CN114938779B - 一种以小花为外植体建立姜荷花再生体系的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种以小花为外植体建立姜荷花再生体系的方法，包括以下步骤：以姜荷花小花为外植体，接种到不定芽诱导培养基中，培养直至产生不定芽，不定芽诱导培养基是在MS培养基中添加蔗糖、卡拉胶、以及植物生长调节剂TDZ；然后将诱导的不定芽转至增殖培养基中进行培养，增殖培养基是在MS培养基中添加蔗糖、卡拉胶以及植物生长调节剂TDZ和NAA；培养至增殖后，将姜荷花苗在水中培养炼苗后直接进行移栽，然后按常规苗进行水肥管理。本发明提供了适合姜荷花小花建立再生的培养条件，建立姜荷花小花再生不定芽体系和增殖体系，为姜荷花组织培养快速繁殖和育种研究提供了技术支持。

Description

一种以小花为外植体建立姜荷花再生体系的方法
技术领域
本发明属于组织培养繁殖领域，具体其涉及一种以小花为外植体建立姜荷花再生体系的方法。
背景技术
姜荷花(Curcuma alismatifolia)适用于盆栽、切花以及园林应用等，近年来市场在不断发展扩大。姜荷花为国外引进品种，在国内发展过程中的制约因素之一是种苗。姜荷花是球根花卉，单靠传统的分球繁殖，繁殖系数低，完全不能满足市场发展的需要。因此通过建立姜荷花再生体系的方法，为姜荷花组织培养快速繁殖提供新途径，对姜荷花产业的发展具有重要意义。目前已报道的研究中，尚未见以姜荷花小花为外植体建立再生体系的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以小花为外植体建立姜荷花再生体系的方法，为姜荷花种苗繁育以及未来转基因体系的建立提供技术支持。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种以小花为外植体建立姜荷花再生体系的方法如下：
1)在姜荷花小花即将开放或开放1朵时将花枝采下，取上部花序部分，用75％酒精消毒5min后，加2％次氯酸钠和0.1‰-0.2‰的吐温消毒7-8min，无菌水冲洗1次后，加2％次氯酸钠消毒7-8min，无菌水冲洗3-4次后置于灭菌纸上备用；
2)将清理干净的姜荷花在无菌纸上切去苞片，将每片苞片内小花成簇切下，以小花为外植体，接种到不定芽诱导培养基中，置于25℃±1℃，光照14±0.5h/d，光强3000-5000LX条件下进行培养，根据品种材料不同，在30-40d即有不定芽产生；
所述不定芽诱导培养基由基础培养基和植物生长调节剂组成，制备方法为：在MS培养基中添加30g/L蔗糖和6.5g/L卡拉胶，得到基础培养基，然后添加0.5mg/L的TDZ，最后将培养基的酸碱度调节至5.8；
3)将步骤2)诱导的不定芽转至增殖培养基中，置于25℃±1℃，光照14±0.5h/d，光强3000-5000LX条件下进行培养；
所述增殖培养基由基础培养基和植物生长调节剂组成，制备方法为：在MS培养基中添加30g/L蔗糖和6.5g/L卡拉胶，得到基础培养基，然后添加0.2mg/L TDZ和NAA 0.2mg/L，培养基的酸碱度调节至5.8；
4)增殖后不需要另外进行生根培养，将姜荷花苗开盖洗净培养基，在水中培养炼苗3-5d，炼苗后直接进行移栽，然后按常规苗进行水肥管理。
本发明提供了适合姜荷花小花建立再生的培养条件，建立姜荷花小花再生不定芽体系和增殖体系，为姜荷花组织培养快速繁殖和育种研究提供了技术支持，其有益效果在于：
1.由MS培养基+0.5mg/L TDZ+30g/L蔗糖+卡拉胶6.5g/L组成的诱导培养基可以诱导姜荷花小花产生不定芽，不同姜荷花材料均能诱导出不定芽，诱导率71.4％-100％。
2.姜荷花不定芽适宜在MS培养基+TDZ 0.2mg/L+NAA 0.2mg/L+卡拉胶6.5g/L中继代增殖，增殖系数达4以上。
3.本方法不需要另外进行生根培养，增殖后的姜荷花苗根系旺盛，可炼苗后直接进行移栽。
附图说明
图1为姜荷花小花诱导形成不定芽。
图2为姜荷花增殖后组培苗。
具体实施方式
实施例1不定芽诱导培养基的选择
培养基不同，植物植物生长调节剂浓度组合对姜荷花小花进行不定芽诱导，基础培养基为：MS培养基+卡拉胶6.5g/L。
表1不同植物生长调节剂浓度组合对诱导种子愈伤的影响
本实施例中，各组培养基均能诱导出不定芽，但诱导的效率不同。在蔗糖含量为30g/L的情况下，TDZ浓度从0.3mg L-1升到0.5mg L-1时，小花不定芽的诱导率从67.1％提高到89.6％，在TDZ浓度均为0.5mg L-1时，蔗糖浓度为20g/L时，不定芽诱导率为83.3％，因此TDZ浓度以0.5mg L-1为宜，蔗糖浓度以30g/L为宜；以此培养基在其他两个姜荷花材料中的诱导率分别为71.4％和100％，均具有较高的诱导率。姜荷花小花诱导产生的不定芽如图1所示，在不定芽形成早期即有发根，不定芽旺盛，且数量多。
实施例2
增殖培养基的选择
本实施例考察了不同培养基对姜荷花不定芽继代增殖的影响，基础培养基为：MS培养基+卡拉胶6.5g/L。
表2不同培养基对不同姜荷花品种的增值系数
材料 MS 6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L TDZ 0.2mg/L+NAA 0.2mg/L
1 2.5B 2.7B 4.7A
2 2.6b 2.7b 4.2a
3 3.1B 3.4B 5.3A
4 1.7b 2.5b 4.2a
5 1.7B 2.3B 5.5A
注：不同字母表示同一材料不同培养基间增值系数显著性差异.小写字母表示显著水平P<0.05；大写字母表示显著水平P<0.01。
本实施例中，对5个不同姜荷花材料的不定芽进行增殖继代，以普通MS培养基为对照，在含有植物生长调节剂TDZ 0.2mg/L+NAA 0.2mg/L的培养基中，不定芽增殖系数为4.2-5.5，比含有植物生长调节剂6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L的培养基(增殖系数为2.3-3.4)和普通MS培养基(增值系数为1.7-3.1)高，且均达到显著水平。经过增殖继代的苗子长势良好，根系旺盛粗壮(图2)。
在确定了不定芽诱导培养基和增殖培养基后，以下通过实施例3-5进一步详细说明本发明提供的一种以小花为外植体建立姜荷花再生体系的方法。
实施例3
一种以小花为外植体建立姜荷花再生体系的方法，包括以下步骤：
1)在姜荷花小花即将开放或开放1朵时将花枝采下，取上部花序部分，用75％酒精消毒5min后，加2％次氯酸钠和0.1‰的吐温消毒8min，无菌水冲洗1次后，加2％次氯酸钠消毒8min，无菌水冲洗4次后置于灭菌纸上备用。
2)将清理干净的姜荷花在无菌纸上切去苞片，将每片苞片内小花成簇切下，以小花为外植体，接种到不定芽诱导培养基中，置于24℃，光照13.5h/d，光强3000LX条件下进行培养，直至不定芽产生；
所述不定芽诱导培养基由基础培养基和植物生长调节剂组成，制备方法为：在MS培养基中添加30g/L蔗糖和6.5g/L卡拉胶，得到基础培养基，然后添加0.5mg/L的TDZ，最后将培养基的酸碱度调节至5.8；
3)将步骤2)诱导的不定芽转至增殖培养基中，置于24℃，光照13.5h/d，光强3000LX条件下进行培养；
所述增殖培养基由基础培养基和植物生长调节剂组成，制备方法为：在MS培养基中添加30g/L蔗糖和6.5g/L卡拉胶，得到基础培养基，然后添加0.2mg/L TDZ和NAA 0.2mg/L，培养基的酸碱度调节至5.8。
4)增殖后不需要另外进行生根培养，将姜荷花苗开盖洗净培养基，在水中培养炼苗3d，炼苗后直接进行移栽，然后按常规苗进行水肥管理。
实施例4
一种以小花为外植体建立姜荷花再生体系的方法，包括以下步骤：
1)在姜荷花小花即将开放或开放1朵时将花枝采下，取上部花序部分，用75％酒精消毒5min后，加2％次氯酸钠和0.2‰的吐温消毒78min，无菌水冲洗1次后，加2％次氯酸钠消毒7min，无菌水冲洗3次后置于灭菌纸上备用。
2)将清理干净的姜荷花在无菌纸上切去苞片，将每片苞片内小花成簇切下，以小花为外植体，接种到不定芽诱导培养基中，置于26℃，光照14.5h/d，光强5000LX条件下进行培养，直至不定芽产生；
所述不定芽诱导培养基由基础培养基和植物生长调节剂组成，制备方法为：在MS培养基中添加30g/L蔗糖和6.5g/L卡拉胶，得到基础培养基，然后添加0.5mg/L的TDZ，最后将培养基的酸碱度调节至5.8；
3)将步骤2)诱导的不定芽转至增殖培养基中，置于26℃，光照14.5h/d，光强5000LX条件下进行培养；
所述增殖培养基由基础培养基和植物生长调节剂组成，制备方法为：在MS培养基中添加30g/L蔗糖和6.5g/L卡拉胶，得到基础培养基，然后添加0.2mg/L TDZ和NAA 0.2mg/L，培养基的酸碱度调节至5.8。
4)增殖后不需要另外进行生根培养，将姜荷花苗开盖洗净培养基，在水中培养炼苗5d，炼苗后直接进行移栽，然后按常规苗进行水肥管理。
实施例5
一种以小花为外植体建立姜荷花再生体系的方法，包括以下步骤：
1)在姜荷花小花即将开放或开放1朵时将花枝采下，取上部花序部分，用75％酒精消毒5min后，加2％次氯酸钠和0.15‰的吐温消毒7min，无菌水冲洗1次后，加2％次氯酸钠消毒8min，无菌水冲洗3次后置于灭菌纸上备用。
2)将清理干净的姜荷花在无菌纸上切去苞片，将每片苞片内小花成簇切下，以小花为外植体，接种到不定芽诱导培养基中，置于25℃，光照14h/d，光强4000LX条件下进行培养，直至不定芽产生；
所述不定芽诱导培养基由基础培养基和植物生长调节剂组成，制备方法为：在MS培养基中添加30g/L蔗糖和6.5g/L卡拉胶，得到基础培养基，然后添加0.5mg/L的TDZ，最后将培养基的酸碱度调节至5.8；
3)将步骤2)诱导的不定芽转至增殖培养基中，置于25℃，光照14h/d，光强4000LX条件下进行培养；
所述增殖培养基由基础培养基和植物生长调节剂组成，制备方法为：在MS培养基中添加30g/L蔗糖和6.5g/L卡拉胶，得到基础培养基，然后添加0.2mg/L TDZ和NAA 0.2mg/L，培养基的酸碱度调节至5.8。
4)增殖后不需要另外进行生根培养，将姜荷花苗开盖洗净培养基，在水中培养炼苗4d，炼苗后直接进行移栽，然后按常规苗进行水肥管理。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (1)

1.一种以小花为外植体建立姜荷花再生体系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）在姜荷花小花即将开放或开放1朵时将花枝采下，取上部花序部分，用75%酒精消毒5min后，加2%次氯酸钠和0.1‰-0.2‰的吐温消毒7-8min，无菌水冲洗1次后，加2%次氯酸钠消毒7-8min，无菌水冲洗3-4次后置于灭菌纸上备用；
2) 将清理干净的姜荷花在无菌纸上切去苞片，将每片苞片内小花成簇切下，以小花为外植体，接种到不定芽诱导培养基中，置于25℃±1℃，光照14±0.5 h/d，光强3000-5000LX条件下培养30-40天，直至产生不定芽；
所述不定芽诱导培养基的制备方法为：在MS培养基中添加30 g/L蔗糖和6.5g/L卡拉胶，得到基础培养基，然后添加0.5mg/L的TDZ，最后将培养基的酸碱度调节至5.8;
3）将步骤2)诱导的不定芽转至增殖培养基中，置于25℃±1℃，光照14±0.5 h/d，光强3000-5000LX条件下进行培养；
所述增殖培养基的制备方法为：在MS培养基中添加30 g/L 蔗糖和6.5g/L卡拉胶，得到基础培养基，然后添加0.2 mg/L TDZ 和NAA 0.2 mg/L，最后将培养基的酸碱度调节至5.8;
4) 培养至增殖后，将姜荷花苗在水中培养炼苗3-5d，炼苗后直接进行移栽，然后按常规苗进行水肥管理。
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