CN112106657B

CN112106657B - 一种密序苣苔的组织培养方法

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Publication number: CN112106657B
Application number: CN202011022114.8A
Authority: CN
Inventors: 王逸之; 向建英; 孙大宽; 罗仕秋
Original assignee: Southwest Forestry University
Current assignee: Southwest Forestry University
Priority date: 2020-09-25
Filing date: 2020-09-25
Publication date: 2021-04-20
Anticipated expiration: 2040-09-25
Also published as: CN112106657A

Abstract

本发明提供一种密序苣苔的组织培养方法，包括以下措施：密序苣苔外植体的无菌体系建立、密序苣苔组织的初代培养、继代增殖、生根培养、炼苗移栽。本发明提供密序苣苔组织培养方法不仅能够降低密序苣苔叶片外植体接种过程中的污染率、提高的成活率，还能够提高密序苣苔的不定芽诱导率、增殖系数及生根率。

Description

一种密序苣苔的组织培养方法

技术领域

本发明涉及植物养殖技术领域，尤其涉及一种密序苣苔的组织培养方法。

背景技术

密序苣苔(Hemiboeopsislongisepala(H.W.Li)W.T.Wang)原属于苦苣苔科(Gesneriaceae)，密序苣苔属(Hemiboeopsis)，为多年生亚灌木，该属为单型属，仅有密序苣苔一种，其优美的植株形态、鲜艳巨大的花朵赋予了该物种较高的观赏与开发利用价值。根据最新的分子生物学与形态学证据，植物分类学者将密序苣苔重新归类于汉克苣苔属(Henckelia)，并将接受名改为Henckelialongisepala(H.W.Li)D.J.Middleton and Mich.

(

al.,2016；Wen etal.,2019)。密序苣苔分布于云南东南部，老挝与越南北部，仅生于海拔250～800m石灰岩山谷灌丛或沟边阴处，生境非常特殊，对环境要求的严格程度高，一旦上层植被遭到破坏即难以生存。云南省极小种群拯救保护规划纲要(2010-2020年)将其列为亟待保护的62种野生极小种群植物之一，IUCN评价属于极危状态[CRB1a,b(i,ii,iii)]。生境的特殊性和分布狭域性以及沟谷雨林的破坏导致其现有种群生存受到极大威胁，应尽快开展种质资源保护工作。

虽然苦苣苔科植物具有较高的自交亲和性，但其在自然条件下自花授粉条件较为苛刻，传粉方式主要还是以异花授粉为主，传粉媒介为蜂类、蜂鸟、蝙蝠等。若采用种子播种繁殖的方法，其种子细小不易收集，采种繁琐，授粉困难，不利于人工繁殖的规模化。因此，建立密序苣苔组织培养体系可以充分缓解该物种野生种群的生存威胁，促进其种群的恢复和可持续发展，有效保护密序苣苔遗传种质资源，同时为该物种的大规模繁殖和进一步产业化开发奠定基础。

然而，密序苣苔植株构件表面普遍存在细毛，给外植体灭菌带来了一定的困难，因此灭菌流程、消毒剂选择、灭菌时间等需要多次尝试摸索，寻找适合的灭菌组合，降低污染率，提高密序苣苔外植体接种成活率。植物生长激素是植物组织培养过程中的重要影响因子，同种激素不同浓度的使用对外植体生长和分化的作用均存在差异，在密序苣苔组织培养过程中寻找合适的激素浓度配比，使得外植体获得较高的不定芽诱导率、增殖系数、生根率是密序苣苔组织培养研究的另一个重点问题。

发明内容

本发明的目的在于解决上述现有技术存在的缺陷，提供一种密序苣苔的组织培养方法。

一种密序苣苔的组织培养方法，包括以下措施：

密序苣苔外植体处理、密序苣苔组织的初代培养、继代增殖、生根培养、炼苗移栽。

进一步地，如上所述的密序苣苔的组织培养方法，所述密序苣苔外植体处理包括：

选取密序苣苔健康植株的幼嫩叶片，用软毛刷蘸取洗洁精稀释液轻轻扫除其表面污物，自来水下冲洗干净后放入盛满水的150ml烧杯中，加入3滴洗洁精，轻轻震荡10min后，流水冲洗15min，转移到超净工作台进行灭菌的操作；

然后将叶片在75％酒精溶液中浸泡10s，无菌水冲洗2次；然后将叶片在加入3-5滴的吐温80的0.1％HgCl₂溶液中浸泡2-10min，浸泡过程中轻轻震荡使叶片充分接触溶液，无菌水冲洗5次。

进一步地，如上所述的密序苣苔的组织培养方法，所述密序苣苔组织的初代培养包括：

将灭菌结束后的叶片切成1.5cm×1.5cm大小，按叶面正面朝上的方式平铺接入不定芽诱导培养基中进行培养；

所述不定芽诱导培养基为：MS+白砂糖30g·L^-1+琼脂7.0g·L^-1+6-BA1.5mg·L^-1+NAA0.2mg·L^-1。

进一步地，如上所述的密序苣苔的组织培养方法，所述继代增殖包括：

将获得的不定芽接入增殖培养基中进行培养，所述增殖培养基为：MS+白砂糖30g·L^-1+琼脂7.0g·L^-1+6-BA1.0mg·L^-1+NAA0.2mg·L^-1。

进一步地，如上所述的密序苣苔的组织培养方法，所述生根培养包括：

将具有4片或更多叶片的幼苗接入生根培养基中进行生根诱导培养；所述生根培养基为：1/2MS+0.3mg·L^-1NAA。

进一步地，如上所述的密序苣苔的组织培养方法，所述炼苗移栽包括：

待植株生根后，将具有6片或更多叶片、根数6条以上、根长2cm以上的组培瓶苗放置温室中炼苗5-7d后在温室中进行移栽，移栽基质为泥炭混合珍珠岩，所述泥炭与珍珠岩的体积比为2:1。

有益效果：

本发明提供密序苣苔组织培养方法不仅能够降低密序苣苔叶片外植体接种过程中的污染率、提高的成活率，还能够提高密序苣苔的不定芽诱导率、增殖系数及生根率。

附图说明

图1为本发明密序苣苔组织培养主要过程图；其中，A.外植体接种；B.叶片不定芽诱导；C.继代增殖培养；D.生根培养；E.炼苗移栽。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明从外植体灭菌到幼苗移栽，对密序苣苔组织培养各环节进行了研究，首次建立了密序苣苔的组织培养体系，结果表明密序苣苔组织培养外植体灭菌优选方式为将外植体置于75％酒精溶液中浸泡10s，无菌水冲洗2次，然后将其在加入3-5滴的吐温80的0.1％HgCl₂溶液中浸泡8min，浸泡过程中轻轻震荡使叶片充分接触溶液，无菌水冲洗5次；密序苣苔不定芽诱导优选培养基为MS+6-BA1.5mg·L^-1+NAA0.2mg·L^-1，不定芽增殖优选培养基为MS+6-BA1.0mg·L^-1+NAA0.2mg·L^-1，生根优选培养基为1/2MS+0.3mg·L^-1NAA；移栽基质为泥炭混合珍珠岩(体积比为2:1)，移栽成活率可达92.4％。

具体实施方式如下：

1.外植体处理：

选取密序苣苔健康植株的幼嫩叶片，用软毛刷蘸取洗洁精稀释液轻轻扫除其表面污物，自来水下冲洗干净后放入盛满水的150ml烧杯中，加入3滴洗洁精，轻轻震荡10min后，流水冲洗15min，转移到超净工作台进行灭菌的操作。将叶片在75％酒精溶液中浸泡10s，无菌水冲洗2次；然后将叶片在加入3-5滴的吐温80的0.1％HgCl₂溶液中浸泡2-10min，浸泡过程中轻轻震荡使叶片充分接触溶液，无菌水冲洗5次后待用。

2.无菌体系的建立

将消毒后完成灭菌的叶片用无菌纱布吸干其表面残留水分，切成1.5cm×1.5cm大小，按叶面正面朝上的方式平铺接种于空白MS培养基中，所有空白培养基的pH值均为5.7，在温度(25±2)℃，光照强度2000lx、光照时间16h/d的条件下培养，每个处理接种叶片30片，重复3次，每天观察记录污染情况，及时清理出现污染的外植体与培养基，接种20d后调查成活率。

表1不同0.1％HgCl₂处理时间对密序苣苔叶片灭菌效果的影响

根据表1数据显示，不同的0.1％HgCl₂处理时间对密序苣苔外植体灭菌效果影响较大。随着0.1％HgCl₂处理时间的增加，外植体污染率不断下降，但褐化率却在提高，因为HgCl₂在灭杀的微生物的同时也对外植体产生了一定的毒害作用，导致无菌活体较为脆弱，容易产生褐化现象。综合表1数据来看，处理4即0.1％HgCl₂处理8min，灭菌效果最好，污染率为5.29％，褐化率为23.08％，成活率为71.63％。

3.初代培养与继代增殖

3.1培养基与培养条件

以MS为基本培养基，加入白砂糖30g·L^-1，琼脂7.0g·L^-1，同时添加不同种类和浓度的植物生长调节剂，灭菌前培养基pH5.7-6.1，配制分装后，于125℃灭菌25min，冷却后接种，在温度(25±2)℃、光照强度2000lx、光照时间16h/d的条件下培养。

3.2不定芽诱导

灭菌结束后，将叶片切成1.5cm×1.5cm大小，按叶面正面朝上的方式平铺接入培养基中，每种培养基接种叶片30片，重复3次。培养40天后统计从叶片直接诱导出不定芽的数量，计算不定芽诱导率。

表2不同植物生长调节剂配比对密序苣苔不定芽诱导的影响

注：不定芽诱导率＝产生不定芽叶片数/接种数×100％。

由表2数据可以看出，在40d的培养时间内，添加6-BA与NAA的培养基可以从叶片直接诱导出不定芽，不定芽诱导率在NAA浓度相同的情况下，随着6-BA浓度的升高呈现先上升后下降的趋势，外植体不定芽诱导率在MS+6-BA1.5mg·L^-1+NAA0.2mg·L^-1培养基条件下达到最大值79.45％。

3.3不定芽增殖

将获得的不定芽接入增殖培养基中。每种培养基接种不定芽30株，3次重复。培养40d后计算增殖系数。

表3不同植物生长调节剂配比对密序苣苔不定芽增殖的影响

注：增殖系数＝新芽数/接种芽数。

由表3数据可以看出，在40d增殖培养时间内，部分不定芽分化后长成叶片形态并进一步生长成小植株，部分不定芽易玻璃化或变黄干枯。接种40d后，密序苣苔不定芽的增殖系数最高为25.84，最低为8.82，最优不定芽增殖培养基为MS+6-BA1.0mg·L^-1+NAA0.2mg·L^-1。

4.生根培养与炼苗移栽

4.1生根培养

将具有4片或更多叶片的幼苗接入生根培养基中进行生根诱导培养。每种培养基接种小苗30株，3次重复。培养条件同上。培养30d后统计产生根的植株数量，计算生根率。

表4培养基种类和不同植物生长调节剂配比对密序苣苔生根培养的影响

处理	基本培养基	NAA/mg·L<sup>-1</sup>	生根率/％	生长情况
					1	1/2MS	0.1	93.40	健壮，根长，根多
2	1/2MS	0.3	98.31	健壮，根长，根多
					3	1/2MS	0.5	91.53	健壮，根长，根多
4	MS	0.1	90.01	细弱，根长，根多
					5	MS	0.3	94.69	细弱，根长，根多
6	MS	0.5	89.15	细弱，根长，根多

由表4数据可以看出，在1/2MS基本培养基上附加0.3mg·L^-1NAA时，密序苣苔生根率达到最大值98.31％，植株健壮，根长，根多，有利于后期炼苗移栽。

4.2炼苗移栽

待植株生根后，将具有6片或更多叶片、根数6条以上、根长2cm以上的组培瓶苗放置温室中炼苗5-7d后在温室中进行移栽，移栽基质为泥炭混合珍珠岩(体积比为2:1)，20d后统计移栽成活率为92.4％。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种密序苣苔的组织培养方法，其特征在于，包括以下措施：

密序苣苔外植体处理、密序苣苔组织的初代培养、继代增殖、生根培养、炼苗移栽；

所述密序苣苔组织的初代培养包括：

将灭菌结束后的叶片切成1.5 cm×1.5 cm大小，按叶面正面朝上的方式平铺接入不定芽诱导培养基中进行培养；

所述不定芽诱导培养基为：MS+白砂糖30g·L^-1+琼脂7.0g·L^-1+6-BA1.5mg•L^-1+NAA0.2mg•L^-1。

2.根据权利要求1所述的密序苣苔的组织培养方法，其特征在于，所述密序苣苔外植体处理包括：

然后将叶片在75%酒精溶液中浸泡10s，无菌水冲洗2次；然后将叶片在加入3-5滴的吐温80的0.1%HgCl₂溶液中浸泡8min，浸泡过程中轻轻震荡使叶片充分接触溶液，无菌水冲洗5次。

3.根据权利要求1所述的密序苣苔的组织培养方法，其特征在于，所述继代增殖包括：

将获得的不定芽接入增殖培养基中进行培养，所述增殖培养基为：MS+白砂糖30g·L^-1+琼脂7.0g·L^-1+6-BA1.0mg•L^-1+NAA0.2mg•L^-1。

4.根据权利要求1所述的密序苣苔的组织培养方法，其特征在于，所述生根培养包括：

将具有4 片或更多叶片的幼苗接入生根培养基中进行生根诱导培养；所述生根培养基为：1/2 MS+白砂糖30g·L^-1+琼脂7.0g·L^-1+0.3mg•L^-1NAA。

5.根据权利要求1所述的密序苣苔的组织培养方法，其特征在于，所述炼苗移栽包括：

待植株生根后，将具有6 片或更多叶片、根数6 条以上、根长2cm 以上的组培瓶苗放置温室中炼苗5-7d后在温室中进行移栽，移栽基质为泥炭混合珍珠岩，所述泥炭与珍珠岩的体积比为2:1。