CN113575334B - 基于器官直接发生途径的半夏快速繁殖方法 - Google Patents

基于器官直接发生途径的半夏快速繁殖方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于器官直接发生途径的半夏快速繁殖方法，属于无性繁殖技术领域，该方法选取健康无病害的半夏块茎作为母体，除去泥土杂质，清洗，自然晾干；采用酒精、双氧水和次氯酸钠溶液对半夏块茎进行浸泡灭菌；半夏块茎切块；将半夏块茎切块在植物生长调节剂溶液中浸泡后，再采用防腐剂溶液浸泡后，直接作为人工种子进行种植；本发明证明了通过切块繁殖直接诱导半夏再生的可行性，既克服了传统繁殖方法存在的繁殖周期长、繁殖系数低的缺点，也避免了组培方法的复杂程序和高成本，该方法获得的半夏切块可以直接作为人工种子，且方法安全，简便易行，并可以规模化生产，是半夏种子生产的一种有效途径。

Description

基于器官直接发生途径的半夏快速繁殖方法
技术领域
本发明涉及无性繁殖技术领域，特别是涉及一种基于器官直接发生途径的半夏快速繁殖方法。
背景技术
半夏(Pinellia ternata(Thunb.)Breit.)是天南星科多年生的药用植物，喜温和湿润气候和隐蔽的环境。《中国药典》中收录的半夏，以干燥块茎入药，是一种重要的中药材，半夏块茎含挥发油、烟碱、谷氨酸、谷甾醇等化学成分。具有降逆止吐、燥湿化痰、消痞散结等功能，多用于治疗痰喘咳、恶心呕吐、眩晕等。由于其良好的应用价值受到国内外各界人士的广泛关注，长期以来，市场上半夏始终处于供不应求的状态，市场价格不断攀升。
半夏产区在我国各地均有，主产于四川、湖北、江苏等地，虽然半夏资源分布广泛，但由于环境破坏及人们滥开滥采，野生资源已濒临枯竭；而传统的人工栽培育种，周期长，繁殖系数不高，再加上受到病毒的侵害，导致药材出现产量不足，质量不高，药效减弱等情况。组织培养技术的使用虽然在半夏人工种子生产方面提供了可行方案，通过组培方法快繁半夏种苗的方法主要集中于外植体、培养条件和培养基、再生途径方面。半夏组织培养中常用的半夏材料有叶片、叶柄、块茎和珠芽。夏海武(1994)在半夏不同生长时期分别取叶片、叶柄和块茎进行培养，发现早期取材诱导效果较好。万美亮等(1995)的研究表明叶柄诱导效果最好，叶片次之，二者皆启动快，诱导率可达90％；而块茎、珠芽较差。半夏植株再生途径有两种：器官途径和胚状体途径。朱忠荣(1991)等用叶柄和块茎切块进行培养，过程中不出现明显的愈伤组织，而是直接从外植体表面产生多个球状体，然后由球状体上方长绿芽，下方长出根。何奕昆(1994)等将叶柄接在分化培养基上，可直接产生小块茎或小鳞茎,进而分化出完整植株。在某些情况下也可经过愈伤阶段形成再生苗。以上研究为半夏组培快繁奠定了基础，可利用半夏叶柄、叶片、珠芽和块茎作为外植体进行培养，最终均可获得完整植株。但这些方法均需要将半夏外植体培育出小芽或幼株后，再移栽到土地中，使得这些研究大部分处在实验室阶段，而且存在设备昂贵、成本高、操作复杂、技术要求高等问题，以及在栽培过程中遇到各种病虫害问题，这些问题限制了其在半夏生产实践中的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于器官直接发生途径的半夏快速繁殖方法，以解决上述现有技术存在的问题，该方法优化了半夏块茎切块繁殖方法，可直接将处理后的半夏块茎种植于大田中，方法简便易行，易于规模化生产，且所收获的块茎药用活性成分含量与野生组没有显著差异。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种基于器官直接发生途径的半夏快速繁殖方法，包括以下步骤：
(1)选取健康无病害的半夏块茎作为母体，除去泥土杂质，清洗，自然晾干；
(2)采用酒精、双氧水和次氯酸钠溶液对半夏块茎进行浸泡灭菌；
(3)半夏块茎切块；
(4)将半夏块茎切块在植物生长调节剂溶液中浸泡后，再采用防腐剂溶液浸泡后，于土壤中覆土栽培，正常田间管理。
进一步地，所述半夏块茎的直径为1.5-2cm。
进一步地，在步骤(1)中，所述清洗包括：半夏块茎用洗衣粉清洗一遍，用水冲洗至水清澈。
进一步地，在步骤(2)中，所述酒精的体积浓度为75％，所述双氧水的体积浓度为10％，所述次氯酸钠溶液的体积浓度为4％。
进一步地，所述浸泡灭菌的具体操作包括：依次在乙醇中浸泡2min，双氧水中浸泡15min，次氯酸钠溶液中浸泡20min。
进一步地，在步骤(3)中，所述切块包括：将半夏块茎纵切成4-8块。
进一步地，在步骤(4)中，所述植物生长调节剂包括IAA或6-BA，所述植物生长调节剂溶液的浓度为0.1-1mg/L。
进一步地，在步骤(4)中，所述防腐剂为碳酸钾，所述防腐剂溶液的质量浓度为0.1-0.2％。
本发明公开了以下技术效果：
本发明证明了通过切块繁殖直接诱导半夏再生的可行性，既克服了传统繁殖方法存在的繁殖周期长、繁殖系数低的缺点，也避免了组培方法的复杂程序和高成本，该方法获得的半夏切块可以直接作为人工种子，且方法安全，简便易行，并可以规模化生产，是半夏种子生产的一种有效途径。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为不切块半夏盆栽图；
图2为切块半夏0.1％K2CO3浸泡(无激素诱导)盆栽图；
图3为切块半夏经1mg/L 6-BA诱导并0.1％K2CO3浸泡后盆栽图；
图4为不切块半夏盆栽6个月后每盆收获种茎；
图5为切块半夏经1mg/L 6-BA诱导并0.1％K2CO3浸泡后盆栽6个月后每盆收获种茎。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明实施例中采用江西本地半夏块茎作为实验材料。
实施例1
一种基于器官直接发生途径的半夏快速繁殖方法，包括以下步骤：
(1)选取直径在1.5-2cm且健康无病害的半夏块茎作为母体，用洗衣粉清洗一遍，用自来水冲洗至水清澈，置于通风处自然晾干；
(2)采用75％酒精、10％双氧水和4％次氯酸钠溶液依次对半夏块茎进行浸泡灭菌，浸泡程序为：乙醇中浸泡2min，双氧水中浸泡15min，次氯酸钠溶液中浸泡20min，浸泡完成后，无菌水冲洗3次，表面晾干备用；
(3)半夏块茎纵切成4块；
(4)将半夏块茎切块在1mg/L的6-BA溶液中浸泡30min，再采用0.1wt％碳酸钾溶液浸泡30min后，于土壤中覆土栽培，正常田间管理。
实施例2
1.半夏切块繁殖最佳灭菌条件筛选
半夏块茎用洗衣粉清洗一遍，自来水冲洗至水清澈，置于通风处晾干。每个种茎(直径1.5-2cm)纵切成4块，使用正交实验筛选半夏切块繁殖最佳灭菌条件，正交设计如表1：
表1
实验编号 75％酒精 10％双氧水 4％次氯酸钠
1 1min 5min 15min
2 1min 10min 20min
3 1min 15min 10min
4 30s 5min 15min
5 30s 10min 20min
6 30s 15min 10min
7 2min 5min 15min
8 2min 10min 20min
9 2min 15min 10min
每个实验组设5个重复，每个实验重复5次，灭菌后于1mg/L 6-BA溶液中浸泡30min，置于浸湿的无菌脱脂棉上26℃培养，光照周期8h/d。培养20天，统计新的子芽发生数量。结果如表2：
表2
试验号 重复1 重复2 重复3 重复4 重复5
1 30 30 39 30 42
2 33 29 36 42 24
3 44 57 45 30 44
4 45 36 44 51 42
5 50 42 47 44 59
6 51 39 55 30 33
7 35 57 36 49 39
8 33 45 51 41 41
9 33 41 36 62 60
经统计，获得最佳灭菌条件组合为75％乙醇2min，10％双氧水15min，4％次氯酸钠溶液20min。
2.半夏切块再生植物生长调节剂的筛选
半夏块茎用洗衣粉清洗一遍，自来水冲洗至水清澈，置于通风处晾干。依次用75％乙醇浸泡2min，10％双氧水15min，4％次氯酸钠溶液20min，无菌水冲洗3次，表面晾干备用。半夏块茎经消毒处理后，纵切为3段，分别放置含一种植物生长调节剂的脱脂棉组培瓶中，植物生长调节剂为IAA、NAA、6-BA或KT，浓度为0.1mg/L或1mg/L。每种植物生长调节剂的每个浓度均设3个重复，于26℃培养，光照周期8h/d。将观察得到的数据进行单因素方差分析，结果如表3。
表3植物生长调节剂浓度对半夏块茎再生芽数量的影响
Figure BDA0003230943850000071
结果表明：对再生芽数量进行单因素方差分析，添加0.5mg/L IAA或1mg/L 6-BA呈现显著性差异(P<0.05)，再生芽数量均值显著高于其他处理组。
3.影响半夏切块再生的切块方式筛选
将半夏块茎消毒(消毒方式同上)，表面晾干，将直径1.5-2cm的种茎纵切成4、8、16块，实验组置于1mg/L 6-BA中，对照组置于无菌水中，均置于4℃浸泡24h，表面晾干。每个处理重复3次。置于浸湿的无菌脱脂棉上26℃培养，光照周期8h/d。培养20天，统计新的子芽发生数量，结果如表4。
表4切块大小对半夏再生芽数量的影响
Figure BDA0003230943850000081
结果显示，在添加1mg/L 6-BA条件下，将块茎纵切4块或8块可促进半夏切块上新子芽的发生。
4.半夏切块防腐处理条件筛选
切块处理的半夏覆土栽培后极易腐败，几乎无法再生存活。以K2CO3为防腐剂，取上述最优灭菌条件处理，并在1mg/L 6-BA中浸泡24h的切块半夏，不同浓度K2CO3溶液浸泡处理后(每处理重复3次)，覆土盆栽(直径15cm花盆)，定期观察，统计再生植株数量。培养6个月后收获块茎，称重，结果如表5。
结果表明：将直径1.5-2cm的半夏种茎纵切成大小近等的4块，切块半夏置于0.1％K2CO3溶液中浸泡30min，可以有效提高再生成株的效率，更高的浓度并不能提高植株再生效率；如表6所示，将直径1.5-2cm的半夏种茎纵切成4块，收获的子代块茎量最多，且显著高于未切块种茎种植的产量。切块过小(8块)，虽然再生植株的数量多，但是当年收获的种茎产量却显著下降，因此切块大小不宜小于0.5cm。
表5 K2CO3浓度对半夏切块覆土栽培效果的影响
Figure BDA0003230943850000091
表6半夏切块大小对覆土栽培产量的影响
Figure BDA0003230943850000092
以上处理栽培40天时拍照，可见直接栽培未切块半夏种茎获得的植株(图1)长势良好，但数量与栽培种茎块数一样，没有增加；将半夏种茎纵切4块但无激素诱导(图2)所获得的植株长势较慢，但数量比未切块略有增加；而将半夏种茎纵切4块经1mg/L 6-BA诱导(图3)所获得的植株显著增加。切块半夏均在0.1％K2CO3浸泡后盆栽。
栽培6个月后，每盆分别收获种茎。可见未切块半夏种植所获得的种茎单个个体相对较大(图4)；切块半夏经1mg/L 6-BA诱导并0.1％K2CO3浸泡后栽培所获种茎个体相对较小，但总量较多(图5)。
实施例3
半夏块茎药物成分分析
收获自然生长的半夏块茎和采用实施例1方法切块生长的块茎，通过对野生组与切块再生组生长得到的半夏块茎进行非靶向代谢组检测实验，块茎代谢物槲皮素、山奈酚以及松柏素的相对定量信息平均数见表7，将所得块茎代谢物槲皮素、山奈酚以及松柏素的相对定量信息进行单因素方差分析，结果显示，野生组与切块再生组在槲皮素、山奈酚以及松柏素组间差异不显著(p>0.05)。综上所述，切块再生所收获的块茎药用活性成分含量与野生组没有显著差异。证明该方式可以应用于生产。
表7野生组与切块再生组块茎代谢物槲皮素、山奈酚、松柏素的相对定量信息
Figure BDA0003230943850000101
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种基于器官直接发生途径的半夏快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)选取健康无病害的半夏块茎作为母体，除去泥土杂质，清洗，自然晾干；
(2)采用酒精、双氧水和次氯酸钠溶液对半夏块茎进行浸泡灭菌；
(3)半夏块茎切块；
(4)将半夏块茎切块在植物生长调节剂溶液中浸泡后，再采用防腐剂溶液浸泡后，于土壤中覆土栽培，正常田间管理；
其中，所述半夏块茎切块直接作为人工种子，经步骤(4)处理后直接种植于大田中，无须将其培养出小芽或幼株。
2.根据权利要求1所述的半夏快速繁殖方法，其特征在于，所述半夏块茎的直径为1.5-2cm。
3.根据权利要求1所述的半夏快速繁殖方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述清洗包括：半夏块茎用洗衣粉清洗一遍，用水冲洗至水清澈。
4.根据权利要求1所述的半夏快速繁殖方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述酒精的体积浓度为75％，所述双氧水的体积浓度为10％，所述次氯酸钠溶液的体积浓度为4％。
5.根据权利要求4所述的半夏快速繁殖方法，其特征在于，所述浸泡灭菌的具体操作包括：依次在乙醇中浸泡2min，双氧水中浸泡15min，次氯酸钠溶液中浸泡20min。
6.根据权利要求1所述的半夏快速繁殖方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述切块包括：将半夏块茎纵切成4-8块。
7.根据权利要求1所述的半夏快速繁殖方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述植物生长调节剂包括IAA或6-BA，所述植物生长调节剂溶液的浓度为0.1-1mg/L。
8.根据权利要求1所述的半夏快速繁殖方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述防腐剂为碳酸钾，所述防腐剂溶液的质量浓度为0.1-0.2％。
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