로트콘), 바카리스(Baccharis) 종 (갯능쟁이), 바크호우시아(Backhousia) 종 (아이언우드), 박트리스(Bactris) 종 (복숭아 야자), 발라니테스(Balanites) 종 (토치우드), 발레리아(Baleria) 종 (제비꽃), 밤부사(Bambusa) 종 (대나무), 밥티시아(Baptisia) 종 (인디고), 바르바레아(Barbarea) 종 (크레스), 바셀라(Basella) 종 (시금치), 바우히니아(Bauhinia) 종 (오키드 트리), 베아우카르네아(Beaucarnea) 종 (야자나무), 베고니아(Begonia) 종 (베고니아), 벨람칸다(Belamcanda) 종 (백합), 베닌카사(Benincasa) 종 (동아), 베르베리스(Berberis) 종 (매자나무), 베르톨레티아(Bertholletia) 종 (브라질 너트), 베타(Beta) 종 (비트, 근대), 베툴라(Betula) 종 (자작나무), 비덴스(Bidens) 종 (서양도깨비바늘), 빌라르디에라(Billardiera) 종 (애플베리), 비스코피아(Bischofia) 종 (비숍우드), 비스마르키아(Bismarckia) 종 (야자나무), 빅사(Bixa) 종 (안나토), 블리그히아(Blighia) 종 (아키), 보에센베르기아(Boesenbergia) 종 (핑거루트), 보라고(Borago) 종 (보라지), 보라수스(Borassus) 종 (야자나무), 보로조아(Borojoa) 종 (보로조), 보리키아(Borrichia) 종 (바다 데이지), 보스키아(Boscia) 종 (한자), 보스웰리아(Boswellia) 종 (유향), 보우에아(Bouea) 종 (야자 망고), 브라헤아(Brahea) 종 (야자나무), 브라시카(Brassica) 종 (브로콜리, 근대, 양배추, 콜리플라워, 초이 섬, 케일, 겨자, 머스타드 그린, 평지씨, 순무, 방울 양배추), 브레이니아(Breynia) 종 (스노우부시), 브로시뭄(Brosimum) 종 (브레드너트), 브로왈리아(Browallia) 종 (자수정 플라워), 브룬펠시아(Brunfelsia) 종 (레인트리), 부카나니아(Buchanania) 종 (키라울리-너트), 부시다(Bucida) 종 (총알 나무), 부멜리아(Bumelia) 종 (키탐우드), 분코시아(Bunchosia) 종 (피넛 버터 프루트), 부르세라(Bursera) 종 (림보), 부티아(Butia) 종 (젤리 팜), 북수스(Buxus) 종 (회양목), 비르소니마(Byrsonima) 종 (로커스트베리), 카에살피니아(Caesalpinia) 종 (실거리나무), 카자누스(Cajanus) 종 (비둘기 콩), 칼라디움(Caladium) 종 (칼라듐), 칼라마그로스티스(Calamagrostis) 종 (갈대, 스몰위드), 칼라테아(Calathea) 종 (칼라테아, 프레이어 플랜트, 레렌), 칼렌둘라(Calendula) 종 (천수국), 칼리안드라(Calliandra) 종 (파우더 퍼프 플랜트, 페어리 더스터), 칼리카르파(Callicarpa) 종 (작살나무), 칼리스테몸(Callistemon) 종 (쇠뜨기), 칼로세드루스(Calocedrus) 종 (향삼나무), 칼로필룸(Calophyllum) 종 (칼로필룸), 칼리칸투스(Calycanthus) 종 (자주받침꽃), 칼립트란테스(Calyptranthes) 종 (리드플라워, 스파이스우드, 마운틴베이), 카마시아(Camassia) 종 (카마스, 야생 히아신스), 카멜리나(Camelina) 종 (양구슬냉이, 동백나무), 캄파눌라(Campanula) 종 (초롱꽃), 캄포마네시아(Campomanesia) 종 (가우비로바), 캄프시스(Campsis) 종 (능소화, 미국 능소화), 카나리움(Canarium) 종 (퍼시픽 아몬드), 카나발리아(Canavalia) 종 (작두콩), 카넬라(Canella) 종 (계피), 칸나(Canna) 종 (칸나 릴리, 인디안 쇼트), 칸나비스(Cannabis) 종 (대마초), 카파리스(Capparis) 종 (케이퍼), 캅셀라(Capsella) 종 (냉이), 캅시쿰(Capsicum) 종 (벨 페퍼, 카이엔 페퍼, 칠레 할라페뇨, 피망), 카렉스(Carex) 종 (사초), 카리카(Carica) 종 (파파야), 카리사(Carissa) 종 (큰잎카리사, 넘-넘), 카르네기에아(Carnegiea) 종 (사와로), 카르펜타리아(Carpentaria) 종 (카르펜타리아 야자), 카르피누스(Carpinus) 종 (서어나무), 카르포브로투스(Carpobrotus) 종 (피그페이스, 아이스 플랜트, 막사국, 호텐토트 피그), 카르타무스(Carthamus) 종 (홍화), 카룸(Carum) 종 (캐러웨이), 카리아(Carya) 종 (히코리 너트, 피칸), 카리오카르(Caryocar) 종 (페키, 수아리-너트), 카리오타(Caryota) 종 (공작 야자), 카사시아(Casasia) 종 (카사시아, 세븐-이어 애플), 카시미로아(Casimiroa) 종 (사포트), 카시아(Cassia) 종 (계수나무), 카스타네아(Castanea) 종 (밤나무, 친커핀), 카수아리나(Casuarina) 종 (호주 소나무), 카수아리나세아에(Casuarinaceae) 종 (목마황), 카탈파(Catalpa) 종 (개오동나무, 카토바), 카타란투스(Catharanthus) 종 (페리윙클), 케아노투스(Ceanothus) 종 (케아노투스, 벅브러시, 소프 부시), 세드루스(Cedrus) 종 (삼나무), 세이바(Ceiba) 종 (실크-플로스 트리), 셀로시다(Celosia) 종 (맨드라미, 울플라워), 셀티스(Celtis) 종 (해크베리, 팽나무), 센타우리움(Centaurium) 종 (센토리), 센텔라(Centella) 종 (피막이풀), 센트라테룸(Centratherum) 종 (브라질 버튼, 라크 데이지), 세팔란투스(Cephalanthus) 종 (버튼부시), 세라스티움(Cerastium) 종 (점나도나물), 세라토니아(Ceratonia) 종 (캐럽), 세르시디필룸(Cercidiphyllum) 종 (침나무), 세르시스(Cercis) 종 (박태기나무), 카에노멜레스(Chaenomeles) 종 (모과), 카에로필룸(Chaerophyllum) 종 (처빌), 카마에시파리스(Chamaecyparis) 종 (편백), 카마에도레아(Chamaedorea) 종 (대나무 야자, 팔로 팜), 카마에멜룸(Chamaemelum) 종 (캐모마일), 카마에롭스(Chamaerops) 종 (유럽 팬 팜), 켈리도니움(Chelidonium) 종 (애기똥풀), 케노포디움(Chenopodium) 종 (명아주), 킬롭시스(Chilopsis) 종 (사막 버드나무), 키마필라(Chimaphila) 종 (매화노루발), 키모노밤부사(Chimonobambusa) 종 (대나무), 키오코카(Chiococca) 종 (밀크베리, 스노우베리), 키오난투스(Chionanthus) 종 (이팝나무), 크리산테뭄(Chrysanthemum) 종 (국화), 크리소발라누스(Chrysobalanus) 종 (코코플럼), 크리소필룸(Chrysophyllum) 종 (스타 애플, 사틴리프), 시서(Cicer) 종 (병아리콩), 시코리움(Cichorium) 종 (치커리, 엔다이브, 에스카롤), 신코나(Cinchona) 종 (퀴나), 신나모뭄(Cinnamomum) 종 (계피, 녹나무, 계수나무), 시르시움(Cirsium) 종 (엉겅퀴), 시타렉실룸(Citharexylum) 종 (피들우드, 지더우드), 시트릴루스(Citrillus) 종 (수박), 시트루스(Citrus) 종 (시트러스, 그레이프프루트, 레몬, 라임, 오렌지, 포멜로, 탄제린), 클라드라스티스(Cladrastis) 종 (옐로우우드), 클라르키아(Clarkia) 종 (고데티아), 클라우세나(Clausena) 종 (왐피), 클라이토니아(Claytonia) 종 (쇠비름), 클레오메(Cleome) 종 (자주달개비, 비 플랜트, 고양이 수염), 클레로덴드론(Clerodendron) 종 (누리장나무, 백플라워, 복주머니), 클리노포디움(Clinopodium) 종 (탑꽃), 클루시아로세아(Clusiarosea) 종 (클루시아, 피치 애플), 코콜로바(Coccoloba) 종 (모자반), 코코트리낙스(Coccothrinax) 종 (실버팜), 코코스(Cocos) 종 (코코넛), 코페아(Coffea) 종 (커피), 콜레우스(Coleus) 종 (콜레우스), 콜로카시아(Colocasia) 종 (타로), 콜루브리나(Colubrina) 종 (네이키드우드, 사문재, 녹심목, 호그플럼), 콤브레툼(Combretum) 종 (부시윌로우, 콤브레툼), 콤미포라(Commiphora) 종 (미르), 코노카르푸스(Conocarpus) 종 (버튼우드), 콘라디나(Conradina) 종 (폴스 로즈마리), 콘린기아(Conringia) 종 (헤어즈 이어 머스타드), 콘발라리아(Convallaria) 종 (은방울꽃), 코파이페라(Copaifera) 종 (코파이바), 콥티스(Coptis) 종 (황련), 코르코루스(Corchorus) 종 (황마), 코르디아(Cordia) 종 (맨잭, 보코트), 코르딜리네(Cordyline) 종 (타이 플랜트, 팜 릴리), 코레옵시스(Coreopsis) 종 (칼리옵시스, 기생초), 코리안드룸(Coriandrum) 종 (코리안더, 실란트로), 코르누스(Cornus) 종 (층층나무), 코로닐라(Coronilla) 종 (황금싸리), 코리달리스(Corydalis) 종 (코리달리스), 코릴루스(Corylus) 종 (개암나무, 헤이즐, 헤이즐넛), 코스모스(Cosmos) 종 (코스모스, 멕시코 아스터, 케니커), 코스투스(Costus) 종 (스파이럴 진저), 코티누스(Cotinus) 종 (스모크트리), 크람베(Crambe) 종 (크람베), 크라소세팔룸(Crassocephalum) 종 (주홍서나물, 씨크헤드, 볼로기, 에볼로), 크라술라(Crassula) 종 (제이드 플랜트, 대구돌나물), 크라타에구스(Crataegus) 종 (산사나무, 서양참산사나무, 쏜애플, 메이-트리, 하우베리), 크레센티아(Crescentia) 종 (칼라바시 트리, 휴인고, 크라바시, 칼레바스), 크리눔(Crinum) 종 (스왐프릴리, 크리눔), 크로쿠스(Crocus) 종 (샤프론), 크로탈라리아(Crotalaria) 종 (치필린), 크립토타에니아(Cryptotaenia) 종 (반디나물, 일본 삼나무), 쿠쿠미스(Cucumis) 종 (칸탈루프, 오이, 멜론, 게르킨, 머스크멜론, 허니듀), 쿠쿠르비타(Cucurbita) 종 (호박, 서머 스쿼시, 윈터 스쿼시), 쿠미눔(Cuminum) 종 (쿠민), 쿠닌그하미아(Cunninghamia) 종 (넓은잎삼나무, 차이나-피어), 쿠파니옵시스(Cupaniopsis) 종 (터커루, 소프베리), 쿠페아(Cuphea) 종 (쿠페아, 시가 플랜트, 헤더), 쿠프레소시파리스(Cupressocyparis) 종 (레이란디, 레이란드 삼나무), 쿠프레수스(Cupressus) 종 (사이프러스), 쿠르쿠마(Curcuma) 종 (강황), 시아몹시스(Cyamopsis) 종 (구아), 시카스(Cycas) 종 (소철), 시클로피아(Cyclopia) 종 (허니부시), 시도니아(Cydonia) 종 (모과), 심보포곤(Cymbopogon) 종 (레몬그래스), 시나라(Cynara) 종 (카르둔, 아티초크, 엉겅퀴), 시페루스(Cyperus) 종 (기름골, 파피루스, 플랫세지, 너트세지, 알방동사니, 방동사니), 달리아(Dahlia) 종 (달리아), 달베르기아(Dalbergia) 종 (킹우드, 인디언 로즈우드, 아프리칸 블랙우드, 튤립나무), 다우쿠스(Daucus) 종 (당근), 다비드소니아(Davidsonia) 종 (오레이), 델로닉스(Delonix) 종 (포인시아나), 덴드란테마(Dendranthema) 종 (멈스), 덴드로칼라무스(Dendrocalamus) 종 (대나무), 데파리아(Deparia) 종 (양치류), 더마토필룸(Dermatophyllum) 종 (메스칼빈), 데스캄프시아(Deschampsia) 종 (좀새풀, 다발풀), 디알리움(Dialium) 종 (타마린드), 디안투스(Dianthus) 종 (카네이션, 핑크, 수염패랭이꽃, 디안투스), 디센트라(Dicentra) 종 (블리딩-하트), 딕티오포라(Dictyophora) 종 (대곰보버섯), 디에테스(Dietes) 종 (우드 아이리스, 포트나이트 릴리, 아프리칸 아이리스, 일본 아이리스, 나비 아이리스), 디모카르푸스(Dimocarpus) 종 (용안), 디오스코레아(Dioscorea) 종 (참마), 디오스피로스(Diospyros) 종 (감, 블랙 사포트), 디플라지움(Diplazium) 종 (양치류), 디플로탁시스(Diplotaxis) 종 (야생 루콜라), 디지고테카(Dizygotheca) 종 (둥근잎 아랄리아, 디지고테카), 도도나에아(Dodonaea) 종 (홉-부시), 도엘린게리아(Doellingeria) 종 (참취), 돔베야(Dombeya) 종 (돔베야, 디크바스, 핑크볼), 도비알리스(Dovyalis) 종 (구스베리, 케이-애플), 드라카에나(Dracaena) 종 (용혈수, 드라카에나), 드리옵테리스(Dryopteris) 종 (양치류), 두리오(Durio) 종 (두리안), 딥시스(Dypsis) 종 (나비 야자), 디스코리스테(Dyschoriste) 종 (스네이크허브), 디스파니아(Dysphania) 종 (에파조테), 에키나세아(Echinacea) 종 (에키나세아, 콘플라워), 에키움(Echium) 종 (패터슨스 커스), 에클로니아(Ecklonia) 종 (감태), 엘라에아그누스(Elaeagnus) 종 (실버베리, 보리수나무), 엘라에오카르푸스(Elaeocarpus) 종 (실론 올리브), 엘레타리아(Elettaria) 종 (카르다몸), 엘웬디아(Elwendia) 종 (블랙 쿠민), 엘리무스(Elymus) 종 (개밀, 갯보리, 휘트그래스), 에필로비움(Epilobium) 종 (분홍바늘꽃), 에피메디움(Epimedium) 종 (삼지구엽초), 에피프렘눔(Epipremnum) 종 (센티페데 톤가비네(Centipede tongavine), 포토스, 스킨답서스), 에레모시트루스(Eremocitrus) 종 (사막 라임), 에리게론(Erigeron) 종 (개망초, 망초), 에리오보트리아(Eriobotrya) 종 (비파), 에리오딕티온(Eriodictyon) 종 (예르바 산타), 에르노데아(Ernodea) 종 (너도밤나무, 코프부시), 에루카(Eruca) 종 (아루굴라), 에린기움(Eryngium) 종 (에린고, 씨 홀리, 쿨란트로), 에리트리나(Erythrina) 종 (코랄 트리, 불꽃 나무, 부카레, 카퍼붐), 유칼립투스(Eucalyptus) 종 (검, 유칼립스, 말리), 유카리스(Eucharis) 종 (옥잠수선), 유콤미아(Eucommia) 종 (중국 고무 나무), 유게니아(Eugenia) 종 (도금양, 레인포레스트 플럼, 산벚나무, 피탄가, 아라자), 유오디아(Euodia) 종 (유오디아), 유파토리움(Eupatorium) 종 (등골나무, 향등골나무, 스네이크루트), 유포르비아(Euphorbia) 종 (대극), 유리옵스(Euryops) 종 (유리옵스), 유스토마(Eustoma) 종 (리시안더스, 대초원 용담), 유테르페(Euterpe) 종 (아사이 팜), 엑사쿰(Exacum) 종 (페르시안 바이올렛), 파고피룸(Fagopyrum) 종 (메밀), 파구스(Fagus) 종 (너도밤나무), 파체데라(Fatshedera) 종 (트리 아이비, 아랄리아 아이비), 페룰라(Ferula) 종 (회향, 개구리발톱, 숨불), 페스투카(Festuca) 종 (김의털), 피카리아(Ficaria) 종 (애기똥풀), 피쿠스(Ficus) 종 (무화과), 필리펜둘라(Filipendula) 종 (터리풀), 피르미아나(Firmiana) 종 (벽오동), 플라코우르티아(Flacourtia) 종 (바토코 플럼), 플람물리나(Flammulina) 종 (팽이버섯), 포에니쿨룸(Foeniculum) 종 (회향), 포레스티에라(Forestiera) 종 (스왐프프리베트), 포르투넬라(Fortunella) 종 (금귤), 포테르길라(Fothergilla) 종 (위치 올더), 프라가리아(Fragaria) 종 (딸기), 프란굴라(Frangula) 종 (카스카라), 프란클리니아(Franklinia) 종 (프랭클린 트리), 프락시누스(Fraxinus) 종 (서양물푸레나무), 프리틸라리아(Fritillaria) 종 (패모), 푸쿠스(Fucus) 종 (록위드), 푸마리아(Fumaria) 종 (현호색), 가일라르디아(Gaillardia) 종 (천인국), 갈리움(Galium) 종 (선갈퀴), 가노데르마(Ganoderma) 종 (영지), 가르베리아(Garberia) 종 (가르베리아, 가버스 스크럽 스타트), 가르시니아(Garcinia) 종 (망고스틴, 사프트리, 가르시니아), 가르데니아(Gardenia) 종 (치자나무), 가울테리아(Gaultheria) 종 (노루발풀, 소귀나무, 스노우베리, 스할론), 가일루사시아(Gaylussacia) 종 (월귤나무), 가자니아(Gazania) 종 (가자니아, 트레일링 가자니아, 클럼핑 가자니아), 게이제라(Geijera) 종 (게이제라, 윌가, 오일부시, 쉽부시), 게니파(Genipa) 종 (게닙), 겐티아나(Gentiana) 종 (용담), 게라니움(Geranium) 종 (제라늄, 이질풀), 기간토클로아(Gigantochloa) 종 (대나무), 긴코(Ginkgo) 종 (은행나무, 메이덴헤어 트리), 글레비오니스(Glebionis) 종 (국화, 공작 국화, 쑥갓), 글레디치아(Gleditsia) 종 (허니 로커스트), 글리누스(Glinus) 종 (스위트쥬스), 글리시네(Glycine) 종 (대두), 곰프레나(Gomphrena) 종 (천일홍), 구디에라(Goodyera) 종 (털사철란, 제이드 오키드, 타래난초), 고르도니아(Gordonia) 종 (고르도니아, 로블롤리-베이), 고시피움(Gossypium) 종 (면실), 그레빌레아(Grevillea) 종 (그레빌레아, 스파이더 플라워, 실키 오크, 칫솔 나무), 그레위아(Grewia) 종 (팔사), 그리폴라(Grifola) 종 (잎새버섯), 그린델리아(Grindelia) 종 (검위드), 구아이아쿰(Guaiacum) 종 (과이액), 구이조티아(Guizotia) 종 (니거 종자), 김네마(Gymnema) 종 (김네마), 김노카르피움(Gymnocarpium) 종 (토끼고사리), 김노클라두스(Gymnocladus) 종 (커피나무, 무환자 나무), 하코네클로아(Hakonechloa) 종 (하코네 그래스, 황금풍지초), 할레시아(Halesia) 종 (실버벨, 스노우드롭 트리), 하마멜리스(Hamamelis) 종 (위치-하젤), 하멜리아(Hamelia) 종 (파이어부시, 허밍버드 부시, 스칼렛 부시, 레드헤드), 한코르니아(Hancornia) 종 (망가바), 하르페필룸(Harpephyllum) 종 (카피르-플럼), 헤디키움(Hedychium) 종 (가랜드 플라워, 꽃생강, 카힐리 꽃생강), 헬리안투스(Helianthus) 종 (해바라기, 뚱딴지), 헬리크리숨(Helichrysum) 종 (커리 플랜트), 헬리코니아(Heliconia) 종 (신풍옥, 토칸 비크, 왕질경이, 극락조화), 헬릭토트리콘(Helictotrichon) 종 (푸른 귀리풀), 헤메로칼리스(Hemerocallis) 종 (원추리), 헤라클레움(Heracleum) 종 (돼지풀, 어수리), 헤리시움(Hericium) 종 (폼 폼, 식용 버섯), 헤스페리스(Hesperis) 종 (보라십자화), 휴케라(Heuchera) 종 (코랄 벨, 알룸루트), 히비스쿠스(Hibiscus) 종 (히비스쿠스, 촉규화, 무궁화), 히에로클로에(Hierochloe) 종 (잔디), 히페아스트룸(Hippeastrum) 종 (아마릴리스), 히포파에(Hippophae) 종 (산자나무), 홀로디스쿠스(Holodiscus) 종 (오션스프레이, 크림부시), 호르데움(Hordeum) 종 (보리), 호스타(Hosta) 종 (비비추, 기보시, 옥잠화), 호투이니아(Houttuynia) 종 (도쿠다미), 호베니아(Hovenia) 종 (호리깨), 호웨아(Howea) 종 (켄챠 팜, 타치 팜, 컬리 팜), 호야(Hoya) 종 (옥접매, 왁스바인, 왁스플라워, 호야), 히브리드(Hybrid) 종 (승마), 히드란게아(Hydrangea) 종 (수국, 호르텐시아), 히드로필룸(Hydrophyllum) 종 (워터리프), 힐로세레우스(Hylocereus) 종 (용과, 피타야), 히메나에아(Hymenaea) 종 (코울바릴), 히메노칼리스(Hymenocallis) 종 (석산), 히페리쿰(Hypericum) 종 (성요한초, 염소풀), 히파에네(Hyphaene) 종 (둠 야자), 히프시지구스(Hypsizygus) 종 (만가닥버섯), 히소푸스(Hyssopus) 종 (히솝풀), 일렉스(Ilex) 종 (호랑가시나무, 미국낙상홍), 일리시움(Illicium) 종 (팔각, 붓순나무), 임파티엔스(Impatiens) 종 (봉선화, 물봉선화, 노랑물봉선화, 스냅위드, 페이션스, 발삼, 아프리카봉선화), 임페라타(Imperata) 종 (새틴테일), 인디고페라(Indigofera) 종 (인디고), 인가(Inga) 종 (인가), 이포모에아(Ipomoea) 종 (고구마, 나팔꽃, 공심채, 캉쿵, 메꽃, 밤메꽃, 할라파), 이리스(Iris) 종 (붓꽃), 이르빈기아(Irvingia) 종 (디카), 이바(Iva) 종 (마시 엘더), 익소라(Ixora) 종 (웨스트 인디안 자스민, 비루치, 란간, 헤메, 폰나, 칸 타네아, 테키, 판, 시안탄, 자룸-자룸, 제자룸, 정글 플레임, 정글 제라늄, 크루즈 드 말타), 자카란다(Jacaranda) 종 (자카란다), 자스미눔(Jasminum) 종 (자스민), 자트로파(Jatropha) 종 (피직 너트, 네틀스퍼지), 주바에아(Jubaea) 종 (야자나무), 주글란스(Juglans) 종 (호두나무), 준쿠스(Juncus) 종 (러시), 주니페루스(Juniperus) 종 (노간주나무), 주스티시아(Justicia) 종 (쥐꼬리망초, 새우풀, 말라바 너트), 칼란코에(Kalanchoe) 종 (칼란코에, 판다 플랜트, 천손초, 펠트 플랜트), 칼리메리스(Kalimeris) 종 (마란, 쑥부쟁이), 칼미아(Kalmia) 종 (쉽-로렐, 램-킬, 카프-킬, 킬-키드, 쉽-포이즌, 스푼우드), 칼로파낙스(Kalopanax) 종 (캐스터 아랄리아, 두릅나무, 음나무), 크니포피아(Kniphofia) 종 (트리토마, 레드 핫 포커, 토치 릴리, 노플러, 포커 플랜트), 코엘류테리아(Koelreuteria) 종 (모감주나무, 플레임골드, 중국 모감주나무), 쿤제아(Kunzea) 종 (쿤제아, 카누카, 마누카, 문트리), 랍랍(Lablab) 종 (제비콩, 랍랍 빈, 바토, 인디안 빈), 라부르눔(Laburnum) 종 (노란등, 금련화, 라부르눔), 락투카(Lactuca) 종 (상추, 셀터스), 라게나리아(Lagenaria) 종 (조롱박, 박), 라게르스트로에미아(Lagerstroemia) 종 (배롱나무, 백일홍), 라미나리아(Laminaria) 종 (켈프, 탱글), 란시움(Lansium) 종 (란존, 랑사트), 라타니아(Latania) 종 (라탄 팜, 라타니아 팜), 라우나에아(Launaea) 종 (라우나에아), 라우루스(Laurus) 종 (월계수, 스위트 베이), 라반둘라(Lavandula) 종 (라벤더), 레시티스(Lecythis) 종 (파라다이스 너트, 멍키 팟, 크림 너트, 사푸카이아 너트), 레에아(Leea) 종 (레에아, 탈리안탄), 렌스(Lens) 종 (렌틸), 렌티눌라(Lentinula) 종 (표고), 레오누루스(Leonurus) 종 (익모초), 레피디움(Lepidium) 종 (페퍼크레스, 페퍼그래스, 페퍼워트, 텀블위드), 레피스타(Lepista) 종 (블레위트, 버섯-형성 진균), 레스페데자(Lespedeza) 종 (싸리, 일본 클로버), 레스퀘렐라(Lesquerella) 종 (가스라이트 블래더팟), 레세르티아(Lessertia) 종 (벌룬 피), 류카에나(Leucaena) 종 (리드트리), 류칸테뭄(Leucanthemum) 종 (막스 크리산테뭄(Max chrysanthemum), 크리핑 데이지, 옥스아이 데이지, 샤스타 데이지), 류코토에(Leucothoe) 종 (류코토에, 스위트벨, 도그호블, 블랙 로렐), 류코트리낙스(Leucothrinax) 종 (야자나무), 레비스티쿰(Levisticum) 종 (로바지), 레위시아(Lewisia) 종 (레위시아), 리아트리스(Liatris) 종 (블레이징 스타), 리카니아(Licania) 종 (고퍼 애플, 산사포트, 미어큐어, 오이티시카), 리구스트룸(Ligustrum) 종 (쥐똥나무), 릴리움(Lilium) 종 (참나리꽃, 백합), 림난테스(Limnanthes) 종 (메도우폼), 림노필라(Limnophila) 종 (구와말), 리모니아(Limonia) 종 (우드-애플), 리모니움(Limonium) 종 (갯질경이, 스타티스, 카스피아, 마시-로즈마리), 린데라(Lindera) 종 (스파이스우드, 스파이스부시, 벤자민 부시), 린나에아(Linnaea) 종 (뷰티 부시, 린네풀), 리눔(Linum) 종 (아마), 리피아(Lippia) 종 (향수목, 향리피아, 리코라이스 버베나), 리퀴담바르(Liquidambar) 종 (아메리칸 스토락스, 새틴-월넛, 레드검, 스위트검, 스타 검), 리리오덴드론(Liriodendron) 종 (튤립나무, 튤립 포플라, 옐로우 포플라), 리리오페(Liriope) 종 (맥문동, 멍키 그래스, 스파이더 그래스), 리치(Litchi) 종 (리치), 리비스토나(Livistona) 종 (팬 야자), 로벨리아(Lobelia) 종 (로벨리아), 로불라리아(Lobularia) 종 (스위트 알리섬), 로니세라(Lonicera) 종 (인동), 로로페탈룸(Loropetalum) 종 (로로페탈룸, 중국 프린지 플라워), 로투스(Lotus) 종 (연, 디어베치, 벌노랑이, 트레포일), 루파(Luffa) 종 (박, 수세미), 루나리아(Lunaria) 종 (어니스티), 루피누스(Lupinus) 종 (루핀, 루핀), 리크니스(Lychnis) 종 (캄피온, 끈끈이대나물), 리시움(Lycium) 종 (고지 베리, 구기자, 데저트-쏘른), 리코페르시콘(Lycopersicon) 종 (토마토, 야생 토마토), 리코푸스(Lycopus) 종 (구주쉽싸리, 버글위드, 쉽싸리), 리오니아(Lyonia) 종 (스태거부시, 푸어-그럽, 메일베리, 히-허클베리, 허라부시), 리시키톤(Lysichiton) 종 (앉은부채, 스왐프 랜턴), 리실로마(Lysiloma) 종 (폴스 타마린드, 사비쿠), 리시마키아(Lysimachia) 종 (부처꽃), 마아키아(Maackia) 종 (다릅나무), 마카다미아(Macadamia) 종 (마카다미아), 마클루라(Maclura) 종 (콕스퍼 쏘른, 오세이지 오렌지, 다이어스 멀버리, 꾸지뽕나무), 마크로시스티스(Macrocystis) 종 (자이언트 켈프, 자이언트 블래더 켈프), 마그놀리아(Magnolia) 종 (목련), 마호니아(Mahonia) 종 (오레곤 그레이프, 프레몬트스 마호니아, 아가리타, 샤파랄 베리), 마이안테뭄(Maianthemum) 종 (솜대), 말콜미아(Malcolmia) 종 (버지니아 스토크, 아프리칸 머스타드), 말로토니아(Mallotonia) 종 (갯질경이), 말피그히아(Malpighia) 종 (아세로라, 바베이도스 체리, 드와프 홀리), 말루스(Malus) 종 (사과, 크랩애플, 크랩트리, 돌능금나무), 맘메아(Mammea) 종 (마미 애플, 열대 살구, 살라피), 만데빌라(Mandevilla) 종 (락트럼펫, 알라만다), 만기페라(Mangifera) 종 (망고, 화이트 망고, 잭, 파후탄, 파호), 마니호트(Manihot) 종 (카사바), 마닐카라(Manilkara) 종 (사포딜라, 마사란두바, 치클, 사포타), 마란타(Maranta) 종 (프레이어 플랜트, 오비디언스 플랜트, 마란타), 마를리에레아(Marlierea) 종 (베루퀼로), 마루비움 불가레(Marrubium vulgare) (호어하운드), 마티시아(Matisia) 종 (몰리닐로, 추파-추파), 마트리카리아(Matricaria) 종 (독일 캐모마일, 메이위드), 마튜시아(Matteuccia) 종 (개면마, 고비, 청나래고사리), 마트히올라(Matthiola) 종 (스톡, 길리-플라워), 메디카고(Medicago) 종 (알팔파, 개자리, 버클로버), 멜라류카(Melaleuca) 종 (페이퍼바크, 허니-미르틀, 티-트리), 멜람포디움(Melampodium) 종 (블랙푸트), 멜리아(Melia) 종 (차이나베리 트리, 멀구슬나무), 멜리코쿠스(Melicoccus) 종 (마몬치요, 모토요에, 퀘네파), 멜릴로투스(Melilotus) 종 (전동싸리, 스위트 클로버, 쿠모니가), 멜리사(Melissa) 종 (레몬 밤), 멘타(Mentha) 종 (민트), 메릴리아(Merrillia) 종 (플라워링 메릴리아, 카팅가, 말레이 레몬), 메셈브리안테뭄(Mesembryanthemum) 종 (아이스 플랜트), 메스필루스(Mespilus) 종 (서양모과), 메타세콰이아(Metasequoia) 종 (메타세콰이아), 미켈리아(Michelia) 종 (초령목, 화이트 캄파카, 금후박, 댄디, 바나나 쉬럽), 미크로시트루스(Microcitrus) 종 (라임), 미크로메리아(Micromeria) 종 (예르바 부에나, 화이트 미크로메리아, 화이트-리브드 사보리, 미크로메리아), 밀리시아(Milicia) 종 (이로코, 아프리칸 티크, 오덤), 밀레티아(Millettia) 종 (퐁가미아), 미물루스(Mimulus) 종 (물꽈리아재비), 미스칸투스(Miscanthus) 종 (억새, 참억새), 미첼라(Mitchella) 종 (호자덩굴), 모모르디카(Momordica) 종 (비터 멜론, 가크, 가시 조롱박, 칸톨라, 발삼 페어), 모나르다(Monarda) 종 (비밤, 호스민트, 오스웨고 티, 베르가못), 몬스테라(Monstera) 종 (스위스 치즈 플랜트, 슁글 플랜트, 파이브 홀스 플랜트, 몬스테라), 몬티아(Montia) 종 (광부 상추, 쇠별꽃, 겨울 쇠비름), 모르켈라(Morchella) 종 (모렐), 모린다(Morinda) 종 (노니, 인도 뽕나무, 스위트 모린다, 레잘, 요위드, 치즈 스크럽), 모루스(Morus) 종 (뽕나무), 무쿠나(Mucuna) 종 (디어-아이 빈, 덩키-아이 빈, 옥스-아이 빈, 햄버거 시드), 무흘렌베르기아(Muhlenbergia) 종 (쥐꼬리새), 문틴기아(Muntingia) 종 (자메이카-체리), 무라야(Murraya) 종 (커리 나무, 오렌지 자스민, 차이나 박스), 무사(Musa) 종 (바나나, 플란테인), 미르시안테스(Myrcianthes) 종 (루쿠밀로, 호자덩굴, 아라얀, 구아비유), 미르시아리아(Myrciaria) 종 (자보티카바, 구아바베리, 히바푸루, 사바라, 이바푸루), 미리카(Myrica) 종 (베이베리, 베이-럼 트리, 캔들베리, 들버드나무, 소귀나무), 미리스티카(Myristica) 종 (너트멕, 메이스, 쿰팡, 마사카르 너트멕, 실버 너트멕), 미록실론(Myroxylon) 종 (발삼), 미르히스(Myrrhis) 종 (시셀리, 몰약, 스위트 처빌), 미르시네(Myrsine) 종 (콜릭우드, 콜레아, 마티포), 미르투스(Myrtus) 종 (도금양), 난디나(Nandina) 종 (남천, 헤븐리 뱀부, 세이크리드 뱀부), 나르시수스(Narcissus) 종 (다포딜, 수선화, 노랑수선화), 나스투르티움(Nasturtium) 종 (물냉이, 개갓냉이), 나스투스(Nastus) 종 (대나무), 넬룸보(Nelumbo) 종 (연), 네오마리카(Neomarica) 종 (워킹 아이리스, 어포슬스 아이리스, 어포슬 플랜트), 네페타(Nepeta) 종 (개박하, 캣민트, 캣츠워트), 네펠리움(Nephelium) 종 (람부탄, 코를란, 풀라산), 네프롤레피스(Nephrolepis) 종 (마초 펀, 줄고사리), 네리움(Nerium) 종 (협죽도, 네리움), 니코티아나(Nicotiana) 종 (담배), 니겔라(Nigella) 종 (블랙 캐러웨이, 니겔라, 데빌-인-어-부시, 러브-인-어-미스트), 노론히아(Noronhia) 종 (마다가스카르 올리브), 님파에아(Nymphaea) 종 (수련, 수련), 니사(Nyssa) 종 (투펠로, 흑고무나무), 오크로시아(Ochrosia) 종 (엘립틱 옐로우우드, 블러드혼, 콥시아, 카우아이 옐로우우드, 서던 오크로시아), 오시뭄(Ocimum) 종 (바질, 레몬 바질, 스위트 바질, 툴시), 오돈토네마(Odontonema) 종 (투티드쓰레드), 오에노카르푸스(Oenocarpus) 종 (투루 팜, 팔마 밀페소스, 바카바, 파타와), 오에노테라(Oenothera) 종 (프림로즈, 이브닝 프림로즈, 선컵, 선드롭), 올레아(Olea) 종 (올리브, 블랙 아이언우드, 아이언우드, 이스트 아프리칸 올리브, 엘곤 티크), 오노브리키스(Onobrychis) 종 (세인포인), 오플로파낙스(Oplopanax) 종 (데블스 클럽, 알라스칸 인삼), 오푼티아(Opuntia) 종 (프리클리 페어, 튜나, 노팔), 오리가눔(Origanum) 종 (오레가노, 마조람, 크레탄 디타니, 바이블 히솝), 오리자(Oryza) 종 (벼, 와일드 라이스, 아프리칸 라이스, 롱스타멘 라이스, 레드 라이스, 아시안 라이스), 오스만투스(Osmanthus) 종 (프래그란트 티 올리브, 홀리 오스만투스), 오스문다(Osmunda) 종 (로얄 펀, 플라워링 펀), 오스문다스트룸(Osmundastrum) 종 (꿩고비), 오스트리아(Ostrya) 종 (새우나무, 새우나무), 옥살리스(Oxalis) 종 (애기괭이밥, 선괭이밥, 덩이괭이밥, 사랑초, 사우어그래스, 옥살리스), 옥시덴드룸(Oxydendrum) 종 (사워우드, 소렐 트리), 파키라(Pachira) 종 (기아나 체스트넛, 돈나무, 말라바 체스트넛, 프렌치 피넛, 프로비젼 트리, 사바 너트, 몬구바, 포코테), 파키르히주스(Pachyrhizus) 종 (히카마, 얌 빈, 누페, 아히파), 파키스타키스(Pachystachys) 종 (카디날스 가드, 롤리팝 플랜트, 금새우꽃), 파에오니아(Paeonia) 종 (모란, 폴리시 로즈), 파낙스(Panax) 종 (인삼, 노토진셍, 삼칠근, 마운틴 플랜트, 슈도진셍), 판다누스(Pandanus) 종 (판단, 스크류 팜, 스크류 파인, 니코바-브레드프루트, 카루카), 판도레아(Pandorea) 종 (왕가 바인, 바우어 오브 뷰티, 판도라스 바인, 보트 바인), 파니쿰(Panicum) 종 (패닉그래스, 수수, 파니쿰, 위치그래스, 회전초, 메이든케인), 파파버(Papaver) 종 (양귀비), 파르키아(Parkia) 종 (비터 빈, 아프리칸 로커스트 빈), 파르킨소니아(Parkinsonia) 종 (팔로 베르데, 브레아, 베르데 올리보), 파로티아(Parrotia) 종 (페르시안 아이언우드, 차이니스 아이언우드), 파르테노시수스(Parthenocissus) 종 (미국 담쟁이덩굴, 인동덩굴, 세븐리프 크리퍼, 담쟁이덩굴), 파시플로라(Passiflora) 종 (패션프루트, 패션 플라워, 패션 바인, 꽃시계덩굴, 시계풀), 파스티나카(Pastinaca) 종 (파스닙), 파울리니아(Paullinia) 종 (구아라나, 요코), 파울로우니아(Paulownia) 종 (참오동나무, 키리, 오동나무, 용혈수), 팍시스티마(Paxistima) 종 (오레곤 박스리프, 캔비스 마운틴-러브), 펠라르고니움(Pelargonium) 종 (제라늄, 양아욱, 펠라고늄), 펠토포룸(Peltophorum) 종 (위핑 와틀, 코퍼팟, 옐로우 플레임보이안트, 노랑 불꽃나무, 옐로우 포인시아나), 펜니세툼(Pennisetum) 종 (수크령, 펄 밀렛, 키쿠유 그래스, 페더탑 그래스), 펜스테몬(Penstemon) 종 (베어드텅), 펜탈리논(Pentalinon) 종 (와일드 알라만다), 펜타스(Pentas) 종 (이집티안 스타클러스터, 펜타), 페페로미아(Peperomia) 종 (래디에이터 플랜트, 페페로미아), 페릴라(Perilla) 종 (페릴라, 일본 바질), 페르세아(Persea) 종 (아보카도, 월계수 나무, 코요, 레드베이, 목련), 페르시카리아(Persicaria) 종 (버들여뀌, 마디풀, 명아자여뀌, 핫 민트), 페타시테스(Petasites) 종 (버터버, 관동화), 페트로셀리눔(Petroselinum) 종 (파슬리), 페투니아(Petunia) 종 (페투니아), 퓨세다눔(Peucedanum) 종 (마스터워트), 퓨무스(Peumus) 종 (볼도), 파세올루스(Phaseolus) 종 (콩, 야생 콩), 펠로덴드론(Phellodendron) 종 (황벽나무, 펠로덴드론), 필라델푸스(Philadelphus) 종 (모크-오렌지), 필로덴드론(Philodendron) 종 (필로덴드론, 라스카가르간타, 바일바인, 트리러버), 플록스(Phlox) 종 (플록스, 와일드 스위트 윌리엄), 포에닉스(Phoenix) 종 (대추 야자, 대추), 폴리오타(Pholiota) 종 (나메코, 양송이), 포티니아(Photinia) 종 (포티니아), 필란투스(Phyllanthus) 종 (구스베리, 여우구슬, 스크러비 스퍼지, 레드 루트 플로터, 샌드 레버코니아, 그립위드, 섀터스톤), 필로스타키스(Phyllostachys) 종 (왕대, 포대죽, 황조죽, 마다크, 참대, 모소 대나무), 피살리스(Physalis) 종 (꽈리, 토마틸로, 허스크 토마토, 잉카 베리, 포하 베리, 골든 베리, 케이프 구스베리), 피소카르푸스(Physocarpus) 종 (나인바크), 피세아(Picea) 종 (가문비나무), 필레아(Pilea) 종 (알루미늄 플랜트, 아틸러리 플랜트, 실버 스프링클, 프렌드십 플랜트, 크리핑 찰리), 피멘타(Pimenta) 종 (올스파이스, 베이 럼 트리, 실리멘트), 핌피넬라(Pimpinella) 종 (아니스, 아니시드, 핌피넬라, 참나물, 바위취), 핀크네야(Pinckneya) 종 (조지아 바크, 핀크네야), 피누스(Pinus) 종 (소나무), 피퍼(Piper) 종 (피망, 파리파로바, 멕시칸 페퍼리프, 베텔 바인), 피프투루스(Pipturus) 종 (마마키), 피스타시아(Pistacia) 종 (피스타치오, 유향), 피숨(Pisum) 종 (완두), 피테셀로비움(Pithecellobium) 종 (마드라스-쏘른), 피토스포룸(Pittosporum) 종 (피토스토룸, 페트롤륨 너트, 돈나무), 플란타고(Plantago) 종 (플란테인), 플라타누스(Platanus) 종 (버즘나무, 시카모어), 플라토니아(Platonia) 종 (바쿠리), 플라티클라두스(Platycladus) 종 (측백나무, 비오타), 플라티코돈(Platycodon) 종 (도라지), 플렉트란투스(Plectranthus) 종 (스퍼플라워), 플류로투스(Pleurotus) 종 (느타리버섯), 플리니아(Plinia) 종 (브라질리안 그레이프트리, 자보티카바, 캄부카), 플룸바고(Plumbago) 종 (플룸바고, 리드워트), 플루메리아(Plumeria) 종 (플루메리아, 프란기파니), 포도카르푸스(Podocarpus) 종 (옐로우우드, 소나무, 일라와라 플럼), 폴리고나툼(Polygonatum) 종 (죽대), 폴리포디움(Polypodium) 종 (폴리포디스, 록캡 펀), 폴리스키아스(Polyscias) 종 (밍 아랄리아, 오히), 폴리스티쿰(Polystichum) 종 (양치류), 폰시루스(Poncirus) 종 (탱자나무), 폰테데리아(Pontederia) 종 (피케렐 위드), 포풀루스(Populus) 종 (포플라, 사시나무, 미루나무), 포로필룸(Porophyllum) 종 (코리안더), 포르툴라카(Portulaca) 종 (쇠비름), 포텐틸라(Potentilla) 종 (양지꽃, 토르멘틸, 배른 스트로베리), 포우테리아(Pouteria) 종 (아비우, 카니스텔, 루쿠마, 사포테), 프리물라(Primula) 종 (프림로즈), 프로보스키데아(Proboscidea) 종 (유니콘 플랜트), 프로소피스(Prosopis) 종 (메스키트), 프로스탄테라(Prostanthera) 종 (민트부시), 프루넬라(Prunella) 종 (힐-올), 프루누스(Prunus) 종 (아몬드, 살구, 체리, 초크체리, 승도복숭아, 복숭아, 자두, 플럼콧, 프룬, 슬로), 슈다나모미스(Pseudanamomis) 종 (모노스 플럼), 슈도라릭스(Pseudolarix) 종 (금전송), 슈도추가(Pseudotsuga) 종 (개솔송나무), 프시디움(Psidium) 종 (구아바), 프시코트리아(Psychotria) 종 (야생 커피), 프텔레아(Ptelea) 종 (홉나무), 프테리디움(Pteridium) 종 (양치류), 프테로카르푸스(Pterocarpus) 종 (사운더), 프테로카리아(Pterocarya) 종 (윙너트), 프테로스티락스(Pterostyrax) 종 (나래쪽동백), 프티코스페르마(Ptychosperma) 종 (캐비지 야자), 푸에라리아(Pueraria) 종 (칡), 푸니카(Punica) 종 (석류), 피크난테뭄(Pycnanthemum) 종 (산박하), 피로스테기아(Pyrostegia) 종 (파장화), 피루스(Pyrus) 종 (배나무), 콰라리베아(Quararibea) 종 (구아야빌로), 콰시아(Quassia) 종 (아마고), 퀘르쿠스(Quercus) 종 (떡갈나무), 퀼라자(Quillaja) 종 (소프바크), 란디아(Randia) 종 (인디고베리), 라파누스(Raphanus) 종 (다이콘, 무), 라피아(Raphia) 종 (와인 팜), 라베날라(Ravenala) 종 (여인목), 레만니아(Rehmannia) 종 (지황), 람누스(Rhamnus) 종 (갈매나무), 라피스(Rhapis) 종 (종려죽), 륨(Rheum) 종 (대황), 리조포라(Rhizophora) 종 (트루 맹그로브), 로도덴드론(Rhododendron) 종 (진달래, 라브라도 티, 로도덴드론), 루스(Rhus) 종 (옻나무), 리베스(Ribes) 종 (까치밥나무, 구스베리, 요스타베리), 리시노덴드론(Ricinodendron) 종 (아프리칸 너트), 리시누스(Ricinus) 종 (피마자유), 로비니아(Robinia) 종 (로커스트), 로리파(Rorippa) 종 (크레스), 로사(Rosa) 종 (장미), 로세마리누스(Rosemarinus) 종 (로즈마리), 로이스토네아(Roystonea) 종 (대왕 야자), 루부스(Rubus) 종 (라즈베리, 블랙베리, 클라우드베리, 테이베리, 영베리), 루드베키아(Rudbeckia) 종 (콘플라워, 검은눈 천인국), 루엘리아(Ruellia) 종 (와일드 페투니아), 루멕스(Rumex) 종 (소렐, 수영), 루타(Ruta) 종 (류), 사발(Sabal) 종 (팔메토, 사발), 사기타리아(Sagittaria) 종 (와파토), 살라카(Salacca) 종 (살락 팜), 살릭스(Salix) 종 (버드나무), 살비아(Salvia) 종 (세이지, 클라리, 로즈마리, 키아), 삼부쿠스(Sambucus) 종 (엘더베리, 엘더), 산도리쿰(Sandoricum) 종 (산톨), 산구이소르바(Sanguisorba) 종 (버넷), 산탈룸(Santalum) 종 (콴동), 산비탈리아(Sanvitalia) 종 (크리핑 진니아), 사르가숨(Sargassum) 종 (모자반, 씨 홀리), 사사프라스(Sassafras) 종 (사사프라스), 사투레자(Satureja) 종 (사보리), 사비아(Savia) 종 (사비아), 스카비오사(Scabiosa) 종 (큰체꽃), 스카에볼라(Scaevola) 종 (스카에볼라, 팬-플라워, 하프-플라워, 부채꽃, 걸피드), 쉬누스(Schinus) 종 (후추나무), 쉰지오피톤(Schinziophyton) 종 (몽곤고), 쉬산드라(Schisandra) 종 (오미자), 쉬조네페타(Schizonepeta) 종 (형개), 스콜리무스(Scolymus) 종 (골든 티슬), 스코르조네라(Scorzonera) 종 (블랙 살시파이), 세칼레(Secale) 종 (호밀), 세키움(Sechium) 종 (차요테), 세둠(Sedum) 종 (꿩의비름), 세네시오(Senecio) 종 (금방망이, 개쑥갓), 세네갈리아(Senegalia) 종 (검 아라빅, 카테추), 센나(Senna) 종 (캔들부시, 아바룸), 세콰이아(Sequoia) 종 (코스탈 레드우드), 세콰이아덴드론(Sequoiadendron) 종 (자이안트 세콰이아), 세레노아(Serenoa) 종 (톱야자), 세사뭄(Sesamum) 종 (참깨), 세수비움(Sesuvium) 종 (갯는장이), 쉐페르디아(Shepherdia) 종 (버팔로베리), 시달케아(Sidalcea) 종 (체커말로우), 실리붐(Silybum) 종 (큰엉겅퀴), 시마로우바(Simarouba) 종 (시마루바), 심몬드시아(Simmondsia) 종 (호호바), 시나피스(Sinapis) 아종 (겨자), 시시린키움(Sisyrinchium) 종 (블루-아이드 그래스), 시움(Sium) 종 (감자개발나물, 여뀌), 솔라눔(Solanum) 종 (토마토, 감자, 코코나, 까마중, 페피노, 나랑히야, 가든 허클베리, 가지), 솔리다고(Solidago) 종 (미역취), 소포라(Sophora) 종 (코와이), 소르부스(Sorbus) 종 (마가목, 채진목), 소르가스트룸(Sorghastrum) 종 (인디안그래스), 소르굼(Sorghum) 종 (소르굼), 스파르티나(Spartina) 종 (코드그래스), 스파티필룸(Spathiphyllum) 종 (스파트, 피스 릴리), 스파토데아(Spathodea) 종 (아프리칸 튤립 나무), 스파에로프테리스(Sphaeropteris) 종 (나무 고사리), 스피나키아(Spinacia) 종 (시금치), 스피라에아(Spiraea) 종 (스피레아), 스폰디아스(Spondias) 종 (몸빈), 스타키스(Stachys) 종 (베토니, 헤지네틀), 스타키타르페타(Stachytarpheta) 종 (포터위드), 스테노클라에나(Stenochlaena) 종 (양치류), 스테르쿨리아(Sterculia) 종 (열대 밤나무), 스테비아(Stevia) 종 (스테비아), 스테와르티아(Stewartia) 종 (스테와르티아), 스토케시아(Stokesia) 종 (스토크 아스터), 스트렐리치아(Strelitzia) 종 (극락조화), 스트로파리아(Stropharia) 종 (양송이), 스트루티오프테리스(Struthiopteris) 종 (디어 펀), 스티프놀로비움(Styphnolobium) 종 (네크레이스포드), 스티락스(Styrax) 종 (때죽나무), 수리아나(Suriana) 종 (베이 세더), 수테라(Sutera) 종 (수테라), 스위에테니아(Swietenia) 종 (마호가니), 시아그루스(Syagrus) 종 (오버탑 야자, 리커리 야자, 여왕 야자), 심포리카르포스(Symphoricarpos) 종 (스노우베리), 신세팔룸(Synsepalum) 종 (미라클 프루트), 시린가(Syringa) 종 (라일락), 시지기움(Syzygium) 종 (브러시 체리, 워터베리, 정향), 타베부이아(Tabebuia) 종 (트럼펫 트리), 타베르나에몬타나(Tabernaemontana) 종 (밀크우드), 타게테스(Tagetes) 종 (천수국), 탈리눔(Talinum) 종 (페임플라워), 타마린두스(Tamarindus) 종 (타마린드), 타나세툼(Tanacetum) 종 (쑥국화), 타락사쿰(Taraxacum) 종 (민들레), 타스만니아(Tasmannia) 종 (페퍼부시), 탁소디움(Taxodium) 종 (낙엽송, 수송), 탁수스(Taxus) 종 (주목), 테코마(Tecoma) 종 (트렘펫부시), 텔리마(Tellima) 종 (프린지컵), 터미날리아(Terminalia) 종 (인디안 아몬드, 터미날리아, 카카두 플럼), 테른스트로에미아(Ternstroemia) 종 (후피향나무), 테트라고나이(Tetragonai) 종 (시금치), 테트라지기아(Tetrazygia) 종 (클로버 애쉬), 튜크리움(Teucrium) 종 (저맨더), 테오브로마(Theobroma) 종 (카카오), 틀라스피(Thlaspi) 종 (말냉이), 투자(Thuja) 종 (서양측백, 투자, 삼나무), 티무스(Thymus) 종 (백리향), 티르소스타키스(Thyrsostachys) 종 (대나무), 티아렐라(Tiarella) 종 (폼플라워), 티보우키나(Tibouchina) 종 (티보우키나), 틸리아(Tilia) 종 (린덴), 톨미에아(Tolmiea) 종 (피기백 플랜트), 투나(Toona) 종 (연필향나무), 토레이아(Torreya) 종 (비자나무, 토레이아), 트라키카르푸스(Trachycarpus) 종 (야자나무), 트라키스페르뭄(Trachyspermum) 종 (아조완), 트라데스칸티아(Tradescantia) 종 (자주달개비), 트라고포곤(Tragopogon) 종 (샐서피), 트레멜라(Tremella) 종 (펀거스), 트리아디카(Triadica) 종 (조구나무), 트리불루스(Tribulus) 종 (납가새), 트리콜로마(Tricholoma) 종 (펀거스), 트리엔탈리스(Trientalis) 종 (스타플라워), 트리폴리움(Trifolium) 종 (클로버), 트리고넬라(Trigonella) 종 (호로파), 트릴리움(Trillium) 종 (트릴리움), 트리티쿰(Triticum) 종 (밀), 트로파에올룸(Tropaeolum) 종 (한련), 추가(Tsuga) 종 (헴록 트리), 투버(Tuber) 종 (송로), 투르비나리아(Turbinaria) 종 (디스크 코랄, 스크롤 코랄, 컵 코랄, 베이스 코랄, 파고다 코랄, 러플드 리지 코랄), 투르네라(Turnera) 종 (다미아나), 티파(Typha) 종 (캣테일, 부들, 리드메이스, 갈대, 펑크스, 애기부들), 우아파카(Uapaca) 종 (슈가 플럼), 우그니(Ugni) 종 (칠레 구아바), 울무스(Ulmus) 종 (느릅나무), 운카리아(Uncaria) 종 (캣츠 클로, 갬비어), 운그나디아(Ungnadia) 종 (멕시칸 벅아이), 우니올라(Uniola) 종 (바다 귀리), 우르티카(Urtica) 종 (쐐기풀), 바시니움(Vaccinium) 종 (블루베리, 크랜베리, 허클베리, 린곤베리), 발레리아넬라(Valerianella) 종 (상치아재비), 반코우베리아(Vancouveria) 종 (인사이드-아웃 플라워), 반구에리아(Vangueria) 종 (스페니쉬-타마린드), 바닐라(Vanilla) 종 (바닐라), 바스콘셀레아(Vasconcellea) 종 (마운틴 파파야, 바바코), 베르바스쿰(Verbascum) 종 (뮬레인), 베르베나(Verbena) 종 (버베나), 베르노니아(Vernonia) 종 (아이언위드), 베로니카(Veronica) 종 (꼬리풀), 비부르눔(Viburnum) 종 (크랜베리, 비부르눔), 비키아(Vicia) 종 (살갈퀴), 비그나(Vigna) 종 (콩), 비올라(Viola) 종 (팬지, 제비꽃), 비텍스(Vitex) 종 (자두, 채스트트리), 비티스(Vitis) 종 (포도나무), 볼바리엘라(Volvariella) 종 (양송이), 와싱토니아(Washingtonia) 종 (야자나무), 웨델리아(Wedelia) 종 (크리핑-옥스아이), 위스테리아(Wisteria) 종 (등나무), 윈타니아(Withania) 종 (아쉬와간다), 크산토세라스(Xanthoceras) 종 (기름밤나무), 크산토소마(Xanthosoma) 종 (타니에), 크시메니아(Ximenia) 종 (탈로우우드), 크실로피아(Xylopia) 종 (그레인즈 오브 셀림), 유카(Yucca) 종 (유카), 자미아(Zamia) 종 (소철), 잔톡실룸(Zanthoxylum) 종 (피망), 제아(Zea) 종 (옥수수, 테오신트), 젤코바(Zelkova) 종 (느티나무), 제피란테스(Zephyranthes) 종 (백합), 진기버(Zingiber) 종 (생강), 진니아(Zinnia) 종 (백일홍), 지자니아(Zizania) 종 (와일드 라이스), 및/또는 지지푸스(Ziziphus) 종 (대추나무, 지자펀)의 속으로부터의 임의의 식물을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 식물은 표 2 또는 표 4 또는 상기 단락에 제공된 목록에 열거된 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 유용한 예시 식물은 시트러스 식물 (예를 들어, 그레이프프루트, 오렌지, 레몬, 라임 등), 토마토 식물, 옥수수 식물, 피칸 식물, 및 담배 식물을 포함한다.
표 1. 플라스트 단백질
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표 2. 아그로박테리움 종에 대한 자연 숙주이거나 또는 아그로박테리움 종이 DNA 전달 프로세스에 사용된 예시 식물
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표 3. 예시 스틸렛 쉬스 억제 펩티드
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표 4. 예시 식물 및 이의 질환 및 해충
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표 5. 대표적인 표적화 펩티드의 아미노산 서열.
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X5는 임의의 5개의 아미노산이 단백질을 퍼옥시좀에 표적화하는 서열에 존재할 수 있음을 의미한다 (예를 들어 RLAVAVAHL, 서열식별번호:65).
본 발명은 이제 하기 실시예를 참고로 설명될 것이다. 이들 실시예는 본 발명에 대한 청구항의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 오히려 특정 실시양태의 예시적인 것으로 의도됨이 이해되어야 한다. 통상의 기술자에게 일어나는 예시화된 방법의 임의의 변동은 본 발명의 범위 내에 해당하는 것으로 의도된다.
실시예
실시예 1. 공생체 형성 접종물 및 공생체의 접종/생성
공생체 형성 접종물 및 공생체는 도 1에 예시된 바와 같은 i) 공동-접종, ii) 단일 접종, 및 iii) 직접 DNA 접종을 포함하는 몇몇 상이한 방법을 사용하여 생성될 수 있다.
i. 공동-접종 방법은 2종의 아그로박테리움 종 균주를 채용한다. 한 균주는 관심의 폴리뉴클레오티드 (POI)를 발현시키는데 사용되는 이원성 벡터를 함유하는 디스아암드 아그로박테리움 종 (예를 들어, 에이. 투메파시엔스 균주 EHA105 균주) 및 식물호르몬 유전자 (PHG)를 식물 세포에 전달하는데 사용되는 제2 야생형 (WT) 아그로박테리움 균주이다. POI 및 PH 유전자 (PHG) 둘 다를 갖는, 이 방식으로 공동-접종된 식물 세포는 의도되는 용도에 따라 공생체 형성 접종물로 또는 공생체로 지칭될 수 있다. 일부 경우에, 세포는 숙주 식물 상에 공생체를 형성하는 공생체 형성 접종물로서 사용될 수 있거나, 또는 식물 (또는 그의 부분) 상에 위치한 세포가 이 방식으로 박테리아 세포로 접종되는 경우, 이들은 식물 상에 직접적으로 공생체를 형성할 수 있다.
이원성 벡터를 운반하는 디스아암드 아그로박테리움 균주, 이 실시예에서, 균주 에이. 투메파시엔스 EHA105, 및 WT 균주를 관련 기술분야에서 통상적인 절차를 사용하여 성장시키고, 이어서 각각의 균주를 원심분리하여 박테리아 펠릿을 회수하고, 이어서 접종 완충제 (10 mM MgCl2, 10 mM MES [pH 5.6], 100 μM 아세토시린곤)에 OD600에서 각각 1 및 0.1의 최종 농도로 재현탁시켰다. 이어서 이들을 실온에서 1 내지 3시간 동안 유지하고, 이어서 함께 혼합한 후, 식물 조직에 접종한 후, 공생체 형성 접종물 또는 공생체가 형성되었다.
ii. 단일 접종 방법을 위해, 단지 단일 아그로박테리움 종을 사용하여 식물 세포 또는 식물 (예를 들어, 숙주 식물)을 접종한다. 이 실시예에서, POI 및 PHG 둘 다를 포함하는 이원성 벡터 (예를 들어, pSYM 플라스미드, 도 2 참조)를 운반하는 디스아암드 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA105 균주를 사용하여 식물 세포를 접종하였다. pSYM 플라스미드는 대략 7.5Kb 식물 성장 조절제, (인돌-3-아세트아미드 히드롤라제, 트립토판 2-모노옥시게나제, 이소펜테닐 트랜스퍼라제, 인돌-3-락테이트 신타제) 및 구성적 또는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 POI의 카세트를 함유한다. pSYM 플라스미드는 또한 pSYM 플라스미드를 운반하는 아그로박테리움 종 세포의 선택을 허용하는 선택가능한 마커 유전자 (카나마이신)를 함유하였다. 식물 조직을 아그로박테리움 종을 함유하는 pSYM의 현탁액으로 접종하여 공생체 형성 접종물 또는 공생체를 형성한다.
iii. 직접 DNA 접종을 위해, 바이오리스틱 전달 시스템은 DNA를 식물 세포 또는 조직 내로 전달하는데 사용될 수 있다. 이는 유전자(들) 벡터로서 아그로박테리움 종을 사용하지 않으면서 숙주 식물 세포 내로 직접적으로 추진되는 POI 및 PHG 유전자 코팅된 금속 입자를 사용하여 수행된다. 이어서 세포는 POI 및 PHG 유전자를 게놈 내로 혼입시키고, 이어서 식물 조직은 공생체 형성 접종물 또는 공생체 중 어느 하나 내로 형성될 수 있다. 예를 들어, 유사한 성공을 갖는 전기천공, 미세주사, 리포펙션 (리포솜 매개된 형질전환), 초음파처리, 규소 섬유 매개된 형질전환, 화학적으로 자극된 DNA 흡수 (예를 들어, 폴리펙션; 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 매개된 형질전환), 및/또는 레이저 마이크로빔 (UV) 유도된 형질전환을 포함하는 직접 DNA 전달의 많은 다른 방법은 공지되어 있으며, 바이오리스틱스 대신 사용될 수 있다.
DNA가 숙주 식물 세포 게놈 내로 전달되면, PHG의 발현은 식물 조직이 상이한 유전자 삽입 및 POI 및 PHG의 발현 수준을 갖는 세포의 수집을 갖는 혼합된 배양된 공생체를 성장시키도록 유도하고 자극시킬 것이다 (도 3 참조). 혼합된 배양된 공생체는 자율적으로 성장하고, POI 생성물이 숙주 식물에 수송될 수 있는 체관부 및 물관부 중 하나 또는 둘 다와 연결함으로써 맥관형성을 통해 숙주 식물에 연결할 수 있다. 공생체에 의해 생산된 POI 생성물은 공생체로부터의 아포플라스트 및/또는 심플라스트를 통해 및/또는 숙주 식물 전반에 걸쳐 분산을 위한 체관부 및/또는 물관부를 통해 전달될 수 있다.
혼합된 배양된 공생체는 이어서 절제되고, 바람직한 소질 및 발현 수준을 갖는 세포가 선택될 수 있는 호르몬 무함유 배양물에서 성장되고, 그렇게 하여 균일한 공생체 형성 접종물(들)의 단리를 허용할 수 있다. 순수한 배양 공생체 형성 접종물(들)에 대한 선택은 항생제 선택의 사용 (예를 들어, 단지 형질전환된 세포의 성장을 허용할 항생제 저항성 마커 POI (즉, POI 및 PHG를 갖는 세포)를 사용하는 것), 배양물의 계열 희석/분열을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않거나, 또는 단리되고 순수한 배양물로 성장될 수 있는 원형질체 및 단일 원형질체 세포로 전환될 수 있다. 공생체 형성 접종물(들)은 POI 및 PHG의 발현 외에도 바람직한 속성을 발현하는 것들에 대해 선택될 수 있다.
또한, 항생제를 사용하는 프로세스는 또한 아그로박테리움이 공생체 형성 프로세스에 사용되는 경우 혼합된 배양된 공생체 형성 접종물로부터 아그로박테리움 세포를 분리하는데 사용될 수 있다.
최종 절차는 식물 내로의 및 또는 식물 전반에 걸쳐 분산을 위한 그것이 POI 발현 생성물 또는 POI 발현 생성물의 생성물을 부착시키고 제공할 수 있는 숙주 식물 상으로의 선택된 공생체 형성 접종물(들)의 이식을 수반한다 (예를 들어, POI 발현 생성물은 공생체에서 생성물의 생합성에 관여하는 효소일 수 있고, 이는 공생체로부터 및 숙주 식물 내로 수송되는 생성물이다). 공생체 형성 접종물(들)이 식물 숙주에 부착되면, 이는 공생체(들)로 용어화되는 것을 형성한다. 공생체의 예는 도 4에 나타내어지며, 여기서 패널 A 및 B는 공동-접종 방법을 사용하여 접종 후 60일 후에 형성된 시트러스 공생체를 나타낸다. 패널 C 및 D는 시트러스 상에 단일 균주-접종 방법을 사용하여 형성된 공생체를 나타낸다 (예를 들어, 공동-접종 및 단일 균주 접종의 그래프적 제시에 대해서는 도 1 참조).
이 실시예에서, pSYM을 운반하는 아그로박테리움 종을 사용하여 식물 숙주를 접종하고, 공생체 형성을 유도하였다. 이렇게 하기 위해, 아그로박테리움 종을 적절한 항생제 (50 μg의 카나마이신)로 보충된 10 mL 루리아 버타니(Luria Bertani) 브로쓰에서 28℃에서 밤새 성장시켰다. 둘 다의 균주를 원심분리하여 박테리아 세포의 펠릿을 회수하고, 이어서 이를 접종 완충제 (이전에 기재됨)에 재현탁시켰다. 상이한 기술을 사용하여 숙주 식물을 접종할 수 있다. 예를 들어, 줄기 상에 거친 외부 구조를 갖는 시트러스와 같은 목질 식물은 식물 내로 침투하기 위하여 목질 줄기 조직을 천공하는 방법을 요구한다. 여기서 아그로박테리움 종 접종 용액에 침지된 시트러스를 위한 톱니 핀셋 (도 5, 패널 A 참조)을 사용하여 시트러스 껍질 조직을 천공하여 용액을 식물에 전달하였다. 유연성 줄기를 갖는 토마토와 같은 초본 식물 (도 5, 패널 B 및 도 5, 패널 C)은 이 실시예에서 아그로박테리움 종 용액에 바늘을 간단히 침지하고, 조직을 천공함으로써, 문신 바늘 (도 5, 패널 B) 또는 시린지 바늘 (도 5, 패널 C)을 사용하여 접종하여 아그로박테리움 종 용액을 식물 조직 내로 주사하거나 통과시켰다.
공생체 조직은 다양한 상이한 숙주 식물 유형 상에서 성장될 수 있다. 도 6에서, 본 발명자들은 피칸 (도 6, 패널 A), 토마토 (도 6, 패널 B), 시트러스 (도 6, 패널 C), 및 니코티아나 벤타미아나 (도 6, 패널 D) 상의 공생체 형성 및 성장을 예시한다. 이들 공생체는 상기 기재된 방법 중 하나를 사용한 접종에 의해 형성되었다.
실시예 2. 공생체-형성 접종물 시험관내 배양
공생체 형성 접종물 (예를 들어 도 7)은 추가의 숙주 식물을 접종하기 위해 생성되고 사용될 수 있다. 이 실시예는 아그로박테리움 종, 또는 공생체를 생성하는데 사용된 다른 박테리아, 및 한천 또는 액체 배양물을 오염시킬 수 있는 임의의 미생물 불순물의 제거를 포함한 미생물 오염의 공생체 조직을 세정하기 위한 프로세스를 기재한다 (예를 들어 도 8). 이 프로세스는 공생체 형성 접종물 시험관내 배양의 생성 및 유지를 허용한다.
공생체가 숙주 식물 상에서 발달하면, 이는 공생체 형성 접종물을 생성하는데 사용될 수 있다 (도 7 및 도 8). 이 목적을 위해, 공생체 조직을 숙주 식물로부터 분리하고, 흐르는 수돗물로 약 30분 동안 세정한다. 이어서 세정된 조직을 에탄올로 세척한다. 이어서, 조직을 10% 표백제 용액으로 세척하고, 이어서 멸균수의 용액으로 세척하였다. 멸균 단계는 박테리아 또는 진균의 외부 오염을 회피하기 위해 판상 유동 후드에서 멸균 조건에서 무균 기술을 사용하여 수행된다.
멸균 단계 후, 조직을 멸균 페이퍼 상으로 정치하여 건조시키고 (예를 들어, 멸균 필터 페이퍼), 이어서 토마토 및 시트러스 둘 다를 위해 무라쉬게 및 스쿠그(Murashige and Skoog) (MS) 기반 고체 한천 배지 상으로 (도 8, 패널 A 및 B) 또는 토마토 및 시트러스 둘 다를 위해 액체 한천 배지에 (도 8, 패널 C 및 D) 정치하였다.
항생제를 포함하는 성장 배지를 세포 배양에 사용하여 아그로박테리움 종 세포를 분리하고, 단지 공생체 형성 접종물 세포를 제공하였다. 다수의 조직 배양 분열 및 배지 상의 계대 후, POI의 균질한 발현이 도 7에 나타내어진 바와 같이 제공된다. 도 7은 선택적 배지 상에 엠체리를 발현하는 공생체 형성 접종물이 UV 광 및 엠체리 필터 하에서 나타내어진 바와 같이 형광 마커의 높은 발현을 가짐을 나타낸다.
실시예 3. 숙주 식물 상으로의 공생체 형성 접종물의 이식
공생체 조직 (도 6)을 상이한 작물로부터 단리하고, 실시예 2에 기재된 바와 같이 선택적 한천 배지 상에서 성장시켜 박테리아를 분리하여, 배양 배지 상에 공생체 형성 접종물을 생산하였다. 엠체리 (도 7) 또는 녹색 형광 단백질 (GFP)로 형질전환된 공생체 형성 접종물 조직을 사용하여, UV 램프를 갖는 엠체리/GFP 필터를 사용하여 형광 강도를 스크리닝함으로써 및 단지 형광 세포를 새로운 선택 한천 배지에 다수 회 전달함으로써 조직 선택을 최적화하였다 (실시예 2에 기재된 바와 같음). 토마토 및 시트러스로부터의 공생체 형성 접종물 조직을 선택적 고체 한천 배지 조건 하에서 (도 8, 패널 A (토마토); 도 8, 패널 B (시트러스)) 및 선택적 액체 한천 배지 조건 하에서 (도 8, 패널 C (토마토) 및 (도 8, 패널 D (시트러스)) 성장시켰다.
이식을 위해 준비된 공생체 형성 접종물 조직을 배양 배지로부터 분리하고, 이어서 식물호르몬을 함유하는 이식 용액 (옥신 및 시토키닌을 갖는 멸균 증류수)에서 세척하였다. 이식 용액은 공생체 형성 접종물 및 숙주 식물 상호작용의 이식 효능을 보조하는데 사용된다. 세척 후, 이식 용액 중의 공생체 형성 접종물, 시트러스로부터의 조직을 줄기 표피 층이 이전에 제거된 위치에서 시트러스 식물 줄기에 적용하였다. 공생체를 형성하기 위한 공생체 형성 접종물의 이식/그라프팅 부착을 보장하기 위해, 규소 테이프를 공생체 형성 접종물/공생체 조직 및 줄기 주위에 단단히 적용하였다 (도 9, 패널 A). 널리 이해될 것인 바와 같이, 제조된 숙주 식물 상의 위치에 공생체 형성 접종물/공생체 조직을 유지하기 위한 다른 방법을 규소 테이프 대신 사용한다. 약 6주 후, 규소 테이프를 공생체로부터 제거하고 (도 9, 패널 B), 조직을 절제하여 부착, 맥관형성 (도 9, 패널 C) 및 GFP 발현 (도 9, 패널 F)을 평가하였으며, 이들 각각을 관찰하였다.
토마토에 대해, 토마토로부터 제조된 공생체 형성 접종물 조직을 먼저 식물호르몬 (옥신 및 시토키닌)을 함유하는 이식 용액에서 세척하였다. 토마토로부터의 공생체 형성 접종물 조직을 줄기 표피 층이 제거된 토마토 식물 줄기에 적용하였다. 시트러스 실시예와 유사하게, 줄기에의 공생체 조직의 부착을 보장하기 위해, 플라스틱 랩 (예를 들어 파라필름® M)을 적용하여 습도의 유지 및 공생체 형성 접종물 및 줄기 사이의 접촉을 보조하였다 (도 9, 패널 D). 6주 후, 공생체 조직을 토마토 숙주 식물과 통합하고, 크기를 증가시켰으며 (도 9, 패널 E), 이는 성공적인 이식을 입증한다.
실시예 4. 공생체 다용도성
공생체 세포는 1개 또는 2개 이상의 단계 (예를 들어, 1회 또는 2회 이상의 접종 (예를 들어, 1종 또는 1종 초과의 아그로박테리움 균주); DNA를 전달하는 것으로 공지된 임의의 시스템을 사용한 1회 또는 1회 초과의 도입에서 세포에 제공될 수 있는 1개 또는 2개 이상의 벡터/발현 카세트를 사용하여 도입된 1종 또는 2종 이상의 POI를 발현할 수 있다. 이러한 방법은 도 1에 예시되어 있다. 숙주 식물 상으로 상이한 공생체 유형 (즉, 하나의 유형의 POI를 갖는 1종의 공생체 및 1종 이상의 상이한 POI를 포함하는 1종 이상의 추가의 공생체)을 이식하는 것 외에도, 동일한 벡터/발현 카세트/T-DNA 영역 상에 다수의 관심의 폴리뉴클레오티드를 갖는 pSYM 플라스미드를 생성하는 것이 또한 가능하다 - 전달되는 단일 pSYM 상에 다수의 POI를 효과적으로 '스태킹'하여 공생체를 형성함 (실시예 1 내지 3에 이전에 기재된 바와 같음). 이러한 POI는 각각 특이적 프로모터에 의해 조절될 수 있거나 (도 10), 또는 동일한 프로모터 또는 상이한 프로모터일 수 있는 별개의 프로모터에 의해 조절될 수 있다. 각각 단지 1종의 POI를 갖는 고유한 pSYM을 각각 운반하는 상이한 아그로박테리움 종 (또는 다른 생존 박테리아 시스템)을 사용하는 것이 또한 가능하다 (도 2). 다수의 POI를 갖는 pSYM은 또한 채용될 수 있는 '유전자 스태킹'의 예이다 (도 10). 상이한 공생체 형성 접종물 (동일한 또는 상이한 POI를 가짐)이 동일한 숙주 식물 상에 사용되는 경우는 식물에게 식물 당 다수의 POI의 유익을 제공하는 '공생체 스태킹'의 예이다.
이 실시예에서, 본 발명자들은 별개의 아그로박테리움 공생체 형성 접종물의 공동-접종으로의 아그로박테리움-매개된 형질전환을 사용하였으며, 하나는 GFP를 코딩하는 고유한 pSYM 플라스미드를 갖고, 다른 것은 엠체리를 코딩하는 pSYM 플라스미드를 갖는다. GFP 및 엠체리 축적의 검출을 형광 현미경검사 조사에 의해 수행하였다 (도 11). 공생체 살아 있는 세포를 이용하여 단백질의 국재화 및 역학을 추적하고, 공생체의 섹션을 현미경 하에서 분석하여 GFP를 발현하는 세포, 엠체리를 발현하는 세포, 및 GFP 및 엠체리 발현 둘 다를 갖는 세포를 검출하였다. 이 실시예는 상이한 세포에서 고유한 POI (도 11, 패널 B 내지 E) 또는 동일한 세포에서 다수의 POI (도 11, 패널 G 내지 H)를 발현하는 공생체 세포의 다용도성 및 동일한 숙주 식물 상에 지지되는 그들의 능력을 입증하였다.
실시예 5. POI 생성물의 생산 및 이출
공생체는 대량의 목적하는 POI 생성물 (예를 들어 단백질, 도 12)을 생산하고 축적할 수 있다. 예비 평가는 공생체 조직의 최대 30%가 POI 생성물일 수 있음을 시사한다 (도 13). GFP를 발현하는 공생체를 아그로박테리움 종 단일 접종 (예를 들어, 단일 균주)을 사용하여 토마토 및 시트러스 숙주 식물 상에 생성하였다 (도 12). GFP 및 엠체리 둘 다를 조합하는 것은 웨스턴 블롯을 사용하여 형광 강도 및 단백질 축적을 측정함으로써 유전자 발현의 가시화 및 정량화를 허용하였다 (도 13). 공생체로부터 총 단백질을 추출하기 위해, 1g의 공생체 물질을 사용하고, 액체 질소로 동결시키고 조직을 분쇄함으로써 분말로 변화시켰다. 이어서 이를 단백질 추출 완충제 (예를 들어, 150 mM 트리스-HCl, pH 7.5; 150 mM NaCl; 5mM EDTA; 1% IGEPAL® CA-630; 및 1% (부피/부피) 프로테아제 억제제 혼합물 1 정제 100 mL)에 현탁시켰다. 추출을 위해, 완충제를 2 mL/g의 조직 분말로 첨가하였다. 샘플을 4℃에서 20분 원심분리에 의해 정화시켰다. 상청액을 수집하고, 몇 번 희석을 투입을 위해 10-7 희석까지 수행하고, SDS-PAGE 겔 상에서 환원 조건 하에서 분석하였다. 이어서 샘플을 니트로셀룰로스 막 상으로 블롯팅하고, 제조업체의 프로토콜 (써모피셔(ThermoFisher)®)에 따라 항체와 인큐베이션하였다. 막을 화학발광 기질을 사용하여 인큐베이션하고, 화상화 및 데이터를 포획하였다 (도 13).
공생체는 물-전도 용기 및 동화-수송 체 요소로 이루어진 숙주 식물과의 세련된 맥관 네트워크 연결의 형성을 유도할 수 있다 (도 14, 패널 A 및 B). 공생체 세포는 원형질연락사를 기능화함으로써 긴밀하게 연결된다. 톨루이딘 블루를 사용하여 체관부 및 물관부 세포 사이를 구별하였는데, 이는 체관부에서 발견되는 세포가 단지 1차 세포벽을 갖는 반면, 물관부에서 발견되는 세포는 1차 및 2차 세포벽 둘 다를 갖기 때문이다 (도 14, 패널 C). 조합으로 공생체 세포에서의 높은-수준의 POI 발현 및 많은 양의 맥관화된 조직은 숙주 식물 맥관 조직 내로의 POI의 이동을 용이하게 한다. 형광 단백질 GFP 및 엠체리를 사용하여, 형광 현미경을 사용하여 토마토 식물에서 공생체 세포로부터 식물 맥관계로의 단백질의 축적 및 이동을 검출하고 모니터링하였다. 공생체 위 1 내지 2 cm의 숙주 식물 조직을 세로 (도 14, 패널 D) 및 횡단면 (도 15)으로 수집하여 GFP/엠체리 이동을 확인하였다 (형광 현미경검사에 의해). 웨스턴 블롯 기술을 또한 사용하여 공생체에서 및 식물 숙주 줄기에서 단백질 축적을 검출하고 분석하였으며, 이는 현미경검사 분석으로부터의 결과를 입증한다 (도 16).
용질은 숙주 식물의 그것에 연결되고, 동화물의 수송을 위한 체관부 및 물 및 광물을 위한 물관부로 이루어진 맥관 조직을 통해 공생체에 들어가며, 동일한 방식으로 공생체의 생성물은 공생체로부터 숙주 식물로 수송된다. 생성물은 공생체 세포로부터 숙주 식물로 이동할 수 있지만, 공생체로부터 숙주 식물 세포로의 유전 물질 이동은 없다. 본 발명자들은 POI에 대한 특이적 프라이머를 사용한 PCR 검출을 사용함으로써 POI의 DNA가 공생체에 제한됨을 확인하였고, 본 발명자들은 공생체 및 이웃하는 줄기 섹션을 조사하였다. 공생체 및 숙주 식물 조직의 PCR 분석은 단지 공생체 세포가 POI로 유전적으로 형질전환됨을 나타내었으며 (도 17), 이는 숙주 식물이 POI로 형질전환되지 않음을 지시한다. 이는 새로운 특징을 갖지만 유전자 변형은 갖지 않는 숙주 식물을 제공한다.
실시예 6: 숙주 식물에 대한 POI의 효과
공생체 조직은 매우 다용도성이며, 이는 많은 상이한 기능 또는 활성을 적응시키거나 그에 적응될 수 있다. 예를 들어, 플라워링 로커스 T (FT3) 단백질은 잎에서 합성되고, 체관부를 통해 및 식물에서의 개화를 제어하는 접목 접착부를 통해 전위되며, 그의 과발현은 종종 식물 왜소증과 연관된다. 본 발명자들은 PHG 및 FT3 생성물을 식물에 전달하는 pSYM을 갖는 아그로박테리움 투메파시엔스를 사용하여 토마토 식물 상에 공생체를 생성하였고 (도 18, 패널 A), 또한 대조군으로서 야생형 아그로박테리움 투메파시엔스 (즉, pSYM을 결여함)를 사용하여 토마토 상에 공생체를 생성하였다 (도 18, 패널 B).
FT3을 발현하는 공생체를 갖는 토마토 식물은 무성하고, 대조군에 비해 많은 가지 및 잎 구조를 갖는다 (도 18, 패널 A 및 B를 비교). FT3을 발현하는 공생체는 가지의 수를 증가시켜 (도 18, 패널 A), 단지 하나의 잎이 각각의 마디에 존재하는 토마토 입차례를 변형시키고, 식물의 중심 줄기는 대조군 토마토 식물 상에 나타내어진 바와 같이 다른 측면 줄기에 비해 우세하다 (도 18, 패널 B).
공생체는 또한 식물 표현형을 변형시키고 조정하여, 특이적 병원체에 대한 저항성을 증진시켜 방어 메커니즘을 개선시키고, 식물 건강을 증가시키는데 사용될 수 있다. 도 19는 특이적 병원체에 대한 식물의 저항성을 증진시키는 예를 나타낸다. 여기서 공생체를 PHG 및 온코신 (항미생물 펩티드)을 갖는 pSYM을 포함하는 아그로박테리움 투메파시엔스를 사용하여 시트러스 상에 생성하고, 그에 의해 PHG 및 온코신을 포함하는 공생체를 생성하였다 (도 19, 패널 A). 대조군으로서 공생체를 "온코신 없는" 대조군으로서 야생형 에이. 투메파시엔스로 시트러스 상에 생성하였다 (도 19 B). 온코신 생산 공생체는 온코신을 전달하여 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스 (CLas)를 처리하도록/살해하도록 디자인된다. CLas는 전세계 시트러스에서 파괴적인 수율 소실을 유발하는 감귤녹화병 (시트러스 녹화병으로 공지됨)의 원인적 작용제이다. 지금까지, 이 질환에 대한 확립된 치유법은 없다. 본 발명자들은 고도로 맥관화되어 숙주 식물에 및 CLas 박테리아에 대해 이 항박테리아 펩티드를 생산하고 전달하는 공생체 구조를 이용하였다. 펩티드의 이출을 개선시키기 위해, 이를 신호/표적 서열 펩티드 (SS 또는 +)에 융합시켰다. 신호 서열은 예를 들어 세포질 세망에 표적화되고, 결국 세포외로 분비되도록 정해진 단백질에서 발견된다. "온코신" 및 "온코신 +"를 발현하는 공생체는 둘 다 qPCR에 의해 결정된 바와 같이 시간 경과에 따라 CLas 역가를 감소시켰으며 (도 20), 또한 식물 건강은 대조군에 비해 얼룩진 반점의 감소 (도 19, 패널 D 및 F)를 포함한 전형적인 HLB 식물 증상의 감소 (도 19, 패널 C 및 E)에 의해 지시된 바와 같이 개선되었다.
나타내어진 바와 같이, 공생체는 생성물을 발현하고 전위시켜 직접적으로 감염을 방해하거나 숙주 식물에 존재하는 병원체를 살해하는데 사용될 수 있다. 온코신 및 온코신 +를 발현하는 공생체는 시트러스 건강을 개선시키고 CLas 박테리아 역가를 감소시키는 것으로 이전에 확인되었다 (기재된 바와 같음, 도 19 및 도 20). 이를 추가로 조사하기 위해, 본 발명자들은 상이한 POI (GFP+, TMOF, TMOF+, 온코신 및 온코신+)를 발현하는 상이한 공생체를 갖는 CLas 양성 시트러스 숙주 식물을 연구하였으며, CLas 역가 효과의 qPCR 분석에 의해 이들 상이한 POI의 CLas 역가 및 효능을 모니터링하였다 (도 21). "GFP+" (신호 서열을 갖는 GFP)를 발현하는 공생체를 대조군으로서 사용하였다. 결과는 TMOF, TMOF+, 온코신, 및 온코신+ 둘 다가 그의 역가를 감소시킴으로써 CLas에 대한 항박테리아 효과를 가짐을 지시하였다 (도 21).
나타내어진 바와 같이, 본 발명의 공생체의 다용도성은 숙주 식물 특징을 개선시키고 식물 해충을 방제하는 능력을 제공한다. 또 다른 예로서, 공생체는 예를 들어, 식물 과다민감성 반응 및 세포 사멸을 촉발시킴으로써, 제초제로서 사용될 수 있는 유해 식물 효과를 생성하는데 사용될 수 있다. 예로서, 니코티아나 벤타미아나를 세포 사멸 프로세스의 활성화를 초래하고 숙주 식물을 살해하는 반응성 산소 종 (ROS)의 과도한 생산을 유발하는 식물 뉴클레오티드-결합, 류신-풍부 반복부 (NLR) 면역 수용체에 의해 인식되는 CLas로부터의 이펙터 단백질에 대한 POI를 갖는 공생체 형성 접종물로 주사하였다 (도 22).
상기는 본 발명의 예시이며, 그의 제한인 것으로 해석되지 않아야 한다. 상기 논의된 실시양태의 추가의 변동은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다. 따라서, 상기 기재된 실시양태는 제한적이라기 보다는 예시적인 것으로 간주되어야 한다. 따라서, 그러한 실시양태에 대한 변동은 청구항의 등가물이 그 안에 포함되는 하기 청구항에 의해 한정되는 바와 같은 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않으면서 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> The United States of America, as Represented by the Secretary of Agriculture AgroSource, Inc. Shatters, Robert G. Stover, Eddie W. Niedz, Randall P. Heck, Michelle L. Pitino, Marco Grando, Magali Ferrari Krystel, Joseph <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODIFYING A PLANT CHARACTERISTIC WITHOUT MODIFYING THE PLANT GENOME <130> 1554-3WO <150> US 62/903,183 <151> 2019-09-20 <160> 65 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1398 <212> DNA <213> Agrobacterium tumefaciens <400> 1 attaaaagca tcgggaaagg aaggaaaatt tatggctttt tctaatgctg ccccgattgc 60 taacagacgg tggtctgacc ccgctaatcc atcaatttcc attccaacag gcaagcgatc 120 aggtgtaagg caggcaggaa ggctcaaccc aggtaggcct gcgttgctgc ttgggtccac 180 atttcgcacg tagatcttga aagtgttcat cattgagcca ttgtggatga ctgacgactc 240 ctgacctatg gctttggccg ctaagggtgc agttgggaaa aggattgcat ctaactgata 300 gagtctgaag taattccgat aagtggcctg gagccttggc ctgaaggatt gacgcgccag 360 ttcatattca tcgttggaaa tttgatgccc atcaatttgc gcactgacaa tgttcgctac 420 atcggggcta cgaattcttt gaaacgtcag aaaaagaaat gttcccacaa aatcgtccag 480 atactttttt agagcgtgtg gaaattcgta aagcgcaatt ggcaaacttg ccccactatt 540 cagttcctct aggtggggga tgtcggcttc aacaaaggtt acgcctctgt 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Agrobacterium tumefaciens <400> 2 Met Val Pro Ile Thr Ser Leu Ala Gln Thr Leu Glu Arg Leu Arg Arg 1 5 10 15 Lys Asp Tyr Ser Cys Leu Glu Leu Val Lys Thr Leu Ile Ala Arg Cys 20 25 30 Gln Ala Ala Lys Pro Leu Asn Ala Leu Leu Ala Thr Asp Trp Asp Gly 35 40 45 Leu Arg Arg Thr Ala Lys Lys Ile Asp Arg His Gly Asn Ala Gly Leu 50 55 60 Gly Leu Cys Gly Ile Pro Leu Cys Phe Lys Gly Asn Ile Ala Thr Gly 65 70 75 80 Ile Phe Pro Thr Ser Ala Ala Thr Pro Ala Leu Ile Asn His Leu Pro 85 90 95 Asn Ile Pro Ser Arg Val Pro Gln Thr Leu Phe Ser Ala Gly Pro Leu 100 105 110 Pro Gly Ala Ser Gly Asn Met His Glu Leu Ser Phe Gly Ile Thr Ser 115 120 125 Asn Asn Tyr Ala Thr Gly Ala Val Arg Asn Pro Trp Asn Pro Ser Leu 130 135 140 Ile Pro Gly Gly Ser Ser Gly Gly Val Ala Ala Ala Val Ala Ser Arg 145 150 155 160 Leu Met Leu Gly Gly Ile Gly Thr Asp Thr Gly Ala Ser Val Arg Leu 165 170 175 Pro Ala Ala Leu Cys Gly Val Val Gly Phe Arg Pro Thr Leu Ala Arg 180 185 190 Tyr Pro Arg Asp Arg Ile Ile Pro Val Ser Pro Thr Arg Asp Thr Ala 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gaaacctgat gctgaagggt 600 tcggcaggtt cctttccaac aatcgacttg ctctacgact acagaccgtt ttttgaccaa 660 tgttccgata gtggacggat cggcttcttt ccggaggatg ttcctaagcc gaaagtggcg 720 gtcattggcg ctggcatttc cggactcgtg gtggcaaacg aactgcttca tgctggggta 780 gacgatgtta caatatatga agcaagtgat cgtgttggag gcaagctttg gtcacatgct 840 ttcagggacg ctcctagtgt cgtggccgaa atgggggcga tgcgatttcc tcctgctgca 900 ttctgcttgt ttttcttcct cgagcgttac ggcctgtctt cgatgaggcc gttcccaaat 960 cccggcacag tcgacactta cttggtctac caaggcgtcc aatacatgtg gaaagccggg 1020 cagctgccac cgaagctgtt ccatcgcgtt tacaacggtt ggcgtgcgtt cttgaaggac 1080 ggttttcatg agcgagatat tgtgttggct tcgcctgtcg ctattactca ggccttgaaa 1140 tcaggagaca ttaggtgggc tcatgactcc tggcaaattt ggctgaaccg tttcgggagg 1200 gagtccttct cttcagggat agagaggatc tttctgggca cacatcctcc tggtggtgaa 1260 acatggagtt ttcctcatga ttgggaccta ttcaagctaa tgggaatagg atctggcggg 1320 tttggtccag tttttgaaag cgggtttatt gagatcctcc gcttggtcat caacggatat 1380 gaagaaaatc agcggatgtg ccctgaagga atctcagaac ttccacgtcg gatcgcatct 1440 gaagtggtta acggtgtgtc tgtgagccag cgcatatgcc atgttcaagt cagggcgatt 1500 cagaaggaaa agacaaaaat aaagataagg cttaagagcg ggatatctga actttatgat 1560 aaggtggtgg tcacatctgg actcgcaaat atccaactca ggcattgcct gacatgcgat 1620 accaatattt ttcaggcacc agtgaaccaa gcggttgata acagccatat gacaggatcg 1680 tcaaaactct tcctgatgac tgaacgaaaa ttctggttag accatatcct cccgtcttgt 1740 gtcctcatgg acgggatcgc aaaagcagtg tattgcctgg actatgagtc gcaggatccg 1800 aatggtaaag gtctagtgct catcagttat acatgggagg acgactccca caagctgttg 1860 gcggtccccg acaaaaaaga gcgattatgt ctgctgcggg acgcaatttc gagatctttc 1920 ccggcgtttg cccagcacct atttcctgcc tgcgctgatt acgaccaaaa tgttattcaa 1980 catgattggc ttacagacga gaatgccggg ggagctttca aactcaaccg gcgtggtgag 2040 gatttttatt ctgaagaact tttctttcaa gcactggaca cggctaatga taccggagtt 2100 tacttggcgg gttgcagttg ttccttcaca ggtggatggg tggagggtgc tattcagacc 2160 gcgtgtaacg ccgtctgtgc aattatccac aattgtggag gcattttggc aaagggcaat 2220 cctctcgaac actcttggaa gagatataac taccgcacta gaaattag 2268 <210> 4 <211> 755 <212> PRT <213> Agrobacterium tumefaciens <400> 4 Met Ser Ala Ser Ala Leu Leu Asp Asn Gln Cys Asp His Phe Ser Thr 1 5 10 15 Lys Met Val Asp Leu Ile Met Val Asp Lys Ala Asp Glu Leu Asp Arg 20 25 30 Arg Val Ser Asp Ala Phe Ser Glu Arg Glu Ala Ser Arg Gly Arg Met 35 40 45 Ile Thr Gln Ile Ser Gly Glu Cys Ser Ala Gly Leu Ala Cys Lys Arg 50 55 60 Leu Ala Asp Gly Arg Phe Pro Glu Ile Ser Ala Gly Glu Lys Val Ala 65 70 75 80 Ala Leu Ser Ala Tyr Ile Tyr Val Gly Lys Glu Ile Leu Gly Arg Ile 85 90 95 Leu Glu Ser Glu Pro Trp Ala Arg Ala Arg Val Ser Gly Leu Val Ala 100 105 110 Ile Asp Leu Ala Pro Phe Cys Met Asp Phe Ser Glu Ala Gln Leu Leu 115 120 125 Gln Thr Leu Phe Leu Leu Ser Gly Lys Arg Cys Ala Ser Ser Asp Leu 130 135 140 Ser His Phe Val Ala Ile Ser Ile Ser Lys Thr Ala Arg Ser Arg Thr 145 150 155 160 Leu Gln Met Pro Pro Tyr Glu Lys Gly Thr Thr Lys Arg Val Thr Gly 165 170 175 Phe Thr Leu Thr Leu Glu Glu Ala Val Pro Phe Asp Met Val Ala Tyr 180 185 190 Gly Arg Asn Leu Met Leu Lys 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cttgcttgcc aggcccagca 240 ggtatacccc tgaatattat actcaatgat tctctaacgt acgtttattg ttcgtttcaa 300 gcaatgcgaa agtacgcaca caagcgattt tatgacggcg tttccgacga aggcgtagtc 360 atctccaccg ttccacccta tgcggaagga ataacaaaag aaactatgag gtcgtggcac 420 aacaacgtct gtcagaatac aagcaatgaa acacatgatt tggatgctta tattgctttc 480 cttcctactt cgcttcaaaa tccaagtttc tcgcatatga agatcggctg cgatagcttc 540 ttagcgccat cccgggttga tcctttctgt gttgaaataa tcgcggtcgg caaagccctc 600 tttcatgata acgggctgaa aaagaaccca aggtgtggtg gtcaatggct cccaccttct 660 tgt 663 <210> 6 <211> 221 <212> PRT <213> Agrobacterium fabrum <400> 6 Met Tyr His Ser Arg Pro Ile Phe Asn Ile Ile Asp Ser Ser Asn Ile 1 5 10 15 Gln Asp Arg Arg Glu Leu Lys Leu Val Leu Arg His Thr Glu Ile Ala 20 25 30 Tyr Arg Ser Phe Ala Gln Glu Asp Leu Ile Pro Ala Gln Arg Ser Trp 35 40 45 Met Asn Ser Ile Ile Asn Thr Asp Val Pro Ile Asp Pro Ala Ile Asp 50 55 60 Glu Val Val Lys Arg Phe Cys Glu Val Ala Cys Leu Pro Gly Pro Ala 65 70 75 80 Gly Ile Pro Leu Asn Ile Ile Leu Asn Asp Ser 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Met Val Asp Leu Ile Met Val Asp Lys Ala Asp Glu Leu Asp Arg 20 25 30 Arg Val Ser Asp Ala Phe Ser Glu Arg Glu Ala Ser Arg Gly Arg Arg 35 40 45 Ile Thr Gln Ile Ser Gly Glu Cys Ser Ala Gly Leu Ala Cys Lys Arg 50 55 60 Leu Ala Asp Gly Arg Phe Pro Glu Ile Ser Ala Gly Glu Lys Val Ala 65 70 75 80 Ala Leu Ser Ala Tyr Ile Tyr Val Gly Lys Glu Ile Leu Gly Arg Ile 85 90 95 Leu Glu Ser Glu Pro Trp Ala Arg Ala Arg Val Ser Gly Leu Val Ala 100 105 110 Ile Asp Leu Ala Pro Phe Cys Met Asp Phe Ser Glu Ala Gln Leu Leu 115 120 125 Gln Thr Leu Phe Leu Leu Ser Gly Lys Arg Cys Ala Ser Ser Asp Leu 130 135 140 Ser His Phe Val Ala Ile Ser Ile Ser Lys Thr Ala Arg Ser Arg Thr 145 150 155 160 Leu Gln Met Pro Pro Tyr Glu Lys Gly Thr Thr Lys Arg Val Thr Gly 165 170 175 Phe Thr Leu Thr Leu Glu Glu Ala Val Pro Phe Asp Met Val Ala Tyr 180 185 190 Gly Arg Asn Leu Met Leu Lys Ala Ser Ala Gly Ser Phe Pro Thr Ile 195 200 205 Asp Leu Leu Tyr Asp Tyr Arg Ser Phe Phe Asp Gln Cys Ser Asp Ser 210 215 220 Gly Arg Ile Gly Phe Phe 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gaagaactga aaggaacgag ccgtctatac 180 cttgatgatc ggcctctggt gaagggtatc atcgcagcca agcaagctca tgaaaggctg 240 atgggggagg tgtataatta tgaggcccac ggcgggctta ttcttgaggg aggatctatc 300 tcgttgctca agtgcatggc gcaaagcagt tattggagtg cggattttcg ttggcatatt 360 attcgccacg agttagcaga cgaggagacc ttcatgaacg tggccaaggc cagagttaag 420 cagatgttac gccctgctgc aggcctttct attatccaag agttggttga tctttggaaa 480 gagcctcggc tgaggcccat actgaaagag atcgatggat atcgatatgc catgttgttt 540 gctagccaga accagatcac atccgatatg ctattgcagc ttgacgcaga tatggaggat 600 aagttgattc atgggatcgc tcaggagtat ctcatccatg cacgccgaca agaacagaaa 660 ttccctcgag ttaacgcagc cgcttacgac ggattcgaag gtcatccatt cggaatgtat 720 <210> 22 <211> 240 <212> PRT <213> Agrobacterium fabrum <400> 22 Met Asp Leu Arg Leu Ile Phe Gly Pro Thr Cys Thr Gly Lys Thr Ser 1 5 10 15 Thr Ala Val Ala Leu Ala Gln Gln Thr Gly Leu Pro Val Leu Ser Leu 20 25 30 Asp Arg Val Gln Cys Cys Pro Gln Leu Ser Thr Gly Ser Gly Arg Pro 35 40 45 Thr Val Glu Glu Leu Lys Gly Thr Ser Arg Leu Tyr Leu Asp Asp Arg 50 55 60 Pro Leu Val Lys Gly Ile Ile Ala Ala Lys Gln Ala His Glu Arg Leu 65 70 75 80 Met Gly Glu Val Tyr Asn Tyr Glu Ala His Gly Gly Leu Ile Leu Glu 85 90 95 Gly Gly Ser Ile Ser Leu Leu Lys Cys Met Ala Gln Ser Ser Tyr Trp 100 105 110 Ser Ala Asp Phe Arg Trp His Ile Ile Arg His Glu Leu Ala Asp Glu 115 120 125 Glu Thr Phe Met Asn Val Ala Lys Ala Arg Val Lys Gln Met Leu Arg 130 135 140 Pro Ala Ala Gly Leu Ser Ile Ile Gln Glu Leu Val Asp Leu Trp Lys 145 150 155 160 Glu Pro Arg Leu Arg Pro Ile Leu Lys Glu Ile Asp Gly Tyr Arg Tyr 165 170 175 Ala Met Leu Phe Ala Ser Gln Asn Gln Ile Thr Ser Asp Met Leu Leu 180 185 190 Gln Leu Asp Ala Asp Met Glu Asp Lys Leu Ile His Gly Ile Ala Gln 195 200 205 Glu Tyr Leu Ile His Ala Arg Arg Gln Glu Gln Lys Phe Pro Arg Val 210 215 220 Asn Ala Ala Ala Tyr Asp Gly Phe Glu Gly His Pro Phe Gly Met Tyr 225 230 235 240 <210> 23 <211> 243 <212> PRT <213> Agrobacterium rhizogenes <400> 23 Met Leu Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Pro Thr Cys Ser Gly Lys Thr Asp 1 5 10 15 Ile Ala Ile Gln Ile Ala Gln Lys Thr Gly Trp Pro Val Val Ala Leu 20 25 30 Asp Arg Val Gln Cys Cys Pro Gln Ile Ala Thr Gly Ser Gly Arg Pro 35 40 45 Leu Pro Ser Glu Leu Gln Ser Thr Arg Arg Ile Tyr Leu Asp Ser Arg 50 55 60 Arg Leu Thr Lys Gly Ile Ile Asp Ala Glu Gly Ala His Arg Arg Leu 65 70 75 80 Ile Leu Glu Val Asp Trp Gln Glu Ser Glu Glu Gly Leu Ile Leu Glu 85 90 95 Gly Gly Ser Val Ser Leu Leu Asn Cys Met Ala Lys Ser Pro Tyr Trp 100 105 110 Lys Ser Gly Phe Gln Trp His Val Lys Arg Leu Arg Leu Gly Asp Ser 115 120 125 Asp Ala Phe Leu Ala Arg Ala Lys Gln Arg Val Thr Glu Met Phe Ala 130 135 140 Ile Arg Glu Asp Arg Pro Ser Leu Leu Glu Glu Leu Ala Glu Leu Trp 145 150 155 160 Asn Tyr Pro Ala Thr Arg Pro Ile Leu Glu Asp Ile Asp Gly Tyr Arg 165 170 175 Cys Ala Ile Arg Phe Ala Arg Lys His Asp Leu Ala Ile Asn Gln Leu 180 185 190 Pro Asp Ile Asp Ala Glu Arg Gln Gln Asp Leu Ile Glu Ala Ile Ala 195 200 205 Lys Glu Tyr Leu Glu His Ala Ile Met Gln Glu Arg Asp Phe Pro Gln 210 215 220 Trp Pro Glu Asp Gly Ala Arg Gln Pro Val Gly Pro Ala Thr Leu Met 225 230 235 240 Arg Ile Gln <210> 24 <211> 282 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> polynucleotide Jaburetox <400> 24 atgggtccag ttaatgaagc caattgtaaa gcagctatgg agattgtgtg cagaagggaa 60 tttggacata aggaagaaga agatgcaagt gagggtgtta ccacaggaga ccctgattgt 120 cctttcacca aagccattcc tcgtgaagaa tatgctaaca agtatggtcc gactattggt 180 gacaaaatcc gtcttggtga cactgatttg attgctgaaa ttgaaaagga ttttgccctt 240 tatggtgatg aaagtgtttt tggaggtgga aaagttatat ag 282 <210> 25 <211> 93 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> polypeptide Jaburetox <400> 25 Met Gly Pro Val Asn Glu Ala Asn Cys Lys Ala Ala Met Glu Ile Val 1 5 10 15 Cys Arg Arg Glu Phe Gly His Lys Glu Glu Glu Asp Ala Ser Glu Gly 20 25 30 Val Thr Thr Gly Asp Pro Asp Cys Pro Phe Thr Lys Ala Ile Pro Arg 35 40 45 Glu Glu Tyr Ala Asn Lys Tyr Gly Pro Thr Ile Gly Asp Lys Ile Arg 50 55 60 Leu Gly Asp Thr Asp Leu Ile Ala Glu Ile Glu Lys Asp Phe Ala Leu 65 70 75 80 Tyr Gly Asp Glu Ser Val Phe Gly Gly Gly Lys Val Ile 85 90 <210> 26 <211> 36 <212> DNA <213> Aedes aegypti <400> 26 atgtacgatc ctgctccacc cccaccgcca ccttaa 36 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Aedes aegypti <400> 27 Tyr Asp Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro 1 5 10 <210> 28 <211> 6 <212> PRT <213> Neobellieria bullata <400> 28 Asn Pro Thr Asn Leu His 1 5 <210> 29 <211> 45 <212> DNA <213> Oncopeltus fasciatus <400> 29 atggtcgata agccaccgta tttaccgagg ccgagaccgc cgtaa 45 <210> 30 <211> 13 <212> PRT <213> Oncopeltus fasciatus <400> 30 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro 1 5 10 <210> 31 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Oncocin analogue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> wherein Xaa is ornithine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> wherein Xaa is ornithine <400> 31 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Xaa Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Xaa <210> 32 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Oncocin analogue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> wherein r is D-arginine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> wherein r is D-arginine <400> 32 Val Asp Lys Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Arg Arg Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Arg <210> 33 <211> 1863 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <400> 33 atggataaca atccgaacat caatgaatgc attccttata attgtttaag taaccctgaa 60 gtagaagtat taggtggaga aagaatagaa actggttaca ccccaatcga tatttccttg 120 tcgctaacgc aatttctttt gagtgaattt gttcccggtg ctggatttgt gttaggacta 180 gttgatataa tatggggaat ttttggtccc tctcaatggg acgcatttct tgtacaaatt 240 gaacagttaa ttaaccaaag aatagaagaa ttcgctagga accaagccat ttctagatta 300 gaaggactaa gcaatcttta tcaaatttac gcagaatctt ttagagagtg ggaagcagat 360 cctactaatc cagcattaag agaagagacg cgtattcaat tcaatgacat gaacagtgcc 420 cttacaaccg ctattcctct tttggcagtt caaaattatc aagttcctct tttatcagta 480 tatgttcaag ctgcaaattt acatttatca gttttgagag atgtttcagt gtttggacaa 540 aggtggggat ttgatgccgc gactatcaat agtcgttata atgatttaac taggcttatt 600 ggcaactata cagattatgc tgtacgctgg tacaatacgg gattagaacg tgtatgggga 660 ccggattcta gagattgggt aaggtacaat caatttagga gagaattaac gctaactgta 720 ttagatatcg ttgctctgtt cccgaattat gatagtagaa gatatccaat tcgaacagtt 780 tcccaattaa caagagaaat ttatacaaac ccagtattag aaaattttga tggtagtttt 840 cgaggctcgg ctcagggcat agaaagaagt attaggagtc cacatttgat ggatatactt 900 aacagtataa ccatctatac ggatgctcat aggggttatt attattggtc agggcatcaa 960 ataatggctt ctcctgtcgg tttttcgggg ccagaattca cgtttccgct atatggaacc 1020 atgggaaatg cagctccaca acaacgtatt gttgctcaac taggtcaggg cgtgtataga 1080 acattatcct ctacttttta tagaagacct tttaatatag ggataaataa tcaacaacta 1140 tctgttcttg acgggacaga atttgcttat ggaacctcct caaatttgcc atccgctgta 1200 tacagaaaaa gcggaacggt agattcgctg gatgaaatac caccacagaa taacaacgtg 1260 ccacctaggc aaggatttag tcatcgatta agccatgttt caatgtttcg ttcaggctct 1320 agtaatagta gtgtaagtat aataagagct cctatgttct cttggataca tcgtagtgct 1380 gaatttaata atataattgc atcggatagt attactcaaa tccctgcagt gaagggaaac 1440 tttcttttta atggttctgt aatttcagga ccaggattta ctggtgggga cttagttaga 1500 ttaaatagta gtggaaataa cattcagaat agagggtata ttgaagttcc aattcacttc 1560 ccatcgacat ctaccagata tcgagttcgt gtacggtatg cttctgtaac cccgattcac 1620 ctcaacgtta attggggtaa ttcatccatt ttttccaata cagtaccagc tacagctacg 1680 tcattagata atctacaatc aagtgatttt ggttattttg aaagtgccaa tgcttttaca 1740 tcttcattag gtaatatagt aggtgttaga aattttagtg ggactgcagg agtgataata 1800 gacagatttg aatttattcc agttactgca acactcgagg ctgaatataa tctggaaaga 1860 tag 1863 <210> 34 <211> 620 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 34 Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu 1 5 10 15 Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu Thr Gly 20 25 30 Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe Leu Leu Ser 35 40 45 Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu Val Asp Ile Ile 50 55 60 Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile 65 70 75 80 Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala 85 90 95 Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu 100 105 110 Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu 115 120 125 Glu Thr Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala 130 135 140 Ile Pro Leu Leu Ala Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val 145 150 155 160 Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser 165 170 175 Val Phe Gly Gln Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg 180 185 190 Tyr Asn Asp Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp Tyr Ala Val 195 200 205 Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg 210 215 220 Asp Trp Val Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val 225 230 235 240 Leu Asp Ile Val Ala Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Arg Tyr Pro 245 250 255 Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn Pro Val 260 265 270 Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gln Gly Ile Glu 275 280 285 Arg Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu Asn Ser Ile Thr 290 295 300 Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Tyr Tyr Tyr Trp Ser Gly His Gln 305 310 315 320 Ile Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly Pro Glu Phe Thr Phe Pro 325 330 335 Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala Pro Gln Gln Arg Ile Val Ala 340 345 350 Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Thr Phe Tyr Arg 355 360 365 Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu Asp 370 375 380 Gly Thr Glu Phe Ala Tyr Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val 385 390 395 400 Tyr Arg Lys Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln 405 410 415 Asn Asn Asn Val Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His 420 425 430 Val Ser Met Phe Arg Ser Gly Ser Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile Ile 435 440 445 Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Glu Phe Asn Asn 450 455 460 Ile Ile Ala Ser Asp Ser Ile Thr Gln Ile Pro Ala Val Lys Gly Asn 465 470 475 480 Phe Leu Phe Asn Gly Ser Val Ile Ser Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly 485 490 495 Asp Leu Val Arg Leu Asn Ser Ser Gly Asn Asn Ile Gln Asn Arg Gly 500 505 510 Tyr Ile Glu Val Pro Ile His Phe Pro Ser Thr Ser Thr Arg Tyr Arg 515 520 525 Val Arg Val Arg Tyr Ala Ser Val Thr Pro Ile His Leu Asn Val Asn 530 535 540 Trp Gly Asn Ser Ser Ile Phe Ser Asn Thr Val Pro Ala Thr Ala Thr 545 550 555 560 Ser Leu Asp Asn Leu Gln Ser Ser Asp Phe Gly Tyr Phe Glu Ser Ala 565 570 575 Asn Ala Phe Thr Ser Ser Leu Gly Asn Ile Val Gly Val Arg Asn Phe 580 585 590 Ser Gly Thr Ala Gly Val Ile Ile Asp Arg Phe Glu Phe Ile Pro Val 595 600 605 Thr Ala Thr Leu Glu Ala Glu Tyr Asn Leu Glu Arg 610 615 620 <210> 35 <211> 16 <212> PRT <213> Bacillus brevis <400> 35 Ala Val Gly Ala Leu Ala Val Val Val Trp Leu Trp Leu Trp Leu Trp 1 5 10 15 <210> 36 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Magainin 2 <400> 36 Gly Ile Gly Lys Phe Leu His Ser Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe 1 5 10 15 Val Gly Glu Ile Met Asn Ser 20 <210> 37 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> cathelicidin <400> 37 Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu Phe 1 5 10 15 Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg 20 25 30 Thr Glu Ser 35 <210> 38 <211> 20 <212> PRT <213> Pyrrhocoris apterus <400> 38 Val Asp Lys Gly Ser Tyr Leu Pro Arg Pro Thr Pro Pro Arg Pro Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Arg Asn 20 <210> 39 <211> 34 <212> PRT <213> Lactococcus lactis <400> 39 Ile Thr Ser Ile Ser Leu Cys Thr Pro Gly Cys Lys Thr Gly Ala Leu 1 5 10 15 Met Gly Cys Asn Met Lys Thr Ala Thr Cys His Cys Ser Ile His Val 20 25 30 Ser Lys <210> 40 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Ala Cys Tyr Cys Arg Ile Pro Ala Cys Ile Ala Gly Glu Arg Arg Tyr 1 5 10 15 Gly Thr Cys Ile Tyr Gln Gly Arg Leu Trp Ala Phe Cys Cys 20 25 30 <210> 41 <211> 38 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 41 Asn Pro Val Ser Cys Val Arg Asn Lys Gly Ile Cys Val Pro Ile Arg 1 5 10 15 Cys Pro Gly Ser Met Lys Gln Ile Gly Thr Cys Val Gly Arg Ala Val 20 25 30 Lys Cys Cys Arg Lys Lys 35 <210> 42 <211> 40 <212> PRT <213> Pseudoplectania nigrella <400> 42 Gly Phe Gly Cys Asn Gly Pro Trp Asp Glu Asp Asp Met Gln Cys His 1 5 10 15 Asn His Cys Lys Ser Ile Lys Gly Tyr Lys Gly Gly Tyr Cys Ala Lys 20 25 30 Gly Gly Phe Val Cys Lys Cys Tyr 35 40 <210> 43 <211> 10 <212> PRT <213> Paenibacillus polymyxa <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> wherein Xaa is 2,4-diaminobutanoic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(4) <223> wherein Xaa is 2,4-diaminobutanoic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(9) <223> wherein Xaa is 2,4-diaminobutanoic acid <400> 43 Xaa Thr Xaa Xaa Lys Leu Leu Xaa Xaa Thr 1 5 10 <210> 44 <211> 13 <212> PRT <213> Streptomyces roseosporus <400> 44 Trp Asn Asp Thr Gly Lys Asp Ala Asp Gly Ser Glu Tyr 1 5 10 <210> 45 <211> 21 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 45 Val Gly Ile Gly Thr Pro Ile Phe Ser Tyr Gly Gly Gly Ala Gly His 1 5 10 15 Val Pro Glu Tyr Phe 20 <210> 46 <211> 18 <212> PRT <213> Trichoderma permeabilises <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> wherein B is alpha-aminoisobutyric acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> wherein B is alpha-aminoisobutyric acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> wherein B is alpha-aminoisobutyric acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> wherein B is alpha-aminoisobutyric acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> wherein B is alpha-aminoisobutyric acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(16) <223> wherein B is alpha-aminoisobutyric acid <400> 46 Pro Asx Ala Asx Ala Gln Asx Val Asx Gly Leu Asx Pro Val Asx Asx 1 5 10 15 Glu Gln <210> 47 <211> 11 <212> PRT <213> Bacillus brevis <400> 47 Ser Val Lys Leu Phe Pro Val Lys Leu Phe Pro 1 5 10 <210> 48 <211> 35 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 48 Asn Lys Gly Cys Ala Thr Cys Ser Ile Gly Ala Ala Cys Leu Val Asp 1 5 10 15 Gly Pro Ile Pro Asp Phe Glu Ile Ala Gly Ala Thr Gly Leu Phe Gly 20 25 30 Leu Trp Gly 35 <210> 49 <211> 29 <212> PRT <213> Oldenlandia affinis <400> 49 Gly Leu Pro Val Cys Gly Glu Thr Cys Val Gly Gly Thr Cys Asn Thr 1 5 10 15 Pro Gly Cys Thr Cys Ser Trp Pro Val Cys Thr Arg Asn 20 25 <210> 50 <211> 18 <212> PRT <213> Rhesus macaques <400> 50 Gly Phe Cys Arg Cys Leu Cys Arg Arg Gly Val Cys Arg Cys Ile Cys 1 5 10 15 Thr Arg <210> 51 <211> 221 <212> PRT <213> Ficus carica <400> 51 Leu Pro Glu Thr Val Asp Trp Arg Ile Gln Gly Ala Val Asn Pro Ile 1 5 10 15 Arg Asn Gln Gly Arg Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Val Val Val 20 25 30 Val Val Glu Gly Ile Thr Lys Ile Val Thr Asp Glu Leu Pro Ser Leu 35 40 45 Ser Glu Gln Gln Leu Val Asp Cys Ala Thr Ser Tyr Lys Asn Leu Gly 50 55 60 Cys Ser Gly Gly Trp Met Lys Ala Tyr Asp Tyr Ile Ile Lys Asn Gly 65 70 75 80 Gly Ile Thr Ser Gln Ser Asn Tyr Pro Tyr Thr Ala Lys Lys Gly Glu 85 90 95 Cys Asn Lys Asp Leu Ala Ser Gln Ile Val Ala Thr Ile Asp Ser Tyr 100 105 110 Glu His Val Pro Arg Asn Asn Glu Asn Ala Leu Lys Asn Ala Val Ala 115 120 125 Asn Gln Pro Val Ser Val Thr Ile Glu Ala Gly Gly Arg Ala Phe Glu 130 135 140 Leu Tyr Lys Ser Gly Val Phe Val Gly Ser Cys Gly Thr Lys Leu Asp 145 150 155 160 His Ala Val Val Ala Ile Gly Tyr Gly Ser Glu Asn Asp Val Asp Tyr 165 170 175 Trp Leu Val Arg Asn Ser Trp Gly Thr Asn Trp Gly Glu Arg Gly Tyr 180 185 190 Ile Lys Leu Gln Arg Asn Val Ala Glu Pro Thr Gly Lys Cys Gly Ile 195 200 205 Ala Met Gln Ser Thr Tyr Pro Val Lys Lys Thr Ser Ala 210 215 220 <210> 52 <211> 57 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 52 Met Ala Ser Ser Val Leu Ser Ser Ala Ala Val Ala Thr Arg Ser Asn 1 5 10 15 Val Ala Gln Ala Asn Met Val Ala Pro Phe Thr Gly Leu Lys Ser Ala 20 25 30 Ala Ser Phe Pro Val Ser Arg Lys Gln Asn Leu Asp Ile Thr Ser Ile 35 40 45 Ala Ser Asn Gly Gly Arg Val Gln Cys 50 55 <210> 53 <211> 26 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 53 Met Arg Ile Leu Pro Lys Ser Gly Gly Gly Ala Leu Cys Leu Leu Phe 1 5 10 15 Val Phe Ala Leu Cys Ser Val Ala His Ser 20 25 <210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> PTS-2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(7) <223> wherein Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 54 Arg Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His Leu 1 5 <210> 55 <211> 13 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> PTS-2 <400> 55 Met Arg Leu Ser Ile His Ala Glu His Leu Ser Lys Leu 1 5 10 <210> 56 <211> 85 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 56 Met Leu Arg Thr Val Ser Cys Leu Ala Ser Arg Ser Ser Ser Ser Leu 1 5 10 15 Phe Phe Arg Phe Phe Arg Gln Phe Pro Arg Ser Tyr Met Ser Leu Thr 20 25 30 Ser Ser Thr Ala Ala Leu Arg Val Pro Ser Arg Asn Leu Arg Arg Ile 35 40 45 Ser Ser Pro Ser Val Ala Gly Arg Arg Leu Leu Leu Arg Arg Gly Leu 50 55 60 Arg Ile Pro Ser Ala Ala Val Arg Ser Val Asn Gly Gln Phe Ser Arg 65 70 75 80 Leu Ser Val Arg Ala 85 <210> 57 <211> 35 <212> PRT <213> Chlamydomonas reinhardtii <400> 57 Met Ala Leu Val Ala Arg Pro Val Leu Ser Ala Arg Val Ala Ala Ser 1 5 10 15 Arg Pro Arg Val Ala Ala Arg Lys Ala Val Arg Val Ser Ala Lys Tyr 20 25 30 Gly Glu Asn 35 <210> 58 <211> 29 <212> PRT <213> Chlamydomonas reinhardtii <400> 58 Met Gln Ala Leu Ser Ser Arg Val Asn Ile Ala Ala Lys Pro Gln Arg 1 5 10 15 Ala Gln Arg Leu Val Val Arg Ala Glu Glu Val Lys Ala 20 25 <210> 59 <211> 35 <212> PRT <213> Chlamydomonas reinhardtii <400> 59 Met Gln Thr Leu Ala Ser Arg Pro Ser Leu Arg Ala Ser Ala Arg Val 1 5 10 15 Ala Pro Arg Arg Ala Pro Arg Val Ala Val Val Thr Lys Ala Ala Leu 20 25 30 Asp Pro Gln 35 <210> 60 <211> 31 <212> PRT <213> Chlamydomonas reinhardtii <400> 60 Met Gln Ala Leu Ala Thr Arg Pro Ser Ala Ile Arg Pro Thr Lys Ala 1 5 10 15 Ala Arg Arg Ser Ser Val Val Val Arg Ala Asp Gly Phe Ile Gly 20 25 30 <210> 61 <211> 51 <212> PRT <213> Chlamydomonas reinhardtii <400> 61 Met Ala Phe Ala Leu Ala Ser Arg Lys Ala Leu Gln Val Thr Cys Lys 1 5 10 15 Ala Thr Gly Lys Lys Thr Ala Ala Lys Ala Ala Ala Pro Lys Ser Ser 20 25 30 Gly Val Glu Phe Tyr Gly Pro Asn Arg Ala Lys Trp Leu Gly Pro Tyr 35 40 45 Ser Glu Asn 50 <210> 62 <211> 50 <212> PRT <213> Chlamydomonas reinhardtii <400> 62 Met Ala Ala Val Ile Ala Lys Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Ala Arg 1 5 10 15 Pro Ala Arg Ser Ser Val Arg Pro Met Ala Ala Leu Lys Pro Ala Val 20 25 30 Lys Ala Ala Pro Val Ala Ala Pro Ala Gln Ala Asn Gln Met Met Val 35 40 45 Trp Thr 50 <210> 63 <211> 40 <212> PRT <213> Chlamydomonas reinhardtii <400> 63 Met Ala Ala Met Leu Ala Ser Lys Gln Gly Ala Phe Met Gly Arg Ser 1 5 10 15 Ser Phe Ala Pro Ala Pro Lys Gly Val Ala Ser Arg Gly Ser Leu Gln 20 25 30 Val Val Ala Gly Leu Lys Glu Val 35 40 <210> 64 <211> 4 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 64 Cys Val Val Gln 1 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> PTS-2 <400> 65 Arg Leu Ala Val Ala Val Ala His Leu 1 5

Claims (118)

  1. 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 식물호르몬 생합성 효소는 적어도 1종의 시토키닌 생합성 효소 및/또는 옥신 생합성 효소인 공생체 형성 접종물.
  2. 제1항에 있어서, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드가 세포에 포함되고, 임의로 세포가 식물 세포 또는 박테리아 세포인 공생체 형성 접종물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 식물호르몬 생합성 효소가 박테리아 종 및/또는 식물 종으로부터의 것인 공생체 형성 접종물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 식물호르몬 생합성 효소가 인돌-3-아세트아미드 히드롤라제 (iaaH) (E.C. 번호: EC 3.5.1.4), 아미다제 1 (EC 3.5.1.4), 트립토판 2-모노옥시게나제 (IaaM) (EC 1.13.12.3), 인돌-3-락테이트 신타제 (EC 1.1.1.110), L-트립토판--피루베이트 아미노트랜스퍼라제 1 (EC 2.6.1.99), 트립토판 아미노트랜스퍼라제-관련된 단백질 1 (EC 2.6.1.27), 인돌-3-아세트알데히드 옥시다제 (EC 1.2.3.7), 트립토판 데카르복실라제 1/트립토판 데카르복실라제 2 (EC4.1.1.105), 이소펜테닐 트랜스퍼라제 (Ipt) 및/또는 Tzs (EC 2.5.1.27)인 공생체 형성 접종물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 식물호르몬 생합성 효소가 인돌-3-아세트아미드 히드롤라제 (iaaH), 트립토판 2-모노옥시게나제 (IaaM), 및/또는 이소펜테닐 트랜스퍼라제 (Ipt)인 공생체 형성 접종물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 식물호르몬 생합성 효소가 인돌-3-락테이트 신타제인 공생체 형성 접종물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스트 폴리펩티드 (예를 들어, 가소성 폴리펩티드)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 임의로 플라스트 폴리펩티드가 6b, rolB, rolC, 및/또는 orf13인 공생체 형성 접종물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드가 단일 핵산 구축물에 또는 2개 이상의 핵산 구축물 (예를 들어, 1개 이상의 발현 카세트)에 포함되는 것인 공생체 형성 접종물.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 플라스트 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 핵산 구축물에 포함되고, 임의로 플라스트 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 관심의 폴리뉴클레오티드와 동일한 또는 별개의 핵산 구축물 (예를 들어, 발현 카세트)에 있는 것인 공생체 형성 접종물.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 1개 이상의 핵산 구축물이 1개 이상의 벡터에 포함되는 것인 공생체 형성 접종물.
  11. 제10항에 있어서, 1개 이상의 벡터가 플라스미드, T-DNA, 박테리아 인공 염색체, 바이러스 벡터, 또는 이원성-박테리아 인공 염색체인 공생체 형성 접종물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 관심의 폴리뉴클레오티드가 생체분자, 생물활성 분자 및/또는 생물활성 분자의 생합성에 관여하는 폴리펩티드를 코딩하는 것인 공생체 형성 접종물.
  13. 제12항에 있어서, 관심의 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가된 비생물적 스트레스 저항성 (예를 들어, 고염 내성, 고열 내성, 중금속 내성, 추위 내성, 가뭄 내성, 과잉수 내성, UV 방사선에 대한 내성), 병원체 (예를 들어, 바이러스, 진균, 박테리아) 또는 해충 (예를 들어, 곤충, 선충)에 대한 증가된 저항성 또는 내성, 또는 제초제에 대한 증가된 내성을 부여하는 것인 공생체 형성 접종물.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 생물활성 분자가 생물자극제, 생물살진균제, 생물제초제, 살곤충 단백질/펩티드 (예를 들어, 생물살곤충제; 예를 들어, 자부레톡스 (펩티드 JBTX; 작두콩 (카나발리아 엔시포르미스(Canavalia ensiformis) 종자)으로부터 유래된 생물살곤충제); 거미 독으로부터의 (예를 들어, 하드로니케 베르수타(Hadronyche versuta)로부터의) 살곤충 펩티드; 트립신 조정 오스타틱 인자 (TMOF); 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis) 독소 (δ 내독소, 예를 들어, Cry 독소, Cyt 독소); 식물성 살곤충 단백질 (Vip)), 영양분 (예를 들어, 질소, 예를 들어, 레게모글로빈, 니트로게나제), 식물 성장 조절제 (옥신, 시토키닌, 지베렐린, 에틸렌; 성장 억제제/지연제), 식물 지질, 식물 지방산, 식물 오일, RNA (예를 들어, siRNA, dsRNA, miRNA, shRNA), 식물항체, 스틸렛 쉬스 억제 단백질 (예를 들어, 피신, 브로멜라인), 리보자임, 박테리오신, 항미생물 펩티드 (예를 들어, 온코신), 압타머, 뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성화인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 및/또는 조작된 메가뉴클레아제인 공생체 형성 접종물.
    [청구항 14]
    제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 관심의 폴리뉴클레오티드가 표적화 서열에 작동가능하게 연결된 폴리펩티드를 코딩하고, 임의로 표적화 서열이 단백질을 막, 세포하 위치 또는 세포외 위치에 위치시키는 것인 공생체 형성 접종물.
  15. 제14항에 있어서, 표적화 서열이 막 표적화 서열, 세포질 세망 표적화 서열, 미토콘드리아 표적화 서열, 엽록체 표적화 서열, 핵 표적화 서열, 공포 표적화 서열, 퍼옥시좀 표적화 서열, 리소좀 표적화 서열, 또는 식물 바이러스 이동 단백질인 공생체 형성 접종물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, iaaH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, IaaM을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 이소펜테닐 트랜스퍼라제 (Ipt)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 인돌-3-락테이트 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드) 및/또는 플라스트 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 핵 표적화 (핵 국재화) 서열에 작동가능하게 연결된 것인 공생체 형성 접종물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드가 각각 단일 프로모터에 또는 적어도 2개의 별개의 프로모터에 임의의 조합으로 작동가능하게 연결된 것인 공생체 형성 접종물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 iaaH, IaaM 및 Ipt를 코딩하는 경우, iaaH, IaaM 및 Ipt를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)가 단일 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 관심의 폴리뉴클레오티드가 단일 프로모터에 또는 별개의 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 공생체 형성 접종물.
  19. 제7항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스트 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 임의로 플라스트 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 관심의 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것과 동일한 프로모터 또는 별개의 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 공생체 형성 접종물.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 프로모터, 별개의 프로모터, 및/또는 2개 이상의 별개의 프로모터가 각각 임의의 조합으로 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터인 공생체 형성 접종물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 관심의 폴리뉴클레오티드가 공생체 형성 접종물에서 발현되는 것인 공생체 형성 접종물.
  22. 제2항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 세포가 유형 IV 분비 시스템 (T4SS, 예를 들어, T4ASS, (예를 들어, VirB/D4 시스템), T4BSS) 또는 유형 III 분비 시스템 (T3SS)을 포함하는 것인 공생체 형성 접종물.
  23. 제2항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 세포가 아그로박테리움(Agrobacterium) 종 (예를 들어, 에이. 투메파시엔스(A. tumefaciens) (예를 들어, 생물변이형 1), 에이. 리조게네스(A. rhizogenes) (예를 들어, 생물변이형 2), 에이. 비티스(A. vitis) (예를 들어, 생물변이형 3), 에이. 파브룸(A. fabrum) (예를 들어, 균주 C58), 리조비움(Rhizobium) 종, 메소리조비움(Mesorhizobium) 종, 시노리조비움(Sinorhizobium) 종, 브라디리조비움(Bradyrhizobium) 종, 슈도모나스(Pseudomonas) 종 (예를 들어, 피. 사바스타노이(P. savastanoi) 병원체변종 사바스타노이(Savastanoi)), 필로박테리움(Phyllobacterium) 종, 오크로박트룸(Ochrobactrum) 종, 아조박터(Azobacter) 종, 클로스테리움(Closterium) 종, 클레브시엘라(Klebsiella) 종, 로도스피릴룸(Rhodospirillum) 종, 또는 크산토모나스(Xanthomonas) 종의 박테리아 속으로부터의 것인 공생체 형성 접종물.
  24. 제2항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 세포에 포함되는 공생체 형성 접종물이 세포 배양물, 식물 캘러스, 캘러스 배양물, 및/또는 현탁 배양물의 형태로 2개 이상의 세포를 포함하는 것인 공생체 형성 접종물.
  25. 제2항 내지 제21항 및 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 세포가 대형조류, 피자식물, 나자식물 또는 양치식물로부터의 것인 공생체 형성 접종물.
  26. 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함하고 발현하는 식물 세포를 포함하는 공생체이며, 여기서 식물호르몬 생합성 효소가 적어도 1종의 시토키닌 생합성 효소 및/또는 적어도 1종의 옥신 생합성 효소이고, 공생체의 식물 세포가 자율적으로 분열하는 것인 공생체.
  27. 제26항에 있어서, 식물 세포가 1개 초과의 식물 세포를 포함하고, 식물 또는 그의 부분 상으로 이식되는 경우 비분화된 다세포 구조를 형성하는 것인 공생체.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 식물호르몬 생합성 효소가 박테리아 종 및/또는 식물 종으로부터의 것인 공생체.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 식물호르몬 생합성 효소가 인돌-3-아세트아미드 히드롤라제 (iaaH) (E.C. 번호: EC 3.5.1.4), 아미다제 1 (EC 3.5.1.4), 트립토판 2-모노옥시게나제 (IaaM) (EC 1.13.12.3), 인돌-3-락테이트 신타제 (EC 1.1.1.110), L-트립토판--피루베이트 아미노트랜스퍼라제 1 (EC 2.6.1.99), 트립토판 아미노트랜스퍼라제-관련된 단백질 1 (EC 2.6.1.27), 인돌-3-아세트알데히드 옥시다제 (EC 1.2.3.7), 트립토판 데카르복실라제 1/트립토판 데카르복실라제 2 (EC4.1.1.105), 이소펜테닐 트랜스퍼라제 (Ipt) 및/또는 Tzs (EC 2.5.1.27)인 공생체.
  30. 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 식물호르몬 생합성 효소가 인돌-3-아세트아미드 히드롤라제 (iaaH), 트립토판 2-모노옥시게나제 (IaaM), 및/또는 이소펜테닐 트랜스퍼라제 (Ipt)를 포함하고, 임의로 식물호르몬 생합성 효소가 인돌-3-락테이트 신타제를 포함하는 것인 공생체.
  31. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스트 폴리펩티드 (예를 들어, 가소성 폴리펩티드)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 임의로 플라스트 폴리펩티드가 6b, rolB, rolC, 및/또는 orf13인 공생체.
  32. 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드가 단일 핵산 구축물에 또는 2개 이상의 핵산 구축물 (예를 들어, 1개 이상의 발현 카세트)에 포함되는 것인 공생체.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 플라스트 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 핵산 구축물에 포함되고, 임의로 플라스트 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 관심의 폴리뉴클레오티드와 동일한 또는 별개의 핵산 구축물에 있는 것인 공생체.
  34. 제26항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 관심의 폴리뉴클레오티드가 생체분자, 생물활성 분자 및/또는 생물활성 분자의 생합성에 관여하는 폴리펩티드를 코딩하는 것인 공생체.
  35. 제34항에 있어서, 관심의 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가된 비생물적 스트레스 저항성 (예를 들어, 고염 내성, 고열 내성, 중금속 내성, 추위 내성, 가뭄 내성, 과잉수 내성, UV 방사선에 대한 내성), 병원체 (예를 들어, 바이러스, 진균, 박테리아) 또는 해충 (예를 들어, 곤충, 선충)에 대한 증가된 저항성 또는 내성, 또는 제초제에 대한 증가된 내성을 부여하는 것인 공생체.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 생물활성 분자가 제약, 생물자극제, 생물살진균제, 생물제초제, 살곤충 단백질/펩티드 (예를 들어, 생물살곤충제, 예를 들어, 자부레톡스 (펩티드 JBTX), 거미 독으로부터의 (예를 들어, 하드로니케 베르수타로부터의) 살곤충 펩티드; 트립신 조정 오스타틱 인자 (TMOF), 바실루스 투린기엔시스 독소 (δ 내독소, 예를 들어, Cry 독소, Cyt 독소), 식물성 살곤충 단백질 (Vip)), 영양분 (예를 들어, 질소, 예를 들어, 레게모글로빈, 니트로게나제), 식물 성장 조절제 (옥신, 시토키닌, 지베렐린, 에틸렌; 성장 억제제/지연제), RNA (예를 들어, siRNA, dsRNA, miRNA, shRNA), 식물항체, 스틸렛 쉬스 억제 단백질 (예를 들어, 피신, 브로멜라인), 리보자임, 박테리오신, 식물 지질, 식물 지방산, 식물 오일, 항미생물 펩티드 (예를 들어, 온코신), 압타머, 뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성화인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 및/또는 조작된 메가뉴클레아제인 공생체.
  37. 제26항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 관심의 폴리뉴클레오티드가 표적화 서열에 작동가능하게 연결된 폴리펩티드를 코딩하고, 임의로 표적화 서열이 폴리펩티드를 막, 세포하 위치 또는 세포외 위치에 위치시키는 것인 공생체.
  38. 제37항에 있어서, 표적화 서열이 막 표적화 서열, 세포질 세망 표적화 서열, 미토콘드리아 표적화 서열, 엽록체 표적화 서열 또는 식물 바이러스 이동 단백질인 공생체.
  39. 제26항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, iaaH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, IaaM을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이소펜테닐 트랜스퍼라제 (Ipt)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 인돌-3-락테이트 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드) 및/또는 플라스트 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 핵 표적화 서열에 작동가능하게 연결된 것인 공생체.
  40. 제26항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드가 단일 프로모터에 또는 적어도 2개의 별개의 프로모터에 임의의 조합으로 작동가능하게 연결된 것인 공생체.
  41. 제26항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 iaaH, IaaM, 및 Ipt를 코딩하는 경우, iaaH, IaaM, 및 Ipt를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)가 단일 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 관심의 폴리뉴클레오티드가 동일한 프로모터 또는 별개의 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 공생체.
  42. 제26항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스트 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 임의로 플라스트 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 관심의 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것과 동일한 프로모터 또는 별개의 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 공생체.
    [청구항 42]
    제26항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 세포가 대형조류, 피자식물, 나자식물 또는 양치식물로부터의 것인 공생체.
  43. 제26항 내지 제42항 중 어느 한 항의 적어도 1종의 공생체를 포함하는 숙주 식물이며, 여기서 적어도 1종의 공생체는 숙주 식물 상의 적어도 1개의 부위 상에 위치하는 것인 숙주 식물.
  44. 제43항에 있어서, 숙주 식물 상의 적어도 1개의 부위가 외식편, 배, 잎, 순, 줄기, 가지, 인, 이삭, 대, 껍질, 자루, 표피 조직, 정단 분열 조직, 꽃 조직 (예를 들어, 화분, 암술, 배주, 꽃밥, 수술, 화관, 꽃받침, 꽃잎, 화탁, 화사, 암술대, 암술머리 등), 과실, 종자, 꼬투리, 피막, 자엽, 배축, 엽병, 괴경, 구경, 뿌리, 근단, 공생체, 마디, 식물 푸드 바디, 도마티아, 꽃밖 꿀샘, 뿌리혹, 식물 신생물 또는 벌레혹 상에 있는 것인 숙주 식물.
  45. 제43항 또는 제44항에 있어서, 관심의 폴리뉴클레오티드가 공생체에서 발현되고, 관심의 폴리뉴클레오티드의 발현 생성물 및/또는 관심의 폴리뉴클레오티드의 발현 생성물을 사용하여 제조된 생성물이 숙주 식물 내로 수송되는 것인 숙주 식물.
  46. 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 식물이 임의의 연령 또는 크기 (예를 들어, 묘목, 어린 식물, 또는 성숙한 식물)의 야생형 식물로부터의 것인 숙주 식물.
  47. 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 식물이 대형조류, 피자식물 식물, 나자식물 식물 또는 양치식물 식물인 숙주 식물.
  48. 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하거나, 또는 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 트랜스제닉 세포 내로 도입하고, 여기서 식물호르몬 생합성 효소는 적어도 1종의 시토키닌 생합성 효소 및/또는 옥신 생합성 효소이고, 그에 의해 공생체 형성 접종물을 생산하는 단계를 포함하며, 임의로 세포가 식물 세포 또는 박테리아 세포인, 공생체 형성 접종물을 생산하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 세포를 배양하여 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포의 집단을 생산하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  50. (a) (i) 식물 (또는 그의 부분 (예를 들어, 외식편)) 상의 적어도 1개의 부위 내로/상으로 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드 서열을 도입하거나, 이를 포함하는 식물 세포를 이식하거나, 또는 이를 포함하는 박테리아 세포를 식물 (또는 그의 부분) 상의 적어도 1개의 부위 상으로 접종하거나, 또는
    (ii) 식물 (또는 그의 부분) 상의 적어도 1개의 부위 내로/상으로 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하거나, 이를 포함하는 식물 세포를 이식하거나, 또는 이를 포함하는 박테리아 세포를 식물 (또는 그의 부분) 상의 적어도 1개의 부위 상으로 접종하고, 여기서 (ii)의 식물 (또는 그의 부분)은 관심의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고,
    여기서 식물호르몬 생합성 효소는 적어도 1종의 시토키닌 생합성 효소 및/또는 옥신 생합성 효소이고, 그에 의해 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물 (또는 그의 부분) 상의 공생체를 생산하는 단계; 및
    (b) 식물 상의 공생체로부터 1개 이상의 세포를 선택하여, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 1개 이상의 세포를 제공하고, 그에 의해 공생체 형성 접종물을 생산하는 단계
    를 포함하는, 공생체 형성 접종물을 생산하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, (c) (b)로부터의 1개 이상의 세포를 배양하여 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물 세포의 집단 (예를 들어, 캘러스 배양물 및/또는 현탁 배양물)을 생산하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, 식물호르몬 생합성 효소가 박테리아 종 및/또는 식물 종으로부터의 것인 방법.
  53. 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 식물호르몬 생합성 효소가 인돌-3-아세트아미드 히드롤라제 (iaaH) (E.C. 번호: EC 3.5.1.4), 아미다제 1 (EC 3.5.1.4), 트립토판 2-모노옥시게나제 (IaaM) (EC 1.13.12.3), 인돌-3-락테이트 신타제 (EC 1.1.1.110), L-트립토판--피루베이트 아미노트랜스퍼라제 1 (EC 2.6.1.99), 트립토판 아미노트랜스퍼라제-관련된 단백질 1 (EC 2.6.1.27), 인돌-3-아세트알데히드 옥시다제 (EC 1.2.3.7), 트립토판 데카르복실라제 1/트립토판 데카르복실라제 2 (EC4.1.1.105), 이소펜테닐 트랜스퍼라제 (Ipt) 및/또는 Tzs (EC 2.5.1.27)인 방법.
  54. 제50항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 식물호르몬 생합성 효소가 인돌-3-아세트아미드 히드롤라제 (iaaH), 트립토판 2-모노옥시게나제 (IaaM), 및/또는 이소펜테닐 트랜스퍼라제 (Ipt)를 포함하고/거나, 임의로 인돌-3-락테이트 신타제를 포함하는 것인 방법.
  55. 제50항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 상의 적어도 1개의 부위가 식물의 지상부 및/또는 식물의 지하부 상에 있는 것인 방법.
  56. 제50항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스트 폴리펩티드 (예를 들어, 가소성 폴리펩티드)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포 또는 식물 상의 적어도 1개의 부위 내로 도입하는 단계를 추가로 포함하고, 임의로 플라스트 폴리펩티드가 6b, rolB, rolC, 및/또는 orf13인 방법.
  57. 제50항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드가 단일 핵산 구축물에서 또는 2개 이상의 핵산 구축물 (예를 들어, 1개 이상의 발현 카세트)에서 별개로 도입되는 것인 방법.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 플라스트 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 핵산 구축물에 포함되고, 임의로 플라스트 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 관심의 폴리뉴클레오티드와 동일한 또는 별개의 핵산 구축물에서 도입되는 것인 방법.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, 2개 이상의 핵산 구축물이 1개 이상의 벡터에 포함되고, 임의로 벡터가 플라스미드, T-DNA, 박테리아 인공 염색체, 바이러스 벡터, 또는 이원성-박테리아 인공 염색체인 방법.
  60. 제50항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 관심의 폴리뉴클레오티드가 생체분자, 생물활성 분자 및/또는 생물활성 분자의 생합성에 관여하는 폴리펩티드를 코딩하는 것인 방법.
  61. 제60항에 있어서, 관심의 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가된 비생물적 스트레스 저항성 (예를 들어, 고염 내성, 고열 내성, 중금속 내성, 추위 내성, 가뭄 내성, 과잉수 내성, UV 방사선에 대한 내성), 병원체 (예를 들어, 바이러스, 진균, 박테리아) 또는 해충 (예를 들어, 곤충, 선충)에 대한 증가된 저항성 또는 내성, 및/또는 제초제에 대한 증가된 내성을 부여하는 것인 방법.
  62. 제60항 또는 제61항에 있어서, 생물활성 분자가 생물자극제, 생물살진균제, 생물제초제, 살곤충 단백질/펩티드 (예를 들어, 생물살곤충제; 예를 들어, 자부레톡스 (펩티드 JBTX; 작두콩 (카나발리아 엔시포르미스 종자)으로부터 유래된 생물살곤충제); 거미 독으로부터의 (예를 들어, 하드로니케 베르수타로부터의) 살곤충 펩티드; 트립신 조정 오스타틱 인자 (TMOF); 바실루스 투린기엔시스 독소 (δ 내독소, 예를 들어, Cry 독소, Cyt 독소); 식물성 살곤충 단백질 (Vip)), 영양분 (예를 들어, 질소, 예를 들어, 레게모글로빈, 니트로게나제), 식물 성장 조절제 (옥신, 시토키닌, 지베렐린, 에틸렌; 성장 억제제/지연제), RNA (예를 들어, siRNA, dsRNA, miRNA, shRNA), 식물항체, 스틸렛 쉬스 억제 단백질 (예를 들어, 피신, 브로멜라인), 리보자임, 박테리오신, 항미생물 펩티드 (예를 들어, 온코신), 식물 지질, 식물 지방산, 식물 오일, 압타머, 뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성화인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 및/또는 조작된 메가뉴클레아제인 방법.
  63. 제50항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 관심의 폴리뉴클레오티드가 표적화 서열에 작동가능하게 연결된 폴리펩티드를 코딩하고, 임의로 표적화 서열이 단백질을 막, 세포하 위치 또는 세포외 위치에 위치시키고, 임의로 표적화 서열이 막 표적화 서열, 세포질 세망 표적화 서열, 미토콘드리아 표적화 서열, 엽록체 표적화 서열 또는 식물 바이러스 이동 단백질인 방법.
  64. 제50항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 플라스트 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 핵 표적화 서열에 작동가능하게 연결된 것인 방법.
  65. 제50항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드가 각각 단일 프로모터에 또는 적어도 2개의 별개의 프로모터에 임의의 조합으로 작동가능하게 연결된 것인 방법.
  66. 제50항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 iaaH, IaaM, 및 Ipt를 코딩하는 경우, iaaH, IaaM, 및 Ipt를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)가 단일 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 관심의 폴리뉴클레오티드가 단일 프로모터에 또는 별개의 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 방법.
  67. 제50항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 iaaH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, IaaM을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 Ipt를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 경우, iaaH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, IaaM을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 Ipt를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 각각 적어도 2개의 별개의 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 관심의 폴리뉴클레오티드가 적어도 2개의 별개의 프로모터와 별개의 프로모터에 작동가능하게 연결되거나 또는 적어도 2개의 별개의 프로모터 중 적어도 하나에 연결된 것인 방법.
  68. 제56항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스트 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 임의로 플라스트 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 관심의 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것과 동일한 프로모터 또는 별개의 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 방법.
  69. 제65항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터, 단일 프로모터 및/또는 2개 이상의 별개의 프로모터가 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터인 방법.
  70. 제48항 내지 제54항 및 제56항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 세포가 유형 IV 분비 시스템 (T4SS, 예를 들어, T4ASS, (예를 들어, VirB/D4 시스템), T4BSS) 또는 유형 III 분비 시스템 (T3SS)을 포함하는 것인 방법.
  71. 제48항 내지 제54항 및 제56항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 세포가 아그로박테리움 종 (예를 들어, 에이. 투메파시엔스 (예를 들어, 생물변이형 1), 에이. 리조게네스 (예를 들어, 생물변이형 2), 에이. 비티스 (예를 들어, 생물변이형 3), 에이. 파브룸 (예를 들어, 균주 C58), 리조비움 종, 메소리조비움 종, 시노리조비움 종, 브라디리조비움 종, 슈도모나스 종 (예를 들어, 피. 사바스타노이 병원체변종 사바스타노이), 필로박테리움 종, 오크로박트룸 종, 아조박터 종, 클로스테리움 종, 클레브시엘라 종, 로도스피릴룸 종, 또는 크산토모나스 종의 박테리아 속으로부터의 것인 방법.
  72. 제50항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 식물, 식물 부분 또는 식물 세포가 임의의 연령 또는 크기 (예를 들어, 묘목, 어린 식물, 또는 성숙한 식물)의 야생형 식물 또는 트랜스제닉 식물로부터의 것인 방법.
  73. 제50항 내지 제69항 및 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 식물, 식물 부분 또는 식물 세포가 대형조류, 피자식물 식물, 나자식물 식물 또는 양치식물 식물로부터의 것인 방법.
  74. 제50항 내지 제69항, 제72항 및 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 세포가 식물 세포 배양물 (캘러스 배양물 또는 현탁 배양물), 원형질체, 묘목, 외식편, 배, 잎, 순, 줄기, 가지, 인, 이삭, 대, 껍질, 자루, 표피 조직, 정단 분열 조직, 꽃 조직 (예를 들어, 화분, 암술, 배주, 꽃밥, 수술, 화관, 꽃받침, 꽃잎, 화탁, 화사, 암술대, 암술머리 등), 과실, 종자, 꼬투리, 피막, 자엽, 배축, 엽병, 괴경, 구경, 뿌리, 근단, 공생체, 마디, 식물 푸드 바디, 도마티아, 꽃밖 꿀샘, 뿌리혹, 벌레혹 또는 식물 신생물로부터의 것인 방법.
  75. 제50항 내지 제69항 및 제72항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 식물 상의 적어도 1개의 부위가 외식편, 배, 잎, 순, 줄기, 가지, 인, 이삭, 대, 껍질, 자루, 표피 조직, 정단 분열 조직, 꽃 조직 (예를 들어, 화분, 암술, 배주, 꽃밥, 수술, 화관, 꽃받침, 꽃잎, 화탁, 화사, 암술대, 암술머리 등), 과실, 종자, 꼬투리, 피막, 자엽, 배축, 엽병, 괴경, 구경, 뿌리, 근단, 공생체, 마디, 식물 푸드 바디, 도마티아, 꽃밖 꿀샘, 뿌리혹, 식물 신생물 또는 벌레혹인 방법.
  76. 제50항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 도입이 박테리아 매개된 형질전환, 아르고인필트레이션, 바이러스-매개된 형질전환, 입자 포격 (바이오리스틱스), 전기천공, 미세주사, 리포펙션 (리포솜 매개된 형질전환), 초음파처리, 규소 섬유 매개된 형질전환, 화학적으로 자극된 DNA 흡수 (예를 들어, 폴리펙션; 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 매개된 형질전환), 및/또는 레이저 마이크로빔 (UV) 유도된 형질전환을 통한 것인 방법.
  77. 제50항 내지 제69항 및 제72항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 (ii) 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 적어도 1개의 식물 세포에 포함되고, 적어도 1개의 식물 세포가 식물 상의 적어도 1개의 부위 상으로 이식되는 것인 방법.
  78. 제77항에 있어서, 식물이 식물 상의 적어도 1개의 부위에의 적어도 1개의 식물 세포의 이식 전에 또는 동안에 적어도 1개의 부위에서 상처입은 것인 방법.
  79. 제76항에 있어서, 도입이 박테리아 매개된 형질전환을 통한 것이고, 식물 세포 또는 식물 (또는 그의 부분, 예를 들어, 외식편)을 적어도 1종의 박테리아 종 또는 균주의 세포와 공동-배양하는 것을 포함하고, 여기서 박테리아 세포는 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 관심의 폴리뉴클레오티드, 및/또는 적어도 1종의 플라스트 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드 중 1개 이상을 포함하는 것인 방법.
  80. 제79항에 있어서, 식물 (또는 그의 부분; 예를 들어, 외식편)이 적어도 1종의 박테리아 균주의 세포와의 공동-배양 전에 또는 동안에 적어도 1개의 부위에서 상처입은 것인 방법.
  81. 제79항 또는 제80항에 있어서, 적어도 1종의 박테리아 종 또는 균주의 세포가 적어도 2종의 박테리아 종 또는 균주의 세포를 포함하고, 적어도 1종의 식물호르몬 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 적어도 1종의 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 박테리아 균주와 별개의 박테리아 균주에 포함되는 것 (예를 들어, 이중 박테리아 형질전환)인 방법.
  82. 제79항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1종의 박테리아 균주 또는 종 및/또는 적어도 2종의 박테리아 균주 또는 종이 유형 IV 분비 시스템 (T4SS, 예를 들어, T4ASS, (예를 들어, VirB/D4 시스템), T4BSS) 또는 유형 III 분비 시스템 (T3SS)을 포함하는 박테리아 세포인 방법.
  83. 제82항에 있어서, 박테리아 세포가 아그로박테리움 종 세포 (예를 들어, 에이. 투메파시엔스 (예를 들어, 생물변이형 1), 에이. 리조게네스 (예를 들어, 생물변이형 2), 에이. 비티스 (예를 들어, 생물변이형 3), 에이. 파브룸 (예를 들어, 균주 C58), 리조비움 종 세포, 메소리조비움 종 세포, 시노리조비움 종 세포, 브라디리조비움 종 세포, 슈도모나스 종 세포 (예를 들어, 피. 사바스타노이 병원체변종 사바스타노이), 필로박테리움 종 세포, 오크로박트룸 종 세포, 아조박터 종 세포, 클로스테리움 종 세포, 클레브시엘라 종 세포, 로도스피릴룸 종 세포, 또는 크산토모나스 종 세포인 방법.
  84. 제48항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 공생체 형성 접종물의 적어도 1개의 세포에서 적어도 1종의 핵산을 편집하여 적어도 1종의 편집된 핵산을 생산하는 단계를 추가로 포함하고, 임의로 편집이 유전자 편집 뉴클레아제로 수행되는 것인 방법.
  85. 제84항에 있어서, 적어도 1종의 편집된 핵산이 변형된 발현 (예를 들어, 그렇게 변형되지 않은 동일한 핵산과 비교하여 증가된 또는 감소된 발현)을 갖는 것인 방법.
  86. 제48항 내지 제85항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 공생체 형성 접종물.
  87. 제86항에 있어서, 접종물이 박테리아 세포, 박테리아 배양물, 식물 세포, 또는 식물 세포 배양물 (예를 들어, 캘러스 또는 세포 현탁액)을 포함하는 것인 공생체 형성 접종물.
  88. 식물호르몬 생합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 제86항 또는 제87항의 공생체 형성 접종물로부터의 세포 또는 원형질체.
  89. 제86항 또는 제87항의 공생체 형성 접종물 또는 제88항의 세포, 또는 제26항 내지 제42항 중 어느 한 항의 공생체를 숙주 식물 상의 적어도 1개의 부위에 이식하는 단계; 및
    공생체 형성 접종물 또는 공생체를 숙주 식물 상의 적어도 1개의 부위에서 배양하여 적어도 1개의 부위에서 숙주 식물 상의 공생체를 형성하고, 여기서 관심의 폴리뉴클레오티드는 숙주 식물 상의 공생체에서 발현되고, 관심의 폴리뉴클레오티드의 발현 생성물 및/또는 관심의 폴리뉴클레오티드의 발현 생성물을 사용하여 제조된 생성물은 숙주 식물 내로 수송되고, 그에 의해 변형된 특징을 갖는 숙주 식물을 생산하는 단계
    를 포함하는, 식물 게놈을 변형시키지 않으면서 숙주 식물 특징을 변형시키는 방법.
  90. 제89항에 있어서, 관심의 폴리뉴클레오티드가 생체분자, 생물활성 분자 및/또는 생물활성 분자의 생합성에 관여하는 폴리펩티드를 코딩하는 것인 방법.
  91. 제90항에 있어서, 관심의 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가된 비생물적 스트레스 저항성 (예를 들어, 고염 내성, 고열 내성, 중금속 내성, 추위 내성, 가뭄 내성, 과잉수 내성, UV 방사선에 대한 내성), 병원체 (예를 들어, 바이러스, 진균, 박테리아) 또는 해충 (예를 들어, 곤충, 선충)에 대한 증가된 저항성 또는 내성, 또는 제초제에 대한 증가된 내성을 부여하는 것인 방법.
  92. 제90항 또는 제91항에 있어서, 생물활성 분자가 제약 (예를 들어, 치료 단백질, 치료 폴리뉴클레오티드, 치료 화학물질; 예를 들어, 백신, 항체, 재조합 항체, 항체 단편, 융합 단백질, 항체 융합 단백질, 인간 혈청 알부민, 위 리파제, 인슐린, 글루코세레브로시다제, 성장 인자, 시토카인, B형 간염 표면 항원 (HBsAg), Apo-A1, 알파-갈락토시다제 (PRX-102), 알파-갈락토시다제 (PRX-102), 아세틸콜린에스테라제 (PRX-105), 항종양 괴사 인자 (Pr-항-TNF), IgG, 인터페론-알파, 플라스민, 락토페린, 리소자임, 및 콜라겐), 생물자극제, 생물살진균제, 생물제초제, 살곤충 단백질/펩티드 (예를 들어, 생물살곤충제; 예를 들어, 자부레톡스 (펩티드 JBTX; 작두콩 (카나발리아 엔시포르미스 종자)으로부터 유래된 생물살곤충제, 거미 독으로부터의 (예를 들어, 하드로니케 베르수타로부터의) 살곤충 펩티드; 트립신 조정 오스타틱 인자 (TMOF), 바실루스 투린기엔시스 독소 (δ 내독소, 예를 들어, Cry 독소, Cyt 독소); 식물성 살곤충 단백질 (Vip), 영양분 (예를 들어, 질소, 예를 들어, 레게모글로빈, 니트로게나제), 식물 성장 조절제 (옥신, 시토키닌, 지베렐린, 에틸렌; 성장 억제제/지연제), RNA (예를 들어, siRNA, dsRNA, miRNA, shRNA), 식물항체, 식물 지질, 식물 지방산, 식물 오일, 스틸렛 쉬스 억제 단백질 (예를 들어, 피신, 브로멜라인), 리보자임, 박테리오신, 항미생물 펩티드 (예를 들어, 온코신), 압타머, 뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성화인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 및/또는 조작된 메가뉴클레아제인 방법.
  93. 제89항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 식물 상의 적어도 1개의 부위가 숙주 식물의 지상부 상에 및/또는 숙주 식물의 지하부 상에 있는 것인 방법.
  94. 제89항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 공생체 또는 공생체 형성 접종물이 숙주 식물 상으로 적어도 2회 및/또는 숙주 식물 상의 적어도 2개의 부위 상으로 이식되는 것인 방법.
  95. 제89항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 생성물이 전사 생성물 또는 번역 생성물, 또는 그의 변형인 방법.
  96. 제89항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드의 발현 생성물을 사용하여 제조된 생성물이 화학물질, 단백질 (폴리펩티드/펩티드) 또는 폴리뉴클레오티드인 방법.
  97. 제89항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 숙주 식물 특징이 질환 유발 유기체 (예를 들어, 진균, 박테리아, 바이러스)에 대한 증가된 내성/저항성인 방법.
  98. 제89항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 숙주 식물 특징이 식물 방어 유전자의 증가된 (유도된) 발현인 방법.
  99. 제89항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 숙주 식물 특징이 증가된 곤충 내성/저항성인 방법.
  100. 제89항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 숙주 식물 특징이 증가된 선충 내성/저항성인 방법.
  101. 제89항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 숙주 식물 특징이 변형된 형태학인 방법.
  102. 제101항에 있어서, 변형된 형태학이 단축된 절간, 증가된 곁가지화 및/또는 증가된 개화를 포함하는 것인 방법.
  103. 제89항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 숙주 식물 특징이 생체분자, 생물활성 분자 및/또는 생물활성 분자의 생합성에 관여하는 폴리펩티드의 존재인 방법.
  104. 제103항에 있어서, 생물활성 분자가 제약 (예를 들어, 치료 단백질, 치료 폴리뉴클레오티드, 치료 화학물질), 생물자극제, 생물살진균제, 생물제초제, 살곤충 단백질/펩티드, 트립신 조정 오스타틱 인자 (TMOF); 바실루스 투린기엔시스 독소, 식물성 살곤충 단백질 (Vip), 영양분, 식물 성장 조절제, RNA, 식물항체, 스틸렛 쉬스 억제 단백질, 리보자임, 박테리오신, 항미생물 펩티드, 식물 지질, 식물 지방산, 식물 오일, 압타머, 뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성화인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 및/또는 조작된 메가뉴클레아제인 방법.
  105. 제103항 또는 제104항에 있어서, 생물활성 분자가 자부레톡스 (펩티드 JBTX), δ 내독소, Cry 독소, Cyt 독소, 레게모글로빈, 니트로게나제, 피신, 브로멜라인, 박테리오신, 니신 및/또는 온코신인 방법.
  106. 제89항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 숙주 식물 특징이 숙주 식물에서의 생물활성 분자 (예를 들어, 살생물 분자)의 존재 및 식물 병원체에 대한 증가된 저항성/내성인 방법.
  107. 제106항에 있어서, 생물활성 분자가 박테리오신 또는 항미생물 펩티드이고, 식물 병원체가 박테리아인 방법.
  108. 제107항에 있어서, 박테리오신 또는 항미생물 펩티드가 온코신 및/또는 니신인 방법.
  109. 제89항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 숙주 식물 특징이 살곤충 단백질 (예를 들어, 생물살곤충제)의 존재 및 증가된 곤충 내성 또는 저항성인 방법.
  110. 제109항에 있어서, 살곤충 단백질이 자부레톡스, 트립신 조정 오스타틱 인자 (TMOF), 바실루스 투린기엔시스 독소 (예를 들어, δ 내독소, 예를 들어, Cry 독소, Cyt 독소); 스틸렛 쉬스 억제 단백질 (예를 들어, 피신, 브로멜라인), 및/또는 식물성 살곤충 단백질 (Vip)인 방법.
  111. 제89항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 숙주 식물 특징이 식물 성장 조절제 (예를 들어, 옥신, 시토키닌, 지베렐린, 에틸렌; 성장 억제제/지연제)의 존재 또는 그의 증가된 또는 감소된 생산 및 변형된 성장인 방법.
  112. 제89항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 숙주 식물 특징이 RNA의 존재 또는 그의 증가된 생산 및 폴리뉴클레오티드, 펩티드 또는 폴리펩티드의 증가된/감소된 생산인 방법.
  113. 제112항에 있어서, RNA가 siRNA, dsRNA, miRNA, 또는 shRNA, 임의로 dvsnf7, ccomt, dCS, asn1, phL, RI, PGAS, 및/또는 ppo5인 방법.
  114. 제89항 내지 제113항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 변형된 특징을 갖는 숙주 식물.
  115. 제26항 내지 제42항 중 어느 한 항의 공생체를 제공하고, 여기서 관심의 폴리뉴클레오티드는 생체분자 및/또는 생물활성 분자를 코딩하고, 공생체에서 생산된 생체분자 및/또는 생물활성 분자를 수집하는 단계; 및/또는
    제43항 내지 제47항 중 어느 한 항의 숙주 식물을 제공하고, 여기서 관심의 폴리뉴클레오티드는 생체분자 및/또는 생물활성 분자를 코딩하고, 공생체 및 숙주 식물에서 생산된 생체분자 및/또는 생물활성 분자를 수집하는 단계
    를 포함하는, 생체분자 및/또는 생물활성 분자를 생산하는 방법.
  116. 제1항 내지 제25항, 제86항, 및 제87항 중 어느 한 항의 공생체 형성 접종물, 또는 제88항의 세포 또는 제26항 내지 제42항 중 어느 한 항의 공생체를 숙주 식물 상의 적어도 1개의 부위 상으로 이식하는 단계; 및
    공생체 형성 접종물 또는 공생체를 숙주 식물 상의 적어도 1개의 부위에서 배양하여 적어도 1개의 부위에서 숙주 식물 상의 공생체를 형성하고, 여기서 관심의 폴리뉴클레오티드는 공생체에서 발현되고, 관심의 폴리뉴클레오티드의 발현 생성물 및/또는 관심의 폴리뉴클레오티드의 발현 생성물을 사용하여 제조된 생성물은 숙주 식물 내로 수송되고, 그에 의해 관심의 화합물을 식물에 전달하는 단계
    를 포함하는, 관심의 화합물을 숙주 식물에 전달하는 방법.
  117. 제1항 내지 제25항, 제86항, 및 제87항 중 어느 한 항의 공생체 형성 접종물, 또는 제88항의 세포, 또는 제26항 내지 제42항 중 어느 한 항의 공생체를 숙주 식물 상의 적어도 1개의 부위 상으로 이식하는 단계; 및
    공생체 형성 접종물 또는 공생체를 숙주 식물 상의 적어도 1개의 부위에서 배양하여 적어도 1개의 부위에서 숙주 식물 상의 공생체를 형성하고, 여기서 관심의 폴리뉴클레오티드는 공생체에서 발현되고, 관심의 폴리뉴클레오티드의 발현 생성물 및/또는 관심의 폴리뉴클레오티드의 발현 생성물을 사용하여 제조된 생성물은 숙주 식물 내로 수송되고, 그에 의해 변형된 유전자형을 갖지 않는 변형된 특징을 포함하는 식물을 생산하는 단계
    를 포함하는, 식물의 유전자형을 변형시키지 않으면서 변형된 특징을 포함하는 식물을 생산하는 방법.
  118. 제117항의 방법에 의해 생산된 식물.
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