CN103238526A - 一种利用组织培养技术快速繁殖仙客来的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种利用组织培养技术快速繁殖仙客来的方法，具体包括对外植体的选择与消毒处理、材料处理、愈伤组织的诱导和芽的分化、继代培养、生根培养以及炼苗移栽等步骤，这种组织培养技术提高了仙客来的繁殖效率，也提高了球茎的利用率。

Description

一种利用组织培养技术快速繁殖仙客来的方法

技术领域

本发明涉及一种组织培养方法，具体涉及一种仙客来的组织培养方法。

背景技术

仙客来，又名兔耳花、萝卜海棠、一品冠等，为报春花科仙客来属多年生草本植物，花形奇特，仙客来原产地在欧洲南部希腊等地中海地区，被爱花人士栽培的历史已经有300多年以上了。在18世纪的时候曾以德国为栽培中心，后来更风靡了整个欧洲。由于园艺学家不断地进行品种改良，终于把栽培中心移转到了美国。并逐渐成为世界性的观赏花卉，很受爱花者的推崇，因此被推举为盆花的女王。现栽培的均为杂交种，品种甚多。广泛栽培于各温带地区，是著名的冬春季温室盆花。花期长达数月，深受人们喜爱。圣马力诺选上这种"世界级"的花卉来当国花的确相当有眼光。仙客来喜凉爽、湿润及阳光充足的环境。生长和花芽分化的适温为15-20℃，湿度70％-75％；冬季花期温度不得低于10℃，若温度过低，则花色暗淡，且易凋落；夏季温度若达到 28-30℃，则植株休眠，若达到35℃以上，则块茎易于腐烂。幼苗较老株耐热性稍强。为中日照植物，生长季节的适宜光照强度为28000Lx，低于1500Lx或高于45000LX，则光合强度明显下降。并且种植时要求疏松、肥沃、富含腐殖质、排水良好的微酸性沙壤土。花期10月至翌年4月。

随着世界上仙客来新品种的不断开发和改良，我国仙客来栽培技术水平也随之有了较大的改进和完善，主要表现在其生产周期的缩短和成品花品质的巨大提高。现在仙客来的栽培周期已经由以前的2-3年缩短到了8-12个月，近年成品花的品质也已接近国外的水平。现在仙客来一般都用种子进行繁育，可以说一年中任何季节随时都可以播种。但是播种时间的安排主要由种植者根据其成品花的上市时间、自己的生产设施条件以及所种品种的栽培周期长短而决定。也可采用分割球茎和组织培养繁殖，但是因为分割球茎的技术比较难以掌握，目前还没有广泛采用，利用组织培养进行无性繁殖的研究也比较少，并且技术也不成熟。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种利用组织培养技术快速繁殖仙客来的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是： 

一种利用组织培养技术快速繁殖仙客来的方法，包括以下步骤：

（1）外植体的选择与消毒处理：首先选用生长健壮、成熟的新鲜的仙客来球茎，剥去球茎最外层干皱的鳞片和基部残余老根，流水冲洗20min后放入清水中浸泡15min后，再在紫外灯下照射20min，继而转入超净工作台，在超净工作台上先用70 %的乙醇浸泡15秒，然后用无菌水冲洗2-3次，再用5%次氯酸钠溶液消毒10min，无菌水冲洗2-3次；然后迅速加入3 %双氧水浸泡杀菌8-10 min ，浸泡过程中经常摇动烧杯，然后倒掉升双氧水液体，用无菌水冲洗4-5次后，再用无菌水浸泡备用。

（2）材料的处理：将消毒处理好的球茎用无菌滤纸吸干，在无菌条件下将材料按照上、中、下部分割开来，分别切成6-8mm的小块，并且上、中、下部还有材料分别进行下一步培养。

（3）愈伤组织的诱导和芽的分化：将经过步骤（2）处理好的球茎切块接种到愈伤组织诱导培养基中，PH6.5，培养温度为24℃，光照周期11h/d，光强度为2000lux，空气的相对湿度为70-75%，培养18-22天可以形成愈伤组织和芽的分化，所述愈伤组织诱导培养基为MS+琼脂6.0g/L+ GA₃1.5mg/L+6-BA 1.2mg/L+ ZT 0.4mg/L +蔗糖25g/L。

（4）继代培养：将步骤（3）中诱导的愈伤组织和分化出来的芽分别切下接种在继代培养基上，PH6.5，培养温度为24℃，光照周期12h/d，光强度为2300lux，空气的相对湿度继续保持在70-75%，所述的培养基为1/2MS+蔗糖35mg/L +6-BA2.0mg/L +NAA0.5mg/L +KT0.5mg/L+琼脂8.0g/L；经过15-20天长出小球茎。

（5）生根培养：将分化出来的小球茎分别接种于下列诱导培养基中进行生根诱导：MS培养基+ GA₃ 1.2mg/L+活性炭4.8mg/L+琼脂7g/L+IBA0.5mg/L+蔗糖15mg/L，培养温度为21-23℃，光照周期11-13h/d，光强度为2200-2400lx，PH值为6.5，相对湿度为70%左右，经过28天左右根系长出5-10个根时，即开始下一个阶段。

（6）炼苗移栽：先将培养瓶移至温室，自然条件下炼苗一周左右，将长出新根的小鳞茎从培养瓶中取出，在阳光下晒1-2天，在晒的过程中要适当遮光，然后将其移栽到由腐殖土、蛭石、珍珠岩、泥炭的混合比例为2∶1∶2∶3的苗床上；将小苗取出用自来水冲洗去根部的琼脂，避免损伤根，然后用高锰酸钾2000倍液浸泡8-12min后把小苗进行移栽，在移栽初期的3天内，用塑料薄膜覆盖，以保持在85%以上高湿度，并且控制光照强度小于1400lx，之后逐渐揭去薄膜并适当增加光照，直至将移栽苗置于自然条件下。

本发明的有益效果是： 

（1）提供了一种完整的仙客来组织培养的技术方法，建立了一套完整的仙客来组织培养快速繁殖体系。  

（2）仙客来的上、中、下部分化能力不同，将上、中、下部还有基部的材料分别进行下一步培养，有利于材料的形成愈伤组织的时间比较统一，有利于管理；

（3）移栽的过程中采取必要的措施控制了生长的温度，使仙客来在适宜的温度下进行繁殖，提高了幼苗的质量和成活率，由于合理的移植，幼苗的成活率达到95%以上。 

具体实施方式

下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

实施例1

一种利用组织培养技术快速繁殖仙客来的方法，包括以下步骤：

（1）外植体的选择与消毒处理：首先选用生长健壮、成熟的新鲜的仙客来球茎，剥去球茎最外层干皱的鳞片和基部残余老根，流水冲洗20min后放入清水中浸泡15min后，再在紫外灯下照射20min，继而转入超净工作台，在超净工作台上先用70 %的乙醇浸泡15秒，然后用无菌水冲洗2次，再用5%次氯酸钠溶液消毒10min，无菌水冲洗2次；然后迅速加入3 %双氧水浸泡杀菌8 min ，浸泡过程中经常摇动烧杯，然后倒掉升双氧水液体，用无菌水冲洗4次后，再用无菌水浸泡备用。

（2）材料的处理：将消毒处理好的球茎用无菌滤纸吸干，在无菌条件下将材料按照上、中、下部分割开来，分别切成6mm的小块，并且上、中、下部还有材料分别进行下一步培养。

（3）愈伤组织的诱导和芽的分化：将经过步骤（2）处理好的球茎切块接种到愈伤组织诱导培养基中，PH6.5，培养温度为24℃，光照周期11h/d，光强度为2000lux，空气的相对湿度为70%，培养22天可以形成愈伤组织和芽的分化，所述愈伤组织诱导培养基为MS+琼脂6.0g/L+ GA₃1.5mg/L+6-BA 1.2mg/L+ ZT 0.4mg/L +蔗糖25g/L。

（4）继代培养：将步骤（3）中诱导的愈伤组织和分化出来的芽分别切下接种在继代培养基上，PH6.5，培养温度为24℃，光照周期12h/d，光强度为2300lux，空气的相对湿度继续保持在70%，所述的培养基为1/2MS+蔗糖35mg/L +6-BA2.0mg/L +NAA0.5mg/L +KT0.5mg/L+琼脂8.0g/L；经过18天长出小球茎。

（5）生根培养：将分化出来的小球茎分别接种于下列诱导培养基中进行生根诱导：MS培养基+ GA₃ 1.2mg/L+活性炭4.8mg/L+琼脂7g/L+IBA0.5mg/L+蔗糖15mg/L，培养温度为21℃，光照周期13h/d，光强度为2400lx，PH值为6.5，相对湿度为70%左右，经过26天根系长出5-10个根时，即开始下一个阶段。

（6）炼苗移栽：先将培养瓶移至温室，自然条件下炼苗一周左右，将长出新根的小鳞茎从培养瓶中取出，在阳光下晒1天，在晒的过程中要适当遮光，然后将其移栽到由腐殖土、蛭石、珍珠岩、泥炭的混合比例为2∶1∶2∶3的苗床上；将小苗取出用自来水冲洗去根部的琼脂，避免损伤根，然后用高锰酸钾2000倍液浸泡8min后把小苗进行移栽，在移栽初期的3天内，用塑料薄膜覆盖，以保持在85%以上高湿度，并且控制光照强度小于1400lx，之后逐渐揭去薄膜并适当增加光照，直至将移栽苗置于自然条件下。

实施例2

一种利用组织培养技术快速繁殖仙客来的方法，包括以下步骤：

（1）外植体的选择与消毒处理：首先选用生长健壮、成熟的新鲜的仙客来球茎，剥去球茎最外层干皱的鳞片和基部残余老根，流水冲洗20min后放入清水中浸泡15min后，再在紫外灯下照射20min，继而转入超净工作台，在超净工作台上先用70 %的乙醇浸泡15秒，然后用无菌水冲洗3次，再用5%次氯酸钠溶液消毒10min，无菌水冲洗3次；然后迅速加入3 %双氧水浸泡杀菌10 min ，浸泡过程中经常摇动烧杯，然后倒掉升双氧水液体，用无菌水冲洗5次后，再用无菌水浸泡备用。

（2）材料的处理：将消毒处理好的球茎用无菌滤纸吸干，在无菌条件下将材料按照上、中、下部分割开来，分别切成8mm的小块，并且上、中、下部还有材料分别进行下一步培养。

（3）愈伤组织的诱导和芽的分化：将经过步骤（2）处理好的球茎切块接种到愈伤组织诱导培养基中，PH6.5，培养温度为24℃，光照周期11h/d，光强度为2000lux，空气的相对湿度为75%，培养18天可以形成愈伤组织和芽的分化，所述愈伤组织诱导培养基为MS+琼脂6.0g/L+ GA₃1.5mg/L+6-BA 1.2mg/L+ ZT 0.4mg/L +蔗糖25g/L。

（4）继代培养：将步骤（3）中诱导的愈伤组织和分化出来的芽分别切下接种在继代培养基上，PH6.5，培养温度为24℃，光照周期12h/d，光强度为2300lux，空气的相对湿度继续保持在75%，所述的培养基为1/2MS+蔗糖35mg/L +6-BA2.0mg/L +NAA0.5mg/L +KT0.5mg/L+琼脂8.0g/L；经过16天长出小球茎。

（5）生根培养：将分化出来的小球茎分别接种于下列诱导培养基中进行生根诱导：MS培养基+ GA₃ 1.2mg/L+活性炭4.8mg/L+琼脂7g/L+IBA0.5mg/L+蔗糖15mg/L，培养温度为23℃，光照周期12h/d，光强度为2200lx，PH值为6.5，相对湿度为70%左右，经过28天根系长出5-10个根时，即开始下一个阶段。

（6）炼苗移栽：先将培养瓶移至温室，自然条件下炼苗一周左右，将长出新根的小鳞茎从培养瓶中取出，在阳光下晒2天，在晒的过程中要适当遮光，然后将其移栽到由腐殖土、蛭石、珍珠岩、泥炭的混合比例为2∶1∶2∶3的苗床上；将小苗取出用自来水冲洗去根部的琼脂，避免损伤根，然后用高锰酸钾2000倍液浸泡12min后把小苗进行移栽，在移栽初期的3天内，用塑料薄膜覆盖，以保持在85%以上高湿度，并且控制光照强度小于1400lx，之后逐渐揭去薄膜并适当增加光照，直至将移栽苗置于自然条件下。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (1)

1.一种利用组织培养技术快速繁殖仙客来的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）外植体的选择与消毒处理：首先选用生长健壮、成熟的新鲜的仙客来球茎，剥去球茎最外层干皱的鳞片和基部残余老根，流水冲洗20min后放入清水中浸泡15min后，再在紫外灯下照射20min，继而转入超净工作台，在超净工作台上先用70 %的乙醇浸泡15秒，然后用无菌水冲洗2-3次，再用5%次氯酸钠溶液消毒10min，无菌水冲洗2-3次；然后迅速加入3 %双氧水浸泡杀菌8-10 min ，浸泡过程中经常摇动烧杯，然后倒掉升双氧水液体，用无菌水冲洗4-5次后，再用无菌水浸泡备用；

（2）材料的处理：将消毒处理好的球茎用无菌滤纸吸干，在无菌条件下将材料按照上、中、下部分割开来，分别切成6-8mm的小块，并且上、中、下部还有材料分别进行下一步培养；

（3）愈伤组织的诱导和芽的分化：将经过步骤（2）处理好的球茎切块接种到愈伤组织诱导培养基中，PH6.5，培养温度为24℃，光照周期11h/d，光强度为2000lux，空气的相对湿度为70-75%，培养18-22天可以形成愈伤组织和芽的分化，所述愈伤组织诱导培养基为MS+琼脂6.0g/L+ GA₃1.5mg/L+6-BA 1.2mg/L+ ZT 0.4mg/L +蔗糖25g/L；

（4）继代培养：将步骤（3）中诱导的愈伤组织和分化出来的芽分别切下接种在继代培养基上，PH6.5，培养温度为24℃，光照周期12h/d，光强度为2300lux，空气的相对湿度继续保持在70-75%，所述的培养基为1/2MS+蔗糖35mg/L +6-BA2.0mg/L +NAA0.5mg/L +KT0.5mg/L+琼脂8.0g/L；经过15-20天长出小球茎；

（5）生根培养：将分化出来的小球茎分别接种于下列诱导培养基中进行生根诱导：MS培养基+ GA₃ 1.2mg/L+活性炭4.8mg/L+琼脂7g/L+IBA0.5mg/L+蔗糖15mg/L，培养温度为21-23℃，光照周期11-13h/d，光强度为2200-2400lx，PH值为6.5，相对湿度为70%左右，经过28天左右根系长出5-10个根时，即开始下一个阶段；

（6）炼苗移栽：先将培养瓶移至温室，自然条件下炼苗一周左右，将长出新根的小鳞茎从培养瓶中取出，在阳光下晒1-2天，在晒的过程中要适当遮光，然后将其移栽到由腐殖土、蛭石、珍珠岩、泥炭的混合比例为2∶1∶2∶3的苗床上；将小苗取出用自来水冲洗去根部的琼脂，避免损伤根，然后用高锰酸钾2000倍液浸泡8-12min后把小苗进行移栽，在移栽初期的3天内，用塑料薄膜覆盖，以保持在85%以上高湿度，并且控制光照强度小于1400lx，之后逐渐揭去薄膜并适当增加光照，直至将移栽苗置于自然条件下。