CN107711488B - 一种制备异枝江蓠原生质体的方法 - Google Patents

一种制备异枝江蓠原生质体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种制备异枝江蓠(Gracilaria bailinae)原生质体的方法，本发明的方法通过培养海洋细菌Marinomonas sp.YS‑70发酵产生琼胶酶粗酶液，混合纤维素酶、离析酶及添加缓冲介质和渗压剂组成原生质体分离液，对经过消毒、切碎的异枝江蓠藻体进行酶解处理，使其释放出游离原生质体。本发明采用异枝江蓠原生质体的分离的琼胶酶，其中包含多种酶活性，产量多，能够使细胞壁解离充分，成本低而且高效。离析酶与纤维素酶和琼胶酶互相配合起协同作用，效率高，所需时间短，仅需要解离4h，可得到大量的原生质体，有利于提高原生质体的产量及其存活率。解离后原生质体活性强，后续的培养存活率高及细胞壁再生能力强。而且本发明的异枝江蓠不需要预处理，有利于节省成本。

Description

一种制备异枝江蓠原生质体的方法
技术领域
本发明涉及一种制备大型海藻的原生质体的方法，特别涉及一种制备异枝江蓠原生质体的方法。
背景技术
异枝江蓠(Gracilaria bailinae)是我国南方沿海的一种经济海藻，可作为鲍鱼的饵料和提取琼胶的原料。有报道发现异枝江蓠适合生长的温度为23～33℃，适合生长的盐度为18～28，有适应广温和广盐的性质。具有氮高效利用的营养特征，由于其具有生长快、有耐受广温和广盐等特性，近年来已经在我国广东、福建等地进行栽培。
异枝江蓠的生活史是，四分孢子体成熟后在皮层细胞形成许多四分孢子囊，且每个四分孢子囊中有四个经减数分裂产生的四分孢子。四分孢子放散之后，发育成雌、雄配子体。雌配子体性成熟后形成果孢，雄配子性成熟之后形成精子囊，大量的精子从精子囊释放后游离到雌配子体上，然后生殖细胞结合形成合子，合子在雌配子体的表面发育出凸起的囊果，即形成果孢子体。果孢子体成熟后放散并发育成四分孢子体，完成世代交替的生活史。
由于目前异枝江蓠的栽培生产是采用传统方式进行种质保存和培养，即采用藻体进行营养繁殖，这种方法需要耗费大量藻体作为种苗，且这些种苗若保存在室内，则因为保存数量有限，难以实现大规模生产栽培，若保存在海区，则种苗容易受到自然环境的影响，苗种产量难以进行控制，因此需要建立起异枝江蓠苗种培育技术体系，以应用于栽培生产。
原生质体的分离、培养再生是植物组织培养技术中的两种重要的手段，利用原生质体再生的方法快速繁殖植物，已在高等植物生产应用上取得成效。在大型海藻方面，只有将常规育苗技术改变成为细胞工程育苗技术，能建立良种保存、扩繁、育苗和栽培的良种化技术体系，实现海藻的良种化生产，这也将成为今后大型海藻人工栽培发展的新趋势。本发明技术对异枝江蓠建立一种可行的种质保存和组织培养的技术体系，开发苗种培育新技术，满足栽培生产对苗种的需要，对利用江蓠原生质体再生、融合等细胞工程技术进行江蓠属海藻的育种研究，均具有重要意义。
江蓠的细胞壁主要由纤维素和琼胶组成，其中纤维素是同多糖，通过购买的较纯的纤维素酶很容易将细胞壁中的纤维素降解，但琼胶的组成成份很复杂，它由琼脂糖和硫琼胶组成,琼胶糖是由1,3连接的β-D-半乳吡喃糖和1,4连接的3,6-内醚-α-L-半乳吡喃糖残基反复交替连接的直链聚合物，结构较均一,凝胶强度高。硫琼胶由长短不一的半乳糖残基多糖链组成,结构较复杂,其中包含有D-半乳糖、3,6-半乳糖酐、半乳糖醛酸和多种取代基如丙酮酸、硫酸基、甲基等，是琼脂结构中的非凝胶组分，其结构很不均一,凝胶强度低。由于江蓠的种类、生长环境和采集季节等的不同，其细胞壁中的多糖和其他物质的含量和种类也会相应变化，所含琼胶的数量及其物理化学性质变化很大，有的产琼胶率高、质量好，有的则很差。不同种江蓠的细胞壁中的琼胶含量与琼胶的凝胶强度不一样，故在降解相应的江蓠的细胞壁时，所选用的琼胶酶是关键，故在分离它们的原生质体的时候需要采用不同的手段。目前市场上卖的琼胶酶一般是经过纯化的，不能有效降解细胞壁，从而使原生质体不释放或释放量少，而且商品琼胶酶价格昂贵，成本高。
Zhang S,et al.(Studies on the isolation and culture of protoplastsfrom Kappaphycus alvarezii[J].Acta Oceanologica Sinica,2014,33:114-123)公开了一种制备长心卡帕藻的原生质体的方法，他们研究发现，随着时间的增加，长心卡帕藻的原生质体产量增加，但是如果延长酶解时间原生质体的存活率却逐渐降低。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种制备异枝江蓠原生质体的方法。
一种制备异枝江蓠原生质体的方法，主要包括以下步骤：
1)样品挑选：选取健康、无损伤的异枝江蓠，清洗异枝江蓠表面备用；
2)样品处理：将1)中清洗过的异枝江蓠截取尖端3厘米后进行处理，消除异枝江蓠表面的杂藻及有害微生物；
3)琼胶酶粗酶液制备：培养海洋细菌Marinomonas sp.YS-70 2％发酵产生琼胶酶粗酶液，储存在-80℃冰箱中；
4)原生质体分离液的制备：将MES-Tris和CaCl2·2H2O加入去离子水中配置成浓度为25mM的基液，然后把基液与步骤3)所得琼胶酶粗酶液按体积比4:6混合，再在混合液中加入2％w/v的纤维素酶干粉，1％w/v的离析酶干粉和0.4M山梨醇；2％w/v表示2g/100ml；
5)原生质体的制备：将步骤2)处理后的异枝江蓠切成2-3毫米大小，再用消毒海水冲洗多次，将步骤4)所得原生质体分离液加入异枝江蓠中，在pH 6.5，28℃下，90r/min摇床上遮光酶解4小时，酶解后用45μm的尼龙网进行过滤，取滤液在25℃下离心处理后弃掉上清，加含0.6M山梨醇的MES培养液重悬原生质体，重复离心处理多次。
步骤1)中用消毒海水清洗藻体表面。
步骤2)中除去异枝江蓠表面的杂藻及有害微生物等附着杂质的目的是为了尽可能地消除影响原生质体的外部环境干扰因素。选择异枝江蓠截取尖端3厘米原因之一在于该处藻体细胞分化程度低、活性强，转化成原生质体后活力强、分化能力高。
步骤4)中若不加MES-Tris和CaCl2·2H2O，则原生质体的产量变少，原生质体无细胞壁，CaCl2·2H2O可以作为质膜保护剂保护原生质体的细胞膜，使其处于稳定状态，使原生质体相对不那么容易破裂；原生质体因为无细胞壁，对渗透压敏感，因此以0.4M山梨醇为渗压剂；若改变酶的比例，则原生质体产量也将改变，本发明已经优化了酶浓度，得到这是一个最佳的配比。纤维素和琼胶酶对异枝江蓠的原生质体的分离都是缺一不可的，只用纤维素酶或琼胶酶不能有效分离出异枝江蓠的原生质体，离析酶与纤维素酶和本发明提取的琼胶酶互相配合起协同作用，可以促进原生质体的解离。
步骤5)中pH影响酶的活性，调节pH值主要是使解离细胞壁的酶达到一个最佳的解离水平，本发明所用纤维素酶的最适pH为5.0，离析酶R-10的最适pH为5.0～6.0。本发明中分离出来的琼胶酶最适pH为5.5～8.5，自然界中的海水pH一般在8左右，是江蓠正常生长的环境pH值，若解离酶液的pH越小，自然对江蓠细胞不利。本发明通过大量实验探索分析发现，pH 6.5时能得到原生质体的最大产量。高低温都会影响酶的活性，亦会影响细胞活力，本发明所得原生质体制备最适温度为28℃。酶解时间对原生质体的数量和成活率有影响，时间长，原生质体数量多，但存活率低，时间短，原生质体存活率高但数量低，在酶解4小时，原生质体的数量与存活率的乘积达到最大。步骤5)中的温度及震荡转速为恒温摇床培养箱控制。
对于海藻来说，藻段越小，与酶解液接触越充分越有利于原生质体的产量；但是藻段越小，因剪切力受到伤害的细胞也越多，原生质体的存活率也越低。本发明先截取异枝江蓠尖端3厘米，处理除去表面的杂藻及有害微生物后再切成2-3mm段。更有利于提高原生质体的产量及其存活率。而且切成3cm是因为若藻体太大则不方便清理表面的杂藻和附生物；同时切成3cm，用少量的消毒液也能完全浸没。先不把藻藻体切成2-3mm再消毒是因为若切得太小，藻体伤口越多，消毒液对藻体伤害越大。
进一步的，步骤2)对样品的处理包括：用消毒海水培养5天，用超声波清洁仪处理3分钟，然后浸泡于1.5％KI中10分钟，用消毒海水冲洗多次后浸泡于抗生素溶液中48小时。1.5％KI溶液及抗生素溶液均为了消除藻体表面的杂藻及有害微生物。
进一步的，步骤3)中琼胶酶粗酶液制备，主要包括：以海洋细菌Marinomonassp.YS-70 2％的接种量接种在2216E发酵培养基中，在26℃下120r/min震荡培养48小时后，取发酵液在4℃下离心30分钟，取上清液作为琼胶酶粗酶液。得到的琼胶酶，属于一种粗酶，其中包含多种酶活，用其产生琼胶酶有产量多，能够使细胞壁解离充分，成本低而且高效的特点。
进一步的，步骤5)为每1g异枝江蓠中加入10mL原生质体分离液。
步骤5)中的摇床为恒温摇床培养箱。
与现有技术相比，本发明采用异枝江蓠原生质体的分离的琼胶酶，属于一种粗酶，其中包含多种酶活性，产量多，能够使细胞壁解离充分，成本低而且高效的特点。离析酶与纤维素酶和本发明提取的琼胶酶互相配合起协同作用，效率高，所需时间短，仅需要解离4小时，可得到大量的原生质体，有利于提高原生质体的产量及其存活率。而且本发明的异枝江蓠不需要预处理，有利于节省成本，平均产量也能达到3.13×106个原生质体/g鲜藻。
附图说明
图1为原生质体的产量与基液的关系图；其中1为海水，2为去离子水，3为去离子水中含25mM MES-Tris和25mM CaCl2·2H2O；
图2为原生质体的产量与离析酶浓度的关系图；
图3为原生质体的产量与纤维素酶浓度的关系图；
图4为原生质体的产量与酶液pH的关系图；
图5为原生质体的产量与山梨醇浓度的关系图；
图6为原生质体的产量与酶解温度的关系图；
图7为原生质体的产量与存活率与酶解时间的关系图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例1
一种制备异枝江蓠原生质体的方法，包括如下步骤：
1)样品挑选：选取健康、无损伤的藻体，清洗藻体表面以除去附生杂藻及其他附着物，备用；
2)样品处理：将1)中清洗过的藻体截取尖端3厘米，用消毒海水培养5天，用超声波清洁仪处理3分钟，然后浸泡于1.5％KI中10分钟，用消毒海水冲洗3次后浸泡于抗生素溶液中48小时；
3)琼胶酶粗酶液制备：以细菌Marinomonas sp.YS-70 2％的接种量接种在100mL的发酵培养基中，用500mL的锥形瓶培养，在26℃下120r/min震荡培养48小时后，取发酵液在4℃下10000×g离心30分钟，取上清液作为琼胶酶粗酶液储存在-80℃冰箱中；
4)原生质体分离液的制备：以40％的蒸馏水包含有25mM MES-Tris和25mMCaCl2·2H2O为缓冲介质，2％的纤维素酶，60％3)所述琼胶酶粗酶液，1％离析酶R-10为混合酶组成，0.4M山梨醇为渗压剂，配制成原生质体分离液；
5)原生质体的制备：将2)所述样品用解剖刀切成2-3毫米大小，再用消毒海水冲洗3次，称取0.5g藻体到50mL的锥形瓶中，加入5mL 4)所述原生质体分离液，在pH 6.5，28℃下，90r/m摇床上遮光酶解4小时，酶解后将藻体和分离液用45μm的尼龙网进行过滤，取滤液在25℃下离心8min，转速为200×g，离心后弃掉80％的上清，加含0.6M山梨醇的MES培养液重悬原生质体，再以上述条件进行离心，重复三次。
本实施例采用异枝江蓠原生质体的分离的琼胶酶，属于一种粗酶，其中包含多种酶活性，产量多，能够使细胞壁解离充分，成本低而且高效的特点。离析酶与纤维素酶和本发明提取的琼胶酶互相配合起协同作用，效率高，所需时间短，仅需要解离4小时，可得到大量的原生质体，有利于提高原生质体的产量及其存活率。而且异枝江蓠不需要预处理，有利于节省成本，平均产量也能达到3.13×106个原生质体/g鲜藻。
实施例2
产琼胶酶的细菌的选择
本实施例中共筛选出5株产琼胶酶的细菌，用卢戈氏碘液对生长了菌落的培养基进行染色后通过对比透明圈与菌落直径大小之比初步判断细菌的产酶能力，并将各细菌经发酵培养后所得粗酶液与纤维素酶混合配制成原生质体分离液，其中纤维素酶浓度为2％，山梨醇浓度为0.8M，在pH为6.5，温度为28℃的情况下，酶解4h，然后检测异枝江蓠原生质体的产量。表1为产琼胶酶海洋细菌的筛选结果，从表中可以看出YS-70与T-3中提取的粗酶液能对异枝江蓠原生质体的分离起作用。
表1产琼胶酶细菌的筛选结果
Figure BDA0001438541180000071
注:“-”代表不能解离出原生质体；“+”代表能解离出原生质体且“+”越多解离出的原生质体越多.
实施例3
1、原生质体分离液的优化
(1)优化了基液
如图1所示，分别设置基液为海水，去离子水，去离子水中含25mM MES-Tris和25mMCaCl2·2H2O三种，发现用离子水中含25mM MES-Tris和25mM CaCl2·2H2O作为基液时原生质体产量最高。
(2)优化了离析酶
设置离析酶浓度梯度为0％，0.5％，1.0％，1.5％，。原生质体的产量与离析酶浓度的关系图如图2所示，发现离析酶浓度为1％时，解离效果最佳，原生质体的产率最高。
(3)优化纤维素酶的浓度
纤维素酶浓度梯度为0％，1％，2％，3％，4％，原生质体的产量与纤维性酶浓度的关系图如图3所示，当纤维素酶浓度为2％时解离效果最佳，原生质体的产率最高。
2、酶解条件的优化
(1)酶解pH值的优化
在做pH的对比实验时，分别设置了5.9、6.1、6.3、6.5、6.7这5个pH值，原生质体的产量与酶液pH的关系图如图4所示，异枝江蓠原生质体产量在pH为6.5时的产量显著大于其他pH条件的产量。
(2)探究了渗透压浓度
以山梨醇作为渗压剂，如图5所示，设置其浓度梯度为0.2M、0.4M、0.6M、0.8M、1.0M，发现在浓度为0.4M时有最大原生质体产量。
(3)酶解温度的优化
温度梯度为25℃、28℃、31℃，原生质体的产量与酶解温度的关系如图6所示，发现28℃条件下最适宜异枝江蓠原生质体的解离。
(4)酶解时间的优化
本实施例对酶解时间对异枝江蓠原生质体的产量与存活率进行研究，研究结果如图7所示，异枝江蓠原生质体的产量随着酶解时间的延长，原生质体的产量逐渐增多，其在6h的时候产量也达到了4.0×106个原生质体/g鲜藻，而且随着酶解时间的延长其产量可能还会增加，但是如果延长酶解时间原生质体的存活率却逐渐降低。综合考虑产量与存活率，根据公式：原生质体的存活数量(个/g鲜藻)＝原生质体数量(个/g鲜藻)×存活率(％)，得出在酶解时间为4h时最好。平均产量也能达到3.13×106个原生质体/g鲜藻，此时存活的原生质体数量为1.75×106个原生质体/g鲜藻。
初始酶液与解离原生质体的初始条件是：以4：6的比例将基液3(去离子水中含有25mM MES-Tris和25mM CaCl2·2H2O)和琼胶酶粗酶液混合，加入1％w/v的纤维素酶和0.8M的山梨醇，在pH为6.5，温度为25℃下酶解4h，之后按照从图1到6的顺序分别优化条件，每次进行下一步优化时取上一次优化的最优条件。
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (2)

1.一种制备异枝江蓠原生质体的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
1)样品挑选：选取健康、无损伤的异枝江蓠，清洗异枝江蓠表面备用；
2)样品处理：将1)中清洗过的异枝江蓠截取尖端3厘米后进行处理，消除异枝江蓠表面的杂藻及有害微生物；
3)琼胶酶粗酶液制备：培养海洋细菌Marinomonas sp.YS-70，用2％的接种量接种在2216E发酵培养基中，在26℃下120r/min震荡培养48小时后，取发酵液在4℃下离心30分钟，取上清液作为琼胶酶粗酶液，储存在-80℃冰箱中；
4)原生质体分离液的制备：将MES-Tris和CaCl2·2H2O加入去离子水中配置成浓度为25mM的基液，然后把基液与步骤3)所得琼胶酶粗酶液按体积比4:6混合，再在混合液中加入2％w/v的纤维素酶干粉，1％w/v的离析酶干粉和0.4M山梨醇；
5)原生质体的制备：将步骤2)处理后的异枝江蓠切成2-3毫米大小，再用消毒海水冲洗多次，将步骤4)所得原生质体分离液加入异枝江蓠中，每1g异枝江蓠中加入10mL原生质体分离液，在pH 6.5，28℃下，90r/min摇床上遮光酶解4小时，酶解后用45μm的尼龙网进行过滤，取滤液在25℃下离心处理后弃掉上清，加含0.6M山梨醇的MES培养液重悬原生质体，重复离心处理多次。
2.根据权利要求1所述制备异枝江蓠原生质体的方法，其特征在于，步骤2)对样品的处理包括：用消毒海水培养5天，用超声波清洁仪处理3分钟，然后浸泡于1.5％KI中10分钟，用消毒海水冲洗多次后浸泡于抗生素溶液中48小时。
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