CN105340745A - 仙客来植株愈伤组织和芽的培养基及培养方法 - Google Patents

仙客来植株愈伤组织和芽的培养基及培养方法 Download PDF

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CN105340745A CN201510809317.4A CN201510809317A CN105340745A CN 105340745 A CN105340745 A CN 105340745A CN 201510809317 A CN201510809317 A CN 201510809317A CN 105340745 A CN105340745 A CN 105340745A
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孙文超
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/001—Culture apparatus for tissue culture

Abstract

本发明提供了一种诱导仙客来叶片形成愈伤组织和芽的培养基及培养方法，通过“二步法”高效诱导仙客来愈伤组织和芽的形成，有效抑制外植体褐化。首先，外植体叶片采取前，将仙客来植株遮光处理24～26小时，随后离体低温(20℃～22℃)黑暗培养，有效解决了褐化问题；其次，通过低温黑暗培养，诱导愈伤组织，30～40天后提高培养温度至25℃～28℃，光照培养诱导成芽；最后，芽形成15～20天后诱导生根。该技术体系能有效抑制褐化，繁殖系数高，并能保存F1代的原有性状和杂种优势，为仙客来种苗的工厂化生产提供关键技术支撑。

Description

仙客来植株愈伤组织和芽的培养基及培养方法
技术领域
本发明属于植物无性繁殖领域，尤其涉及一种诱导仙客来叶片形成愈伤组织和芽的培养基和培养方法。
背景技术
仙客来(CyclamenpersicumMill)又名一品冠、兔耳花、萝卜海棠，为报春花科仙客来属多年生球根草本花卉，是近年来较为流行的春节室内名贵盆花，其观赏价值较高、花期较长，在欧洲、日本等国都是名列前茅的盆花之一，且市场价格昂贵。仙客来生长适宜温度为18～20℃。仙客来繁殖方法分为有性繁殖和无性繁殖。商品仙客来大多是杂种一代F1，用种子繁殖难以保存F1代的原有性状和杂种优势，同时种子发芽率低，观赏价值越高的品种种子生产越困难，这成为制约仙客来商品化生产和经济效益的主要因素。仙客来也可用组织培养、球茎分割等方法繁殖。球茎分割法繁殖速度慢，此种方法只适于栽培条件十分优越，管理水平高、灭菌、消毒条件好时采用，否则容易失败。组织培养能够保持两性性状，并且有很高的繁殖率，为当前仙客来种苗产业的发展提供了一条捷径，但是由于仙客来芽分化率低、褐化问题严重、生根困难等技术障碍，相关技术达不到高效快速繁殖的目的，仙客来的组织培养苗尚未进入商品化和产业化生产阶段。我国栽培的仙客来优良品种，大多为国外引进的品种或其后代。国产的仙客来优质品种极其缺乏，国外原种不仅价格昂贵，且由于其大多为F1代，继续繁殖会出现性状分离，而长期引进国外种子会造成生产成本太高，因此急需建立国产仙客来优良品种培育体系。因此，通过组织培养快速建立无性繁殖体系，保持优良品种的固有性状，是当前仙客来种苗产业急需解决的关键问题。
发明内容
为了达到上述目的，本发明提供了一种能简单高效保存F1代的原有性状和杂种优势，同时繁殖系数高的仙客来离体繁殖的技术体系。
一方面，本发明提供了一种诱导仙客来叶片形成愈伤组织和芽的培养基，其组分包括，
组分 浓度(mg/L)
NH4NO3 820～825
KNO3 945～950
CaCl2·2H2O或CaCl2 215～220
MgSO4·7H2O 180～185
KH2PO4 80～85
KI 0.40～0.45
H3BO3 3.0～3.1
MnSO4·7H2O 11.0～11.2
ZnSO4·7H2O 4.0～4.5
Na2MnO4·2H2O 0.1～0.2
CuSO4·5H2O 0.01～0.02
CoCl2·6H2O 0.01～0.02
FeSO4·7H2O 13.5～14.0
Na2·EDTA·2H2O 18.0～18.7
肌醇 45～50
烟酸 0.2～0.3
盐酸吡哆醇 0.2～0.3
盐酸硫胺素 0.04～0.05
甘氨酸 0.8～1.0
2,4-D 1.8～2.0
6-BA 0.18～0.2
KT 0.18～0.2
此外，还包括占培养基总质量百分比为3.0～3.2％的蔗糖和占培养基总质量百分比为0.8～0.9％的琼脂，培养基pH值5.8～6.0。
另一方面，本发明还提供了一种仙客来植株的培养方法，其包括以下步骤：
步骤A，配置如权利要求1所述的培养基，对培养基、操作环境进行灭菌和消毒；
步骤B，仙客来植株叶片在采取前，将植株进行遮光处理24～26小时，然后将仙客来植株幼叶消毒、切块，反面向上置于培养基表面；
步骤C，将步骤B接种好的材料置于20℃～22℃下黑暗培养30～40天。
本发明提供了一种仙客来植株愈伤组织和芽的培养基及培养方法，通过“二步法”有效防止外植体褐化，高效诱导形成仙客来愈伤组织和芽。首先，仙客来叶片在采取前，将植株进行遮光处理24～26小时，离体低温(20℃～22℃)黑暗培养，有效解决了褐化难题；其次，通过低温(20℃～22℃)黑暗培养，诱导愈伤组织，30～40天后提高培养温度至25℃～28℃，光照培养诱导成芽；最后，芽形成15～20天后诱导生根。该技术体系能有效抑制褐化，繁殖系数高，并能保存F1代的原有性状和杂种优势，为仙客来种苗的工厂化生产提供关键技术支撑。
具体实施方式
一方面，本发明提供了一种诱导仙客来叶片形成愈伤组织和芽的培养基，其组分包括，
组分 浓度(mg/L)
NH4NO3 820～825
KNO3 945～950
CaCl2·2H2O或CaCl2 215～220
MgSO4·7H2O 180～185
KH2PO4 80～85
KI 0.40～0.45
H3BO3 3.0～3.1
MnSO4·7H2O 11.0～11.2
ZnSO4·7H2O 4.0～4.5
Na2MnO4·2H2O 0.1～0.2
CuSO4·5H2O 0.01～0.02
CoCl2·6H2O 0.01～0.02
FeSO4·7H2O 13.5～14.0
Na2·EDTA·2H2O 18.0～18.7
肌醇 45～50
烟酸 0.2～0.3
盐酸吡哆醇 0.2～0.3
盐酸硫胺素 0.04～0.05
甘氨酸 0.8～1.0
2,4-D 1.8～2.0
6-BA 0.18～0.2
KT 0.18～0.2
此外，还包括占培养基总质量百分比为3.0～3.2％的蔗糖和占培养基总质量百分比为0.8～0.9％的琼脂，培养基pH值5.8～6.0。
具体的，本专利所述2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、6-BA(6-苄氨基嘌呤)、KT(激动素)、IBA(吲哚丁酸)和NAA(萘乙酸)是植物激素。
优选的愈伤组织和芽的诱导培养基，其组分包括，
组分 浓度(mg/L)
NH4NO3 825
KNO3 950
CaCl2·2H2O或CaCl2 220
MgSO4·7H2O 185
KH2PO4 85
KI 0.42
H3BO3 3.10
MnSO4·7H2O 11.15
ZnSO4·7H2O 4.30
Na2MnO4·2H2O 0.125
CuSO4·5H2O 0.0125
CoCl2·6H2O 0.0125
FeSO4·7H2O 13.90
Na2·EDTA·2H2O 18.65
肌醇 50
烟酸 0.25
盐酸吡哆醇 0.25
盐酸硫胺素 0.05
甘氨酸 1.00
2,4-D 2.0
6-BA 0.2
KT 0.2
此外，还包括占培养基总质量百分比为3.0～3.2％的蔗糖和占培养基总质量百分比为0.8～0.9％的琼脂，培养基pH值5.8～6.0。
另一方面，本发明还提供了一种仙客来植株的培养方法，其包括以下步骤：
步骤A，配置如权利要求1所述的培养基，对培养基、操作环境进行灭菌和消毒；
步骤B，仙客来植株叶片在采取前，将植株进行遮光处理24～26小时，然后将仙客来植株幼叶消毒、切块，反面向上置于培养基表面；
步骤C，将步骤B接种好的培养基20℃～22℃下黑暗培养30～40天。
本发明以仙客来植株的幼嫩叶片作为外植体，既取材方便，又可达到彻底消毒。此外，外植体的摆放方法对愈伤组织诱导具有极显著的影响。该实验将叶片反面向上置于培养基，相对于正面向上置于培养基更有利于愈伤组织的诱导作用。这可能是由于该摆放方法与植物体自然生长状态相反，从而可刺激更多愈伤组织的形成；同时叶片的下表皮向上，使气孔暴露出来，更有利于气体交换。第三，所述步骤B中仙客来叶片在采取前，将母株进行遮光处理24～26小时，然后再切取外植体培养。如此，能够有效抑制外植体褐化。第四，高温能促进酚氧化，而低温能抑制酚类化合物氧化，降低多酚氧化酶的活性，从而减轻褐化。因此，在不影响正常生长和分化的前提下，尽量降低温度。本发明采用20℃～22℃培养。第五，本发明发现黑暗低温培养，减小了外界因素对愈伤组织诱导的影响，因此，是仙客来目前抗褐化的最佳选择。
优选的，还包括步骤D，将步骤C培养得到的愈伤组织转至光照培养，光照强度2000～2500lx，光照时间为12～14小时/天，同时培养温度升至25℃～28℃。可以通过改变培养温度，一步法形成幼芽。
进一步优选的，还包括步骤E，芽形成15～20天后将不定芽剪下，转接至生根培养基中继续培养，培养条件为，光照强度2000～2500lx，光照时间为12～14小时/天。
更进一步优选的，所述生根培养基组分如下，
组分 浓度(mg/L)
NH4NO3 825
KNO3 950
CaCl2·2H2O或CaCl2 220
MgSO4·7H2O 185
KH2PO4 85
KI 0.42
H3BO3 3.10
MnSO4·7H2O 11.15
ZnSO4·7H2O 4.30
Na2MnO4·2H2O 0.125
CuSO4·5H2O 0.0125
CoCl2·6H2O 0.0125
FeSO4·7H2O 13.90
Na2·EDTA2H2O 18.65
肌醇 50
烟酸 0.25
盐酸吡哆醇 0.25
盐酸硫胺素 0.05
甘氨酸 1.00
2,4-D 2.0
IBA 0.2
KT 0.2
此外，还包括占培养基总质量百分比为3.0～3.2％的蔗糖和占培养基总质量百分比为0.8～0.9％的琼脂，培养基pH值5.8～6.0。
更进一步优选的，还包括步骤F，将已有3～4片叶，具有5～6条根系的幼苗炼苗后栽入基质中定期喷水保湿培养。
优选的，所述步骤B以完全展开的幼叶为外植体，切去叶片边缘，并沿主叶脉剪切成块，切块尺寸为10mm～11mm×10mm～11mm。外植体的选择很重要，本发明开始用成熟叶片作为外植体，但其褐化严重。选用仙客来完全展开的幼叶取得了较好的效果，叶片沿主叶脉剪切比侧脉细脉剪切愈伤组织诱导率高，从主叶脉剪口处开始增厚膨大，然后形成愈伤，因此选用带有主脉的幼嫩叶片为外植体可获得高质量的愈伤组织。外植体大小对褐化的影响，表现为小的材料更容易发生褐化，相对较大的材料则褐化较轻。因此，叶片外植体适当切大些，10mm～11mm×10mm～11mm比较合适。
优选的，所述步骤B中将仙客来植株叶片切块在质量浓度为0.1～0.12％的升汞溶液中浸泡10～15min，再用无菌水冲洗3～4次进行消毒。各种消毒用的化学试剂对外植体的伤害也会引起褐化，酒精消毒对外植体的伤害比较重，较易引起材料的死亡，对于不易褐化的种类，用氯化汞消毒后，一般不会引起褐化，若用次氯酸钠进行消毒，则很容易引起褐化的发生，而且消毒效果不如氯化汞。针对仙客来褐化，应尽可能减少用酒精消毒外植体的时间，实验证明，不用酒精消毒，适当延长升汞消毒的时间可以获得比较好的消毒效果。
优选的，所述步骤B中将培养基在101KP，121～126℃灭菌20～25min。
下面结合具体实施例，进一步对本发明进行详细描述。当然所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例1
实验材料：本发明植株母体采用仙客来“国旗红”品种，购于武汉市青山区铁机路花卉市场。外植体采用仙客来的幼嫩健康叶片。
仪器设备：
⒈格兰仕微波炉，名秀光波G8023SCL-K3型，佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司；
⒉双哈全自动不锈钢双层立式电蒸汽压力消毒器，YX.350Z，上海三申医疗器械有限公司；
⒊BOXUN洁净工作台，洁净等级100级(≥0.5μm粒子≤3粒子/L)YS-800-2；
⒋TONE智能光照培养箱，GXZ型，南京同立实验仪器有限公司；
⒌电子天平，200mL三角烧瓶、方形塑料带盖培养瓶、镊子、解剖刀、培养皿、滤纸、酒精灯。
操作步骤：
1.培养基配制
配置仙客来植株愈伤组织和芽的培养基，其组分如下，
组分 浓度(mg/L)
NH4NO3 1650
KNO3 1900
CaCl2·2H2O 440
MgSO4·7H2O 370
KH2PO4 170
KI 0.83
H3BO3 6.2
MnSO4·7H2O 22.3
ZnSO4·7H2O 8.6
Na2MnO4·2H2O 0.25
CuSO4·5H2O 0.025
CoCl2·6H2O 0.025
FeSO4·7H2O 27.8
Na2·EDTA·2H2O 37.3
肌醇 100
烟酸 0.5
盐酸吡哆醇 0.5
盐酸硫胺素 0.1
甘氨酸 2.0
2,4-D 1
6-BA 0.5
NAA 0.5
此外，还包括占培养基总质量百分比为3.0％的蔗糖和占培养基总质量百分比为0.8％的琼脂，调pH至5.8～6.0，得到培养基。
2.灭菌和消毒
培养基灭菌：将配制好的仙客来植株愈伤组织和芽的培养基分装，每300mL培养基分装5瓶，用包头纸包好烧瓶口或盖上塑料盖，与若干瓶蒸馏水、培养皿、滤纸、镊子、解剖刀一起放入灭菌锅内，121℃灭菌20分钟。
操作环境灭菌：进行无菌操作前，将所需器具、药品放入超净工作台，首先用空气过滤灭菌，同时用紫外灯照射灭菌20min，然后用70％酒精对操作台表面进行擦拭，操作人员双手也用70％酒精擦拭，未经高压灭菌的器材及即将放进超净工作台的培养瓶表面均用70％酒精擦拭，待酒精挥发完全后，再进行无菌操作。
外植体消毒：仙客来植株叶片在采取前，将植株进行遮光处理24～26小时，取材后用洗洁精漂洗叶片，用流水冲洗叶片3～5min，吸去叶面水分，然后将叶片移入操作台，在0.1％升汞溶液中浸泡10～15min，再用无菌水冲洗3～4次，放入无菌培养皿备用。
3.接种和培养
将消毒后的外植体，切去叶片边缘，并沿叶脉剪切成10mm×11mm的方形小块，将叶片反面向上置于仙客来植株愈伤组织和芽的培养基表面，每瓶接种7～12片外植体。将接种好的培养基放入培养箱中，培养条件为20℃，黑暗培养25天。待长出愈伤组织后，将培养得到的愈伤组织转至光照培养，光照强度2000lx，光照时间为12小时/天，同时培养温度升至25℃。
4.生根培养
不定芽形成15天后，剪下不定芽，转接至生根培养基中继续培养，培养条件为，光照强度2000lx，光照时间为12小时/天。所述生根培养基组分如下，
组分 浓度(mg/L)
NH4NO3 545
KNO3 630
CaCl2·2H2O 145
MgSO4·7H2O 120
KH2PO4 55
KI 0.25
H3BO3 2.0
MnSO4·7H2O 7.4
ZnSO4·7H2O 2.5
Na2MnO4·2H2O 0.05
CuSO4·5H2O 0.005
CoCl2·6H2O 0.005
FeSO4·7H2O 9.20
Na2·EDTA·2H2O 12.0
肌醇 30
烟酸 0.1
盐酸吡哆醇 0.1
盐酸硫胺素 0.02
甘氨酸 0.6
IBA 0.7
NAA 0.2
此外，还包括占培养基总质量百分比为3.0％的蔗糖和占培养基总质量百分比为0.8％的琼脂，调pH至5.8～6.0，得到培养基。培养基pH值5.8～6.0。
5.移栽
将已有3～4片叶，具有5～6条根系的幼苗炼苗后栽入基质中定期喷水保湿培养。
实施例2
操作步骤：
1.培养基配制
配置仙客来植株愈伤组织和芽的培养基，其组分如下，
组分 浓度(mg/L)
NH4NO3 1650
KNO3 1900
CaCl2·2H2O 440
MgSO4·7H2O 370
KH2PO4 170
KI 0.83
H3BO3 6.2
MnSO4·7H2O 22.3
ZnSO4·7H2O 8.6
Na2MnO4·2H2O 0.25
CuSO4·5H2O 0.025
CoCl2·6H2O 0.025
FeSO4·7H2O 27.8
Na2·EDTA·2H2O 37.3
肌醇 100
烟酸 0.5
盐酸吡哆醇 0.5
盐酸硫胺素 0.1
甘氨酸 2.0
2,4-D 2
6-BA 0.5
此外，还包括占培养基总质量百分比为3.0％的蔗糖和占培养基总质量百分比为0.8％的琼脂，调pH至5.8～6.0，得到培养基。
2.灭菌和消毒
培养基灭菌：将配制好的仙客来植株愈伤组织和芽的培养基分装，每300mL培养基分装5瓶，用包头纸包好烧瓶口或盖上塑料盖，与若干瓶蒸馏水、培养皿、滤纸、镊子、解剖刀一起放入灭菌锅内，121℃灭菌20分钟。
操作环境灭菌：进行无菌操作前，将所需器具、药品放入超净工作台，首先用空气过滤灭菌，同时用紫外灯照射灭菌20min，然后用70％酒精对操作台表面进行擦拭，操作人员双手也用70％酒精擦拭，未经高压灭菌的器材及即将放进超净工作台的培养瓶表面均用70％酒精擦拭，待酒精挥发完全后，再进行无菌操作。
外植体消毒：仙客来植株叶片在采取前，将植株进行遮光处理24～26小时，取材后用洗洁精漂洗叶片，用流水冲洗叶片3～5min，吸去叶面水分，然后将叶片移入操作台，在0.1％升汞溶液中浸泡10～15min，再用无菌水冲洗3～4次，放入无菌培养皿备用。
3.接种和培养
将消毒后的外植体，切去叶片边缘，并沿叶脉剪切成10mm×10mm的方形小块，将叶片反面向上置于仙客来植株愈伤组织和芽的培养基表面，每瓶接种7～12片外植体。将接种好的培养基放入培养箱中，培养条件为22℃，黑暗培养30天。待长出愈伤组织后，将培养得到的愈伤组织转至光照培养，光照强度2500lx，光照时间为14小时/天，同时培养温度升至28℃。
4.生根培养
不定芽形成15天后剪下，转接至生根培养基中继续培养，培养条件为，光照强度2500lx，光照时间为14小时/天。所述生根培养基组分如下，
组分 浓度(mg/L)
NH4NO3 545
KNO3 630
CaCl2·2H2O 145
MgSO4·7H2O 120
KH2PO4 55
KI 0.25
H3BO3 2.0
MnSO4·7H2O 7.4
ZnSO4·7H2O 2.5
Na2MnO4·2H2O 0.05
CuSO4·5H2O 0.005
CoCl2·6H2O 0.005
FeSO4·7H2O 9.20
Na2·EDTA·2H2O 12.0
肌醇 30
烟酸 0.1
盐酸吡哆醇 0.1
盐酸硫胺素 0.02
甘氨酸 0.6
IBA 0.7
NAA 0.2
此外，还包括占培养基总质量百分比为3.0％的蔗糖和占培养基总质量百分比为0.8％的琼脂，调pH至5.8～6.0，得到培养基。
5.移栽
将已有3～4片叶，具有5～6条根系的幼苗炼苗后栽入基质中定期喷水保湿培养。
实施例3
操作步骤：
1.培养基配制
配置诱导愈伤组织和芽的培养基，其组分如下，
组分 浓度(mg/L)
NH4NO3 1650
KNO3 1900
CaCl2·2H2O 440
MgSO4·7H2O 370
KH2PO4 170
KI 0.83
H3BO3 6.2
MnSO4·7H2O 22.3
ZnSO4·7H2O 8.6
Na2MnO4·2H2O 0.25
CuSO4·5H2O 0.025
CoCl2·6H2O 0.025
FeSO4·7H2O 27.8
Na2·EDTA·2H2O 37.3
肌醇 100
烟酸 0.5
盐酸吡哆醇 0.5
盐酸硫胺素 0.1
甘氨酸 2.0
NAA 2.5
6-BA 0.2
此外，还包括占培养基总质量百分比为3.0％的蔗糖和占培养基总质量百分比为0.8％的琼脂，调pH至5.8～6.0，得到培养基。
2.灭菌和消毒
培养基灭菌：将配制好的仙客来植株愈伤组织和芽的培养基分装，每300mL培养基分装5瓶，用包头纸包好烧瓶口或盖上塑料盖，与若干瓶蒸馏水、培养皿、滤纸、镊子、解剖刀一起放入灭菌锅内，121℃灭菌20分钟。
操作环境灭菌：进行无菌操作前，将所需器具、药品放入超净工作台，首先用空气过滤灭菌，同时用紫外灯照射灭菌20min，然后用70％酒精对操作台表面进行擦拭，操作人员双手也用70％酒精擦拭，未经高压灭菌的器材及即将放进超净工作台的培养瓶表面均用70％酒精擦拭，待酒精挥发完全后，再进行无菌操作。
外植体消毒：仙客来植株叶片在采取前，将植株进行遮光处理24～26小时，取材后用洗洁精漂洗叶片，用流水冲洗叶片3～5min，吸去叶面水分，然后将叶片移入操作台，在0.1％升汞溶液中浸泡10～15min，再用无菌水冲洗3～4次，放入无菌培养皿备用。
3.接种和培养
将消毒后的外植体，切去叶片边缘，并沿叶脉剪切成11mm×10mm的方形小块，将叶片反面向上置于仙客来植株愈伤组织和芽的培养基表面，每瓶接种7～12片外植体。将接种好的培养基放入培养箱中，培养条件为22℃，黑暗培养30天。待长出愈伤组织后，将培养得到的愈伤组织转至光照培养，光照强度2500lx，光照时间为14小时/天，同时培养温度升至28℃。
4.生根培养
不定芽形成15天后剪下，转接至生根培养基中继续培养，培养条件为，光照强度2500lx，光照时间为14小时/天。所述生根培养基组分如下，
组分 浓度(mg/L)
NH4NO3 545
KNO3 630
CaCl2·2H2O 145
MgSO4·7H2O 120
KH2PO4 55
KI 0.25
H3BO3 2.0
MnSO4·7H2O 7.4
ZnSO4·7H2O 2.5
Na2MnO4·2H2O 0.05
CuSO4·5H2O 0.005
CoCl2·6H2O 0.005
FeSO4·7H2O 9.20
Na2·EDTA·2H2O 12.0
肌醇 30
烟酸 0.1
盐酸吡哆醇 0.1
盐酸硫胺素 0.02
甘氨酸 0.6
IBA 0.7
NAA 0.2
此外，还包括占培养基总质量百分比为3.0％的蔗糖和占培养基总质量百分比为0.8％的琼脂，调pH至5.8～6.0，得到培养基。
5.移栽
将已有3～4片叶，具有5～6条根系的幼苗炼苗后栽入基质中定期喷水保湿培养。
实施例4
操作步骤：
1.培养基配制
配置诱导愈伤组织和芽的培养基，其组分如下，
组分 浓度(mg/L)
NH4NO3 1650
KNO3 1900
CaCl2 440
MgSO4·7H2O 370
KH2PO4 170
KI 0.83
H3BO3 6.2
MnSO4·7H2O 22.3
ZnSO4·7H2O 8.6
Na2MnO4·2H2O 0.25
CuSO4·5H2O 0.025
CoCl2·6H2O 0.025
FeSO4·7H2O 27.8
Na2·EDTA·2H2O 37.3
肌醇 100
烟酸 0.5
盐酸吡哆醇 0.5
盐酸硫胺素 0.1
甘氨酸 2.0
NAA 0.2
6-BA 2
KT 0.2
此外，还包括占培养基总质量百分比为3.0％的蔗糖和占培养基总质量百分比为0.8％的琼脂，调pH至5.8～6.0，得到培养基。
2.灭菌和消毒
培养基灭菌：将配制好的仙客来植株愈伤组织和芽的培养基分装，每300mL培养基分装5瓶，用包头纸包好烧瓶口或盖上塑料盖，与若干瓶蒸馏水、培养皿、滤纸、镊子、解剖刀一起放入灭菌锅内，121℃灭菌20分钟。
操作环境灭菌：进行无菌操作前，将所需器具、药品放入超净工作台，首先用空气过滤灭菌，同时用紫外灯照射灭菌20min，然后用70％酒精对操作台表面进行擦拭，操作人员双手也用70％酒精擦拭，未经高压灭菌的器材及即将放进超净工作台的培养瓶表面均用70％酒精擦拭，待酒精挥发完全后，再进行无菌操作。
外植体消毒：仙客来植株叶片在采取前，将植株进行遮光处理24～26小时，取材后用洗洁精漂洗叶片，用流水冲洗叶片3～5min，吸去叶面水分，然后将叶片移入操作台，在0.1％升汞溶液中浸泡10～15min，再用无菌水冲洗3～4次，放入无菌培养皿备用。
3.接种和培养
将消毒后的外植体，切去叶片边缘，并沿叶脉剪切成11mm×11mm的方形小块，将叶片反面向上置于仙客来植株愈伤组织和芽的培养基表面，每瓶接种7～12片外植体。将接种好的培养基放入培养箱中，培养条件为22℃，黑暗培养30天。待长出愈伤组织后，将培养得到的愈伤组织转至光照培养，光照强度2500lx，光照时间为14小时/天，同时培养温度升至28℃。
4.生根培养
不定芽形成15天后剪下，转接至生根培养基中继续培养，培养条件为，光照强度2500lx，光照时间为14小时/天。所述生根培养基组分如下，
组分 浓度(mg/L)
NH4NO3 545
KNO3 630
CaCl2·2H2O 145
MgSO4·7H2O 120
KH2PO4 55
KI 0.25
H3BO3 2.0
MnSO4·7H2O 7.4
ZnSO4·7H2O 2.5
Na2MnO4·2H2O 0.05
CuSO4·5H2O 0.005
CoCl2·6H2O 0.005
FeSO4·7H2O 9.20
Na2·EDTA·2H2O 12.0
肌醇 30
烟酸 0.1
盐酸吡哆醇 0.1
盐酸硫胺素 0.02
甘氨酸 0.6
IBA 0.7
NAA 0.2
此外，还包括占培养基总质量百分比为3.0％的蔗糖和占培养基总质量百分比为0.8％的琼脂，调pH至5.8～6.0，得到培养基。
5.移栽
将已有3～4片叶，具有5～6条根系的幼苗炼苗后栽入基质中定期喷水保湿培养。
实施例5
操作步骤：
1.培养基配制
配置诱导愈伤组织和芽的培养基，其组分如下，
组分 浓度(mg/L)
NH4NO3 820
KNO3 945
CaCl2 215
MgSO4·7H2O 180
KH2PO4 80
KI 0.40
H3BO3 3.0
MnSO4·7H2O 11.0
ZnSO4·7H2O 4.0
Na2MnO4·2H2O 0.1
CuSO4·5H2O 0.01
CoCl2·6H2O 0.01
FeSO4·7H2O 13.5
Na2·EDTA·2H2O 18.0
肌醇 45
烟酸 0.2
盐酸吡哆醇 0.2
盐酸硫胺素 0.04
甘氨酸 0.8
2,4-D 2
6-BA 0.2
此外，还包括占培养基总质量百分比为3.2％的蔗糖和占培养基总质量百分比为0.9％的琼脂，调pH至5.8～6.0，得到培养基。
2.灭菌和消毒
培养基灭菌：将配制好的仙客来植株愈伤组织和芽的培养基分装，每300mL培养基分装5瓶，用包头纸包好烧瓶口或盖上塑料盖，与若干瓶蒸馏水、培养皿、滤纸、镊子、解剖刀一起放入灭菌锅内，121℃灭菌20分钟。
操作环境灭菌：进行无菌操作前，将所需器具、药品放入超净工作台，首先用空气过滤灭菌，同时用紫外灯照射灭菌20min，然后用70％酒精对操作台表面进行擦拭，操作人员双手也用70％酒精擦拭，未经高压灭菌的器材及即将放进超净工作台的培养瓶表面均用70％酒精擦拭，待酒精挥发完全后，再进行无菌操作。
外植体消毒：仙客来植株叶片在采取前，将植株进行遮光处理24～26小时，取材后用洗洁精漂洗叶片，用流水冲洗叶片3～5min，吸去叶面水分，然后将叶片移入操作台，在0.1％升汞溶液中浸泡10～15min，再用无菌水冲洗3～4次，放入无菌培养皿备用。
3.接种和培养
将消毒后的外植体，切去叶片边缘，并沿叶脉剪切成11mm×11mm的方形小块，将叶片反面向上置于仙客来植株愈伤组织和芽的培养基表面，每瓶接种7～12片外植体。将接种好的培养基放入培养箱中，培养条件为22℃，黑暗培养30天。待长出愈伤组织后，将培养得到的愈伤组织转至光照培养，光照强度2500lx，光照时间为14小时/天，同时培养温度升至28℃。
4.生根培养
不定芽形成15天后剪下，转接至生根培养基中继续培养，培养条件为，光照强度2500lx，光照时间为14小时/天。所述生根培养基组分如下，
组分 浓度(mg/L)
NH4NO3 550
KNO3 635
CaCl2·2H2O 150
MgSO4·7H2O 125
KH2PO4 60
KI 0.3
H3BO3 2.1
MnSO4·7H2O 7.5
ZnSO4·7H2O 3.0
Na2MnO4·2H2O 0.1
CuSO4·5H2O 0.01
CoCl2·6H2O 0.01
FeSO4·7H2O 9.3
Na2·EDTA·2H2O 12.5
肌醇 35
烟酸 0.2
盐酸吡哆醇 0.2
盐酸硫胺素 0.04
甘氨酸 0.7
IBA 0.9
NAA 0.2
此外，还包括占培养基总质量百分比为3.2％的蔗糖和占培养基总质量百分比为0.9％的琼脂，调pH至5.8～6.0，得到培养基。
5.移栽
将已有3～4片叶，具有5～6条根系的幼苗炼苗后栽入基质中定期喷水保湿培养。
实施例6
操作步骤：
1.培养基配制
配置诱导愈伤组织和芽的培养基，其组分如下，
组分 浓度(mg/L)
NH4NO3 820
KNO3 945
CaCl2 215
MgSO4·7H2O 180
KH2PO4 80
KI 0.40
H3BO3 3.0
MnSO4·7H2O 11.0
ZnSO4·7H2O 4.0
Na2MnO4·2H2O 0.1
CuSO4·5H2O 0.01
CoCl2·6H2O 0.01
FeSO4·7H2O 13.5
Na2·EDTA·2H2O 18.0
肌醇 45
烟酸 0.2
盐酸吡哆醇 0.2
盐酸硫胺素 0.04
甘氨酸 0.8
2,4-D 2
6-BA 0.2
KT 0.2
此外，还包括占培养基总质量百分比为3.0％的蔗糖和占培养基总质量百分比为0.8％的琼脂，调pH至5.8～6.0，得到培养基。
2.灭菌和消毒
培养基灭菌：将配制好的仙客来植株愈伤组织和芽的培养基分装，每300mL培养基分装5瓶，用包头纸包好烧瓶口或盖上塑料盖，与若干瓶蒸馏水、培养皿、滤纸、镊子、解剖刀一起放入灭菌锅内，121℃灭菌20分钟。
操作环境灭菌：进行无菌操作前，将所需器具、药品放入超净工作台，首先用空气过滤灭菌，同时用紫外灯照射灭菌20min，然后用70％酒精对操作台表面进行擦拭，操作人员双手也用70％酒精擦拭，未经高压灭菌的器材及即将放进超净工作台的培养瓶表面均用70％酒精擦拭，待酒精挥发完全后，再进行无菌操作。
外植体消毒：仙客来植株叶片在采取前，将植株进行遮光处理24～26小时，取材后用洗洁精漂洗叶片，用流水冲洗叶片3～5min，吸去叶面水分，然后将叶片移入操作台，在0.1％升汞溶液中浸泡10～15min，再用无菌水冲洗3～4次，放入无菌培养皿备用。
3.接种和培养
将消毒后的外植体，切去叶片边缘，并沿叶脉剪切成11mm×11mm的方形小块，将叶片反面向上置于仙客来植株愈伤组织和芽的培养基表面，每瓶接种7～12片外植体。将接种好的培养基放入培养箱中，培养条件为20℃，黑暗培养25天。待长出愈伤组织后，将培养得到的愈伤组织转至光照培养，光照强度2000lx，光照时间为12小时/天，同时培养温度升至25℃。
4.生根培养
培养40天后将不定芽剪下，转接至生根培养基中继续培养，培养条件为，光照强度2000lx，光照时间为12小时/天。所述生根培养基组分如下，
组分 浓度(mg/L)
NH4NO3 550
KNO3 635
CaCl2·2H2O 150
MgSO4·7H2O 125
KH2PO4 60
KI 0.3
H3BO3 2.1
MnSO4·7H2O 7.5
ZnSO4·7H2O 3.0
Na2MnO4·2H2O 0.1
CuSO4·5H2O 0.01
CoCl2·6H2O 0.01
FeSO4·7H2O 9.3
Na2·EDTA·2H2O 12.5
肌醇 35
烟酸 0.2
盐酸吡哆醇 0.2
盐酸硫胺素 0.04
甘氨酸 0.7
IBA 0.7
NAA 0.2
此外，还包括占培养基总质量百分比为3.2％的蔗糖和占培养基总质量百分比为0.9％的琼脂，调pH至5.8～6.0，得到培养基。
5.移栽
将已有3～4片叶，具有5～6条根系的幼苗炼苗后栽入基质中定期喷水保湿培养。
在接种后统计接种量，以后每隔三至五天观察并记录一次，观察有无污染、外植体形态变化等。记录观察到的现象如下：
污染情况：接种5天后即可观察到有无污染。实验中有两种污染情况：培养基污染和外植体污染。培养基污染可见培养基表面散布小型白色菌落，外植体污染则仅仅叶片周围有菌落。接种20天后仍有少量污染情况发生。
离体培养观察：培养10天叶片向上翘起；20天时叶片有明显加厚，30天时可看见大量愈伤形成，局部放大后发现愈伤为淡黄的，很紧密。具体的，实施例1的培养基褐化严重；实施例2的培养基和实施例3的培养基能诱导愈伤组织，但愈伤组织量少，色暗，不如实施例5的培养基和实施例6的培养基；实施例4的培养基愈伤组织的形成启动缓慢；实施例5的培养基和实施例6的培养基培养基上的愈伤组织启动最早(20-25天)，切口处增厚明显、长势强；实施例6的培养基产生的愈伤组织质量较好，为白色，且量最大。

Claims (10)

1.一种诱导仙客来叶片形成愈伤组织和芽的培养基，其组分包括，
组分 浓度(mg/L) NH4NO3 820～825 KNO3 945～950 CaCl2·2H2O或CaCl2 215～220 MgSO4·7H2O 180～185 KH2PO4 80～85 KI 0.40～0.45 H3BO3 3.0～3.1 MnSO4·7H2O 11.0～11.2 ZnSO4·7H2O 4.0～4.5 Na2MnO4·2H2O 0.1～0.2 CuSO4·5H2O 0.01～0.02 CoCl2·6H2O 0.01～0.02 FeSO4·7H2O 13.5～14.0 Na2·EDTA·2H2O 18.0～18.7 肌醇 45～50 烟酸 0.2～0.3 盐酸吡哆醇 0.2～0.3 盐酸硫胺素 0.04～0.05 甘氨酸 0.8～1.0 2,4-D 1.8～2.0 6-BA 0.18～0.2 KT 0.18～0.2
此外，还包括占培养基总质量百分比为3.0～3.2％的蔗糖和占培养基总质量百分比为0.8～0.9％的琼脂，培养基pH值5.8～6.0。
2.如权利要求1所述诱导仙客来叶片形成愈伤组织和芽的优选培养基，其特征在于：其组分包括，
组分 浓度(mg/L) NH4NO3 825 KNO3 950 CaCl2·2H2O或CaCl2 220 MgSO4·7H2O 185 KH2PO4 85 KI 0.42 H3BO3 3.10 MnSO4·7H2O 11.15 ZnSO4·7H2O 4.30
Na2MnO4·2H2O 0.125 CuSO4·5H2O 0.0125 CoCl2·6H2O 0.0125 FeSO4·7H2O 13.90 Na2·EDTA·2H2O 18.65 肌醇 50 烟酸 0.25 盐酸吡哆醇 0.25 盐酸硫胺素 0.05 甘氨酸 1.00 2,4-D 2.0 6-BA 0.2 KT 0.2
此外，还包括占培养基总质量百分比为3.0～3.2％的蔗糖和占培养基总质量百分比为0.8～0.9％的琼脂，培养基pH值5.8～6.0。
3.一种仙客来植株的培养方法，其包括以下步骤：
步骤A，配置如权利要求1所述的培养基，对培养基、操作环境进行灭菌和消毒；
步骤B，仙客来植株叶片在采取前，将植株进行遮光处理24～26小时，然后将仙客来植株幼叶消毒、切块，反面向上置于培养基表面；
步骤C，将步骤B接种好的材料置于20℃～22℃下黑暗培养30～40天。
4.如权利要求3所述的仙客来植株的培养方法，其特征在于：还包括步骤D，将步骤C培养得到的愈伤组织转至光照培养，光照强度2000～2500lx，光照时间为12～14小时/天，同时培养温度升至25℃～28℃。
5.如权利要求4所述的仙客来植株的培养方法，其特征在于：还包括步骤E，芽形成15～20天后将不定芽剪下，转接至生根培养基中继续培养，培养条件为，光照强度2000～2500lx，光照时间为12～14小时/天。
6.如权利要求5所述的仙客来植株的培养方法，其特征在于：所述生根培养基组分如下，
组分 浓度(mg/L)
NH4NO3 545～550 KNO3 630～635 CaCl2·2H2O或CaCl2 145～150 MgSO4·7H2O 120.0～125.0 KH2PO4 55.0～60.0 KI 0.25～0.3 H3BO3 2.0～2.1 MnSO4·7H2O 7.4～7.5 ZnSO4·7H2O 2.5～3.0 Na2MnO4·2H2O 0.05～0.1 CuSO4·5H2O 0.005～0.01 CoCl2·6H2O 0.005～0.01 FeSO4·7H2O 9.20～9.3 Na2·EDTA·2H2O 12.0～12.5 肌醇 30.0～35.0 烟酸 0.1～0.2 盐酸吡哆醇 0.1～0.2 盐酸硫胺素 0.02～0.04 甘氨酸 0.6～0.7 IBA 0.7～0.9 NAA 0.15～0.2
此外，还包括占培养基总质量百分比为3.0～3.2％的蔗糖和占培养基总质量百分比为0.8～0.9％的琼脂，培养基pH值5.8～6.0。
7.如权利要求5所述的仙客来植株的培养方法，其特征在于：还包括步骤F，将已有3～4片叶，具有5～6条根系的幼苗炼苗后栽入基质中定期喷水保湿培养。
8.如权利要求3所述的仙客来植株的培养方法，其特征在于：所述步骤B以完全展开的幼叶为外植体，切去叶片边缘，并沿主叶脉剪切成块，切块尺寸为10mm～11mm×10mm～11mm。
9.如权利要求3所述的仙客来植株的培养方法，其特征在于：所述步骤B中将仙客来植株叶片切块在质量浓度为0.1～0.12％的升汞溶液中浸泡10～15min，再用无菌水冲洗3～4次进行消毒。
10.如权利要求3所述的仙客来植株的培养方法，其特征在于：所述步骤B中将培养基在101KP，121～126℃灭菌20～25min。
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PB01 Publication
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RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160224

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