CN109988740A - 一种植物原生质体培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物原生质体培养方法。本发明在悬浮培养条件下，采用复硝酚钠激活原生质，增强对原生质的刺激强度，从而提高原生质的体外扩增能力，在原生质洗脱前进行高温水浴后并快速冰浴，避免原生质粘联导致收获率低。本发明培养过程易于控制、操作简便、易于放大。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域，尤其涉及一种植物原生质体培养方法。
背景技术
植物原生质体融合技术是借鉴于动物细胞融合的研究成果，在原生质体分离培养的基础上建立起来的，以植物的原生质体为材料，通过物理、化学等因素的诱导，使两个原生质体融合在一起以致形成融合细胞的技术。它不是雌雄孢子之间的结合，而是具有完整遗传物质的体细胞之间的融合，是2种原生质体间的杂交。通过原生质体融合可以把带有不同基因组的两个细胞结合在一起，与常规有性杂交相比，不但可以使杂交亲本组合的范围扩大，还可以使育种周期期缩短，繁育新品种的风险减小。但是直到目前为止，植物原生质体融合育种仍然很困难，其主要原因是原生质体再生形成植株效率极低，重复性较差，并且还具有基因型的依赖性。
原生质体融合技术为植物育种提供了全新的途径。与常规杂交育种相比，原生质体融合这一无性杂交方式可以在一定程度上克服有性生殖中的隔离现象，如远缘有性杂交不亲和性、无融合生殖有性杂交育种中花粉败育及较少形成有性杂种、花期不育等问题，能扩大有利性状的结合及重组范围，从而获得通过有性杂交无法得到的新种质；通过原生质体融合还可以实现胞质基因组及多基因控制性状的有效转移，如雄性不育性、抗寒性、耐盐性等。同时，作为木本植物的蓝莓由于无性繁殖的特点，原生质体融合获得的种质材料就容易被固定及向后代传递，从而能克服融合后代不育或不孕所带来的问题；另外，在植物育种中，由于较少的性状要求，就容易在融合后代中选择到所要求的性状组合；且随着非对称融合技术的发展，可以只转移部分基因或基因组，使解决融合后代性状无选择进入的问题也成为可能。因此研究蓝莓原生质体培养融合技术，对于有效获得新种质材料并应用于育种实践将具有重要意义。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种植物原生质体培养方法，本发明在悬浮培养条件下，采用复硝酚钠激活原生质，增强对原生质的刺激强度，从而提高原生质的体外扩增能力，在原生质洗脱前进行高温水浴后并快速冰浴，避免原生质粘联导致收获率低。本发明培养过程易于控制、操作简便、易于放大。
本发明提出了一种植物原生质体培养方法，在悬浮培养条件下，采用复硝酚钠激活原生质，增强对原生质的刺激强度，从而提高原生质的体外扩增能力；在悬浮培养原生质洗脱前，先进行高温水浴，然后快速冰浴，从而提高原生质体的收获率。
优选地，复硝酚钠的使用浓度为0.0003-0.0009％。
优选地，原生质洗脱前在36℃-38℃水浴30分钟，然后立即置冰水混合物中冷却至0℃。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种植物原生质体培养方法，提高了原生质体培养的效率与产量，克服了原生质体培养产量底、易粘联、难分离的问题，对通过原生质体融合获得的种质材料实验具有重要意义。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
1、原生质体解冻与活化
(1)取一离心管用滴管在其内滴加5-9ml培养液。
(2)从液氮罐中取出冻存管，并迅速放入36℃-38℃水浴，不时摇动，使其急速融化，30-60s内完成。
(3)冻存管用70％酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将原生质体悬液转移入上述离心管中。
(4)低速离心(1200r/min)6min，去上清后再用5-9ml培养液再清洗离心一次。
2、装瓶培养
(1)离心后去掉上清液，在离心管中滴加内滴加3ml培养液(MS)，混匀。
(2)将离心管中的混合液转移到培养瓶中，并在培养瓶中滴加复硝酚钠至其浓度为0.0003-0.0009％，盖上瓶盖，将培养瓶平放，置于37℃培养箱中培养。
3、制原生质体悬液
(1)向瓶内加入胰蛋白酶液1ml，置于37℃孵箱或室温(25℃温度)下进行消化，1--3min后把培养瓶放在倒置显微镜下进行观察，当发现胞质回缩、原生质体间隙增大后，应立即中止消化。
(2)吸出消化液，向瓶内用滴管加入培养液少量，轻轻转动培养瓶，把残留胰蛋白液消化液冲掉，然后再少量含MS的加培养液。
(3)使用吸管，吸取瓶内培养液，按顺序反复轻轻吹打瓶壁原生质体，使之从瓶壁脱离形成原生质体悬液。吹打时动作要轻柔，以防用力过猛损伤原生质体。
(4)将准备好的原生质体悬液转入离心管中，离心(1200r/min)6min
4、原生质体分装
(1)将离心后离心管中液体倒掉，在离心管中加入3ml培养液，并反复吹打原生质体，制成原生质体悬液。
(2)取3个无菌培养瓶，酒精棉球擦拭消毒，并在酒精灯下过火消毒。
(3)在培养瓶中各加入1ml原生质体悬液、2ml培养液(用移液枪)、复硝酚钠至浓度为0.0003-0.0009％，加好后酒精灯下过火加塞。
(4)原生质体培养换液时间应根据原生质体生长的状态和实验要求来确定。2-3d后换一次生长液。
5、原生质体悬液的制作
(1)选对数增生期原生质体(原生质体铺满度为90％左右时)，在冻存前1d换液。
(2)试验台的消毒工作准备好，吸掉或倒掉培养瓶内旧培养液。
(3)向瓶内加入1ml 0.25％胰蛋白酶液，以能覆盖培养瓶底为宜。
(4)置37℃孵箱或室温(25℃温度)下进行消化，2--3min后把培养瓶放在倒置显微镜下进行观察，当发现胞质回缩、原生质体间隙增大后，应立即中止消化。
(5)吸出消化液，在吸除胰蛋白液后，直接加入3ml培养液+复硝酚钠至其浓度为0.0003-0.0009％，终止消化。
(6)使用弯头吸管，吸取瓶内培养液，按顺序反复轻轻吹打瓶壁原生质体，使之从瓶壁脱离形成原生质体悬液。
(7)将培养瓶中的原生质悬液在36℃-38℃水浴30分钟，然后立即置冰水混合物中冷却至0℃。
6、冻存
(1)配制含10％甘油、10％MS的冻存培养液，于离心管中加入1ml冻存液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使原生质体均匀，一个培养瓶中的原生质体只加入一个冻存管。
(2)将原生质体悬液分装入无菌冻存管中，每管1-1.5ml(冻存液要先预冷到4℃)；在冻存管上标明原生质体的名称，冻存时间及操作者。
(3)冻存：标准的冻存程序为降温速率-1--2℃/min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃--10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有原生质体的冻存管放入-20℃冰箱2h，然后放入液氮气中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种植物原生质体培养方法，其特征在于，在悬浮培养条件下，采用复硝酚钠激活原生质，增强对原生质的刺激强度，从而提高原生质的体外扩增能力；在悬浮培养原生质洗脱前，先进行高温水浴，然后快速冰浴，从而提高原生质体的收获率。
2.根据权利要求1所述植物原生质体培养方法，其特征在于，复硝酚钠的使用浓度为0.0003-0.0009％。
3.根据权利要求1所述植物原生质体培养方法，其特征在于，原生质洗脱前在36℃-38℃水浴30分钟，然后立即置冰水混合物中冷却至0℃。
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