CN103283600A - 一种利用组织培养技术快速繁殖暗紫贝母的方法 - Google Patents

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本发明公开了一种利用组织培养技术快速繁殖暗紫贝母的方法，包括材料的选择与消毒、材料的处理、初代培养、继代培养、生根培养、生根试管苗温室炼苗移栽等步骤，本发明采用新鲜的暗紫贝母鳞茎球作为外植体进行繁殖，鳞茎球的利用率很高，达到95%以上，并且培育出来的植株枝叶茂盛，根系发达，植株生长旺盛；一个直径4cm鳞茎球大约能够繁殖150-200个小鳞茎，即能够利用有限的资源进行繁殖，繁殖系数很高。在继代培养过程中当愈伤组织分化出细芽后，升高培养温度，提高光照周期和光照强度，这样缩短了培养时间。

Description

一种利用组织培养技术快速繁殖暗紫贝母的方法
技术领域
本发明涉及一种贝母的组织培养方法，尤其涉及一种适用于暗紫贝母的快速繁殖方法。
背景技术
暗紫贝母(F. unibiacteata Hsiao et K. C. Hsia) 是贝母属中较名贵的中药材，其鳞茎可以有效止咳、祛痰、清热润肺，尤其适合于老年人和儿童久治不愈的顽固性虚寒咳嗽。暗紫贝母在中药材市场上的需求量特别高，但是其鳞茎生长速度特别慢，从种子长成商品药材一般需要四年的时间，由于贝母药效好、价值高,加上人工种植难度大、繁殖系数低、生长周期长，因此商品药材价格一直居高不下，并且近年来需求量越来越大，导致暗紫贝母的价格也越来越高。野生的暗紫贝母主要分布在地势高亢寒冷、日照强烈、空气干燥、春秋短暂的地区生长。主产区若尔盖、红原两县因受地形、寒流等影响，常年无夏，这种气候特点构成了暗紫贝母生长的特殊环境条件，所以这种特殊的生长环境决定了暗紫贝母在田间及人工种植比较困难，为了扩大暗紫贝母的繁殖，利用组织培养技术进行快速繁殖十分必要。目前对贝母的组织培养技术的研究已经初具规模，但是对暗紫贝母的研究还不是很多，并且繁殖方法还没有成规模，没有形成一套完整的繁殖体系。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种利用组织培养技术繁殖暗紫贝母的方法，为暗紫贝母的快速增殖提供一套完整的组织培养繁殖体系。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是： 
一种利用组织培养技术快速繁殖暗紫贝母的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）材料的选择与消毒：首先选用生长健壮、成熟的新鲜的暗紫贝母鳞茎球，剥去鳞茎最外层干皱的鳞片和基部残余老根，流水冲洗30 min后放入清水中浸泡15min，用50％多菌灵500倍液浸泡20-30 min后，将鳞茎球一层一层的剥开，再在紫外灯下照射20 min，继而转入超净工作台，在超净工作台上先用70-75 %的乙醇浸泡10秒，然后用无菌水冲洗，再转入滴加了2～3滴土温80的0.1 %的升汞溶液中浸泡5min，用无菌水冲洗4次； 
（2）材料的处理：将消毒处理好的鳞片用无菌滤纸吸干，在无菌条件下将材料按照上、中、下部还有基部分割开来，分别切成4-6mm的小块；
（3）初代培养：在无菌的条件下将步骤（2）得到的外植体接种在初代培养基上，该培养基是在在MS常规培养基中添加了1.0mg/L的6-BA、1.2mg/L的NAA、 0.4mg/L的ZT；培养温度为26℃，光照时间14 h/d，光照强度22 00 Lx，PH为 6.5，琼脂5 g/L，经过15-20天形成愈伤组织；
（4）继代培养：将初代培养的愈伤组织切下接种在继代培养基上，该培养基是在3/4MS常规培养基中添加了0.5mg/L的6-BA、0.4 mg/L的NAA、0.3mg/L的KT和30mg/L的蔗糖，培养温度为22℃，光照周期13h/d，光强度为2500lux，PH 6.5，经过4-5天时间分化出细芽后，升高培养温度到25℃，光照周期为14h/d，光强度为2800lux，继续培养6-10天便可分化出一簇一簇的小鳞茎；
（5）生根培养：将分化出来的小鳞茎一个个分别接种于下列诱导培养基中进行生根诱导： MS培养基、1.5mg/L的活性炭、6g/L的琼脂、0.3mg/L 的IBA、0.4mg/L的KT，培养温度为23℃，光照周期12h/d，光强度为2000lux，PH值为6.0，经过20-25天待小鳞茎长至3cm高，当根系比较健壮并且长出6-10个根时，即开始下一个阶段；
（6）生根试管苗温室炼苗移栽：将生根的试管苗开瓶后置温室温度在25-28℃，湿度80-85％，光照强度在5000-5500lx条件下炼苗3-5天后，洗掉苗上的培养基，将其移栽到由羊粪、腐殖土、珍珠岩的混合比例为1∶3∶2 的苗床上。当外界夜间温度在10-15℃，白天温度在18-25之间时把试管苗进行移栽，在移栽初期的5天内，用塑料薄膜覆盖，以保持湿度在80%以上，并且控制光照强度在2700-3300lx，之后逐渐揭去薄膜并适当增加光照，直至将移栽苗置于自然条件下。
本发明的有益效果是：
（1） 本发明采用新鲜的暗紫贝母鳞茎球作为外植体进行繁殖，鳞茎球的利用率很高，达到95%以上，并且培育出来的植株枝叶茂盛，根系发达，植株生长旺盛；一个直径4cm鳞茎球大约能够繁殖150-200个小鳞茎，即能够利用有限的资源进行繁殖，繁殖系数很高。
（2）在继代培养过程中当愈伤组织分化出细芽后，升高培养温度，提高光照周期和光照强度，这样缩短了培养时间。
（3）在生根试管苗温室炼苗移栽过程中当外界夜间温度在10-15℃，白天温度在18-25之间时进行移栽，有利于暗紫贝母的生长发育，即把握了移栽的时间，使试管苗的移栽成功率达到了85%以上。
具体实施方式
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
实施例1
一种利用组织培养技术快速繁殖暗紫贝母的方法，包括：
（1）材料的选择与消毒：首先选用生长健壮、成熟的新鲜的暗紫贝母鳞茎球，剥去鳞茎最外层干皱的鳞片和基部残余老根，流水冲洗30 min后放入清水中浸泡15min，用50％多菌灵500倍液浸泡20 min后，将鳞茎球一层一层的剥开，再在紫外灯下照射20 min，继而转入超净工作台，在超净工作台上先用70 %的乙醇浸泡10秒，然后用无菌水冲洗，再转入滴加了2滴土温80的0.1 %的升汞溶液中浸泡5min，用无菌水冲洗4次； 
（2）材料的处理：将消毒处理好的鳞片用无菌滤纸吸干，在无菌条件下将材料按照上、中、下部还有基部分割开来，分别切成4mm的小块；
（3）初代培养：在无菌的条件下将步骤（2）得到的外植体接种在初代培养基上，该培养基是在在MS常规培养基中添加了1.0mg/L的6-BA、1.2mg/L的NAA、 0.4mg/L的ZT；培养温度为26℃，光照时间14 h/d，光照强度22 00 Lx，PH为 6.5，琼脂5 g/L，经过15-20天形成愈伤组织；
（4）继代培养：将初代培养的愈伤组织切下接种在继代培养基上，该培养基是在3/4MS常规培养基中添加了0.5mg/L的6-BA、0.4 mg/L的NAA、0.3mg/L的KT和30mg/L的蔗糖，培养温度为22℃，光照周期13h/d，光强度为2500lux，PH 6.5，经过4天时间分化出细芽后，升高培养温度到25℃，光照周期为14h/d，光强度为2800lux，继续培养8天便可分化出一簇一簇的小鳞茎；
（5）生根培养：将分化出来的小鳞茎一个个分别接种于下列诱导培养基中进行生根诱导： MS培养基、1.5mg/L的活性炭、6g/L的琼脂、0.3mg/L 的IBA、0.4mg/L的KT，培养温度为23℃，光照周期12h/d，光强度为2000lux，PH值为6.0，经过20-25天待小鳞茎长至3cm高，当根系比较健壮并且长出6-10个根时，即开始下一个阶段；
（6）生根试管苗温室炼苗移栽：将生根的试管苗开瓶后置温室温度在25℃，湿度80％，光照强度在5000lx条件下炼苗5天后，洗掉苗上的培养基，将其移栽到由羊粪、腐殖土、珍珠岩的混合比例为1∶3∶2 的苗床上。当外界夜间温度在10-15℃，白天温度在18-25之间时把试管苗进行移栽，在移栽初期的5天内，用塑料薄膜覆盖，以保持湿度在80%以上，并且控制光照强度在2700lx，之后逐渐揭去薄膜并适当增加光照，直至将移栽苗置于自然条件下。
经过上述步骤的培养，暗紫贝母的愈伤组织形成率达到了95%，增殖倍数达到了5.8倍，生根率达到了95%，最终的成活率达到了88%，并且暗紫贝母的质量和产量都得到很大的提高。
 
实施例2
一种利用组织培养技术快速繁殖暗紫贝母的方法，包括以下步骤：
（1）材料的选择与消毒：首先选用生长健壮、成熟的新鲜的暗紫贝母鳞茎球，剥去鳞茎最外层干皱的鳞片和基部残余老根，流水冲洗30 min后放入清水中浸泡15min，用50％多菌灵500倍液浸泡30 min后，将鳞茎球一层一层的剥开，再在紫外灯下照射20 min，，继而转入超净工作台，在超净工作台上先用75 %的乙醇浸泡10秒，然后用无菌水冲洗，再转入滴加了3滴土温80的0.1 %的升汞溶液中浸泡5min，用无菌水冲洗4次； 
（2）材料的处理：将消毒处理好的鳞片用无菌滤纸吸干，在无菌条件下将材料按照上、中、下部还有基部分割开来，分别切成6mm的小块；
（3）初代培养：在无菌的条件下将步骤（2）得到的外植体接种在初代培养基上，该培养基是在在MS常规培养基中添加了1.0mg/L的6-BA、1.2mg/L的NAA、 0.4mg/L的ZT；培养温度为26℃，光照时间14 h/d，光照强度22 00 Lx，PH为 6.5，琼脂5 g/L，经过20天形成愈伤组织；
（4）继代培养：将初代培养的愈伤组织切下接种在继代培养基上，该培养基是在3/4MS常规培养基中添加了0.5mg/L的6-BA、0.4 mg/L的NAA、0.3mg/L的KT和30mg/L的蔗糖，培养温度为22℃，光照周期13h/d，光强度为2500lux，PH 6.5，经过4-5天时间分化出细芽后，升高培养温度到25℃，光照周期为14h/d，光强度为2800lux，继续培养6-10天便可分化出一簇一簇的小鳞茎；
（5）生根培养：将分化出来的小鳞茎一个个分别接种于下列诱导培养基中进行生根诱导： MS培养基、1.5mg/L的活性炭、6g/L的琼脂、0.3mg/L 的IBA、0.4mg/L的KT，培养温度为23℃，光照周期12h/d，光强度为2000lux，PH值为6.0，经过20-25天待小鳞茎长至3cm高，当根系比较健壮并且长出6-10个根时，即开始下一个阶段；
（6）生根试管苗温室炼苗移栽：将生根的试管苗开瓶后置温室温度在28℃，湿度85％，光照强度在5500lx条件下炼苗3天后，洗掉苗上的培养基，将其移栽到由羊粪、腐殖土、珍珠岩的混合比例为1∶3∶2 的苗床上。当外界夜间温度在15℃，白天温度在25之间时把试管苗进行移栽，在移栽初期的5天内，用塑料薄膜覆盖，以保持湿度在80%以上，并且控制光照强度在3300lx，之后逐渐揭去薄膜并适当增加光照，直至将移栽苗置于自然条件下。
经过上述步骤的培养，暗紫贝母的愈伤组织形成率达到了92%，增殖倍数达到了6倍，生根率达到了98%，最终的成活率达到了90%。 
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (1)

1.一种利用组织培养技术快速繁殖暗紫贝母的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）材料的选择与消毒：首先选用生长健壮、成熟的新鲜的暗紫贝母鳞茎球，剥去鳞茎最外层干皱的鳞片和基部残余老根，流水冲洗30 min后放入清水中浸泡15min，用50％多菌灵500倍液浸泡20-30 min后，将鳞茎球一层一层的剥开，再在紫外灯下照射20 min，继而转入超净工作台，在超净工作台上先用70-75 %的乙醇浸泡10秒，然后用无菌水冲洗，再转入滴加了2～3滴土温80的0.1 %的升汞溶液中浸泡5min，用无菌水冲洗4次； 
（2）材料的处理：将消毒处理好的鳞片用无菌滤纸吸干，在无菌条件下将材料按照上、中、下部还有基部分割开来，分别切成4-6mm的小块；
（3）初代培养：在无菌的条件下将步骤（2）得到的外植体接种在初代培养基上，该培养基是在在MS常规培养基中添加了1.0mg/L的6-BA、1.2mg/L的NAA、 0.4mg/L的ZT；培养温度为26℃，光照时间14 h/d，光照强度22 00 Lx，PH为 6.5，琼脂5 g/L，经过15-20天形成愈伤组织；
（4）继代培养：将初代培养的愈伤组织切下接种在继代培养基上，该培养基是在3/4MS常规培养基中添加了0.5mg/L的6-BA、0.4 mg/L的NAA、0.3mg/L的KT和30mg/L的蔗糖，培养温度为22℃，光照周期13h/d，光强度为2500lux，PH 6.5，经过4-5天时间分化出细芽后，升高培养温度到25℃，光照周期为14h/d，光强度为2800lux，继续培养6-10天便可分化出一簇一簇的小鳞茎；
（5）生根培养：将分化出来的小鳞茎一个个分别接种于下列诱导培养基中进行生根诱导： MS培养基+1.5mg/L的活性炭+6g/L的琼脂+0.3mg/L 的IBA+0.4mg/L的KT，培养温度为23℃，光照周期12h/d，光强度为2000lux，PH值为6.0，经过20-25天待小鳞茎长至3cm高，当根系比较健壮并且长出6-10个根时，即开始下一个阶段；
（6）生根试管苗温室炼苗移栽：将生根的试管苗开瓶后置温室温度在25-28℃，湿度80-85％，光照强度在5000-5500lx条件下炼苗3-5天后，洗掉苗上的培养基，将其移栽到由羊粪、腐殖土、珍珠岩的混合比例为1∶3∶2 的苗床上，当外界夜间温度在10-15℃，白天温度在18-25之间时把试管苗进行移栽，在移栽初期的5天内，用塑料薄膜覆盖，以保持湿度在80%以上，并且控制光照强度在2700-3300lx，之后逐渐揭去薄膜并适当增加光照，直至将移栽苗置于自然条件下。
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