CN102325442A - 改造植物热稳定的疾病抗性 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一组可以编码热稳定的植物抗性多肽的核酸分子，该多肽可以使植物的防御响应具有热稳定性，其中该多肽含有NB-LRR结构基序。本发明进一步涉及表达所述核酸分子的转基因植物和转化的宿主细胞，这些植物和宿主细胞可以在广泛的温度范围内都展现出较强的疾病抗性。

Description

改造植物热稳定的疾病抗性
联邦资助研究声明
本工作得到了美国农业部第2005-35100-16044号授权基金的资助。政府对本发明拥有一定权利。
发明背景
本发明涉及植物的抗病性。
植物病害所导致的作物减产对全球食物供应和人类福祉的破坏是巨大的。植物所演化出的防御机制可抵御各种生物的侵袭以确保它们的存活和健康。这种植物免疫发生在多个水平，主要可分为2个类型(1，31)。一种是响应多种病原体中共有分子的普遍抗性，另一种是响应病原体中毒性因子的“品种特异的”抗性。后者是通过宿主植物的抗病基因(R)特异性地识别病原体中种属特异的非毒性(Avr)基因所引发的(32)。这种“基因对基因”的相互作用最终会引起快速有效的防御反应，这包括一种被称为超敏反应(HR)的程序性细胞死亡，以此来限制病原体的生长(33)。目前已经对很多物种中的许多R基因进行了分子克隆，其中最大类别的R蛋白含有“核苷酸结合”(NB)结构域和富亮氨酸重复(LRR)结构域(8，9)。Avr蛋白和R蛋白之间直接或者间接的相互作用可以激活下游信号传导事件，进而导致局部的超敏反应以及整个植物的系统获得性抗性。
植物的防御响应受到多种环境因子所调节，包括光，湿度以及温度。温度变化会影响植物对细菌，真菌，病毒以及昆虫的疾病抗性(34)。高温通常会抑制植物的疾病抗性，这种现象被称为“热屏蔽效应”。已有报道表明这种热敏感性在许多R基因介导的疾病抵御响应中都是存在的，例如烟草中N基因(35)介导的疾病抵御响应，番茄中Mi基因(6)介导的疾病抵御响应，拟南芥中的RPW8基因(36)介导的疾病抵御响应，以及拟南芥中的SNC1基因(7)介导的疾病抵御响应。
因此，本领域中迫切需要提供一种技术，该技术可以提高植物对温度的耐受性从而避免高温对疾病抵御响应产生抑制作用。所以，本领域中需要提供一种可以赋予植物温度不敏感性的基因从而使得植物在高温下仍保有疾病抗性的技术。本发明提供了这样的基因，并且还提供了赋予植物在通常会因为热敏感性而导致其防御响应被降低或者屏蔽的温度下仍具有疾病抗性的方法。
发明概述
现有研究已发现温度可以通过疾病抗性蛋白来调节植物的防御响应。如本申请以下所述，本发明通过遗传筛选的手段从十字花科植物拟南芥中鉴定出了引起植物疾病抗性温度敏感性的成分，该成分是一种NB-LRR类型的R样基因SNC1。具体地，本发明已经证明了SNC1的特定突变体可以诱导产生热稳定的疾病抗性。为了证明该发现的通用性，我们对另一个R基因N进行了类似的修饰，并发现它也能够使植物对烟草花叶病毒具有热稳定的疾病抗性。本发明的上述发现为通过基因工程改造或者育种方式或者两者结合的方式来获得在一系列温度范围下都具有防御响应能力的植物品种提供了一种方法学。
大体而言，本发明涉及分离的核酸分子，其所含核苷酸序列编码的多肽包含：(a)核苷酸结合(NB)结构域；和(b)富亮氨酸重复(LRR)结构域，其中所述多肽可以赋予针对植物病原体的热稳定防御响应。在一个实施例中，该多肽所包含的LRR结构域含有可以赋予热稳定防御响应的亚结构域。在优选的实施方式中，所述可以赋予针对植物病原体的热稳定防御响应的LRR结构域包括，E/L(K或R)LD基序或者E/L(K或Y)LV(N或D)基序。
在其他优选的实施方式中，所述核酸序列被可操作的连接到可以驱使其在植物细胞中进行表达的启动子上。可用的启动子包括组成型启动子，诱导型启动子或组织特异性启动子。在优选的实施方式中，所述组织特异性启动子包括根，叶或种子特异的启动子。本申请已经描述了这些启动子的实例。在其他优选的实施方式中，所述分离的核酸序列全部或者部分的由合成的核苷酸结构单元构成。在还有一些优选的实施方式中，核苷酸序列的密码子使用偏性(codon usage)被优化成适于其在植物中进行表达。
在优选的实施方式中，表达获得的多肽可以赋予表达该多肽的植物同时在22℃和28℃或者同时在22℃和30℃下都具有疾病抗性。在其他实施方式中，表达获得的多肽可以赋予表达该多肽的植物在23℃，24℃，25℃，26℃，27℃，28℃，29℃，30℃，31℃，32℃，33℃，34℃，35℃，36℃或者更高的温度下都具有疾病抗性。
在其他方面，本发明还涉及包含有任何此前所述的分离的核酸分子的载体、细胞、植物或者植物成分。本发明记载了这些载体、细胞以及植物的实例。
在还有一些方面，本发明涉及赋予植物或者植物成分针对病原体抗性的方法，该方法包括如下步骤：(a)用分离的核酸分子转化植物细胞，该核酸分子所编码的多肽包含：(i)NB结构域；以及(ii)LRR结构域，其中该多肽可以赋予针对植物病原体的热稳定防御响应；以及(b)从转化后的植物细胞中再生植物或者植物成分，其中该植物或者植物成分具有针对病原体的抗性。在一个实施例中，该多肽含有可以赋予热稳定防御响应的LRR结构域。在优选的实施方式中，表达后的多肽可以赋予表达该多肽的植物在广泛的温度条件下都具有疾病抗性(如23℃，24℃，25℃，26℃，27℃，28℃，29℃，30℃，31℃，32℃，33℃，34℃，35℃，36℃或者更高的温度)。
在其他优选的实施方式中，表达热稳定的NB-LRR多肽的植物与相应的对照植物相比，其在高温条件下具有更高的抗性水平。
在还有一些实施方式中，可以通过育种、转化或二者结合的方法来导入核酸分子。优选地，植物是单子叶植物或双子叶植物，病原体是细菌，真菌，线虫，昆虫或者病毒。可用于本发明的植物的实例包括但不限于，十字花科植物如拟南芥，毛果杨(美国黑杨)，马铃薯(土豆)，甜瓜(香瓜)，紫花苜蓿(苜蓿)，香液杨树(香脂白杨)，四季豆(芸豆)，大豆(黄豆)，蒺藜苜蓿，烟草(Nicotiana tabacum)，粘性烟草，西红柿(番茄)，马铃薯品种(Solanum tuberosumsubsp.andigena)，兵豆(扁豆)，亚麻(胡麻)，葡萄(酿酒葡萄)，水稻印度组(Oryza sativa IndicaGroup)(印度大米)，水稻日本组(Oryza sativa Japonica Group)(日本大米)，玉米，大麦和小麦。
在另一方面，本发明涉及基本上纯的多肽，其包含：(a)NB结构域；和(b)LRR结构域，该多肽可以赋予针对植物病原体的热稳定防御响应。优选地，该多肽可以赋予表达该多肽的植物同时在22℃和28℃下或者同时在22℃和30℃下都具有疾病抗性。在一个实施例中，所述基本上纯的多肽包含有可以赋予热稳定防御响应的LRR结构域。在其他实施方式中，所述基本上纯的多肽可以赋予表达该多肽的植物在23℃，24℃，25℃，26℃，27℃，28℃，29℃，30℃，31℃，32℃，33℃，34℃，35℃，36℃或者更高的温度下都具有疾病抗性。
术语“热稳定的防御响应”是指，植物中NB-LRR多肽介导的病原体防御响应，该防御响应发生在某一温度，在该温度下如果缺少该NB-LRR多肽时植物无法对病原体启动防御响应。该温度要高于植物在缺少该多肽的情况下仍启动病原体防御响应能力所需的温度。例如，优选地，热稳定防御响应时的温度要比因为不具有该多肽而致使植物失去病原体防御响应能力的温度高2℃，3℃，4℃或者甚至5℃；更优选地，热稳定的防御响应时的温度要比因为不具有该多肽而致使植物失去病原体防御响应能力的温度高6℃，7℃，或者甚至8℃；最优选地，热稳定的防御响应时的温度要比因为不具有该多肽而致使植物失去病原体防御响应能力的温度高9℃，10℃，或11℃(或者甚至12℃或更高温度)。
术语“基本上纯的多肽”是指从与其天然伴存的成分中分离出来的多肽，例如热稳定的NB-LRR疾病抗性多肽(例如，SNC1-3，SNC1 E640R，N Y646K，或N Y638K N648D多肽，或者图9或图10中记载的那些多肽)。通常，当该多肽所占的质量百分比至少为60％，并且不含有与该多肽天然结合的蛋白和天然存在的有机分子时，则该多肽被称为基本上纯的多肽。优选地，热稳定的NB-LRR疾病抗性多肽所占的质量百分比至少为75％，更优选至少90％，最优选至少99％。基本上纯的热稳定的NB-LRR疾病抗性多肽可通过多种方法获得，例如，通过从天然原材料(例如，植物细胞)中提取获得；通过表达编码热稳定NB-LRR疾病抗性多肽的重组核酸获得；或者通过化学合成蛋白质的方法获得。纯度可以通过任何适用的方法来进行测定，例如，柱色谱，聚丙烯酰胺凝胶电泳，或者HPLC分析。
术语“分离的核酸分子”是指不含有其它基因的核酸分子，所述其它基因是指在从中获取分离的核酸分子的生物体的天然存在的基因组中与分离的核酸分子侧翼相连的基因。因此该术语包括，例如，导入到载体中的重组DNA；导入到能自主复制的质粒或病毒中的重组DNA；导入到原核或真核细胞基因组DNA中的重组DNA；或者以不含有其他序列的单独分子(例如，通过PCR或限制性内切酶消化产生的cDNA或基因组片段或cDNA片段)的形式存在的重组DNA。该术语还包括作为杂合基因一部分的重组DNA，所述杂合基因编码其它的多肽序列。
术语“源自”或“衍生自”或“来源于”是指，从天然存在的序列中分离出来，或者含有天然存在序列(例如，cDNA，基因组DNA，合成的DNA或它们的组合)。
术语“屏蔽温度”是指，在该温度下植物对某种病原体的防御响应能力失去效力从而使得该植物不能对这种病原体产生抗性。
术语“多肽”或“蛋白”是指任意的氨基酸链，不管它们的长度以及是否存在翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)。
术语“植物细胞”是指，任何半透膜所界定出来的含有原生质体且能够自我繁殖的细胞。如果希望该细胞可以进一步增殖，则该细胞还可以包含细胞壁。本申请中使用的植物细胞包括但不限于，藻类，蓝藻，种子，悬浮培养物，胚芽，分生区，愈伤组织，叶子，根，芽，配子体，孢子体，花粉以及小孢子。
术语“植物成分”是指，从完整的植物或者植物细胞上获得的部分、片段或者器官。植物成分的实例包括但不限于，体胚，叶子，茎，根，花，蔓，果实，接穗，种子以及根茎。
术语“十字花科植物”是指任何归入十字花科的植物。十字花科植物包括许多农作物，包括但不限于，油菜(例如，油青四九菜心(Brassica campestris)和甘蓝型油菜(Brassicanapus))，青花菜，卷心菜，抱子甘蓝，萝卜，羽衣甘蓝，芥蓝，球茎甘蓝，花椰菜，芜菁，大头菜，芥菜，山葵，以及拟南芥。
术语“转基因”是指，通过一定方法导入到细胞中并成为由该细胞发育生长得到的生物体基因组的一部分的核酸分子(例如，DNA)。这种转基因可以包括与转基因的生物体部分或完全异源的(也就是外源的)基因，或者可以表示与该生物体的内源基因具有序列一致性的基因。
术语“转基因的”是指一种细胞，该细胞包含有通过一定方法导入到该细胞中并成为由该细胞发育生长所得到的生物体基因组一部分的核酸分子(例如，DNA序列)。本申请中所使用的转基因生物体通常是转基因的植物，其中所述DNA(例如，转基因)通过特定技术被导入到其细胞核或其细胞质基因组中。本发明的转基因的植物可以含有一种或者多种本申请中所描述的分离的核酸分子。
术语“病原体”是指一种生物体，该生物体在感染生长中的植物组织后可以在该植物组织中诱导产生疾病反应。这样的病原体包括但不限于，细菌，支原体，真菌，卵菌，昆虫，线虫，病毒以及类病毒。有关这些病原体所导致的植物疾病都已经记载在Chapters 11-16 ofAgrios，Plant Pathology，3rd ed.，Academic Press，Inc.，New York，1988中。
细菌病原体的实例包括但不限于，欧文氏菌属(例如，软腐欧文氏菌)，假单胞杆菌属(例如，丁香假单胞菌)，以及黄单胞菌属(例如，开姆佩斯崔斯菌(X.campepestris)和水稻细菌性条斑病菌)。
真菌或者真菌样致病病原体的实例包括但不限于，链格孢属(例如，芸苔生链格孢和番茄早疫病菌)，壳二孢属(例如，豌豆壳二胞菌)，葡萄孢属(例如，灰葡萄孢菌)，尾孢菌属(例如，大豆紫斑病菌和玉米灰斑病菌)，炭疽菌属(例如，菜豆炭疽菌)，色二孢属(例如，马伊德壳色单隔孢)白粉菌属(例如，格兰米尼斯菌(E.graminis f.sp)和大麦白粉病菌)，镰刀菌属(例如雪腐镰刀菌和尖孢镰刀菌，禾谷镰刀菌，茄镰孢菌，串珠镰孢菌和粉红镰孢菌)，顶囊壳属(例如小麦全蚀病菌)，长蠕孢属(例如，大斑病长蠕孢菌，碳色长蠕孢菌，玉米小斑病菌)，壳球孢属(例如菜豆壳球孢菌和稻瘟菌)，丛赤壳属(例如赤球丛赤壳菌)，霜霉属(例如，大豆霜霉菌，烟草霜霉菌)，茎点霉属(例如，甜菜茎点霉菌)，榴梗孢属(例如，棉根腐病菌)，疫霉属(例如，樟疫霉菌，恶疫霉菌，菜豆疫霉病菌，烟草黑胫病菌，柑桔褐腐疫霉菌，大豆疫霉菌，晚疫病菌)单轴霉属(例如，葡萄生单轴霉菌)，叉丝单囊壳属(例如，苹果白粉病菌)，柄锈菌属(例如玉米柄锈菌，小麦条锈病菌，小麦秆锈菌，天门冬属柄锈菌，叶锈病菌和花生锈病菌)，腐霉属(例如瓜果腐霉菌)，核腔菌属(例如小麦颖枯病菌)，梨孢属(例如，水稻稻瘟病菌)，腐霉属(例如，终极腐霉菌)，丝核菌属(例如，立枯丝核菌和禾谷丝核菌)，小菌核菌属(例如，木霉菌)，核盘菌属(例如，核盘菌)，针壳孢属(例如，番茄壳针孢菌，大豆褐纹壳针孢菌，狗牙根壳针孢菌，小麦壳针孢菌)，根串珠霉属(例如，烟草根黑腐病菌)，钩丝壳属(例如，葡萄白粉菌)，黑星菌属(例如，苹果黑星病菌)，轮枝孢属(例如，黄萎菌和黑白轮枝菌)。
致病的线虫实例包括但不限于，根结线虫(例如，根结线虫属，如南方根结线虫，花生根结线虫，奇特伍德根结线虫，北方根结线虫，爪哇根结线虫，拟禾本科根结线虫，小突根结线虫，禾本科根结线虫，和纳西根结线虫)，孢囊线虫(例如，孢囊线虫属，如甜菜孢囊线虫，大豆胞囊线虫，甘蔗胞囊线虫，水稻胞囊线虫，禾谷胞囊线虫，木豆胞囊线虫，微小胞囊线虫，豌豆孢囊线虫，麦类孢囊线虫，地中海孢囊线虫，莫斯孢囊线虫(H.mothi)，高粱孢囊线虫和玉米孢囊线虫，又或例如，球孢囊属，如马铃薯金线虫和马铃薯白线虫)，袭根线虫(例如，肾形肾状线虫，半穿刺线虫，矮尾短体线虫，柑桔穿孔线虫，香蕉穿孔线虫，剑线虫，里弗斯剑线虫，微小拟毛刺线虫，实夜蛾异小杆线虫和松材线虫)，以及地上部线虫(例如，剪股颖粒线虫(Anguina funesta)，小麦粒线虫，茎线虫，食菌茎线虫和干尖线虫)。
病毒性病原体的实例包括但不限于，烟草花叶病毒(TMV)，烟草坏死病毒(TNV)，马铃薯卷叶病毒X，马铃薯病毒Y，番茄斑点萎凋病毒，以及番茄环斑病毒。
如之前所述，本申请已经鉴定，分离或者改造，以及表征了一些编码热稳定NB-LRR抗病多肽的基因。相应地，本发明也提供了许多保护植物抵御病原体的重要改进和优点。例如，本发明提供了一种有效且经济的手段来保护植物在热屏蔽或者热敏感的温度条件下来抵御植物病原体。本发明的保护植物抵御病原体的方法可以降低传统化学试剂的使用(例如，使用杀真菌剂，除菌剂，杀线虫剂，杀虫剂或者杀病毒剂)或者使得化学试剂的使用最小化，这些化学试剂通常是农民为了控制植物病原体的传播并防护作物免受致病病原体侵害而使用的。此外，因为含有热稳定的NB-LRR抗病多肽的植物对于病原体及其疾病不再那么易受感染，因此本发明进一步提升了生产效率并提高了作物植物以及观赏性植物的质量和产量。因此，本发明对于生产高质量和高产量的农产品提供了帮助，例如，水果，观赏性植物，蔬菜，谷物以及由于病原体所导致的减产、产生缺陷以及斑点的大田作物；本发明还提高了农产品的货架期并降低了操作成本，以及为农业(例如谷物和大田作物)，工业(例如，油料种子)和商业(例如，纤维植物)提供了高质量和高产量的作物。此外，由于本发明减少了使用化学试剂保护植物抵御病原体的必要性，所以本发明还有益于作物的生长环境。通过使用可以表达本发明中的基因的植物所生产获得的遗传改进的种子和其它植物产物，从而可以实现在先前因为极端温度和全球气候变化而不能进行农业生产的区域来进行农业耕作。
构建体
如之前所讨论，本发明涉及载体，尤其是质粒以及其它在遗传工程中通常使用的载体，它们含有上述分离的编码热稳定的NB-LRR多肽的核酸分子。优选地，这些包含在载体中的核酸分子可操作地连接到可以在真核细胞中进行转录和表达多肽或蛋白质的调控元件上。通常，含有所述分离的核酸分子的重组DNA分子在5’至3’转录方向上以可操作的方式连接有：能够促进、起始和/或调节植物细胞中的转录和翻译的转录起始控制区域(启动子区域)；编码热稳定的NB-LRR多肽的核酸分子，以及；转录和翻译终止区域(或者称为3’非翻译区域)。当第一个核酸序列被排列到可以影响第二个核酸序列功能的位置时，则被称作第一个核酸序列“可操作的连接”到第二个核酸序列。优选地，这两条序列是同一个连续的核酸分子的一部分，更优选是相邻的序列。“重组”核酸或者“重组DNA分子”可以通过人工组合两条分离的序列片段获得，例如，通过化学合成方式获得或者通过使用遗传工程技术对分离出的核酸片段进行操作后获得。“重组DNA构建体”，“重组载体”，“表达载体”，或“表达盒”是指，任何来源的能够进行基因组整合或自主复制，并且在它所含的DNA分子中有一条或者多条DNA序列以功能上可操作的方式连接在一起的一种试剂，例如质粒，粘粒，病毒，BAC(人工细菌染色体)，自复制序列，噬菌体，或线性或环状单链或双链DNA或RNA核苷酸序列。
本申请所述的“启动子”是指，可以与RNA聚合酶(通常也还有其他转录因子)结合促使下游DNA序列转录的DNA序列。所产生的转录的序列可以是具有如rRNA(核糖体RNA)或tRNA(转运RNA)功能的RNA分子。通常，所产生的RNA是杂化核RNA(hnRNA)，其内含子被剪切后产生mRNA(信使RNA)。“植物启动子”是指能够在植物细胞中发挥功能的天然的或者非天然的启动子。组成型启动子可以在植物发育的整个过程中在绝大部分或所有植物组织中都发挥功能。组织特异的，器官特异的或者细胞特异的启动子只有在或者是主要在相应的特定组织，器官或者细胞类型中进行表达。此处所使用的特异的表达是指，任何可以在特定组织或发育阶段或者在特定环境条件下提高表达水平的启动子，但是其也有可能在其它组织或发育阶段或者在特定环境条件下引起表达甚至引起明显的表达。
临时调控启动子只在或者主要在植物发育的特定阶段或者天数内发挥功能。诱导性启动子在存在内源性或者外源性刺激的情况下可以选择性地表达可操作性连接的DNA序列，例如应答化合物(化学诱导剂)或者响应环境的、激素的，化学的和/或发育的信号。诱导性或调控性启动子包括，例如，受到光，热，压力，洪水或干旱，植物激素，伤口，寒冷，或者化学物质如乙醇、茉莉酮酸酯、水杨酸或保护剂调控的启动子。
对于绝大部分情况而言，可以使用任意的植物启动子来作为5’调控序列来调节特定的一个或多个基因的表达，如植物RNA聚合酶II启动子。当融合到异源的DNA序列时，这样的启动子通常使融合的序列按照与该启动子正常连接的基因序列相似的方式来进行转录。可以在启动子中加入调控序列片段(例如，融合到含有部分的或者完整的自身调控序列的活性启动子的5’末端融合，或者插入到该活性启动子的内部)。或者，可以将异源的调控序列添加到失活的残缺的启动子的5’上游区域，该失活的残缺的启动子例如是只含有TATA核心序列，或者有时还可以含有CCAAT序列。
含有特定顺式作用的转录调控元件的启动子，可以从基因表达总体调控的不同方面来对基因表达进行控制。本发明中的启动子序列可以含有调控基因表达的顺式作用元件。顺式作用元件可以是启动子的一部分，也可以是位于所述启动子的上游或者下游。从远距离对启动子发挥作用的顺式作用元件(或其构成的组合)通常称为抑制子或增强子。增强子能够上调RNA聚合酶在启动子上的转录起始速度，而抑制子则可以降低该速度。在有些情况下，启动子，增强子或抑制子具有相同的元件。顺式作用元件通常位于转录因子结合到DNA上的位点并对RNA聚合酶结合到启动子上的速度进行调控。
在植物细胞中具有活性的组成型启动子的实例包括但不限于，胭脂碱合成酶(NOS)启动子；花椰菜花叶病毒(CaMV)19S和35S(有时在本申请中也称为35S)启动子；烟草花叶病毒启动子；玄参花叶病毒启动子；以及肌动蛋白启动子，如拟南芥肌动蛋白基因启动子。
术语“组织特异性启动子”是指，能够使其下游基因在植物发育的特定时间在特定的细胞或组织中的转录水平得到增强的调控序列，例如增强基因在营养组织或生殖组织中的转录水平。受到发育调控的组织特异性启动子的实例包括，只在(或主要只在)特定组织中起始转录的启动子，例如营养组织如根、叶或茎，或者生殖组织如果实、胚珠、种子、花粉、雌蕊、花，或者任意胚组织。生殖组织特异性的启动子可以是，例如，胚珠特异的，胚芽特异的，胚乳特异的，珠被特异的，种皮特异的，花粉特异的，花瓣特异的，萼片特异的，花柱特异的，或者它们的一些组合。本领域的技术人员知道组织特异性的启动子可能会在除靶组织以外的其他组织中驱动与其可操作连接的序列的表达。因此，本申请中的组织特异性的启动子是一种优先在靶点组织中驱动基因表达的启动子，但其也有可能在其他组织中驱动基因表达。
在本发明的一个优选的实施方式中，编码热稳定的NB-LRR多肽的核酸分子可操作的连接在组织特异性的启动子上，或连接在引导其在叶组织或叶组织的某个区域中进行表达的启动子上。
其他可能适合的调控序列的实例还包括，内含子，3’非编码区域例如聚腺苷酸序列(polyA sequences)，隔离子区域及类似的调控序列。用于鉴定，获取以及与本发明中所述核酸分子一起组合使用这样的调控元件的分子生物学技术属于本领域的已有技术。
转化方法，转基因的植物或植物成分
本发明进一步涉及转基因的植物细胞和转基因的植物，它们通过转化获得并表达热稳定的NB-LRR多肽。“转化的”，“转染的”或“转基因的”是指细胞、组织、器官或者生物体内被导入了外来的核酸，例如重组载体。本发明的转基因植物可以含有一种或者多种本发明所述的核酸分子。优选地，所导入的核酸被整合到受体细胞、组织、器官或生物体的基因组DNA中，这些被导入的核酸可以被遗传给其后代。“转基因的”或“转化的”细胞或生物体也包括了该细胞或生物体的后代，以及通过使用“转基因的”植物作为父本进行杂交育种所获得的后代，该后代因为存在重组的表达构件或载体所以可以展现出改变后的表型。转化的方法对于本发明而言并不是至关重要的，各种已知的植物转化方法都适用于本发明。例如，本发明中将DNA序列导入到植物和/或植物细胞中的过程可以通过农杆菌介导的转化来实现，或者通过病毒载体介导的转化来实现，或者通过电穿孔来实现，亦或者通过基因枪介导的转化(粒子枪或生物弹方法)来实现。该DNA序列还可以通过质体转化直接导入到细胞质基因组中。
本发明也可以通过蘸花法转化(floral dip transformation)来将构建体导入到植物中。此处可以使用带有遗传构建体的农杆菌对开花植物如拟南芥进行转染，该花随后结成种子，然后再根据标准方法从后代幼苗中筛选出转基因的植物。
可以通过标准的植物组织培养技术来再生获得的整个植物，例如通过培养已经用植物表达载体转化后的单个细胞、愈合组织或者叶圆片来获得整个植物。本领域的技术人员知晓，可以根据标准技术对几乎来自任意植物的各种细胞、组织以及器官进行培养从而成功地再生整株植物。
本发明适用于单子叶植物以及双子叶植物，而且也适用于新的和/或改良的转化技术。为了能够高效地从植物细胞或植物组织中生产转基因的植物，用于转化的植物组织最好是具有高再生能力的组织。通过转化的植物细胞培养得到的植物组织来再生植物的技术已为本领域所公知。
如之前所述，本发明所生产的转基因植物可以是任意的双子叶植物或单子叶植物，优选地，例如是，玉米、豌豆、大豆、苜蓿、木薯、马铃薯、棉花以及谷物(例如，大麦、燕麦、黑麦、黑小麦和小麦)。玉米包括所有种类的玉米，以及所有用它育种获得的玉米品种。小麦包括所有品种的小麦，包括但不限于春小麦、冬小麦以及所有兼性的小麦品种(facultativewheat varieties)。小麦还包括任何其他的小麦品种，包括但不限于，硬质小麦(Triticum durum)，斯佩尔特小麦(Triticum spelta)，二粒小麦(Triticum dicoccum)以及一粒小麦(Triticummonococcum)。小麦还包括任何可以与前述的任一小麦品种进行育种的种类。大豆包括所有的大豆品种，以及所有可以由其育种获得的品种。水稻包括所有的水稻品种，以及所有由它育种获得的品种。大麦包括所有的大麦品种，以及所有由它育种获得的品种。燕麦包括所有品种的燕麦，以及所有由它育种获得的品种。芥花子(Canola)是一个新词，其是指通过遗传修饰的油菜籽植物、油菜籽(甘蓝型油菜)和芜菁油菜(白菜型油菜)获得的种子、油和粉，此处的介花子包括所有的油菜籽植物以及可以由其育种获得的生物体。本发明所用的根瘤农杆菌包括该物种所有的菌株以及类型。棉花包括所有棉属植物，以及所有可以由其育种获得的植物。
本发明的方法包括，将含有可以在植物细胞中发挥功能的启动子可操作的连接到编码热稳定的NB-LRR多肽的核酸序列上的方法(图8，9，10和11示出了分离的DNA分子的实例)，以及通过转化的植物细胞来生产获得植物(以及这些植物的可繁育的后代植物)的方法。后代包括特定植物或者植物种系的可繁育的后代。
本发明进一步涉及转基因种子的制备。“转基因种子”是指，该植物种子的细胞核中导入了一种基本上纯的核酸分子，该核酸分子可以编码含有能够赋予植物热稳定的防御响应能力的NB-LRR多肽；例如，含有包括LRR热稳定的亚结构域的NB-LRR多肽，该多肽可以调节表达该多肽的植物的防御响应能力，例如通过本申请所记载的转化方法来实现。术语“转基因植物”是指，通过最初的转化体所获得的植物，或者由其后代得到的后代，或者转化后的植物所获得的杂交体及其后代，只要这些后代在它的细胞核基因组中含有重组的DNA。
本发明进一步涉及转基因的植物成分。术语“植物成分”是指从完整的植物或者植物细胞中获得的部分、片段或者器官。植物成分的实例包括但不限于，体胚，叶子，茎，根，花，蔓，果实，接穗，种子，块茎以及根茎。
通过以下的附图、发明详述以及权利要求可以更好地理解本发明的其它特征和优点。
附图说明
图1A-1E显示突变体int102具有温度不敏感的防御响应。
图1A显示突变体snc1-1在22℃下所表现出的矮生表型在28℃时被得到了抑制。所示为4周龄的植物。
图1B显示int102突变使snc1-1在28℃下保留了对致病病原体的抗性。所示为番茄细菌性斑点病菌(Pst)DC3000在22℃和28℃时分别在野生型、snc1-1和int102-1 snc1-1中的生长情况。
图1C显示int102突变使snc1-1在28℃下产生了矮生型。所示为3周龄的植物。
图1D显示int102-1 snc1-1中防御基因的表达水平在22℃和28℃都得到了上调，并且该基因在int102-1 snc1-1中的表达上调依赖于PAD4。PR1和SNC1的表达使用RNA杂交检测。
图1E示出了int102-1 snc1-1在28℃时其矮生表型被pad4和nahG所抑制。所示为在28℃下印迹处理后的野生型，int102-1 snc1-1pad4，和int102-1 snc1-1 nahG的生长情况。
图2A-2C示出了snc1-3突变使得SNC1获得了温度不敏感的活性。
图2A示出了具有snc1-3突变的SNC1在28℃下诱导产生了超敏反应(HR)。4种p35S::SNC1:GFP构建体：SNC1野生型(WT)，SNC1-1，SNC1-3和SNC1-4(同时含有snc1-1和snc1-3突变)，通过农杆菌(农杆菌渗入法)导入到烟草(Nb)叶子中。所示为导入3天后的叶子。箭头所示为HR。
图2B示出了22℃和28℃时SNC1:GFP蛋白在Nb中的亚细胞定位。图2A所示的导入后的叶子在开始HR的前一天使用荧光显微镜进行分析。除SNC1-1外，SNC1-3和SNC1-4在28℃时都被保留在细胞核内。由于SNC1WT的信号很弱，对其成像的曝光使用了更长的时间。
图2C示出了SNC1:GFP蛋白在拟南芥原生质体中的亚细胞定位。将与图2A中相同的4个构建体转化到拟南芥原生质体中，转化12小时后使用荧光显微镜观察GFP荧光信号。相比其他三个样品，SNC1WT使用了更长的曝光时间。
图2D显示核导出信号(NES)消除了SNC1-3和SNC1-4的活性。SNC1-3:GFP，SNC1-3:GFP:NES，SNC1-4:GFP，以及SNC1-4:GFP:NES使用农杆菌渗入法转入Nb中，并在22℃和28℃下分析它们的HR诱导活性。每片叶子的左半部导入了SNC1:GFP融合蛋白，而叶子的右半部导入了相应的融合了NES的SNC1:GFP融合蛋白。所示为导入3天后的叶子。箭头所示的HR仅在不含有NES的融合蛋白半边观察到。
缩写：WT，SNC1WT:GFP；-1，SNC1-1:GFP；-3，SNC1-3:GFP；-4，SNC1-4:GFP；-3:NES，SNC1-3:GFP:NES；-4:NES，SNC1-4:GFP:NES。
图3A-3C显示MOS3和MOS6基因对于SNC1-3蛋白的活性而言是必需的。
图3A显示snc1-4的矮生表型被mos3或mos6所抑制。所示为22℃和28℃下培养的野生型，snc1-4 mos3，snc1-4 mos6和snc1-4三周龄的幼苗。
图3B和3C示出了野生型(wt)，mos3，mos6和pad4植物中SNC1-1:GFP蛋白在22℃(图3A)以及SNC1-3:GFP蛋白在28℃(图3C)的亚细胞定位。SNC1WT:GFP，SNC1-1:GFP，和SNC1-3:GFP分别是在22℃或28℃下通过在从mos3，mos6和pad4突变体植株中分离出的原生质体中进行表达获得，并且GFP信号在转化后12小时使用荧光显微镜观察。如在野生型中一样，该SNC1-1和SNC1-3蛋白存在于pad4突变体细胞核中，但是它们绝大多数都存在于mos3和mos6的细胞质和质膜中。缩写：Wt，野生型；其他同图2。
图4A-4B显示N基因中的突变使得防御响应对温度不敏感。
图4A示出了野生型以及三种N基因突变型在22℃和30℃下在Nt中诱导产生的HR。该野生型和突变型N基因使用农杆菌渗入法与其诱导物p50一起导入Nt中。野生型N基因在22℃而非30℃下诱导出HR，而所示Y646K和Y646KN648D突变型在两种温度下都能够诱导HR。
图4B示出了当N-citrine和p50共同表达时，N-citrine在22℃和30℃下在Nb中的定位。N-citrine嵌合基因和p50一起使用农杆菌渗入，对citrine信号进行三天的监测。该N-citrine蛋白在细胞核中的定位可在22℃下观测到，在30℃下则不能。
图5显示核导出信号(NES)抑制了SNC1-3和SNC1-4蛋白的核定位。所示为Nb中28℃表达的SNC1-3:GFP，SNC1-4:GFP，SNC1-3:GFP:NES，和SNC1-4:GFP:NES蛋白的定位。绝大部分SNC1-3:GFP和SNC1-4:GFP定位在细胞核中，而SNC1-3:GFP:NES和SNC1-4:GFP:NES在细胞核中的表达量出现了减少，并在细胞质和质膜上出现表达。名词缩写和图2中一致。
图6显示MOS3和MOS6基因对于SNC1-3以及SNC1-4蛋白的活性而言是必需的。所示为SNC1-3:GFP在22℃(A)以及SNC1-4:GFP蛋白在22℃(B)和28℃(C)分别在野生型(wt)，mos3，mos6和pad4中的亚细胞定位。SNC1-3:GFP，SNC1-4:GFP在22℃和28℃下在从mos3，mos6和pad4突变体植株中分离获得的原生质体中进行表达，并且GFP信号在转化后12小时使用荧光显微镜观察。如在野生型中的一样，该SNC1-3和SNC1-4蛋白存在于pad4突变体的细胞核中，但是它们在两种温度下绝大多数都存在于mos3和mos6的细胞质和质膜中。缩写：wt，野生型；其他同图2中一样。
图7示出了SNC1蛋白的氨基酸序列。其中TIR，NB-ARC和LRR结构域分别使用斜体，粗体和双下划线突出显示。snc1-1，snc1-3和snc1-5的突变用高亮显示。
图8示出了拟南芥中的与SNC1同源的500条同源序列。所示为Genbank中的编号。
图9示出了在拟南芥以外的其他物种中发现的SNC1同源序列。列表为500条在非拟南芥物种中找到的SNC1的同源序列。所示为Genbank的编号。
图10示出了对于赋予热稳定的疾病抗性有用的R突变。列表所示为对赋予热稳定的疾病抗性有用的R蛋白中的突变。
图11示出了R基因及其修饰体之间的序列比对，该修饰使得R基因可以赋予所选定的植物热稳定的防御响应能力。
发明详述
概述
植物的免疫系统含有多个层面的响应来应对各种生物侵袭，以保证植物的生存，健康以及繁殖(1，2)。这些防御响应受到非生物的环境因素调节，例如光、湿度以及温度(3-7)。如之前所述，高温会抑制很多植物在正常情况下所具有的对病原体侵袭的防御响应能力。防御相应能力的这种温度敏感性对农业生产造成了威胁，但这种温度调节的具体分子机制仍然未知。本发明以下部分证明了，已知可以识别病原体效应因子的疾病抗性(R)基因(8，9)是一种温度感应器，该温度感应器可以使疾病抗性具有温度敏感性。本发明进一步证明了，通过改变SNC1和N蛋白的特定残基可以对抗这种温度效应并使植物在高温下仍具有防御响应能力。这些发现可以用来使植物在广泛温度条件下都具有有效的植物免疫应答能力。
就如本申请以下部分所详细描述的，本发明使用拟南芥的snc1-1突变体作为起始株系从而分离获得可以在高温条件下仍保留很高疾病抗性的突变体。snc1-1突变体在NB-LRR型R蛋白SNC1上具有错义突变，同时在它的正常生长温度22℃下具有组成型的防御响应并展现出矮化表型，但在更高的温度如28℃下其虽然展现出正常的生长表型但却具有疾病的易感染性。通过突变体的筛选一些突变体，这些突变体在22℃和28℃下都具有依赖snc1-1生长的和防御突变体的表型。将通过上述筛选获得的一个突变体作为SNC1的等位基因(snc1-4)进行克隆，其中SNC1蛋白的E640突变为K(称为snc1-3突变)(表1)。单独的snc1-3突变就足以在低温和高温条件下诱导出很强的疾病抗性，而不需要存在原始的snc1-1突变。该发现第一次揭示了R蛋白中的突变而不是植物天然免疫系统中其他因子的突变就足以使得植物获得温度不敏感的特性。因此，该R基因是防御响应中的温度感应器。此外，R蛋白SNC1中的特定突变可以改变温度敏感性，使得它们能够在低温和高温条件下都具有活性。
我们对SNC1蛋白的这种温度敏感性的分子学基础同样进行了研究。发现温度会对SNC1蛋白的亚细胞定位产生影响：SNC1的细胞核定位与其生物学活性相关。只在22℃下具有活性的SNC1-1蛋白其在22℃时主要集中在细胞核中，但是在28℃下则位于细胞核外；而在22℃和28℃都具有活性的SNC1-3蛋白在这两种温度条件下均位于细胞核中。在SNC1-3蛋白上添加核导出信号将会导致SNC1-3蛋白被移出细胞核，并导致SNC1蛋白在28℃下失去活性。因此，温度对R蛋白定位的调节作用是R蛋白温度敏感性的本质，这进一步导致了疾病抗性的温度敏感性。
这些在拟南芥SNC1中发现的规律对于由其他NB-LRR型R蛋白介导的疾病抗性具有普适性。例如，烟草N基因(11)介导了对烟草花叶病毒的抗性，但这种抗性在30℃的高温条件下会受到抑制。当向N基因中导入snc1-3的同源突变后，可以使植物具有热稳定的抗性(表1)，这表明了疾病抗性中的温度敏感性存在普适的机制。虽然这些突变所产生的分子水平的变化还并不清楚，但可以认为这很可能是LRR区域的E640残基附近的带电性由负电转变为了正电从而改变了R蛋白的构象或影响了它与其它蛋白的相互作用所导致的。通过将SNC1的E640突变为R可以获得热稳定的HR(表1)，该现象进一步支持了我们的推论。
以下将对前述提到的实验的细节作进一步描述。
实验
对snc1-1(10)进行遗传筛选，以寻找高温条件下的防御响应抑制机制存在缺陷的突变体。野生型的拟南芥植株并不具有组成型的防御响应，因为这些防御响应通常会妨碍植物的生长并且有时会导致细胞死亡。拟南芥snc1-1突变体具有组成型的防御响应，并在正常生长温度22℃下还展现出因为SNC1连接区存在错义突变(10)所导致的矮生表型，这些表型在高温例如28℃下会受到抑制(7)(图1A，B)。通过筛选分离得到一种突变体int(温度不敏感)102-1，该突变体在22℃和28℃下都具有snc1-1依赖的矮化表型(图1C)。int102-1snc1-1突变体在22℃时和snc1-1一样都对番茄细菌性斑点病菌(Pst)DC3000具有抗性，但是与snc1-1不同的是它在28℃时仍然对该病毒具有抗性(图1B)。因此，该int102-1snc1-1突变体确实具有温度不敏感(热稳定的)的组成型防御响应。与前述结果相一致的是，两个响应水杨酸(SA)增加的基因PR1和SNC1(7，12)在28℃下其在int102-1snc1-1中的表达水平要比野生型或snc1-1中的表达水平来的高(图1D)，其中所述水杨酸与疾病抗性的增强有关联。突变体Int102-1snc1-1的防御表型和生长表型都会被编码SA降解酶的nahG(13)以及防御响应中的pad4(14)缺陷所抑制(图1D，E，数据未示出)，这进一步证实了突变体int102-1snc1-1在28℃下的防御响应被上调。
我们基于INT102基因紧密连锁到SNC1的特点在作图群体中对其进行了克隆(onlinemethods)。对int102-1snc1-1突变型的SNC1基因的测序结果揭示，其中的一个G到A的点突变导致了SNC1的LRR结构域中第640位氨基酸残基由谷氨酸变成了赖氨酸(称为snc1-3)(表1)。
表1.SNC1和N蛋白中分离或产生的突变
  基因  起始残基#   序列   高温条件下的HR
  SNC1 WT  639   EELD   否
  SNC1-3   EKLD   是
  SNC1 E640R   ERLD   是
  N WT  637   EYVN   否
  N Y646K   EKVN   是，弱
  N N648D   EYVD   是
N Y646K N648D EKVD 是
所示为SNC1和N蛋白的序列比对区域，其中突变的残基以下划线显示。测试了野生型和突变型的基因在28℃(对于SNC1)和30℃(对于N)下其诱导产生HR的活性。
这里将int102-1snc1-1突变体命名为snc1-4，它同时含有snc1-1和snc1-3的突变。为确认snc1-3突变是造成温度不敏感的疾病抗性表型的原因，我们进行了转基因植物实验，从而使野生型Col-0植株携带有野生型或突变型SNC1-4基因的基因组片段。但是携带野生型SNC1基因的转基因植物也展现出类似于携带SNC1-4突变型基因的转基因植物的矮生表型(数据未示出)，这种SNC1作为转基因时自动激活的现象可能是因为其缺少了位于它内源染色体位点处的转录抑制作用的缘故(15)。我们随后在烟草(Nb)中利用超敏响应(HR)制定了分析SNC1基因活性的瞬时表达试验(transient assay)，所谓超敏反应是指由于R蛋白激活所诱导的一种程序性细胞死亡的形式。SNC1蛋白在羧基末端使用绿色荧光蛋白(GFP)标记，并使用强启动子CaMV 35S进行表达。该p35S::SNC1:GFP融合基因通过农杆菌介导的渗入(农杆菌渗入法)在Nb叶子中进行表达，导入后的3天期间内分别在22℃和28℃下对HR现象进行监测，例如叶子枯萎现象。与不会引起任何HR的野生型SNC1基因(SNC1WT)不同，SNC1-1突变型基因在22℃下会诱导HR而在28℃则不诱导HR，而SNC1-3和SNC1-4基因两者在这两种温度条件下都诱发HR(图2A)。因此，snc1-3确实是引发int102-1snc1-1表型的突变。此外，单独的snc1-3突变(不含snc1-1)就足以引发温度不敏感的防御响应。该结果表明疾病抗性的温度敏感性是通过R基因而非其他成分来进行调控的，并且NB-LRR型R基因中的突变足以产生温度不敏感的疾病抗性。
为进一步研究防御响应的温度敏感性的机制，我们在热稳定的snc1-4突变体背景下进行了抑制子筛选试验。通过筛选试验得到了，一种重新获得了防御响应的高温抑制性能的突变体，并将其命名为rit(revertant of int)。这种rit1snc1-4突变体具有类似于snc1-1的表型：在22℃具有矮生表型但在28℃呈现类似野生型的表型，这表明其重新获得了温度敏感性。与生长缺陷有关联的是，该rit1snc1-4突变体在22℃时对番茄细菌性斑点病菌(Pst)DC3000具有较强的疾病抗性，但在28℃下该疾病抗性受到了抑制。在22℃下与野生型Col相比，PstDC3000在rit1snc1-4中存在和snc1-1以及snc1-4相似的生长抑制现象。而在28℃下，snc1-4展现出和22℃时相似程度的对细菌生长的抑制作用。相比之下，rit snc1-4则在28℃时失去了对细菌生长的抑制作用，并展现出与snc1-1和野生型相似程度的有助细菌生长的作用。因此rit1确实将热稳定抗性的表型反转成了热敏感的表型。
我们发现rit1是snc1-4的基因内的抑制子。在对28℃生长的rit snc1-4和野生型Col或Ler进行杂交时，在其F2代没有观察到性状分离的现象，这表明rit1与SNC1基因位置紧密连接。通过对rit1 snc1-4突变体中的整个SNC1基因组片段进行测序后鉴定出了一个G至A的点突变，该突变导致第380位氨基酸残基的甘氨酸被替换为了丝氨酸。我们将该G380S突变命名为snc1-5，将含有该新等位基因以及snc1-1，snc1-3和snc1-5突变的突变体命名为snc1-6(图3C)。该甘氨酸残基直接位于NBR-ARC结构域中被推测为GxP或GLPL基序的后面。此前的研究已经证实该基序对核酸结合非常重要，如果紧邻该基序的残基发生突变可能会使得NB-LRR蛋白(30)的活性受到影响。
在相同的rit筛选中还鉴定出了另一个基因内的抑制子，命名为rit4。该突变体与rit1相互独立，因为它是从不同的突变池中分离出来的，并且具有与防御无关的另一表型。有意思的是，我们在rit4中发现了相同的导致G380S突变的G至A突变。这两个相互独立但却产生相同rit表型的突变现象可以证实snc1-5突变确实是导致snc1-4的温度不敏感性发生回转突变的原因。
SNC1-6在Nb瞬时表达系统具有活性这一现象可以进一步支持上述结论。将snc1-5突变导入至p35S::SNC1-4:GFP构建体，产生p35S::SNC1-6:GFP。在Nb中，SNC1-4在22℃和28℃下都能够诱导HR，而SNC1-6只在22℃下诱导HR而不能在28℃下诱导HR。因此，snc1-5突变似乎可以在28℃下作为热稳定的SNC1-4活性的抑制子，而其在22℃下则不能显著地抑制SNC1-4的活性。此外，snc1-5突变在22℃下不能抑制SNC1-1活性(数据未示出)这一点则进一步支持了上述观点。
通过鉴定不同类型的可以赋予不同温度敏感性的防御响应能力的的SNC1，我们可以得出这样的结论，即NB-LRR基因SNC1是一种温度敏感性成分，其引起了其所诱导的所有防御响应的温度敏感性特点。高温条件对植物免疫力的抑制作用很可能是通过该信号通路的早期成分即NB-LRR基因来实现的。
我们进一步研究了NB-LRR类R基因SNC1温度敏感性的分子学基础。研究发现在两种温度下生长的Nb中，SNC1蛋白的细胞核定位与其诱导HR的活性存在相关性。对于SCN1WT:GFP融合蛋白，在细胞质与质膜上只检测到非常微弱的GFP信号(图2B)。使用核染料4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色证实(数据未示出)，SNC1-1:GFP突变体融合蛋白在22℃时定位在细胞核中(图2B)，但在28℃时却定位在细胞质及质膜上(图2B)。相反地，SNC1-3:GFP和SNC1-4:GFP在22℃和28℃时都定位在细胞核中(图2B)。这些SNC1蛋白的定位在拟南芥的瞬时表达系统中得到了验证。22℃下在拟南芥原生质体中进行表达时，SNC1-1:GFP，SNC1-3:GFP，和SNC1-4:GFP都主要定位在细胞核中，但SNC1WT:GFP则不是(图2C)。在28℃下，只有SNC1-3:GFP和SNC1-4:GFP定位在细胞核中，而SNC1WT:GFP和SNC1-1:GFP则不是(图3B，3C，图6)。这似乎表明温度条件对SNC1蛋白的定位产生了影响，而snc1-3突变体则可以使SNC1即使在高温条件下也定位在细胞核中。
为了确定SNC1的细胞核定位到底是产生高温下的较强防御响应的原因还是其结果，我们向SNC1:GFP融合蛋白中添加了核导出信号(NES)(16)并在Nb叶子中对这些构建体进行表达。添加NES后极大的减少了28℃下SNC1-3:GFP和SNC1-4:GFP的细胞核定位，并使得它们在细胞质和质膜上也进行表达(图5)。与SNC1-3:GFP和SNC1-4:GFP不同，SNC1-3:GFP:NES和SNC1-4:GFP:NES都没有在Nb叶子中诱导出HR(图2D)。因此，细胞核定位对于SNC1蛋白突变体在高温条件下诱导出防御响应来说是非常关键的。该发现与之前所发现的有些R蛋白的细胞核定位情况会对疾病抗性能力产生影响这一点是相一致的(17，18)。
蛋白质的细胞核-细胞质分区定位对于不同的植物发育信号以及环境响应具有至关重要的作用，已有结果表明一些参与了细胞核-细胞质穿梭过程的基因对于防御响应是必需的(19，20)。例如，MOS3(可能编码核孔蛋白Nup96)或MOS6(可能编码核转运蛋白α3)中的突变可以抑制snc1-1的疾病抗性(21，22)，虽然目前还不清楚其确切的机制。为了验证参与细胞核-细胞质转运的基因对于SNC1突变蛋白在高温下诱发防御响应而言是否必要这一点，我们进行了相关试验。分别将mos3和mos6突变引入到snc1-4突变体中，snc1-4mos3和snc1-4mos6这两个双突变在22℃和28℃下都展现出了野生型的生长表型(图3A)，这表明功能性的MOS3和MOS6对于SNC1-4在这两个温度下的活性而言是必要的。为确定MOS3和MOS6是否通过SNC1的定位来对SNC1所介导的防御响应进行调控，我们使用从野生型、mos3和mos6植株分离出的原生质体表达获得了不同形式的p35::SNC1:GFP。mos3和mos6突变对22℃时SNC1-1在野生型中的细胞核定位产生了极大的抑制作用(图3B)，这表明MOS3和MOS6可能是通过调控SNC1-1蛋白的定位来调控snc1-1介导的防御。类似地，在22℃和28℃时，野生型中SNC1-3和SNC1-4蛋白在细胞核中的定位在mos3和mos6突变体中被大大减少，而SNC1-3和SNC1-4蛋白在细胞质和质膜上的定位却得到了增加(图3C和图6)。因此，这表明SNC1-3和SNC1-4在高温下的活性需要这两个参与细胞核-细胞质转运的基因。与mos3和mos6突变不同，作用于R蛋白激活信号下游的基因PAD4的功能缺失型突变并不会改变SNC1突变蛋白的细胞核定位，虽然它也能够像mos3和mos6一样抑制snc1突变表型(图1E，3B，3C，和图6)。这些数据表明MOS3和MOS6通过调控R蛋白SNC1进而来介导SNC-1诱导的防御响应。这也进一步证明了高温条件下SNC1蛋白的核定位是引起热稳定防御响应的原因而非其结果。
为确定在拟南芥SNC1诱导的防御响应中所发现的温度敏感性现象是不是疾病抗性领域中的一个普适现象，我们向烟草R基因N中引入了和snc1-3相似的突变，所谓的N基因其可以赋予烟草针对烟草花叶病毒(TMV)的抗性。大家都知道含有N基因的植物在高于30℃的温度下会失去抗性，但却并不清楚其机理(11)。我们通过特定位点的点突变改变了N蛋白的2个氨基酸残基：一个是Y646K突变(E640K)，其对应于SNC1蛋白的snc1-3突变，另一个是N640D突变，其对应于SNC1蛋白的D642突变(表1)。当在烟草(Nb)中通过农杆菌渗入法将野生型的N基因与其诱导物p50一起进行表达时，野生型的N基因在22℃下会诱导HR但在30℃下则不会(图4A，表1)。相反地，将三个N基因突变体也就是分别含有Y646K，N648D和Y646K N648D突变的突变体，与其诱导物p50一同在Nb中进行表达时，它们会在22℃和30℃下都诱发产生HR(图4A，表1)。这些突变体并不具有组成型的自激活活性，因为在缺失p50时它们不会诱导HR(数据未示出)。因此，N基因是造成TMV抗性温度敏感性的原因，这表明其他的NB-LRR型R基因在疾病抗性中也作为温度感应器来行使功能，并且这种温度敏感性可以通过R蛋白中的特定突变来进行变化从而使得植物获得热稳定的疾病抗性。
和SNC1基因一样，我们也对N基因的温度敏感性是否与N蛋白的定位相关这一点进行了相关实验。当将其与p50在烟草中一起进行表达的时候，N-citrine融合蛋白在22℃时定位在细胞核内(图4B)，这与此前的发现是一致的(18)。但是，当植物在30℃下生长时，细胞核中没有检测到任何信号(图4B)。这表明激活的野生型R蛋白的核定位受到了温度的调节，这与突变型R蛋白如SNC1-1活化形式所受到的核定位调控类似。
R蛋白温度不敏感的突变体的作用机制目前还并没有得到完全阐明。这不仅仅是因为R蛋白的过度活化，因为在22℃下SNC1-1突变体蛋白显然和SNC1-4具有相同的活性，但其在28℃时却没有活性。SNC1的E640K突变体可以潜在地诱导局部的蛋白翻译后修饰，例如泛素化、类泛素化、乙酰化和生物素化。特别是snc1-3周围的“EKID”序列，以及snc1-1周围的“LKIG”序列被推测为类泛素化的位点(http://www.abgent.com/tools/sumoplot_login)。但是，不含Y646K突变的N蛋白中单独的N648D突变足以在高温时诱导HR，这表明类泛素化并不是产生活性的基础或者说至少不是其唯一的基础。因此，我们通过将E640R突变导入到SNC1的方式对是不是因为电荷的改变而非局部蛋白的修饰导致了温度不敏感性这一点进行了相关实验(表1)。与SNC1-3:GFP类似，在Nb中表达SNC1E640R:GFP时，其会在28℃下诱导HR，并且SNC1E640R:GFP定位在细胞核中(数据未示出)。E至K的突变以及E至R的突变都可以增加区域的正电荷，进而可能产生局部的核定位信号(23)。为测试这些突变是否产生了这样的信号以及这样的信号是否足以诱导核定位，我们构建了更短形式的SNC1:GFP蛋白，它由连接区以及SNC1蛋白的LRR结构域构成。Snc1-3和snc-1突变都不能使短形式的SNC:GFP融合蛋白具有核定位的能力(数据未示出)，这表明这些突变自身并不能够诱导SNC1的细胞核定位。
R蛋白的激活涉及分子内相互作用的改变，包括NB结构域的打开以及可能使氨基末端能够与下游的信号分子相互作用(24，25)。高温很有可能会影响分子内的相互作用并使得R蛋白处于未活化的关闭形式。蛋白3D结构模型表明，SNC1 E640以及附近的包括D642在内的一些残基能够形成带有更多负电荷的袋状结构，该袋状结构可能与ARC结构域中带正电荷的残基发生直接的接触。E640K/R突变可能会干扰LLR结构域与ARC结构域间的相互作用，从而导致在高温条件下使SNC1蛋白具有活化的构象。或者，这些突变能够改变SNC1与下游信号分子的相互作用，从而导致在高温时能够产生激活的信号事件。
上述实验结果使用了如下所述的材料和方法。
材料与方法
通过持续光照和22℃或28℃的温度条件下在土壤中生长培育获得用于形态分析和表型分析的拟南芥植株，通过12小时(hr)光照/12hr遮光的光照周期下生长培育获得用于疾病抗性实验的拟南芥植株。用于原生质体转化的拟南芥幼苗通过在光照周期为8hr光照/16hr遮光条件下在固态培养基中培养获得。烟草(Nt)和白氏烟(Nb)植株在温室中进行栽培。进行化学诱变时，snc1-1种子使用0.25％EMS(甲烷磺酸乙酯)处理12小时。克隆INT102基因时，Col-0中的int102-1snc1-1突变体通过与野生型Ws-2杂交，并使用标准的作图方法鉴定出含有INT102基因的区间(26)。构建体p35S::SNC1:GFP含有强启动子35S CaMV，SNC1编码区的基因组片段(从翻译起始位点至最后一个氨基酸)，以及框内融合到SNC1羧基末端的绿色荧光蛋白(GFP)。基因定点突变使用”QuikChange”试剂盒并根据生产商的使用说明(Stratagene)来进行。拟南芥原生质体使用培养皿培养的幼苗根据Zhai和Vatamaniuk提供的方法(发表中)进行。RNA杂交分析，病原体抗性检测，以及Nb和Nt中的瞬时表达实验使用之前所记载的方法来进行(7，27，28)。
植物材料和生长条件。用于进行形态表型分析以及基因表达分析的拟南芥植株，在22℃或28℃下、持续光照以及相对湿度保持在40％至60％之间的条件下通过有土栽培方式获得。用于原生质体转化的拟南芥幼苗通过在固态培养基中栽培获得，该培养基含有1/2MS盐、2％乳糖以及0.8％琼脂，培养的光照周期为8hr光照/16hr遮光。烟草(Nt)和白氏烟(Nb)植株在温室中栽培。
突变筛选。snc1-1种子使用0.25％EMS(甲烷磺酸乙酯)处理12小时。在28℃条件下从大约40,000M2植株(来源于4,000M1)中筛选出类似于snc1-1的矮生表型。可能的突变体随后与野生型Col-0进行杂交，对其F2代群体进行分析测定它们是否依赖于snc1-1。
图位克隆。通过Col-0系的int102-1突变体与Ws-2系的野生型杂交产生获得作图群体。从28℃下生长的F2后代中挑选出矮生植株用于作图。分离群体分组分析方法使用，含40株植物的池子利用Col-0和Ws-2间的SSLP，CAPS，和dCAPS标志物来进行(26)。发现INT102基因与距离SNC1基因1cM的标志物VRN2连锁。对240株矮生植株的进一步分析表明，INT102和SNC1间没有发生重组，这表明这两个基因紧密连锁。
生成构建体。从来自ABRC的BAC克隆体F5D3中分离出了一条5.5kb的片段，该片段含有SNC1编码区及其3’UTR。通过聚合酶链式反应(PCR)在该基因组片段SNC1终止密码子前添加了一个BamHI限制性酶切位点。含有SNC1编码区且不含终止密码子的NcoI-BamHI双酶切片段被插入到载体pSAT-N1(29)中以构建p35S::SNC1:GFP构建体。SNC1-1，SNC1-3和SNC1-4突变通过使用”QuikChange”试剂盒并参照生产商的说明书(Stratagene)来进行基因定点突变导入到p35S::SNC1:GFP中。各种p35S::SNC1:GFP的表达框使用PI-PspI酶切位点切出并克隆至pHPT双元载体(29)中，以生成pHPT-SNC1，pHPT-SNC1-1，pHPT-SNC1-3，和pHPT-SNC1-4构建体。
Nb和Nt中的瞬时表达。上述二元载体随后被转化到农杆菌菌株C58C1中(30)。转化后的农杆菌在液体LB培养基中过夜培养至OD600达到1.0。离心收集培养细胞并在诱导基质(10mM MES，pH5.7，10mM MgCl2，200μM乙酰丁香酮)中进行再悬浮处理，使其OD600为0.5。室温静置3小时后，农杆菌细胞使用1ml无针头注射器渗入到Nb或Nt叶子的叶轴侧表面。经渗入的植株随后在22℃或28℃下培养，然后在接种后48小时内使用显微镜(BX61型，Olympus)检测叶子中的GFP信号。
RNA分析。使用Tri Reagent(Molecular Research，Cincinnati，OH)提取3周龄植物叶子的总RNA。每种样品都使用总量为20微克的RNA来进行凝胶印迹分析。
病原体抗性检测。番茄细菌性斑点病菌DC3000在KB培养基中生长过夜，并在含有10mMMgCl2和0.02％Silwet L-77的溶液中进行重悬浮，使其浓度为108。两周龄的幼苗通过沾染方式接种细菌并保持接触1小时。植物中的细菌总量在沾染1小时后(0天)以及沾染3天后(3天)进行分析。取三个接种幼苗的地上部分，在同一个时间点从每个基因型从收集三个样品。幼苗在1ml 10mM MgCl2中进行研碎处理，并对研碎处理后的组织进行一系列的稀释用于测定每毫克叶组织的菌落形成单位(cfu)的数量。
遗传工程改造热稳定的疾病抗性
如前面所讨论，本发明涉及对植物的热稳定疾病抗性进行遗传工程改造，用于进行遗传工程改造的植物通常存在不耐热的种属特异的疾病抗性。本发明的改造方法通常是先生成引起种属特异抗性的NB-LRR类型R蛋白的突变体形式。或者，使用标准的方法从自然群体中鉴定和分离出突变体形式，然后将该分离出的R变体导入到植物中，使该植物在通常会屏蔽防御反应的温度下仍具有针对一种或多种病原体的疾病抗性。
这样的R变体可以用来修饰疾病抗性的温度敏感性。此外，还可以改变R蛋白的特定位点以生成特定的R蛋白，该R蛋白不仅能介导疾病抗性而且还具有热稳定性从而使植物在高于其屏蔽温度的条件下也能抵御疾病。
如之前所述，本发明还涉及一种赋予植物疾病抗性的方法，从而使植物在其疾病响应被抑制的温度下仍具有疾病抗性，从而降低了热屏蔽效应。这样的方法包括但不限于，过表达或外源表达热稳定的NB-LRR疾病抗性多肽(如SNC1-3，SNC1 E640R，N Y646K，N648D或NY738K N648D或任何图9和图10中所记载的多肽)。
为测试此处提到的构建体其赋予针对某个病原体的疾病抗性的能力，栽培可以表达这些构建体的转基因植物，并使用本领域技术人员所熟知的方法在屏蔽温度下对转基因植物和非转化的植物的疾病抗性进行比较。表达热稳定的NB-LRR多肽的植物与对照植物在对照植物的屏蔽温度下相比，其具有“更高水平的抗性”，这些植物可以用在本发明中。表达热稳定的NB-LRR多肽的的植物对植物病原体具有热稳定的防御响应，这可以通过本领域技术人员所熟知的标准方法以及本发明所述方法进行监测和评估。术语“更高的抗性水平”是指非天然存在的植物(或细胞或其种子)对致病病原体的抗性水平高于对照植物(例如，非转基因植物或野生型，或转基因植物或含有热敏感的NB-LRR多肽的野生型植物)的抗性水平。在优选的实施方式中，本发明中非天然存在的转基因植物的抗性水平要比对照植物所展现的抗性水平高出至少5％至20％(优选30％或40％)。在其他优选的实施方式中，对致病病原体的抗性水平要比对照植物高出50％，60％，更优选甚至高75％或90％；最优选高至100％或更高。例如，疾病抗性响应可在23℃，24℃，25℃，26℃，27℃，28℃，29℃，30℃，31℃，32℃，33℃，34℃，35℃下进行测定，或者在高于不表达热稳定NB-LRR疾病抗性多肽的对照植物的屏蔽温度下进行测定。抗性水平可使用传统的方法例如本申请中所记载的那些方法进行测量。例如，对某个病原体的抗性水平可通过比较其物理特性及形状(例如，植物的高度和重量)或通过比较非天然存在的植物(例如，转基因植物)的疾病症状(例如，枯斑进展变缓，枯斑尺寸减小，叶子的凋萎和卷曲，水渍出点，病原体生长的数量，以及细胞的脱色)来测量。
在一个实施例中，通过修饰N的方式来对转基因的烟草植物进行遗传工程改造从而使其展现出热稳定的防御响应，进而赋予其热稳定的疾病抗性。由此得到了转化后含有Y646K或Y646KN648D修饰的N基因的烟草。在30℃下，使用烟草花叶病毒对植物感染7天。7天后，将植物转至22℃培养并分析TMV在30℃时的扩散情况。表达含有Y646K或Y646KN648D修饰的N基因的转基因烟草与在30℃下表达野生型N基因的对照烟草植物相比，其表现出对TMV的抗性。
本发明还涉及使热敏感的NB-LRR抗性基因具有热稳定性的方法。这通常涉及(1)鉴定热敏感的NB-LRR型R基因，(2)将Rs基因的蛋白质序列与SNC1和N基因的蛋白质序列进行比对，以鉴定与SNC1热稳定结构域一致的LLR结构域；(3)通过基因定点突变方式将snc1-3的同源突变引入到Rs基因；以及(4)分析其温度敏感性。
1)鉴定引起针对特定病原体抗性的NB-LRR型R基因。
对于热敏感的疾病抗性，首先鉴定出决定该抗性的R基因(这里被表示为Rs)。可以通过很多本领域公知的方法来进行鉴定，例如，通过位图克隆寻找该植物不同种系中的天然变体。现有技术已经提供了许多Rs基因(参见图8和9)。也可以使用数据库来鉴定Rs基因(见图8和9)。克隆和分离Rs的方法可以使用本领域所公知的标准方法来进行。
2)将Rs蛋白序列与SNC1和N蛋白序列进行比对以鉴定相应的SNC1 E640氨基酸残基。
多数可以用来进行蛋白质序列比对的的序列分析程序都可以用在此处。例如，NCBI的“Blast2”程序可以用来比对两条序列，Vector NTI可以比对2条或者多条序列。NB-LRR蛋白在N末端具有CC或者TIR结构域，在中部具有ARC-linker结构域，在其C末端具有LRR结构域。不同R蛋白的ARC-linker结构域和LRR结构域通常具有很高的序列相似度，可以容易地进行匹配。
3)使用基因定点突变将snc1-3的同源突变导入到Rs基因中。
将Rs蛋白中相应的SNC1 640ELD区域的序列改变为KLD。这可以通过使用很多公司出售的定点突变试剂盒实现。例如，Invitrogen公司的“Quick-change”试剂盒，其使用一对含所需突变的互补引物进行聚合酶链式反应(PCR)来替换野生型的序列。对突变的Rs基因进行测序以确证引入到Rs蛋白的是所需的突变而不是其他突变。
4)测试突变后的Rs基因的温度敏感性。
对Rs基因进行瞬时表达实验以分析它们的活性(如对于N和SNC1)，该分析可用于检测突变的Rs基因在高温时是否提供了疾病抗性。对不进行瞬时表达实验的Rs基因，则使用步骤6中的方法来对其进行操作。该分析包括通过农杆菌将病原体诱导物基因以及植物Rs基因共同渗入到烟草中，然后监测不同温度下的超敏反应(HR)。如果突变体的Rs基因在高温下诱导了HR，而野生型的Rs基因没有，则说明突变体的基因确实获得了热稳定性。如果不具有这样的活性，则再进行以下筛选来寻找这样的突变。
5)分离Rs基因中的热稳定突变
例如，通过随机突变产生Rs基因的突变体文库。这可以通过标准技术来实现，例如，通过使用X11-red细胞的错误倾向PCR或错误倾向X11-red复制来实现。对编码连接区和LRR结构域的DNA片段进行这样的突变，从而使每个片段中的0.1-0.5％的核苷酸片段被改变。将这些突变片段与剩下的Rs基因连接起来从而重建全长的Rs基因。Rs基因的其他区域也可以突变，包括N末端的CC或TIR结构域和ARC-linker结构域。通常来说，Rs基因的任意区域都可以进行突变生成有用的突变文库以用于分析。含有这些突变的Rs基因的文库随后根据标准方法进行筛选以鉴定出前述步骤4中提到的在高温下可以引起HR的活性的突变。
6)如果无法对Rs基因的活性进行瞬时表达分析，则可以将突变的Rs基因或者突变Rs基因的文库转化到易感染疾病的植物以及转基因植物中，然后再分析它们在高温条件下的疾病抗性。通过本申请中所述的方法可以鉴定和筛选得到具有热稳定抗性的突变体。
本发明还涉及以下几个方面：
1)繁殖具有热稳定抗性的植物
植物种属间的差异(野生品种或栽培品种)为R基因的变化提供了来源。与其它基因相比，NB-LRR基因是拟南芥中中演化最迅速的基因(37)，这在其它植物品种也很有可能是这样的。通过Rs基因的突变演化，一个特定的品种有可能被演化成具有热稳定的疾病抗性。相应地，本发明提供了一种快速筛选这样的R基因品种的方法以帮助植物育种。
随后使用PCR对来自不同植物品种的Rs基因的连接区域和LRR区域进行扩增。对于赋予热稳定抗性的植物品种而言，在相应于SNC1的640E位点处带有正电荷残基(K，R，或H)的Rs基因是是比较好的候选物。可以直接在高温条件下对这些品种的疾病抗性进行测试。
当找到了具有热稳定抗性的Rs突变体后，通过杂交两个品种的方式将Rs突变体导入到作物中，并在标志物协助筛选的方式下从F2群体中分离出具有最多原种性状和Rs突变体的品种。
其他在作物植物中用遗传工程改造热稳定防御响应的实例包括如下。为了使大麦具有热稳定的防御响应以抵御白粉病菌(Blumeria graminis)引起的白粉病，对R基因例如Mla1和Mla6进行修饰以使其分别表达具有Y613K G615D和V636K的多肽(相对于野生型R多肽)。在玉米中，相比于野生型R多肽，对R基因例如Rp1-D和Rp3进行如下修饰：修饰A676KE678D和A613K H615D以生成具有抗性的多肽，该多肽可以抵御锈病菌(Puccinia sorghi)引起的叶锈病。可以表达修饰的NB-LRR多肽(Xa1：E1086K E1088D)的水稻植物可以产生热稳定的防御响应以抵御水稻白叶枯病菌(Xanthamonas oryzae)引起的白叶枯病。与野生型的相比，对水稻抗性基因Pi-b进行修饰使其表达具有Y1130K S1132D突变的NB-LRR多肽，从而使得其可以抵御稻瘟菌(Magnaporthe grisea)引起的稻瘟病。可以通过如下方式对Lr21蛋白进行修饰，从而使得小麦针对小麦叶锈菌(puccinia triticina)引起的小麦叶锈病具有热稳定的防御响应：M967K N969D。白粉病菌引起的小麦白粉病可以通过表达如下突变的Pm3多肽来进行抵御：V628K。马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)是一种导致马铃薯晚疫病的真菌类病原体。通过修饰转基因马铃薯中的马铃薯R基因例如R1(Q1203K)可有效的抵御马铃薯晚疫病。在另一实施例中，表达Cf-2(F243K F245D)的转基因番茄能够抵御叶霉病菌(Cladosporium fulvum)所引起的叶霉病。图11总结了上述在各种植物中为抵御各种病原体而对野生型多肽所进行的修饰。图11还示出了R基因与SNC1的序列比对。
虽然本发明为了说明之目的而进行了详细的描述，但是应当理解，这些描述只是为了对本发明进行说明，本领域的技术人员在不偏离本发明精神和范围的前提下可以多本发明进行各种变化，本发明的保护范围由权利要求书限定。
其他实施方式
本发明提供了鉴定、分离、以及使用编码NB-LRR疾病抗性多肽的核酸分子的方法，所述NB-LRR疾病抗性多肽包含有热稳定的LRR亚结构域。
这种多肽含有(a)核苷酸结合结构域(NB)以及(b)富亮氨酸重复(LRR)结构域，其中该LRR结构域包含有赋予植物针对植物病原体的热稳定的防御响应能力的亚结构域。所述多肽包括各种源自特定NB-LRR多肽的衍生多肽，该特定多肽可以通过各种操作方式从而获得各种衍生的多肽，例如，在天然蛋白质的N末端和/或C末端删除(所谓的截取)或添加一个或者多个氨基酸；在天然蛋白质的一个或多个位点删除或添加一个或多个氨基酸；或者在NB-LRR多肽的一个或多个位点替换一个或多个氨基酸。这样的变体可以通过例如人工操作方式来获得。这些操作方法通常已为本领域技术人员所知。例如，多肽氨基酸序列的变体可通过对其相应的DNA进行突变来获得。用于进行突变以及核酸序列改变的方法已为本领域技术人员所知。本领域已经公开了一些技术用来进行合适的氨基酸替换而不会对目的蛋白的生物学活性产生影响。优选的为保守替换，例如将一个氨基酸替换成具有相似性质的氨基酸。
本发明中的NB-LRR多肽基因以及核酸序列既包括天然存在的序列，也包括其突变形式。类似地，NB-LRR多肽既包括天然存在的蛋白质，也包括其变体及修饰形式。这些体仍然具有所需要的活性。本发明中所包含的对NB-LRR多肽序列进行的删除、插入以及替换应不会对多肽的性质产生根本上的改变。当然，当在进行替换、删除或者插入之前很难预测这些改变的确切效果，但是本领域的技术人员应当知道这些效果可以通过本申请所提到过的那些常规筛选分析手段来进行评估。
可以对这些核酸分子进行优化处理以增强其在植物中的表达。这样，这些基因或基因片段可以使用本领域所公知的方法以植物偏好的密码子进行合成。应当理解基因的整体或者其任意片段都可以进行优化或合成。也就是说可以采用合成的或者部分优化的序列。核酸序列以及蛋白质的变体也包括通过突变和重组技术衍生获得的变体，例如通过DNA改组技术得到的序列和蛋白质。通过使用这样的技术，可以对一种或者多种不同的编码序列进行操控从而产生新的具有所需性质的多肽。通过这种方式，可以从相关序列的多核苷酸群体生成重组多聚核苷酸文库，所述相关序列的多核苷酸包括具有基本上的序列一致性并且可以在体外或者体内同源重组的序列区域。这样的DNA改组策略已为本领域所公知。
术语“变体”是指基本相似的序列。对于核酸序列来说，变体包括因为存在简并遗传密码子所以可以编码与参照蛋白相同氨基酸序列的核苷酸序列。天然存在的等位基因变体可以使用公知的分子生物学技术来进行鉴定，如聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术。变体核苷酸序列还包括通过合成手段获得的核苷酸序列，例如那些通过特定位点点突变技术对参照蛋白的编码序列以及对编码具有氨基酸替换的多肽的序列进行突变所获得的核苷酸序列。一般来说，本发明的核苷酸序列变体和天然核苷酸序列相比具有至少40％，50％，60％，优选70％，更优选80％，甚至更优选90％，最优选99％的序列一致性，以及前面所列百分数档内的各个百分数。例如，40％，41％，42％，或者达到至少90％档的百分数。变体还可以包括与鉴定出的基因片段相对应的全长基因。
本发明的保护范围也包括，与本申请记载的编码含有热稳定LRR亚结构域的NB-LRR多肽的核酸分子具有基本一致序列的核酸分子(例如，SNC1-3，SNC1 E640R，N Y646K，或NY646K N648D多肽或者图10中记载的任意多肽)。
术语“基本一致”是指与对照氨基酸序列或核酸序列相比具有至少40-50％，优选85％，更优选90％，最优选95％同源性的多肽或者核苷酸。对多肽而言，比对序列的长度通常是至少16个氨基酸，优选至少20个氨基酸，更优选至少25个氨基酸，最优选至少35个氨基酸。对核酸而言，比对序列的长度通常是至少50个核苷酸，优选至少60个核苷酸，更优选至少75个核苷酸，最优选至少110个核苷酸。通常，核苷酸序列与NB-LRR核苷酸序列(或者多肽)的一致性至少为40％，50％，60％，优选70％，更优选80％，甚至更优选90％，最优选99％，以及前面所列百分数档内的各个百分数。例如，20％，25％，30％，35％，40％，41％，42％等，或者达到至少90％档的百分数。
序列一致性通常使用序列分析软件(例如University of Wisconsin Biotechnology Center，1710 University Avenue，Madison，Wis.53705提供的Sequence Analysis Software Package of theGenetics Computer Group软件)来进行测定。这种软件通过对各种替换、删除以及其他修饰设定同源度值来匹配相似的序列。保守替换通常包括以下组之间的替换：甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；以及苯丙氨酸，酪氨酸。对于序列比较，通常使用一条序列作为参照序列，另一条序列作为测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法的时候，先将测试序列和对照序列输入到计算机中，如有必要，可以设定子序列坐标，然后再设定序列算法程序的参数。序列比较算法然后基于设定的程序参数来计算测试序列相对于参照序列的序列一致性百分比。
可用于本发明中作为编码热稳定NB-LRR多肽的核酸序列来源以及用来作为分离出的核酸分子进行转化的受体的植物细胞优选包括，具有农艺、园艺、装饰、经济或商业价值的植物，更优选的植物细胞包括但不限于来自以下组的植物细胞：洋槐，苜蓿，苹果，茴香，苹果，杏，洋蓟，芝麻菜，芦笋，鳄梨，香脂杨，香蕉，大麦，豆类，甜菜，美洲黑杨，黑莓，蓝莓，椰菜，芽甘蓝，卷心菜，改良油菜籽，香瓜，胡萝卜，木薯，蓖麻，花椰菜，芹菜，樱桃，菊苣，香菜，柑橘，克莱门柑，三叶草，椰子，咖啡，玉米，棉花，黄瓜，花旗松，茄子，苣荬菜，莴苣，桉树，小茴香，无花果，亚麻，四季豆，大蒜，葫瓜，葡萄，葡萄柚，蜜瓜，野生稻，日本米，豆薯，奇异果，生菜，韭菜，柠檬，青柠，火炬松，亚麻籽，芒果，玉蜀黍，甜瓜，蘑菇，油桃，坚果，燕麦，油棕，油菜，秋葵，橄榄，洋葱，橙子，香瓜，棕榈树，木瓜，欧芹，牛蒡，豌豆，桃，花生，梨，胡椒，柿子，松，菠萝，芭蕉，李子，石榴，白杨，马铃薯，南瓜，柑橘，放射松，大豆，菠菜，西葫芦，草莓，甜菜，甘蔗，向日葵，地瓜，枫香，橘子，茶，烟草，番茄，黑小麦，草皮，芜菁，葡萄树，西瓜，小麦，山药，以及小胡瓜。
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Figure IPA00001423335500011
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Claims (40)

1.分离的核酸分子，其所含的核苷酸序列编码的多肽包括：
(a)核苷酸结合(NB)结构域；以及
(b)富亮氨酸重复(LRR)结构域，其中所述多肽赋予针对植物病原体的热稳定防御响应。
2.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述LRR结构域包含赋予所述热稳定防御响应的亚结构域。
3.根据任一上述权利要求所述的核酸分子，其中所述核酸分子被可操作的连接到可以驱使其在植物细胞中进行表达的启动子上。
4.根据任一上述权利要求所述的核酸分子，其中所述启动子是组成型启动子，诱导型启动子，或组织特异性启动子。
5.根据任一上述权利要求所述的核酸分子，其中所述组织特异性启动子是根特异性启动子，叶特异性启动子或种子特异性启动子。
6.根据任一上述权利要求所述的核酸分子，其中所述核酸分子是合成的。
7.根据任一上述权利要求所述的核酸分子，其中所述核苷酸序列的密码子使用偏性被优化成适于在植物或植物成分中进行表达。
8.根据任一上述权利要求所述的核酸分子，其中所述赋予针对植物病原体的热稳定防御响应的LRR亚结构域包括，E/L(K或R)LD基序或者E/L(K或Y)LV(N或D)基序。
9.根据任一上述权利要求所述的核酸分子，其中所述多肽是SNC1-3，SNC1 E640R，NY646K，或者NY646K N648D多肽。
10.根据任一上述权利要求所述的核酸分子，其中所述多肽是SNC1的同源物，其中该同源物包含有所述赋予针对植物病原体的热稳定防御响应的LRR亚结构域。
11.根据任一上述权利要求所述的核酸分子，其中所述多肽记载在图9、图10或图11中。
12.根据任一上述权利要求所述的核酸分子，其中所述多肽是N的同源物，其中该同源物包含有所述赋予针对植物病原体的热稳定防御响应的LRR亚结构域。
13.含有任一上述权利要求所述的核酸分子的载体。
14.含有任一上述权利要求所述的核酸分子的细胞。
15.含有任一上述权利要求所述的核酸分子的植物或植物成分。
16.赋予植物或植物成分针对病原体抗性的方法，该方法包含以下步骤：
(a)用权利要求1-12中任一项所述的核酸分子转化植物细胞，所述核酸分子编码的多肽包含：
(i)核苷酸结合(NB)结构域；以及
(ii)富亮氨酸重复(LRR)结构域，其中所述多肽赋予针对植物病原体的热稳定防御响应；以及
(b)通过所述转化后的植物细胞再生植物或植物成分，其中所述植物展现出针对所述病原体的抗性。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述LRR结构域包含有赋予所述热稳定防御响应的亚结构域。
18.根据上述任一权利要求所述的方法，与相应的对照植物相比，所述表达热稳定的NB-LRR多肽的植物或植物成分在所述对照植物或对照植物成分的屏蔽温度下具有更高的抗性水平。
19.根据任一上述权利要求所述的方法，其中所述核苷酸序列被可操作的连接到可以驱使其在植物细胞中进行表达的启动子上。
20.根据任一上述权利要求所述的方法，其中所述启动子是组成型启动子，诱导型启动子，或组织特异性启动子。
21.根据任一上述权利要求所述的方法，其中所述组织特异性启动子是根特异性启动子，叶特异性启动子或种子特异性启动子。
22.根据任一上述权利要求所述的方法，其中所述核酸分子是合成的。
23.根据任一上述权利要求所述的方法，其中所述核苷酸序列的密码子使用偏好被优化成适于其在植物或植物成分中进行表达。
24.根据任一上述权利要求所述的方法，其中所述赋予针对植物病原体的热稳定防御响应的LRR亚结构域包括，E/L(K或R)LD基序或者E/L(K或Y)LV(N或D)基序。
25.根据任一上述权利要求所述的方法，其中所述核酸分子通过育种导入。
26.根据任一上述权利要求所述的方法，其中所述核酸分子通过转化导入。
27.根据任一上述权利要求所述的方法，其中所述植物或植物成分是单子叶植物或双子叶植物。
28.根据任一上述权利要求所述的方法，其中所述病原体是细菌，昆虫，线虫，真菌或病毒性病原体。
29.基本上纯的多肽，其包含：
(a)核苷酸结合(NB)结构域；以及
(b)富亮氨酸重复(LRR)结构域，其中所述多肽赋予针对植物病原体的热稳定防御响应。
30.根据权利要求29所述的多肽，其中所述LRR结构域包含有赋予所述热稳定防御响应的亚结构域。
31.根据任一上述权利要求所述的多肽，其中当该多肽在植物中进行表达时其定位在植物的细胞核中。
32.根据任一上述权利要求所述的多肽，其中所述赋予针对植物病原体的热稳定防御反应的LRR亚结构域包括，E/L(K或R)LD基序或者E/L(K或Y)LV(N或D)基序。
33.根据任一上述权利要求所述的多肽，其中该多肽是SNC1-3，SNC1 E640R，NY646K，或N Y646K N648D多肽。
34.根据任一上述权利要求所述的多肽，其中该多肽是SNC1的同源物，其中所述同源物含有所述赋予针对植物病原体的热稳定防御响应的LRR亚结构域。
35.根据任一上述权利要求所述的多肽，其中该多肽记载在图9、图10或图11中。
36.根据任一上述权利要求所述的多肽，其中该多肽是N的同源物，其中所述同源物含有所述赋予针对植物病原体的热稳定防御响应的LRR亚结构域。
37.一种植物或植物成分，其含有基本上纯的多肽，该多肽包含：
(a)核苷酸结合(NB)结构域；以及
(b)富亮氨酸重复(LRR)结构域，其中所述多肽赋予针对植物病原体的热稳定防御响应。
38.根据权利要求37的植物或植物成分，其中所述LRR结构域包含有赋予所述热稳定防御响应的亚结构域。
39.包含有基本上纯的多肽的植物或植物成分的应用，该多肽含有：
(a)核苷酸结合(NB)结构域；以及
(b)富亮氨酸重复(LRR)结构域，其中所述多肽赋予针对植物病原体的热稳定防御响应。
40.根据权利要求39所述的植物或植物成分的应用，其中所述LRR结构域包含有赋予所述热稳定防御响应的亚结构域。
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