CN110106137A - 一种辣木叶肉原生质体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种辣木叶肉原生质体及其制备方法。该制备方法以辣木三周龄从茎尖往下数第一分支与第二分支叶片为材料，采用纤维素酶R‑10和果胶酶R‑10进行酶解，先真空抽滤45‑50分钟，再使用30rpm水平摇床避光酶解5‑5.5小时，40μm的细胞筛过滤酶解后产物，并利用密度梯度自沉淀法冰上静置两小时分离原生质体。本发明克服了辣木原生质体小、分离效率低、杂质多等问题，有效建立了辣木叶肉原生质体高效且快速的制备方法。

Description

一种辣木叶肉原生质体及其制备方法

技术领域

本发明属于细胞生物技术领域，具体涉及一种辣木叶肉原生质体及其制备方法。

背景技术

原生质体培养技术作为植物细胞工程的重要组成部分，被广泛应用于植物的遗传、育种学、基因工程研究领域。近年来，植物原生质体被广泛用于蛋白的亚细胞定位、蛋白-蛋白互作、蛋白-DNA互作反应、胞内蛋白运输机制、制备转基因植物(原生质体脱分化形成愈伤组织；再分化成完全植株)、通过原生质体融合技术培养体细胞杂交体等许多领域。

辣木(Moringa oleifera)全身是宝，叶片、果荚中富含多种矿物质、维生素，食用有增进营养和保健功能；种子中油脂含量高且含有有活性絮凝成分，有净水功能；根部含有生物碱，尤其是辣木碱有明显的杀菌作用；树干是造纸工业很好的原料。然而，辣木作为具有独特经济价值的多年生植物，国内外却没有关于辣木叶肉原生质体制备的方法。此外，采用现有的拟南芥、水稻或者其他植物的原生质体制备方法，得到的辣木叶肉原生质体出现数量少、细胞碎片多、大小不均匀等问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种快速高效的辣木叶肉原生质体的制备方法以及由该方法制备得到的辣木叶肉原生质体。

本发明通过测定辣木原生质体大小确定细胞筛孔径大小，比较离心法与密度梯度自沉淀法来确定辣木叶肉原生质体更适合密度梯度自沉淀，并通过梯度实验摸索最适合的自沉淀时间，具体的，本发明的辣木叶肉原生质体制备方法包括如下步骤：

(1)取辣木幼苗从茎尖往下数第一分支与第二分支叶片，在超净工作台中去除叶片两端1.5-2mm部分，留中间部分叶片切成0.3-0.4mm条状细丝，并马上将切下的细丝放置在渗透剂中，暗条件下放置；

(2)在室温下，用镊子将全部叶片细丝转移到酶解液中，真空抽滤45-50min，然后置于水平摇床上避光酶解5-5.5h，往酶解产物中加入预冷的W5溶液，混匀，然后经细胞筛过滤至圆底无菌离心管，冰上静置，待溶液出现明显分层，吸去上清，得到辣木叶肉原生质体。

进一步地，将得到的辣木叶肉原生质体使用预冷的W5溶液重悬，进行镜检。

上述步骤(1)的渗透剂为0.5mol/L甘露醇水溶液，所述的渗透剂用量为15mL/25片叶子。

步骤(2)的酶解液含有15mg/mL纤维素酶R-10、3mg/mL果胶酶R-10、0.4M的甘露醇、20mM的氯化钾，20mM pH5.7的MES、10mM无水氯化钙、1mg/mL BSA、5mMβ-巯基乙醇，溶剂为超纯水。

所述的酶解液制备步骤为：将纤维素酶R-10、果胶酶R-10、甘露醇、氯化钾、pH5.7的MES混合，用超纯水定容到10mL，55℃水浴10min，冷却后加入无水氯化钙、BSA、β-巯基乙醇，混匀，加入超纯水定容到15mL，用0.45μm滤膜过滤灭菌，得到酶解液。

步骤(2)的在水平摇床上避光酶解是将含有叶片细丝的酶解液置于10cm的无菌培养皿，包上锡箔纸、30rpm避光酶解。

步骤(2)的W5溶液含有5mM葡萄糖、154mM氯化钠、125mM氯化钙、5mM氯化钾、2mMpH5.7MES，溶剂为超纯水。

步骤(2)的细胞筛孔径大小为40μm。

步骤(2)的细胞筛在过滤前用4-5mL的预冷W5溶液过滤，起到湿润细胞筛的作用。

步骤(2)的过滤是在冰上进行，将圆底无菌离心管的8/10-9/10管身埋在冰中。

步骤(1)的辣木幼苗是通过以下方法获得：

(1)干辣木种子采用蒸馏水浸泡过夜，然后采用1g/L的多菌灵水溶液消毒处理35-45min，消毒过程中每隔5min充分摇晃；

(2)将消毒后的辣木种子用无菌水洗五遍，铺在湿润育苗纸催芽，一周后挑选生根发芽的幼苗移栽到泥炭土：蛭石＝4:1m/m的基质中培养21-25天，得到辣木幼苗，其中催芽和育苗的培养条件均为32℃，光照16h，黑暗8h，光照强度为8000Lux。

本发明的有益效果是：本发明克服了辣木原生质体小、分离效率低、杂质多等问题，有效建立了辣木叶肉原生质体高效且快速的制备方法，使用本方法操作简单且快速。与老叶相比(深绿色)，采用辣木幼苗从茎尖往下数第一分支与第二分支叶片(嫩绿色)，能提高原生质体的数量且镜检观察得到嫩叶的叶肉原生质体比老叶叶肉原生质体大，相对较大的原生质体能提高原生质体的转化效率。应用真空抽滤，能够使辣木叶肉细胞产生轻微的质壁分离，加速酶解液的渗透作用，能大大提高酶解效率。采用水平摇床低速避光摇晃能让酶解液充分接触植物细胞，提高酶解液的酶解效果，也能大大提高酶解效率。采用密度梯度自沉淀法代替离心法可从辣木叶肉中分离到少杂质、大小均匀的原生质体细胞。本发明能为研究辣木蛋白的亚细胞定位、蛋白-蛋白互作、蛋白-DNA互作反应、胞内蛋白运输机制、制备转基因辣木和体细胞杂交体等许多领域搭建一个可靠的技术平台。

附图说明

图1为实施例1制备的辣木叶肉原生质体的显微镜图片。

图2为实施例1制备的辣木叶肉原生质体的形态。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1

(1)取适量颗粒饱满的干辣木种子(PKM-1)置于组培瓶中，蒸馏水浸泡过夜(10-12小时)。

(2)将过夜浸泡后的辣木种子采用1g/L的多菌灵水溶液消毒处理35-45分钟，为了消毒充分，期间每隔5分钟充分摇晃。

(3)消毒种子用无菌水洗五遍，铺在湿润育苗纸催芽，一周后挑选生根发芽的幼苗移栽到泥炭土：蛭石＝4:1m/m的基质中培养，催芽和育苗的培养条件均为32℃，光照16h，黑暗8h，光照强度为8000Lux。

(4)培养21-25天后，待辣木长成13-18cm高的幼苗，取辣木幼苗从茎尖往下数第一分支与第二分支叶片，在超净工作台中(工作台不开灯)，用锋利的手术刀去除叶片两端1.5-2mm部分，留中间部分叶片切成0.3-0.4mm条状细丝，并马上将切下的细丝转入装有15mL渗透剂的10cm的无菌培养皿中暗条件下放置10分钟。所述渗透剂为0.5mol/L甘露醇水溶液，所述的渗透剂用量为15mL/25片叶子。

(5)酶解以获得原生质体：在室温条件下(23-25℃)，用镊子小心将全部叶片细丝转移到酶解液中，真空抽滤45-50min，将含有叶片细丝的酶解液置于10cm的无菌培养皿，包上锡箔纸、在水平摇床上30rpm避光酶解5-5.5小时。所述的酶解液含有15mg/mL纤维素酶R-10、3mg/mL果胶酶R-10、0.4M的甘露醇、20mM的氯化钾，20mM pH5.7的MES、10mM无水氯化钙、1mg/mL BSA、5mMβ-巯基乙醇，溶剂为超纯水。酶解液的制备步骤为：将纤维素酶R-10、果胶酶R-10、甘露醇、氯化钾、pH5.7的MES混合，用超纯水定容到10mL，55℃水浴10min，冷却后加入无水氯化钙、BSA、β-巯基乙醇，混匀，加入超纯水定容到15mL，用0.45μm滤膜过滤灭菌，得到酶解液。

(6)酶解完成后，在酶解产物中轻轻加入15mL预冷的W5溶液，轻摇混合均匀，得到酶解产物悬液。所述W5溶液含有5mM葡萄糖、154mM氯化钠、125mM氯化钙、5mM氯化钾、2mMpH5.7MES，溶剂为超纯水。W5溶液的制备步骤为：将葡萄糖、氯化钠、氯化钙、氯化钾和MES，混合，溶于超纯水，即得。

(7)轻轻将酶解产物悬液使用孔径大小为40μm的细胞筛过滤至圆底的50mL无菌离心管。所述的细胞筛在过滤前用4-5mL预冷W5溶液过滤，起到湿润细胞筛的作用。所述的过滤操作在冰上进行，将50mL圆底无菌离心管的8/10-9/10管身埋在冰中。

(8)将离心管置于冰上静置两小时。两小时后出现明显的分层现象，用胶头滴管小心吸去上清，加入5mL预冷W5溶液悬浮原生质体，进行镜检，使用25×16型的细胞计数板统计原生质体数量。根据公式：原生质体个数/1mL＝80个小方格细胞总数/80×400×10000×稀释倍数，其中80个小方格指的是计数板四个角和中央的五个中方格中的小方格总和。根据公式得到辣木叶肉原生质体数量为5×10⁶个，原生质体的直径在14.86-21.91μm之间。辣木叶肉原生质的显微镜图片见图1所示。辣木叶肉原生质的形态见图2所示。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种辣木叶肉原生质体制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取辣木幼苗从茎尖往下数第一分支与第二分支叶片，在超净工作台中去除叶片两端1.5-2mm部分，留中间部分叶片切成0.3-0.4mm条状细丝，并马上将切下的细丝放置在渗透剂中，暗条件下放置；

(2)在室温下，用镊子将全部叶片细丝转移到酶解液中，真空抽滤45-50min，然后置于水平摇床上避光酶解5-5.5h，往酶解产物中加入预冷的W5溶液，混匀，然后经细胞筛过滤至圆底无菌离心管，冰上静置，待溶液出现明显分层，吸去上清，得到辣木叶肉原生质体。

2.根据权利要求1所述的辣木叶肉原生质体制备方法，其特征在于，步骤(1)的渗透剂为0.5mol/L甘露醇水溶液，所述的渗透剂用量为15mL/25片叶子。

3.根据权利要求1所述的辣木叶肉原生质体制备方法，其特征在于，步骤(2)的酶解液含有15mg/mL纤维素酶R-10、3mg/mL果胶酶R-10、0.4M的甘露醇、20mM的氯化钾，20mM pH5.7的MES、10mM无水氯化钙、1mg/mL BSA、5mMβ-巯基乙醇，溶剂为超纯水。

4.根据权利要求1所述的辣木叶肉原生质体制备方法，其特征在于，步骤(2)的在水平摇床上避光酶解是将含有叶片细丝的酶解液置于10cm的无菌培养皿，包上锡箔纸、30rpm避光酶解。

5.根据权利要求1所述的辣木叶肉原生质体制备方法，其特征在于，步骤(2)的W5溶液含有5mM葡萄糖、154mM氯化钠、125mM氯化钙、5mM氯化钾、2mM pH5.7MES，溶剂为超纯水。

6.根据权利要求1所述的辣木叶肉原生质体制备方法，其特征在于，步骤(2)的细胞筛孔径大小为40μm。

7.根据权利要求1所述的辣木叶肉原生质体制备方法，其特征在于，步骤(2)的细胞筛在过滤前用4-5mL的预冷W5溶液过滤，起到湿润细胞筛的作用。

8.根据权利要求1所述的辣木叶肉原生质体制备方法，其特征在于，步骤(2)的过滤是在冰上进行，将圆底无菌离心管的8/10-9/10管身埋在冰中。

9.根据权利要求1所述的辣木叶肉原生质体制备方法，其特征在于，所述的辣木幼苗通过以下方法获得：

(1)干辣木种子采用蒸馏水浸泡过夜，然后采用1g/L的多菌灵水溶液消毒处理35-45min，消毒过程中每隔5min充分摇晃；

(2)将消毒后的辣木种子用无菌水洗五遍，铺在湿润育苗纸催芽，一周后挑选生根发芽的幼苗移栽到泥炭土：蛭石＝4:1m/m的基质中培养21-25天，得到辣木幼苗，其中催芽和育苗的培养条件均为32℃，光照16h，黑暗8h，光照强度为8000Lux。

10.一种按照权利要求1-9任一所述的辣木叶肉原生质体制备方法制备得到的辣木叶肉原生质体。